JP2019520037A - 高度膵異形成の検出 - Google Patents
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Abstract
Description
配列番号45および46からなる、BMP3に対するプライマーの組、
配列番号47および48からなる、NDRG4に対するプライマーの組、
配列番号1および2からなる、ABCB1に対するプライマーの組、
配列番号3および4からなる、AK055957に対するプライマーの組、
配列番号7および8からなる、C13ORF18に対するプライマーの組、
配列番号43および44からなる、CD1Dに対するプライマーの組、
配列番号9および10からなる、CLEC11Aに対するプライマーの組、
配列番号11および12からなる、DLX4に対するプライマーの組、
配列番号13および14からなる、ELMO1に対するプライマーの組、
配列番号15および16からなる、EMX1に対するプライマーの組、
配列番号17および18からなる、FER1L4に対するプライマーの組、
配列番号19および20からなる、FRMD4Aに対するプライマーの組、
配列番号21および22からなる、GRIN2Dに対するプライマーの組、
配列番号23および24からなる、HOXA1に対するプライマーの組、
配列番号25および26からなる、LRRC4に対するプライマーの組、
配列番号29および30からなる、PRKCBに対するプライマーの組、
配列番号31および32からなる、SP9に対するプライマーの組、
配列番号33および34からなる、ST6GAL2に対するプライマーの組、
配列番号35および36からなる、ST8SIA1に対するプライマーの組、
配列番号37および38からなる、TBX15に対するプライマーの組、
配列番号39および40からなる、VWC2に対するプライマーの組、および
配列番号41および42からなる、ZNF781に対するプライマーの組。
本願技術の理解を促進するために、多数の用語およびフレーズを、以下に定義する。追加の定義は、詳細な説明中に記載する。
膵臓がんは、本来的に成長の速い悪性腫瘍であり、必然的に高い死亡率を伴うという従来の見方とは対照的に、分子的な開始から、前がんへの発達、がんへの発展、および転移へと進行するのに、平均で20年かかる可能性があり(Yachida, S., et al., Nature, 2010. 467(7319): p. 1114-1117参照)、結腸直腸新生物の成長率および自然歴とよく似ている(Stryker, S.J., et al., Gastroenterology, 1987. 93(5): p. 1009-13;Bozic, I., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010. 107(43): p. 18545-50参照)ということが、最近の計算モデルによって示唆されており。前がんステージおよびがんの初期ステージT1における症候前の長い滞留時間によって、実際には、スクリーン検出が可能な限られた機会を比較的長くできる可能性がある。
いくつかの実施形態において、上記技術は、表2および表6に示す二つ以上のDMR(例えば、DMR番号1〜96の内の二つ以上のDMR)を含むマーカーの組み合わせのメチル化状態(state)を評価することに関する。いくつかの実施形態において、二つ以上のマーカーのメチル化状態(state)を評価することで、被検体における高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)の存在を同定するためのスクリーニングまたは診断の特異性および/または感度が増大する。
5−メチルシトシンの存在のために核酸を分析する最も頻繁に使用されている方法は、Frommer et al.に記載のDNAにおける5−メチルシトシンを検出するための重亜硫酸塩方法(Frommer et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1827-31)またはその変形に基づく。5−メチルシトシンをマップする重亜硫酸塩方法は、5−メチルシトシンではなくシトシンと亜硫酸水素塩イオン(重亜硫酸塩としても知られる)との反応を観察することに基づく。当該反応は、通常、下記のステップにしたがって実施される:まず、シトシンと亜硫酸水素塩とを反応させてスルホン化シトシンを形成する。次に、スルホン化反応中間物の自発的脱アミノ反応によって、スルホン化ウラシルを得る。最後に、スルホン化ウラシル(uricil)をアルカリ状態下で脱スルホン化することによって、ウラシルを形成する。ウラシルはアデニンと共に塩基対を形成する(これにより、チミンのように作用する)一方、5−メチルシトシンはグアニンと塩基対を形成する(これにより、シトシンのように作用する)ので、検出が可能となる。これにより、例えば、重亜硫酸塩ゲノムシークエンシング(Grigg G, & Clark S, Bioessays (1994) 16: 431-36;Grigg G, DNA Seq. (1996) 6: 189-98)または、例えば、米国特許第5,786,146号に開示されるようなメチル化特異的PCR(MSP)によって、メチル化されたシトシンとメチル化されていないシトシンとの区別が可能になる。
上記技術のいくつかの実施形態において、以下のステップを含む方法を提供する。
2)高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)(例えば、80%以上の感度および80%以上の特異性を有する高度膵異形成)の欠如を検出すること。
2)高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)(例えば、80%以上の感度および80%以上の特異性を有する高度膵異形成)を分類すること。
膵管内乳頭粘液性腫瘍(IPMN)および膵上皮内腫瘍性病変(PanIN)は、膵管腺がん(PDAC)の鍵となる管状前駆体である。高度異形成(HGD)を有する前駆体の病変および初期PDACは外科的に治療するべきという共通認識がある一方、現在の撮像ツールおよびリスク予測モデルは不完全であり、そのような病変の検出に頻繁に失敗する。膵液、膵臓嚢胞液、または便等の媒体に適用される判別式分子マーカーが、高リスク病変のより正確な検出のために必要である。
異常膵臓組織像の程度が異なる8人の患者から採取したブラインド化嚢胞液試料に対してマーカーをテストした。本願のマーカーの内の7個を用いて、重亜硫酸塩変換された嚢胞液DNA上にMSPを行った。コピーを、LRRC4を分母としたメチル化パーセンテージに正規化した。4個のマーカーから得られた結果を表4に示す。
本実施例は、実施例1および2の材料、方法、および結果を記載する。
RRBSは、プロモーターおよびCpGアイランド(がん細胞において高メチル化され、正常な細胞において低メチル化されると知られている領域である)におけるエピジェネティックサインまたはメチル化サインの偏りのない観察を可能にする手法である。我々が行ってきた多数の研究は、同種の内で(がんの種類およびフィルタリング方法の両方において)初めてのものである。マーカー領域を同定およびランク付けするために我々が使用する基準は、臨床メチル化特異的増幅アッセイをデザインすることに最終目標を合わせており、そのことによって処理が独特なものとなっている。4つの主なフィルターは、1)定義されたCpG密集度基準およびベータ回帰モデリングの使用を要するDMR、2)ROC曲線分析、3)(正常な組織または正常な白血球のいずれかに対する)倍率変化、および4)(患者における)領域に対して実証されたCpG共メチル化および(コントロールにおける)共メチル化の欠如、である。
CpG含有モチーフを認識するメチル化特異的制限酵素であるMspIを10ユニット用いた消化によってゲノムDNA(300ng)を断片化し、それにより、試料のCpG濃度を増加させ、ゲノムの余剰領域を除去した。消化された断片の末端を修復し、5ユニットのクレノウ断片(3’−5’エキソ)によって末端にA鎖を付加し、(自身の試料IDをそれぞれの断片にリンクさせるための)バーコード配列を含むメチル化されたTruSeqアダプター(Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ)と一晩かけて連結させた。Agencourt AMPure XP SPRIビーズ/緩衝液(Beckman Coulter、カリフォルニア州ブレーア)を用いて、160〜340bp断片(40〜220bpインサート)のサイズ選定を実施した。緩衝液のカットオフは、ビーズ/緩衝液の試料体積の0.7〜1.1倍であった。最終溶出体積は22μL(EB緩衝液;Qiagen、メリーランド州ジャーマンタウン)であり、小さい試料アリコートにおけるライゲーション効率および断片品質の測定にはqPCRを用いた。改変Epi Tectプロトコル(Qiagen)を用いて、試料に重亜硫酸塩変換を施した(二回)。変換した試料アリコートを、qPCRおよび従来のPCR(PfuTurbo Cx hotstart、Agilent、カリフォルニア州サンタ・クララ)、続けてBioanalyzer 2100(Agilent)評価に供することによって、最終のライブラリー増幅の前に、最適なPCRサイクル数を決定した。最終PCRには、以下の条件を使用した:1)50μLの反応のそれぞれは、5μLの10倍緩衝液、1.25μLの10mM各デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)、5μLのプライマーカクテル(〜5μM)、15μLの鋳型(試料)、1μLのPfuTurbo Cx hotstart、および22.75の水、を含み;温度および時間は95℃で5分、98℃で30秒、12〜16サイクルのそれぞれでは98℃で10秒、65℃で30秒、72℃で30秒、72℃で5分、および4℃で維持した。試料を、無作為化スキームに基づいて4−plexライブラリーへと(等モル)混合し、生体分析器を用いてテストすることにより最終サイズを確認し、ファイX基準およびアダプター特異的プライマーを用いたqPCRによってテストした。
内部アッセイコントロール用のさらなるレーンを用意するため無作為レーン割当て法にしたがって試料をフローセルに充填した。Mayo Clinic Medical Genome Facilityの次世代シークエンシングコア(Next Generation Sequencing Core)によって、Illumina HiSeq 2000を用いて配列決定を行った。101回のサイクルにおいて、読み取りは一方向で行った。各フローセルレーンでは、整列された配列用の30〜50倍のシークエンシング深度(CpG毎のリード数)のカバレッジの中央値に十分である、100,000,000〜120,000,000のリードを生成した。標準Illuminaパイプラインソフトウェアでは、fastqフォーマットにおいて、塩基を呼び出し、リード生成をシークエンシングした。配列アラインメントおよびメチル化抽出には低発現量重亜硫酸塩シークエンシング用流線分析およびアノテーションパイプライン(SAAP−RRBS)を用いた。RRBS発見段階では、各マップ化CpGにおける、膵臓新生物患者と、膵臓コントロール/白血球コントロール/(ある用途では)結腸コントロールとの間のメチル化の差異が主な比較対象であった。CpGアイランドは、期待値に対する観察値CpG比>0.6によって生物化学的に定義される。しかしながら、このモデルでは、CpG分析のタイルユニット「可変メチル化領域(DMR)」が、染色体それぞれにおけるCpG部位の位置間の距離に基づいて生成された。単一のCpGのみを有するアイランドは除外した。疾患グループ毎のカバレッジの全体深度が200リード以上(平均が一被検体につき10リード)であって、メチル化パーセンテージの分散が0よりも大きい(非有益なCpGは除外した)場合にのみ、個々のCpG部位が層別解析の対象となった。リード‐深度基準は、それぞれのグループにおける試料サイズが18個体である二つのグループ間のメチル化パーセンテージにおける10%の差異を検出するための望ましい統計的検出力に基づいた。統計的有意性は、リード数に基づいて、DMR毎のメチル化割合のロジスティック回帰によって決定した。個々の被検体にわたって異なるリード深度を考慮するために、過度に分散したロジスティック回帰モデルを使用し、当該モデルにおいて、分散パラメータは適合モデルからの残余のピアソン・カイ二乗統計値を用いて推定した。その有意レベルに応じてランク付けされたDMRは、さらに、組織および白血球コントロールの組み合わせにおけるメチル化パーセンテージが患者において1%以下10%以上である場合に考慮の対象とした。この結果、94個のマーカーが得られた(表2)。全てのマーカーはAUCが0.85よりも高く、患者対正常な膵臓組織におけるシグナル倍率変化が25よりも大きく、患者対コントロール(低度および中度異形成試料を含む)におけるシグナル倍率変化が5よりも大きく、p値が0.001未満であった。
組織における候補マーカー(通常、一部位につき上位20〜30個のRRBS DMR)をメチル化特異的PCRによって確認する。最初は発見試料に対して行い、次により大きな個別試料集合に対して行う。
28個の上位のマーカーに特異的なプライマーを設計および発注した(IDT、アイオワ州コーラルビル)。設計は、Methprimerソフトウェア(University of California、カリフォルニア州サンフランシスコ)またはMSPプライマー(Johns Hopkins University、メリーランド州ボルチモア)のいずれかを用いて行った。アッセイは、普遍的にメチル化されたゲノムDNAおよびメチル化されていないゲノムDNAコントロールの希釈液上で、SYBRグリーンを用いたqPCRによってテストおよび最適化した。
発見試料に対して定量的MSP反応を行い、パフォーマンスを確認した。ゲノムワイド次世代(genome wide next gen)シークエンシング研究は、高い発見失敗率を被る場合があるため、高い分析的感度および特異性を有するプラットフォームにおいてDMR候補をテストすることは重要である。確認は、患者グループおよびコントロールグループから得られた別々のマイクロ切開組織およびメチル化特異的PCRを用いて選択されたマーカーのブラインド化アッセイに基づいて行い、マーカーレベルは、膵臓上皮組織用マーカーであるメチル化されたLRRC4について標準化した。患者グループ(n=53)はIPMN−HGD(19)、PanIN−3(4)、およびPDAC(30)を含んだ。コントロールグループ(n=111)は組織学的に正常な膵臓組織(31)、IPMN−LGD(36)、PanIN−1(34)、およびPanIN−2(10)を含んだ。AUCはロジスティック回帰によってそれぞれのマーカーについて算出し、マーカーの組み合わせによる区別を探った。
本実施例では、膵臓嚢胞において進行した新生物を、新しいDNAメチル化マーカーを用いて正確に検出できることを実践する。
本実施例では、膵臓嚢胞において進行した新生物を、嚢胞液中の新しいDNAメチル化マーカーのアッセイによって検出できることを実証する。
Claims (50)
- 被検体から得られた試料における高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)をスクリーニングする方法であって、当該方法は、
a)被検体から得られた試料におけるマーカーのメチル化状態(state)を評価すること、および、
b)上記マーカーの上記メチル化状態(state)が、高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)を有していない被検体において評価したマーカーのメチル化状態(state)とは異なる場合に、上記被検体が高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)を有していると同定することを含み、
上記マーカーは、BMP3、NDRG4、ABCB1、AK055957、C13ORF18、CD1D、CLEC11A、DLX4、ELMO1、EMX1、FER1L4、FRMD4A、GRIN2D、HOXA1、LRRC4、PRKCB、SP9、ST6GAL2、ST8SIA1、TBX15、VWC2、およびZNF781から選択される可変メチル化領域(DMR)における塩基を含む、方法。 - 上記試料は膵臓組織および/または膵臓嚢胞液を含む、請求項1に記載の方法。
- 上記試料は便試料、血液試料、および/または血液分画試料を含む、請求項1に記載の方法。
- 上記マーカーの上記メチル化状態が、上記マーカーの通常のメチル化状態に対して、増大したメチル化を含んでいる、請求項1に記載の方法。
- 上記マーカーの上記メチル化状態が、上記マーカーの通常のメチル化状態に対して、上記マーカーの、異なるパターンのメチル化状態を含んでいる、請求項1に記載の方法。
- 上記評価することが、メチル化特異的なオリゴヌクレオチドの使用を含んでいる、請求項1に記載の方法。
- 上記評価することがメチル化特異的なポリメラーゼ連鎖反応を利用する、請求項1に記載の方法。
- 上記評価することが核酸配列決定を利用する、請求項1に記載の方法。
- 上記評価することが質量分析を利用する、請求項1に記載の方法。
- 上記評価することがメチル化特異的ヌクレアーゼを利用する、請求項1に記載の方法。
- 上記評価することは、メチル化特異的なポリメラーゼ連鎖反応、核酸配列決定、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量に基づく分離、またはターゲットキャプチャーを用いることを含んでいる、請求項1に記載の方法。
- 被検体から得られた試料における高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)をスクリーニングする方法であって、当該方法は、
a)BMP3、NDRG4、ABCB1、AK055957、C13ORF18、CD1D、CLEC11A、DLX4、ELMO1、EMX1、FER1L4、FRMD4A、GRIN2D、HOXA1、LRRC4、PRKCB、SP9、ST6GAL2、ST8SIA1、TBX15、VWC2、およびZNF781からなる群から選択されるDMRにおける塩基を含む試料におけるマーカーのメチル化状態(state)を判定すること、
b)上記被検体試料由来の上記マーカーの上記メチル化状態(state)を、高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)を有していない被検体から得られた正常コントロール試料由来の上記マーカーのメチル化状態(state)と比較すること、
c)上記被検体試料および上記正常コントロール試料の上記メチル化状態(state)における上記差異の信頼区間および/またはp値を決定すること、を含む、方法。 - 上記信頼区間が、90%、95%、97.5%、98%、99%、99.5%、99.9%または99.99%であり、上記p値が、0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001または0.0001である、請求項12に記載の方法。
- 上記試料は膵臓組織および/または膵臓嚢胞液を含む、請求項12に記載の方法。
- 上記試料は便試料、血液試料、および/または血液分画試料を含む、請求項12に記載の方法。
- 被検体から得られた試料における高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)をスクリーニングする方法であって、当該方法は、
DMRを含んでいる核酸(例えば、BMP3、NDRG4、ABCB1、AK055957、C13ORF18、CD1D、CLEC11A、DLX4、ELMO1、EMX1、FER1L4、FRMD4A、GRIN2D、HOXA1、LRRC4、PRKCB、SP9、ST6GAL2、ST8SIA1、TBX15、VWC2、およびZNF781)を重亜硫酸塩試薬と反応させて重亜硫酸塩反応させた核酸を生成すること、
上記重亜硫酸塩反応させた核酸の配列決定をして上記重亜硫酸塩反応させた核酸のヌクレオチド配列を示すこと、
上記重亜硫酸塩反応させた核酸の上記ヌクレオチド配列を高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)を有していない被検体から得られたDMRを含んでいる核酸のヌクレオチド配列と比較することで当該二つの配列における差異を同定すること、および
差異が存在する場合に、上記被検体が高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)を有していると同定すること、を含む、方法。 - 上記試料は膵臓組織および/または膵臓嚢胞液を含む、請求項16に記載の方法。
- 上記試料は便試料、血液試料、および/または血液分画試料を含む、請求項16に記載の方法。
- 被検体から得られた試料における高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)のスクリーニングをするためのシステムであって、当該システムは、試料のメチル化状態(state)を判定するように構成された分析コンポーネントと、上記試料のメチル化状態(state)とデータベースに記録されたコントロール試料または参照試料のメチル化状態(state)とを比較するように構成されたソフトウェアコンポーネントと、メチル化状態(state)の組み合わせに基づいて単一の値を決定し、高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)に関連するメチル化状態(state)をユーザに警告するように構成された警告コンポーネントと、を備えるシステム。
- 上記試料は、BMP3、NDRG4、ABCB1、AK055957、C13ORF18、CD1D、CLEC11A、DLX4、ELMO1、EMX1、FER1L4、FRMD4A、GRIN2D、HOXA1、LRRC4、PRKCB、SP9、ST6GAL2、ST8SIA1、TBX15、VWC2、およびZNF781から選択されるDMRを含んでいる核酸を含む、請求項19に記載のシステム。
- 核酸を単離するためのコンポーネントをさらに備えている、請求項19に記載のシステム。
- 試料を回収するためのコンポーネントをさらに備えている、請求項19に記載のシステム。
- 上記試料は膵臓組織および/または膵臓嚢胞液を含む、請求項19に記載のシステム。
- 上記試料は便試料、血液試料、および/または血液分画試料を含む、請求項19に記載のシステム。
- 上記データベースが、DMRを含んでいる核酸配列を含んでいる、請求項19に記載のシステム。
- 上記データベースは、高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)を有している被検体および高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)を有していない被検体からの核酸配列を含む、請求項19に記載のシステム。
- 被検体から得られた試料における高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)を検出する方法であって、当該方法は、
a)被検体からDNAを含む試料を得ること、
b)上記得られたDNAにおけるメチル化されていないシトシン残基を選択的に修飾することで修飾残基を生成するがメチル化されたシトシン残基は修飾しない試薬を用いて上記得られたDNAを処理すること、
c)上記ステップb)の処理に供された上記DNAにおける一つ以上のDNAメチル化マーカーの上記メチル化レベルを決定することであって、一つ以上のDNAメチル化マーカーはBMP3、NDRG4、ABCB1、AK055957、C13ORF18、CD1D、CLEC11A、DLX4、ELMO1、EMX1、FER1L4、FRMD4A、GRIN2D、HOXA1、LRRC4、PRKCB、SP9、ST6GAL2、ST8SIA1、TBX15、VWC2、およびZNF781から選択される可変メチル化領域(DMR)における塩基を含んでいること、
d)上記一つ以上のDNAメチル化マーカーの上記決定したメチル化レベルと、高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)を有していない被検体用の上記一つ以上のDNAメチル化マーカーの参照メチル化レベルとを比較することによって、上記二つの配列の差異を同定すること、
e)差異が存在する場合に、上記被検体が高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)を有していると同定すること、を含む、方法。 - 一つ以上の上記DNAメチル化マーカーにおけるメチル化の上昇の決定は、CpGアイランドおよびCpGアイランドショアからなる群から選択される領域内における改変されたメチル化の決定を含む、請求項27に記載の方法。
- 上記CpGアイランドまたはCpGショア内でのメチル化の上昇の決定は、DNAメチル化マーカーのコード領域または制御領域内でのメチル化の上昇を含む、請求項27に記載の方法。
- 上記ステップb)の処理に供された上記DNAにおける一つ以上のDNAメチル化マーカーのメチル化レベルの決定は、上記一つ以上のDNAメチル化マーカーの上記メチル化スコアおよび/または上記メチル化頻度の決定を含む、請求項27に記載の方法。
- 上記ステップb)の処理は、上記得られたDNAを重亜硫酸塩修飾することによって行われる、請求項27に記載の方法。
- 上記ステップb)の処理に供された上記DNAにおける一つ以上のDNAメチル化マーカーの上記メチル化レベルの決定は、メチル化特異的PCR、定量的メチル化特異的PCR、メチル化感受性DNA制限酵素分析、定量的重亜硫酸塩パイロシークエンシング、および重亜硫酸塩ゲノムシークエンシングPCRからなる群から選択される手法によって行われる、請求項27に記載の方法。
- 上記参照メチル化レベルは、LRRC4のメチル化との比較を含む、請求項27に記載の方法。
- 上記試料は、膵臓組織試料、膵臓嚢胞液、便試料、血液試料、および/または血液分画試料を含む、請求項27に記載の方法。
- 配列番号1〜48からなる群から選択される配列を含んでいる、オリゴヌクレオチド。
- DMRにおける塩基を有する染色体領域と相補的な配列を含んでいる、オリゴヌクレオチド。
- 1)重亜硫酸塩試薬と、
2)BMP3、NDRG4、ABCB1、AK055957、C13ORF18、CD1D、CLEC11A、DLX4、ELMO1、EMX1、FER1L4、FRMD4A、GRIN2D、HOXA1、LRRC4、PRKCB、SP9、ST6GAL2、ST8SIA1、TBX15、VWC2、およびZNF781から選択されるDMR由来の配列を含み、がんを有していない被検体に関連するメチル化状態(state)を有するコントロール核酸と、を含むキット。 - 重亜硫酸塩試薬と、配列番号1〜48からなる群から選択される配列を含んでいる一つ以上のオリゴヌクレオチドと、を含むキット。
- 1)重亜硫酸塩試薬と、
2)BMP3、NDRG4、ABCB1、AK055957、C13ORF18、CD1D、CLEC11A、DLX4、ELMO1、EMX1、FER1L4、FRMD4A、GRIN2D、HOXA1、LRRC4、PRKCB、SP9、ST6GAL2、ST8SIA1、TBX15、VWC2、およびZNF781から選択されるDMR由来の配列を含み、高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)を有する被検体に関連するメチル化状態(state)を有するコントロール核酸と、を含むキット。 - 被検体から試料を得るための試料回収器と、上記試料から核酸を単離するための試薬と、重亜硫酸塩試薬と、配列番号1〜48からなる群から選択される配列を含んでいる一つ以上のオリゴヌクレオチドと、を含むキット。
- DMRを含んでいる核酸と、配列番号1〜48からなる群から選択される配列を含んでいる一つ以上のオリゴヌクレオチドと、を含む組成物。
- DMRを含んでいる核酸と、メチル化感受性制限酵素と、を含む組成物。
- DMRを含んでいる核酸と、ポリメラーゼと、を含む組成物。
- 生体試料を特徴付ける方法であって、当該方法は、
上記生体試料におけるゲノムDNAを重亜硫酸塩を用いて処理すること、
上記重亜硫酸塩処理されたゲノムDNAを、上記選択された二つ以上遺伝子用のプライマーの組を用いて増幅すること、および
メチル化特異的PCR、定量的メチル化特異的PCR、メチル化感受性DNA制限酵素分析、定量的重亜硫酸塩パイロシークエンシング、または重亜硫酸塩ゲノムシークエンシングPCRによって、上記CpG部位の上記メチル化レベルを決定することを介して、
ヒトの生体試料におけるBMP3、NDRG4、ABCB1、AK055957、C13ORF18、CD1D、CLEC11A、DLX4、ELMO1、EMX1、FER1L4、FRMD4A、GRIN2D、HOXA1、LRRC4、PRKCB、SP9、ST6GAL2、ST8SIA1、TBX15、VWC2、およびZNF781のいずれかから選択される二つ以上遺伝子についてCpG部位のメチル化レベルを測定すること、を含む、方法。 - 上記メチル化レベルと、高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)を有していないコントロール試料における対応する遺伝子の集合のメチル化レベルとを比較すること、および
上記二つ以上遺伝子において測定された上記メチル化レベルの方がそれぞれの上記コントロール試料において測定された上記メチル化レベルよりも高い場合に、当該個体は高度膵異形成(IPMN−HGD、PanIN−3、またはPDAC)を有すると決定すること、をさらに含む、請求項44に記載の方法。 - 上記生体試料は膵臓組織および/または膵臓嚢胞液を含む、請求項44に記載の方法。
- 上記生体試料は便試料、血液試料、および/または血液分画試料を含む、請求項44に記載の方法。
- 上記選択された二つ以上の遺伝子に対するプライマーの組が、以下の通りである請求項44に記載の方法:
配列番号45および46からなる、BMP3に対するプライマーの組、
配列番号47および48からなる、NDRG4に対するプライマーの組、
配列番号1および2からなる、ABCB1に対するプライマーの組、
配列番号3および4からなる、AK055957に対するプライマーの組、
配列番号7および8からなる、C13ORF18に対するプライマーの組、
配列番号43および44からなる、CD1Dに対するプライマーの組、
配列番号9および10からなる、CLEC11Aに対するプライマーの組、
配列番号11および12からなる、DLX4に対するプライマーの組、
配列番号13および14からなる、ELMO1に対するプライマーの組、
配列番号15および16からなる、EMX1に対するプライマーの組、
配列番号17および18からなる、FER1L4に対するプライマーの組、
配列番号19および20からなる、FRMD4Aに対するプライマーの組、
配列番号21および22からなる、GRIN2Dに対するプライマーの組、
配列番号23および24からなる、HOXA1に対するプライマーの組、
配列番号25および26からなる、LRRC4に対するプライマーの組、
配列番号29および30からなる、PRKCBに対するプライマーの組、
配列番号31および32からなる、SP9に対するプライマーの組、
配列番号33および34からなる、ST6GAL2に対するプライマーの組、
配列番号35および36からなる、ST8SIA1に対するプライマーの組、
配列番号37および38からなる、TBX15に対するプライマーの組、
配列番号39および40からなる、VWC2に対するプライマーの組、および
配列番号41および42からなる、ZNF781に対するプライマーの組。 - 上記CpG部位がコード領域または制御領域に存在する、請求項44に記載の方法。
- 二つ以上の遺伝子についての上記メチル化レベル CpG部位を、上記測定することが、上記CpG部位のメチル化スコアを決定すること、および上記CpG部位のメチル化頻度を決定することからなる群から選択される決定を含んでいる、請求項44に記載の方法。
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