JP2019507603A - サッカロースホスホリラーゼ - Google Patents

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コッホ，ティモ・ヨハネス
ヘスラー，トーマス
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ファイファー・ウント・ランゲン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング・ウント・コンパニー・コマンディートゲゼルシャフト
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Abstract

本発明は、特に、サッカロース及びリン酸からのグルコース−１−リン酸及びフルクトースの合成を触媒するサッカロースホスホリラーゼに関する。本発明によるサッカロースホスホリラーゼは、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）由来のサッカロースホスホリラーゼの突然変異とみなすことができる。野生型サッカロースホスホリラーゼと比較して、本発明によるサッカロースホスホリラーゼは、活性、プロセス安定性、温度安定性が改善していること、及び生成物阻害が低下していることにより区別され、従って工業プロセスにおける使用に特に適する。

Description

本発明は、特に、スクロース及びホスフェート（phosphate）からのグルコース−１−リン酸及びフルクトースの合成を触媒するスクロースホスホリラーゼに関する。本発明によるスクロースホスホリラーゼは、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）由来のスクロースホスホリラーゼの突然変異体として理解され得る。野生型スクロースホスホリラーゼと比較して、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、活性、プロセス安定性、温度安定性が改善していることにより、及び生成物阻害が低下していることにより区別され、従って工業プロセスにおける使用に特に適する。
スクロースホスホリラーゼは、スクロース及びリン酸からフルクトース及びグルコース−１−リン酸への変換を触媒する。この加リン酸分解活性に加えて、該酵素は、適切な条件下では、グルコース−１−リン酸及びフルクトースからスクロースの合成を逆方向に触媒し、リン酸を放出する能力も有する。
セロビオースは、セルロースの基本的な構成ブロックを形成する天然の二糖類である。セロビオースは、食品及びフィードセクターにおいて益々魅力的となっている。セロビオースは、セルロースの化学的又は酵素的加水分解により製造され得る。英国特許第２ ４３８ ５７３号は、セルロースの加水分解、その他の糖類と比較して糖溶液内のセロビオースの割合（％）を増加させる限外濾過、及び結晶化とその後のセロビオースの精製を含む、セロビオースを取得する方法について記載する。
セルロースからのセロビオース製造に対する代替案として、セロビオースホスホリラーゼを使用するセロビオース合成が挙げられる。この場合、グルコース−１−リン酸が、α−グルカンホスホリラーゼを用いたスターチの加リン酸分解により、又はスクロースホスホリラーゼを用いたスクロースの加リン酸分解により、中間体として取得可能である。
欧州特許第０ ４２３ ７６８号は、スクロースホスホリラーゼ、グルコースイソメラーゼ、及びセロビオースホスホリラーゼを使用し、スクロースから開始して、セロビオースを製造する方法について開示する。該方法は、（１）スクロースホスホリラーゼ触媒反応の下、オルトリン酸の存在下で、スクロースをグルコース−１−リン酸とフルクトースに切断するステップ；（２）グルコースイソメラーゼ触媒反応の下で、フルクトースをグルコースに異性化するステップ；（３）オルトリン酸を除去すると共に、セロビオースホスホリラーゼ触媒反応の下、グルコース及びグルコース−１−リン酸からセロビオースを合成するステップ；（４）反応混合物からセロビオースを部分的に集積し、また残りのオルトリン酸含有反応混合物の一部をステップ（１）にリサイクルするステップを含む。
国際公開第２０１１／１２４５３８ Ａ１号は、安定性が向上し、６０℃において１６時間酵素的に活性な、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス由来のスクロースホスホリラーゼのバリアントについて開示する。更に、酵素を発現し、並びにグルコース−１−リン酸及びフルクトースを合成するためにそれを使用する方法の記載が存在する。
Ｖｅｒｈａｅｇｈｅらの“Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｉｔｅ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｓｉｓ ｂｙ ａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ”、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ、９６巻、２０１３年１２月１日、８１〜８８頁は、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティスに由来する野生型のスクロースホスホリラーゼについて、様々な基質に対するその親和性に関する調査を記載する。開示は、基質親和性に影響を有するスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列内の様々な点についてなされている。
Ｃｅｒｄｏｂｂｅｌらの“Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｂｙ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ− ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２４巻、１１号、２０１１年１１月１日、８２９〜８３４頁は、６０℃での温度安定性が改善している、アミノ酸配列内に６つの突然変異を有するビフィドバクテリウム・アドレスセンティス由来のスクロースホスホリラーゼのバリアントについて開示する。
ＤＡＴＡＢＡＳＥ ＵｎｉＰｒｏｔ、ＩＤ Ａ０Ａ０８７ＡＸＣ６、ＤＡＴＡＢＡＳＥ Ｇｅｎｅｓｅｑ、配列番号３２３、ＤＡＴＡＢＡＳＥ ＵｎｉＰｒｏｔ、ＩＤ Ａ０Ａ０８７ＣＸＱ８、及びＤＡＴＡＢＡＳＥ ＵｎｉＰｒｏｔ、ＩＤ Ａ０Ａ０８７ＣＭＶ６のデータベースは、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティスに由来するスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列内の突然変異を開示する。
セロビオースのこのような合成の重要な中間体は、グルコース−１−リン酸である。グルコース−１−リン酸は、中間体として多くの生化学的なプロセスを経由し、従って代謝において中心的役割を演ずる。
酵素を最適化する１つの方法は、改善した特性を有する開始酵素のバリアントの開発に狙いを定めた酵素エンジニアリングの使用にある。酵素エンジニアリングは、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス由来のスクロースホスホリラーゼにすでに適用されている。国際公開第２０１１／１２４５３８号は、高温度で炭化水素を変換するための生体触媒として適する、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス由来のスクロースホスホリラーゼに関する。
特にセロビオースホスホリラーゼによる触媒反応下でセロビオースを合成する場合、グルコース−１−リン酸が更なる反応でその後使用可能であるように、好ましくは出発物質としてスクロース及びリン酸から、工業スケールでグルコース−１−リン酸を製造する方法に対して改善の必要性が存在する。
改善した特性を有するスクロースホスホリラーゼを提供することが本発明の目的である。スクロース及びリン酸からグルコース−１−リン酸を合成する場合、スクロースホスホリラーゼは、既知のスクロースホスホリラーゼと比較して、活性及びプロセス安定性、特に温度安定性が改善していることにより、並びに反応物質及び生成物による阻害が低下していることにより、理想的には区別されるべきである。
この目的は、特許請求の範囲の主題により達成される。
本発明の第１の態様は、配列番号１に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、又は少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、又は少なくとも８９％、いっそうより好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、及び特に少なくとも９８．５％、少なくとも９９．０％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、又は少なくとも９９．８％の同一性を有し、並びに配列番号１と比較して、少なくとも１つのアミノ酸突然変異、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つのアミノ酸突然変異を、
・配列番号１に記載の、位置１１〜３１に対応する配列セグメントＡ）内に、及び／又は
・配列番号１に記載の、位置１３２〜１６１に対応する配列セグメントＢ）内に、及び／又は
・配列番号１に記載の、位置１７５〜１９５に対応する配列セグメントＣ）内に、及び／又は
・配列番号１に記載の、位置２８５〜３０５に対応する配列セグメントＤ）内に、及び／又は
・配列番号１に記載の、位置３９４〜４０６に対応する配列セグメントＥ）内に、及び／又は
・配列番号１に記載の、位置４４７〜４５９に対応する配列セグメントＦ）内に、及び／又は
・配列番号１に記載の、位置４６４〜４８４に対応する配列セグメントＧ）内に、
いずれの場合も互いに独立して含むアミノ酸配列を含むスクロースホスホリラーゼに関する。
好ましい実施形態では、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、
配列番号１に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも８０％の同一性を有し、並びに
配列番号１と比較して、
・配列番号１に記載の、位置１７５〜１９５に対応する配列セグメントＣ）内にアミノ酸突然変異を含み、及び
・配列番号１に記載の、位置２８５〜３０５に対応する配列セグメントＤ）内にアミノ酸突然変異を含む
アミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態では、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、又は少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、又は少なくとも８９％、いっそうより好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、又は少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％、及び特に少なくとも９８．５％、少なくとも９９．０％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、又は少なくとも９９．８％の同一性を有し、並びに配列番号１と比較して、少なくとも１つのアミノ酸突然変異、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つのアミノ酸突然変異を、
・配列番号１に記載の、位置１１〜３１に対応する配列セグメントＡ）内に、及び／又は
・配列番号１に記載の、位置１７５〜１９５に対応する配列セグメントＣ）内に、及び／又は
・配列番号１に記載の、位置２８５〜３０５に対応する配列セグメントＤ）内に、及び／又は
・配列番号１に記載の、位置４６４〜４８４に対応する配列セグメントＧ）内に、
いずれの場合も互いに独立して含むアミノ酸配列を含む。
驚くべきことに、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティスに由来するスクロースホスホリラーゼのアミノ酸配列（野生型、配列番号１）の特定の配列セグメントにおけるアミノ酸突然変異により、改善したスクロースホスホリラーゼが取得可能であることが判明した。
野生型スクロースホスホリラーゼと比較して、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、活性、プロセス安定性、温度安定性が改善していることにより、並びに反応物質及び生成物による阻害が低下していることにより区別され、従って工業プロセスにおける使用に特に適する。改善した特性は、空時収量の改善、及び合成に対する加リン酸分解の比の増加を実現し得る。
本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明によれば、「同一性」は、最適にアライメントされた２つの比較配列間の同一一致の割合（％）として定義される。最適なアライメントでは、２つの配列のいずれかにギャップが挿入され得る。Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ＴＦ、Ｗａｔｅｒｍａｎ ＭＳ（１９８１年）、Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４７巻、１９５〜１９７頁）を使用して、好ましくは、自由に利用可能である、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが導入されているＥＭＢＯＳＳパッケージからコンピュータープログラムＷＡＴＥＲ（Ｒｅｉｓ Ｐ、Ｌｏｎｇｄｅｎ Ｉ、Ｂｌｅａｓｂｙ Ａ（２０００年）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６巻、２７６〜２７７頁）を使用して、２つの比較配列間の同一性を判断することが優先される。ここでは、置換マトリックスについて、ＧＯＰ（ギャップオープニングペナルティ）１０、及びＧＥＰ（ギャップエクステンションペナルティ）０．５を用いたＢＬＯＳＵＭ６２の使用が優先される。
本発明の文脈におけるアミノ酸突然変異は、スクロースホスホリラーゼ野生型配列のアミノ酸を、好ましくは配列番号１に記載のスクロースホスホリラーゼ野生型配列のアミノ酸を、異なるタンパク質構成アミノ酸に交換することとして定義される。
本発明によるスクロースホスホリラーゼの好ましい実施形態では、
・配列セグメントＡ）が配列番号１に記載の、位置１６〜２６に対応し、及び／又は
・配列セグメントＢ）が配列番号１に記載の、位置１３７〜１５６に対応し、及び／又は
・配列セグメントＣ）が配列番号１に記載の、位置１８０〜１９０に対応し、及び／又は
・配列セグメントＤ）が配列番号１に記載の、位置２９０〜３００に対応し、及び／又は
・配列セグメントＥ）が配列番号１に記載の、位置３９４〜４０１に対応し、及び／又は
・配列セグメントＦ）が配列番号１に記載の、位置４４７〜４５６に対応し、及び／又は
・配列セグメントＧ）が配列番号１に記載の、位置４６９〜４８１に対応する。
本発明によるスクロースホスホリラーゼの特に好ましい実施形態では、
・配列セグメントＡ）が配列番号１に記載の、位置２０〜２２に対応し、及び／又は
・配列セグメントＢ）が配列番号１に記載の、位置１４１〜１５２に対応し、及び／又は
・配列セグメントＣ）が配列番号１に記載の、位置１８４〜１８６に対応し、及び／又は
・配列セグメントＤ）が配列番号１に記載の、位置２９４〜２９６に対応し、及び／又は
・配列セグメントＥ）が配列番号１に記載の、位置３９５〜３９７に対応し、及び／又は
・配列セグメントＦ）が配列番号１に記載の、位置４５０〜４５２に対応し、及び／又は
・配列セグメントＧ）が配列番号１に記載の、位置４７３〜４７７に対応する。
好ましい実施形態では、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１と比較して、少なくとも１つ、但しより好ましくは１つを超えないアミノ酸突然変異を、上記で定義した配列セグメントＡ）内に含む。
好ましい実施形態では、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１と比較して、少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２つ、但しいっそうより好ましくは２つを超えないアミノ酸突然変異を、上記で定義した配列セグメントＢ）内に含む。
好ましい実施形態では、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１と比較して、少なくとも１つ、但しより好ましくは１つを超えないアミノ酸突然変異を、上記で定義した配列セグメントＣ）内に含む。
好ましい実施形態では、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１と比較して、少なくとも１つ、但しより好ましくは１つを超えないアミノ酸突然変異を、上記で定義した配列セグメントＤ）内に含む。
好ましい実施形態では、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１と比較して、少なくとも１つ、但しより好ましくは１つを超えないアミノ酸突然変異を、上記で定義した配列セグメントＥ）内に含む。
好ましい実施形態では、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１と比較して、少なくとも１つ、但しより好ましくは１つを超えないアミノ酸突然変異を、上記で定義した配列セグメントＦ）内に含む。
好ましい実施形態では、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１と比較して、少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２つ、但しいっそうより好ましくは２つを超えないアミノ酸突然変異を、上記で定義した配列セグメントＧ）内に含む。
好ましい実施形態では、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１と比較して、２つ以上のアミノ酸突然変異、好ましくは少なくとも２つ、３つ、又は４つのアミノ酸突然変異を含む。
好ましい実施形態では、少なくとも２つ、３つ、又は４つのアミノ酸突然変異は、配列セグメントＡ）、Ｂ）、Ｃ）、Ｄ）、Ｅ）、Ｆ）、及び／又はＧ）内に、互いに独立して存在する。
好ましい実施形態では、少なくとも２つ、３つ、又は４つのアミノ酸突然変異が、配列セグメントＡ）、Ｃ）、Ｄ）、及び／又はＧ）内に、互いに独立して存在し、配列セグメントＡ）内の１つのアミノ酸突然変異、配列セグメントＣ）内の１つのアミノ酸突然変異、配列セグメントＤ）内の１つのアミノ酸突然変異、及び／又は配列セグメントＧ）内の１つのアミノ酸突然変異が優先される。
別の好ましい実施形態では、少なくとも２つ、３つ、又は４つのアミノ酸突然変異が、配列セグメントＣ）、Ｄ）、Ｆ）、及び／又はＧ）内に互いに独立して存在し、配列セグメントＣ）内の１つのアミノ酸突然変異、配列セグメントＤ）内の１つのアミノ酸突然変異、配列セグメントＦ）内の１つのアミノ酸突然変異、及び／又は配列セグメントＧ）内の１つのアミノ酸突然変異が優先される。
好ましい実施形態では、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１と比較して、少なくとも２つのアミノ酸突然変異、すなわちＡ／／Ａ、Ａ／／Ｂ、Ａ／／Ｃ、Ａ／／Ｄ、Ａ／／Ｅ、Ａ／／Ｆ、Ａ／／Ｇ；Ｂ／／Ｂ、Ｂ／／Ｃ、Ｂ／／Ｄ、Ｂ／／Ｅ、Ｂ／／Ｆ、Ｂ／／Ｇ；Ｃ／／Ｃ、Ｃ／／Ｄ、Ｃ／／Ｅ、Ｃ／／Ｆ、Ｃ／／Ｇ；Ｄ／／Ｄ、Ｄ／／Ｅ、Ｄ／／Ｆ、Ｄ／／Ｇ；Ｅ／／Ｅ、Ｅ／／Ｆ、Ｅ／／Ｇ；Ｆ／／Ｆ、Ｆ／／Ｇ；及びＧ／／Ｇからなる群から選択される「配列セグメント内の第１のアミノ酸突然変異」／／「配列セグメント内の第２のアミノ酸突然変異」を含む。この場合、例えば「Ｅ／／Ｆ」は、少なくとも２つアミノ酸突然変異のうちの１番目が、配列セグメントＥ）内に存在し、且つ少なくとも２つのアミノ酸突然変異のうちの２番目が、配列セグメントＦ）内に存在することを意味する。
特に好ましい実施形態では、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１と比較して、少なくとも２つのアミノ酸突然変異、すなわちＡ／／Ｃ、Ａ／／Ｄ、Ａ／／Ｇ；Ｂ／／Ｅ、Ｂ／／Ｇ；Ｃ／／Ｄ、Ｃ／／Ｆ、Ｃ／／Ｇ；Ｄ／／Ｆ、Ｄ／／Ｇ；Ｅ／／Ｇ；及びＦ／／Ｇからなる群から選択される「配列セグメント内の第１のアミノ酸突然変異」／／「配列セグメント内の第２のアミノ酸突然変異」を含む。
本発明によるスクロースホスホリラーゼの特に好ましい実施形態では、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つのアミノ酸突然変異は、
・Ｓ２１
・Ｈ１４２、Ｌ１５１
・Ｈ１８５
・Ｉ２９５
・Ｎ３９６
・Ｓ４５１
・Ｄ４７４、及びＴ４７６
からなる群より選択される。
本発明による特に好ましいスクロースホスホリラーゼは、Ｈ１８５、Ｉ２９５、及びＤ４７４からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸突然変異を含む。
本発明による特に好ましいスクロースホスホリラーゼは、Ｎ３９６及びＤ４７４からなる群から選択される１つ又は２つのアミノ酸突然変異を含む。
本発明による特に好ましいスクロースホスホリラーゼは、Ｈ１４２、Ｎ３９６、及びＤ４７４からなる群から選択される１つ、２つ、又は３つのアミノ酸突然変異を含む。
本発明による特に好ましいスクロースホスホリラーゼは、Ｌ１５１、Ｎ３９６、及びＤ４７４からなる群から選択される１つ、２つ、又は３つのアミノ酸突然変異を含む。
本発明による特に好ましいスクロースホスホリラーゼは、Ｈ１８５、Ｉ２９５、及びＴ４７６からなる群から選択される１つ、２つ、又は３つのアミノ酸突然変異を含む。
本発明による特に好ましいスクロースホスホリラーゼは、Ｈ１８５、Ｉ２９５、及びＤ４７４からなる群から選択される１つ、２つ、又は３つのアミノ酸突然変異を含む。
本発明による特に好ましいスクロースホスホリラーゼは、Ｓ２１、Ｈ１８５、Ｉ２９５、及びＤ４７４からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸突然変異を含む。
本発明による特に好ましいスクロースホスホリラーゼは、Ｈ１８５、Ｉ２９５、Ｓ４５１、及びＤ４７４からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸突然変異を含む。
好ましくは、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１と比較して、特定のアミノ酸突然変異を有さない。従って、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、Ｑ３３１Ｅ、Ｒ３９３Ｎ、Ｄ４４５Ｐ、Ｄ４４６Ｇ、Ｄ４４６Ｔ、Ｑ４６０Ｅ、及びＥ４８５Ｈからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含まない、好ましくはこれらすべてのアミノ酸突然変異を含まないことが、本発明に基づき好ましい。
本発明によるスクロースホスホリラーゼの特に好ましい実施形態では、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つのアミノ酸突然変異は、
・Ｓ２１Ｇ
・Ｈ１４２Ａ、Ｌ１５１Ｙ
・Ｈ１８５Ｇ
・Ｉ２９５Ｖ
・Ｎ３９６Ｓ
・Ｓ４５１Ｔ
・Ｄ４７４Ｅ、及びＴ４７６Ａ
からなる群より選択される。
本発明による特に好ましいスクロースホスホリラーゼは、Ｈ１８５Ｇ、Ｉ２９５Ｖ、及びＤ４７４Ｅからなる群から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つのアミノ酸突然変異を含む。
本発明による特に好ましいスクロースホスホリラーゼは、Ｎ３９６Ｓ及びＤ４７４Ｅからなる群から選択される、１つ又は２つのアミノ酸突然変異を含む。
本発明による特に好ましいスクロースホスホリラーゼは、Ｈ１４２Ａ、Ｎ３９６Ｓ、及びＤ４７４Ｅからなる群から選択される、１つ、２つ、又は３つのアミノ酸突然変異を含む。
本発明による特に好ましいスクロースホスホリラーゼは、Ｌ１５１Ｙ、Ｎ３９６Ｓ、及びＤ４７４Ｅからなる群から選択される、１つ、２つ、又は３つのアミノ酸突然変異を含む。
本発明による特に好ましいスクロースホスホリラーゼは、Ｈ１８５Ｇ、Ｉ２９５Ｖ、及びＴ４７６Ａからなる群から選択される、１つ、２つ、又は３つのアミノ酸突然変異を含む。
本発明による特に好ましいスクロースホスホリラーゼは、Ｈ１８５Ｇ、Ｉ２９５Ｖ、及びＤ４７４Ｅからなる群から選択される、１つ、２つ、又は３つのアミノ酸突然変異を含む。
本発明による特に好ましいスクロースホスホリラーゼは、Ｓ２１Ｇ、Ｈ１８５Ｇ、Ｉ２９５Ｖ、及びＤ４７４Ｅからなる群から選択される、１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸突然変異を含む。
本発明による特に好ましいスクロースホスホリラーゼは、Ｈ１８５Ｇ、Ｉ２９５Ｖ、Ｓ４５１Ｔ、及びＤ４７４Ｅからなる群から選択される、１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸突然変異を含む。
特に好ましくは、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態では、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１と異なり、且つ配列番号２に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記アミノ酸配列は、配列番号１と比較して、下記の位置：Ｈ１４２、Ｎ３９６、及びＤ４７４、好ましくはそのすべての位置に、１つ又は複数のアミノ酸突然変異を有する。好ましくは、前記アミノ酸配列は、配列番号１と比較して、下記のアミノ酸突然変異：Ｈ１４２Ａ、Ｎ３９６Ｓ、及びＤ４７４Ｅのうちの１つ又は複数、好ましくはそのすべてを有する。
好ましい実施形態では、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１と異なり、且つ配列番号３に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記アミノ酸配列は、配列番号１と比較して、下記の位置：Ｌ１５１、Ｎ３９６、及びＤ４７４、好ましくはそのすべての位置に、１つ又は複数のアミノ酸突然変異を有する。好ましくは、前記アミノ酸配列は、配列番号１と比較して、下記のアミノ酸突然変異：Ｌ１５１Ｙ、Ｎ３９６Ｓ、及びＤ４７４Ｅのうちの１つ又は複数、好ましくはそのすべてを有する。
好ましい実施形態では、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１と異なり、且つ配列番号４に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記アミノ酸配列は、配列番号１と比較して、下記の位置：Ｓ２１、Ｈ１８５、Ｉ２９５、及びＤ４７４、好ましくはそのすべての位置に、１つ又は複数のアミノ酸突然変異を有する。好ましくは、前記アミノ酸配列は、配列番号１と比較して、下記のアミノ酸突然変異：Ｓ２１Ｇ、Ｈ１８５Ｇ、Ｉ２９５Ｖ、及びＤ４７４Ｅのうちの１つ又は複数、好ましくはそのすべてを有する。
好ましい実施形態では、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１と異なり、且つ配列番号５に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記アミノ酸配列は、配列番号１と比較して、下記の位置：Ｈ１８５、Ｉ２９５、Ｓ４５１、及びＤ４７４、好ましくはそのすべての位置に、１つ又は複数のアミノ酸突然変異を有する。好ましくは、前記アミノ酸配列は、配列番号１と比較して、下記のアミノ酸突然変異：Ｈ１８５Ｇ、Ｉ２９５Ｖ、Ｓ４５１Ｔ、及びＤ４７４Ｅのうちの１つ又は複数、好ましくはそのすべてを有する。
好ましい実施形態では、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１と異なり、且つ配列番号６に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記アミノ酸配列は、配列番号１と比較して、下記の位置：Ｈ１８５、Ｉ２９５、及びＴ４７６、好ましくはそのすべての位置に、１つ又は複数のアミノ酸突然変異を有する。好ましくは、前記アミノ酸配列は、配列番号１と比較して、下記のアミノ酸突然変異：Ｈ１８５Ｇ、Ｉ２９５Ｖ、及びＴ４７６Ａのうちの１つ又は複数、好ましくはそのすべてを有する。
好ましい実施形態では、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１と異なり、且つ配列番号７に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記アミノ酸配列は、配列番号１と比較して、下記の位置：Ｎ３９６及びＤ４７４、好ましくはそのすべての位置に、１つ又は複数のアミノ酸突然変異を有する。好ましくは、前記アミノ酸配列は、配列番号１と比較して、下記のアミノ酸突然変異：Ｎ３９６Ｓ及びＤ４７４Ｅのうちの１つ又は複数、好ましくはそのすべてを有する。
好ましい実施形態では、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１と異なり、且つ配列番号８に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、前記アミノ酸配列は、配列番号１と比較して、下記の位置：Ｈ１８５、Ｉ２９５、及びＤ４７４、好ましくはそのすべての位置に、１つ又は複数のアミノ酸突然変異を有する。好ましくは、前記アミノ酸配列は、配列番号１と比較して、下記のアミノ酸突然変異：Ｈ１８５Ｇ、Ｉ２９５Ｖ、及びＤ４７４Ｅのうちの１つ又は複数、好ましくはそのすべてを有する。
一般的に、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、スクロース及びリン酸からグルコース−１−リン酸及びフルクトースへの変換を触媒する。この場合、本発明によるスクロースホスホリラーゼは、配列番号１に記載のスクロースホスホリラーゼと比較して、好ましくは、
（ｉ）等モル量のグルコース−１−リン酸及びフルクトースの存在下で、スクロース及びリン酸からグルコース−１−リン酸及びフルクトースへの変換に関して活性が増加している、及び／又は
（ｉｉ）等モル量のグルコース−１−リン酸及びフルクトースの存在下で、スクロース及びリン酸からグルコース−１−リン酸及びフルクトースへの変換に関して、フルクトースによる阻害が低下している、及び／又は
（ｉｉｉ）５８℃で１５分間インキュベーションした後の温度安定性がより高い。
下記の表は、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（野生型（ＷＴ）、配列番号１）由来のスクロースホスホリラーゼと比較して、本発明に記載のそのアミノ酸配列の相違を列挙する。
本発明の更なる態様は、スクロース及びリン酸からグルコース−１−リン酸及びフルクトースへの酵素的に触媒された変換のための、上記本発明によるスクロースホスホリラーゼの使用に関する。好ましくは、前記本発明による使用は、その後、セロビオースホスホリラーゼによる酵素的触媒反応の下、グルコースと共にグルコース−１−リン酸が得られ、セロビオースが形成される反応を含む。
本発明によるスクロースホスホリラーゼと関連付けて上記したすべての好ましい実施形態は、本発明によるその使用にも同様に適用され、従ってここでは繰り返さない。
本発明の更なる態様は、グルコース−１−リン酸及びフルクトースを製造する方法であって、上記本発明によるスクロースホスホリラーゼによる酵素的触媒反応の下、スクロース及びリン酸の変換を含む前記方法と関する。
本発明によるスクロースホスホリラーゼ又は本発明によるその使用と関連付けて上記したすべての好ましい実施形態は、本発明による方法に同様に適用され、従ってここでは繰り返さない。
本発明の更なる態様は、スクロース及びグルコースからセロビオース及びフルクトースを製造する方法であって、
（ａ）上記本発明によるスクロースホスホリラーゼによる酵素的触媒反応の下、スクロース及びリン酸の変換により、グルコース−１−リン酸及びフルクトースを合成するステップと、
（ｂ）セロビオースホスホリラーゼによる酵素的触媒反応の下、グルコース−１−リン酸をグルコースと反応させることにより、セロビオース及びリン酸を合成するステップと
を含む前記方法と関する。
本発明によるスクロースホスホリラーゼ又は本発明によるその使用と関連付けて上記したすべての好ましい実施形態は、本発明による方法に同様に適用され、従ってここでは繰り返さない。
更なる好ましい実施形態は下記の通り。
実施形態１：配列番号１に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも８０％の同一性を有し、且つ配列番号１と比較して、
・配列番号１に記載の、位置１１〜３１に対応する配列セグメントＡ）内に、及び／又は
・配列番号１に記載の、位置１３２〜１６１に対応する配列セグメントＢ）内に、及び／又は
・配列番号１に記載の、位置１７５〜１９５に対応する配列セグメントＣ）内に、及び／又は
・配列番号１に記載の、位置２８５〜３０５に対応する配列セグメントＤ）内に、及び／又は
・配列番号１に記載の、位置３９４〜４０６に対応する配列セグメントＥ）内に、及び／又は
・配列番号１に記載の、位置４４７〜４５９に対応する配列セグメントＦ）内に、及び／又は
・配列番号１に記載の、位置４６４〜４８４に対応する配列セグメントＧ）内に
少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含むアミノ酸配列を含むスクロースホスホリラーゼ。
実施形態２：配列番号１に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも８０％の同一性を有し、且つ配列番号１と比較して、
・配列番号１に記載の、位置１１〜３１に対応する配列セグメントＡ）内に、及び／又は
・配列番号１に記載の、位置１７５〜１９５に対応する配列セグメントＣ）内に、及び／又は
・配列番号１に記載の、位置２８５〜３０５に対応する配列セグメントＤ）内に、及び／又は
・配列番号１に記載の、位置４６４〜４８４に対応する配列セグメントＧ）内に
少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む、実施形態１に記載のスクロースホスホリラーゼ。
実施形態３：実施形態１又は２に記載のスクロースホスホリラーゼであって、
・配列セグメントＡ）が配列番号１に記載の、位置１６〜２６に対応する、及び／又は
・配列セグメントＢ）が配列番号１に記載の、位置１３７〜１５６に対応する、及び／又は
・配列セグメントＣ）が配列番号１に記載の、位置１８０〜１９０に対応する、及び／又は
・配列セグメントＤ）が配列番号１に記載の、位置２９０〜３００に対応する、及び／又は
・配列セグメントＥ）が配列番号１に記載の、位置３９４〜４０１に対応する、及び／又は
・配列セグメントＦ）が配列番号１に記載の、位置４４７〜４５６に対応する、及び／又は
・配列セグメントＧ）が配列番号１に記載の、位置４６９〜４８１に対応する、
前記スクロースホスホリラーゼ。
実施形態４：実施形態１〜３のいずれかに記載のスクロースホスホリラーゼであって、
・配列セグメントＡ）が配列番号１に記載の、位置２０〜２２に対応する、及び／又は
・配列セグメントＢ）が配列番号１に記載の、位置１４１〜１５２に対応する、及び／又は
・配列セグメントＣ）が配列番号１に記載の、位置１８４〜１８６に対応する、及び／又は
・配列セグメントＤ）が配列番号１に記載の、位置２９４〜２９６に対応する、及び／又は
・配列セグメントＥ）が配列番号１に記載の、位置３９５〜３９７に対応する、及び／又は
・配列セグメントＦ）が配列番号１に記載の、位置４５０〜４５２に対応する、及び／又は
・配列セグメントＧ）が配列番号１に記載の、位置４７３〜４７７に対応する、
前記スクロースホスホリラーゼ。
実施形態５：実施形態１〜４のいずれかに記載のスクロースホスホリラーゼであって、少なくとも１つのアミノ酸突然変異が、
・Ｓ２１
・Ｈ１４２、Ｌ１５１
・Ｈ１８５
・Ｉ２９５
・Ｎ３９６
・Ｓ４５１
・Ｄ４７４、及びＴ４７６
からなる群から選択される、前記スクロースホスホリラーゼ。
実施形態６：実施形態１〜５のいずれかに記載のスクロースホスホリラーゼであって、いずれの場合も互いに独立して、請求項１又は２において定義される、少なくとも２つ、３つ、又は４つのアミノ酸突然変異を含む、前記スクロースホスホリラーゼ。
実施形態７：実施形態１〜６のいずれかに記載のスクロースホスホリラーゼであって、Ｑ３３１Ｅ、Ｒ３９３Ｎ、Ｄ４４５Ｐ、Ｄ４４６Ｇ、Ｄ４４６Ｔ、Ｑ４６０Ｅ、及びＥ４８５Ｈからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含まない、好ましくはこれらすべてのアミノ酸突然変異を含まない、前記スクロースホスホリラーゼ。
実施形態８：実施形態１〜７のいずれかに記載のスクロースホスホリラーゼであって、少なくとも１つのアミノ酸突然変異が、
・Ｓ２１Ｇ
・Ｈ１４２Ａ、Ｌ１５１Ｙ
・Ｈ１８５Ｇ
・Ｉ２９５Ｖ
・Ｎ３９６Ｓ
・Ｓ４５１Ｔ
・Ｄ４７４Ｅ、及びＴ４７６Ａ
からなる群から選択される、前記スクロースホスホリラーゼ。
実施形態９：実施形態１〜８のいずれかに記載のスクロースホスホリラーゼであって、スクロース及びリン酸からグルコース−１−リン酸及びフルクトースへの変換を触媒する前記スクロースホスホリラーゼ。
実施形態１０：実施形態１〜９のいずれかに記載のスクロースホスホリラーゼであって、配列番号１に記載のスクロースホスホリラーゼと比較して、
（ｉ）等モル量のグルコース−１−リン酸及びフルクトースの存在下で、スクロース及びリン酸からグルコース−１−リン酸及びフルクトースへの変換に関して活性が増加している、及び／又は
（ｉｉ）等モル量のグルコース−１−リン酸及びフルクトースの存在下で、スクロース及びリン酸からグルコース−１−リン酸及びフルクトースへの変換に関して、フルクトースによる阻害が低下している、及び／又は
（ｉｉｉ）５８℃で１５分間インキュベーションした後の温度安定性がより高い
前記スクロースホスホリラーゼ。
実施形態１１：実施形態１〜１０のいずれかに記載のスクロースホスホリラーゼであって、配列番号４に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも９０％の同一性を有する前記スクロースホスホリラーゼ。
実施形態１２：実施形態１１に記載のスクロースホスホリラーゼであって、同一性が、配列番号４に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも９５％である前記スクロースホスホリラーゼ。
実施形態１３：スクロース及びリン酸からグルコース−１−リン酸及びフルクトースへの酵素的に触媒された変換のための、実施形態１〜１２のいずれかに記載のスクロースホスホリラーゼの使用。
実施形態１４：実施形態１〜１２のいずれかに記載のスクロースホスホリラーゼによる酵素的触媒反応の下で、スクロース及びリン酸の変換を含む、グルコース−１−リン酸及びフルクトースを製造する方法。
実施形態１５：スクロース及びグルコースからセロビオース及びフルクトースを製造する方法であって、
（ａ）実施形態１〜１２のいずれかに記載のスクロースホスホリラーゼによる酵素的触媒反応の下で、スクロース及びリン酸を変換することにより、グルコース−１−リン酸及びフルクトースを合成するステップと
（ｂ）セロビオースホスホリラーゼによる酵素的触媒反応の下で、グルコース−１−リン酸をグルコースと反応させることにより、セロビオース及びリン酸を合成するステップと、
を含む前記方法。
更に、更なる好ましい実施形態は下記の通り。
実施形態１６：配列番号１に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも８０％の同一性を有し、
且つ配列番号１と比較して、
・配列番号１に記載の、位置１３２〜１６１に対応する配列セグメントＢ）内に、及び／又は
・配列番号１に記載の、位置３９４〜４０６に対応する配列セグメントＥ）内に、及び／又は
・配列番号１に記載の、位置４６４〜４８５に対応する配列セグメントＧ）内に
少なくとも２つのアミノ酸突然変異を含むアミノ酸配列を含むスクロースホスホリラーゼ。
実施形態１７：実施形態１６に記載のスクロースホスホリラーゼであって、
・配列セグメントＢ）が配列番号１に記載の、位置１３７〜１５６に対応する、及び／又は
・配列セグメントＥ）が配列番号１に記載の、位置３９４〜４０１に対応する、及び／又は
・配列セグメントＧ）が配列番号１に記載の、位置４６９〜４８１に対応する
前記スクロースホスホリラーゼ。
実施形態１８：実施形態１７に記載のスクロースホスホリラーゼであって、
・配列セグメントＢ）が配列番号１に記載の、位置１４１〜１５２に対応する、及び／又は
・配列セグメントＥ）が配列番号１に記載の、位置３９５〜３９７に対応する、及び／又は
・配列セグメントＧ）が配列番号１に記載の、位置４７３〜４７７に対応する
前記スクロースホスホリラーゼ。
実施形態１９：実施形態１８に記載のスクロースホスホリラーゼであって、アミノ酸突然変異が、
・Ｈ１４２若しくはＬ１５１、及び／又は
・Ｎ３９６、及び／又は
・Ｄ４７４若しくはＴ４７６
である、前記スクロースホスホリラーゼ。
実施形態２０：実施形態１９に記載のスクロースホスホリラーゼであって、アミノ酸突然変異が、
・Ｈ１４２、及び／又は
・Ｎ３９６、及び／又は
・Ｄ４７４
である、前記スクロースホスホリラーゼ。
実施形態２１：実施形態１９に記載のスクロースホスホリラーゼであって、アミノ酸突然変異が、
・Ｌ１５１、及び／又は
・Ｎ３９６、及び／又は
・Ｄ４７４
である、前記スクロースホスホリラーゼ。
実施形態２２：実施形態１９〜２１のいずれかに記載のスクロースホスホリラーゼであって、アミノ酸突然変異が、
・Ｈ１４２Ａ若しくはＬ１５１Ｙ、及び／又は
・Ｎ３９６Ｓ、及び／又は
・Ｄ４７４Ｅ若しくはＴ４７６Ａ
である、前記スクロースホスホリラーゼ。
（記載なし。）
下記の実施例は本発明について説明するが、制限的に解釈されるものではない。
［実施例１］
ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス由来の野生型スクロースホスホリラーゼのエンジニアリング
ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス由来の野生型のスクロースホスホリラーゼのエンジニアリングでは、下記のエンジニアリング最終目標を定義した
・フルクトース阻害の低下
・活性の一般的な増加
・リン酸に関してＫｍ値の低下
・Ｇ１Ｐ阻害の低下
・温度安定性の維持
エンジニアリングにおいて、選択した方式は半合理的反復アプローチであった。第１ラウンドのエンジニアリングでは、まず第１に、入手可能な全データを分析した後、興味深いと思われる位置及び考え得る置換を識別し、並びにそれを個々の突然変異体として構築した。次にこれを、所望のエンジニアリング最終目標に応じて、マルチパラメータースクリーニングでスクリーニングした。前記第１ラウンドから得られた有望な突然変異をその後統合し、得られたバリアントの特徴付けを行った。
すべてのアッセイを、３０℃、ｐＨ６．３で実施した。市販のＧ１Ｐ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、品番Ｇ７０００）をＧ１Ｐとしてもっぱら使用した。野生型酵素（新たにコドンが最適化されている）を、比較酵素として各プレート上で２回、常時、同時アッセイした。すべてのデータを同一のプレート上で同時アッセイした比較酵素に対して標準化し、発現の変動又は異なるプレート間の測定変動の補償を可能にした。
マルチパラメータースクリーニングの概要
ＭＤＭ分析により、１６９箇所の位置及び置換を、第１ラウンドのエンジニアリングのために選択した。これは、すべての位置の約３３％、但しすべての考え得る個々の突然変異体の２％未満に対応する。前記個々の突然変異体は、ＡＧＭ法（自動化された突然変異体生成法）を使用して構築した。野生型遺伝子（コドンが最適化されている）の配列を、テンプレートとして用いた。構築したバリアントを発現させ、異なるエンジニアリング最終目標に応じてスクリーニングした。結果を、各プレート上で重複して同時アッセイした野生型に対して標準化した。エンジニアリング最終目標すべてについて、改善したバリアントを識別することができた。
第２ラウンドのエンジニアリングでは、第１ラウンドから得られた最良の突然変異７例を相互に組み合わせた（１２８バリアント）。国際公開第２００９／１４６８９２号に記載の突然変異誘発法を使用して、コンプレックスバンクを構築した。コンプレックスバンクの３７６クローンを取り出し、発現させ、及びエンジニアリング最終目標に関してスクリーニングした（オーバサンプリング２．９倍、スクリーニング範囲９５％）。エンジニアリング最終目標すべてについて、改善したバリアントを識別することができた。
第３ラウンドのエンジニアリングでは、第２ラウンドから得られたヒットを、第１ラウンドから得られた更なる一次ヒットと更に組み合わせた（１０５バリアント）。前記バリアントを構築し、発現させ、ＡＧＭ法（自動化された突然変異体生成法）を使用してスクリーニングした。
加リン酸分解活性、フルクトース阻害に関するエンジニアリングの結果、及びリン酸（Ｐｉ）に関してＫｍ値を、図１Ａ〜１Ｃに、野生型（ＷＴ）と比較して示す。
［実施例２］
最良のバリアント７例の特徴付け
詳細な最終的特徴付けのために、第２及び第３ラウンドのエンジニアリングから得られた最良のバリアント７例を選択した（配列番号２〜８）。
ａ） 活性収率及び可溶性発現
選択したバリアント７例、及び野生型酵素（ＷＴ）を、振盪フラスコ内の２つの独立した発現培養液中で発現させ、それを破壊し、発現培養液１ｍＬ当たりの活性収率を測定した。
可溶性発現の評価では、可溶性分画を標準化した。異なるバリアント間で発現レベルに有意差は認められなかった。
ｂ）融解曲線
エンジニアリング最終目標の１つは、野生型スクロースホスホリラーゼの高温安定性を維持することであった。バリアントを試験するために、ＰＣＲサイクラー中、４０〜７２℃の温度で、１５分間、酵素をインキュベートし、酵素の残存活性をその後決定した。調査したバリアントのうち５例が、野生型酵素と同等の温度安定性を示した。結果を図２に示す。
ｃ）フルクトース阻害、Ｇ１Ｐ阻害、及びリン酸のＫｍ値
フルクトース又はＧ１Ｐ阻害に関して、バリアントに生ずると考え得る変化を評価する際には、フルクトース又はＧ１Ｐの存在下、その濃度を高めながら、酵素バリアント及び野生型酵素のそれぞれの場合について、初期活性変化を測定した。基質として、２００ｍＭのスクロース及びリン酸を、それぞれの場合において添加した。
調査したバリアントすべてにおいて、２５０〜７５０ｍＭのフルクトースの存在下で、顕著な阻害低下が認められることが明らかとなった。フルクトース阻害を完全に取り除くことは不可能であったが、改善の度合いは顕著である。対照的に、Ｇ１Ｐ阻害の場合は、認められた改善はそれほど明白ではなかった。但し、野生型のＧ１Ｐ阻害も、フルクトース阻害と同様に、それほど際立っていない。更に、Ｇ１Ｐ阻害は、Ｇ１Ｐ濃度が１００ｍＭを超えたときに限り、その効果が現れる。
酵素阻害に関する実験に類似して、１０〜２５０ｍＭのリン酸が存在したときの初期活性を、リン酸におけるＫｍ値の変化を把握するために、すべてのバリアント酵素及び野生型酵素について測定した。バリアントのいずれも、異なるリン酸濃度において、野生型と比較して、初期活性に有意差を示さなかった。バリアントのいずれについても、野生型と比較して劣等性は認められなかった。
フルクトース、リン酸、及びグルコース−１−リン酸阻害に関する結果を、図３Ａ〜３Ｃに示す。
選択されたバリアント４例を振盪フラスコ中で発現、採取し、５０ｍＭのＮａ ＭＥＳバッファー、ｐＨ６．３中で再懸濁し、超音波を使用して破壊した。細胞断片及び不溶性成分を遠心分離により除去した。上清を滅菌濾過し、無菌のグリセロールを用いて５０／５０（ｖ／ｖ）混合した。処方された酵素の加リン酸分解活性を決定した。

Claims (34)

  1. 配列番号１に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも８０％の同一性を有し、並びに
    配列番号１と比較して、
    配列番号１に記載の、位置１７５〜１９５に対応する配列セグメントＣ）内にアミノ酸突然変異を含み、及び
    配列番号１に記載の、位置２８５〜３０５に対応する配列セグメントＤ）内にアミノ酸突然変異を含む
    アミノ酸配列を含むスクロースホスホリラーゼ。
  2. 配列セグメントＣ）が配列番号１に記載の、位置１８０〜１９０に対応し、及び
    配列セグメントＤ）が配列番号１に記載の、位置２９０〜３００に対応する、
    請求項１に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  3. 配列セグメントＣ）が配列番号１に記載の、位置１８４〜１８６に対応し、及び
    配列セグメントＤ）が配列番号１に記載の、位置２９４〜２９６に対応する、
    請求項２に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  4. 前記アミノ酸突然変異が、Ｈ１８５及び位置Ｉ２９５である、請求項３に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  5. 前記アミノ酸突然変異が、Ｈ１８５Ｇ及びＩ２９５Ｖである、請求項４に記載のスクロースホスホリラーゼ
  6. 配列セグメントＣ）及びＤ）内のアミノ酸突然変異に付加して、
    配列番号１に記載の、位置４６４〜４８４に対応する配列セグメントＧ）内に
    少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  7. 配列セグメントＧ）が配列番号１に記載の、位置４６９〜４８１に対応する、請求項６に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  8. 配列セグメントＧ）が配列番号１に記載の、位置４７３〜４７７に対応する、請求項７に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  9. 前記アミノ酸突然変異が、Ｄ４７４又はＴ４７６である、請求項８に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  10. 前記アミノ酸突然変異が、Ｄ４７４Ｅ又はＴ４７６Ａである、請求項９に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  11. 配列セグメントＣ）及びＤ）、並びに任意選択的にＧ）内のアミノ酸突然変異に付加して、
    配列番号１に記載の、位置１１〜３１に対応する配列セグメントＡ）内に
    アミノ酸突然変異を含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  12. 配列セグメントＡ）が配列番号１に記載の、位置１６〜２６に対応する、請求項１１に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  13. 配列セグメントＡ）が配列番号１に記載の、位置２０〜２２に対応する、請求項１２に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  14. 前記アミノ酸突然変異が、Ｓ２１である、請求項１３に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  15. 前記アミノ酸突然変異が、Ｓ２１Ｇである、請求項１４に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  16. 配列セグメントＣ）及びＤ）、並びに任意選択的にＧ）内のアミノ酸突然変異に付加して、
    配列番号１に記載の、位置４４７〜４５９に対応する配列セグメントＦ）内に
    アミノ酸突然変異を含む、請求項１から１５のいずれか１項に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  17. 配列セグメントＦ）が配列番号１に記載の、位置４４７〜４５６に対応する、請求項１６に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  18. 配列セグメントＦ）が配列番号１に記載の、位置４４７〜４５６に対応する、
    請求項１７に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  19. 前記アミノ酸突然変異が、Ｓ４５１である、請求項１８に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  20. 前記アミノ酸突然変異が、Ｓ４５１Ｔである、請求項１９に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  21. Ｑ３３１Ｅ、Ｒ３９３Ｎ、Ｄ４４５Ｐ、Ｄ４４６Ｇ、Ｄ４４６Ｔ、Ｑ４６０Ｅ、及びＥ４８５Ｈからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含まない、好ましくはこれらすべてのアミノ酸突然変異を含まない、請求項１から２０のいずれか１項に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  22. スクロース及びリン酸からグルコース−１−リン酸及びフルクトースへの変換を触媒する、請求項１から２１のいずれか１項に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  23. 配列番号１に記載のスクロースホスホリラーゼと比較して、
    （ｉ）等モル量のグルコース−１−リン酸及びフルクトースの存在下で、スクロース及びリン酸からグルコース−１−リン酸及びフルクトースへの変換に関して活性が増加している、及び／又は
    （ｉｉ）等モル量のグルコース−１−リン酸及びフルクトースの存在下で、スクロース及びリン酸からグルコース−１−リン酸及びフルクトースへの変換に関して、フルクトースによる阻害が低下している、及び／又は
    （ｉｉｉ）５８℃で１５分間インキュベーションした後の温度安定性がより高い、
    請求項１から２２のいずれか１項に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  24. 配列番号４に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１から２３のいずれか１項に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  25. 配列番号４に記載のアミノ酸配列に関連して、同一性が少なくとも９５％である、請求項２４に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  26. 配列番号５に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１から２５のいずれか１項に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  27. 配列番号５に記載のアミノ酸配列に関連して、同一性が少なくとも９５％である、請求項２６に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  28. 配列番号６に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１から２７のいずれか１項に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  29. 配列番号６に記載のアミノ酸配列に関連して、同一性が少なくとも９５％である、請求項２８に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  30. 配列番号８に記載のアミノ酸配列に関連して、少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１から２９のいずれか１項に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  31. 配列番号８に記載のアミノ酸配列に関連して、同一性が少なくとも９５％である、請求項３０に記載のスクロースホスホリラーゼ。
  32. スクロース及びリン酸からグルコース−１−リン酸及びフルクトースへの酵素的に触媒された変換のための、請求項１から３１のいずれか１項に記載するスクロースホスホリラーゼの使用。
  33. 請求項１から３１のいずれか１項に記載のスクロースホスホリラーゼによる酵素的触媒反応下での、スクロース及びリン酸への変換を含む、グルコース−１−リン酸及びフルクトースを製造する方法。
  34. スクロース及びグルコースからセロビオース及びフルクトースを製造する方法であって、
    （ａ）請求項１から３１のいずれか１項に記載のスクロースホスホリラーゼによる酵素的触媒反応下で、スクロース及びリン酸を変換することによりグルコース−１−リン酸及びフルクトースを合成するステップと、
    （ｂ）セロビオースホスホリラーゼによる酵素的触媒反応の下で、グルコース−１−リン酸をグルコースと反応させることにより、セロビオース及びリン酸を合成するステップと
    を含む、前記方法。
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