JP2019512479A - 抗菌薬耐性又はバイオフィルム感染症の温熱療法治療又は予防のためのシステム及び方法 - Google Patents

抗菌薬耐性又はバイオフィルム感染症の温熱療法治療又は予防のためのシステム及び方法 Download PDF

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Abstract

本システムは、ナノ粒子集合体（ＮＰＡ）を受容し、微生物に感染したまたは感染する危険性のある生物の局所領域に向けて搬送される支持体を含み、前記ナノ粒子集合体（ＮＰＡ）は、熱エネルギーに反応可能である金属コア及び前記金属コアを取り囲む表面をそれぞれ有する複数のナノ粒子（ＮＰｓ）と、前記ナノ粒子集合体に暴露された前記局在領域に少なくとも１回のサーマルショットを適用することにより、前記ナノ粒子集合体（ＮＰＡ）を介して前記局在領域の温度を所定の値まで上昇させ、それによりナノセラノスティクス・マルチモーダル抗菌療法を可能にするように構成されたエネルギーユニット（１５）と、含み、前記金属コアは銀、金、鉄、又は銀と金との混合物からなる。

Description

本発明は、概して、温熱療法の技術分野に関する。より詳細には、本発明は、抗菌薬耐性及びバイオフィルム感染症を治療及び予防する温熱療法の技術分野にある。
効果的な抗生物質へのアクセスは、全ての医療システムにおいて不可欠である。それらの使用は、小児死亡率を減少させ、平均余命を増加させ、がん化学療法及び固形臓器移植のような侵襲的手術及び治療に重要である。抗菌薬耐性（ＡＭＲ）は、それ自体では病気ではなく概念であり、その劇的な増加にもかかわらず、ＳＡＲＳ、流行性インフルエンザ、エボラ等の急性感染の脅威や、ＨＩＶ、結核、及びマラリアの３つの主要な感染症と同じようには注目されていない。ＡＭＲは世界的な経済、社会、及び公衆衛生に影響を与える深刻な世界的脅威である。最新の世界経済フォーラム（Ｗｏｒｌｄ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｆｏｒｕｍ）のグローバルリスク（Ｇｌｏｂａｌ Ｒｉｓｋｓ）報告書によれば、ＡＭＲは人間の健康に対する社会的リスクの最大の脅威の１つであるとされている。
入院患者に感染を引き起こすという点で最も重要なＡＭＲ細菌は、いわゆる「ＥＳＫＡＰＥ」病原体である。これらはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及びエンテロバクター属菌（Ｅｎｔｅｍｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）である。ＡＭＲの最も顕著な脅威は、過去数年間で病院感染を引き起こすＡＭＲ「ＥＳＫＡＰＥ」細菌間の耐性が急激に上昇してきたことである。ＥＳＫＡＰＥ病原体に加えて、ＡＭＲ大腸菌は、依然として入院患者における重度の敗血症による死亡の主要な原因となっている。カルバペネム耐性を含むＭＤＲ耐性のレベルが高い国において、カルバペネム耐性緑膿菌（ＭＤＲ／ＸＤＲ緑膿菌発生率：２５〜５０％）に起因する感染症の場合、わずかな治療選択肢しか利用できず、この中にはポリミキシンがある。これらの国々において、ＭＤＲ／ＸＤＲ緑膿菌の場合、ポリミキシン又はアミノグリコシドに対する耐性の存在は、感染した患者の治療の選択肢が更に限定されつつあるという重要な警告である。そして、治療に十分効果的な抗生物質はほとんどない。それでも作用する抗生物質は、しばしば重大な副作用を有するか、効力が低いか、又は非常に高価である（チゲサイクリン）。ＡＭＲは、人的被害という点だけでなく、金銭面でも多大な損害をもたらす。ＡＭＲは現在、欧米だけで毎年少なくとも５万人、世界中で約７０万人の命を奪うものであり、毎年１５億ユーロ又は３５億ドルを超える予算を必要としている。
既存の薬剤に対する耐性の上昇に加えて、新たな抗生物質も開発されていない。長年、製薬業界は新しい抗菌薬の量産に成功している。しかし、新規抗生物質を見つけることはますます難しくなり、そのプロセスは非常にコストがかかり、多くの場合、功を奏さないため、多くの大手製薬会社は、抗生物質の開発プログラムから撤退している。驚くべきことに、新たな抗生物質がほとんど開発されていない一方で、大変な速度で耐性が広がっているために、既存の抗生物質は効力を失いつつある。故に、抗生物質開発の低下傾向に伴って、耐性細菌のレベルが上昇しているという最悪の事態のような矛盾した状況に我々は直面している。
ＡＭＲ細菌の蔓延は、前抗生物質時代の暗黒時代まで近代医学を劇的に後退させる可能性があり、今日当たり前と考えている分娩、帝王切開、早産児の治療、大手術や更には不潔な小手術、肺炎の治療、性感染症、臓器移植、及びがん化学療法の安全性の低下等、現代医学の成果は、抗生物質による細菌感染の有効な治療へのアクセスなしでは不可能であろう。
抗生物質の有効性を保つために、ヒトと動物の両方の医療分野において様々なレベルの様々な政策の他に、ＡＭＲ治療のための新しい抗生物質や代替手段の開発、緊急に必要とされる抗生物質の開発に対する経済的インセンティブの増大に関連する研究資金に対する緊急の必要性が認識されている。
更に、関節置換や他のタイプの整形外科器具、人工心臓弁、ペースメーカー、埋め込み型除細動器、尿カテーテル及びステント、腹膜透析カテーテル、血管内カテーテル、脳脊髄液シャント、乳房インプラント、並びに血管グラフト及びステント等の医療機器に関連する治療が困難な慢性感染症は、今日の医療実務において一般的である。これらの機器が感染すると、関連する感染症をうまく治療するために頻繁に機器を除去する必要がある。機器の除去は、重要な罹患率、費用、場合によっては死亡率に関連する。ステント、シャント、プロテーゼ、インプラント、気管内チューブ、ペースメーカー、及び様々なタイプのカテーテル等の機器は、様々な細菌種又はカンジダ属菌（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）によるコロニー形成及びバイオフィルム形成を補助することが示されている。これらの細菌種又はカンジダバイオフィルムは、プランクトン細胞よりも３０〜２，０００倍高い抗菌剤耐性を有する。
当技術分野では、ナノ粒子を用いて特定の細胞に薬物を送達する可能性を提供したナノテクノロジーの価値が知られている。ナノテクノロジーは、ナノスケール範囲（１〜１００ｎｍ）でサイズ及び形状を制御することによる、材料、構造、機器、及びシステムの意図的な設計、特徴付け、製造、及び応用として定義される。ナノ材料は、生体分子及びシステムと同様のスケールであるが、様々な機能を有するように設計することができるため、ナノテクノロジーは医療用途に潜在的に有用である。ナノ医薬の分野は、分子レベルでの疾患の診断及び治療のために、ナノ材料の特性と物理的特徴を使用することを目指している。ナノ材料は現在、生物学的障壁を通して輸送治療剤の運搬を補助する、分子にアクセスする、分子相互作用を媒介する、及び高感度・高スループットの方法で分子変化を検出するように設計されている。原子や巨視的材料とは対照的に、ナノ材料は、光学的、電子的、磁気的、及び生物学的特性が調整可能であるだけでなく、容量に対する表面積の比も高く、様々なサイズ、形状、化学組成、表面化学特性、及び中空構造又は中実構造を有するように設計することができる。これらの特性は、新世代の薬物送達ビヒクルに組み込まれており、そのうちのいくつかは現在臨床試験中であるか、又はヒトにおける使用のために食品医薬品局（ＦＤＡ）によって既に認可されている。
腫瘍性疾患及び感染症の画像化、診断、及び治療に役立つ金ナノ粒子及び銀ナノ粒子の価値も当該技術分野で知られている。更に、この物体の設計では、プログラムされた崩壊も計画されているので、機器は、使用後、その役目を終えると安全なイオン種に解体され、最終的に身体によって排泄される。小さいＡｇＮＰ（タンパク質のサイズ）は、インビボで腐食し溶解して、ＲＯＳを誘発し細菌の呼吸機構を妨害するＡｇ＋イオンを産生し、結果として非常に広いスペクトルの抗生物質をもたらすことが知られている。そして、Ａｇ＋と抗生物質とによって、永続的な細菌死滅の相乗作用が得られる。
従来の腫瘍治療に対する補助療法としての温熱治療への関心は過去２０年間で増加している。ここで温熱治療は、従来の治療に対して組織を感作させるか、又は腫瘍退行を誘導するために、腫瘍、組織、又はシステムを最高４２℃の温度まで加熱することを指す。しかし、療法としての温熱治療は何千年も前に遡り、エジプト人、ギリシア人、ローマ人は、石やレンガの蒸気に加熱された液体を、おそらくは乳がんであるものの治療に使用していた。現代医学における温熱治療は、１８９８年に婦人科医Ｆｒａｎｓ Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｋによって最初に使用され、温水を腔内螺旋管に流すことによって局所的に進行した子宮頸がんにおいて優れた応答を達成した。その後、温熱治療は様々な医療環境で使用されてきた。
適度な温熱治療（４２℃以下）は、酸素供給により腫瘍血流を増加させるため、酸素供給を増やすことによって放射線増感剤として、及び腫瘍床における化学増感剤として作用することができる。これは潜在的に、温熱治療が血管新生を改変する方法である。温熱治療はまた、タンパク質変性、タンパク質折り畳み、凝集、及びＤＮＡ架橋により細胞プロセスに影響を及ぼし、生体分子集合体の破壊、ヒートショックタンパク質の誘導、及びアシドーシス又はアポトーシスの発生を促進する細胞機構の破壊を引き起こす。適用の程度に応じて異なる機構を介して熱を供給することができる。例えば、エネルギー源としては、超音波、熱室、レーザー光、近赤外光、又は放射線療法を挙げることができる。
ナノ粒子を使用する温熱治療は、腫瘍組織の加熱制御を可能にする新規概念である。ナノ粒子による温熱治療は、直接的な治療効果を有し、且つ単一治療での薬物送達を増強することができ、がん治療の２つの利点を有する治療法となる。ナノ粒子は、局所熱源（ナノ粒子）を腫瘍内に集中させることにより、理論的には健常細胞への熱誘導損傷を最小限に抑えることができるので、温熱治療の興味深い応用形態を提供する。更に、ナノ粒子は、温熱治療が誘発されると同時に化学療法薬を腫瘍に送達するためのビヒクルを提供する。このような複合ナノ粒子は、化学増感効果を直接的に利用することができる。そこで、ナノスケール技術を用いて温熱治療効率を高めた。具体的には、金系ナノ粒子（ＡｕＮＰ）、炭素系ナノ粒子（ＣＮＰ）及び酸化鉄ナノ粒子（ＩＯＮＰ）は、温熱治療改善のための最も有望なナノサイズの構造物であるようである。金や銀のナノ結晶及びナノロッドを含む金属ナノ材料は、入射光放射の吸収及び表面プラズモンの緩和により局所的な温熱を生成することが示されている。金ナノ粒子の加熱は、高周波（ＲＦ）電界下でも実証されている。しかし、複数の加熱機構が提案されており、ＲＦ電界における金粒子の加熱の程度は不確実である。
国際公開第２０１５１４８７２６号は、感染の防止を確実にし、且つ抗生物質耐性の発生を回避するべく、殺菌剤を放出するように作動可能なコーティングを開示している。銀イオンは、抗菌特性のために使用される。更に、逆電気分解により、持続された期間にわたってイオンが放出され、その後、銀中毒を回避するためにインプラント上に回収される。無線逆電気分解システムは、関節インプラント周囲のバイオフィルムを分解するのに十分な量の銀イオンを放出する。正味の負の値を有する変調された電流波形を導電性銅ストリップに印加することによって、銀コーティング表面に誘導されるミラー電流は正味の正の流れを有し、イオンを周囲の組織に放出させる。細菌を死滅させるために銀イオンの電気分解を誘発する能力は、術後感染を回避するために使用することができる。
国際公開第２０１７０２５１０４号は、化学物質を送達するのに適した送達装置、例えば、海洋塗料用の防汚剤を含むマイクロカプセルの形態の医療装置に関する。この送達装置は、最も内側の壁面によって画定される閉じた空洞を含み、内壁表面の少なくとも一部は送達膜の内面を構成し、この送達膜はホストポリマーとゲストポリマーとを含む相互貫入ポリマーネットワーク基材を含み、このゲストポリマーがホストポリマーを相互貫入して前記ホストポリマー内に実質的に連続した経路を形成する。
先行技術の文献のいずれも、微生物に感染しているか又は感染するリスクのある患者の局所領域に配置され、１以上のサーマルショットによって活性化されるように意図された支持体（例えば、ヒドロゲル、足場等）上に送達されるナノ粒子集合体を開示していない。更に、先行技術文献のいずれも、サーマルショットが適用されると局所領域のアプタマーとして作用する、ナノ粒子の表面に付着した抗菌剤の会合を開示していない。
国際公開ＷＯ２０１５／１４８７２６号公報 国際公開ＷＯ２０１７／０２５１０４号公報
本発明は、ＡＭＲ及びバイオフィルム感染症のための先進的な標的化温熱療法抗生物質セラノスティクスナノ粒子（ＮＰ）システム及び方法に関する。
本発明は、多剤耐性（ＭＤＲ）／超多剤耐性（ＸＤＲ）細菌感染症又は治療若しくは予防が非常に困難なバイオフィルム感染症を治療又は予防するために、先に説明した原理の一部を応用する。
この目的のために、本発明の実施形態は、第１の態様によると、ナノ粒子集合体を受容するように構成され、且つ微生物に感染した又は感染する危険のある生物の局所領域に向かって搬送されるように構成され、前記ナノ粒子集合体が金属コア及び前記金属コアを取り囲む表面をそれぞれが有する複数のナノ粒子を含み、前記金属コアが熱エネルギーに反応可能である支持体（例えば、メッシュ、血管又は尿カテーテル、ヒドロゲル、プロテーゼ、ステント、縫合糸、糸、ワイヤ、電極、又は気管内チューブ）；及び前記ナノ粒子集合体に暴露された前記局在領域に少なくとも１回のサーマルショットを適用する（一般的に短時間の熱エネルギーの供給）ことにより、前記ナノ粒子集合体を介して前記局在領域の温度を所定の値まで上昇させ、それによりナノセラノスティクス・マルチモーダル抗菌療法を可能にするように構成されたエネルギーユニット；を備える、抗菌薬耐性又はバイオフィルム感染症の温熱療法治療又は予防のためのシステムを提供する。
金属コアは、銀（Ａｕ）、金（Ａｇ）、それらの混合物（Ａｕ／Ａｇ）、又は鉄からなるものでもよい。
一実施形態によれば、少なくとも１つの抗菌剤はナノ粒子の表面に付着し、前記少なくとも１つの抗菌剤は、それ自体が局所領域のアプタマーとして作用するように構成されている。
一実施形態によれば、各ナノ粒子の表面は、ナノ粒子が生物によって異物として認識されないようにするために、ｍＰＥＧ被覆を含む。
一実施形態によれば、システムはまた、少なくとも１回のサーマルショットが適用された後の局所領域の前記温度上昇が４０℃を超えないように制御するように構成された制御ユニットを備える。制御ユニットは、独立ユニットであってもよいし、エネルギーユニットに一体化してもよいことに留意されたい。
更に別の実施形態によれば、ナノ粒子は、少なくとも１つの抗菌剤に対する金属コアジョイントを含む。
サーマルショットは、近赤外線エネルギー、低強度パルス超音波エネルギー、低超音波エネルギー、光線療法、低電圧電気加熱、電気分解、又は放射線療法による低電圧電気加熱のいずれかを含むことができる。
本発明の実施形態はまた、第２の態様によると、熱エネルギーに反応可能である金属コア及び前記金属コアを取り囲む表面をそれぞれが有する複数のナノ粒子を含むナノ粒子集合体を包含する支持体を、微生物に感染した又は感染する危険のある生物の局所領域に向かって支持体を搬送すること；及び前記ナノ粒子集合体に暴露された前記局所領域に少なくとも１回のサーマルショットをエネルギーユニットによって適用することにより前記ナノ粒子集合体を介して前記局所領域の温度を所定の値に上昇させ、それによりナノセラノスティクス・マルチモーダル抗菌療法を可能にすること；を含む、抗菌薬耐性又はバイオフィルム感染症の温熱療法治療又は予防のための方法を提供する。
この方法の一実施形態によれば、前記サーマルショットが適用された後の局所領域の前述の温度上昇は、４０℃を超えないように制御される。
光、熱伝導、電流、超音波等の様々な手段によって、エネルギーを局所領域に供給することができる。
一実施形態によれば、少なくとも１つの抗菌剤は、前記ナノ粒子の表面に付着し、処置されるべき前記局所領域のアプタマーとして作用する。ナノ粒子は、付着した抗菌剤に対する金属コアジョイントを含み得る。
更に、各ナノ粒子の表面は、ナノ粒子が生物によって異物として認識されないようにするために、ｍＰＥＧ被覆も含み得る。
ほとんどの場合、前述のサーマルショットを含む治療には、微生物増殖の検出のために制御下に維持される治療すべき感染症の活性に応じて所定の持続期間（通常は１５分〜８時間）の後に繰り返されるいくつかのサーマルショットを包含する。好ましくは、サーマルショットの繰り返しは、エネルギーユニットに機能的に接続された制御ユニットによって管理され、制御ユニットの一部を形成するか、又は独立ユニットである。治療は、異なる、好ましくは連続した日に適用することができる。
ナノ粒子の表面に付着することができる抗菌剤は、グラム陽性球菌、グラム陰性桿菌、又は抗細菌剤に対して異なる効果を有することができ、以下のマイコバクテリア薬：抗菌薬アズトレオナム、アミノグリコシド（アミカシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン）、カルバペネム（ドリペネム、エルタペネム、イミペネム−シラスタチン、メロペネム）、セファロスポリン（セフェピム、セファゾリン、セフォキシチン、セフィキシム、セフォペラゾン−スルバクタム、セフォタキシム、セフタジジム、セフトリアキソン、セフロキシム、セフタロリン、セフチゾキシム）、クリンダマイシン、フルオロキノロン（シプロフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、オフロキサシン）、フシジン酸、グリコペプチド、グリコリポペプチド、リポペプチド（ダルババンシン、ダプトマイシン、テラバンシン、テイコプラニン、バンコマイシン）、リネゾリド、マクロライド（アジスロマイシン、クラリスロマイシン）、ペニシリン（アモキシシリン、アムロシリン、クラブラン酸塩、アンピシリン、アンピシリン−スルバクタム、ピペラシリン、ピペラシリン−タゾバクタム、チカルシリン、チカルシリン−クラブラン酸塩、テモシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ）、ポリミキシン（コリスチン、ポリミキシンＢ）、テトラサイクリン（ドキシサイクリン、ミノサイクリン）、スルファジアジン、トリメトプリム＋スルメトキサゾール、チゲサイクリン、ホスホマイシン、キヌプリスチン＋ダルフォプリスチン、クロラムフェニコールから選択可能である。
提案された方法の特定の実施形態によれば、アミカシン、カプレオマイシン、クロファジミン、エタンブトール、エチオナミド、イソニアジド、カナマイシン、パラアミノサリチル酸、ピラジナミド、リファブチン、リファペンチン、又はストレプトマイシンのような抗マイコバクテリア剤が更にナノ粒子集合体に包含される。
開示された方法は、膿瘍（脳、硬膜下膿瘍、硬膜外、肺、胸膜、肝臓、脾臓、腎臓、若しくは腎周囲、婦人科系、腹腔内、筋肉、皮下）、縦隔炎、急性及び慢性骨髄炎、糖尿病性足感染、プロテーゼ感染（整形外科インプラント関連感染症、血管グラフト感染、気管ステント感染等）、長期カテーテル関連血流感染のロック療法、慢性前立腺炎、感染又は定着した気管内チューブ又は尿カテーテルの除菌又は消毒、脳脊髄液シャント及びドレーン感染、蜂巣炎、壊死性筋膜炎、及び皮下組織感染のような治療が困難な感染症を治療若しくは予防するため、又はその抗菌／外科療法の補助療法として使用することができる。
別の実施形態によれば、本方法は、ＭＤＲ／ＸＤＲ緑膿菌、ＭＤＲ／ＸＤＲクレブシエラ・ニューモニエ、ＭＤＲ／ＸＤＲアシネトバクター・バウマニ、大腸菌、及び２種を超える抗菌薬に耐性のある他のグラム陰性桿菌（ＧＮＲ）によって引き起こされるＧＮＲ細菌感染症を治療又は予防するために使用するのにも適している。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌によって引き起こされるＭＤＲグラム陽性球菌感染症。更に、本方法は、バイオフィルム中で増殖する細菌、特にコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、及び緑膿菌による感染症を治療するために使用してもよい。更に、本方法は、ＭＤＲ若しくは超多剤耐性ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、又は治療が困難な他の非定型マイコバクテリアを処理するために使用してもよい。
提案された方法は、独特の治療又は予防として使用することができ、あるいは治療が非常に困難なこれらＡＭＲ又はバイオフィルム感染症の選択的抗菌又は外科的治療の補助薬又は補完物となる。
従って、本発明は、ＡＭＲ又はバイオフィルム感染症に対処するための標的化温熱療法抗生物質セラノスティクスナノ粒子を作製することに基づいている。本発明は、数回のショットで異なるＡＭＲ感染を診断し、治療することができる。
本発明は、それ自体で抗菌効果を有し、温熱療法を施し、且つ画像診断（Ｘ線、ＣＴスキャン、ＭＲＩ）用造影剤として役立つ、十分な量の薬物を搬送することを意図した多機能方法を提供する。ナノ粒子コアは、治療必要性の関数として、化学的安定性（従って、銀の腐食を制御する）及び生体内分布を調整するために、異なるサイズのＡｕ−Ａｇ ＮＣ（合金、コア−シェル、及びヘテロ二量体）の混合物からなることが好ましい。これらのナノ粒子は、異なる抗生物質をナノ粒子の表面に付着させ、アプタマーとして作用させて、所望の微生物に向かって「指向」させ、同時に複数の抗菌効果及び熱効果を可能にする。バンコマイシンを保有するＡｕ−Ａｇ官能化ナノ粒子は、ＭＤＲ／ＸＤＲグラム陽性感染症、コリスチン又はアミカシンを搭載したＭＤＲグラム陰性感染症、及びアミカシンが付着したＸＤＲヒト型結核菌を標的とする。腫瘍性疾患の画像化、診断及び治療に役立つ金ナノ粒子の価値が知られている。更に、この物体の設計においては、プログラムされた崩壊も計画されているので、使用後、その役目を終えると、支持体は安全なイオン種に解体され、最終的に身体によって排泄される。小さいＡｇ ＮＰ（タンパク質のサイズ）は、インビボで腐食し溶解して、細菌の呼吸機構を妨害するＡｇ＋イオンを産生し、結果として非常に広いスペクトルの抗生物質をもたらすことが知られている。そして、Ａｇ＋、抗生物質及び温熱治療の効果によって、永続的な細菌死滅の相乗作用が存在する。
温熱治療の存在下で、ナノ粒子自体からのＡｕ、Ａｇ、又はＡｕ−Ａｇが熱を吸収する。温熱治療の場合、酸素供給の増加、血管新生、ヒートショックタンパク質の誘導、最終的にはＤＮＡ細菌の損傷や死滅を誘発するＲＯＳの産生等、温熱治療の有益な効果を強化するために、Ａｕ、Ａｇ、又はＡｕ−ＡｇＮＰが熱源を濃縮する。
本発明は、様々なＡＭＲ感染症又は治療が非常に困難な細菌感染症を、数ショット（即ち、所与の時間間隔で分離された、いくつかのサーマルショット（感染のタイプに応じたサーマルショットの数）でナノ粒子に伝達される熱エネルギー）で診断し治療することができる。
本発明は、抗菌効果を有し、温熱療法を施し、且つ温熱療法によって活性化可能な薬剤及び画像診断（Ｘ線、ＣＴ Ｓｅａｎ、ＭＲＩ）用造影剤として役立つ金属コアを十分な量で搬送することができる。
特定の実施形態において、金（１０ｎｍ）及び銀（１５及び４０ｎｍ）ナノ粒子は、異なる抗生物質（アミカシン及びコリスチン）と共にインキュベートされる。異なる緩衝液を使用して表面及び抗生物質分子の電荷を制御し、それにより、それらの静電相互作用を制御する。ＵＶ−ＶＩＳ分光法及びＺ電位を用いて接合をモニタリングする。
更に、前述の戦略によって、本発明は、異なるＸＤＲ細菌感染マウスモデルにおける、Ａｕ−ＡｇＮＰ又はＡｕＮＰのいずれかと抗生物質又はＡｕとの混合物の多機能性ナノ粒子の有効性の評価を提供するものであり、この評価は、第一には、サーモナノ抗生物質が薬物ターゲティングを改善すること、第二には、薬物ターゲティングがサーモナノ抗生物質療法を改善することを示そうとするものである。
前述の及び他の利点及び特徴は、添付の図面を参照して、以下の実施形態の詳細な説明からより完全に理解されるであろう。添付の図面は、例示的且つ非限定的であるとみなされなければならない。
本発明の動作原理の一実施形態、即ち、抗菌薬耐性感染症又はバイオフィルム感染症を治療するためのナノセラノスティクス温熱療法戦略を示す概略図である。この特定の実施形態によるナノ粒子は、異なる抗生物質が表面に付着し、アプタマーとして作用するのを可能するＡｕ−Ａｇ金属コアを含む。 この場合には光線療法を用いてサーマルショットを適用するための提案された方法の実施形態の概略図である。 ４時間、８時間、及び２４時間でのＡＫ、ＡｇＮＰ、ＡｇＮＰ＿ＡＫの時間−殺菌曲線アッセイを例証する。（ａ）緑膿菌株、（ｂ）クレブシエラ・ニューモニエ株、及び（ｃ）アシネトバクター・バウマニ株。 緑膿菌の高リスククローン（ＳＴ１７５）で評価されたサーマルショット適用のための光線療法（光）による温熱治療を用いたＡｇＮＰ＿ＡＫの有効性を示す。 緑膿菌の高リスククローン（ＳＴ１７５）で評価された本発明の適用のための熱による温熱治療を用いたＡｇＮＰ＿ＡＫの有効性を示す図である。 ａ）ＸＤＲ緑膿菌（Ｐａ１０１６）、ｂ）ＸＤＲアシネトバクター・バウマニ（ＡｂＩ４）、及びｃ）ＸＤＲクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｐ１）菌株において評価された低アンペアの直流＋砂浴による温熱治療を用いたＡｇＮＰ＿ＡＫの有効性を示す図である。全ての画像において、最初の図は、拡大したグラフを表している（１番目のグラフは３ＥＣまで、２番目のグラフは２４時間まで）。 ＰＡＯ１株で評価した低アンペアの直流＋砂浴による温熱治療を用いたＡｇＮＰ＿ＡＫの有効性を示す。ａ）対照（３７℃でのプレート）のうちの１つの治療群、及びｂ）サーモショット（ＴｈｅｒｍｏＳｈｏｔ）プレートの治療群。ＥＣ＋砂浴による温熱治療。 Ｋｐ３株で評価された低アンペアの直流＋電気分解による温熱治療を用いたＡｇＮＰ＿ＡＫの有効性を示す。
本発明は、ＡＭＲ／ＸＤＲ細菌又はバイオフィルム感染症を治療又は予防する治療用マルチモーダルシステム及び方法を提供する。
一実施形態によれば、提案されたシステムは、ナノ粒子集合体ＮＰＡを受容し、微生物に感染した又は感染する危険のある生体の局所領域に向かって搬送されるように構成された支持部（図示せず）を備える。ナノ粒子集合体ＮＰＡは、金属コア及び該金属コアを取り囲む表面をそれぞれが有する複数のナノ粒子ＮＰを含み、金属コアは熱エネルギーに反応可能である。エネルギーユニット１５（図２のその例を参照）は、ナノ粒子集合体ＮＰＡに暴露された前記局所領域に少なくとも１回のサーマルショットを適用する（短時間での熱エネルギーの供給）ことにより前記局在領域の温度を上昇させ、それによりナノセラノスティクス・マルチモーダル抗菌療法を可能にするように構成される。
図１の実施形態によれば、金属コアは、金と銀との混合物からなる。他の実施形態によれば、図示されていないこの場合、金属コアは銀、金、又は鉄からなる。
提案されたシステムは、好ましくは、エネルギーユニット１５に少なくとも接続され、且つエネルギーユニット１５とは独立しているか、又はそこに一体化された制御ユニット（図示せず）も備える。制御ユニットは、少なくとも１回のサーマルショットが適用された後の局所領域の温度上昇が４０℃を超えないように制御するように構成される。更に、制御ユニットは、所与の持続時間の間隔で分離されたサーマルショットの繰り返しを制御するように構成されてもよい。
図１の実施形態によれば、ナノ粒子ＮＰはまた、表面に付着させた１つ以上の抗菌剤（図１に例証されるような抗生物質Ａｂ）を含む。様々な抗生物質がアプタマーとして作用する性質を有する。例示されていない代替の実施形態では、ナノ粒子はいかなる抗生物質も含まない。
各ナノ粒子ＮＰの表面はまた、ナノ粒子ＮＰが生物によって異物として認識されないようにするために、ｍＰＥＧ被覆を含み得る。
１回又はそれ以上のサーマルショットは、様々な戦略によって適用することができる。例えば、（図２に示すように）ランプを使用する光線療法（光）又は熱（例えば、ホットプレート）等による適用である。電流電源を用いた低アンペアの直流＋砂浴を使用することもできる。後者の場合、白金電極が使用される。
ナノ粒子集合体ＮＰＡが配置され得る支持体は、とりわけ、メッシュ、血管若しくは尿カテーテル、ヒドロゲル、プロテーゼ、ステント、縫合糸、糸、ワイヤ、電極、又は気管内チューブのいずれかを含み得る。
以下、提案された方法及びナノ粒子調製プロセスの様々な実施形態を詳細に説明する。
ｉ）本発明は、標的化温熱療法ナノセラノスティクス抗菌デバイスを使用することによって、抗菌薬耐性感染症及び細菌性バイオフィルムに起因する治療が困難な感染症に対する治療用マルチモーダル戦略を開発する。この戦略により、マルチモーダル治療における直接的な治療効果が得られる。
ｉｉ）銀ナノ粒子の合成及び特徴付け並びに抗生物質との結合
−銀ナノ粒子（ＡｇＮＰ）の合成：ＡｇＮＰをシード成長技術によって調製した。三つ口丸底フラスコに、５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ＳＣ）及び０．０２５ｍＭのタンニン酸（ＴＡ）を含有する１００ｍＬの水溶液を調製した。この溶液を激しく攪拌しながら加熱マントルで加熱し、凝縮器で溶媒の蒸発を回避した。５分間の煮沸後、２５ｍＭの硝酸銀（ＡｇＮＯ３）１ｍＬを注入した。溶液は直ちに明るい黄色になった。１０分間激しく撹拌した後、１ｍＬのアリコートを抽出して特徴付けを行った（ｇ００）。
−銀ナノ粒子の成長：ＡｇＮＰを１０ｎｍから２０ｎｍ（ｇ０１及びｇ０２）まで成長させるために、溶液の温度を９０℃まで冷却した。次いで、０．１ｍＬのＳＣ（２５ｍＭ）、０．２５ｍＬのＴＡ（２．５ｍＭ）及び０．２５ｍＬのＡｇＮＯ３（２５ｍＭ）を２サイクル注入した（時間遅延：約１分）。１５分後、１ｍＬのアリコートを更なる特徴付けのために抽出した。全てのプロセス（合成及び成長）において、ＡｇＮＰは光からの保護下で、合成からの元の溶液中に保存された。
−ｍＰＥＧ及び抗生物質とのナノ粒子の結合：結合にはアミカシン又はコリスチンを用いた。カチオン性界面活性剤としては、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＯＨ）（１０ｍＭ）を用いた。これは、ＡｇＮＰの凝集を回避するために必要であった。得られたナノ粒子を、室温で２サイクルの遠心分離（２０，０００ｇ、２０分間）によって精製した。第１のペレットを蒸留水で再懸濁し、第２のペレットを同じ容量のＴＭＡＯＨ（１０ｍＭ）に再懸濁した。この溶液をガラスバイアルに移し、マグネチックスターラーを用いて撹拌した。次いで、少量のアミカシン又はコリスチンを添加してＡｇＮＰと混合した最終濃度１２．８ｍｇ／Ｌを達成した。室温で激しく撹拌して１時間後、メルカプトポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）とアミカシン又はコリスチンとの混合溶液を添加した。ｍＰＥＧの最終濃度は０．３μＭであったが、抗生物質の最終濃度は２５．６ｍｇ／Ｌであった。３０分間激しく撹拌した後、調製した溶液を精製し（２０，０００ｇ、２０分間）、ペレットを蒸留水で元の容量まで再懸濁した。
−技術：アミカシン又はコリスチンと結合したナノ粒子の各工程の特徴付けをＵＶ−Ｖｉｓ分光光度法によって分析し、ＡｇＮＰ溶液を細胞に入れ、室温にて３００〜８００ｎｍの範囲でスペクトル分析を行った。動的光散乱（ＤＬＳ）を用いてＡｇＮＰのサイズを測定した。１ｍＬのＡｇＮＰを細胞に入れ、ＤＬＳ及びＺ電位分析を行った。透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いてＡｇＮＰの画像を視覚化した。調製したコロイド状ＡｇＮＰをサイズ分布測定に使用した。
ｉｉｉ）金ナノ粒子の合成及び特徴付け並びに抗生物質との結合
−金ナノ粒子の合成：金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）をシード成長法により作製した。１５０ｍＬのＳＣ（２．２ｍＭ）水溶液、０．１ｍＬのＴＡ２．５ｍＭ及び１ｍＬの炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３、１５０ｍＭ）を、２５０ｍＬの三口丸底フラスコに加えた。激しく撹拌しながら加熱マントルで溶液を加熱した。凝縮器を利用して溶媒の蒸発を防止した。温度が７０℃で安定した後、前駆体であるテトラクロロ金酸（ＨＡｕＣｌ４、２５ｍＭ）１ｍＬを注入した。溶液の色は１０秒未満で黒灰色に変わり、その後１〜２分で橙赤色に変化した。溶液を７０℃で５分間更に撹拌して反応を完了させた。得られた粒子（約３．５ｎｍ、７・１０１３ＮＰ／ｍＬ）を負電荷で被覆し、数週間安定させた。
−金ナノ粒子の成長：Ａｕシードを合成した直後に同じ容器内で、サンプルを５５ｍＬで抽出し、次に２．２ｍＭのＳＣを５５ｍＬ加えて希釈した。次に、温度が７０℃で安定したままであるとき、０．５ｍＬのＨＡｕＣｌ４（２５ｍＭ）を１０分間隔で順次２回注入した。サンプルの希釈とＨＡｕＣｌ４の２回の注入とを含むこの成長段階を、粒子が所望のサイズに達するまで繰り返した。
−ｍＰＥＧ及び抗生物質とのナノ粒子の結合：得られたナノ粒子を、１ｍＬのエッペンドルフにおいて室温で遠心分離（１５０００ｇ、１５分間）することによって精製した。ペレットを１０ｍＭのＴＭＡＯＨで元の容量まで再懸濁した。
この溶液をガラスバイアルに移し、マグネチックスターラーを用いて撹拌した。次いで、少容量のコリスチン／アミカシンを添加して、ＡｕＮＰと混合した最終濃度１２．８ｍｇ／Ｌを達成した。室温で激しく攪拌しながら１時間後、ｍＰＥＧと抗生物質との混合溶液を添加した。ｍＰＥＧの最終濃度は０．３μＭに設定し、抗生物質の最終濃度は２５．６ｍｇ／Ｌとした。
その後、３０分間撹拌し、調製した溶液を遠心分離し（２０，０００ｇ、２０分間）、ペレットを蒸留水で元の容量まで再懸濁した。
−技術：各工程のアリコートをＵＶ−Ｖｉｓ分光光度法によって特徴付けた。
ｉｖ）細菌の株及び増殖条件
プランクトン感受性試験のために、緑膿菌の３つの広範囲薬物耐性（ＸＤＲ）臨床分離株（Ｐａ１０１６；コリスチン及びアミカシンにのみ感受性であるＡｍｐＣのハイパープロダクション、ＯｐｒＤ不活性化（Ｑ１４２Ｘ）を含むＸＤＲ株、並びにスペインの病院で播種された分離株（ＳＴ１７５）、Ｐａ４６；コリスチン及びアミカシンにのみ感受性であるＶＩＭ−２を含むＸＤＲ株（ＳＴ１１１）、並びにＰａ５４；コリスチン及びアミカシンにのみ感受性であるＶＩＭ−２を有するＸＤＲ株（ＳＴ１１１））（表１）、クレブシエラ・ニューモニエの４つのＸＤＲ臨床分離株（Ｋｐ１；コリスチン、ホスホマイシン、及びアミカシンにのみ感受性であるＣＴＸ−Ｍ及びＯＸＡ−４８を産生するＸＤＲ株、Ｋｐ２；ホスホマイシン及びコリスチンにのみ感受性であるＣＴＸ−Ｍ及びＮＤＭを産生するＸＤＲ株、Ｋｐ３；ゲンタマイシン及びコリスチンにのみ感受性であるＫＰＣカルバペネマーゼを産生するＸＤＲ株、並びにＫｐ４；コリスチン及びアミカシンにのみ感受性であるＡｍｐＣを産生するＸＤＲ株）（表２）、アシネトバクター・バウマニの３つのＸＤＲ臨床分離株（Ａｂ４２５６；ＸＸＸにのみ感受性であるＯＸＡ−５１及びＯＸＡ−２４を含む単離株（ＳＴ３８）、ＡｂＩ１；コリスチン及びチゲサイクリンにのみ感受性であるＯＸＡ−５１を有する単離株（ＳＴ１０３）、並びにＡｂＩ４；コリスチン、アミカシン、及びチゲサイクリンにのみ感受性であるＯＸＡ−５１を含む分離株（ＳＴ２））（表３）、２つの表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（ＳＥ１４及びＳＥ９４）、並びに２つのメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ１５及びＭＲＳＡ１６）を使用した。
バイオフィルム感受性試験のために、緑膿菌の１つの実験室バイオフィルム製造参照株（ＰＡＯ１）を使用した。
全ての菌株は、冷凍保存容器に−８０℃のスキムミルク中にて保存した。各実験の前に、菌株をトリプチケースソイ寒天培地（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ Ｓｏｙ Ａｇａｒ）中、３７℃で２４時間継代培養した。次いで、継代培養物からの細胞を、トリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）又はミューラ・ヒントンブロス（ＭＨＢ）に懸濁してマクファーランドスケールの濁度に達し、その後、接種材料を所望の濃度に調整した。
表１．緑膿菌株の感受性
ａＩＤ：株識別番号、ｂＣＳＴ：コリスチン、ＡＭＫ：アミカシン、ＴＯＢ：トブラマイシン、ＬＶＸ：レボフロキサシン、ＡＴＭ：アズトレオナム、ＩＰＭ：イミペネム、ｃＳＴ：シーケンスタイプ、Ｓ：感受性、Ｒ：耐性、Ｉ：中間。
表２．クレブシエラ・ニューモニエ株の感受性
ａＳ：感受性、Ｒ：耐性、ＡＭＰ：アンピシリン、ＣＡＺ：セフタジジム、ＦＥＰ：セフェピーム、ＩＭＰ：イミペネム、ＭＥＭ：メロペネム、ＣＩＰ：シプロフロキサシン、ＧＥＮ：ゲンタマイシン、ＡＫ：アミカシン、Ｔ／Ｓ：トリメトプリム／スルファメトキサゾール、ＦＯＳ：ホスホマイシン、ＣＳＴ：コリスチン。
表３．アシネトバクター・バウマニ同起源株の表現型及び遺伝子型の特徴
ＳＴ：シーケンスタイプ、ＳＧ：配列群、ＣＡＺ：セフタジジム、ＦＥＰ：セフェピーム、ＩＭＰ：イミペネム、ＭＥＭ：メロペネム、ＣＩＰ：シプロフロキサシン、ＬＥＶ：レボフロキサシン、ＧＥＮ：ゲンタマイシン、ＡＫ：アミカシン、Ｔ／Ｓ：トリメトプリム／スルファメトキサゾール、ＴＩＧ：チゲサイクリン、ＣＯ：コリスチン。フルオロキノロンに対する高レベル耐性に関与するアミノ酸変化；ＡＧＬＲ：ａａｃＡ４／ａｐｈ６Ａによるアミノグリコシドに対する耐性、ＣＨＤＬ：クラスＤカルバペネム加水分解β−ラクタマーゼ。
ｖ）感受性試験
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）値は、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｔｈａｔ Ｇｒｏｗ Ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ：Ａｐｐｒｏｖｅｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍ７−Ａ７．ＣＬＳＩ，Ｗａｙｎｅ，ＰＡ，ＵＳＡ，２００６」に従ってブロス微量希釈法によって測定した。コリスチン及びアミカシンを含まない薬物を評価して、ナノ粒子の有効性を比較した。ＭＩＣは、Ｐａ４６、Ｐａ１０１６、Ｋｐ１、Ｋｐ４、ＡｂＩ４、Ａｂ４２５６、ＭＲＳＡ１５、ＭＲＳＡ１６、ＳＥ１４、及びＳＥ９４株において評価した。ＡＴＣＣ緑膿菌２７８５３、ＡＴＣＣ大腸菌２５９２２、及びＡＴＣＣアシネトバクター・バウマニ１９６０６を品質管理として使用した。
ｖｉ）時間−殺菌曲線アッセイ
プランクトンに対するアミカシン結合銀ナノ粒子の有効性を、Ｐａ４６、Ｐａ１０１６、Ｋｐ１、Ｋｐ４、ＡｂＩ４、及びＡｂ４２５６株において評価した。時間−殺菌曲線アッセイは、（「Ｐｉｌｌａｉ Ｓｅａ．ＡｎｔｉＭｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ．Ｉｎ Ｖ．Ｌｏｒｉａｎ（ｅｄ．）、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５ｔｈ ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ．ｐ．３６５−４４０，２００５」）において以前に記載されたように行った。単独で試験した各抗菌剤の濃度はＭＩＣであり、ナノ粒子を異なる容量で加えた。ナノ粒子１ｍＬ及びナノ粒子２ｍＬ。抗生物質を含まない陽性増殖管を対照として用いた。試験管に接種し（最終濃度：５×１０５コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌ）、３７℃でインキュベートした。
インキュベーションの４、８、及び２４時間でｃｆｕ／ｍＬの数を決定した。３７℃で２４時間後、生菌数を測定した。この処理は、初期接種材料の３ｌｏｇ１０以上の減少に達したときに陽性の殺菌活性を有すると考えられた。
ｖｉｉ）サーマルショットの適用
ｖｉｉ．ｉ）サーマルショット：ＡｇＮＰを用いた光線療法（光）による温熱治療
標準化：
主な目的は、温熱治療として光（エネルギーユニット）１５を使用して１２ウェルプレートの培地において４０℃に達するのに要した時間を見出すことであった。対照ユニットを用いて培地の温度を評価した。その最も単純な例では、センサ温度計を制御ユニットとして使用することができる。
１２ウェルプレートにおいて、２ｍＬのミューラ・ヒントンブロス（ＭＨｂ）を対照として、１ｍＬのＭＨＢ＋１ｍＬのＡｇＮＰ及び１ｍＬのＭＨＢ＋１ｍＬのＡｇＮＰ＿ＡＫを処理物として異なる容量及び培地／処理物を試験した。最初に、プレートを３７℃で４５分間焼戻しした後、所定の距離Ｄ（好ましくは高さ約４５ｃｍ）で光の下に置いた。どの培地を使用したかにかかわらず、各ウェルプレートで４０〜４１℃に達するには１５分必要であった（図２）。
適用：
サーマルショット適用のための光線療法（光）による温熱治療を用いたプランクトンに対するアミカシン結合ＡｇＮＰの有効性を緑膿菌（Ｐａ１０１６）の高リスククローン（ＳＴ１７５）において評価した。
２枚のプレートを評価した。一方は３７℃（光線療法なし）で、他方では、Ｔ１ｈ、Ｔ１．５ｈ、Ｔ２ｈ、Ｔ２．５ｈ、及びＴ３ｈの異なる時点（Ｔ）で光線療法を１５分間適用した。光線療法後、２つのプレートのアリコートを取り出して生存細胞を決定し、次のヒートストロークを待ちつつプレートを３７℃に置いた。
最初の接種材料は１．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬであり、実験に使用した培地はＭＨＢであった。両方のプレート（光線療法の有無にかかわらず）には、増殖制御群、アミカシン（ＭＩＣ）群、及びＡｇＮＰ＿ＡＫ群がある。
この処理は、初期接種材料の３ｌｏｇ１０以上の減少に達したときに陽性の殺菌活性を有すると考えられた。
ｖｉｉ．ｉｉ）サーマルショット：ＡｇＮＰを用いた熱による温熱治療
標準化：
主な目的は、熱源（エネルギーユニット）としてヒーターを使用して１２ウェルプレートの培地において４０℃に達するまでに要した時間を見出すことであった。対照ユニットを用いて培地の温度を評価した。その最も単純な例では、センサ温度計を制御ユニットとして使用することができる。
１２ウェルプレートにおいて、２ｍＬのミューラ・ヒントンブロス（ＭＨｂ）を対照として、１ｍＬのＭＨＢ＋１ｍＬのＡｇＮＰ及び１ｍＬのＭＨＢ＋１ｍＬのＡｇＮＰ＿ＡＫを処理物として異なる容量及び培地／処理物を試験した。まず、プレートを３７℃で４５分間焼戻しした後、ヒーター（６０℃）の上に置いた。どの培地を使用したかにかかわらず、各ウェルプレートで４０〜４１℃に達するには１５分必要であった。
適用：
サーマルショット適用のための熱による温熱治療を用いたプランクトンに対するアミカシン結合ＡｇＮＰの有効性を緑膿菌（Ｐａ１０１６）の高リスククローン（ＳＴ１７５）で評価した。
２つのプレートを評価して、一方は３７℃（光線療法なし）で、他方では、Ｔ１ｈ、Ｔ１．５ｈ、Ｔ２ｈ、Ｔ２．５ｈ、及びＴ３ｈの異なる時点（Ｔ）で熱を１５分間適用した。ヒートストローク後、２つのプレートのアリコートを取り出して生存細胞を決定し、次のヒートストロークを待ちつつプレートを３７℃に置いた。
最初の接種材料は１．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬであり、実験に使用した培地はＭＨＢであった。両方のプレート（熱の有無にかかわらず）には、増殖制御群、アミカシン（ＭＩＣ）群、及びＡｇＮＰ＿ＡＫ群がある。
この処理は、初期接種材料の３ｌｏｇ１０以上の減少に達したときに陽性の殺菌活性を有すると考えられた。
ｖｉｉ．ｉｉｉ）サーマルショット：ＡｇＮＰを用いた低アンペアの直流＋砂浴による温熱治療
標準化：
主な目的は、急速な熱源を達成するために電流を使用して１２ウェルプレートの培地において４０℃に到達するために要したアンペア数及び時間を見出すことであった。培地の温度も制御した。
各ウェルプレートに異なる容量（１倍：１ｍＬ（Ｖ）；２倍：２ｍＬ（２Ｖ）；及び３倍：３ｍＬ（３Ｖ））のＡｇＮＰ又はＡｇＮＰ＿ＡＫを添加した。対照として、２ｍＬのＴＳＢを使用した。
まず、異なる容量の培地／ナノ粒子ＮＰを含有する１２ウェルプレートを３７℃で３０分間焼き戻しした。プレートを７５℃の焼き戻しした砂浴の中に置き、２つの電極を通して、温度が４０℃に達するまで低電流（１〜１０ｍＡ）を試験した。その後、プレートを別の砂浴（４３℃の焼き戻しされた砂浴）に移して、プレートの温度を４０℃で一定時間維持した。最初の砂浴で各ウェルプレートにおいて４０〜４１℃に到達するには１０ｍＡ及び１：３０分必要であり、プレートを他方の砂浴に入れると、４０℃の培地を４分間維持した。
適用：
ｖｉｉ．ｉｉｉ．ｉ）サーマルショット：プランクトン増殖におけるＡｇＮＰを用いた低アンペア数の直流＋砂浴による温熱治療
サーマルショット適用のために低アンペア数の直流＋砂浴による温熱治療を用いたプランクトンに対するアミカシン結合ＡｇＮＰの有効性を、ＸＤＲ緑膿菌（Ｐａ１０１６）、ＸＤＲアシネトバクター・バウマニ（ＡｂＩ４）、及びＸＤＲクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｐ１）において評価した。
１２ウェルプレートに、１ｍＬの接種材料（最終濃度が１．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬに達するようにＴＳＢで調製）と、ＡＫ単独、ＡｇＮＰ、又はＡｇＮＰ＿ＡＫ（最終容量：２ｍＬ）１ｍＬとを同時に添加した。（ウェルの培地を３７℃で焼き戻しつつ）プレートを３７℃で３０分間インキュベートした後、プレートを最初の焼き戻しした砂浴（７５℃）に入れ、１：３０分間１０ｍＡの電流を各ウェルに印加した（電流及び時間は４０℃に達するように標準化（ｖｉｉ．ｉｉｉ段落を参照））。次いで、プレートを次の（６０℃で焼き戻しした）砂浴に４分間移し、４０℃の温度に維持した。
４つのプレートを評価した。１つは３７℃のみ、別のものは電流の印加のみ、別のものは砂浴のみ、最後の１つは砂浴に電流を印加した。Ｔ１ｈ、Ｔ２ｈ、及びＴ３ｈの異なる時点（Ｔ）で電流を印加した。ヒートストローク後、４つのプレートのアリコートを取り出して生存細胞を決定し、次のヒートストローク（各ヒートストローク間の時間は３０分）を待ちつつプレートを３７℃に置いた。
この処理は、初期接種材料の３ｌｏｇ１０以上の減少に達したときに陽性の殺菌活性を有すると考えられた。
ｖｉｉ．ｉｉｉ．ｉｉ）サーマルショット：バイオフィルム成長におけるＡｇＮＰを用いた低アンペアの直流＋砂浴による温熱治療
サーマルショット適用のために低アンペア数の直流＋砂浴による温熱治療を使用したシリコーンバイオフィルムディスクに対するアミカシン結合ＡｇＮＰの有効性を、参照バイオフィルム産生株（ＰＡＯ１）において評価した。
シリコーンディスクに関する実験のために、Ｃｈａｎｄｒａら（「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａ ｂｉｏｆｉｌｍｓ」）により記載されたプロトコルに、いくつかの小さな修正を加えた。この細菌を３７℃で一晩、ＴＳＢ中で増殖させた。培養物を遠心分離し、滅菌リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、最終濃度が１．０×１０７ｃｆｕ／ｍＬになるように０．５マクファーランドの最終濃度まで再懸濁した。１２ウェルプレートの各ウェルに４ｍＬの接種材料を入れ、シリコーンディスクを加えた。３７℃で９０分インキュベーション（接着工程）した後、４ｍＬの新鮮なＴＳＢを含む新しい１２ウェルプレートにディスクを移し、プレートを３７℃で２４インキュベートし、６０ｒｐｍで振盪してバイオフィルムを成長させた。
シリコーンディスクを、処理（最終容量：４ｍＬ）４：アミカシン、ＡｇＮＰ又はＡｇＮＰ＿ＡＫ（３Ｖ）を含む新しい１２ウェルプレートに移した。ＴＳＢを用いて全ウェル中４ｍＬに到達させた。次いで、プレートを７５℃の焼き戻しした砂浴中に置き、電流（１０ｍＡ）を１：３０分かけて印加した。その後、プレートを第２の砂浴に４分かけて移す。このプロセスを、３回までで各３０分、ヒートショックの間に繰り返し、プレートは３７℃であった。
最後に、３回のヒートショットの後及び２４時間後、ディスクを４ｍＬのＴＳＢを含む新しいプレートに移し、ディスクをこすった。コロニー数を、３７℃で２４時間後に数えた。
ｖｉｉ．ｉｖ）サーマルショット：ＡｕＮＰを用いた低アンペア数の直流＋電気分解による温熱治療
プランクトン細胞で実施するための金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）を用いた電気分解サーマルショットの有効性をＫｐ３株において評価した。この実験は、生理食塩水中の活性化ＡｕＮＰによる抗菌電気分解効果を評価するために行った。
１２ウェルプレートにおいて、ＮＳＳ（０．９％ＮａＣｌ）で調整した５・１０５ｃｆｕ／ｍＬ及び１ｍＬのＡｕＮＰを添加した。ＮＳＳを対照として使用した。各ウェルプレートの最終容量は４ｍＬであった。電流の前に、プレートを３７℃で３０分間焼戻しした。試験したアッセイは、１分間に２ｍＡ、各ウェルプレートで３回、ショット間の時間遅延を３０分とした。同じ条件を電流なしで試験した。
結果
ｉｉ）銀ナノ粒子の合成及び特徴付け並びにアミカシンとの結合
シード成長法を用いたナノ粒子ＮＰのサイズは１０ｎｍで開始し、成長工程を通じて２０ｎｍに増加した。３００〜８００ｎｍのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルにより、ＡｇＮＰは約４００ｎｍの初期波長を有し、サイズが増加するとわずかに増加することが観察された。
ｍＰＥＧ（ＡｇＮＰ＿ｍＰＥＧ）とのみ結合された対照ナノ粒子は、約２５ｎｍのより大きなサイズを有する。
アミカシンと結合されたナノ粒子（ＡｇＮＰ＿ＡＫ）は２５ｎｍより大きかった。３００〜８００ｎｍのＵＶ−Ｖｉｓスペクトル範囲において４０９ｎｍの最大吸光度が観察された。Ｚ電位は−４６．６ｍＶの値を示した。
ｉｉｉ）金ナノ粒子の合成及び特徴付け並びに抗生物質との結合
シード成長法を用いたナノ粒子ＮＰのサイズは３．５ｎｍで開始し、成長工程を通して２０ｎｍに増加した。３００〜８００ｎｍのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルにより、ＡｕＮＰは約５００ｎｍの初期波長を有し、サイズが増加するとわずかに増加することが観察された。
ｍＰＥＧ（ＡｕＮＰ＿ｍＰＥＧ）とのみ結合したの対照ナノ粒子は、約５ｎｍのより大きなサイズを有する。ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルは、−４３．１ｍＶの値を有するＺ電位及び５２２ｎｍの波長を示した。
ＡｕＮＰ＿ＡＫは大きなサイズを有し、最大吸光度５２３ｎｍで３００〜８００ｎｍのＵＶ−Ｖｉｓスペクトル範囲が観察された。Ｚ電位は−４６．６ｍＶであった。ＡｕＮＰコリスチンの特徴に関しては、大型であり、最大吸光度５２３ｎｍで３００〜８００ｎｍのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルが観測された。Ｚ電位は−２９ｍＶであった。
ｖ）感受性試験
ＭＩＣ感受性試験の結果を表４に示す。緑膿菌のＸＤＲ株（Ｐａ４６）及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ１５及びＭＲＳＡ１６）において、ナノ粒子ＮＰがアミカシン（ＡｇＮＰ＿ＡＫ）と結合される場合、アミカシンのＭＩＣは３を超える濃度を減少させた。他の菌株は、アミカシンのみに対して１つ以上濃度を減少させた。ＡｇＮＰ＿ｃｏｌｉｓｔｉｎは、表皮ブドウ球菌株（ＳＥ１４及びＳＥ９４）を除く全ての株において同じコリスチン単独のＭＩＣを得たが、これはコリスチン単独に対して３を超える濃度を減少させた。抗生物質（アミカシン又はコリスチン）を含まないナノ粒子ＮＰは、細菌の増殖を阻害することができなかった（３種の濃度を減少させた表皮ブドウ球菌を除く）。
表４．ブロス微量希釈法を用いた様々な臨床分離菌株におけるＭＩＣのインビトロ測定アミカシンと結合された銀ナノ粒子（ＡｇＮＰ＿ＡＫ）
ＭＩＣ：最小阻害濃度、Ｐａ：緑膿菌、Ｋｐ：クレブシエラ・ニューモニエ、Ａｂ：アシネトバクター・バウマニ、ＭＲＳＡ：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、ＳＥ：表皮ブドウ球菌。
ｖｉ）時間−殺菌曲線アッセイ
時間殺菌曲線アッセイ（図３）は、スペインの病院で播種された（Ｐａ１０１６）高リスククローン（ＳＴ１７５）及びＡｇＮＰ＿ＡＫで処理したクレブシエラ・ニューモニエ株について、４、８、及び２４時間で１倍及び２倍の容量で殺菌効果を示した。同様に、これらの菌株は、他の処理物と比較して生菌数が２対数を下回った。試験したアシネトバクター・バウマニの２つの臨床株はいずれも、いかなる時も、異なる容量のナノ粒子で好ましい結果をもたらさなかった。薬物を含まないナノ粒子（ＡｇＮＰ）は、１〜２容量でも、いずれの菌株においても影響を及ぼさなかった。
ｖｉｉ）サーマルショットの適用
ｖｉｉ．ｉ）サーマルショット：ＡｇＮＰを用いた光線療法（光）による温熱治療
サーマルショット適用のための光線療法（光）による温熱治療を用いたプランクトンに対するアミカシン結合ＡｇＮＰの有効性を緑膿菌（Ｐａ１０１６）の高リスククローン（ＳＴ１７５）で評価した（図４）。Ｔ１．５時間で、ＡｇＮＰ＿ＡＫによる処理物の生存細菌のｌｏｇ１０ｃｆｕ／ｍＬの著しい減少が見られ、処理物はいずれも殺菌効果を有したが、にもかかわらず、光線療法を行ったＡｇＮＰ＿ＡＫはＡｇＮＰ＿ＡＫと比較してより速く陰性の培養を達成した。
他の群（光線療法の有無にかかわらず）は、増殖対照に対して細菌数が減少しなかった。
ｖｉｉ．ｉｉ）サーマルショット：ＡｇＮＰを用いた熱による温熱治療
サーマルショット適用のための熱による温熱治療を用いたプランクトンに対するアミカシン結合ＡｇＮＰの有効性を緑膿菌（Ｐａ１０１６）の高リスククローン（ＳＴ１７５）で評価した（図５）。Ｔ１．５時間で、温熱治療を使用したＡｇＮＰ及びＡｇＮＰ＿ＡＫによる生存細菌のｌｏｇ１０ｃｆｕ／ｍＬの著しい減少が観察され、両方の処理物が殺菌効果を有することを示したが、にもかかわらず、熱によるＡｇＮＰ＿ＡＫは、２４時間までの細菌数が皆無であり、一方、ＡｇＮＰは、３回目のヒートストロークと２４時間の間で細胞が再増殖した。
ｖｉｉ．ｉｉｉ）サーマルショット：ＡｇＮＰを用いた低アンペアの直流＋砂浴による温熱治療
ｖｉｉ．ｉｉｉ．ｉ）サーマルショット：プランクトン増殖におけるＡｇＮＰを用いた低アンペア数の直流＋砂浴による温熱治療
低アンペアの直流＋砂浴による温熱治療を用いたプランクトンに対するアミカシン結合ＡｇＮＰの有効性を、ＸＤＲ緑膿菌（Ｐａ１０１６）、ＸＤＲアシネトバクター・バウマニ（ＡｂＩ４）、及びＸＤＲクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｐ１）株（図６）において評価した。Ｐａ１０１６及びＫｐ１では、細菌数を負にする（２４時間で維持）ために２回のヒートショックが必要であり、ＡｂＩ４では最初のヒートショック細菌数が負であった。３７℃のみ、砂用バットのみ、及び電流のみの対照プレートでは、分子と異なる群との効果との間に差異は見られなかった。
ｖｉｉ．ｉｉｉ．ｉｉ）サーマルショット：バイオフィルム成長におけるＡｇＮＰを用いた低アンペアの直流＋砂浴による温熱治療
サーマルショット適用のための低アンペア数直流＋砂浴による温熱治療を用いたシリコーンバイオフィルムディスクに対するアミカシン結合ＡｇＮＰの有効性を、参照バイオフィルム生成株（ＰＡＯ１）で評価した（図７）。最初の１８ａはヒートショックなしのプレート（３７℃で調整された対照プレート）を表していたが、分子と異なる群の効果に違いはなかった。にもかかわらず、電流＋砂浴を適用したプレートでの同じ処理では、陰性の培養が８時間で達成され、２４時間それを維持した。
ｖｉｉ．ｉｖ）サーマルショット：ＡｕＮＰを用いた低アンペア数の直流＋電気分解による温熱治療
低アンペア数直流＋電気分解による温熱治療を用いたシリコーンバイオフィルムディスクに対するアミカシン結合ＡｇＮＰの有効性を、Ｋｐ３株で評価した（図８）。ＮＳＳを含むＡｕＮＰと１分間で２ｍＡの電流印加により、最初の電流の後に陰性培養を達成することができ、次の２４時間中それを維持した。
本発明の前述の説明は、当業者が現在最良の態様と考えられるものを製造し使用することを可能にするが、当業者は、特定の実施形態の変形、組合せ、及び等価物の存在を理解し、方法及び例を挙げることができる。
本発明の保護の範囲は、以下の特許請求の範囲に定義される。

Claims (19)

  1. −ナノ粒子集合体（ＮＰＡ）を受容するように構成され、且つ微生物に感染した又は感染する危険のある生物の局所領域に向かって搬送されるように構成され、前記ナノ粒子集合体（ＮＰＡ）が金属コア及び前記金属コアを取り囲む表面をそれぞれが有する複数のナノ粒子（ＮＰ）を含み、前記金属コアが熱エネルギーに反応可能である、支持体；及び、
    −前記ナノ粒子集合体に暴露された前記局所領域に少なくとも１回のサーマルショットを適用することにより、前記ナノ粒子集合体（ＮＰＡ）を介して前記局所領域の温度を所定の値まで上昇させ、それによりナノセラノスティクス・マルチモーダル抗菌療法を可能にするように構成されたエネルギーユニット（１５）；を備え、
    前記金属コアが銀、金、鉄、又は銀と金との混合物からなる、抗菌薬耐性又はバイオフィルム感染症の温熱療法治療又は予防のためのシステム。
  2. 少なくとも１つの抗菌剤（Ａｂ）が前記ナノ粒子の表面に付着し、前記少なくとも１つの抗菌剤（Ａｂ）がそれ自体で前記局所領域のアプタマーとして作用するように構成されている、請求項１に記載のシステム。
  3. 各ナノ粒子（ＮＰ）の表面が、前記ナノ粒子が前記生物によって異物として認識されないようにするためにｍＰＥＧ被覆を含む、請求項１に記載のシステム。
  4. 前記少なくとも１回のサーマルショットが適用された後の前記局所領域の前記温度上昇が４０℃を超えないように制御するように構成された制御ユニットを更に備える、請求項１〜３のいずれか１項に記載のシステム。
  5. 前記ナノ粒子（ＮＰ）が、前記少なくとも１つの抗菌剤に対する金属コアジョイントを含む、請求項２に記載のシステム。
  6. 前記サーマルショットが、近赤外線エネルギー、低強度パルス超音波エネルギー、低超音波エネルギー、光線療法、低電圧電気加熱、電気分解又は放射線療法による低電圧電気加熱のうちの１つを含む、請求項１に記載のシステム。
  7. 前記支持体が、メッシュ、血管若しくは尿カテーテル、ヒドロゲル、プロテーゼ、ステント、縫合糸、糸、ワイヤ、電極、又は気管内チューブのうちの少なくとも１つを包含する、請求項１に記載のシステム。
  8. −熱エネルギーに反応可能である金属コア及び前記金属コアを取り囲む表面をそれぞれが有する複数のナノ粒子を含むナノ粒子集合体を包含する支持体を、微生物に感染した又は感染する危険のある生物の局所領域に向かって支持体を搬送すること；及び
    −前記ナノ粒子集合体に暴露された前記局所領域に少なくとも１回のサーマルショットをエネルギーユニットによって適用することにより前記ナノ粒子集合体を介して前記局所領域の温度を所定の値に上昇させ、それによりナノセラノスティクス・マルチモーダル抗菌療法を可能にすること；を含み、
    前記金属コアが銀、金、鉄、又は銀と金の混合物からなる、抗菌薬耐性又はバイオフィルム感染症の温熱療法治療又は予防のための方法。
  9. 少なくとも１つの抗菌剤を前記ナノ粒子の表面に付着させることを更に含み、前記少なくとも１つの抗菌剤がそれ自体で前記局所領域のアプタマーとして作用する、請求項８に記載の方法。
  10. 前記サーマルショットが適用された後の前記局所領域の前記温度上昇が４０℃を超えないように制御される、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 前記ナノ粒子が、前記少なくとも１つの抗菌剤に対する金属コアジョイントを含む、請求項９に記載の方法。
  12. 前記サーマルショットが、微生物増殖の検出のために制御下に維持される治療すべき感染症の活性に応じて所定の持続時間後に繰り返される、請求項８に記載の方法。
  13. 前記所定の持続時間が、１５分〜８時間である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記サーマルショットが、近赤外線エネルギー、低強度パルス超音波エネルギー、低超音波エネルギー、光線療法、低電圧電気加熱、電気分解又は放射線療法による低電圧電気加熱のうちの１つを含む、請求項８に記載の方法。
  15. 各ナノ粒子（ＮＰ）の表面が、前記ナノ粒子が前記生物によって異物として認識されないようにするためにｍＰＥＧ被覆を含む、請求項８または９に記載の方法。
  16. 前記支持体が、メッシュ、血管若しくは尿カテーテル、ヒドロゲル、プロテーゼ、ステント、縫合糸、糸、ワイヤ、電極、又は気管内チューブのうちの少なくとも１つを包含する、請求項８に記載の方法。
  17. アミカシン、カプレオマイシン、クロファジミン、エタンブトール、エチオナミド、イソニアジド、カナマイシン、パラアミノサリチル酸、ピラジナミド、リファブチン、リファペンチン、又はストレプトマイシンを含む異なる抗菌剤を前記ナノ粒子集合体に含めることを更に含む、請求項８又は９に記載の方法。
  18. 脳、硬膜下膿瘍、硬膜外、肺、胸膜、肝臓、脾臓、腎臓又は腎周囲、婦人科系、腹腔内、筋肉、皮下を含む膿瘍、縦隔炎、急性及び慢性骨髄炎、糖尿病性足感染、プロテーゼ感染、血管グラフト感染、気管ステント感染、長期カテーテル関連血流感染症のロック療法、慢性前立腺炎、感染した又は定着した気管内チューブ又は尿カテーテルの除菌又は消毒、脳脊髄液シャント及びドレーン感染、蜂巣炎、壊死性筋膜炎、並びに皮下組織感染症のような治療が困難な感染症の抗菌／外科療法の補助療法としての、請求項８〜１７のいずれかに記載の方法の使用。
  19. −ＭＤＲ／ＸＤＲ緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ＭＤＲ／ＸＤＲクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ＭＤＲ／ＸＤＲアシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、及び２種を超える抗菌薬に耐性のある他のグラム陰性桿菌（ＧＮＲ）によって引き起こされるＧＮＲ細菌感染症、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌によって引き起こされるＭＤＲグラム陽性球菌感染症に対する；
    −バイオフィルム中で増殖する細菌、特にコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）及び緑膿菌による感染症を治療するため；並びに、
    −ＭＤＲ又は超多剤耐性ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を治療するため、の請求項８〜１７のいずれかに記載の方法の使用。
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