JP2019509497A - アミノシランを用いるマイクロ及びナノコンタクトプリンティング:多重バイオアッセイのためのマイクロ流体デバイスのパターニング表面 - Google Patents
アミノシランを用いるマイクロ及びナノコンタクトプリンティング:多重バイオアッセイのためのマイクロ流体デバイスのパターニング表面 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019509497A JP2019509497A JP2018558645A JP2018558645A JP2019509497A JP 2019509497 A JP2019509497 A JP 2019509497A JP 2018558645 A JP2018558645 A JP 2018558645A JP 2018558645 A JP2018558645 A JP 2018558645A JP 2019509497 A JP2019509497 A JP 2019509497A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- patterned
- silane
- substrate
- biomolecules
- array
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
- B01L3/502707—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the manufacture of the container or its components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
- G01N33/552—Glass or silica
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
- B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
- B01L2300/0636—Integrated biosensor, microarrays
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0896—Nanoscaled
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/12—Specific details about materials
- B01L2300/123—Flexible; Elastomeric
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】この研究では、水性ベースのマイクロコンタクトプリンティング技術を用いてマイクロ流体デバイス内にアミノシランのマイクロパターンおよびナノパターンを作製するための新しい手段を提示する。PDMSスタンプへの分子の拡散を最小限に抑えるために、我々はインク溶剤として水を使用し、プリンティング工程中のインキュベーション時間および接触時間を短くしてパターン化フィーチャの事前に定義された解像度を保つ。これらのパターンは、その後のバイオアッセイのために、溶液中の複数の生体分子を単一の表面上に結合させるためのビルディングブロッキングとして役立つ。
【選択図】図1
Description
[1]基板とプローブ分子とを含む生体分子のアレイであって、前記基板の表面は、シランのパターン化ナノフィーチャを有することを特徴とする、生体分子のアレイ。
[2]基板の非パターン化表面がPEG−シランでブロッキングされている、[1]に記載の生体分子のアレイ。
[3]ナノフィーチャの直径が10nm〜1000nmにパターン化されている、[1]に記載の生体分子のアレイ。
[4]プローブ分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物および脂質からなる群から選択される、[1]に記載の生体分子のアレイ。
[5]プローブ分子が、基板上のシランのナノフィーチャに結合されている[1]に記載の生体分子のアレイ。
[6]基板とプローブ分子とを含むキットであって、前記基板の表面は、シランのパターン化ナノフィーチャを有するキット。
[7]基板の非パターン化表面がPEG−シランでブロッキングされている[6]に記載のキット。
[8]ナノフィーチャの直径が10nm〜1000nmにパターン化されている、[6]に記載のキット。
[9]プローブ分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物および脂質からなる群から選択される[6]に記載のキット。
[10]生体分子のアレイのための基板であって、前記基板の表面が、プローブ分子を接合するためのシランのパターン化ナノフィーチャを有する、生体分子のアレイのための基板。
[11]基板の非パターン化表面がPEG−シランでブロッキングされている、[10]に記載の生体分子のアレイのための基板。
[12]ナノフィーチャの直径が10nm〜1000nmにパターン化されている、[10]に記載の生体分子のアレイのための基板。
[13]前記生体分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物、脂質からなる群から選択される、[10]に記載の生体分子のアレイのための基板。
[14]生体分子を多重送信フォーマットでマイクロまたはナノパターニングする方法であって、
・PDMSでナノホールを有するシリコンウエハー(Si Wafer)を覆う;
・PDMSをシリコンウエハーから分離する;
・PDMSを感光性ポリマーで覆う;
・光感受性ポリマーを光に暴露する;
・PDMSから光感受性ポリマーレプリカを分離する;
・シランでインキュベートした平面PDMSスタンプにプラズマ活性化した光感受性ポリマーレプリカを接触させる;
・コンタクトエリア内のシランをリフトオフするためにフラットPDMSを分離する;
・ガラススライド上にシランのナノホールを有するフラットPDMSをプリントする;
・ガラススライドからフラットPDMSを分離する;
・パターン化されたシランを水性PEGシランとインキュベートして、非パターン化さ表面をブロッキングする;その後
・パターン化/ブロッキングされたAPTESシランを所望の生体分子とともにインキュベートする
工程からなる。
[15]生体分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物および脂質からなる群から選択される、[14]に記載の方法。
[16]ナノホールの直径が10nm〜1000nmにパターン化されている、[14]に記載の方法。
用語「生体分子」は、ヌクレオチド、ペプチド、抗体、炭水化物および脂質を含むがこれに限定されない生物に存在する任意の化学的または生化学的構造を指すために本明細書で使用される。
1.本発明のパターニングおよび製造手順
1−1.ソフトリソグラフィー
スタンプおよびマイクロ流体デバイスは、AutoCAD(AutoDesk, USA)で設計できる。スタンプの設計は、(i)100μmの間隔を有する100μm幅のストライプ(図1a(i)に概略)、および(ii)50μmで分離された50x50μm平方のアレイ(図6a−b)からなるが、これに限定されない。マイクロ流体デバイスの3つの異なる設計はAutoCADにおいて設計された:(i)100μm幅および(ii)単一方向の流れのために200μm幅の単一入口を備えた平行流路および(iii)交互チャンネルの反対の流れ方向のために、2つの異なった入口を備えた200μm幅の平行流路。より詳細な回路図を図7に示す。デバイスおよびスタンプ用のマスターを製造するために、シリコンウエハー(例:直径4インチ、E&M Corp.Ltd.,Japan)を、フォトレジストの感光性ポリマーの75μmの層(mr−DWL 40 photoresist;Microresist technologies,Germany)でコーティングした。フォト感受性ポリマーの層の厚さはフォトレジストによって定義され、700nm〜200μmに変化でき、フィーチャはDL1000マスクレスライター(NanoSystem Solutions,Japan)のようなデバイスを用いるフォトリトグラフィーによってパターン化され、mr−Dev 600デベロッパー(Microresist Technologies,Germany)のようなデベロッパーを用いて現像した。しっかりとベーキングおよび洗浄した後、ウエハーはデシケーター中、気相でトリクロロ(1H、1H、2H、2H−パーフルオロオクチル)シラン(Sigma−Aldrich,Japan)のようなシランに暴露することにより、抗付着層でコーティングした。脱気して気泡を除去した後、10:1のポリ−(ジメチルシロキサン)(PDMS)(DOW Corning,Japan)をウエハー上に注ぎ、プレポリマーを60℃で15〜48時間、好ましくは24時間硬化させることにより、Si−ウエハー上に存在するパターンの逆コピーを有するマイクロ流体デバイスおよびスタンプを得た。リフト−オフナノコンタクトプリンティング工程のために、フラットPDMSスタンプが、ブランクSi−ウエハー上に上記の混合物を重合することによって製造された。
図1aの模式図に示すように、パターン化されたスタンプは、プラズマ活性化カバースリップ下で、1〜3分間、1重量%水性APTES(APTESaq)の10μLでインク付され得る。我々は、APTESに代えて、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、オクタデシルトリクロロシラン(ODTCS)、トリエトキシシリプロピル無水コハク酸(TESPSA)、(3−グリシジルオキシプロピル)トリメトキシシラン(GPTMS)、オクタデシルトリクロロシラン(OTS)などを使うことができる。スタンプはミリQ水(Millipore,Japan)で10秒間すすいだ後、N2ガスの強いパルスで急速乾燥する。次に、インク付きPDMSスタンプを、プラズマ活性化(Harrick Plasma,USA)ガラススライドと5秒間接触させる。調製されたプラズマ活性化PDMSマイクロ流体デバイスは、プリント基板に垂直に結合される。次いで、この組立てられたデバイスをホットプレート上で85℃で5分間加熱してAPTESaqの共有反応を確実にすると同時に、マイクロ流体デバイスを基板に不可逆的に結合する。基板は、ガラス、シリコンまたはプラスチック、好ましくはガラスまたはプラスチック、より好ましくはガラスで作ることができる。
ナノパターン化(ナノフィーチャーは10nm〜1000nm、好ましくは20nm〜800nm、さらに好ましくは50nm〜500nmでパターン化される)PDMSレプリカは、Ricoult等によって以前に記述されたプロトコールを用いて製造される(S.G. Ricoult, M. Pla-Roca, R. Safavieh, G. MLopez-Ayon, P. Grutter, T. E. Kennedy and D. Juncker, Small, 2013, 9, 3308-3313)。簡潔には、Clewin Pro 4.0((Wieweb software,Hengelo,Netherlands)を用いて、正方形アレイ(長さ200nm、幅200nm、間隔2μm)からなるナノパターンを最初に作成する。4インチシリコンウエハーをPMMAレジストでコーティングし、ドットアレイを電子ビームリソグラフィー(VB6 UHR EWF,Vistec)によってパターン化し、Siへの100nm反応性イオンエッチング(System100 ICP380,Plasmalab)へと続く。洗浄後、デシケーター中の蒸気相中でペルフルオロオクチルトリエトキシシラン(Sigma−Aldrich,Oakville,ON,Canada)に暴露することにより、ウエハーを抗接着剤層で被覆する。先のセクションで記述したように、パターン化されたウエハー上でPDMSを硬化させた後に、Siウエハーの逆ポリマーコピーが得られ、ナノピラーが形成される。PDMSマスター(図3а)の逆コピーを有するナノホールからなるリフト−オフスタンプは、PDMSスタンプ上のNorland Optical Adhesive 63(ノアランド・プロダクツ社、ノーラン・プロダクツ社、ニュージャージー州クランベリー)を、Uvitron 600W UVA Enhanced Lamp(310−400nm;100%強度)(Uvitron International,Inc.,West Springfield,MA)中で、600WのUV光で40秒間硬化させることによって最終的に得られる。
フラットPDMSスタンプを、上記のようなAPTESaq液(図1b)のような1%シランを用いて1〜3分間インク付けする。シラン溶液の濃度は、0.5%〜5%とすることができる。Milli−Q水で10秒間すすいだ後、インク付けスタンプをN2気流下で短時間乾燥させ、直ちにプラズマ活性化感光性ポリマー(例えばNOA63)のリフト−オフスタンプで5秒間接触させる。PDMSは感光性ポリマー(例えばNOA63)リフトオフ−スタンプから分離され、接触領域のAPTESаqはNOA63リフトオ−フスタンプに転写され、残りのAPTESаq分子はPDMSスタンプを5秒間プラズマ活性化ガラス面にプリンティングすることによって最終基板に転写される。
APTESaqパターニングおよびデバイスアセンブリの後、デバイス内の非パターニング領域を、2重量%のPEG−シラン(水性)の溶液をデバイスに流すことによって、30分間ブロッキングした。水性PEG−シラン(水性)の濃度は、1%〜5%であり得る。タンパク質に10倍モル過剰のEDC(2μM)およびMHS(5μM)でEDC−MHS化学反応を用いることにより、蛍光標識された免疫グロブリンまたは目的タンパク質を10μg/mlでAPTESaqパターン化表面上に共有結合的にグラフトした(図2a&b)。100μMのBS3水溶液(Milli−Q水中)を装置中のパターン上に流し、APTESaq上の利用可能な末端アミン(−NH2)基との反応を可能にするBS3(ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート)化学反応を用いて、DNAアプタマーをグラフトし、20mMのHEPES緩衝液および50mMのグリシン水溶液中のアプタマー溶液(10μg/ml)によって処理して未反応のBS3を消失させた。反応の各段階の後に、未反応成分を洗浄緩衝液(1xPBS中0.05%Tween 20)で洗浄した。
NOA63リフト−オフスタンプを、二次電子を検出するETD検出器を使用して、3.5スポットサイズで5kVでQuanta 250 FEG走査電子顕微鏡(FEI,Japan)を使用して画像化した。蛍光標識されたタンパク質のマイクロパターンおよびナノパターンを、Ti−E Eclipse倒立蛍光顕微鏡(Nikon,Japan)およびLSM 780共焦点顕微鏡(Zeiss,Japan)で画像化した。全ての画像は、各実験において一定の露光時間、この実験で示された全ての画像について1から10秒まで変化してキャプチャーされた。平均蛍光強度測定は、ImageJ(NIH,USA)で画像解析を行うことによって得られた。画像は、ImageJの線形改変を介してコントラストを高めるために定量後に処理した。
マイクロアレイは、分子生物学および医学において広く使用されている多重化技術であ
る。マイクロアレイは、微細−ポイント化ピンを用いたプリンティング、予め作製したマスクを用いたフォトリソグラフィー、ダイナミックマイクロミラーデバイスを用いたフォトリソグラフィー、インクジェットプリンティング、マイクロコンタクトプリンティング、またはマイクロ電極アレイ上の電気化学を含む様々な技術を用いて製造することができる。標準的なマイクロアレイでは、プローブ分子は、ガラス、シリコン、プラスチック、ヒドロゲル、アガロース、ニトロセルロースおよびナイロンを含む支持材料の固体表面に表面工学によって付着される。
本発明は、基板とプローブ分子とを含むキットを提供し、基板の表面は、シランのパターン化されたナノフィーチャを有する。基板の非パターン化表面は、好ましくはPEG−シランでブロッキングされる。さらに、10nm〜1000nm、好ましくは20nm〜800nm、より好ましくは50nm〜500nmである。プローブ分子は、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物および脂質からなる群から選択される。方法のセクションは、本発明のキットの詳細について参照することができる。
本発明は、生体分子のアレイのための基板を提供し、基板の表面は、プローブ分子を接合するためのシランのパターン化されたナノフィーチャを有する。基板は、ガラス、シリコンまたはプラスチック、好ましくはガラスまたはプラスチック、より好ましくはガラスで作ることができる。基板の非パターン化表面は、好ましくはPEG−シランでブロッキングされる。さらに、10nm〜1000nm、好ましくは20nm〜800nm、より好ましくは50nm〜500nmである。プローブ分子は、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物および脂質からなる群から選択される。方法のセクションは、本発明の基板の詳細について参照することができる。
分子電荷にかかわらずマイクロ流体デバイス内の生体分子のパターニングを容易にするために、表面と生体分子との間に共有結合を形成するために、密閉マイクロ流体デバイス(図1aの概略図)に水性APTES(APTESaq)をプリントするためのマイクロコンタクトプリンティングプロセスが開発された。ここでは、APTESaqは、PDMSスタンプを用いてプラズマ活性化ガラススライド上にプリントされ(図1a(i)〜(ii))、水平マイクロ流体チャンネル内に垂直プリントを包含するために、プラズマ活性化マイクロ流体装置に結合させた。組み立てられたデバイスを85℃で5分間加熱して、APTES中の反応性シラノールとガラス基板上のヒドロキシル(−OH)基との間の共有結合性シロキサン結合の形成を促進した(J. A. Howarter and J. P. Youngblood, Langmuir, 2006, 22,11142-11147.)。次いで、デバイス内の非パターン化領域を、2%PEG−シランの溶液をデバイスに流すことによって30分間ブロッキングした。PEG−シランは、非生物付着剤として作用するだけでなく、パターン化基板上へのAPTESaqの拡散も防止する。次いで所望の生体分子と適切なリンカーの混合物を装置のパターン化チャネルに流し、APTESaqへの反応および共有結合を可能にした。
生体分子を共有結合的にパターン化するためのAPTESのマイクロパターンを首尾よく作製することに加えて、我々は、生体分子を共有結合的にグラフトするために、マイクロ流体チャネル内にAPTESaqのナノパターンを作製するための簡便なリフト−オフナノコンタクトプリンティング法を実証する。以前のプロトコール(S. G. Ricoult, M. Pla-Roca, R. Safavieh, G. MLopez-Ayon,P. Grutter, T. E. Kennedy and D. Juncker, Small, 2013, 9,3308-3313)に従って、ナノホールを有するウエハーを複製する使い捨てエポキシリフト−オフスタンプ(図3a)を、PDMS中間レプリカを介した二重複製プロセスによって得た。
インターロイキン−6(IL6)(J. S. Yudkin, M. Kumari, S. E. Humphries and V. Mohamed-Ali, Atherosclerosis, 2000, 148, 209-214.; A. G. Vos, N. S. Idris, R.
E. Barth, K. Klipstein-Grobusch and D. E. Grobbee, PloS one, 2016, 11, e0147484.)およびヒトC−反応性タンパク質(hCRP)(I. Kushner, Science, 2002, 297, 520-521.; P. M. Ridker, Circulation, 2003, 107, 363-369.)は、組織の炎症または感染から生じる神経系、心血管系および他の病態生理学的状態の最も重要なバイオマーカーである。これらのバイオマーカーの定量的検出は、これらの疾患の早期診断および治療に非常に役立っている。これらの疾患を正確に診断するためには、これらのバイオマーカーの微量を確実に検出するために、高感度アッセイおよびバイオセンシング技術が必要とされている(S. K. Vashist, A. Venkatesh, E. M. Schneider, C. Beaudoin, P. B. Luppa and J. H. Luong, Biotechnology advances, 2016,34, 272-290. ; A. Qureshi, Y. Gurbuz and J. H. Niazi, Sensors and Actuators B: Chemical, 2012, 171, 62-76.)。したがって、APTESаq−マイクロパターン化マイク流体デバイスの感度および生体機能性を試験するために、アプタマーまたは抗体のいずれかの助けを借りて、IL6およびhCRPを定性的および定量的に検出するためのサンドイッチベースのイムノアッセイを行った。
APTESaqパターンの安定性を評価するために、マイクロ流体デバイス基板を、100μmの間隔で間隔を置いた100μmのストライプでマイクロ流体チャネルに垂直なマイクロコンタクトプリンティングによってAPTESaqで予めパターン化した。30種類のパターン化およびシール化デバイスは、無真空下で室温(25℃)または4℃で3か月間、PEG−シランを用いてブロッキングした後、プラスチック容器に保存された。試験条件当たり3つのデバイスをフィーチャ付けて、蛍光標識IgG(免疫グロブリン)のAPTESaqパターンへのグラフト効率を決定した。
マイクロコンタクトプリンティングの一スタンプ−一インク特性を克服するために、APTESaqパターンを使用して、異なる局所的に送られた生体分子を捕捉し、共有結合的にグラフトさせる。単一の表面上に複数の生体分子をパターニングする能力を視覚的に実証するために、EDC−NHS活性化Alexa−fluor 488および546標識蛍光抗体の2つの異なる溶液を、液体送達の2つの様式によってパターン化基板上に送達した。最初に、APTESaqの四角形のアレイ(50x50μm)を、マイクロコンタクトプリンティングによりプラズマ活性ガラススライド上にパターン化し、2%PEG−シランaqでブロッキングした。次に、液体分配ロボット(Musashi Engineering,Japan)を用いて、2つのタンパク質溶液(図6a)を含むマイクロリットル容積の液滴を送達し、パターン化された表面上に複数の生体分子からなるマイクロアレイを達成した(図6b)。
(3−アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)および2−メトキシ(ポリエチレンオキシ)6−9プロピルトリクロロシラン(PEG−シラン)は、Nacalai(Japan)から購入した。1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、BS3架橋剤、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、HEPES、グリシン、およびストレプトアビジン DyLightTM 550重合体をThermo Fischer Scientific (Japan)から購入した。ビオチン−SP結合AffiniPureヤギ抗マウス抗体は、Jackson ImmunoResearch labs(USA)から購入した。インターロイキン6(IL6)に特異的なビオチン化アプタマーは、BasePair Biotechnologies(USA)から入手した。組換えヒトIL6(PHC0066)はLife Technologiesから購入した。マウス抗C反応性タンパク質抗体[C5] ab8279(Abcam,Japan)および組換えヒトC反応性タンパク質(hCRP)をOriental Yeast Co., Ltd.(Japan)から得た。 Alexa−fluor 488結合ニワトリ抗ヤギ、Alexa−fluor 546結合ウサギ抗マウスおよびヤギ抗ニワトリ免疫グロブリン(IgG)はAbcam(Japan)から購入した。
Claims (16)
- 基板とプローブ分子とを含む生体分子のアレイであって、前記基板の表面は、シランのパターン化ナノフィーチャを有することを特徴とする、生体分子のアレイ。
- 基板の非パターン化表面がPEG−シランでブロッキングされている、請求項1に記載の生体分子のアレイ。
- ナノフィーチャの直径が10nm〜1000nmにパターン化されている、請求項1に記載の生体分子のアレイ。
- プローブ分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物および脂質からなる群から選択される、請求項1に記載の生体分子のアレイ。
- プローブ分子が、基板上のシランのナノフィーチャに結合されている、請求項1に記載の生体分子のアレイ。
- 基板とプローブ分子とを含むキットであって、前記基板の表面は、シランのパターン化ナノフィーチャを有するキット。
- 基板の非パターン化表面がPEG−シランでブロッキングされている、請求項6に記載のキット。
- ナノフィーチャの直径が10nm〜1000nmにパターン化されている、請求項6に記載のキット。
- プローブ分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物および脂質からなる群から選択される、請求項6に記載のキット。
- 生体分子のアレイのための基板であって、前記基板の表面が、プローブ分子を結合するためのシランのパターン化ナノフィーチャを有する生体分子のアレイのための基板。
- 基板の非パターン化表面がPEG−シランでブロッキングされている、請求項10に記載の生体分子のアレイのための基板。
- ナノフィーチャの直径が10nm〜1000nmにパターン化されている、請求項10に記載の生体分子のアレイのための基板。
- 生体分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物および脂質からなる群から選択される、請求項10に記載の生体分子のアレイのための基板。
- 生体分子を複数フォーマットでマイクロまたはナノパターン化する方法であって、
・PDMSでナノホールを有するシリコンウエハー(Siウエハー)を覆う;
・PDMSをSiウエハーから分離する;
・PDMSを感光性ポリマーで覆う;
・光感受性ポリマーを光に暴露する;
・PDMSから光感受性ポリマーレプリカを分離する;
・シランでインキュベートした平面PDMSスタンプにプラズマ活性化した光感受性ポリマーレプリカを接触させる;
・接触領域内のシランをリフト−オフするためにフラットPDMSを分離する;
・ガラススライド上にシランのナノホールを有するフラットPDMSをプリントする;
・ガラススライドからフラットPDMSを分離する;
・パターン化シランを水性PEGシランとインキュベートして、非パターン化表面をブロッキングする;その後
・パターン化/ブロッキング化APTESシランを所望の生体分子とともにインキュベートする
工程を有することを特徴とする方法 - 生体分子が、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、炭水化物および脂質からなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
- ナノホールの直径が10nm〜1000nmにパターン化される、請求項14に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662290067P | 2016-02-02 | 2016-02-02 | |
US62/290,067 | 2016-02-02 | ||
PCT/JP2017/003621 WO2017135309A1 (en) | 2016-02-02 | 2017-02-01 | Micro- and nanocontact printing with aminosilanes: patterning surfaces of microfluidic devices for multi- plexed bioassays |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019509497A true JP2019509497A (ja) | 2019-04-04 |
JP6975466B2 JP6975466B2 (ja) | 2021-12-01 |
Family
ID=59500729
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018558645A Active JP6975466B2 (ja) | 2016-02-02 | 2017-02-01 | アミノシランを用いるマイクロ及びナノコンタクトプリンティング:多重バイオアッセイのためのマイクロ流体デバイスのパターニング表面 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20190030530A1 (ja) |
JP (1) | JP6975466B2 (ja) |
WO (1) | WO2017135309A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022181196A1 (ja) * | 2021-02-26 | 2022-09-01 | 学校法人関西学院 | センシング用チップ、センシング用チップの製造方法、センシング用キット、測定方法及び測定装置 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20220379582A1 (en) * | 2019-10-30 | 2022-12-01 | Nautilus Biotechnology, Inc. | Flow cell systems and methods |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050079486A1 (en) * | 2003-09-23 | 2005-04-14 | Wiscnsin Alumni Research Foundation - | Using liquid crystals to detect affinity microcontact printed biomolecules |
US20060263832A1 (en) * | 2005-05-16 | 2006-11-23 | Wen Shang | Patterning of centrosomes and centrosome fragments as templates for directed growth of microtubules |
WO2007123763A2 (en) * | 2006-03-30 | 2007-11-01 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Articles having localized molecules disposed thereon and methods of producing same |
JP2009222401A (ja) * | 2008-03-13 | 2009-10-01 | Tokyo Metropolitan Industrial Technology Research Institute | 局所表面プラズモン共鳴イメージング装置 |
US20130157889A1 (en) * | 2010-05-17 | 2013-06-20 | Duke University | Detection devices and related methods of use |
JP2015531486A (ja) * | 2012-09-28 | 2015-11-02 | ヴィブラント ホールディングス リミテッド ライアビリティ カンパニー | 生体分子解析のための方法、システム、およびアレイ |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2422197A4 (en) * | 2009-04-24 | 2014-05-07 | Univ Northwestern | MULTIPEX BIOMOLECULAR ARRAYS MANUFACTURED BY POLYMERSTICK LITHOGRAPHY |
US10286376B2 (en) * | 2012-11-14 | 2019-05-14 | Vibrant Holdings, Llc | Substrates, systems, and methods for array synthesis and biomolecular analysis |
CN114089597A (zh) * | 2013-12-19 | 2022-02-25 | Illumina公司 | 包括纳米图案化表面的基底及其制备方法 |
-
2017
- 2017-02-01 US US16/073,791 patent/US20190030530A1/en not_active Abandoned
- 2017-02-01 WO PCT/JP2017/003621 patent/WO2017135309A1/en active Application Filing
- 2017-02-01 JP JP2018558645A patent/JP6975466B2/ja active Active
-
2020
- 2020-09-02 US US17/010,180 patent/US20210046476A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050079486A1 (en) * | 2003-09-23 | 2005-04-14 | Wiscnsin Alumni Research Foundation - | Using liquid crystals to detect affinity microcontact printed biomolecules |
US20060263832A1 (en) * | 2005-05-16 | 2006-11-23 | Wen Shang | Patterning of centrosomes and centrosome fragments as templates for directed growth of microtubules |
WO2007123763A2 (en) * | 2006-03-30 | 2007-11-01 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Articles having localized molecules disposed thereon and methods of producing same |
JP2009222401A (ja) * | 2008-03-13 | 2009-10-01 | Tokyo Metropolitan Industrial Technology Research Institute | 局所表面プラズモン共鳴イメージング装置 |
US20130157889A1 (en) * | 2010-05-17 | 2013-06-20 | Duke University | Detection devices and related methods of use |
JP2015531486A (ja) * | 2012-09-28 | 2015-11-02 | ヴィブラント ホールディングス リミテッド ライアビリティ カンパニー | 生体分子解析のための方法、システム、およびアレイ |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
ARKLES, B. ET AL.: "Silane Coupling Agents", カタログ, JPN6021024677, 2014, pages 27 - 54, ISSN: 0004535029 * |
FALCONNET, D. ET AL.: "A novel approach to produce protein nanopatterns by combining nanoimprint lithography and molecular", NANO LETTERS, vol. 4, no. 10, JPN6020044953, 2004, pages 1909 - 1914, XP003004906, ISSN: 0004391887, DOI: 10.1021/nl0489438 * |
GROLL, J. ET AL.: "Biofunctionalized, Ultrathin Coatings of Cross-Linked Star-Shaped Poly(ethylene oxide) Allow Reversi", JACS, vol. 126, JPN6021024679, 2004, pages 4234 - 4239, ISSN: 0004535028 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022181196A1 (ja) * | 2021-02-26 | 2022-09-01 | 学校法人関西学院 | センシング用チップ、センシング用チップの製造方法、センシング用キット、測定方法及び測定装置 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2017135309A1 (en) | 2017-08-10 |
JP6975466B2 (ja) | 2021-12-01 |
US20210046476A1 (en) | 2021-02-18 |
US20190030530A1 (en) | 2019-01-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Sathish et al. | Microcontact printing with aminosilanes: creating biomolecule micro-and nanoarrays for multiplexed microfluidic bioassays | |
Romanov et al. | A critical comparison of protein microarray fabrication technologies | |
Le Goff et al. | Hydrogel microparticles for biosensing | |
EP1733229B1 (en) | Patterning method for biosensor applications and devices comprising such patterns | |
Fruncillo et al. | Lithographic processes for the scalable fabrication of micro-and nanostructures for biochips and biosensors | |
Hoff et al. | Nanoscale protein patterning by imprint lithography | |
Ekblad et al. | Protein adsorption and surface patterning | |
Martin et al. | Quantitative photochemical immobilization of biomolecules on planar and corrugated substrates: a versatile strategy for creating functional biointerfaces | |
Han et al. | Mutiscale substrates based on hydrogel-incorporated silicon nanowires for protein patterning and microarray-based immunoassays | |
CA2596807A1 (en) | Method for the photochemical attachment of biomolecules to a substrate | |
Roh et al. | Microfluidic fabrication of encoded hydrogel microparticles for application in multiplex immunoassay | |
KR101068972B1 (ko) | 형광 신호가 향상된 생체분자 어레이 및 그 제조방법 | |
US20210046476A1 (en) | Micro- and nanocontact printing with aminosilanes: patterning surfaces of microfluidic devices for multi- plexed bioassays | |
JP2019500580A (ja) | デジタル計数のためのフローシステムおよび方法 | |
JP5148818B2 (ja) | 新規固相担体及びその利用 | |
Guo et al. | Plasma-treated polystyrene film that enhances binding efficiency for sensitive and label-free protein biosensing | |
CN111511926A (zh) | 用于制备编码的水凝胶颗粒的方法以及由此制备的编码的水凝胶颗粒 | |
Fiddes et al. | Durable, region-specific protein patterning in microfluidic channels | |
Chiari et al. | Advanced polymers for molecular recognition and sensing at the interface | |
Prashanth et al. | Non-covalent functionalization using lithographically patterned polyelectrolyte multilayers for high-density microarrays | |
Andersson et al. | Self-assembled and self-sorted array of chemically active beads for analytical and biochemical screening | |
Liu et al. | Fabrication and applications of the protein patterns | |
US7344847B2 (en) | Nanoscale patterning and immobilization of bio-molecules | |
Sivagnanam et al. | Micropatterning of protein-functionalized magnetic beads on glass using electrostatic self-assembly | |
Jang et al. | Micropatterning of biomolecules on a glass substrate in fused silica microchannels by using photolabile linker-based surface activation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20191224 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201124 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210119 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210629 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210824 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20211019 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20211029 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6975466 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |