JP2019519225A - 活性依存性発現構築物およびこれを使用する方法 - Google Patents

活性依存性発現構築物およびこれを使用する方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、コードされるポリペプチドの活性依存性発現のための核酸活性依存性発現ベクターおよび活性依存性発現カセットを提供する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターで感染した細胞による、コードされるポリペプチドの活性依存性発現のための活性依存性発現カセットを含む発現ベクターを含有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も提供される。また、本開示は、標識ポリペプチドの発現を引き起こす活性依存性制御配列を含有する発現ベクターを細胞に導入することによる、インビトロまたはインビボでの細胞の活性依存性標識のための方法も提供する。また、光応答性ポリペプチドの発現を引き起こす活性依存性制御配列を含有する発現ベクターを細胞に導入することによる、インビトロまたはインビボでの細胞の活性依存性制御のための方法も提供される。

Description

活性に基づく変化は、細胞レベルおよび有機体レベルの両方で複雑な生物学的プロセスであり、外部刺激を感知し、これを細胞機能および／または細胞挙動の変化に変換することが必要である。激しく観察される有機体内での細胞活性調整の複雑さの一例は、哺乳動物の脳である。
前頭前野皮質の多くの個々の領域および層は、多様性に富む活性パターンを有する細胞を含むことが知られている。実際に、同じ課題または刺激に応答する活性の顕著に明確な変化を示す主細胞の他と区別することができない集合は、電気生理学的記録および細胞解像蛍光Ｃａ2+イメージングによって特性決定されてきた。
同時に、前頭前野細胞の類型学に関する解剖学的情報および分子情報のデータストリームは、種々の方法から明らかになってきており、主細胞の興奮性ニューロンの豊富な細胞多様性についても、これらの細胞が、高度に多様性であり、容易に分離可能な介在ニューロンよりもさらに均一な性質を有していたという従来の見解にもかかわらず、指摘されている。これらの知見を合わせると、個々の層および部分領域の中でさえ、主細胞のニューロンの形態、配線、電気生理学的な多様性が強調される。この多様性は、これらの活性化パターンの複雑さに反映されている。
ｃ−ｆｏｓの発現上昇は、細胞活性化の多くの形態と同時に起こり、「細胞活性化」との用語は、一般的に、例えば、細胞サイクルに入るための静止細胞の刺激、分化の誘発およびマクロファージまたはニューロンなどの最終的に分化した細胞の機能的活性の長く続く改変など、共通の長期間にわたる表現型の変化を有する生物学的プロセスの初期段階として考えることができる。
ニューロンにおけるｃ−ｆｏｓの発現上昇は、インビトロおよびインビボの両方で、ニューロン活性化の多くの場合に観察されてきた。ＦＯＳ遺伝子は、ＪＵＮファミリーのタンパク質と二量化することが可能なロイシンジッパータンパク質をコードし、それにより、転写因子複合体ＡＰ−１を生成する。このように、ＦＯＳタンパク質は、細胞の増殖、分化、形質転換およびアポトーシス細胞死の制御因子として関与しており、細胞を活性化させる事象に応答して機能が誘発される。
細胞活性に対して所望なタンパク質の発現を組み合わせることによって、複雑な細胞活性パターン、細胞応答の改変、特定の刺激にさらされた後の挙動を視覚化することができる。
本開示は、コードされるポリペプチドの活性依存性発現のための核酸活性依存性発現ベクターおよび活性依存性発現カセットを提供する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターで感染した細胞による、コードされるポリペプチドの活性依存性発現のための活性依存性発現カセットを含む発現ベクターを含有する組換えＡＡＶも提供される。また、本開示は、標識ポリペプチドの発現を引き起こす活性依存性制御配列を含有する発現ベクターを細胞に導入することによる、インビトロまたはインビボでの細胞の活性依存性標識のための方法も提供する。また、光応答性ポリペプチドの発現を引き起こす活性依存性制御配列を含有する発現ベクターを細胞に導入することによる、インビトロまたはインビボでの細胞の活性依存性制御のための方法も提供される。
本開示は、発現ベクターであって、活性依存性発現カセットを含み、活性依存性発現カセットは、（ａ）ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域とｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列とを含む制御配列と、（ｂ）前記制御配列に作動可能に連結するポリペプチドコード配列とを含み、前記制御配列の活性依存性活性化が起こると、前記ポリペプチドコード配列によってコードされるポリペプチドは、前記発現カセットから発現される、発現ベクターを提供する。ある場合には、ベクターは、ウイルスベクターであり、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。ある場合には、制御配列は、哺乳動物ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域と、哺乳動物ｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列とを含む哺乳動物ｃ−ｆｏｓ制御配列である。ある場合には、哺乳動物ｃ−ｆｏｓ制御配列は、げっ歯類ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域と、げっ歯類ｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列とを含むげっ歯類ｃ−ｆｏｓ制御配列である。ある場合には、げっ歯類ｃ−ｆｏｓ制御配列は、マウスｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域と、マウスｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列とを含むマウスｃ−ｆｏｓ制御配列である。ある場合には、発現カセットは、さらに、ポリペプチドコード配列の３’末端に作動可能に連結するＰＥＳＴペプチドをコードする配列を含む。ある場合には、ポリペプチドコード配列は、ｃ−ｆｏｓ制御配列に対して異種である。ある場合には、ポリペプチドコード配列は、光応答性ポリペプチドをコードする。ある場合には、光応答性ポリペプチドは、脱分極オプシンまたは過分極オプシンである。ある場合には、ポリペプチドコード配列は、分子タグをコードする。ある場合には、ポリペプチドコード配列は、カルシウムセンサーまたは電圧センサーまたはイオンチャンネルをコードする。ある場合には、ポリペプチドコード配列は、毒性タンパク質をコードする。ある場合には、ポリペプチドコード配列は、受容体をコードする。ある場合には、ポリペプチドコード配列は、ヌクレアーゼをコードする。ある場合には、ポリペプチドコード配列は、転写因子をコードする。ある場合には、ポリペプチドコード配列は、光応答性ポリペプチド、分子タグ、カルシウムセンサーまたは電圧センサーまたはイオンチャンネル、毒性タンパク質、受容体、ヌクレアーゼおよび転写因子からなる群から選択される２つ以上のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。ある場合には、ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域は、８００ヌクレオチド長未満である。ある場合には、ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域は、配列番号１と８０％以上の配列同一性を有する。ある場合には、ｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列は、ｃ−Ｆｏｓ遺伝子の第１のイントロン全体またはその縮重配列を含む。ある場合には、ｃ−Ｆｏｓの第１のイントロンは、配列番号２と８０％以上の配列同一性を有する。ある場合には、発現カセットは、さらに、ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域とｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列との間に配置される５０〜２００ヌクレオチド長の配列を含む。ある場合には、５０〜２００ヌクレオチド長の配列は、ｃ−Ｆｏｓ遺伝子の第１のエクソンをコードする配列またはその一部を含む。ある場合には、ｃ−Ｆｏｓ遺伝子の第１のエクソンをコードする配列は、配列番号３と８０％以上の配列同一性を有する。
また、本開示は、上述のいずれかの要素を単独で、または組み合わせて含むか、または除外する、発現ベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供する。
また、本開示は、活性細胞の活性依存性標識のための方法であって、当該方法は、（ａ）細胞と、（ｉ）ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域とｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列とを含む制御配列、および（ｉｉ）前記制御配列に作動可能に連結する標識ポリペプチドをコードするコード配列を含む発現カセットを含む発現ベクターとを接触させることと、（ｂ）前記制御配列の活性依存性活性化が可能な条件で前記細胞を維持することとを含み、前記制御配列の活性依存性活性化が起こると、前記標識ポリペプチドが発現されて、それによって前記活性細胞を標識する、方法を提供する。ある場合には、前記接触させることが、インビトロで行われる。ある場合には、前記接触させることが、インビボで行われる。ある場合には、細胞は、ニューロンである。ある場合には、ニューロンは、哺乳動物ニューロンである。ある場合には、ニューロンは、脊椎動物の中枢神経系に存在する。ある場合には、前記細胞を維持する間に、前記細胞を刺激と接触させることによって、前記制御配列を活性化させる。ある場合には、刺激は、電気刺激である。ある場合には、刺激は、薬理学的刺激である。ある場合には、接触させることが、前記発現ベクターを脊椎動物の中枢神経系に投与することによって、インビボで行われ、前記維持することは、前記脊椎動物に、前記制御配列を活性化させるために十分な行動課題を行うことを含む。ある場合には、標識ポリペプチドは、分子タグである。ある場合には、標識ポリペプチドは、リコンビナーゼであり、細胞は、組換え配列を含み、組換えが起こると、分子タグの発現を誘発する。
また、本開示は、活性化された細胞の活性依存性制御のための方法であって、当該方法は、（ａ）細胞と、（ｉ）ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域とｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列とを含む制御配列、および（ｉｉ）前記制御配列に作動可能に連結する光応答性ポリペプチドをコードするコード配列を含む発現カセットを含む発現ベクターとを接触させることと、（ｂ）前記制御配列の活性依存性活性化が可能な条件で前記細胞を維持することとを含み、前記制御配列の活性依存性活性化が起こると、前記光応答性ポリペプチドが、前記活性化された細胞中で発現されることと、（ｃ）前記活性化された細胞を、前記光応答性ポリペプチドが前記細胞中での応答を誘発するきっかけとなるために十分な光にさらし、それによって、前記活性化された細胞を制御することとを含む、方法を提供する。ある場合には、前記接触させることが、インビトロで行われる。ある場合には、前記接触させることが、インビボで行われる。ある場合には、細胞は、ニューロンである。ある場合には、ニューロンは、哺乳動物ニューロンである。ある場合には、ニューロンは、脊椎動物の中枢神経系に存在する。ある場合には、前記細胞を維持する間に、前記細胞を刺激と接触させることによって、前記制御配列を活性化させる。ある場合には、刺激は、電気刺激である。ある場合には、刺激は、薬理学的刺激である。ある場合には、接触させることが、前記発現ベクターを脊椎動物の中枢神経系に投与することによって、インビボで行われ、前記維持することは、前記脊椎動物に、前記制御配列を活性化させるために十分な行動課題を行うことを含む。ある場合には、応答は、脱分極である。ある場合には、応答は、過分極である。
脳全体での由来／標的によって定義されるプロジェクトマッピングを示す画像である。 脳全体での由来／標的によって定義されるプロジェクトマッピングを示す画像である。 脳全体での由来／標的によって定義されるプロジェクトマッピングを示す画像である。 脳全体での由来／標的によって定義されるプロジェクトマッピングを示すさらなる画像である。 脳全体での由来／標的によって定義されるプロジェクトマッピングを示すさらなる画像である。 脳全体での由来／標的によって定義されるプロジェクトマッピングを示すさらなる画像である。 発現カセット構築の戦略を示す模式図と、コカインおよびショックによって活性化されるｍＰＦＣ集合が、別個のプロジェクション標的を有することを示すデータとである。 発現カセット構築の戦略を示す模式図と、コカインおよびショックによって活性化されるｍＰＦＣ集合が、別個のプロジェクション標的を有することを示すデータとである。 コカインおよびショックによって活性化されるｍＰＦＣ集合が、別個のプロジェクション標的を有することを示すさらなるデータである。 コカインおよびショックによって活性化されるｍＰＦＣ集合が、別個のプロジェクション標的を有することを示すさらなるデータである。 コカインおよびショックによって活性化されるｍＰＦＣ集合が、別個のプロジェクション標的を有することを示すさらなるデータである。 コカインおよびショックによって活性化されるｍＰＦＣ集合を標的とするためのｆｏｓＣｈの使用を示すデータである。 コカインおよびショックによって活性化されるｍＰＦＣ集合を標的とするためのｆｏｓＣｈの使用を示すデータである。 コカインおよびショックによって活性化されるｍＰＦＣ集合を標的とするためのｆｏｓＣｈの使用を示すさらなるデータである。 実験を記録するための電極の配置を示す模式図と、コカインおよびショックによって活性化されるｍＰＦＣ集合の異なる行動影響を示すデータとである。 実験を記録するための電極の配置を示す模式図と、コカインおよびショックによって活性化されるｍＰＦＣ集合の異なる行動影響を示すデータとである。 実験を記録するための電極の配置を示す模式図と、コカインおよびショックによって活性化されるｍＰＦＣ集合の異なる行動影響を示すデータとである。 コカインおよびショックによって活性化されるｍＰＦＣ集合の異なる行動影響を示すさらなるデータである。 マウスｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域、ｃ−Ｆｏｓの第１のエクソンおよびｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン制御領域の配列を示す。 代替的なマウスｃ−Ｆｏｓ制御領域の配列を示す。 代替的なマウスｃ−Ｆｏｓ制御領域の配列を示す。 ベクターｐＡＡＶ−ｃＦｏｓ−ＤＩＯ−ｅＮｐＨＲ ３．０−ｅＹＦＰ−ＰＥＳＴのマップを示す。 ベクターｐＡＡＶ−ｃＦｏｓ−ＤＩＯ−ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ｅＹＦＰ−ＰＥＳＴのマップを示す。 ベクターｐＡＡＶ−ｃＦｏｓ−ＥＲ Ｔ２−ＣｒｅＥＲＴ２−ｄｓ−ｐ２Ａのマップを示す。 ベクターｐＡＡＶ−ｃＦｏｓ−ｅＹＦＰ−ＰＥＳＴのマップを示す。 ベクターｐＡＡＶ−ｃＦｏｓ−ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ｅＹＦＰ−ＰＥＳＴのマップを示す。 ベクターｐＡＡＶ−ｃＦｏｓ−ＷＧＡ−Ｃｒｅのマップを示す。 ベクターｐＡＡＶ−ｃＦｏｓ−ＷＧＡ−Ｃｒｅ−ＷＰＲＥのマップを示す。 本明細書に記載する有用な光応答性ポリペプチドの配列（配列番号３０〜３３）を示す。 本明細書に記載する有用な光応答性ポリペプチドの配列（配列番号３４〜３７）を示す。 本明細書に記載する有用な光応答性ポリペプチドの配列（配列番号３８〜４２）を示す。 本明細書に記載する有用な光応答性ポリペプチドの配列（配列番号４３〜４６）を示す。 本明細書に記載する有用な光応答性ポリペプチドの配列（配列番号４７〜５０）を示す。 本明細書に記載する有用な光応答性ポリペプチドの配列（配列番号５１〜５４）を示す。 本明細書に記載する有用な光応答性ポリペプチドの配列（配列番号５５〜５９）を示す。 本明細書に記載する有用な光応答性ポリペプチドの配列（配列番号６０〜６３）を示す。 本明細書に記載する有用な光応答性ポリペプチドの配列（配列番号６４）を示す。
（定義）
本明細書で使用される「プロモーター」との用語は、１つ以上の転写開始部位で構成され、一般的に、基本転写部分の転写因子および／または転写因子複合体のための結合部位を含有する、ゲノムまたは組み換え核酸の制御領域を指す。
本明細書で使用される「エンハンサー」との用語は、１つ以上の近傍の真核生物プロモーターの利用率を高めるシス作用配列を指す。エンハンサーは、プロモーターに対していずれかの方向（すなわち、「順方向」または「逆方向」）に、任意の位置（３’すなわち「下流」または５’すなわち「上流」）で機能することができる。
本明細書で使用される「５’−非コード領域」との用語は、遺伝子の開始コドンの５’すなわち「上流」（すなわち、タンパク質コード遺伝子から誘導されるタンパク質中の第１の翻訳されたコドン）に隣接して存在する非コード核酸配列（すなわち、天然で産生されるポリペプチドをコードしない核酸配列）を指し、一般的に、遺伝子発現を調整する１つ以上の制御要素を含有する。したがって、「５’−非コード領域プロモーター」とは、遺伝子の開始コドンの上流にある核酸配列内に存在するプロモーターを意味する。したがって、本明細書で使用される場合、５’−非コード領域は、限定されないが、遺伝子から発現されるＲＮＡの５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）に転写されるゲノム配列の全てまたは一部を含んでいてもよい。５’−非コード領域の一般的な特徴は、遺伝子、プロモーター、エンハンサーなどの転写開始部位（ＴＳＳ）を含む。しかし、５’非コード配列から抽出される配列の長さに依存して、遺伝子座から誘導される５’−非コード配列は、上述の個々の特徴のいずれかまたは全てを含んでいてもよく、または除外していてもよい。ある場合には、抽出された５’非コード配列は、５’−非コード領域の中に存在する１つ以上のプロモーターの上流および／またはＴＳＳの上流に核酸配列を含んでいてもよい。
「エクソン」との用語は、一般的に、ＲＮＡスプライシングによって一次ＲＮＡ転写物から除去されない遺伝子内の転写配列の領域を指す。しかし、本明細書で使用される場合、あるときには、エクソンは、例えば、タンパク質の１つのエクソン遺伝子の場合には、全てをコードするか、または複数のエクソン遺伝子の場合には、一部分をコードする核酸配列の一部も指す場合がある。したがって、容易に明らかないくつかの場合には、エクソンとの言及は、例えば、転写開始部位（すなわち、開始コドン）、例えば、５’−ＵＴＲを含む部位の上流である転写物の非コード部分を除外する。
本明細書で使用される「イントロン」との用語は、転写されるが、そのいずれかの側にある配列（すなわちエクソン）を一緒にスプライシングすることによって転写物内から除去される、一次転写物の領域を指す。
本明細書で使用される「ベクター」との用語は、一般的に、外来配列のベクターとして作用するように改変されたレプリコンを指す。「発現ベクター」は、一般的に、ベクターからコード配列を発現する目的のために改変されたベクターを指す。例えば、ベクターは、標的細胞中で発現可能なコード配列を含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子導入ベクター」は、一般的に、目的の遺伝子の発現を指令することができ、その目的の遺伝子を標的細胞内に導入するために有用な任意の核酸構築物を指す。したがって、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクルと、組み込み型ベクターおよび非組み込み型ベクターとを含む。したがって、ベクターは、核酸配列を標的細胞に導入することができ、ある場合には、核酸配列を操作し、例えば、核酸配列を組換える（すなわち、組換え核酸配列を作る）などのためにベクターが使用される。本開示の目的のために、ベクターの例としては、限定されないが、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスなどが挙げられる。
「組換え体」との用語は、本明細書では、核酸分子を記述するために用いられ、ゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成および／または合成由来のポリヌクレオチドを意味し、その由来または操作という観点で、天然で会合しているポリヌクレオチド配列の全てまたは一部と会合していない。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される組換えとの用語は、組換えポリヌクレオチドからの発現によって作られるポリペプチドを意味する。宿主細胞またはウイルスに関して使用される組換えとの用語は、組換えポリヌクレオチドが導入された宿主細胞またはウイルスを意味する。組換え体は、本明細書で、ある物質（例えば、細胞、核酸、タンパク質またはベクター）を参照しつつ、その物質が、異種材料（例えば、細胞、核酸、タンパク質またはベクター）の導入によって改変されたことを指すためにも使用される。
「ポリペプチド」および「タンパク質」との用語は、ペプチド結合によって連結したアミノ酸残基のポリマーを指すために相互に置き換え可能に使用され、本開示の目的のために、最小長さは少なくとも１０アミノ酸である。オリゴペプチド、オリゴマーマルチマーなどは、典型的には、さらに長いアミノ酸鎖を指し、さらに、ペプチド結合によって連結する直鎖に配置されたアミノ酸で構成され、生物学的に、組換えによって、または合成的に作られるかどうかによらず、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸で構成されるかどうかによらず、この定義に含まれる。全長タンパク質と、１０アミノ酸より多いそのフラグメントとが、両方ともこの定義に包含される。この用語には、ポリペプチドの翻訳と同時の改変（例えば、シグナルペプチド開裂）および翻訳後改変、例えば、ジスルフィド結合生成、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、タンパク質分解開裂（例えば、フリンまたはメタロプロテアーゼによる開裂）などを有するポリペプチドも含まれる。さらに、本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望な活性を維持している限り、ネイティブ配列に対する改変、例えば、欠失、付加および置換（一般的に、当業者に知られているように、保存的な性質を有する）を含むタンパク質を指す。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発などによって故意に行うことができ、または、例えば、タンパク質を産生する宿主の突然変異、またはＰＣＲ増幅または他の組換えＤＮＡ方法に起因するエラーによる偶発的なものであってもよい。
「個体」、「被験体」、「宿主」および「患者」との用語は、本明細書では相互に置き換え可能に使用され、限定されないが、ネズミ科（例えば、ラット、マウス）、ウサギ目（例えば、ウサギ）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含む哺乳動物を指す。
（詳細な説明）
本開示は、コードされるポリペプチドの活性依存性発現のための核酸活性依存性発現ベクターおよび活性依存性発現カセットを提供する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターで感染した細胞による、コードされるポリペプチドの活性依存性発現のための活性依存性発現カセットを含む発現ベクターを含有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も提供される。また、本開示は、標識ポリペプチドの発現を引き起こす活性依存性制御配列を含有する発現ベクターを細胞に導入することによる、インビトロまたはインビボでの細胞の活性依存性標識のための方法も提供する。また、光応答性ポリペプチドの発現を引き起こす活性依存性制御配列を含有する発現ベクターを細胞に導入することによる、インビトロまたはインビボでの細胞の活性依存性制御のための方法も提供される。
本発明をさらに詳細に記載する前に、本発明は、記載される特定の実施形態をもちろん変更可能であるため、記載される特定の実施形態に限定されないことが理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される専門用語が、特定の実施形態のみを記述する目的のためだけのものであり、限定することを意図していないことも理解されるべきである。
ある範囲の値が与えられる場合、その内容が明らかに他の意味であることを示していない限り、その範囲の上限と下限との間のそれぞれの間に入る値は、下限の単位の１０分の１まで、また、述べられている範囲の任意の他の述べられている値または間に入る値が、本発明に包含されることが理解される。これらの小さい方の範囲の上限および下限は、独立して、その小さい方の範囲に含まれてもよく、述べられている範囲内の任意の具体的に除外されている境界値に従って、本発明にも包含される。述べられている範囲が、境界値の片方または両方を含む場合、これらの含まれている境界値のいずれかまたは両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。
特定の範囲が本明細書に提示され、数値には、「約」という用語が前に付く。「約」との用語は、この用語の後に付く実際の数字、この用語の後につく数字に近い数字またはおおよそ近い数字についての文字通りの意味を与えるために本明細書で使用される。ある数が、具体的に引用されている数字に近い数字であるか、またはおおよそ近い数字であるかを決定する際に、その近いか、またはおおよそ近い引用されていない数字は、提示されている内容において、その具体的に引用されている数字と実質的に等価な値であってもよい。
他の意味であると定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または等価な任意の方法および材料も、本発明の実施または試験に使用することができるが、代表的で具体的な方法および材料をここに記載する。
本明細書に引用される全ての刊行物および特許は、それぞれの個々の刊行物または特許が、具体的かつ個々に参考として組み込まれるように示されているかのように、本明細書に参考として組み込まれ、刊行物が引用されていることと組み合わせて、方法および／または材料を開示し、記載するために、本明細書に参考として組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日よりも前のその開示のためであり、本発明が、従来発明という観点でこのような刊行物に先行するという権利を有していないことを認容するものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の公開日とは異なっている場合があり、これとは独立して確認する必要がある。
本明細書および添付する特許請求の範囲で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」との単数形は、その内容が明確に他の意味であることを示していない限り、複数の対象物も含むことを注記しておく。特許請求の範囲は、任意要素を除外して記載されていてもよいことをさらに注記しておく。このように、この記載は、特許請求の範囲の要素と組み合わせて、または「否定する」方の限定の使用と組み合わせて、「もっぱら」、「〜のみ」などの排他的な用語の使用のための先行詞として機能することを意図している。
本開示を読めば、当業者には明らかであるが、本明細書に記載され、示されている個々の実施形態はそれぞれ、別個の構成要素および特徴を有しており、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されてもよく、またはこれらの特徴と組み合わせてもよい。任意の引用されている方法を、引用されている事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で行うことができる。
（発現構築物）
本開示は、コードされるポリペプチドの活性依存性発現のための発現構築物を提供する。本開示の発現構築物は、一般的に、少なくとも制御配列と、目的のポリペプチド（本明細書では、一般的に、「コードされるポリペプチド」と呼ばれる）をコードする配列とを含む。発現構築物のコード配列からコードされるポリペプチドは、以下にさらに詳細に記載され、一部には、発現構築物の特定の目標または最終的な使用に依存して変わる。
本開示の発現構築物の要素は、一般的に、制御配列がコード配列に対して作動可能に連結するように、制御配列の「上流」すなわち５’から、ポリペプチドコード配列までが並んでおり、制御領域およびコード配列は、制御領域の活性化が、コード配列（複数可）の発現を引き起こすような相対的な方向にあることを意味している。本開示の発現構築物は、さらに、特定の用途に依存して、以下にさらに詳細に記載されるように、発現構築物の維持、繁殖および／または使用に必要な特定の要素を含んでいてもよく、または除外していてもよい。
（制御配列）
本開示の活性依存性制御配列は、プロトオンコジーンｃ−Ｆｏｓ（関連する種に応じて、ＦＯＳ、Ｆｏｓプロトオンコジーン、ＡＰ−１転写因子サブユニット、ＦＢＪ骨肉腫オンコジーンなどとしても知られる）の発現を誘発する転写因子に応答する核酸発現制御要素を含む。ｃ−Ｆｏｓの即時および初期のアップレギュレーションは、一般的に、外部刺激に応答する細胞の活性化を含め、細胞活性化と関係がある。したがって、理論によって束縛されないが、ｃ−Ｆｏｓの制限要素は、下流のコード配列の活性依存性誘発のために効果的な構成要素を与えると決定された。
本明細書に記載される発現構築物の制御配列は、５’−非コード制御配列、イントロン配列、またはこれらの組み合わせを含んでいてもよい。しかし、制御配列は、ある場合には、このような配列が制御機能に寄与しないさらなる配列を含んでいてもよいため、制御機能を与えるこれらの配列にのみ限定される必要はない。ある場合には、制御配列は、制御機能を有していない１つ以上のさらなる配列を除外するように改変されてもよい。本明細書に記載される制御配列は、全体的に非コード配列であってもよく、または、例えば、非コード配列が、１つ以上のコードするエクソンまたはその一部との組み合わせで存在する場合を含め、いくつかのコード配列を含んでいてもよい。
本開示の発現構築物の制御配列は、一般的に、ｃ−Ｆｏｓ遺伝子の５’−非コード制御配列を含有していてもよい。５’−非コード制御領域は、一般的に、遺伝子の５’開始コドンの上流のヌクレオチド配列、すなわち、第１のエクソンの第１の翻訳されたコドンを含む。５’−非コード配列は、一般的に、少なくとも１つのプロモーター要素を含み、１つ以上のエンハンサーを含んでいてもよいが、必ずしも１つ以上のエンハンサーを含む必要があるというわけではない。したがって、ｃ−Ｆｏｓ ５’−非コード制御領域は、少なくとも１つの５’ ｃ−Ｆｏｓ プロモーターを含む。５’−非コード領域は、限定されないが、ｃ−Ｆｏｓ遺伝子転写物の５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）に転写されるゲノムヌクレオチド配列を含んでいてもよい。ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域は、ｃ−Ｆｏｓの転写開始部位（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅまたはｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｔａｒｔ ｓｉｔｅ（ＴＳＳ））を含んでいてもよく、さらに、ｃ−ＦｏｓのＴＳＳの上流に非コード配列を含んでいてもよい。
このように、本開示の発現構築物の５’−非コード制御領域の大きさは、さまざまであってもよく、限定されないが、例えば、ｃ−Ｆｏｓ遺伝子の開始コドンから上流の配列の１ｋｂより大きくてもよく、または小さくてもよく、限定されないが、例えば、上流の配列の１ｋｂ以下、上流の配列の９５０ｂｐ以下、上流の配列の９００ｂｐ以下、上流の配列の８５０ｂｐ以下、上流の配列の８００ｂｐ以下、上流の配列の７９０ｂｐ以下、上流の配列の７８０ｂｐ以下、上流の配列の７７０ｂｐ以下、上流の配列の７６０ｂｐ以下、上流の配列の７５０ｂｐ以下、上流の配列の７４０ｂｐ以下、上流の配列の７３０ｂｐ以下、上流の配列の７２０ｂｐ以下、上流の配列の７１０ｂｐ以下、上流の配列の７００ｂｐ以下などを含む。
本開示の発現構築物の５’−非コード制御領域の長さは、さまざまであってもよく、２５０ｂｐ未満から１ｋｂまで、または１ｋｂより大きくてもよく、例えば、本開示の発現構築物の５’−非コード制御領域の長さは、２５０ｂｐ〜９００ｂｐ、２５０ｂｐ〜８５０ｂｐ、２５０ｂｐ〜８００ｂｐ、２５０ｂｐ〜７５０ｂｐ、２５０ｂｐ〜７００ｂｐ、２５０ｂｐ〜６５０ｂｐ、２５０ｂｐ〜６００ｂｐ、２５０ｂｐ〜５５０ｂｐ、２５０ｂｐ〜５００ｂｐ、５００ｂｐ〜９００ｂｐ、５００ｂｐ〜８５０ｂｐ、５００ｂｐ〜８００ｂｐ、５００ｂｐ〜７５０ｂｐ、５００ｂｐ〜７００ｂｐ、５００ｂｐ〜６５０ｂｐ、５００ｂｐ〜６００ｂｐ、７５０ｂｐ〜９００ｂｐ、７５０ｂｐ〜８５０ｂｐ、７５０ｂｐ〜８００ｂｐなどの範囲であってもよい。
本開示の発現構築物の制御配列は、一般的に、ｃ−Ｆｏｓ遺伝子の第１のイントロンの配列を含んでいてもよく、ここで、「第１のイントロン」は、ｃ−Ｆｏｓ転写物の加工中にスプライシングによって切り出されたｃ−Ｆｏｓ遺伝子の第１のエクソンのすぐ後（すなわち、３’スプライシング部位の下流）にある非コード領域を意味する。したがって、「第１のイントロンの配列」とは、スプライシングによって切り出されたイントロン転写配列に対応するゲノム配列を意味する。発現カセットは、第１のイントロン配列全体、または第１のイントロン配列の一部、限定されないが、例えば、第１のイントロンの全長の割合が、限定されないが、第１のイントロンの例えば、１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％などであるものを含んでいてもよい。このように、本開示の発現構築物に存在するｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列の長さは、一部には、ｃ−Ｆｏｓイントロンの供給源（すなわち、第１のイントロン配列が誘導される元となるｃ−Ｆｏｓ遺伝子）に依存して、さまざまであってもよく、限定されないが、例えば、８００ｂｐ以下、７９５ｂｐ以下、７９０ｂｐ以下、７８５ｂｐ以下、７８０ｂｐ以下、７７５ｂｐ以下、７７０ｂｐ以下、７６５ｂｐ以下、７６０ｂｐ以下、７５５ｂｐ以下、７５４ｂｐ以下、７５３ｂｐ以下、７５２ｂｐ以下、７５１ｂｐ以下、７５０ｂｐ以下、７２５ｂｐ以下、７００ｂｐ以下、６７５ｂｐ以下、６５０ｂｐ以下、６２５ｂｐ以下、６００ｂｐ以下、５７５ｂｐ以下、５５０ｂｐ以下、５２５ｂｐ以下、５００ｂｐ以下、４７５ｂｐ以下、４５０ｂｐ以下、４２５ｂｐ以下、４００ｂｐ以下、３７５ｂｐ以下、３５０ｂｐ以下、３２５ｂｐ以下、３００ｂｐ以下、２７５ｂｐ以下、２５０ｂｐ以下、２２５ｂｐ以下、２００ｂｐ以下、１７５ｂｐ以下、１５０ｂｐ以下、１２５ｂｐ以下、１００ｂｐ以下、７５ｂｐ以下、５０ｂｐ以下などを含んでいてもよい。
ある場合には、発現構築物のｃ−Ｆｏｓの第１のイントロンの配列の長さは、２５ｂｐ〜１ｋｂの範囲であってもよく、または１ｋｂより大きくてもよい。例えば、本開示の発現構築物のｃ−Ｆｏｓの第１のイントロンの長さは、例えば、２５ｂｐ〜１０００ｂｐ、２５ｂｐ〜９００ｂｐ、２５ｂｐ〜８００ｂｐ、２５ｂｐ〜７００ｂｐ、２５ｂｐ〜６００ｂｐ、２５ｂｐ〜５００ｂｐ、２５ｂｐ〜４００ｂｐ、２５ｂｐ〜３００ｂｐ、２５ｂｐ〜２００ｂｐ、２５ｂｐ〜１００ｂｐ、５０ｂｐ〜１０００ｂｐ、５０ｂｐ〜９００ｂｐ、５０ｂｐ〜８００ｂｐ、５０ｂｐ〜７００ｂｐ、５０ｂｐ〜６００ｂｐ、５０ｂｐ〜５００ｂｐ、５０ｂｐ〜４００ｂｐ、５０ｂｐ〜３００ｂｐ、５０ｂｐ〜２００ｂｐ、５０ｂｐ〜１００ｂｐ、１００ｂｐ〜１０００ｂｐ、１００ｂｐ〜９００ｂｐ、１００ｂｐ〜８００ｂｐ、１００ｂｐ〜７００ｂｐ、１００ｂｐ〜６００ｂｐ、１００ｂｐ〜５００ｂｐ、１００ｂｐ〜４００ｂｐ、１００ｂｐ〜３００ｂｐ、１００ｂｐ〜２００ｂｐ、２００ｂｐ〜１０００ｂｐ、２００ｂｐ〜９００ｂｐ、２００ｂｐ〜８００ｂｐ、２００ｂｐ〜７００ｂｐ、２００ｂｐ〜６００ｂｐ、２００ｂｐ〜５００ｂｐ、２００ｂｐ〜４００ｂｐ、２００ｂｐ〜３００ｂｐ、３００ｂｐ〜１０００ｂｐ、３００ｂｐ〜９００ｂｐ、３００ｂｐ〜８００ｂｐ、３００ｂｐ〜７００ｂｐ、３００ｂｐ〜６００ｂｐ、３００ｂｐ〜５００ｂｐ、３００ｂｐ〜４００ｂｐ、５００ｂｐ〜１０００ｂｐ、５００ｂｐ〜９００ｂｐ、５００ｂｐ〜８００ｂｐ、５００ｂｐ〜７００ｂｐ、５００ｂｐ〜６００ｂｐなどの範囲であってもよい。ある場合には、発現構築物のｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列は、第１のイントロンの５’スプライシング部位で開始していてもよく、例えば、本明細書に記載の長さを含め、所望の長さだけ続いていてもよい。ある場合には、ｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列は、５’スプライシング部位および／または５’スプライシング部位の１つ以上のヌクレオチド３’、例えば、５’スプライシング部位および３’に隣接する１〜１００ヌクレオチド、限定されないが、例えば、１〜７５ヌクレオチド、１〜５０ヌクレオチド、１〜２５ヌクレオチド、１〜２０ヌクレオチド、１〜１５ヌクレオチド、１〜１０ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチドなどを除外していてもよい。ある場合には、ｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列は、５’スプライシング部位に隣接する配列を含んでいてもよく、ある場合には、５’スプライシング部位を含んでいてもよい。ある場合には、ｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列は、５’スプライシング部位に隣接する配列を除外していてもよく、ある場合には、５’スプライシング部位を除外していてもよい。
ある場合には、本開示の発現構築物の制御配列は、限定されないが、例えば、ｃ−Ｆｏｓ遺伝子の第１のエクソンの全てまたは一部、ｃ−Ｆｏｓ遺伝子の第２のエクソンの全てまたは一部などを含め、ｃ−Ｆｏｓ遺伝子の１つ以上のエクソンの全てまたは一部を含んでいてもよい。ある場合には、ｃ−Ｆｏｓ遺伝子のエクソンの上流および下流の配列を含む制御配列は、エクソンをコードする配列の全てまたは一部を除去するように改変されていてもよく、ｃ−Ｆｏｓエクソンを欠くか、または完全なｃ−Ｆｏｓエクソンを欠く制御配列が得られる。例えば、ある場合には、ｃ−Ｆｏｓ 制御配列は、ｃ−Ｆｏｓ ５’−非コード配列と、ｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列とを含んでいてもよいが、ｃ−Ｆｏｓの第１のエクソンの全てまたは一部が除外されていてもよい。ある場合には、ｃ−Ｆｏｓ制御配列は、ｃ−Ｆｏｓ ５’−非コード配列と、ｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列と、ｃ−Ｆｏｓの第１のエクソンの全てまたは一部とを含んでいてもよい。
本明細書に記載される場合、本開示の発現構築物の制御要素、およびこのような制御要素に付随するか、または隣接する配列は、例えば、エクソンを含め、１つ以上のｃ−Ｆｏｓ遺伝子から誘導されてもよい。本明細書に記載の制御要素を誘導するために有用なｃ−Ｆｏｓ遺伝子としては、全体的に、または部分的に個体から単離され、またはクローニングされ、または個体において同定されるｃ−Ｆｏｓ遺伝子が挙げられ、その例としては、限定されないが、例えば、無脊椎動物ｃ−Ｆｏｓ遺伝子、脊椎動物ｃ−Ｆｏｓ遺伝子、哺乳動物ｃ−Ｆｏｓ遺伝子、げっ歯類ｃ−Ｆｏｓ遺伝子、霊長類ｃ−Ｆｏｓ遺伝子、ウサギｃ−Ｆｏｓ遺伝子、イヌｃ−Ｆｏｓ遺伝子、ネコｃ−Ｆｏｓ遺伝子、有蹄動物ｃ−Ｆｏｓ遺伝子、霊長類ｃ−Ｆｏｓ遺伝子、非ヒト霊長類ｃ−Ｆｏｓ遺伝子、ヒトｃ−Ｆｏｓ遺伝子などが挙げられる。
有用なｃ−Ｆｏｓ遺伝子としては、限定されないが、例えば、染色体１２マップ位置１２ ３９．７ｃＭに存在するＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓからのＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ １４２８１（ＲｅｆＳｅｑ ＮＣ＿００００７８．６）、染色体６マップ位置６ｑ３１に存在するＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓからのＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ ３１４３２２（ＲｅｆＳｅｑ ＮＣ＿００５１０５．４）、染色体１４マップ位置１４ｑ２４．３に存在するＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓからのＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ ２３５３（ＲｅｆＳｅｑ ＮＣ＿００００１４．９）、染色体３Ｒマップ位置３−９９ｃＭに存在するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒからのＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ ３７７２０８２（ＲｅｆＳｅｑ ＮＴ＿０３３７７７．３）、染色体Ｂ３マップ位置に存在するＦｅｌｉｓ ｃａｔｕｓからのＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ ４９３９３５（ＲｅｆＳｅｑ ＮＣ＿０１８７２８．２）、染色体７に存在するＳｕｓ ｓｃｒｏｆａからのＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ １００１４４４８６（ＲｅｆＳｅｑ ＮＣ＿０１０４４９．４）、染色体７に存在するＭａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａからのＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ ７０２０７７（ＲｅｆＳｅｑ ＮＣ＿０２７８９９．１）、染色体１４に存在するＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓからのＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ ４５３０４７（ＲｅｆＳｅｑ ＮＣ＿００６４８１．３）、染色体７に存在するＯｖｉｓ ａｒｉｅｓからのＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ ４４３２１８（ＲｅｆＳｅｑ ＮＣ＿０１９４６４．２）、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓからのＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ ５４８９５４、染色体２４に存在するＯｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓからのＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ １００８２０７１２（ＲｅｆＳｅｑ ＮＣ＿０１９８８２．１）、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓからのＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ ４４７２０１、染色体ＬＧ２１に存在するＰｏｅｃｉｌｉａ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａからのＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ １０３４５７６００（ＲｅｆＳｅｑ ＮＣ＿０２４３５１．１）、Ｉｃｔｉｄｏｍｙｓ ｔｒｉｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔｕｓからのＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ １０１９５９４０７、Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ ａｕｒａｔｕｓからのＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ １０１８３１７２１などが挙げられる。
例えば、ある場合には、制御要素が誘導され得るｃ−Ｆｏｓ遺伝子は、例えば、転写物ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿０１０２３４．２（配列番号２０）からＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０３４３６４．１（配列番号１９）をコードする、例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１４２８１を含め、マウスｃ−Ｆｏｓ遺伝子であってもよい。マウスｃ−Ｆｏｓ遺伝子の例示的な’５−非コード領域配列は、限定されないが、配列番号４で与えられる開始コドンから上流の１．５ｋｂの配列を含む。ある場合には、有用なマウスｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域は、以下の配列を含み、全体で、または一部で、マウスｃ−Ｆｏｓ遺伝子の開始コドンの上流にある７６７ｂｐを表す。
ＧＴＧＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＣＴＴＴＡＧＧＡＡＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＧＡＧＣＣＴＴＴＡＡＧＧＣＴＧＣＧＴＡＣＴＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＡＡＴＡＣＣＡＧＡＧＡＣＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＣＣＣＧＧＧＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧＧＴＣＣＡＣＡＴＴＧＡＡＴＣＡＧＧＴＧＣＧＡＡＴＧＴＴＣＧＣＴＣＧＣＣＴＴＣＴＣＴＧＣＣＴＴＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＧＣＴＧＣＡＣＣＣＴＣＡＧＡＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＴＴＣＣＣＧＴＣＡＡＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＴＴＴＡＣＡＣＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＴＡＴＴＡＧＧＡＣＡＴＣＴＧＣＧＴＣＡＧＣＡＧＧＴＴＴＣＣＡＣＧＧＣＣＧＧＴＣＣＣＴＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＡＴＣＣＴＡＣＡＣＧＣＧＧＡＡＧＧＴＣＴＡＧＧＡＧＡＣＣＣＣＣＴＡＡＧＡＴＣＣＣＡＡＡＴＧＴＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＡＧＧＴＧＡＡＡＧＡＴＧＴＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＧＧＧＧＧＴＴＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＧＴＡＧＡＧＴＴＧＡＣＧＡＣＡＧＡＧＣＧＣＣＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＣＴＴＧＧＧＧＣＧＣＧＣＴＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＣＣＡＧＴＴＣＣＧＣＣＣＡＧＴＧＡＣＧＴＡＧＧＡＡＧＴＣＣＡＴＣＣＡＴＴＣＡＣＡＧＣＧＣＴＴＣＴＡＴＡＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＧＣＧＣＣＴＡＣＴＡＣＴＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＣＴＧＣＡＧＣＧＡＧＣＡＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＣＧＡＡＣＧＡＧＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＧＣＴＣＣＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＣＣＡＧＴＧＴＣＴＡＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＣＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＣＴＴＣＧＡＣＣ（配列番号５）。
ある場合には、本開示の発現構築物のｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域は、配列番号５と１００％の同一性を有する配列を含んでいてもよい。ある場合には、本開示の発現構築物のｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域は、配列番号５に対して１００％未満の同一性を有する配列、限定されないが、例えば、配列番号５に対して９９％以上、９８％以上、９７％以上、９６％以上、９５％以上、９４％以上、９３％以上、９２％以上、９１％以上、９０％以上、８９％以上、８８％以上、８７％以上、８６％以上、８５％以上、８４％以上、８３％以上、８２％以上、８１％以上、８０％以上、７９％以上、７８％以上、７７％以上、７６％以上、７５％以上、７４％以上、７３％以上、７２％以上、７１％以上、７０％以上、６５％以上、６０％以上、５５％以上、５０％以上などの配列同一性を有する配列を含んでいてもよい。
ある場合には、有用なマウスｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域は、以下の配列を含み、全体で、または一部で、マウスｃ−Ｆｏｓ遺伝子の開始コドンの上流にある７６１ｂｐを表す。
ＡＡＧＣＴＴＴＣＣＴＴＴＡＧＧＡＡＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＧＡＧＣＣＴＴＴＡＡＧＧＣＴＧＣＧＴＡＣＴＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＡＡＴＡＣＣＡＧＡＧＡＣＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＣＣＣＧＧＧＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧＧＴＣＣＡＣＡＴＴＧＡＡＴＣＡＧＧＴＧＣＧＡＡＴＧＴＴＣＧＣＴＣＧＣＣＴＴＣＴＣＴＧＣＣＴＴＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＧＣＴＧＣＡＣＣＣＴＣＡＧＡＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＴＴＣＣＣＧＴＣＡＡＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＴＴＴＡＣＡＣＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＴＡＴＴＡＧＧＡＣＡＴＣＴＧＣＧＴＣＡＧＣＡＧＧＴＴＴＣＣＡＣＧＧＣＣＧＧＴＣＣＣＴＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＡＴＣＣＴＡＣＡＣＧＣＧＧＡＡＧＧＴＣＴＡＧＧＡＧＡＣＣＣＣＣＴＡＡＧＡＴＣＣＣＡＡＡＴＧＴＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＡＧＧＴＧＡＡＡＧＡＴＧＴＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＧＧＧＧＧＴＴＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＧＴＡＧＡＧＴＴＧＡＣＧＡＣＡＧＡＧＣＧＣＣＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＣＴＴＧＧＧＧＣＧＣＧＣＴＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＴＣＣＡＧＴＴＣＣＧＣＣＣＡＧＴＧＡＣＧＴＡＧＧＡＡＧＴＣＣＡＴＣＣＡＴＴＣＡＣＡＧＣＧＣＴＴＣＴＡＴＡＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＧＣＧＣＣＴＡＣＴＡＣＴＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＣＴＧＣＡＧＣＧＡＧＣＡＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＣＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＣＧＡＡＣＧＡＧＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＧＣＴＣＣＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＣＣＡＧＴＧＴＣＴＡＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＣＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＣＴＴＣＧＡＣＣ（配列番号１）。
ある場合には、本開示の発現構築物のｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域は、配列番号１と１００％の同一性を有する配列を含んでいてもよい。ある場合には、本開示の発現構築物のｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域は、配列番号１に対して１００％未満の同一性を有する配列、限定されないが、例えば、配列番号１に対して９９％以上、９８％以上、９７％以上、９６％以上、９５％以上、９４％以上、９３％以上、９２％以上、９１％以上、９０％以上、８９％以上、８８％以上、８７％以上、８６％以上、８５％以上、８４％以上、８３％以上、８２％以上、８１％以上、８０％以上、７９％以上、７８％以上、７７％以上、７６％以上、７５％以上、７４％以上、７３％以上、７２％以上、７１％以上、７０％以上、６５％以上、６０％以上、５５％以上、５０％以上などの配列同一性を有する配列を含んでいてもよい。
ある場合には、有用なマウスｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列は、全体で、または一部で、マウスｃ−Ｆｏｓ遺伝子の７５４ｂｐの第１のイントロン配列を表す以下の配列を含む。
ＧＴＧＡＧＴＴＴＧＧＣＴＴＴＧＴＧＴＡＧＣＣＧＣＣＡＧＧＴＣＣＧＣＧＣＴＧＡＧＧＧＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＧＧＧＴＧＴＧＡＣＴＣＧＣＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＧＡＧＡＣＴＧＧＣＧＣＧＧＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＣＴＴＧＴＣＴＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＴＴＧＴＣＡＴＡＧＴＡＡＧＡＣＴＴＡＧＴＧＡＣＣＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＧＴＴＴＡＴＴＣＴＧＡＧＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＧＣＡＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＧＧＣＣＧＡＣＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＧＧＧＧＣＣＡＡＣＡＡＧＴＣＴＣＧＡＧＣＡＡＡＧＡＧＴＣＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＧＧＣＡＡＡＣＣＧＣＧＧＣＡＡＴＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧＴＧＣＴＧＣＧＧＧＣＧＧＧＴＧＴＧＴＡＡＧＧＣＡＧＴＴＴＣＡＴＴＧＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＧＴＴＣＡＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＴＣＣＧＧＡＧＣＡＧＣＧＣＣＴＧＣＧＴＣＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＴＣＡＧＧＧＡＴＡＴＴＴＡＴＡＡＣＡＡＡＣＣＣＣＣＴＴＴＣＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＧＣＣＧＡＡＧＧＧＡＴＡＡＣＧＧＧＡＡＣＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＡＧＧＣＴＧＣＧＣＴＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＧＡＧＧＡＴＡＴＴＧＧＧＡＧＡＧＣＴＴＴＴＡＴＣＴＣＣＧＡＴＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＡＡＧＣＡＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＧＧＡＡＴＧＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＣＧＡＣＡＣＴＡＧＧＧＣＣＡＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＡＡＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＣＴＣＣＧＣＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＣＡＧ（配列番号２）。
ある場合には、本開示の発現構築物のｃ−Ｆｏｓのイントロン配列は、配列番号２と１００％の同一性を有する配列を含んでいてもよい。ある場合には、本開示の発現構築物のイントロン配列は、配列番号２に対して１００％未満の同一性を有する配列、限定されないが、例えば、配列番号２に対して９９％以上、９８％以上、９７％以上、９６％以上、９５％以上、９４％以上、９３％以上、９２％以上、９１％以上、９０％以上、８９％以上、８８％以上、８７％以上、８６％以上、８５％以上、８４％以上、８３％以上、８２％以上、８１％以上、８０％以上、７９％以上、７８％以上、７７％以上、７６％以上、７５％以上、７４％以上、７３％以上、７２％以上、７１％以上、７０％以上、６５％以上、６０％以上、５５％以上、５０％以上などの配列同一性を有する配列を含んでいてもよい。
ある場合には、制御領域は、マウスｃ−Ｆｏｓの第１のエクソンコード配列を含んでいてもよく、全体で、または一部で、例えば、以下のマウスｃ−Ｆｏｓの第１のエクソンコード配列またはその一部を含む。
ＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＣＧＧＧＴＴＴＣＡＡＣＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＧＣＧＴＣＡＴＣＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＡＧＴＡＧＣＧＣＣＴＣＣＣＣＧＧＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＡＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡＧＣＣＧＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＡＴＧＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧ（配列番号３）。
ある場合には、本開示の発現構築物のｃ−Ｆｏｓのエクソン配列は、配列番号３と１００％の同一性を有する配列を含んでいてもよい。ある場合には、本開示の発現構築物のエクソン配列は、配列番号３に対して１００％未満の同一性を有する配列、限定されないが、例えば、配列番号３に対して９９％以上、９８％以上、９７％以上、９６％以上、９５％以上、９４％以上、９３％以上、９２％以上、９１％以上、９０％以上、８９％以上、８８％以上、８７％以上、８６％以上、８５％以上、８４％以上、８３％以上、８２％以上、８１％以上、８０％以上、７９％以上、７８％以上、７７％以上、７６％以上、７５％以上、７４％以上、７３％以上、７２％以上、７１％以上、７０％以上、６５％以上、６０％以上、５５％以上、５０％以上などの配列同一性を有する配列を含んでいてもよい。
ある場合には、本開示の発現構築物の制御領域は、配列番号７で提示されるマウスの５’−非コード領域、マウスの第１のエクソンおよびマウスの第１のイントロン配列を含有する制御領域を含んでいてもよく、この制御領域から本質的になっていてもよく、またはこの制御領域であってもよい。
ある場合には、制御要素が誘導され得るｃ−Ｆｏｓ遺伝子は、例えば、転写物ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００５２５２．３（配列番号２２）からＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００５２４３．１（配列番号２１）をコードする、例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３５３（ＮＧ＿０２９６７３．１）を含むヒトｃ−Ｆｏｓ遺伝子であってもよい。ヒトｃ−Ｆｏｓ遺伝子の例示的な’５−非コード領域は、限定されないが、例えば、配列番号８で与えられる開始コドンから上流の１．５ｋｂの配列を含む。ある場合には、有用なヒトｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域は、以下の配列を含み、全体で、または一部で、ヒトｃ−Ｆｏｓ遺伝子の開始コドンの上流にある７８４ｂｐを表す。
ＧＴＡＧＧＧＧＣＧＣＡＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＡＧＣＣＧＡＧＧＣＴＴＡＡＧＴＣＣＴＣＧＧＧＧＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＧＡＴＧＣＣＧＴＴＴＣＴＣＣＴＡＴＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＣＡＧＡＡＣＴＧＴＣＴＴＣＡＧＴＴＴＣＣＧＴＡＣＡＡＧＧＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＧＣＴＣＴＣＴＧＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＧＡＡＣＡＡＧＧＧＴＣＣＧＣＡＴＴＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＧＡＡＴＧＴＴＣＴＣＴＣＴＣＡＴＴＣＴＧＣＧＣＣＧＴＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＣＣＧＣＡＣＴＧＣＡＣＣＣＴＣＧＧＴＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＣＧＡＧＣＡＧＴＴＣＣＣＧＴＣＡＡＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＣＴＴＡＣＡＣＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＴＡＴＴＡＧＧＡＣＡＴＣＴＧＣＧＴＣＡＧＣＡＧＧＴＴＴＣＣＡＣＧＧＣＣＴＴＴＣＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＡＴＣＣＣＣＧＡＡＡＣＣＣＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＧＧＧＧＣＣＣＡＣＧＡＧＡＣＣＴＣＴＧＡＧＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＣＧＡＡＡＴＧＣＴＣＡＣＧＡＧＡＴＴＡＧＧＡＣＡＣＧＣＧＣＣＡＡＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＡＧＣＴＧＣＧＡＧＣＧＣＴＧＧＧＧＡＣＧＣＡＧＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＡＧＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣＣＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＣＣＴＣＴＧＧＣＧＣＣＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＧＴＴＴＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＡＴＡＡＡＡＣＧＣＴＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＧＴＡＣＴＣＣＡＡＣＣＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡＧＡＡＧＣＣＡＡＧＡＣＴＧＡＧＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＡＧＣＧＡＡＣＧＡＧＣＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＣＣＴＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣＣＡＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＣＣＣＴＣＧＧＣＣＣＣＴＣＧＣＣＣＧＧＣＴＴＴＧＣＣＴＡＡＣＣＧＣＣＡＣＧ（配列番号９）。
ある場合には、本開示の発現構築物のｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域は、配列番号９と１００％の同一性を有する配列を含んでいてもよい。ある場合には、本開示の発現構築物のｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域は、配列番号９に対して１００％未満の同一性を有する配列、限定されないが、例えば、配列番号９に対して９９％以上、９８％以上、９７％以上、９６％以上、９５％以上、９４％以上、９３％以上、９２％以上、９１％以上、９０％以上、８９％以上、８８％以上、８７％以上、８６％以上、８５％以上、８４％以上、８３％以上、８２％以上、８１％以上、８０％以上、７９％以上、７８％以上、７７％以上、７６％以上、７５％以上、７４％以上、７３％以上、７２％以上、７１％以上、７０％以上、６５％以上、６０％以上、５５％以上、５０％以上などの配列同一性を有する配列を含んでいてもよい。
ある場合には、有用なヒトｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列は、全体で、または一部で、ヒトｃ−Ｆｏｓ遺伝子の７５３ｂｐの第１のイントロン配列を表す以下の配列を含む。
ＧＴＡＡＧＧＣＴＧＧＣＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＣＧＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＧＣＴＴＧＧＧＧＴＣＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＧＣＴＣＣＡＧＴＡＧＡＴＧＡＧＴＡＧＧＧＧＧＣＴＣＣＣＴＴＧＴＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＧＧＣＴＧＣＣＧＴＧＧＣＣＧＧＡＧＣＧＧＴＧＣＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＧＣＴＣＧＧＧＡＣＴＴＧＣＴＣＴＧＡＧＣＧＣＡＣＧＣＡＣＧＣＴＴＧＣＣＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＴＴＧＧＴＴＣＣＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＧＴＴＣＧＴＴＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＴＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＧＡＣＧＧＡＴＣＴＣＴＧＡＣＡＴＴＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＡＧＣＡＣＡＡＡＣＴＣＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＣＣＧＧＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＧＣＡＡＴＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＴＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧＴＧＣＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＴＧＴＧＴＡＡＧＧＣＡＧＴＴＴＣＡＴＴＧＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＧＴＴＣＡＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＴＣＣＧＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴＧＣＧＴＣＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＴＣＡＧＧＧＡＴＡＴＴＴＡＴＡＡＣＡＡＡＣＣＣＣＣＴＴＴＣＡＡＧＣＡＡＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＧＧＡＴＡＡＣＧＧＧＡＡＣＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＧＡＴＧＧＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＣＡＣＴＧＣＧＣＴＧＣＧＧＡＡＴＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＧＡＣＣＴＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＡＴＧＡＧＧＧＡＣＡＴＴＴＡＡＧＡＴＧＡＡＡＴＧＴＣＣＧＴＧＧＣＡＧＧＡＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴＴＣＡＣＴＧＣＴＧＣＡＴＧＣＧＧＣＡＣＴＧＧＧＡＡＣＴＣＧＣＣＣＣＡＣＣＴＧＴＧＴＣＣＧＧＡＡＣＣＴＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＧＴＣＧＧＣＴＴＴＣＣＣＣＴＴＣＴＧＴＴＴＴＧＴＴＣＴＡＧ（配列番号１１）。
ある場合には、本開示の発現構築物のｃ−Ｆｏｓのイントロン配列は、配列番号１１と１００％の同一性を有する配列を含んでいてもよい。ある場合には、本開示の発現構築物のイントロン配列は、配列番号１１に対して１００％未満の同一性を有する配列、限定されないが、例えば、配列番号１１に対して９９％以上、９８％以上、９７％以上、９６％以上、９５％以上、９４％以上、９３％以上、９２％以上、９１％以上、９０％以上、８９％以上、８８％以上、８７％以上、８６％以上、８５％以上、８４％以上、８３％以上、８２％以上、８１％以上、８０％以上、７９％以上、７８％以上、７７％以上、７６％以上、７５％以上、７４％以上、７３％以上、７２％以上、７１％以上、７０％以上、６５％以上、６０％以上、５５％以上、５０％以上などの配列同一性を有する配列を含んでいてもよい。
ある場合には、制御領域は、ヒトｃ−Ｆｏｓの第１のエクソンコード配列を含んでいてもよく、全体で、または一部で、例えば、以下のヒトｃ−Ｆｏｓの第１のエクソンコード配列またはその一部を含む。
ＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＣＧＧＧＣＴＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＧＣＧＴＣＡＴＣＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣＧＴＣＣＣＣＧＧＣＣＧＧＧＧＡＴＡＧＣＣＴＣＴＣＴＴＡＣＴＡＣＣＡＣＴＣＡＣＣＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＡＴＧＧＧＣＴＣＧＣＣＴＧＴＣＡＡＣＧＣＧＣＡＧ（配列番号１２）。
ある場合には、本開示の発現構築物のｃ−Ｆｏｓのエクソン配列は、配列番号１２と１００％の同一性を有する配列を含んでいてもよい。ある場合には、本開示の発現構築物のエクソン配列は、配列番号１２に対して１００％未満の同一性を有する配列、限定されないが、例えば、配列番号１２に対して９９％以上、９８％以上、９７％以上、９６％以上、９５％以上、９４％以上、９３％以上、９２％以上、９１％以上、９０％以上、８９％以上、８８％以上、８７％以上、８６％以上、８５％以上、８４％以上、８３％以上、８２％以上、８１％以上、８０％以上、７９％以上、７８％以上、７７％以上、７６％以上、７５％以上、７４％以上、７３％以上、７２％以上、７１％以上、７０％以上、６５％以上、６０％以上、５５％以上、５０％以上などの配列同一性を有する配列を含んでいてもよい。
ある場合には、本開示の発現構築物の制御領域は、配列番号１３で提示されるヒトの５’−非コード領域、ヒトの第１のエクソンおよびヒトの第１のイントロン配列を含有する制御領域を含んでいてもよく、この制御領域から本質的になっていてもよく、またはこの制御領域であってもよい。
ある場合には、制御要素が誘導され得るｃ−Ｆｏｓ遺伝子は、例えば、転写物ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿０２２１９７．２（配列番号２４）からＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０７１５３３．１（配列番号２３）をコードする、例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：３１４３２２を含むラットｃ−Ｆｏｓ遺伝子であってもよい。ラットｃ−Ｆｏｓ遺伝子の例示的な５’−非コード領域は、限定されないが、例えば、配列番号１４で与えられる開始コドンから上流の１．５ｋｂの配列を含む。ある場合には、有用なラットｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域は、以下の配列を含み、全体で、または一部で、ラットｃ−Ｆｏｓ遺伝子の開始コドンの上流にある７７０ｂｐを表す。
ＧＴＧＧＧＣＴＡＧＣＴＴＴＣＣＴＴＴＧＧＧＡＡＣＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＡＧＣＣＴＴＴＡＧＧＧＣＴＧＣＧＴＧＣＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＡＡＴＡＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧＡＡＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＣＣＣＡＧＴＣＴＣＡＴＣＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＧＧＡＡＣＡＧＡＧＴＡＣＡＣＡＴＴＧＡＡＴＣＡＧＧＴＧＣＧＡＡＴＧＴＴＣＧＣＴＣＧＣＣＴＴＣＴＣＴＧＣＣＴＴＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＣＣＣＴＴＧＣＧＣＴＧＣＡＣＣＣＴＣＡＧＡＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＴＴＣＣＣＧＴＣＡＡＴＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣＴＴＴＡＣＡＣＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＴＡＴＴＡＧＧＡＣＡＴＣＴＧＣＧＴＣＡＧＣＡＧＧＴＴＴＣＣＡＣＧＧＣＣＧＧＴＣＣＣＴＧＴＴＧＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＡＣＣＡＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＣＣＴＡＣＡＴＧＣＧＧＡＧＧＧＴＣＣＡＧＧＡＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＡＴＣＣＣＡＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＣＴＣＡＴＡＧＧＴＧＡＡＡＧＴＴＡＣＡＧＡＣＴＧＡＧＡＣＧＧＧＧＧＴＴＧＡＧＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＧＴＡＧＡＧＴＴＧＡＴＧＡＣＡＧＧＧＡＧＣＣＣＧＣＡＧＡＧＧＧＣＡＴＴＣＧＧＧＡＧＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＣＴＣＣＡＧＴＴＴＣＴＣＴＧＴＴＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＴＡＧＴＡＡＧＣＣＡＴＴＣＡＡＧＣＧＣＴＴＣＴＡＴＡＡＡＧＣＧＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＧＣＧＣＣＴＡＣＴＡＣＴＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＴＴＧＣＡＧＣＴＡＧＣＡＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＧＣＧＡＡＣＧＡＧＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＧＣＴＣＣＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＣＣＡＧＴＧＴＣＴＡＣＣＣＣＴＧＧＡＣＣＣＣＴＣＧＣＣＧＡＧＣＴＴＴＧＣＣＣＡＡＡＣＣＡＣＧＡＣＣ（配列番号１５）。
ある場合には、本開示の発現構築物のｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域は、配列番号１５と１００％の同一性を有する配列を含んでいてもよい。ある場合には、本開示の発現構築物のｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域は、配列番号１５に対して１００％未満の同一性を有する配列、限定されないが、例えば、配列番号１５に対して９９％以上、９８％以上、９７％以上、９６％以上、９５％以上、９４％以上、９３％以上、９２％以上、９１％以上、９０％以上、８９％以上、８８％以上、８７％以上、８６％以上、８５％以上、８４％以上、８３％以上、８２％以上、８１％以上、８０％以上、７９％以上、７８％以上、７７％以上、７６％以上、７５％以上、７４％以上、７３％以上、７２％以上、７１％以上、７０％以上、６５％以上、６０％以上、５５％以上、５０％以上などの配列同一性を有する配列を含んでいてもよい。
ある場合には、有用なラットｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列は、全体で、または一部で、ラットｃ−Ｆｏｓ遺伝子の７６０ｂｐの第１のイントロン配列を表す以下の配列を含む。
ＧＧＴＧＡＧＴＴＴＧＧＣＴＴＴＧＴＧＣＡＧＴＣＧＣＣＡＧＧＴＣＣＧＣＧＣＴＧＧＧＧＧＴＣＧＣＣＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＣＡＴＴＧＧＧＧＴＧＴＧＡＣＴＧＴＣＡＧＧＧＡＡＧＡＧＴＡＧＧＧＧＴＣＴＴＣＣＴＴＧＴＴＴＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧＧＡＧＡＣＴＧＧＣＧＣＧＧＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＣＴＡＧＣＣＴＧＧＧＡＡＣＣＣＡＧＧＡＣＴＴＧＴＣＴＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＴＴＧＴＣＡＴＡＣＴＡＡＧＡＣＴＴＡＧＴＧＡＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＧＴＴＴＡＣＴＣＴＧＡＧＴＧＴＣＣＴＧＣＧＣＴＣＴＴＣＴＣＴＣＧＧＴＧＡＣＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＧＧＧＧＣＣＡＡＣＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＣＡＡＡＧＡＣＴＣＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＣＧＧＣＡＡＡＣＧＧＣＧＧＣＡＡＴＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＧＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧＴＧＣＴＧＣＧＡＧＣＣＧＧＴＧＴＧＴＡＡＧＧＣＡＧＴＴＴＣＡＴＴＧＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＧＴＴＣＡＴＴＣＴＧＧＡＧＡＣＴＣＣＧＧＡＧＣＡＧＣＧＣＣＴＧＣＧＴＣＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＴＣＡＧＧＧＡＴＡＴＴＴＡＴＡＡＣＡＡＡＣＣＣＣＣＴＴＴＣＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＧＧＡＴＡＡＣＧＧＧＡＡＣＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＡＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＧＧＡＧＧＡＴＡＧＡＧＧＡＴＡＴＴＧＧＧＡＧＡＣＣＴＴＴＴＴＡＴＣＴＣＧＧＡＴＧＡＡＧＴＧＣＡＴＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣＡＣＡＡＧＣＡＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＡＡＴＧＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＣＧＡＣＡＣＴＡＧＧＧＣＣＡＣＴＴＧＣＴＣＣＡＣＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＡＡＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＣＴＣＣＧＣＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＣＡ（配列番号１６）。
ある場合には、本開示の発現構築物のｃ−Ｆｏｓのイントロン配列は、配列番号１６と１００％の同一性を有する配列を含んでいてもよい。ある場合には、本開示の発現構築物のイントロン配列は、配列番号１６に対して１００％未満の同一性を有する配列、限定されないが、例えば、配列番号１６に対して９９％以上、９８％以上、９７％以上、９６％以上、９５％以上、９４％以上、９３％以上、９２％以上、９１％以上、９０％以上、８９％以上、８８％以上、８７％以上、８６％以上、８５％以上、８４％以上、８３％以上、８２％以上、８１％以上、８０％以上、７９％以上、７８％以上、７７％以上、７６％以上、７５％以上、７４％以上、７３％以上、７２％以上、７１％以上、７０％以上、６５％以上、６０％以上、５５％以上、５０％以上などの配列同一性を有する配列を含んでいてもよい。
ある場合には、制御領域は、ラットｃ−Ｆｏｓの第１のエクソンコード配列を含んでいてもよく、全体で、または一部で、例えば、以下のラットｃ−Ｆｏｓの第１のエクソンコード配列またはその一部を含む。
ＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＣＧＧＧＴＴＴＣＡＡＣＧＣＧＧＡＣＴＡＣＧＡＧＧＣＧＴＣＡＴＣＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＡＧＴＡＧＣＧＣＣＴＣＣＣＣＧＧＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＡＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡＧＣＣＧＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＡＴＧＧＧＣＴＣＣＣＣＴＧＴＣＡＡＣＡＣＡＣＡ（配列番号１７）。
ある場合には、本開示の発現構築物のｃ−Ｆｏｓのエクソン配列は、配列番号１７と１００％の同一性を有する配列を含んでいてもよい。ある場合には、本開示の発現構築物のエクソン配列は、配列番号１７に対して１００％未満の同一性を有する配列、限定されないが、例えば、配列番号１７に対して９９％以上、９８％以上、９７％以上、９６％以上、９５％以上、９４％以上、９３％以上、９２％以上、９１％以上、９０％以上、８９％以上、８８％以上、８７％以上、８６％以上、８５％以上、８４％以上、８３％以上、８２％以上、８１％以上、８０％以上、７９％以上、７８％以上、７７％以上、７６％以上、７５％以上、７４％以上、７３％以上、７２％以上、７１％以上、７０％以上、６５％以上、６０％以上、５５％以上、５０％以上などの配列同一性を有する配列を含んでいてもよい。
ある場合には、本開示の発現構築物の制御領域は、配列番号１８で提示されるラットの５’−非コード領域、ラットの第１のエクソンおよびラットの第１のイントロン配列を含有する制御領域を含んでいてもよく、この制御領域から本質的になっていてもよく、またはこの制御領域であってもよい。
ある場合には、ｃ−Ｆｏｓ 制御領域は、予想ｃ−Ｆｏｓ プロモーターを含有する以下の配列の１つ以上を含んでいてもよい。
ｔｃｃａｔｔｃａｃａｇｃｇｃｔｔｃｔａｔａａａｇｇｃｇｃｃａｇｃｔｇａｇｇｃｇｃｃｔａｃｔａｃｔｃＣＡＡＣＣＧＣＧＡＣＴ（配列番号６、マウス）、
ｔｔｃａｔａａａａｃｇｃｔｔｇｔｔａｔａａａａｇｃａｇｔｇｇｃｔｇｃｇｇｃｇｃｃｔｃｇｔａｃｔｃｃＡＡＣＣＧＣＡＴＣＴＧ（配列番号１０、ヒト）。
本開示の発現構築物の制御領域を構築する際に、適切な場合に、記載される制御配列を組み合わせてもよく、または置換されてもよい。例えば、特定の種（例えば、マウス、ラット、ヒトなど）からの個々の構成要素、またはそのフラグメントを、所望な場合には、全体的に、または部分的に組み合わせてもよい。ある場合には、キメラまたは異種の制御配列を作成するために、異なる種（例えば、マウス、ラット、ヒトなど）からの個々の構成要素、またはそのフラグメントを、所望な場合には、全体的に、または部分的に組み合わせてもよい。さらに、個々の制御要素を、さらに、種々の理由のために、例えば、得られる構築物の全体的な大きさを小さくするために、さらに小さなまたは最小の機能要素に圧縮してもよい。限定されないが、「プロモーターバッシング」、「エンハンサーバッシング」、保存されたドメインを同定するための同種／オーソロガス配列とのインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）比較などを含め、制限要素の最小機能要素を同定するための種々の方法を使用してもよい。
（コードされるポリペプチド）
本明細書に記載される発現カセットの制御領域は、制御領域の活性依存性活性化が、コードされるポリペプチドの発現を引き起こし得るように、１つ以上のポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結していてもよい。制御領域に作動可能に連結する、コードされるポリペプチドは、制御領域と同じ種から誘導されるタンパク質であってもよく、またはコードされるポリペプチドは、制御領域が誘導された種に対して異種であってもよく、すなわち、コードされるポリペプチドは、制御領域とは異なる種から誘導されてもよい。ある場合には、コードされるポリペプチドは、全体的または部分的に合成であってもよく、すなわち、任意の天然に存在するペプチド配列から誘導されていなくてもよい。ある場合には、本明細書に記載される構築物のコードされるポリペプチドは、改変または変異されたポリペプチド、すなわち、天然に存在する形態または野生型形態と比較して、改変または変異されたポリペプチドであってもよい。ある場合には、コードされるポリペプチドは、野生型タンパク質をコードしてもよいが、野生型タンパク質をコードする核酸は、その野生型形態から改変されていてもよく、例えば、コードする配列が、特定の宿主のコドンの使用について最適化されている場合を含め、コードする配列は、特定の宿主における発現について最適化されていてもよい。このように、ある場合には、コードする配列は、「ヒト化」または「マウス化」されていてもよい。哺乳動物および／またはヒトおよび／またはげっ歯類の発現または他の目的のためのさらなる改変は、限定されないが、例えば、小胞体（ＥＲ）移行シグナル、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、細胞トラフィッキングシグナルなどを含め、本明細書に記載するコードされるタンパク質に加えられてもよい。
種々のコードされるポリペプチドは、限定されないが、例えば、光応答性ポリペプチド、分子タグ、カルシウムセンサーまたは電圧センサー、イオンチャンネル、毒性タンパク質、受容体、ヌクレアーゼ、転写因子などを含め、本開示の発現構築物から発現されてもよい。特定のコードされるポリペプチドの選択は、活性依存性発現ベクターおよび／またはこれが使用される方法の最終用途に依存して変わってもよい。主題となるコードされるポリペプチドは、ある場合には、その発現されるタンパク質の形態に従って本明細書に記載されていてもよい。しかし、当業者は、コードする核酸配列を、このような記載から容易に得ることができ、またはこのような記載から容易に誘導することができることを容易に理解する。
ある場合には、本開示のコードされるポリペプチドは、光応答性ポリペプチドであってもよい。本明細書で使用される場合、「光応答性ポリペプチド」との用語は、配座変化を受けることによって、露光に応答してシグナルを伝播する、これらのポリペプチドを指し、限定されないが、例えば、光遺伝学に有用なこれらのタンパク質を含んでいてもよい。（概説としては、例えば、Ｌｅｒｎｅｒ ＆ Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ（２０１６）Ｃｅｌｌ．１６４：１１３６−１１５０；Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ（２０１５）Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８（９）：１２１３−２５；Ｂｕｚｓａｋｉら（２０１５）Ｎｅｕｒｏｎ．８６（１）：９２−１０５．；Ｋａｒｕｎａｒａｔｈｎｅら（２０１５）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１２８（１）：１５−２５；ＭｃＤｅｖｉｔｔら（２０１４）Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒ Ｄｉｓ Ｔｒｅａｔ．１０：１３６９−７９．；Ｓｉｄｏｒら（２０１４）Ｆｒｏｎｔ Ｂｅｈａｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：４１；Ｘｉｅら（２０１３）Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ．３４（１１）：１３８１−５．；Ｗｉｌｌｉａｍｓら（２０１３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１１０（４１）：１６２８７．；Ｔｏｕｒｉｎｏら（２０１３）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２３（３）：４３０−５．；Ａｓｔｏｎ−Ｊｏｎｅｓら（２０１３）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１５１１：１−５．；Ｈａｎら（２０１２）ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３（８）：５７７−８４．；Ｍｅｉら（２０１２）Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．７１（１２）：１０３３−８．；Ｈａｎら（２０１２）Ｐｒｏｇ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１９６：２１５−３３．；Ｚｅｎｇら（２０１２）Ｐｒｏｇ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１９６：１９３−２１３．；Ｄｅｌ Ｂｅｎｅら（２０１２）Ｄｅｖ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．７２（３）：４０４−１４．を参照。これらの開示内容は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。）有用な光応答性ポリペプチドとしては、限定されないが、例えば、オプシン（例えば、脱分極オプシン、過分極オプシンなど）、およびＰＣＴ公開番号第ＷＯ２０１５／０２３７８２号、ＷＯ２０１２／０６１７４４号、ＷＯ２０１２／０６１６８４号およびＷＯ２０１５／１４８９７４号に記載されるポリペプチドが挙げられ、これらの開示内容と、その対応する米国対応出願とは、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。
有用な光応答性ポリペプチドとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる。例えば、ｉＣ＋＋およびＳｗｉＣｈＲ＋＋次世代の操作された塩素伝導チャンネルロドプシン「ｂＲｅａＣｈＥＳ」赤色にシフトした光励起キメラチャンネルロドプシン、塩素伝導チャンネルロドプシンを含むＳｗｉＣｈＲおよびｉＣ１Ｃ２作動電位阻害、赤色にシフトしたキメラオプシンバリアント（例えば、Ｃ１Ｖ１バリアント）、安定化されたステップ関数型オプシン（例えば、安定化されたステップ関数型ＣｈＲ２バリアント）、第二世代の超高速オプトジェネティクス（Ｕｌｔｒａｆａｓｔ Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ）タンパク質（例えば、ｈＣｈＲ２（Ｔ１５９Ｃ）、ｈＣｈＲ２（Ｅ１２３Ｔ／Ｔ１５９Ｃ）、ｈＣｈＲ２（Ｅ１２３Ａ）など）、第三世代のオプトジェネティクス阻害（Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）タンパク質（例えば、操作されたハロロドプシン構築物（例えば、ｅＮｐＨＲ ３．０）、向上した光制御可能なプロトンポンプ（例えば、Ｈ．ｓｏｄｏｍｅｎｓｅ （例えば、Ａｒｃｈ）由来のもの、Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ ｓｐ．ＴＰ００９由来のもの（例えば、ＡｒｃｈＴ）、Ｌ．ｍａｃｕｌａｎｓ由来のもの（例えば、Ｍａｃ）など）、超高速オプトジェネティクス制御（Ｕｌｔｒａｆａｓｔ Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ）タンパク質（例えば、ＣｈＥＴＡ）、細胞内シグナル伝達の光制御のためのタンパク質（例えば、ＧＰＣＲシグナル伝達カスケードの光制御を可能にする、ウシロドプシンおよびアドレナリン作用性Ｇ−タンパク質共役型受容体のキメラ融合体、「Ｏｐｔｏ−ＸＲ」としても知られる）、膜電位において安定な工程を与える双安定の励起ＣｈＲ２点変異体（例えば、ＣｈＲ２（Ｃ１２８Ａ）、ＣｈＲ２（Ｃ１２８Ｓ）など）、野生型チャンネルロドプシン−２（ＣｈＲ２）タンパク質、ＣｈＲ２変異体（ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）、哺乳動物最適化ハロロドプシン（ＮｐＨＲ、「ｅＮｐＨＲ ２．０」としても知られる）、哺乳動物最適化ボルボックスチャンネルロドプシン−１（ＶＣｈＲ１）など。ある場合には、有用な光応答性ポリペプチドとしては、限定されないが、例えば、アミノ酸配列が図１９に与えられているタンパク質および光応答性構築物が挙げられる。
ある場合には、有用な光応答性ポリペプチドは、光応答性ポリペプチドと蛍光タンパク質（限定されないが、例えば、本明細書に記載する蛍光タンパク質を含む）との間に、融合タンパク質を含んでいてもよい。任意の有用な蛍光タンパク質の融合、例えば、チャンネルロドプシン−蛍光タンパク質の融合を使用してもよい。ある場合には、有用な光応答性ポリペプチド蛍光タンパク質融合としては、限定されないが、例えば、ＣｈＲ２−ＥＧＦＰ、ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ、ＣｈＲ２−ＲＦＰなどを含むチャンネルロドプシン−２（ＣｈＲ２）蛍光タンパク質の融合、例えば、本明細書に記載される蛍光タンパク質を含む任意の蛍光タンパク質とのＣｈＲ２融合を含め、チャンネルロドプシン−蛍光タンパク質の融合が挙げられ得る。
ある場合には、本開示のコードされるポリペプチドは、分子タグであってもよい。本明細書で使用される場合、「分子タグ」との用語は、コード配列から発現される、直接的または間接的に検出可能なポリペプチドを指す。このような直接的に検出可能なポリペプチドとしては、限定されないが、例えば、蛍光タンパク質、発色性タンパク質などが挙げられる。間接的に検出可能なポリペプチドとしては、限定されないが、例えば、検出可能な産物を産生するための基質との反応を触媒する酵素、その後に検出される結合相手（例えば、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）など）との結合を介する検出を可能にする親和性タグ、直接的に検出可能な（例えば、抗体に接続する蛍光タグによって）、または間接的に検出可能な（例えば、蛍光標識された二次抗体（すなわち、蛍光二次抗体）の結合によってエピトープに指向する抗体（例えば、抗ＦＬＡＧ、抗Ｖ５、抗Ｍｙｃ、抗ＨＡなど）の結合によって検出を可能にするエピトープタグが挙げられる。
適切な発色性タンパク質としては、限定されないが、例えば、ＤＮＡ２．０から入手可能なもの（Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）、例えば、Ｂｌｉｔｚｅｎ Ｂｌｕｅ、Ｄｒｅｉｄｅｌ Ｔｅａｌ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ Ｖｉｏｌｅｔ、Ｖｉｘｅｎ Ｐｕｒｐｌｅ、Ｐｒａｎｃｅｒ Ｐｕｒｐｌｅ、Ｔｉｎｓｅｌ Ｐｕｒｐｌｅ、Ｍａｃｃａｂｅｅ Ｐｕｒｐｌｅ、Ｄｏｎｎｅｒ Ｍａｇｅｎｔａ、Ｃｕｐｉｄ Ｐｉｎｋ、Ｓｅｒａｐｈｉｎａ Ｐｉｎｋ、Ｓｃｒｏｏｇｅ Ｏｒａｎｇｅ、Ｌｅｏｒ Ｏｒａｎｇｅ、米国特許第８，９７５，０４２号および第９，２９０，５５２号に記載されるもの（これらの開示内容は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる）などが挙げられる。
適切な蛍光タンパク質としては、限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはその改変体、ＧＦＰの青色蛍光改変体（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光改変体（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光改変体（ＹＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、高感度ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｔｏｐａｚ（ＴＹＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＣｙＰｅｔ、ＹＰｅｔ、ｍＫＯ、ＨｃＲｅｄ、ｔ−ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−モノマー、Ｊ−Ｒｅｄ、ダイマー２、ｔ−ダイマー２（１２）、ｍＲＦＰ１、ポシロポリン、Ｒｅｎｉｌｌａ ＧＦＰ、Ｍｏｎｓｔｅｒ ＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅタンパク質およびキンドリングタンパク質、フィコビリタンパク質、およびＢ−フィコエリスリン、Ｒ−フィコエリスリンおよびアロフィコシアニンを含むフィコビリタンパク質コンジュゲートが挙げられる。蛍光タンパク質の他の例としては、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ２、ｍＰｌｕｍ（Ｓｈａｎｅｒら（２００５） Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２：９０５−９０９）などが挙げられる。例えば、Ｍａｔｚら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９−９７３に記載されるような、Ａｎｔｈｏｚｏａｎ種由来の任意の種々の蛍光および着色タンパク質は、使用に適している。
間接的な検出に適した酵素としては、限定されないが、ペルオキシダーゼ（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）などが挙げられる。
ある場合には、本開示のコードされるポリペプチドは、カルシウムセンサーまたは電圧センサーまたはイオンチャンネルであってもよい。イオンチャンネルは、膜タンパク質複合体であり、その機能は、生体膜を通るイオンの拡散を容易にすることである。ニューロンでは、細胞内カルシウムシグナルは、神経伝達物質放出を活性化し、ニューロン機能における変更の引き金として重要な役割をもつ。電位依存性イオンチャンネルは、細菌からヒトまでの種において、電気シグナルを生成し、その電圧検知モジュールは、シナプス入力および他の生理学的刺激に応答する活動電位の開始と緩電位の変化とを担っている。
本明細書に記載の活性依存性制御領域によって引き起こされるコードされるポリペプチドとして有用なイオンチャンネルとしては、限定されないが、例えば、電位依存性イオンチャンネル、リガンド依存性イオンチャンネルなどが挙げられる。有用な電位依存性イオンチャンネルとしては、限定されないが、例えば、カルシウム活性化カリウムチャンネル、ＣａｔＳｐｅｒチャンネルおよびＴｗｏ−Ｐｏｒｅチャンネル、環状ヌクレオチド依存性チャンネル、内向き整流性カリウムチャンネル、リアノジン受容体チャンネル、一過性受容体電位チャンネル、Ｔｗｏ−Ｐカリウムチャンネル、電位依存性イオンチャンネル、電位依存性カリウムチャンネル、電位依存性プロトンチャンネル、電位依存性ナトリウムチャンネルなどが挙げられる。有用なリガンド依存性イオンチャンネルとしては、限定されないが、例えば、５−ＨＴ３受容体、酸検知（プロトン依存性）イオンチャンネル（ＡＳＩＣ）、上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ）、ＧＡＢＡＡ受容体、グリシン受容体、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、ＩＰ３受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、Ｐ２Ｘ受容体、亜鉛活性化イオンチャンネルなどが挙げられる。他のイオンチャンネルとしては、限定されないが、例えば、アクアポリン、カルシウム活性化塩素チャンネル、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子チャンネル、ＣｌＣファミリーチャンネル、コネキシン、パネキシン、マキシ塩素チャンネル、非選択的ナトリウムリークチャンネル、容積感受性チャンネルなどが挙げられる。
本明細書に記載の活性依存性制御領域によって引き起こされる、コードされるポリペプチドとして有用なカルシウムセンサータンパク質としては、限定されないが、例えば、カルモジュリン、カルネキシン、カルレティキュリン、ゲルソリン、ヒポカルシン、ニューロカルシン、リカバリン、ニューロンカルシウムセンサー（ＮＣＳ）タンパク質ファミリーメンバー、Ｃａ2+結合タンパク質（ＣａＢＰ）などが挙げられ得る。
ある場合には、本開示のコードされるポリペプチドは、毒性タンパク質であってもよい。本明細書で使用される「毒性タンパク質」との用語は、一般的に、細胞内で発現すると、細胞の生存率を下げるか、または細胞死を引き起こす任意のタンパク質を指す。したがって、この用語は、細胞を直接的に除去するために使用されるタンパク質（例えば、ジフテリア毒性タンパク質）、および直接的に毒性を誘発しないが、一般的に生存率を下げ得るもの（例えば、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、プロテアーゼなど）を含む。毒性タンパク質は、種々の目的に役立つように、例えば、発現構築物の制御配列の活性依存性活性化が起こったときに、細胞を弱めるか、または除去するか、または激減させるために、宿主細胞内で発現されてもよい。限定されないが、例えば、ジフテリア毒素のＡサブユニット（ＤＴ−Ａ）、リシンＡサブユニットＩＩＩ、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、Ｍ２（Ｈ３７Ａ）毒性イオンチャンネル、Ｅ．ｃｏｌｉニトロレダクターゼ遺伝子（Ｎｔｒ）、カスパーゼ、細胞死遺伝子の発現産物などを含め、適切で適当な毒性タンパク質を、本開示の発現構築物に利用してもよい。
ある場合には、本開示のコードされるポリペプチドは、受容体、例えば、細胞外受容体（例えば、Ｇタンパク質共役型受容体、チロシンおよびヒスチジンキナーゼ受容体、インテグリン、Ｔｏｌｌ依存性およびＴｏｌｌ様の受容体（例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０およびＴＬＲ１１）、リガンド依存性イオンチャンネル、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−２ファミリー受容体、ＩＬ−３ファミリー受容体、ＩＬ−６ファミリー受容体、ＩＬ−１２ファミリー受容体、プロラクチンファミリー受容体、インターフェロンファミリー受容体、ＩＬ−１０ファミリー受容体、Ｉｇ様ＩＬ−１ファミリー受容体、ＩＬ−１７ファミリー受容体など）、または細胞内受容体（例えば、核内受容体（例えば、甲状腺ホルモン受容体、レチノイン酸受容体、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体、Ｒｅｖ−Ｅｒｂ受容体、レチノイン酸関連オーファン、肝臓Ｘ受容体様受容体、ビタミンＤ受容体様受容体、肝細胞核因子−４受容体、レチノイドＸ受容体、精巣受容体、Ｔａｉｌｌｅｓｓ様受容体、ＣＯＵＰ−ＴＦ様受容体、エストロゲン関連受容体、神経成長因子ＩＢ様受容体、Ｆｕｓｈｉ ｔａｒａｚｕ Ｆ１様受容体、胚細胞核内因子受容体、ＤＡＸ様受容体など）、細胞質受容体、ＩＰ３受容体など）であってもよい。
主題となる発現構築物のコードされるポリペプチドとして有用なＧＰＣＲとしては、限定されないが、例えば、５−ヒドロキシトリプタミン受容体、アセチルコリン受容体、アデノシン受容体、アドレナリン受容体、アンギオテンシン受容体、アペリン受容体、胆汁酸受容体、ボンベシン受容体、ブラジキニン受容体、カンナビノイド受容体、ケメリン受容体、ケモカイン受容体、コレシストキニン受容体、クラスＡオーファンＧＰＣＲ、補体ペプチド受容体、ドーパミン受容体、エンドセリン受容体、ホルミルペプチド受容体、遊離脂肪酸受容体、ガラニン受容体、グレリン受容体、糖タンパク質ホルモン受容体、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体、ＧＰＲ１８、ＧＰＲ５５およびＧＰＲ１１９、Ｇタンパク質共役型エストロゲン受容体、ヒスタミン受容体、ヒドロキシカルボン酸受容体、キスペプチン受容体、ロイコトリエン受容体、リゾリン脂質（ＬＰＡ）受容体、リゾリン脂質（Ｓ１Ｐ）受容体、メラニン濃縮ホルモン受容体、メラノコルチン受容体、メラトニン受容体、モチリン受容体、ニューロメディンＵ受容体、ニューロペプチドＦＦ／ニューロペプチドＡＦ受容体、ニューロペプチドＳ受容体、ニューロペプチドＷ／ニューロペプチドＢ受容体、ニューロペプチドＹ受容体、ニューロテンシン受容体、オピオイド受容体、オレキシン受容体、オキソグルタレート受容体、Ｐ２Ｙ受容体、血小板活性化因子受容体、プロキネチシン受容体、プロラクチン放出ペプチド受容体、プロスタノイド受容体、プロテアーゼ活性化受容体、ＱＲＦＰ受容体、レラクシンファミリーペプチド受容体、ソマトスタチン受容体、コハク酸受容体、タキキニン受容体、チロトロピン放出ホルモン受容体、微量アミン受容体、ウロテンシン受容体、バソプレシンおよびオキシトシン受容体、カルシトニン受容体、コルチコトロピン放出因子受容体、グルカゴン受容体ファミリー受容体、副甲状腺ホルモン受容体、ＶＩＰおよびＰＡＣＡＰ受容体、カルシウム感知受容体、クラスＣオーファンＧＰＲＣ受容体、ＧＡＢＡＢ受容体、代謝型グルタミン酸受容体、味覚１受容体、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ＧＰＣＲ、接着ＧＰＣＲなどが挙げられる。
有用な受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）としては、限定されないが、例えば、以下のＲＴＫサブファミリーのものが挙げられる。Ｉ型ＲＴＫ（ＥｒｂＢ（上皮成長因子）受容体ファミリー）、ＩＩ型ＲＴＫ（インスリン受容体ファミリー）、ＩＩＩ型ＲＴＫ（ＰＤＧＦＲ、ＣＳＦＲ、Ｋｉｔ、ＦＬＴ３受容体ファミリー）、ＩＶ型ＲＴＫ（ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）受容体ファミリー）、Ｖ型ＲＴＫ（ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）受容体ファミリー）、ＶＩ型ＲＴＫ（ＰＴＫ７／ＣＣＫ４）、ＶＩＩ型ＲＴＫ（神経栄養因子受容体／Ｔｒｋファミリー）、ＶＩＩＩ型ＲＴＫ（ＲＯＲファミリー）、ＩＸ型ＲＴＫ（ＭｕＳＫ）、Ｘ型ＲＴＫ（ＨＧＦ（幹細胞成長因子）受容体ファミリー）、ＸＩ型ＲＴＫ（ＴＡＭ（ＴＹＲＯ３−、ＡＸＬ−およびＭＥＲ−ＴＫ）受容体ファミリー）、ＸＩＩ型ＲＴＫ（アンジオポエチン受容体のＴＩＥファミリー）、ＸＩＩＩ型ＲＴＫ（エフリン受容体ファミリー）、ＸＩＶ型ＲＴＫ（ＲＥＴ）、ＸＶ型ＲＴＫ（ＲＹＫ）、ＸＶＩ型ＲＴＫ（ＤＤＲ（コラーゲン受容体）ファミリー）、ＸＶＩＩ型ＲＴＫ（ＲＯＳ受容体）、ＸＶＩＩＩ型ＲＴＫ（ＬＭＲファミリー）、ＸＩＸ型ＲＴＫ（白血球チロシンキナーゼ（ＬＴＫ）受容体ファミリー）、ＸＸ型ＲＴＫ（ＳＴＹＫ１）など。
有用なインテグリンとしては、限定されないが、例えば、インテグリンα１β１、インテグリンα２β１、インテグリンαＩＩｂβ３、インテグリンα４β１、インテグリンα４β７、インテグリンα５β１、インテグリンα６β１、インテグリンα１０β１、インテグリンα１１β１、インテグリンαＥβ７、インテグリンαＬβ２およびインテグリンαＶβ３が挙げられる。
有用な受容体としては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリー（ＴＮＲＳＦ）受容体も挙げられ、限定されないが、例えば、ＴＮＦＲ１（腫瘍壊死因子受容体１／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦＲ２（腫瘍壊死因子受容体２／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、リンホトキシンβ受容体／ＴＮＦＲＳＦ３、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、デコイ受容体３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、ＤＲ４（デス受容体４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、ＤＲ５（デス受容体５／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、デコイ受容体１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、デコイ受容体２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＲＡＮＫ（ＮＦ−κＢの受容体活性因子／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、ＯＰＧ（オステオプロテグリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＤＲ３（デス受容体３／ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＴＷＥＡＫ受容体／ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ−Ｒ（ＢＡＦＦ受容体／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、ＨＶＥＭ（ヘルペスウイルスエントリーメディエーター／ＴＮＦＲＳＦ１４）、神経成長因子受容体／ＴＮＦＲＳＦ１６、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原／ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体／ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＴＡＪ（毒性およびＪＮＫ誘発因子／ＴＮＦＲＳＦ１９）、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＤＲ６（デス受容体６／ＴＮＦＲＳＦ２１）、ＴＮＦＲＳＦ２２、ＴＮＦＲＳＦ２３、エクトジスプラシンＡ２アイソフォーム受容体／ＴＮＦＲＳ２７、エクトジスプラシン１、発汗抑制受容体などが挙げられる。
有用な受容体としては、神経伝達物質受容体も挙げられ、限定されないが、例えば、アドレナリン作動性受容体（例えば、α１Ａ、α１ｂ、α１ｃ、α１ｄ、α２ａ、α２ｂ、α２ｃ、α２ｄ、β１、β２、β３など）、ドーパミン作動性受容体（例えば、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５など）、ＧＡＢＡ作動性受容体（例えば、ＧＡＢＡＡ、ＧＡＢＡＢ１ａ、ＧＡＢＡＢ１δ、ＧＡＢＡＢ２、ＧＡＢＡＣなど）、グルタミン作動性受容体（例えば、ＮＭＤＡ、ＡＭＰＡ、カイニン酸、ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ５、ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ７など）、ヒスタミン作動性受容体（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３など）、コリン作動性受容体（例えば、ムスカリン受容体（例えば、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、ニコチン性受容体（例えば、筋肉、ニューロンの受容体（例えば、α−ブンガロトキシン非感受性）、ニューロン受容体（例えば、α−ブンガロトキシン感受性）など）、オピオイド受容体（例えば、μ、δ１、δ２、κなど）、セロトニン作動性受容体（例えば、５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ１Ｄ、５−ＨＴ１Ｅ、５−ＨＴ１Ｆ、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｂ、５−ＨＴ２Ｃ、５−ＨＴ３、５−ＨＴ４、５−ＨＴ５、５−ＨＴ６、５−ＨＴ７など）、グリシン作動性受容体（例えば、グリシンなど）などが挙げられる。
ある場合には、本開示のコードされるポリペプチドは、限定されないが、例えば、他の用途の中でも特に指向性ゲノム改変において有用な部位特異的なヌクレアーゼを含め、ヌクレアーゼであってもよい。適切な部位特異的なヌクレアーゼとしては、限定されないが、ヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質、例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼなどが挙げられる。
有用なＣａｓ９ポリペプチドとしては、限定されないが、例えば、Ｆｏｎｆａｒａら（２０１４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２：２５７７、およびＳａｎｄｅｒおよびＪｏｕｎｇ（２０１４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：３４７に記載されるものが挙げられ、これらの開示内容は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。Ｃａｓ９ポリペプチドは、以下のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９アミノ酸配列に対し、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＤＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＤＹＫＶＰＳＫＫＬＫＧＬＧＮＴＤＲＨＧＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＡＤＳＴＤＫＶＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＲＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＴＬＬＳＤＩＬＲＶＮＳＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＡＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＹＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＤＩＬＫＥＹＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＶＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＲＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＤＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＲＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ（配列番号２５）。
ある場合には、有用なＣａｓ９ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を欠くが、ＤＮＡ標的結合活性は保持しているＣａｓ９バリアントを含む。このようなＣａｓ９バリアントは、本明細書では、「不活性型Ｃａｓ９（ｄｅａｄ Ｃａｓ９）」または「ｄＣａｓ９」と呼ばれる。例えば、Ｑｉら（２０１３）Ｃｅｌｌ １５２：１１７３を参照。ｄＣａｓ９ポリペプチドは、上記の配列番号２５のＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａアミノ酸、または別のＣａｓ９ポリペプチド中の対応するアミノ酸の置換を含んでいてもよい。
ある場合には、有用なＣａｓ９ポリペプチドは、キメラｄＣａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９と融合相手とを含む融合タンパク質であり、適切な融合相手としては、例えば、酵素活性を与える非Ｃａｓ９酵素が挙げられ、酵素活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性である。ある場合には、適切なコードされるＣａｓ９ポリペプチドは、キメラｄＣａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９と融合相手とを含む融合タンパク質であり、適切な融合相手としては、例えば、酵素活性を与える非Ｃａｓ９酵素が挙げられ、酵素活性は、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジンダイマー生成活性、インテグラーゼ活性、トランスポーゼース活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性である。
また、有用なヌクレアーゼは、例えば、Ｍｉｓｈｒａ，ＮＣ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９５；Ｌｉｍ，ＳＭ ＆ Ｌｌｏｙｄ ＲＳ．Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９３に記載されるものを含んでいてもよく、これらの開示内容は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。
ある場合には、有用なコードされるポリペプチドとしては、２つの長いＤＮＡ鎖の間の短いＤＮＡ片の交換を触媒する酵素であるリコンビナーゼが挙げられる。有用なリコンビナーゼとしては、限定されないが、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｆｌｐリコンビナーゼ、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼなどが挙げられ、例えば、Ｌｏｄｉｓｈ Ｈら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．第４版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ；２０００；Ｏｌｏｒｕｎｎｉｊｉら（２０１６）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．４７３（６）：６７３−８４およびＧａｊら（２０１４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１１（１）：１−１５に記載されるリコンビナーゼが挙げられ、これらの開示内容は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。
ある場合には、本開示の活性依存性発現構築物中の有用なリコンビナーゼとしては、Ｃｒｅリコンビナーゼが挙げられる。有用なＣｒｅリコンビナーゼとしては、限定されないが、例えば、以下のアミノ酸配列のプロチンを含有するものおよび／または以下のアミノ酸配列のプロチンから誘導されるものが挙げられる。
ＭＳＮＬＬＴＶＨＱＮＬＰＡＬＰＶＤＡＴＳＤＥＶＲＫＮＬＭＤＭＦＲＤＲＱＡＦＳＥＨＴＷＫＭＬＬＳＶＣＲＳＷＡＡＷＣＫＬＮＮＲＫＷＦＰＡＥＰＥＤＶＲＤＹＬＬＹＬＱＡＲＧＬＡＶＫＴＩＱＱＨＬＧＱＬＮＭＬＨＲＲＳＧＬＰＲＰＳＤＳＮＡＶＳＬＶＭＲＲＩＲＫＥＮＶＤＡＧＥＲＡＫＱＡＬＡＦＥＲＴＤＦＤＱＶＲＳＬＭＥＮＳＤＲＣＱＤＩＲＮＬＡＦＬＧＩＡＹＮＴＬＬＲＩＡＥＩＡＲＩＲＶＫＤＩＳＲＴＤＧＧＲＭＬＩＨＩＧＲＴＫＴＬＶＳＴＡＧＶＥＫＡＬＳＬＧＶＴＫＬＶＥＲＷＩＳＶＳＧＶＡＤＤＰＮＮＹＬＦＣＲＶＲＫＮＧＶＡＡＰＳＡＴＳＱＬＳＴＲＡＬＥＧＩＦＥＡＴＨＲＬＩＹＧＡＫＤＤＳＧＱＲＹＬＡＷＳＧＨＳＡＲＶＧＡＡＲＤＭＡＲＡＧＶＳＩＰＥＩＭＱＡＧＧＷＴＮＶＮＩＶＭＮＹＩＲＮＬＤＳＥＴＧＡＭＶＲＬＬＥＤＧＤ（配列番号２６）。
ある場合には、有用なリコンビナーゼは、条件付きリコンビナーゼであり、限定されないが、例えば、エストロゲン受容体アンタゴニスト（例えば、タモキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）など）によって結合するまで、核の外側にあるリコンビナーゼを捕捉するエストロゲン受容体（ＥＲ）の改変されたリガンド結合ドメインに作動可能に連結するリコンビナーゼを含む（例えば、Ｆｅｉｌら（１９９７）ＢＢＲＳ ２３７：７５２−７５７、この開示内容は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる）。有用なタモキシフェン誘発性リコンビナーゼとしては、限定されないが、例えば、限定されないが、例えば、Ｃｒｅ−ＥＲT （Ｇ５２１Ｒ）、Ｃｒｅ−ＥＲT2、ＥＲT2−Ｃｒｅ−ＥＲT2など、例えば、Ｈａｎｓら（２００９）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４（２）：ｅ４６４０；Ｂｏｎｉｆａｃｅら（２００９）Ｇｅｎｅｓｉｓ ４７（７）：４８４；Ｓｅｉｂｌｅｒら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（４）：ｅ１２（これらの開示内容は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる）に記載されるものを含む、誘発性Ｃｒｅリコンビナーゼが挙げられる。ＥＲT2ドメインは、ヒトエストロゲン受容体のアミノ酸２８２〜５９５から構成されており、３つの変異（Ｇ４００Ｖ／Ｍ５４３Ａ／Ｌ５４４Ａ）を有する。ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０００１１６．２のヒトエストロゲン受容体アイソフォーム１のアミノ酸配列を以下に示す。
ＭＴＭＴＬＨＴＫＡＳＧＭＡＬＬＨＱＩＱＧＮＥＬＥＰＬＮＲＰＱＬＫＩＰＬＥＲＰＬＧＥＶＹＬＤＳＳＫＰＡＶＹＮＹＰＥＧＡＡＹＥＦＮＡＡＡＡＡＮＡＱＶＹＧＱＴＧＬＰＹＧＰＧＳＥＡＡＡＦＧＳＮＧＬＧＧＦＰＰＬＮＳＶＳＰＳＰＬＭＬＬＨＰＰＰＱＬＳＰＦＬＱＰＨＧＱＱＶＰＹＹＬＥＮＥＰＳＧＹＴＶＲＥＡＧＰＰＡＦＹＲＰＮＳＤＮＲＲＱＧＧＲＥＲＬＡＳＴＮＤＫＧＳＭＡＭＥＳＡＫＥＴＲＹＣＡＶＣＮＤＹＡＳＧＹＨＹＧＶＷＳＣＥＧＣＫＡＦＦＫＲＳＩＱＧＨＮＤＹＭＣＰＡＴＮＱＣＴＩＤＫＮＲＲＫＳＣＱＡＣＲＬＲＫＣＹＥＶＧＭＭＫＧＧＩＲＫＤＲＲＧＧＲＭＬＫＨＫＲＱＲＤＤＧＥＧＲＧＥＶＧＳＡＧＤＭＲＡＡＮＬＷＰＳＰＬＭＩＫＲＳＫＫＮＳＬＡＬＳＬＴＡＤＱＭＶＳＡＬＬＤＡＥＰＰＩＬＹＳＥＹＤＰＴＲＰＦＳＥＡＳＭＭＧＬＬＴＮＬＡＤＲＥＬＶＨＭＩＮＷＡＫＲＶＰＧＦＶＤＬＴＬＨＤＱＶＨＬＬＥＣＡＷＬＥＩＬＭＩＧＬＶＷＲＳＭＥＨＰＧＫＬＬＦＡＰＮＬＬＬＤＲＮＱＧＫＣＶＥＧＭＶＥＩＦＤＭＬＬＡＴＳＳＲＦＲＭＭＮＬＱＧＥＥＦＶＣＬＫＳＩＩＬＬＮＳＧＶＹＴＦＬＳＳＴＬＫＳＬＥＥＫＤＨＩＨＲＶＬＤＫＩＴＤＴＬＩＨＬＭＡＫＡＧＬＴＬＱＱＱＨＱＲＬＡＱＬＬＬＩＬＳＨＩＲＨＭＳＮＫＧＭＥＨＬＹＳＭＫＣＫＮＶＶＰＬＹＤＬＬＬＥＭＬＤＡＨＲＬＨＡＰＴＳＲＧＧＡＳＶＥＥＴＤＱＳＨＬＡＴＡＧＳＴＳＳＨＳＬＱＫＹＹＩＴＧＥＡＥＧＦＰＡＴＶ（配列番号２７）。
ある場合には、本開示のコードされるポリペプチドは、転写因子であってもよい。有用な転写因子としては、限定されないが、例えば、ＡＦ−４転写因子、アンドロゲン受容体転写因子、ＡＰ−２転写因子、ＡＲＩＤ転写因子、ｂＨＬＨ転写因子、Ｃ／ＥＢＰ転写因子、ＣＢＦ転写因子、ＣＧ−１転写因子、ＣＯＥ転写因子、ＣＯＵＰ転写因子、ＣＰ２転写因子、ＣＳＤ転写因子、ＣＳＬ転写因子、ＣＴＦ／ＮＦＩ転写因子、ＣＵＴ転写因子、ＤＭ転写因子、Ｅ２Ｆ転写因子、ＥＡＦ２転写因子、Ｅｃｄｙｓｔｄ受容体転写因子、ＥＴＳ転写因子、Ｆｏｒｋヘッド転写因子、ＧＣＭ転写因子、ＧＣＲ転写因子、ＧＴＦ２Ｉ転写因子、ＨＭＧ転写因子、ＨＭＧＩ／ＨＭＧＹ転写因子、ホメオボックス転写因子、ＨＳＦ転写因子、ＨＴＨ転写因子、ＩＲＦ転写因子、ＭＢＤ転写因子、ＭＨ１転写因子、ＭＹＢ転写因子、ＮＤＴ８０／ＰｈｏＧ転写因子、ＮＦ−ＹＡ転写因子、ＮＦ−ＹＢ／Ｃ転写因子、Ｎｒｆ１転写因子、核内オーファン受容体転写因子、エストロゲン受容体転写因子、Ｐ５３転写因子、ＰＡＸ転写因子、ＰＣ４転写因子、ＰＯＵ転写因子、ＰＰＡＲ受容体転写因子、ＰＲＥＢ転写因子、プロゲステロン受容体転写因子、Ｐｒｏｘ１転写因子、レチノイン酸受容体転写因子、ＲＦＸ転写因子、ＲＨＤ転写因子、ＲＯＲ受容体転写因子、Ｒｕｎｔ転写因子、ＳＡＮＤ転写因子、ＳＰＺ１転写因子、ＳＲＦ転写因子、ＳＴＡＴ転写因子、Ｔ−ボックス転写因子、ＴＥＡ転写因子、ＴＦ＿ｂＺＩＰ転写因子、ＴＦ＿Ｏｔｘ転写因子、ＴＨＡＰ転写因子、甲状腺ホルモン受容体転写因子、ＴＳＣ２２転写因子、Ｔｕｂ転写因子、ＺＢＴＢ転写因子、ｚｆ−ＢＥＤ転写因子、ｚｆ−Ｃ２Ｈ２転写因子、ｚｆ−Ｃ２ＨＣ転写因子、ｚｆ−ＧＡＴＡ転写因子、ｚｆ−ＬＩＴＡＦ様転写因子、ｚｆ−ＭＩＺ転写因子、ｚｆ−ＮＦ−Ｘ１転写因子などが挙げられる。
上述のポリペプチドの多くを、種々の有用な用途のために、融合構築物またはバイシストロン構築物のいずれかで組み合わせてもよい。例えば、細胞機能を有する発現されるタンパク質は、タグ化されたタンパク質を発現する細胞を同定するために、蛍光タンパク質（例えば、上述の種々のチャンネルロドプシンについて記載される通り）との融合によってタグ化されてもよい。ある場合には、第１のポリペプチドをコードする配列を、バイシストロニック構築物において、（例えば、フリン−２Ａ配列を含む２Ａ配列（例えば、ブタテスコウイルス−１由来のｐ２Ａ配列、口蹄疫ウイルス由来のＦ２Ａ配列、ウマ鼻炎Ａウイルス配列由来のＥ２Ａ配列、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス由来のＴ２Ａ配列など）の使用によって）第２のポリペプチドをコードする配列と組み合わせ、細胞内に１個の制御領域からなる両ポリペプチドを協働して、しかし別個に産生してもよい。例えば、ある場合には、光遺伝的構築物のバイシストロニック細胞を満たすバリアントを使用してもよく、ここで、この構築物は、蛍光タンパク質をコードする配列に対し、２Ａ（例えば、ｐ２Ａ）によって連結した光応答性ポリペプチドをコードする配列を含む。融合構築物およびバイシストロニック構築物は、これらの具体的に記載されたものに限定されず、適切な場合、上述のコードされるポリペプチドの任意の（例えば、２以上、３以上、４以上などの）組み合わせによって誘導されてもよい。
ある場合には、本開示のコードされるポリペプチドは、付随または接続するＰＥＳＴ配列（すなわち、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）を豊富に含むペプチド配列）を含んでいてもよい。このようなＰＥＳＴ配列は、発現されるポリペプチドの細胞内半減期を減らすために有用である。有用なＰＥＳＴ配列としては、限定されないが、例えば、以下の配列によってコードされるペプチドおよびその変形が挙げられる。
ＡＧＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＣＣＧＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＡＣＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＴＣＴＴＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＧＡＴＧＧＡＣＣＧＴＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＡＧＧＡＴＣＡＡＴＧＴＧ（配列番号２８）。
（ベクター）
本開示は、コードされるポリペプチド配列の活性依存性発現のためのベクターを提供する。このようなベクターとしては、限定されないが、例えば、本明細書に記載の発現構築物を含む、プラスミド（例えば、エピソームベクター、ミニサークルベクターなど）、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスなどが挙げられる。
本開示のベクターは、１つ以上のベクター特異的要素を含んでいてもよく、または除外していてもよい。「ベクター特異的要素」とは、ベクターの構築の前、構築中または構築後および／またはその使用前に、例えば、所望なコードされるポリペプチドの活性依存性発現を誘発する方法において、ベクターの作成、構築、伝播、維持および／またはアッセイに使用される要素を意味する。このようなベクター特異的要素としては、限定されないが、例えば、その使用中にベクターの伝播、クローニングおよび選択に必要なベクター要素が挙げられ、限定されないが、例えば、ベクター骨格、複製起点、マルチプルクローニング部位、原核生物プロモーター、ファージプロモーター、１つ以上の構造タンパク質をコードする配列、１つ以上のエンベロープタンパク質をコードする配列、転写後制御機構、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子、コードされる酵素タンパク質、コードされる蛍光または発色性タンパク質など）などが挙げられ得る。任意の簡便なベクター特異的要素は、適切な場合、本明細書に記載のベクター中での用途が見つかり得る。
ある場合には、有用なベクターは、所望なポリペプチドの活性依存性発現のための第２のベクターの所望なポリペプチドおよび／または構築の活性依存性発現（例えば、クローニング、ウイルス産生など）のための本明細書に記載の活性依存性制御領域を含むプラスミドを含んでいてもよい。このようなプラスミドは、目的のポリペプチドをコードする配列を含んでいてもよく、または含んでいなくてもよい。例えば、ある場合には、有用なプラスミドは、所望のポリペプチドの挿入のために構成されるクローニング部位（例えば、マルチプルクローニング部位、部位特異的な 組換え部位（例えば、ａｔｔ部位など））に隣接する制御領域を含んでいてもよい。ある場合には、有用なプラスミドは、既に、所望なポリペプチドコード配列に作動可能に連結する制御領域を含んでいてもよい。ある場合には、プラスミドベクターは、本明細書に記載するような所望なポリペプチドの活性依存性発現を（例えば、目的の標的細胞へのプラスミドベクターの直接的な形質導入によって）直接的に誘発するために使用されるような構成であってもよい。
ある場合には、プラスミドベクターは、本開示の１つ以上の組換えウイルスベクターを産生するために構成されていてもよく、したがって、本明細書に記載するウイルス構成要素をコードする配列を含んでいてもよい。ある場合には、ウイルスベクターの産生に必要な１つ以上の構成要素は、トランスに与えられてもよく、すなわち、別個のプラスミドによって与えられてもよい。このように、ある場合には、組換えウイルスの産生に必要な構成要素は、限定されないが、例えば、２個のプラスミド、３個のプラスミド、４個のプラスミド、５個のプラスミドなどを含め、２個以上のプラスミドに分けられていてもよい。
ある場合には、所望なポリペプチドの制御領域によって制御される活性依存性発現にとって有用なベクターは、組換えウイルスベクターを含め、ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターは、一般的に、目的の１つ以上のポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結する制御領域を含有する組換えウイルスゲノムを含む。
有用なウイルスベクターとしては、限定されないが、例えば、レンチウイルスベクター、ＨＳＶベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどが挙げられる。有用なレンチウイルスベクターとしては、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶおよびＥＩＡＶから誘導されるものが挙げられる。レンチウイルスは、限定されないが、ＶＳＶ、狂犬病、Ｍｏ−ＭＬＶ、バキュロウイルスおよびエボラを含む他のウイルスのエンベロープタンパク質を含む偽型であってもよい。このようなベクターは、当該技術分野の標準的な方法を用いて調製されてもよい。
ある場合には、ベクターは、組換えＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、感染する細胞のゲノムに安定に部位特異的な様式で組み込むことができる比較的小さなＤＮＡウイルスである。ＡＡＶベクターは、細胞の成長、形態または分化に顕著な影響を誘発することなく、広いスペクトルの細胞に感染することができる。ＡＡＶゲノムは、クローニングされ、配列決定され、特性決定された。ＡＡＶゲノムは、約４７００塩基を包含し、それぞれの末端に約１４５塩基の逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域を含み、ウイルスの複製起点として役立つ。ゲノムの残りの部分は、カプシド形成機能を有する、ウイルス複製およびウイルス遺伝子の発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含む、ゲノムの左手の部分と、ウイルスのカプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含む、ゲノムの右手の部分との２つの本質的な領域に分けられる。
ＡＡＶベクターは、当該技術分野の標準的な方法を用いて調製されてもよい。任意の血清型を有するアデノ随伴ウイルスが適している。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗ、「Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ」のｐｐ．１６５−１７４、Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ編集（１９８８）；Ｒｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１，１９７４；Ｐ．Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ、「Ｔｈｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｔａｘｏｎｏｍｙ」 ｉｎ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｊ Ｒ Ｋｅｒｒ、Ｓ Ｆ Ｃｏｔｍｏｒｅ．Ｍ Ｅ Ｂｌｏｏｍ、Ｒ Ｍ Ｌｉｎｄｅｎ、Ｃ Ｒ Ｐａｒｒｉｓｈ編集）ｐ５−１４、Ｈｕｄｄｅｒ Ａｒｎｏｌｄ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ（２００６）；およびＤ Ｅ Ｂｏｗｌｅｓ、Ｊ Ｅ Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ、Ｒ Ｊ Ｓａｍｕｌｓｋｉ、「Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ」（Ｊ Ｒ Ｋｅｒｒ、Ｓ Ｆ Ｃｏｔｍｏｒｅ．Ｍ Ｅ Ｂｌｏｏｍ、Ｒ Ｍ Ｌｉｎｄｅｎ、Ｃ Ｒ Ｐａｒｒｉｓｈ編集）ｐ１５−２３、Ｈｕｄｄｅｒ Ａｒｎｏｌｄ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ（２００６）を参照。これらの開示内容は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。）ベクターを精製するための方法は、例えば、米国特許第６，５６６，１１８号、第６，９８９，２６４号および第６９９５００６号、国際特許出願公開第ＷＯ／１９９９／０１１７６４号の名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｈｉｇｈ Ｔｉｔｅｒ Ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ」に見出すことができ、これらの開示内容は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。ハイブリッドベクターの調製は、例えば、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２７０９１号に記載されており、その開示内容は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。インビトロおよびインビボで遺伝子を移動させるためのＡＡＶから誘導されるベクターの使用が記載されている（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ ９１／１８０８８号および第ＷＯ ９３／０９２３９号；米国特許第４，７９７，３６８号、第６，５９６，５３５号および第５，１３９，９４１号；および欧州特許第０４８８５２８号を参照。これら全てが、その全体が本明細書に参考として組み込まれる）。これらの刊行物は、ｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子が欠失しており、目的の遺伝子で置き換わっている種々のＡＡＶから誘導される構築物と、目的の遺伝子をインビトロで（培養した細胞内に）またはインビボで（有機体に直接）移動させるためのこれらの構築物との使用を記載する。本発明の複製欠損組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶに挿入された末端逆位配列（ＩＴＲ）領域によってフランキングされた目的の核酸配列を含有するプラスミドと、ＡＡＶカプシド形成遺伝子（ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子）を有するプラスミドとを、ヒトヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）に感染する細胞株に同時に形質導入することによって、調製することができる。次いで、産生されるＡＡＶ組換え体は、標準的な技術によって精製される。
ある場合には、本明細書に記載されるような発現構築物にとって有用なＡＡＶベクターとしては、ウイルス粒子内でカプシドに包まれたもの（例えば、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５およびＡＡＶ１６を含め、ＡＡＶウイルス粒子）が挙げられる。したがって、本開示は、本明細書に記載のいずれかのベクターを含む組換えウイルス粒子（組換えポリヌクレオチドを含むため、組換え体）を含む。このような粒子を製造する方法は、当該技術分野で知られており、米国特許第６，５９６，５３５号に記載される。
利用されるベクターの種類（例えば、ベクターがプラスミドであるか、またはウイルスベクターであるか）、ベクターの所望な使用に応じて、本明細書に記載されるベクターは、種々の構成で、適切な容器および／または培地で使用するために配合されてもよい。例えば、ある場合には、例えば、主題となるベクターがプラスミドである場合には、ベクターは、乾燥（例えば、凍結乾燥した）形態で、または適切な溶液、例えば、水またはバッファーまたは培地の溶液で配合されてもよい。ある場合には、ベクター（例えば、ウイルスベクターを含む）は、すぐに使用可能なフォーマットで与えられてもよく、例えば、ベクターが、すぐに使用可能なフォーマットで配合されたＡＡＶ組換えベクターである場合には、例えば、直接塗布または注射のために構成されてもよい。
（方法）
本開示は、コードされるポリペプチドの活性依存性発現のための方法を提供する。本開示の方法は、本明細書に記載の発現構築物のうち１つ以上を利用してもよく、一般的に、標的細胞と、例えば、発現構築物が発現ベクターの中にあるものを含め、主題となる発現構築物のうち１つ以上とを接触させることを含む。発現構築物と接触させた標的細胞の制御領域の活性依存性活性化が起こると、標的は、制御領域に作動可能に連結するコードする配列によってコードされるポリペプチドを発現する。
「活性依存性活性化」との用語は、特に、本明細書に記載されるような制御領域の活性化に関する場合には、主題となる制御領域を誘発または活性化するために十分な標的細胞に対する外部からの入力または刺激に起因する標的細胞の活性化の変化を指す。例えば、ｃ−Ｆｏｓ制御領域の活性依存性活性化は、標的細胞に対する、ｃ−Ｆｏｓ制御領域を活性化するために十分な任意の入力または刺激を含んでいてもよい。
ある場合には、例えば、標的細胞がニューロンである場合、ｃ−Ｆｏｓ制御領域活性化にとって十分な刺激は、限定されないが、例えば、シナプス活性化、電気生理学的活性化などを含め、ニューロン活性化を含んでいてもよい。ある場合には、ニューロン活性化は、例えば、ニューロンの電気的刺激によって活動電位を誘発することによって、電気的に誘発されてもよい。ある場合には、ニューロン活性化は、挙動によって誘発されてもよく、例えば、主題となるニューロンを含有する有機体に、ニューロンを活性化する特定の挙動を行わせるか、または受けさせる。有用な挙動による刺激としては、限定されないが、例えば、音の刺激、視覚刺激、嗅覚刺激、回避／痛み（例えば、ショック、熱、冷温など）による刺激、味覚刺激など）が挙げられる。ある場合には、ニューロン活性化は、例えば、ニューロンと、薬理作用がある薬剤（例えば、中毒性および／または乱用薬物、例えば、アルコール、クラブドラッグ（例えば、ＧＨＢ、ＬＳＤ、ＭＤＭＡ、ケタミン、メタンフェタミン、ロヒプノールなど）、コカイン、幻覚剤（例えば、ＬＳＤ、ケタミン、ＰＣＰ、サルビアなど）、吸入剤（すなわち、精神活性のある揮発性物質）、マリファナ、オピオイド（ヘロイン、ヒドロコドン、フェンタニル、オキシコドン、プロポキシフェン、ヒドロモルホン、メペリジン、ジフェノキシレートなど）、中枢神経系抑制薬（例えば、ペントバルビタールナトリウム、ジアゼパム、アルプラゾラムなど）、ニューロンを刺激する興奮剤（例えば、デキストロアンフェタミン、メチルフェニデート、アンフェタミンなど）、合成カンナビノイド、合成カチノン、ニコチンなど）とを接触させることによって、または主題となるニューロンを含む有機体に投与することによって、薬理学的に誘発されてもよい。
ある場合には、ｃ−Ｆｏｓ制御領域の活性化は、ニューロン細胞および非ニューロン細胞を含む細胞と、ｃ−Ｆｏｓ誘発剤とを接触させることを含んでいてもよい。有用なｃ−Ｆｏｓ誘発剤としては、限定されないが、例えば、血清、成長因子（例えば、ＰＤＧＦ）、リゾホスファチジン酸、Ｇタンパク質などが挙げられる。また、ｃ−Ｆｏｓ誘発剤としては、ｃ−Ｆｏｓ制御領域中に存在する要素を活性化するタンパク質、ペプチドおよび／または低分子が挙げられ、限定されないが、例えば、カルシウム環状ＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）誘発剤、血清応答要素（ＳＲＥ）誘発剤、ｃ−ｓｉｓ−血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）誘発性の因子要素（ＳＩＥ）誘発剤などが挙げられる。
本明細書に記載される方法は、インビトロまたはインビボで行われてもよい。例えば、ある場合には、ニューロン細胞型および非ニューロン細胞型を含む主題となる標的細胞を、本明細書に記載の発現ベクターとインビトロで接触させ、その後に、例えば、薬理学的に、電気化学的に刺激し、ｃ−Ｆｏｓ 制御領域の活性依存性活性化を誘発してもよい。ある場合には、活性化されたｃ−Ｆｏｓ制御領域を有する細胞は、本明細書では「活性化された細胞」と呼ばれてもよく、他の場合には、活性化された細胞は、活性化する刺激を受けた標的細胞と呼ばれてもよい。
ある場合には、ニューロン細胞型および非ニューロン細胞型を含む主題となる標的細胞を、本明細書に記載するように、例えば、発現ベクターを、この細胞を含む有機体に投与することによって、発現ベクターとインビボで接触させてもよい。例えば、プラスミドの形質導入のために一般的に使用される方法（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、微粒子銃照射など）、組換えウイルスの感染のために一般的に使用される方法（例えば、注射、エアロゾル送達など）を含め、発現ベクターをインビボで投与する任意の従来の方法を利用してもよい。ある場合には、主題となる発現ベクターを宿主有機体に送達した後、宿主有機体は、限定されないが、例えば、薬理学的刺激、電気刺激、物理的な（例えば、触る、痛みなど）刺激、視覚的な刺激、音の刺激、嗅覚刺激、味覚刺激、行動刺激などを含め、発現ベクターのｃ−Ｆｏｓ制御領域を活性化するために十分な刺激にさらされてもよい。
ある場合には、その方法がインビトロで行われるか、またはインビボで行われるかによらず、主題となる細胞を、活性依存性活性化が可能な条件で維持してもよい。「活性依存性活性化が可能な」とは、細胞が、ある状態に維持され、本明細書に記載の発現構築物にさらされるか、または本明細書に記載の発現構築物に感染すると、細胞が、発現構築物の制御領域を活性化するために十分な刺激に応答することができるようになることを意味する。例えば、この方法がインビトロで行われる場合には、活性依存性活性化が可能な条件に細胞を維持することは、限定されないが、例えば、特定の細胞型にとって確立された培養条件で細胞を培養すること（例えば、細胞の生存率を維持するために十分な培地、温度、ＣＯ2 などを与えること）を含んでいてもよい。この方法がインビボで行われる場合には、活性依存性活性化が可能な条件に細胞を維持することは、限定されないが、宿主有機体の生存率を維持するために十分な環境条件で、この細胞を含む有機体を維持することを含んでいてもよい。活性依存性活性化が可能な条件は、細胞またはこの細胞を含む有機体が、細胞、またはこの細胞を含む有機体は、細胞を活性化するために与えられる刺激を誘発する制限領域に応答することができるような構成であることでもある。
本開示の方法は、本明細書に記載する活性依存性発現構築物を用い、活性化された細胞の活性依存性標識のための方法を含む。例えば、ある場合には、細胞を、活性依存性標識のために構成される発現構築物と接触させ、その後、活性化させ、細胞を標識してもよい。
活性依存性標識に有用な構築物とは、限定されないが、例えば、活性依存性制御領域の制御下で分子タグを発現する構築物が挙げられる。例えば、活性依存性制御領域の制御下で、刺激にさらされると、制御領域が活性化され、蛍光タンパク質が発現されることによって細胞を標識するように、細胞を、蛍光タンパク質を含む発現構築物と接触させてもよい。ある場合には、例えば、分解シグナル、例えば、分子タグとの作動可能な連結におけるＰＥＳＴ配列を発現することによって、分子タグの蓄積が制御される。
活性依存性標識に有用な構築物とは、限定されないが、例えば、活性依存性制御領域の制御下でリコンビナーゼを発現する構築物が挙げられる。例えば、活性依存性制御領域の制御下で、刺激にさらされると、制御領域が活性化され、リコンビナーゼが細胞内の遺伝子要素を組換えることによって細胞を標識するように、細胞を、リコンビナーゼを含む発現構築物と接触させてもよい。ある場合には、細胞は、組換え前には発現しない分子タグ配列を含むように構成され、組み換えた後は、分子タグが発現する。ある場合には、細胞は、組換え前には発現する分子タグ配列を含むように構成され、組み換えた後は、分子タグが発現しない。活性依存性に発現するリコンビナーゼによる、主題となる細胞内での分子タグの発現のトグリングは、種々の様式によって例えば、分子タグの部位のその後の組換えが発現するように、分子タグをコードする配列に隣接する遺伝子停止部分を、組換え部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）でフランキングすることによって、分子タグの部位のその後の組換えがもはや発現しないように、分子タグを、組換え部位でフランキングすることによって、達成されてもよい。組換え事象による標的細胞の標識は、ある場合には、標的細胞の長時間にわたる標識（例えば、ｃ−Ｆｏｓ制御領域がもはや活性ではなくなった後でさえ、標識の連続的な発現を含む）を可能にする。
ある場合には、本明細書に記載の方法は、条件付きレポーターマウスと、活性依存性発現ベクターとを接触させることを含んでいてもよい。有用な条件付きレポーターマウス（例えば、リコンビナーゼが発現すると、レポーターの発現のトグリングが可能になる「ｆｌｏｘｅｄ」対立遺伝子を含むマウス）としては、限定されないが、Ｂ６；１２９Ｓ６−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒtm14(CAG-tdTomato)Hze／Ｊ（ａ．ｋ．ａ．Ａｉ１４）マウス、Ｂ６；１２９Ｓ４−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒtm3(CAG-tdTomato,-EGFP*)Zjh／Ｊマウス、Ｂ６；１２９Ｓ４−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒtm4(CAG-mOrange2,-EGFP,mKate2)Zjh ／Ｊマウス、Ｂ６．Ｃｇ−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒtm9(CAG-tdTomato)Hze／Ｊ（ａ．ｋ．ａ．Ａｉ９）マウス、Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒtm1(CAG-Brainbow2.1)Cle／Ｊマウスなどが挙げられる。
リコンビナーゼの活性依存性発現は、細胞標識以外の目的のために行われてもよく、このような目的は、非常に多様であってもよい。種々の遺伝子は、自己遺伝子および異種遺伝子の両方とも、本明細書に記載するリコンビナーゼの活性依存性発現によって、細胞活性に応答して活性化および／または不活性化されてもよい。例えば、任意の従来の条件付き（例えば、「ｆｌｏｘｅｄ」）げっ歯類株を、本明細書に記載の方法に従って、条件付き対立遺伝子の活性依存性制御に使用してもよい。有用なマウス条件付きマウス株としては限定されないが、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を条件付きで発現するもの（例えば、Ｂ６；１２９−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒtm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh ／Ｊなど）、条件付きのアブレーションを可能にする構成要素を条件付きで発現するもの（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒtm1(HBEGF)Awai ／Ｊなど）、神経系遺伝子を条件付きで発現するもの（例えば、Ｂ６；ＳＪＬ−Ｎｌｇｎ２tm1.1Sud ／Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ−Ｔｇ（Ｎｐｙ−ＥＧＦＰ／ＲＮＡｉ：Ｇａｄ１）１Ｍｉｒｎ／Ｊ、１２９−Ｄａｇ１tm2Kcam ／Ｊ、Ｂ６（Ｃｇ）−Ｓｙｄｅ１tm1c(EUCOMM)Hmgu／ＳｃｈｅｉＪなど）などが挙げられる。
ある場合には、ニューロンの活性依存性標識にとって十分な活性依存性発現構築物を発現する有機体を使用し、ニューロン（例えば、所望な、または望ましくない生物学的機能または挙動に関連する特定のニューロン）を活性化するために十分な刺激を同定してもよい。例えば、細胞活性レポーターを発現するニューロンが、種々の刺激にさらされてもよく、ニューロン活性化がスクリーニングされてもよい。このような様式では、多くの化合物が、本明細書に記載する活性依存性受容体を発現する細胞および／または動物（例えば、ラットまたはマウス）の使用によって、ニューロンを一般的に活性化する際、または特定のニューロンの活性化の際の役割についてスクリーニングされてもよい。薬理化合物のスクリーニングに加え、他の刺激（例えば、本明細書に記載するものを含む）を、一般的にニューロンに対する、または個々のニューロンの特定のセットまたは個々のニューロンに対する活性化の影響についてスクリーニングすることができる。
本開示の方法は、本明細書に記載する活性依存性発現構築物を用い、活性化された細胞の活性依存性制御のための方法を含む。例えば、ある場合には、細胞を、活性依存性標識のために構成される発現構築物と接触させ、その後、活性化させ、細胞を制御してもよい。
活性依存性制御に有用な構築物とは、限定されないが、例えば、活性依存性制御領域の制御下で光応答性ポリペプチドを発現する構築物が挙げられる。例えば、活性依存性制御領域の制御下で、刺激にさらされると、制御領域が活性化され、チャンネルロドプシンタンパク質が発現されることによって、細胞をその後の露光によって制御することができるように、細胞を、チャンネルロドプシンを含む発現構築物と接触させてもよい。ある場合には、例えば、分解シグナル、例えば、光応答性ポリペプチドとの作動可能な連結におけるＰＥＳＴ配列を発現することによって、発現される光応答性ポリペプチドの蓄積が制御される。
活性化された細胞の光を介する制御にとって有用な光応答性ポリペプチドとしては、限定されないが、本明細書に記載の光応答性ポリペプチドが挙げられる。ある場合には、主題となる細胞を刺激にさらすことによってｃ−Ｆｏｓ制御領域を活性化した後、活性化された細胞において、光応答性ポリペプチドが発現され、光にさらされると、細胞の過分極が可能になる。ある場合には、主題となる細胞を刺激にさらすことによってｃ−Ｆｏｓ制御領域を活性化した後、活性化された細胞において、光応答性ポリペプチドが発現され、光にさらされると、細胞の脱分極が可能になる。
ある場合には、主題となる方法は、光応答性ポリペプチドが、活性依存性の様式で発現される場合、特定の刺激に応答して活性化される全てのニューロンについて条件付き制御を可能にする。したがって、ある場合には、薬理学的刺激に応答して活性化されるニューロンの全てまたは大部分が、本明細書に記載の方法に従って露光すると、再活性化されてもよく、または不活性化されてもよい。ある場合には、行動刺激に応答して活性化されるニューロンの全てまたは大部分が、本明細書に記載の方法に従って露光すると、再活性化されてもよく、または不活性化されてもよい。限定されないが、例えば、光ファイバー光、レーザー、蛍光、白色光など、活性化された細胞を光にさらす簡便で適切な方法を使用してもよく、ここで、光は、広帯域の波長を有していてもよく、または制限された帯域の波長、または本質的に１つの波長を有していてもよい。
ある場合には、活性依存性標識のための方法を、活性依存性制御のための方法と組み合わせてもよい。例えば、ある場合には、１つの活性依存性制御領域を使用し、分子タグおよび光応答性ポリペプチドの両方の発現を引き起こし、活性化が起こると、活性細胞は、標識され、かつ、制御可能であってもよい。ある場合には、２つの別個の活性依存性制御領域を使用し（２つの別個の発現カセットおよび／または２つの別個の発現ベクターを使用する場合を含む）、分子タグと光応答性ペプチドとの発現を引き起こしてもよく、活性化が起こると、活性細胞は、標識され、かつ、制御可能であってもよい。主題となる発現構築物とベクターの種々の組み合わせを、活性依存性の様式で標的細胞を標識および／または制御および／または改変するために記載される方法に使用してもよい。
発現構築物および／または発現ベクターのこのような組み合わせは、系（例えば、発現系）として本明細書に記載されてもよく、系は、２つ以上の異なる発現構築物またはベクターを含んでいてもよい。系の２つの構築物またはベクターが、例えば、活性化された細胞を効率的に制御することができるように、活性化された細胞を効率的に標識することができるように、活性化された細胞を同時に制御し、標識することができるように、活性化された細胞を効率的に調整することができるようになど、特定の目的に役立つように協働するように構成されていてもよい。
主題となる方法の標的細胞は、本明細書に記載される活性依存性発現の所望な目的に応じて変わる。ある場合には、細胞は、哺乳動物細胞である。ある場合には、細胞は、ヒト細胞である。ある場合には、細胞は、非ヒト霊長類細胞である。ある場合には、細胞は、げっ歯類細胞である。ある場合には、細胞は、マウス細胞である。ある場合には、細胞は、ラット細胞である。
適切な細胞としては、網膜細胞（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ細胞、神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極細胞、および杆体錐体を含む光受容体細胞、Ｍｕｌｌｅｒグリア細胞および網膜色素上皮）、神経細胞（例えば、視床、感覚皮質、不確帯（ＺＩ）、腹部被蓋野（ＶＴＡ）、前頭前皮質（ＰＦＣ）、側坐核（ＮＡｃ）、扁桃体（ＢＬＡ）、黒質、腹部淡蒼球、淡蒼球、背面線条体、腹部線条体、視床下核、海馬、歯状回、帯状回、内嗅皮質、嗅覚皮質、一次運動野または小脳の細胞）、肝細胞、腎細胞、免疫細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、肺細胞などが挙げられる。
適切な細胞としては、幹細胞（例えば、胚幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚細胞（例えば、卵母細胞、精液、卵原細胞、精原細胞など）、体細胞、例えば、線維芽細胞、乏突起膠細胞、グリア細胞、造血細胞、ニューロン、筋肉細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞などが挙げられる。
適切な細胞としては、ヒト胚幹細胞、胎児心筋細胞、筋線維芽細胞、間葉幹細胞、自己移植され拡張された心筋細胞、含脂肪細胞、分化全能性細胞、多能性細胞、血液幹細胞、筋芽細胞、成人幹細胞、骨髄細胞、間葉系細胞、胚幹細胞、実質細胞、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、外因性細胞、内因性細胞、幹細胞、造血幹細胞、骨髄由来前駆細胞、心筋細胞、骨格細胞、胎児細胞、未分化細胞、多能性前駆細胞、分化単能前駆細胞、単球、心筋芽細胞、骨格芽細胞、マクロファージ、毛細管内皮細胞、異種細胞、同種異系細胞および出産後幹細胞が挙げられる。
ある場合には、細胞は、免疫細胞、ニューロン、上皮細胞および内皮細胞または幹細胞である。ある場合には、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞またはマクロファージである。ある場合には、免疫細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。ある場合には、免疫細胞は、ヘルパーＴ細胞である。ある場合には、免疫細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。
ある場合には、細胞は、幹細胞である。ある場合には、細胞は、人工多能性幹細胞である。ある場合には、細胞は、間葉系幹細胞である。ある場合には、細胞は、造血幹細胞である。ある場合には、細胞は、成体幹細胞である。
適切な細胞としては、気管支肺胞上皮幹細胞（ＢＡＳＣ）、バルジ上皮幹細胞（ｂＥＳＣ）、角膜上皮幹細胞（ＣＥＳＣ）、心筋幹細胞（ＣＳＣ）、表皮神経冠幹細胞（ｅＮＣＳＣ）、胚幹細胞（ＥＳＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、肝臓オーバル細胞（ＨＯＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ケラチノサイト幹細胞（ＫＳＣ）、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、ニューロン幹細胞（ＮＳＣ）、膵臓幹細胞（ＰＳＣ）、網膜幹細胞（ＲＳＣｓ）および皮膚由来前駆体（ＳＫＰ）が挙げられる。
ある場合には、幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）であり、その転写因子は、ＨＳＣの分化を誘発し、赤血球細胞、血小板、リンパ球、単球、好中球、好塩基球または好酸球へと分化する。ある場合には、幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であり、転写因子は、ＭＳＣから、骨、軟骨、平滑筋、腱、靱帯、間質、骨髄、真皮または脂肪の細胞などの結合組織細胞への分化を誘発する。
ある場合には、細胞は、癌細胞である。ある場合には、癌細胞は、癌腫の癌細胞、肉腫の癌細胞、リンパ腫の癌細胞、胚細胞腫瘍の癌細胞、芽細胞腫の癌細胞などである。
（本開示の非限定的な態様の例）
上述の本主題の態様は、実施形態を含め、単独で、または１つ以上の他の態様または実施形態と組み合わせて有益であり得る。上の記載に限定されないが、本開示の特定の非限定的な態様を、以下に１〜４９の番号を付けて提供する。本開示を読めば当業者には明らかであるが、個々に番号を付けた態様はそれぞれ、その前または後の個々に番号を付けた態様のいずれかと共に使用されてもよく、またはこれらと組み合わせてもよい。このことは、態様の全てのこのような組み合わせのサポートを与えることを意図しており、以下に明示的に提供する態様の組み合わせに限定されない。
１．発現ベクターであって、活性依存性発現カセットを含み、前記活性依存性発現カセットは、
（ａ）ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域とｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列とを含む制御配列と、
（ｂ）前記制御配列に作動可能に連結するポリペプチドコード配列とを含み、
前記制御配列の活性依存性活性化が起こると、前記ポリペプチドコード配列によってコードされるポリペプチドは、前記発現カセットから発現される、発現ベクター。
２．前記ベクターはウイルスベクターである、態様１に記載の発現ベクター。
３．前記ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、態様２に記載の発現ベクター。
４．前記制御配列は、哺乳動物ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域と、哺乳動物ｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列とを含む哺乳動物ｃ−ｆｏｓ制御配列である、態様１〜３のいずれかに記載の発現ベクター。
５．前記哺乳動物ｃ−ｆｏｓ制御配列は、げっ歯類ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域と、げっ歯類ｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列とを含むげっ歯類ｃ−ｆｏｓ制御配列である、態様４に記載の発現ベクター。
６．前記げっ歯類ｃ−ｆｏｓ制御配列は、マウスｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域と、マウスｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列とを含むマウスｃ−ｆｏｓ制御配列である、態様５に記載の発現ベクター。
７．前記発現カセットは、さらに、前記ポリペプチドコード配列の３’末端に作動可能に連結するＰＥＳＴペプチドをコードする配列を含む、態様１〜６のいずれかに記載の発現ベクター。
８．前記ポリペプチドコード配列は、前記ｃ−ｆｏｓ制御配列に対して異種である、態様１〜７のいずれかに記載の発現ベクター。
９．前記ポリペプチドコード配列は、光応答性ポリペプチドをコードする、態様１〜８のいずれかに記載の発現ベクター。
１０．前記光応答性ポリペプチドは、脱分極オプシンまたは過分極オプシンである、態様９に記載の発現ベクター。
１１．前記ポリペプチドコード配列は、分子タグをコードする、態様１〜８のいずれかに記載の発現ベクター。
１２．前記ポリペプチドコード配列は、カルシウムセンサーまたは電圧センサーまたはイオンチャンネルをコードする、態様１〜８のいずれかに記載の発現ベクター。
１３．前記ポリペプチドコード配列は、毒性タンパク質をコードする、態様１〜８のいずれかに記載の発現ベクター。
１４．前記ポリペプチドコード配列は、受容体をコードする、態様１〜８のいずれかに記載の発現ベクター。
１５．前記ポリペプチドコード配列は、ヌクレアーゼをコードする、態様１〜８のいずれかに記載の発現ベクター。
１６．前記ポリペプチドコード配列は、転写因子をコードする、態様１〜８のいずれかに記載の発現ベクター。
１７．前記ポリペプチドコード配列は、光応答性ポリペプチド、分子タグ、カルシウムセンサーまたは電圧センサーまたはイオンチャンネル、毒性タンパク質、受容体、ヌクレアーゼおよび転写因子からなる群から選択される２つ以上のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする、態様１〜１６のいずれかに記載の発現ベクター。
１８．前記ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域が、８００ヌクレオチド長未満である、態様１〜１７のいずれかに記載の発現ベクター。
１９．前記ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域は、配列番号１と８０％以上の配列同一性を有する、態様１８に記載の発現ベクター。
２０．前記ｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列は、ｃ−Ｆｏｓ遺伝子の第１のイントロン全体またはその縮重配列を含む、態様１〜１９のいずれかに記載の発現ベクター。
２１．前記ｃ−Ｆｏｓの第１のイントロンは、配列番号２と８０％以上の配列同一性を有する、態様１〜２０のいずれかに記載の発現ベクター。
２２．前記発現カセットは、さらに、前記ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域と前記ｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列との間に配置される５０〜２００ヌクレオチド長の配列を含む、態様１〜２１のいずれかに記載の発現ベクター。
２３．前記５０〜２００ヌクレオチド長の配列は、ｃ−Ｆｏｓ遺伝子の第１のエクソンをコードする配列またはその一部を含む、態様２２に記載の発現ベクター。
２４．前記ｃ−Ｆｏｓ遺伝子の第１のエクソンをコードする配列は、配列番号３と８０％以上の配列同一性を有する、態様２３に記載の発現ベクター。
２５．態様１〜２４のいずれかに記載の発現ベクターを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
２６．活性細胞の活性依存性標識のための方法であって、前記方法は、
（ａ）細胞と、
（ｉ）ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域とｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列とを含む制御配列と、
（ｉｉ）前記制御配列に作動可能に連結する標識ポリペプチドをコードするコード配列とを含む発現カセットを含む発現ベクターとを接触させることと、
（ｂ）前記制御配列の活性依存性活性化が可能な条件で前記細胞を維持することとを含み、前記制御配列の活性依存性活性化が起こると、前記標識ポリペプチドが発現されて、前記活性細胞を標識する、方法。
２７．前記接触させることが、インビトロで行われる、態様２６に記載の方法。
２８．前記接触させることが、インビボで行われる、態様２６に記載の方法。
２９．前記細胞はニューロンである、態様２６〜２８のいずれかに記載の方法。
３０．前記ニューロンは哺乳動物ニューロンである、態様２９に記載の方法。
３１．前記ニューロンは、脊椎動物の中枢神経系に存在する、態様２９〜３０のいずれかに記載の方法。
３２．前記維持することの間に、前記細胞を刺激と接触させることによって、前記制御配列を活性化させる、態様２６〜３１のいずれかに記載の方法。
３３．前記刺激は電気刺激である、態様３２に記載の方法。
３４．前記刺激は薬理学的刺激である、態様３２に記載の方法。
３５．前記接触させることが、前記発現ベクターを、脊椎動物の中枢神経系に投与することによってインビボで行われ、前記維持することが、前記脊椎動物に、前記制御配列を活性化させるために十分な行動課題を行うことを含む、態様２６〜３４のいずれかに記載の方法。
３６．前記標識ポリペプチドは、分子タグである、態様２６〜３５のいずれかに記載の方法。
３７．前記標識ポリペプチドは、リコンビナーゼであり、前記細胞は、組換え配列を含み、組換えが起こると、分子タグの発現を誘発する、態様２６〜３６のいずれかに記載の方法。
３８．活性化された細胞の活性依存性制御のための方法であって、前記方法は、
（ａ）細胞と、
（ｉ）ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域とｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列とを含む制御配列と、
（ｉｉ）前記制御配列に作動可能に連結する光応答性ポリペプチドをコードするコード配列とを含む発現カセットを含む発現ベクターとを接触させることと、
（ｂ）前記制御配列の活性依存性活性化が可能な条件で前記細胞を維持することであって、前記制御配列の活性依存性活性化が起こると、前記光応答性ポリペプチドが、前記活性化された細胞中で発現される、前記維持することと、
（ｃ）前記活性化された細胞を、前記光応答性ポリペプチドが前記細胞中での応答を誘発するきっかけとなるために十分な光にさらし、それによって、前記活性化された細胞を制御することとを含む、方法。
３９．前記接触させることが、インビトロで行われる、態様３８に記載の方法。
４０．前記接触させることが、インビボで行われる、態様３９に記載の方法。
４１．前記細胞はニューロンである、態様３８〜４０のいずれかに記載の方法。
４２．前記ニューロンは哺乳動物ニューロンである、態様４１に記載の方法。
４３．前記ニューロンは、脊椎動物の中枢神経系に存在する、態様３８〜４２のいずれかに記載の方法。
４４．前記維持することの間に、前記細胞を刺激と接触させることによって、前記制御配列を活性化させる、態様３８〜４３のいずれかに記載の方法。
４５．前記刺激は電気刺激である、態様４４に記載の方法。
４６．前記刺激は薬理学的刺激である、態様４４に記載の方法。
４７．前記接触させることが、前記発現ベクターを、脊椎動物の中枢神経系に投与することによってインビボで行われ、前記維持することが、前記脊椎動物に、前記制御配列を活性化させるために十分な行動課題を行うことを含む、態様３８〜４６のいずれかに記載の方法。
４８．前記応答は脱分極である、態様３８〜４７のいずれかに記載の方法。
４９．前記応答は過分極である、態様３８〜４７のいずれかに記載の方法。
材料および方法：
動物
逆の１２時間の明／暗サイクルで、雄および雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを群に分けて成育した。ウイルス注入の時に、マウスは６〜８週齢であった。不断給餌で餌と水を与えた。Ａｉ１４マウスおよび野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＪＡＸから購入した。Ｒｏｓａ２６loxp-stop-loxp-eGFP-L10（本明細書ではｒＴａｇと呼ばれる）マウスは、教育機関から得た。全ての行動アッセイには雄のマウスを使用した。組織学および解剖学のアッセイには、雄および雌の両方のマウスを使用した。全ての実験プロトコルは、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されており、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈからのガイドラインに従ったものであった。
ウイルスおよび注射
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ５またはＡＡＶ８の外被タンパク質を有する血清型に分けられ、封入された。ＰＦＣに、片側に注射を行ない、最終的なウイルス濃度は、１ｍＬあたり、全てゲノムコピー数として、ＡＡＶ８−ｆｏｓ−ＥＲT2−Ｃｒｅ−ＥＲT2−ＰＥＳＴ：３×１０12、ＡＡＶ８−ＣａＭＫＩＩα−ＥＹＦＰ−ＮＲＮ：１．５×１０12、ＡＡＶ５−ｆｏｓＣｈ−ＹＦＰ：２×１０12、ＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩα−ＹＦＰ：１．５×１０11である。
構築物およびウイルス
高感度黄色蛍光タンパク質を用いてタグ化した、コドン最適化されたＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）を、７６７ｂｐの最小プロモーターセグメントと、鍵となる制御要素を含有する５００ｂｐの１つのコード領域とを含む、トランケーションにより切断されたｃ−ｆｏｓ遺伝子配列に融合することによって、ｐＡＡＶ−ｆｏｓ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ（ｆｏｓＣｈ）プラスミドを構築した。７０ｂｐのＰＥＳＴ配列をＣ末端に挿入し、分解を促進し、それによって、膜を標的とするＣｈＲ２−ＹＦＰが時間経過に伴って蓄積することを防いだ。この構築物をＡＡＶ骨格へとクローニングした。ｆｏｓＣｈプラスミド中のＣｈＲ２−ＥＹＦＰをＥＲT2−Ｃｒｅ−ＥＲT2カセットと置き換えることによって、ｐＡＡＶ−ｆｏｓ−ＥＲT2−Ｃｒｅ−ＥＲT2−ＰＥＳＴプラスミドを構築した。ｐＡＡＶ−ＣａＭＫＩＩα−ｅＹＦＰ−ＷＰＲＥ−ｈＧＨｐａ中の４７９ｂｐのｈＧＨ ポリＡテールを、ＡｆｅＩ部位およびＢｓｔＥＩ部位によってフランキングされたニューリチンの９９２ｂｐの３’ＵＴＲと２１５ｂｐのｂＧＨポリＡを含有するＤＮＡフラグメント（ラットニューリチンｍＲＮＡの３’ＵＴＲからのＮＲＮ（ＮＭ＿０５３３４６．１））とに置き換えることによって、ｐＡＡＶ−ＣａＭＫＩＩα−ＥＹＦＰ−ＮＲＮプラスミドを構築した。
ＣＡＰＴＵＲＥ標識
Ａｉ１４マウスに、ＡＡＶ８−ＣａＭＫＩＩα−ＥＹＦＰ−ＮＲＮおよびＡＡＶ８−ｃＦｏｓ−ＥＲ−Ｃｒｅ−ＥＲ−ＰＥＳＴの１μｌ混合物を、ｍＰＦＣの左側に注射した。手術の２週間後、マウスに１５ｍｇ／ｋｇのコカイン（ＩＰ注射）または２０回のランダムな足へのショック（２秒間、０．５ｍＡ、平均で１分あたり２回のショック）を２日連続して与えた。コントロール群は、全期間中、ホームケージの中に入れたままであった。ＣｒｅＥＲが介在する組換えを可能にするために、最後の行動から３時間後に、１０ｍｇ／ｋｇの４−ヒドロキシタモキシフェンを全てのマウスに与えた。マウスを、さらに３〜４週間、自身のホームケージに戻し、蛍光タンパク質を完全に発現させた。
定位手術
６〜７週齢のマウスに、１．５〜３．０％のイソフルランを用いて麻酔し、定位装置（Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に入れた。無菌状態で手術を行った。外科用メスを用い、正中線に沿って切開部を開き、頭蓋骨を露出させた。開頭術を行った後、ウイルス（各ウイルスについて、特定のタイターおよび容積は、ウイルス調製の章で見出すことができる）を、１０μｌのナノフィルシリンジ（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用い、０．１μｌ／分で、ｍＰＦＣに注射した。このシリンジを、３３ゲージの先端が斜めになった針に接続し、斜めになった先端を、動物の前側に面するように置いた。注入が開始してから２０分後に、シリンジをゆっくりと引っ込めた。標的領域でのウイルス発現を制限するための、ゆっくりとした注入速度の後、１０分間の待ち時間を取り、その後にシリンジを引っ込めることが重要であった。注入条件は、前後方向に１．９ｍｍ、中外側に０．３５ｍｍ、背腹側に２．６ｍｍであった。光ファイバーカニューレ（直径が２００μｍのＤｏｒｉｃ Ｌｅｎｓｅｓ）の片側移植のための座標は、前後方向に１．９ｍｍ、中外側に０．３５ｍｍ、背腹側に−２．４ｍｍであった。全ての座標は、ブレグマに対するものであった。
４−ヒドロキシタモキシフェンの送達
一時的な４ＴＭ送達を容易にするために、水性製剤（油の代わりに、さらにゆっくりとした薬物放出を与える傾向がある）を設計する。まず、１０ｍｇの４ＴＭ（Ｓｉｇｍａ Ｈ６２７８）を２５０μｌのＤＭＳＯに溶解した。最初に、このストックを、２％のＴｗｅｅｎ ８０を含有する５ｍｌの生理食塩水で希釈し、次いで、生理食塩水で再び１：１に希釈した。最終的な注射可能な溶液は、１ｍｇ／ｍｌの４ＴＭ、１％のＴｗｅｅｎ ８０および２．５％のＤＭＳＯを生理食塩水中に含んでいた。マウス脳の中の４ＴＭの薬物動態（上のビヒクルを用いる）を、スタンフォードにあるＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで、標準的なＬＳ−ＭＳ方法を用いて決定した。簡単に言うと、３０匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、指定した時間点で（各時間点でｎ＝５）１０ｍｇ／ｋｇの４ＴＭを注射し（ＩＰ）、ビヒクル単独を注射されたｎ＝５のマウスをブランクコントロールとして使用した。異なる時間点で、１ＸＰＢＳを用いて灌流した後に、脳を集め、液体窒素で急速冷凍した後、Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＬＣ−ＭＳ）分析のために均質化した。
ＣＬＡＲＩＴＹ処理
この新しい手法の３つの鍵となる特徴は、以下の通りであった。（１）電気泳動または灌流チャンバなどの特殊な装置から独立して、大きなコホートのための平衡流アシスト型洗浄による分類の促進（図１Ｄ〜１Ｇ）、（２）新しい屈折率を合わせるプロセスを用い、９０％を超えるコスト削減（これも、これらの大きな行動コホートにとって重要である）、（３）市販の光シート顕微鏡（ＬＳＭ）を用い、単一の視野場（ＦＯＶ）で、単一のスタックとして（約６．６ｍｍ範囲にわたって約１２００ステップ）で、全体積にわたって１個の細胞の解像度を有し、２時間未満でマウス全脳を画像化することが可能な光学特性（この速度と単純さは、大きな行動コホートにとっても重要である。図２Ｃ〜２Ｄ）。それぞれの脳からの生データファイルは、大きさが約１２ＧＢであり、圧縮またはスイッチングの必要なく、標準的なデスクトップワークステーションに容易に保存し、直接的に分析することができる。
１％アクリルアミドに基づくヒドロゲル（１％のアクリルアミド、０．１２５％のＢｉｓ、４％のＰＦＡ、０．０２５％のＶＡ−０４４開始剤（ｗ／ｖ）、１ＸＰＢＳ注、Ｒｅｆ）を、全てのＣＬＡＲＩＴＹ調製物に使用した。マウスに、氷冷した４％ＰＦＡを経心臓で灌流させた。灌流の後、脳を４％ＰＦＡ中、４℃で一晩かけて後固定し、次いで、１％ヒドロゲルに４８時間かけて移し、モノマーを拡散させた。サンプルを脱気し、５０ｍｌチューブの中で重合させた（３７℃で４〜５時間）。ヒドロゲルから脳を除去し、８％のＳＤＳを含有する２００ｍＭのＮａＯＨ−ホウ酸バッファー（ｐＨ＝８．５）で６〜１２時間洗浄し、残留するＰＦＡとモノマーとを除去した。ここで、脳を、温度制御循環器を用いて、または５０ｍｌのチューブと加熱した撹拌プレートの単純な組み合わせを用いて、フローアシスト洗浄デバイスに移した（図１Ｄ〜１Ｅ）。この洗浄を促進するために、８％のＳＤＳを含有する１００ｍＭのＴｒｉｓ−ホウ酸バッファー（ｐＨ＝８．５）を使用した（４０℃で）。なお、Ｔｒｉｓを含有するバッファーは、ＰＦＡを完全に洗い流した後にのみ使用すべきである。Ｔｒｉｓは、一級アミド基を有しており、これがＰＦＡと相互作用する可能性があるからである。この設定を用い、全マウス脳を１２日間（循環器を用いて、または半球について８日間）または１６日間（コニカルチューブ／撹拌棒を用いて）で洗浄することができる。洗浄後、脳をＰＢＳＴ（０．２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）で、３７℃で少なくとも２４時間洗浄し、残留するＳＤＳを除去した。屈折率を合わせた溶液（ＲａｐｉｄＣｌｅａｒ、ＲＩ＝１．４５、Ｓｕｎｊｉｎ ｌａｂ、「ｈｔｔｐ：／／」その後、「ｗｗｗ．ｓｕｎ」その後、「ｊｉｎｌａｂ．」その後、「ｃｏｍ／」）中で、３７℃で８時間（１日まで）、次いで、室温で６〜８時間、脳をインキュベートした。ＲＣインキュベートの後、イメージングのための脳の準備ができた。
組織学
マウスに深い麻酔をかけ、氷冷した４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を経心臓で灌流させた。４％のＰＦＡ注で脳を一晩かけて固定し、次いで、３０％ショ糖ＰＢＳ溶液中で平衡状態にした。４０μｍの厚い冠状片を、凍結したミクロトームで切断し、免疫染色のために処理するまで、抗凍結剤中に４℃で保存した。自由に浮かぶ試験片をＰＢＳで洗浄し、次いで、０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｔｘ１００）および３％の正常なロバ血清（ＮＤＳ）中、３０分間インキュベートした。試験片を３％ＮＤＳおよび一次抗体と共に一晩インキュベートした。一次抗体は、ウサギ抗ＧＡＢＡ（Ｓｉｇｍａ Ａ２０５２ １：２００）、マウス抗ＣａＭＫＩＩα（Ａｂｃａｍ ａｂ２２６０９ １：２００）、ニワトリ抗ＧＦＰ（Ａｂｃａｍ ａｂ１３９７０ １：５００）およびウサギ抗ＮＰＡＳ４（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇから寄贈、１：２５００）を含んでいる。次いで、試験片を洗浄し、ロバ抗Ｃｙ５、抗マウスＣｙ３および抗ニワトリＦＩＴＣに接合した二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ １：１０００）と共に室温で３時間インキュベートした。全てのＮＰＡＳ４染色を、ＴＳＡ−Ｃｙ５増幅システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用い、製造業者の指示に従って行った。ＤＡＰＩ（１：５０，０００）と共に２０分間インキュベートした後、試験片を洗浄し、ＰＶＡ−ＤＡＢＣＯを用い、顕微鏡のスライドに乗せた。Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５走査型レーザー顕微鏡で、４０Ｘ／１．２５ＮＡ油浸漬対物レンズを用い、共焦点蛍光画像を得た。複数の試験片による深さ２０μｍをカバーするシリアルスタック画像を、処理条件を盲検状態にして、実験者によって分析した。
ＱＰＣＲおよび発現分析
ｑＰＣＲ分析のために、ＡＢＩ大容量ｃＤＮＡ合成キットを用いてＲＮＡを逆転写し、ＳＹＢＲ−緑色蛍光染料（ＡＢＩ）を含む定量ＰＣＲ反応で使用した。ｍＲＮＡの相対的な発現は、ΔΔＣｔ方法を用い、ＴＢＰレベルを用いて正規化した後に決定された。
細胞培養およびインビトロでの活性試験
一次培養した海馬ニューロンを、Ｐ０ Ｓｐａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ子ラットから調製し、既に記載したように、ガラスカバースリップ上で成長させた。１２分割した培養物を、リン酸カルシウムを用い、１μｇのｆｏｓＣｈ ＤＮＡを用いて形質導入した。形質導入手順のすぐ後に、１．２５％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ローガン、ＵＴ）、４％のＢ−２７上清（ＧＩＢＣＯ、グランドアイランド、ＮＹ）、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（ＧＩＢＣＯ）およびＦＵＤＲ（２ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に培養物を戻し、高い基礎レベルの固有のシナプス活性を維持したか、または１μＭのテトロドトキシン（ＴＴＸ）、２５μＭの２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸（ＡＰＶ）および１０μＭの２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイル−ベンゾ［ｆ］キノキサリン−２，３−ジオン（ＮＢＱＸを含む、物質を追加していないＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中、インキュベートし、電気活性を消滅させた。この培地を、６０ｍＭの等張性ＫＣｌ溶液と交換することによって培養物に３０分間刺激を与え、次いで、所定の時間点で４％ＰＦＡを用いて、固定した。
インビボでのオプトロード記録
イソフルオランによって麻酔されたマウスにおいて、光学刺激および細胞外電気記録を同時に行った。オプトロードは、光ファイバー（コア直径３００μｍ、０．３７Ｎ．Ａ．）に接着したタングステン電極（１ＭΩ、外径が１２５μｍ）から構成されており、電極の先端が、ファイバーより下に３００〜５００ｍｍ突出している。光ファイバーを４７３ｎｍレーザーに接続し、ファイバー先端で測定される５ｍＷの光を１０Ｈｚ（５ｍｓパルス）で伝えた。シグナルを増幅させ、バンドパスフィルターにかけ（３００Ｈｚの下限カットオフ、１０ｋＨｚの上限カットオフ）、その後に、デジタル化し、ディスクに記録した。ｐＣｌａｍｐ １０およびＤｉｇｉｄａｔａ １３２２Ａボードを使用して、データを集め、ファイバーを通る光パルスを生成した。記録されたシグナルを、３００Ｈｚの下限／５ｋＨｚの上限のバンドパスフィルターにかけた（１８００Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ＡＣ Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）。オプトロードの正確な配置のために定位ガイダンスを使用し、これを５０μｍずつ、ｍＰＦＣの背面−腹部軸に沿って下げた。光によって開始する活動電位の発火が得られる部位の割合（％）を決定した。
リアルタイムの条件付け場所嗜好性
動物の暗（活動的な）サイクル中、ウイルス注射の後に行動実験を２週間行った。食餌または嫌悪の条件でｆｏｓＣｈ発現を誘発するために、マウスに、コカイン（１５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射によって投与するか、または２０回のランダムな足へのショック（２秒、０．５ｍＡ、平均で１分あたり２回のショック）を与えた。マウスに、食餌または嫌悪のトレーニングを１日に２回、連続５日間にわたって行った。最後の食餌または嫌悪のトレーニングが終わってから１２〜１６時間以内に、条件付け場所嗜好性（ＣＰＰ）を実施した。ＣＰＰ装置は、長方形のチャンバからなっており、片側のコンパートメントは２３ｃｍ×２６ｃｍと測定され、多色壁を有しており、中央のコンパートメントは、２３ｃｍ×１１ｃｍと測定され、白色のプレキシガラス壁を有しており、別の側のコンパートメントは、２３ｃｍ×２６ｃｍと測定され、別個の縞状の壁を有している。チャンバの壁紙は、マウスが、特定のチャンバに対して平均的なベースラインでの偏りを示さないように選択し、あるチャンバに対して初期に強い嗜好性を有するマウスは、除外した（ベースライン試験中に、他と比べてその側のチャンバに５分より長く滞在する）。自動化されたビデオトラッキングソフトウエア（ＢｉＯｂｓｅｒｖｅ）を使用し、３回の連続した２０分ブロックでマウスの位置をモニタリングし、ｆｏｓＣｈ標識された細胞の光遺伝的刺激の前、最中および後の位置嗜好性行動を評価した。光刺激ブロックの間、マウスがあらかじめ設計したチャンバ（どの側かについて完全に相殺されている）に入ったときに、レーザーが自動的に発せられ、マウスが刺激側にとどまっている間、５秒ごとに２秒間の１０Ｈｚ光パルスのバーストを送った（５ｍＷで５ｍｓパルス）。データは、初期のベースライン嗜好性と比較して、光をあてた側で過ごす時間の倍率変化として表される。
統計
二元配置ＡＮＯＶＡを使用し、遺伝子発現または行動が、他の因子（例えば、ニューロン活性、光遺伝的操作）によってどのように影響を受けるかを評価した。統計学的に有意な効果が観察された場合、Ｔｕｋｅｙの多重比較法を用い、多重比較について補正した事後比較試験を行った。２群間の比較のために独立ｔ検定を使用した。α＝０．０５を用い、両側検定を使用した。偽陽性率法を用い、多重比較を調整した。実験者は、行動実験を行い、画像を分析しつつ、実験群については盲検化された。全ての図において、凡例ｎは、生物学的な繰り返し数を指す。
実施例１：食餌嫌悪実験によって活性化された、ｍＰＦＣの集合の解像およびプロジェクション
食餌嫌悪実験による活性化パターンにおける類似性は、個々に選択された脳領域で報告されている（ここで実施した脳全体の分析によって、全領域ではないものの、広く確認された）。これらの観察結果から得られる反証可能な仮説は、例えば、実験の顕著な特徴に起因して、覚醒状態で報告するそれぞれの領域におけるニューロンを反映し、この２つの刺激によって、同じニューロン型の分布が動員されたということである。ｍＰＦＣにおいて、他の存在する文献のみでは、この仮説の裏付けになっていないか、またはこの仮説は疑わしいが、ｍＰＦＣは、１つの集合の仮説に潜在的に関連するより一般的な機能（注意、顕著な特徴、新規な検出および作業記憶を含む）に加えて、特定の賞罰プロセスと関係がある（一方で、コカインで条件付けされた位置嗜好性を含み、他方で恐れと不安との行動）。ここに報告する脳全体の分析によって検出される領域特異的な異なる活性化は、食餌嫌悪の経験を別個のニューロンの集合に動員するいくつかの回路について、少なくとも別個の仮説を考えるきっかけを開くものである。接続性は、このような別個のプロセスに関与する主細胞の集合型を解明する最も重要な特徴の１つであるが、この特徴は、行動中の機能とリンクさせたままで（１個の細胞レベルで）、脳全体の様式で解明することが困難である。
非常に強く発現する活性依存性細胞を満たす標識（従来の核内ｃ−ｆｏｓ免疫染色または典型的な一時的または遺伝子組換えにより発現するフルオロフォアとは異なる）は、主に、標識され、満たされたニューロンの軸索の軌跡が、この内容で、安定に画像化され、定量化される限り、同じ実験被験体から、同様にこの重要な配線情報を獲得することができる可能性がある。このようなプローブを構築するという目標と共に、一部には、ＥＹＦＰのＣ末端で、ニューリチン（ＮＲＮ）ＲＮＡの３’ＵＴＲに挿入することによって操作される新規なＣＬＡＲＩＴＹ最適化された軸索を満たす高感度蛍光タンパク質が開発された。このＤＮＡ構築物は、高タイターのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドに容易に封入することができ、実際に、ＣＬＡＲＩＴＹにおいて、焦点注射により定義されるプロジェクション標識が可能であることがわかった。例えば、遠心性のｍＰＦＣプロジェクションは、１回の立体定位注射の後で、成マウスの脳全体にわたって容易にフォローすることができた（図１Ａ〜１Ｂ）。３Ｄにおいて軸索の軌跡を視覚化することで、不可能ではないにしても、薄い２Ｄ片では検出することが困難であった、鍵となる局所的な特徴が判明した（図１Ａ、図２Ａ）。例えば、ＶＴＡ付近で鋭いＵ字の方向変換を行うために、ｍＰＦＣから腹部の内側視床まで移動する顕著な軸索束が観察され（図１Ｃ〜１Ｄ）、これは、既存のアトラスでは記載されなかった、潜在的に重要な特徴である（図２Ｂ）。
図１：ＣＬＡＲＩＴＹは、脳全体での由来／標的によって定義されるプロジェクトマッピングを可能にする。（図１Ａ）マウス脳の２Ｄ正射影図（水平面、矢状面および冠状面）。挿入図は、ウイルス注射の位置についての図を示す。方向：Ｄ：背面、Ｖ：腹部、Ａ：前部、Ｐ：後部、Ｌ：側部、Ｍ：正中線。（図１Ｂ）発生するｍＰＦＣプロジェクションを視覚化する、ＣＬＡＲＩＴＹ半球の三次元レンダリング（２Ｘの対物レンズによって、１個のＦＯＶを用いて０．８ｘズーム、ステップサイズ：４μｍ、１０００ステップによって画像化する）。（図１Ｃ）ＶＴＡの付近に回り込む軌跡を示す、ｍＰＦＣからＶＭへと突出している軸索束の３Ｄ視覚化（矢印によって示される）。（図１Ｄ）まばらな標識を含む（低タイターウイルスを用いる）、（図１Ｃ）と同じプロジェクションの視覚化。（図１Ｅ）ＣＬＡＲＩＴＹボリュームからの生画像。橙色：この領域を通る繊維のみをトラッキングするようにユーザが定義した「種領域」。（図１Ｆ）構造テンソルに基づくトラクトグラフィーを用いる、（図１Ｅ）から再構築されたストリームライン。なお、ＣＬＡＲＩＴＹ画像中のユーザが定義した種領域を通過しなかった繊維は、再構築において除外された（マゼンタ色の矢印によって示される）。（図１Ｇ）（図１Ｂ）のＣＬＡＲＩＴＹ画像から再構築された脳全体のストリームライン。ストリームラインは、方向に関して色分けされている。Ａ−Ｐ：赤色、Ｄ−Ｖ：緑色、Ｌ−Ｍ：青色。（図１Ｈ）ＶＴＡ（黄色）またはＢＬＡ（緑色）に対して突出するｍＰＦＣ繊維の代表的なコンピュータ計算による単離。全てのスケールバー：５００μｍ。
図２：ＣＬＡＲＩＴＹは、脳全体での由来／標的によって定義されるプロジェクトマッピングを可能にする。（図２Ａ）（ブレグマに対して）指定された位置での２Ｄ冠状部分（５０μｍの最大プロジェクション）。スケールバー：５００μｍ。（図２Ｂ）Ａｌｌｅｎ Ｂｒａｉｎマウスの接続アトラスからのｍＰＦＣからＶＭへの（緑色で強調）プロジェクション経路の推定スナップショット（赤色のストリームラインとして示される）（「ｈｔｔｐ：／／」、その後「ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ．ｂｒａｉｎ−ｍａｐ」、その後「．ｏｒｇ／」）。スケールバー：１ｍｍ。（図２Ｃ〜２Ｆ）ＣＬＡＲＩＴＹトラクトグラフィーに基づく構造テンソルを用い、軸索プロジェクションをストリームラインへと再構築する代表的な中間ステップ。（図２Ｃ）発生するｍＰＦＣプロジェクション（ＥＹＦＰ）を示す生のＣＬＡＲＩＴＹ画像。（図２Ｄ）３次元ＣＬＡＲＩＴＹ画像の容積を、それぞれｘ軸、ｙ軸、ｚ軸に沿って、Ｇａｕｓｓｉａｎ関数の３次元の一次誘導式（σｄｏｇ＝１ボクセル／６μｍ）を用いてコンボリューションすることによってコンピュータ計算された、画像強度勾配の振幅。（図２Ｅ）コンピュータ計算された構造テンソルの第３の固有ベクトルとして概算された、色分けされた主細胞の繊維方向（Ａ−Ｐ：赤色、Ｄ−Ｖ：緑色、Ｌ−Ｍ：青色）。（σｄ＝１ボクセル／６μｍ、σｄｏｇ＝１ボクセル／６μｍ）。よりよい視覚化のために、色の輝度は、生のＣＬＡＲＩＴＹ画像強度によって重み付けされた。スケールバー：１００μｍ。（図２Ｆ）生のＣＬＡＲＩＴＹ画像に重ね合わされた、色分けされたベクトル場として主細胞の繊維方向を示す、（図２Ｅ）を徐々に拡大した領域。ベクターは、その方向に関して色分けされている。スケールバー：６μｍ。（図２Ｇ）各軸索束の直径と、特定の束を表すストリームラインの数との相関関係。直径は、各束の断面で測定された。ストリームラインを通る数も、同じ断面で測定される。ｎ＝１５、Ｐｅａｒｓｏｎ相関、ｒ2 ＝０．９６、Ｐ＜０．０００１。（図２Ｈ〜２Ｋ）種々の標的領域：Ｎａｃ（図２Ｈ）、ＬＨｂ（図２Ｉ）、ＢＬＡ（図２Ｊ）およびＶＴＡ（図２Ｋ）における、軸索プロジェクション（ｍＰＦＣから発生するプロジェクション）の代表的な再構築。上の行：ＣＬＡＲＩＴＹ画像、下の行：示された３Ｄ領域で終わる再構築されたストリームライン。
大きな行動コホートについての軌跡を定量するために、トラクトグラフィーのためのＣＬＡＲＩＴＹから３Ｄ構造テンソルをコンピュータ計算するための方法を開発した（図２Ｃ〜２Ｆ）。計算されたストリームラインの信頼できる再構築を達成した（拡散トラクトグラフィーのための磁気共鳴画像分析から適応させたツールを用いて）。これらのストリームラインを、ＣＬＡＲＩＴＹ画像からの繊維の上にマッピングし（図１Ｅ〜１Ｆ）、重要なことに、それぞれの束の中のストリームラインの数は、群の真実の軸索束の物理的直径と密に相関関係にあった（図２Ｇ）。この方法を用い、脳全体のプロジェクション（ｍＰＦＣのＡＡＶ注射に由来する）を、３Ｄ ＣＬＡＲＩＴＹ画像に基づいて再構築した（図１Ｇ）。種領域（ここでは、立体定位注射部位によって定義される）と、任意の特定の下流標的、例えば、ＢＬＡまたはＶＴＡとの間の接続性は、容易に視覚化し、ストリームラインを数えることによって評価することができた（図１Ｈ、図２Ｈ〜２Ｋ）。
行動実験中のそれらの使用によって定義される細胞におけるプロジェクションラベリングの必要なさらなる可能性と共に、この新しい可能性を組み込むために、時間に限りがある活性を、持続する導入遺伝子発現に翻訳するためのウイルスＣｒｅＥＲ／４ＴＭ戦略を開発した（活性依存性プロモーターによって引き起こされる典型的な導入遺伝子のフルオロフォア発現は、トラクトグラフィーに十分なほど強くはないことがわかった）。したがって、イントロン−１に最小プロモーターと制御要素とを組み合わせたｃ−Ｆｏｓプロモーターが操作され（図３Ａ）、これはＡＡＶ粒子に封入され、ニューロン活性における特定の十分な捕捉を向上するほど十分に小さかった（図３Ｂ〜３Ｄ）。不安定化されたＥＲ−Ｃｒｅ−ＥＲ−ＰＥＳＴカセットも、このプロモーターに挿入した。Ａｉ１４レポーターマウスに注射すると、このウイルスＣｒｅＥＲ／４ＴＭ系は、活性およびタモキシフェンに依存する細胞本体およびプロジェクションの標識を信頼性よく実現した（図３Ｅ〜３Ｆ）。
図３：コカインおよびショックによって活性化されるｍＰＦＣ集合の別個のプロジェクション標的。（図３Ａ）構築戦略ｃ−ｆｏｓ遺伝子のイントロン１のすぐ後に発現カセットを挿入した。ＣｈＲ２−ＥＦＹＰ（ｃＦｏｓ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ、ｆｏｓＣｈと呼ばれる）またはＥＲT2−Ｃｒｅ−ＥＲT2のいずれかの融合を挿入し、その後、７０ｂｐのＰＥＳＴ配列を挿入し、構築物の分解を促進した（さらに、特異性を高めるために）。（図３Ｂ）ｃ−Ｆｏｓ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰの形質導入の後に、培養された海馬ニューロンの処理を示す模式図。ＴＴＸ、ＡＰＶおよびＮＢＱＸを用い、ニューロンを電気的に静止させた。ｆｏｓＣｈ発現を、「基本」（自然発生的にシナプスが活性であるが、その他の刺激を受けたり、静止したりしていない）培養物での発現レベルと比較した。３０分の脱分極刺激（６０ｍＭのＫＣｌ）の後、ＴＴＸ／ＡＰＶ／ＮＢＱＸ溶液を交換し、所定の時間点で、群を固定した。（図３Ｃ）それぞれの治療群について、培養された海馬ニューロンのｆｏｓＣｈ発現を示す代表的な画像。スケールバー：２５μｍ。（図３Ｄ）ｃで表される条件について、ＥＹＦＰ発現の平均ピクセル強度の定量化。１群あたり、ｎ＝３９〜５９の細胞、Ｆ3,205 ＝３７．２０、***Ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡの後、Ｔｕｋｅｙ多重比較試験。（図３Ｅ〜３Ｆ）ＡＡＶ−ｃＦｏｓ−ＥＲT2−Ｃｒｅ−ＥＲT2−ＰＥＳＴを、Ａｉ１４ ＣｒｅレポーターマウスのｍＰＦＣに注射した。マウスを３つの群に分けた（１つの群あたりｎ＝５）：４ＴＭと共にホームケージ、４ＴＭと共にコカインを注射したもの、４ＴＭを用いずにコカインを注射したもの。（図３Ｅ）ｍＰＦＣニューロン（ｔｄＴｏｍａｔｏ＋）の４ＴＭ依存性および活性依存性標識を示す代表的な画像、スケールバー：１００μｍ。（図３Ｆ）３つの群でのｔｄＴｏｍａｔｏ＋ｍＰＦＣ細胞の定量化（非４ＴＭ群に対して正規化した）。**Ｐ＜０．０１、 ***Ｐ＜０．００１、独立ｔ検定。エラーバー、平均±標準誤差。
最終的な本質的な特徴（行動コホート全体の定量的な活性依存性プロジェクションマッピング）は、活性とは独立した絶対的な大きな標識強度に対する個々の被験体レベルでの正規化を可能にした。この正規化は、主に、注射の有効性における変動を制御するためのウイルスに基づく手法にとって重要である。この特徴（図４Ａ）は、同じ注射部位からのプロジェクションの同時２色活性非依存性（構造、ＥＹＦＰ）標識と活性依存性（ｔｄＴｏｍａｔｏ）標識とにおいて構築することができた。次いで、インタクトな脳全体から複数の下流領域へのプロジェクションの２色による定量化は、これらの領域で終わっているストリームラインの数を数えることによって達成され、活性依存性は、赤色／緑色のストリームライン比からの解剖学的変動性および注射変動性を補正する。行動によって定義されるニューロンの集合から脳を通るプロジェクションを使用した定量化は、（簡単に言うと）、ここでは、組換えの際のＣＬＡＲＩＴＹに基づく活性プロジェクショントラッキング（ＣＬＡＲＩＴＹ−ｂａｓｅｄ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｕｐｏｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）、すなわちＣＡＰＴＵＲＥと呼ばれる（図４Ａ）。
図４：コカインおよびショックによって活性化されるｍＰＦＣ集合の別個のプロジェクション標的。（図４Ａ）ＣＡＰＴＵＲＥワークフローのまとめ（文章で記載される）。（図４Ｂ）Ｎａｃ（上の行）、ＬＨｂ（中央の行）およびＶＴＡ（下の行）において、コカインおよびショックによって標識されたマウスからの構造的なプロジェクション（緑色：ＥＹＦＰ）および活性依存性プロジェクション（白色：ｔｄＴｏｍａｔｏ）の代表的なＣＬＡＲＩＴＹ画像。矢じりは、円形の領域内で終了している軸索束を示している。スケールバー：２００μｍ。（図４Ｃ）３Ｄ脳領域で終了するストリームライン（紫色）を示す、（図４Ｂ）から再構築されたストリームライン。緑色のストリームライン：ＥＹＦＰ繊維から再構築されたもの。赤色のストリームライン：ｔｄＴｏｍａｔｏ繊維から再構築されたもの。スケールバー：２００μｍ。（図４Ｄ〜４Ｆ）３つの領域における、コカインおよびショックによって標識されたｍＰＦＣの集合からのプロジェクション強度の定量化。示された３Ｄ領域で終わる赤色と緑色の繊維の比率を使用し、行動特異的なプロジェクション強度を定量化した（すなわち、赤色ストリームラインの数を、緑色ストリームラインの数で割った）（Ｎａｃ、ＬＨｂおよびＶＴＡ、１群あたりｎ＝６、ｎｓ、Ｐ＞０．０５、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、独立ｔ検定）。エラーバー、平均±標準誤差。
実施例２：行動実験の中の別個のプロジェクションパターン−定義されたｍＰＦＣの集合
ＣＡＰＴＵＲＥを適用し、コカインおよびショックを動員したｍＰＦＣの集合からのプロジェクションを定量した。２群のＡｉ１４レポーターマウスに、ＣａＭＫＩＩα−ＥＹＦＰ−ＮＲＮおよびｃＦｏｓ−ＥＲ−Ｃｒｅ−ＥＲ−ＰＥＳＴのＡＡＶを一緒に注射し、４ＴＭが介在するコカインおよびショックによる標識を行った。ＣＡＰＴＵＲＥを用い、全てのＣａＭＫＩＩα（主に励起グルタミン酸作動性）ニューロンからのプロジェクションをＥＹＦＰで標識し、行動が動員された集合からのプロジェクションをｔｄＴｏｍａｔｏで標識する。重要なことに、Ｎａｃ、ＢＬＡおよびＶＴＡにおけるＥＹＦＰ繊維は、コカインによって標識された動物と、ショックによって標識された動物とを区別することができないことがわかった。このことは、２群間のウイルス感染、形質導入および発現における変動が最小限であることを示している（図４Ｂ）。
まさに同じ動物において、コカインにさらされた動物において、ショックにさらされた動物と比較して、Ｎａｃを標的とする行動活性があるｍＰＦＣニューロンからの顕著に多いプロジェクションが観察された。逆に、ショックにさらされた動物において、ＬＨｂに対して顕著に多い行動活性があるｍＰＦＣ繊維が観察された（図４Ｃ〜４Ｆ）。ＶＴＡに対するｍＰＦＣプロジェクションにおいて、上述の２群間で赤色／緑色（活性／構造）比に有意な差は観察されず、このことから、ウイルスの解剖学的標識の効率または標的において、検出可能な統計的な差はないことがわかる。したがって、コカインによって活性化されたｍＰＦＣの集合は、Ｎａｃに対して優先的に突出していき、一方、ショックによって活性化された集合は、ＬＨｂに対してより強く突出していき、別個の価数の行動経験によってｍＰＦＣに動員されるニューロンの集合は、集合が受けた入力パターンという観点で、単純に異なっているわけではなく、脳全体でのプロジェクションパターンという観点で、解剖学的に別個の細胞の集合を表すことがわかる。
実施例３：コカインおよびショックによって活性化される集合は、食餌嫌悪行動を制御
食餌嫌悪条件に動員されたｍＰＦＣニューロンの集合を、遺伝子発現シグネチャおよび長い範囲の接続性測定値によって分離可能であることを確立し、これら２つの行動活性によって定義される集合における電気活性が、その刺激を受けた同じ動物について正または負の別個の条件調整を有しているか否かを次に試験し、位置嗜好性行動の間に、行動に対する原因となる影響によって評価した。ＥＹＦＰでタグ化された、コドン最適化されたチャンネルロドプシン（ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ）は、ＡＡＶ−ｃＦｏｓ骨格（ｆｏｓＣｈと呼ばれる、図３Ａ）制御下で使用され、ｍＰＦＣにｆｏｓＣｈが立体定位的に注射された。連続した５日間、これらの動物に、毎日、コカイン投与または足へのショック行動の経験を与えた。経験を与えた後、コントロールと比較して、ｆｏｓＣｈ標識された細胞の数および平均ＥＹＦＰ発現レベルの数の有意な増加が観察された（図５Ａ〜５Ｃ）。
図５：コカインおよびショックによって活性化されるｍＰＦＣ集合を標的とするためのｆｏｓＣｈの使用。（図５Ａ）示した行動の後のｍＰＦＣにおけるｆｏｓＣｈ発現を示す代表的な画像。左、皮膚の深さ方向に沿った薄膜を視覚化する画像（正中線は右側にある）。矢じりは、ｆｏｓＣｈ陽性ニューロンを示す。スケールバー：１００μｍ。右、個々のｆｏｓＣｈニューロンの高倍率画像。スケールバー：２５μｍ。（図５Ｂ）ｆｏｓＣｈ細胞数の倍率変化（ホームケージレベルに対して正規化された）。（図５Ｃ）平均ＥＹＦＰ蛍光強度における倍率変化。１群あたりｎ＝１１〜１４、 ***Ｐ＜０．００１、独立ｔ検定。（図５Ｄ）ｆｏｓＣｈおよびＮＰＡＳ４＋細胞の代表的な画像と定量化。矢じりは、二重陽性細胞を示す。１群あたりｎ＝５、**Ｐ＜０．０１、独立ｔ検定。（図５Ｅ〜５Ｇ）左：コカイン群およびショック群についてのｆｏｓＣｈプロジェクションの密度を比較。右：示された領域におけるｆｏｓＣｈプロジェクションの密度を示す代表的な画像。ａｃａ：前部接合面の前側部分。スケールバー：１００μｍ。１群あたりｎ＝１１〜１４、 *Ｐ＜０．０５、独立ｔ検定。エラーバー、平均±標準誤差。
まず、コカインおよびショックによって標識されたｆｏｓＣｈ細胞においてＮｐａｓ４発現を定量化し、コカインによって標識されたｆｏｓＣｈ細胞が、ショックによって標識されたｆｏｓＣｈ細胞と比較して、有意に高いＮｐａｓ４発現を示すという仮説を立てた。これは、実際にその通りであった（図５Ｄ）。重要なことに、一般的な励起ニューロンマーカーまたは阻害ニューロンマーカーの発現は、２つの集合間で差はなかった（図６Ａ〜６Ｂ）。さらに、ＣＡＰＴＵＲＥの知見と一致して、コカインによって標識されたｆｏｓＣｈ細胞は、Ｎａｃに対して強く突出することがわかっており、一方、ＬＨｂは、ショックによって標識されたｆｏｓＣｈ細胞から生じる有意に高密度のＥＹＦＰ繊維を含んでいた（図５Ｅ〜５Ｇ）。重大なことに、この標的化する方法は、得られたまばらに分布するニューロンサブセットを光学的に制御することができるほど十分に強力であった。ｆｏｓＣｈ標識された細胞は、安定した光によって起こる発火を示し、これはインビボでの電気生理学的記録によって評価された（図７Ａ〜７Ｂ）。これらのデータを合わせることで、分子学的および解剖学的に既に特性決定されている同じパターンのｆｏｓＣｈ戦略を用いた解決策が示され、これらのニューロンサブセットが、行動を異なる様式で制御することができるか否かの最終的な試験が可能になった。
図６：コカインおよびショックによって活性化されるｍＰＦＣ集合を標的とするためのｆｏｓＣｈの使用。（図６Ａ）示した抗ＧＡＢＡおよび抗ＣａＭＫＩＩα抗体と共に一緒に標識されたｍＰＦＣ片における、ｆｏｓＣｈ発現を示す代表的な共焦点画像。白色の矢印は、ｆｏｓＣｈ＋／ＣａＭＫＩＩα＋ニューロンを示す。黄色の矢じりは、ｆｏｓＣｈ＋／ＧＡＢＡα＋ニューロンを示す。（図６Ｂ）定量化から、コカイン群およびショック群について、ＣａＭＫＩＩα陽性（左）およびＧＡＢＡ陽性（右）のｆｏｓＣｈ細胞の数に有意な差はないことがわかった。１群あたり、ｎ＝１０〜１４匹のマウス。エラーバー、平均±標準誤差。
図７：コカインおよびショックによって活性化されるｍＰＦＣ集合の異なる行動影響。（図７Ａ）インビボ記録実験についての記録電極および光ファイバーの位置を示すための模式図。オプトロードは、ｍＰＦＣの背面−腹部軸に沿って１００μｍステップ下がっていた。（図７Ｂ）左、１０Ｈｚの光トレーニングに対する神経応答を示す代表的な細胞外記録（２秒間に５ｍｓパルス、５秒ごと、５ｍＷの４７３ｎｍの青色光、青色の棒グラフによって示される）。右、円グラフは、ホームケージ（灰色）群、コカイン（赤色）群およびショック（青色）群について、光によって発生する活動電位の発火を示す記録部位の割合を示す。（図７Ｃ）模式図は、緑色で、注射部位の上に配置された光ファイバーの位置を示す。５日間のトレーニングの後、３回の連続した２０分間の試行からなるリアルタイム位置嗜好性試験によってマウスを試験した。（図７Ｄ）それぞれの試行全体で、光刺激を受けた側について、嗜好性の倍率変化としてプロットされた行動結果（初期のベースラインの嗜好性によって正規化した）。１群あたりｎ＝１０〜１４、 *Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ、次いで、Ｔｕｋｅｙ多重比較試験。エラーバー、平均±標準誤差。（図７Ｅ）光刺激試行中の代表的なコカインおよびショックによって標識された動物からの移動トラッキングデータ。
この問題に対処するために、行動チャンバの片方の側に入ったときに１０Ｈｚ光パルスのトレーニングが自動的に開始されるリアルタイム位置嗜好性パラダイムを使用した。ｆｏｓＣｈの定義されたニューロンの組み合わせの再活性化のために光をあてる前、最中および後に、マウスの行動を、３回の連続した２０分間の試行でモニタリングし、位置嗜好性を定量した（図７Ｃ）。ＣｈＲ２の発現が、従来の活性には関係なく、ＣａＭＫＩＩαプロモーターによって引き起こされるというさらなる実験アームが含まれ、行動が、ランダムに標識されたニューロンによって偏る可能性を制御した。この制御アームで、ウイルスを滴定し、同様の数のｍＰＦＣニューロンを標的とし、コカインまたはショックにさらされた後のｆｏｓＣｈ発現レベルに適合させた（図８Ａ〜８Ｂ）。これらの非活性特異的なニューロンの集合の光遺伝的刺激は、位置嗜好性に影響を与えず、ホームケージに動員されたｆｏｓＣｈ集合の動物でも、細胞が光学的に活性化されたチャンバについて、嗜好性または嫌悪を示さないことが観察された。しかし、顕著なことに、ショックまたはコカインによって定義されるｆｏｓＣｈ集合を再活性化すると、位置嗜好性において顕著な（反対方向の）シフトが誘発され、光刺激を合わせた側では、コカインにさらされたマウスは嗜好性を示し、ショックにさらされたマウスは嫌悪を示した（図７Ｄ〜７Ｅ、コカインについて、試験後での平均嗜好性変化：１．３ｘ±０．１、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｐ＝．０００６；ショックについて、０．８ｘ±０．１、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｐ＝．００２）。これらのデータから、活性が定義されたｍＰＦＣ神経の集合は、解剖学的および分子学的に異なっているだけではなく、行動を調整する際の機能的な影響も異なっていることがわかる。
図８：コカインおよびショックによって活性化されるｍＰＦＣ集合の異なる行動影響。（図８Ａ）ＣａＭＫＩＩα−ＣｈＲ２制御状態のｍＰＦＣ発現を示す代表的な画像左、２枚の４０Ｘ画像を一緒に合わせ、全ての皮質層を視覚化した。スケールバー＝１００μｍ。右、個々のＣａＭＫＩＩα−ＣｈＲ２ニューロンの高倍率画像。スケールバー＝２５μｍ。（図８Ｂ）定量化により、ＣａＭＫＩＩα−ＣｈＲ２条件とｆｏｓＣｈ条件との間に、標識された細胞の数（左）またはＥＦＹＰ発現レベル（右）に有意な差がないことがわかった。１群あたりｎ＝１３のマウス。エラーバー、平均±標準誤差。
実施例４：活性依存性制御領域および関連する構築物
図９（配列番号７）に示されるように、７６１ｂｐの５’マウスのｃ−Ｆｏｓ非コード配列、マウスｃ−Ｆｏｓのエクソン１およびマウスｃ−Ｆｏｓのイントロン１を含む制御領域によって引き起こされるレポーター構築物の活性依存性発現を、（１）同じレポーターの図１０（配列番号１）に示すｃ−Ｆｏｓの５’−非コード配列によって引き起こされる活性依存性発現、（２）同じレポーターの全ｃ−Ｆｏｓ遺伝子、その後、図１１（配列番号２９）に示されるＩＲＥＳによって引き起こされる活性依存性発現と比較した。
図９（配列番号７）に示されるような、７６１ｂｐの５’マウスのｃ−Ｆｏｓ非コード配列、マウスｃ−Ｆｏｓのエクソン１およびマウスｃ−Ｆｏｓのイントロン１を含む制御領域によって引き起こされるレポーターからの活性依存性発現は、高い漏れがない発現にとって最良であることがわかった。これと比べると、代替的な構築物（１）は、ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード配列のみによって引き起こされるレポーターであり、これは、きわめて漏れやすく、非特異的であることがわかった。これに加え、ｃ−Ｆｏｓ遺伝子全体、次いでＩＲＥＳによって引き起こされるレポーターである代替的な構築部（２）からの発現は、悪いことがわかった。
したがって、５’−非コード配列、第１のエクソンおよび第１のイントロンを含有する制御配列は、試験される代替的な制御構築物と比較して、最良の発現制御パラメータを有することがわかった。したがって、この制御配列を用い、限定されないが、例えば、図１２に示されるもの（ｐＡＡＶ−ｃＦｏｓ−ＤＩＯ−ｅＮｐＨＲ ３．０−ｅＹＦＰ−ＰＥＳＴ）、図１３に示されるもの（ｐＡＡＶ−ｃＦｏｓ−ＤＩＯ−ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ｅＹＦＰ−ＰＥＳＴ）、図１４に示されるもの（ｐＡＡＶ−ｃＦｏｓ−ＥＲ−ＣｒｅＴ−ＥＲ−ｄｓ−ｐ２Ａ）、図１５に示されるもの（ｐＡＡＶ−ｃＦｏｓ−ｅＹＦＰ−ＰＥＳＴ）、図１６に示されるもの（ｐＡＡＶ−ｃＦｏｓ−ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ｅＹＦＰ−ＰＥＳＴ）、図１７に示されるもの（ｐＡＡＶ−ｃＦｏｓ−ＷＧＡ−Ｃｒｅ）、図１８に示されるもの（ｐＡＡＶ−ｃＦｏｓ−ＷＧＡ−Ｃｒｅ−ＷＰＲＥ）を含め、種々の発現構築物を作成した。
上述の発明を、理解の明確さのために、図および例によって、ある程度詳細に記載してきたが、本発明の教示の観点で、特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることは、当業者には容易に明らかである。
したがって、前述した内容は、単に本発明の原理を示している。当業者は、本明細書に明示的に記載されていないか、または示されていないが、本発明の原理を具現化し、その精神および範囲に含まれる種々の変更を考案することができることが理解される。さらに、本明細書で引用される全ての例および条件に関する用語は、主に、読者が、本発明の原理と、本願発明者らが当該技術をさらに進めるために寄与する概念とを理解するために役立つことを意図しており、このような具体的に引用される例および条件に限定することなく解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、態様および実施形態を引用する本明細書の全ての記載、およびその具体的な例は、その構造的等価物および機能的等価物の両方を包含することを意図している。さらに、このような等価物は、現時点で知られている等価物と、将来開発される等価物（すなわち、構造にかかわらず、同じ機能を発揮するように開発された任意の要素）との両方を含むことを意図している。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され、記載される例示的な実施形態に限定することを意図していない。むしろ、本発明の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。
本出願は、２０１６年５月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／３４１，５１６号の利益を請求し、この出願は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。
配列表（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ）の参照による組み込みは、テキストファイルとして与えられる。
配列表は、本明細書と共に、２０１６年５月２５日に作成し、大きさが１６７ＫＢのテキストファイル「ＳＴＡＮ−１３１９ＰＲＶ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として与えられる。このテキストファイルの内容は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。

Claims (49)

  1. 活性依存性発現カセットを含む発現ベクターであって、
    前記活性依存性発現カセットは、
    （ａ）ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域とｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列とを含む制御配列と、
    （ｂ）前記制御配列に作動可能に連結するポリペプチドコード配列とを含み、
    前記制御配列の活性依存性活性化が起こると、前記ポリペプチドコード配列によってコードされるポリペプチドは、前記活性依存性発現カセットから発現される、発現ベクター。
  2. 前記発現ベクターはウイルスベクターである、請求項１に記載の発現ベクター。
  3. 前記ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２に記載の発現ベクター。
  4. 前記制御配列は、哺乳動物ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域と、哺乳動物ｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列とを含む哺乳動物ｃ−ｆｏｓ制御配列である、請求項１〜３のいずれかに記載の発現ベクター。
  5. 前記哺乳動物ｃ−ｆｏｓ制御配列は、げっ歯類ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域と、げっ歯類ｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列とを含むげっ歯類ｃ−ｆｏｓ制御配列である、請求項４に記載の発現ベクター。
  6. 前記げっ歯類ｃ−ｆｏｓ制御配列は、マウスｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域と、マウスｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列とを含むマウスｃ−ｆｏｓ制御配列である、請求項５に記載の発現ベクター。
  7. 前記活性依存性発現カセットは、さらに、前記ポリペプチドコード配列の３’末端に作動可能に連結するＰＥＳＴペプチドをコードする配列を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の発現ベクター。
  8. 前記ポリペプチドコード配列は、ｃ−ｆｏｓ制御配列に対して異種である、請求項１〜７のいずれかに記載の発現ベクター。
  9. 前記ポリペプチドコード配列はが、光応答性ポリペプチドをコードする、請求項１〜８のいずれかに記載の発現ベクター。
  10. 前記光応答性ポリペプチドは、脱分極オプシンまたは過分極オプシンである、請求項９に記載の発現ベクター。
  11. 前記ポリペプチドコード配列は、分子タグをコードする、請求項１〜８のいずれかに記載の発現ベクター。
  12. 前記ポリペプチドコード配列は、カルシウムセンサーまたは電圧センサーまたはイオンチャンネルをコードする、請求項１〜８のいずれかに記載の発現ベクター。
  13. 前記ポリペプチドコード配列は、毒性タンパク質をコードする、請求項１〜８のいずれかに記載の発現ベクター。
  14. 前記ポリペプチドコード配列は、受容体をコードする、請求項１〜８のいずれかに記載の発現ベクター。
  15. 前記ポリペプチドコード配列は、ヌクレアーゼをコードする、請求項１〜８のいずれかに記載の発現ベクター。
  16. 前記ポリペプチドコード配列は、転写因子をコードする、請求項１〜８のいずれかに記載の発現ベクター。
  17. 前記ポリペプチドコード配列は、光応答性ポリペプチド、分子タグ、カルシウムセンサーまたは電圧センサーまたはイオンチャンネル、毒性タンパク質、受容体、ヌクレアーゼおよび転写因子からなる群から選択される２つ以上のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする、請求項１〜１６のいずれかに記載の発現ベクター。
  18. 前記ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域は、８００ヌクレオチド長未満である、請求項１〜１７のいずれかに記載の発現ベクター。
  19. 前記ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域は、配列番号１と８０％以上の配列同一性を有する、請求項１８に記載の発現ベクター。
  20. 前記ｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列は、ｃ−Ｆｏｓ遺伝子の第１のイントロン全体またはその縮重配列を含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の発現ベクター。
  21. 前記ｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列は、配列番号２と８０％以上の配列同一性を有する、請求項１〜２０のいずれかに記載の発現ベクター。
  22. 前記活性依存性発現カセットは、さらに、前記ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域と前記ｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列との間に配置される５０〜２００ヌクレオチド長の配列を含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の発現ベクター。
  23. 前記５０〜２００ヌクレオチド長の配列は、ｃ−Ｆｏｓ遺伝子の第１のエクソンをコードする配列またはその一部を含む、請求項２２に記載の発現ベクター。
  24. 前記ｃ−Ｆｏｓ遺伝子の第１のエクソンをコードする配列は、配列番号３と８０％以上の配列同一性を有する、請求項２３に記載の発現ベクター。
  25. 請求項１〜２４のいずれかに記載の発現ベクターを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
  26. 活性細胞の活性依存性標識のための方法であって、
    （ａ）細胞と、
    （ｉ）ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域とｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列とを含む制御配列、および
    （ｉｉ）前記制御配列に作動可能に連結する標識ポリペプチドをコードするコード配列を含む発現カセットを含む発現ベクターとを接触させることと、
    （ｂ）前記制御配列の活性依存性活性化が可能な条件で前記細胞を維持することとを含み、
    前記制御配列の活性依存性活性化が起こると、前記標識ポリペプチドが発現されて、前記活性細胞を標識する、方法。
  27. 前記接触させることが、インビトロで行われる、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記接触させることが、インビボで行われる、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記細胞はニューロンである、請求項２６〜２８のいずれかに記載の方法。
  30. 前記ニューロンは哺乳動物ニューロンである、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記ニューロンは、脊椎動物の中枢神経系に存在する、請求項２９または３０のいずれかに記載の方法。
  32. 前記細胞を維持する間に、前記細胞を刺激と接触させることによって、前記制御配列を活性化させる、請求項２６〜３１のいずれかに記載の方法。
  33. 前記刺激は電気刺激である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記刺激は薬理学的刺激である、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記接触させることが、前記発現ベクターを、脊椎動物の中枢神経系に投与することによってインビボで行われ、前記維持することが、前記脊椎動物に、前記制御配列を活性化させるために十分な行動課題を行うことを含む、請求項２６〜３４のいずれかに記載の方法。
  36. 前記標識ポリペプチドは、分子タグである、請求項２６〜３５のいずれかに記載の方法。
  37. 前記標識ポリペプチドは、リコンビナーゼであり、前記細胞は、組換え配列を含み、組換えが起こると、分子タグの発現を誘発する、請求項２６〜３６のいずれかに記載の方法。
  38. 活性化された細胞の活性依存性制御のための方法であって、
    （ａ）細胞と、
    （ｉ）ｃ−Ｆｏｓの５’−非コード領域とｃ−Ｆｏｓの第１のイントロン配列とを含む制御配列、および
    （ｉｉ）前記制御配列に作動可能に連結する光応答性ポリペプチドをコードするコード配列とを含む発現カセットを含む発現ベクターとを接触させることと、
    （ｂ）前記制御配列の活性依存性活性化が可能な条件で前記細胞を維持することであって、前記制御配列の活性依存性活性化が起こると、前記光応答性ポリペプチドが、前記活性化された細胞中で発現される、前記細胞を維持することと、
    （ｃ）前記活性化された細胞を、前記光応答性ポリペプチドが前記細胞中での応答を誘発するきっかけとなるために十分な光にさらし、それによって、前記活性化された細胞を制御することとを含む、方法。
  39. 前記接触させることが、インビトロで行われる、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記接触させることが、インビボで行われる、請求項３８に記載の方法。
  41. 前記細胞はニューロンである、請求項３８〜４０のいずれかに記載の方法。
  42. 前記ニューロンは哺乳動物ニューロンである、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記ニューロンは、脊椎動物の中枢神経系に存在する、請求項４１または４２のいずれかに記載の方法。
  44. 前記細胞を維持する間に、前記細胞を刺激と接触させることによって、前記制御配列を活性化させる、請求項３８〜４３のいずれかに記載の方法。
  45. 前記刺激は電気刺激である、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記刺激は薬理学的刺激である、請求項４４に記載の方法。
  47. 前記接触させることが、前記発現ベクターを、脊椎動物の中枢神経系に投与することによってインビボで行われ、前記維持することが、前記脊椎動物に、前記制御配列を活性化させるために十分な行動課題を行うことを含む、請求項３８〜４６のいずれかに記載の方法。
  48. 前記応答は脱分極である、請求項３８〜４７のいずれかに記載の方法。
  49. 前記応答は過分極である、請求項３８〜４７のいずれかに記載の方法。
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