JP2019502749A - イムノアセンブリン(ia)タンパク質複合体 - Google Patents
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Abstract
本明細書で提供した技術は、新規種類の組換えタンパク質複合体、特に、病原体の表面上に提示されることが好ましいが必須ではないタンパク質から得られる複数の抗原または抗原ドメインを含む、動物およびヒトワクチンとして適切な、以後イムノアセンブリン(IA)と称する抗体様組換え融合タンパク質複合体に関する。前記組換えタンパク質をコードする核酸分子、ベクター、核酸を含有する宿主細胞ならびにこのようなタンパク質およびタンパク質複合体を調製および生成するための方法、前記ワクチンまたは前記融合タンパク質をコードする前記核酸分子の使用によって誘導または作製される抗体ならびに受動免疫療法のためのこのような抗体または組換え誘導体の使用。
Description
本開示は、新規種類の組換えタンパク質複合体、特に、病原体の表面上に提示されることが好ましいが必須ではないタンパク質から得られる複数の抗原または抗原ドメインを含む、動物およびヒトワクチンとして適切な、以後イムノアセンブリン(IA)と称する抗体様組換え融合タンパク質複合体に関する。前記組換えタンパク質をコードする核酸分子、ベクター、核酸を含有する宿主細胞ならびにこのようなタンパク質およびタンパク質複合体を調製および生成するための方法、前記ワクチンまたは前記融合タンパク質をコードする前記核酸分子の使用によって誘導または作製される抗体ならびに受動免疫療法のためのこのような抗体または組換え誘導体の使用。
免疫系に絶対必要な機能は、感染に対する防御である。体液性免疫系は、最初の接触によって、抗原として作用する感染因子に対して特異的に生じる抗体を使用して、病原体などの非自己として認識した分子と戦う。天然の抗体は、典型的には、内部鎖ジスルフィド結合によって結合した重(H)鎖および軽(L)鎖を含む多価分子である。ヒトでは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgEおよびIgMを含む、抗体の数種のアイソタイプが知られている。IgGは、2つの重鎖および2つの軽鎖を含有する。各鎖は、定常(C)および可変(V)領域を含有し、これらはさらにCH1、CH2、CH3、VHおよびCL、VLと呼ばれるドメインにさらに分類される(図3)。抗体は、Fab部分に含有される可変領域ドメインを介して抗原に結合し、結合後、定常ドメインによって、ほとんどはFc部分を通じて、免疫系の分子および細胞と相互作用することができる。
微生物に対するヒトおよび動物の予防的免疫には、ヒトまたは動物において抗体および/または抗原の細胞性免疫応答を増加させる物質と併用した、微生物から得られた抗原の投与が含まれる。しかし、数種の新たな顧みられない疾患(例えば、MERS、エボラ、HIV、狂犬病、マラリア、インフルエンザ)に対する今日のワクチン開発およびそれらに対する効果的な対応策には、未だにいくつかの困難が存在している。いくつかの感染因子は、抗原が非常に変化しやすく多様であることが特徴で(例えば、HIV、インフルエンザ、プラスモディウム(Plasmodium)種およびアピコンプレクサ(Apicomplexa)のその他のメンバー)、ワクチン開発の大きな課題となっている。いくつかの場合には、非常に特殊かつ希少で広範な中和抗体(bnAb)が同定されており、ヒトにおいてこのようなbnAbを効率的に誘導することができる抗原同等物を同定して開発できることが期待されている。現場に出現する循環型の病原体種、エスケープ変異体およびバリアントの広がりは危機的で、しばしば、臨床開発および市場導入が難しい範囲にワクチンまたはワクチン候補の使用は制限されている。
さらに、当業者であれば、ワクチンによって誘導される免疫応答の質および量はいずれも、抗原分子自体だけでなく、使用する製剤、特にアジュバントに左右されることを知っている。ワクチンの効力は、使用する製剤およびアジュバントに著しく左右される。アジュバントがないと所与の用量で誘導される免疫応答は弱く、高用量が必要なためワクチンの費用が高くなるだけでなく、副作用の危険性も増大する。さらに、アジュバントは免疫応答の質にも影響を及ぼすため、防御を実現するのに不可欠である。いくつかの病原体、例えば、狂犬病ウイルスは、体液性応答によって効率的に中和されるが、その他はT細胞応答の効率的な誘導に左右される。数種のアジュバント、特に、ミョウバンは数十年にわたって使われ成功してきたが、様々な作用機序を有する新たなアジュバントの必要性は大きい。最後に、有効性の高い集団接種を実現しながら、費用を抑え、注射回数を減らすためにワクチンを組み合わせることも必要である。
数種の抗原およびワクチンを単一のワクチン製品に組み合わせる場合、または数種のワクチンを同時に投与する場合、免疫応答が全成分に対して確実に生じることが非常に重要である。単一または数種の成分によって誘導される応答が優位であると、その他の成分が実質的に不活性化し、したがって使えなくなる。また、多数の成分を含むいかなる複合ワクチンも、特に、異なる発現および精製方法が使用された場合、製造費用がたちまち制限要素となり得る。
例えば、マラリアはアピコンプレクサ(Apicomplexa)門の原生動物寄生生物、すなわちプラスモジウム(Plasmodium)属の寄生生物による感染によって引き起こされる疾患であり、全世界で毎年2億人以上の新規感染、および70万人以上の死亡を引き起こしている。マラリアは、アフリカでは特に深刻な問題であり、小児の死亡の5人に1人(20%)はこの疾患の影響によるものである。アフリカの小児は毎年、マラリア熱を平均して1.6から5.4回発症する。
効率的なマラリアワクチンの開発の主な障害は、寄生生物の多段階の生活環によって生じる。寄生生物発達の各段階は、異なる種類の免疫応答を誘発する異なる一連の表面抗原を特徴とする。多種多様な表面抗原が出現するにもかかわらず、それらに対する免疫応答は有効でないことが多い。理由の1つはマラリア原虫抗原の幅広い配列多型性であり、これが様々な単離株の免疫回避を容易にする(それらの単離株の交差範囲の欠如が交差防御の不足を引き起こす)。
マラリアワクチンの開発に対する研究は1960年代から推し進められてきたが、未だに利用可能な認可されたマラリアワクチンはないので、熱帯熱マラリアの原因病原体、熱帯熱マラリア原虫(plasmodium falciparum)は、依然として科学者等にとって手強い強敵である。抗マラリアワクチンの開発を妨げている主な障害には、寄生生物の多くの生活環段階に関連した多様な抗原レパートリー、抗原の変化および野生型単離株の多様性ならびに宿主の限定された遺伝応答性が含まれる。
マラリア寄生生物に対する免疫は、段階依存的および種依存的である。多くのマラリア研究者等および教本の記述は、生活環の1段階のみに対応する単一抗原ワクチンでは十分ではなく、効果的な免疫性を誘導するには、寄生生物発達の異なる段階、すなわち少なくとも2段階を標的とする多抗原、多段階ワクチンが必要であると考え結論づけている(Mahajan,Berzofsky et al. 2010)。多抗原ワクチンの構築(異なる寄生生物段階を網羅し、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)エスケープ突然変異体の可能性を回避するためにワクチンによって誘導される免疫応答の幅を増大することを目的とした)は、遺伝子的に一緒に結合した(フルサイズ)抗原、組換えタンパク質の混合物、または異なる寄生生物タンパク質および段階から得られる数種のペプチドを含有する、合成ペプチドベースの(15〜25マー)化学合成ワクチンのいずれかによって達成することができる。
数種の異なる抗原または単一抗原の数種の異なる対立遺伝子から構成される単一融合タンパク質アプローチ(寄生生物に対して相乗的活性を有する抗体を誘導するため)は、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)の抗原多様性および免疫回避能力によって妨害される(Richards,Beeson, 2009)。可能性があるワクチン候補として多数の抗原が評価されたが、ほとんどの臨床試験は臨床マラリアを防ぐことに対してあまり効果を示さなかったものの、それらのうちのいくつかは寄生生物増殖を低減させることが示された。得られた融合タンパク質/ワクチン候補のサイズは別の制限因子で、数種の選択された抗原の組合せのみが可能となるが、選択された抗原が自然免疫の標的ではない、および/または顕著な遺伝的多型性を示すことが排除されるわけではない。複数の対立遺伝子を有する可変性の高い抗原が自然曝露下での免疫応答の明白な標的であり、PfAMA1およびPfMSP2のワクチン研究は対立遺伝子特異的効果を達成することができることを示唆している(Schwartz, 2012)。現在併用ワクチン(PfCSPおよびPfAMA1から構成される)のみが、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)の前赤内期および無性生殖血液段階を標的とする臨床試験を受けている(Schwartz, 2012)。プラスモジウム属(Plasmodium)の3つの生活環主要段階全てを標的とする(ハマダラカ属(Anopheles)の蚊の有性生殖段階を含み、したがって寄生生物伝染をブロックする)、融合物でも組合せアプローチでもない多抗原ワクチン候補は、未だに臨床試験で試験されたことがない。
したがって、新規および改善された多成分の、特に多段階ヒトおよび/または動物ワクチンを利用できると、非常に有利となる可能性がある。
本開示は、組換え融合タンパク質単位を含むワクチンとして適切な新規タンパク質複合体に関する。本開示は、特に、単離された組換えイムノアセンブリン(IA)、特に、ウイルス、細菌および/または真核寄生生物に起因する感染症、自己免疫疾患およびがんに対する、動物またはヒトワクチンとして適切な、抗体様組換え融合タンパク質複合体に関し、IAは、病原体または細胞の表面上に提示されていることが好ましいが必須ではないタンパク質から得られる複数の抗原または抗原ドメインを含む。特に、組換えポリペプチドの新規種類の複合体には、単一または2つ以上の病原体の複数の異なる抗原、および/または同じ抗原の複数のバリアント、および/または病原体から得られない少なくとも1つの成分が含まれる。
第1の態様では、本開示は、少なくとも3つの組換え融合タンパク質単位を含むワクチンとして適切なイムノアセンブリン(IA)タンパク質複合体に関し、
a)第1の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第1の抗原を含み、前記第1の抗原はイムノグロブリン重鎖定常ドメインのうちの少なくとも1つのN末端および/またはC末端に結合しており(HC融合ポリペプチド単位1、HC単位1)、
b)第2の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第2の抗原を含み、前記第2の抗原はCL−ドメインのN末端および/またはC末端に結合しており(LC融合ポリペプチド単位1、LC単位1)、
c)第3の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第3の抗原を含み、前記第3の抗原は前記第3の融合タンパク質のイムノグロブリン重鎖定常ドメインのN末端および/またはC末端に融合している、または
d)第3の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第3の抗原を含み、前記第3の抗原はCL−ドメインのN−またはC末端に融合しており、
前記3つの組換え融合タンパク質単位の前記抗原はアミノ酸配列が異なっている。
a)第1の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第1の抗原を含み、前記第1の抗原はイムノグロブリン重鎖定常ドメインのうちの少なくとも1つのN末端および/またはC末端に結合しており(HC融合ポリペプチド単位1、HC単位1)、
b)第2の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第2の抗原を含み、前記第2の抗原はCL−ドメインのN末端および/またはC末端に結合しており(LC融合ポリペプチド単位1、LC単位1)、
c)第3の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第3の抗原を含み、前記第3の抗原は前記第3の融合タンパク質のイムノグロブリン重鎖定常ドメインのN末端および/またはC末端に融合している、または
d)第3の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第3の抗原を含み、前記第3の抗原はCL−ドメインのN−またはC末端に融合しており、
前記3つの組換え融合タンパク質単位の前記抗原はアミノ酸配列が異なっている。
本開示の一部の態様は、IAタンパク質複合体に関し、
a)第1の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第1の抗原を含み、前記第1の抗原はCH1−ドメインのN末端に融合しており(HC単位1)、
b)前記第2の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第2の抗原を含み、前記第2の抗原はCL−ドメインのN末端に融合しており(LC単位1)、前記第1および前記第2の融合タンパク質単位は、特に少なくとも1つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合しており、
c)前記第3の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第3の抗原を含み、前記第3の抗原は前記第3の融合タンパク質単位のCH1−ドメインのN末端に融合しており(HC単位2)、前記HC単位1およびHC単位2は、特に少なくとも1つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合しており、
d)前記第4の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第4の抗原を含み、前記第4の抗原は前記第4のタンパク質のCL−ドメインのN末端に融合しており(LC単位2)、前記第3および第4の融合タンパク質単位は、特に少なくとも1つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合している。
a)第1の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第1の抗原を含み、前記第1の抗原はCH1−ドメインのN末端に融合しており(HC単位1)、
b)前記第2の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第2の抗原を含み、前記第2の抗原はCL−ドメインのN末端に融合しており(LC単位1)、前記第1および前記第2の融合タンパク質単位は、特に少なくとも1つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合しており、
c)前記第3の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第3の抗原を含み、前記第3の抗原は前記第3の融合タンパク質単位のCH1−ドメインのN末端に融合しており(HC単位2)、前記HC単位1およびHC単位2は、特に少なくとも1つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合しており、
d)前記第4の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第4の抗原を含み、前記第4の抗原は前記第4のタンパク質のCL−ドメインのN末端に融合しており(LC単位2)、前記第3および第4の融合タンパク質単位は、特に少なくとも1つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合している。
IAタンパク質複合体に含まれる前記組換え融合タンパク質をコードする核酸分子、前記核酸を含有するベクターおよび宿主細胞ならびにこのような融合タンパク質および/またはタンパク質複合体を調製および生成するための方法、ならびにワクチンに適切な前記複合体の使用によって誘導または作製される抗体ならびに免疫療法のためのこのような複合体および/または抗体またはそれらの組換え誘導体の使用も開示する。
したがって、さらなる態様では、本開示の実施形態はまた、本開示によるタンパク質複合体および薬学的に許容される担体および/またはアジュバントを含むワクチン組成物に関する。一部の有利な態様では、本開示はまた、アジュバントを追加しない本開示によるタンパク質複合体を含むワクチン組成物に関する。
別の態様では、本開示は、本開示によるIAタンパク質複合体に結合する様々な単離された抗体もしくはそれらの断片を含む抗体組成物または本開示によるIAタンパク質複合体における様々な組換えタンパク質に結合する様々な単離された抗体もしくはそれらの断片を含む抗体組成物を対象とする。
さらなる態様では、本開示の実施形態は、生理学的に許容される媒体中に活性成分として本開示によるタンパク質複合体および担体を含む、特にマラリアに対して、ほ乳類、特にヒトを免疫するためのワクチン組成物に関する。
さらに、本開示のIAタンパク質複合体、本開示の組換え融合タンパク質のIAタンパク質複合体を含む組成物または本開示によるワクチン組成物の有効量を投与することを含む、病原体に対して、特にプラスモディウム(plasmodium)感染に対して、特に熱帯熱マラリア原虫(plasmodium falciparum)に対して、ヒトを免疫する方法を開示する。
別の態様は、
a)本開示による宿主細胞を、前記組換え融合タンパク質を生成するために適切な条件下、適切な培養培地中で培養するステップであって、宿主細胞が本開示による単離されたIAタンパク質複合体の融合タンパク質単位をコードする全核酸分子を含み、前記IAタンパク質複合体が宿主細胞中で形成されるステップ、
b)前記IAタンパク質複合体を単離するステップ、および場合によって、
c)前記IAタンパク質複合体を処理するステップ
を含む、本開示によるIAタンパク質複合体を生成する方法に関する。
a)本開示による宿主細胞を、前記組換え融合タンパク質を生成するために適切な条件下、適切な培養培地中で培養するステップであって、宿主細胞が本開示による単離されたIAタンパク質複合体の融合タンパク質単位をコードする全核酸分子を含み、前記IAタンパク質複合体が宿主細胞中で形成されるステップ、
b)前記IAタンパク質複合体を単離するステップ、および場合によって、
c)前記IAタンパク質複合体を処理するステップ
を含む、本開示によるIAタンパク質複合体を生成する方法に関する。
別の態様は、
(a)本開示による複数の宿主細胞を、前記組換え融合タンパク質を生成するために適切な条件下、適切な培養培地中で培養するステップ、
(b)前記生成した融合タンパク質を単離するステップ、
(c)前記IAタンパク質複合体を生成するために前記融合タンパク質を混合するステップ、
(d)前記生成したIAタンパク質複合体を単離するステップ、および場合によって、
(e)IAタンパク質複合体を処理するステップ
を含む、本開示によるIAタンパク質複合体を生成する方法に関する。
(a)本開示による複数の宿主細胞を、前記組換え融合タンパク質を生成するために適切な条件下、適切な培養培地中で培養するステップ、
(b)前記生成した融合タンパク質を単離するステップ、
(c)前記IAタンパク質複合体を生成するために前記融合タンパク質を混合するステップ、
(d)前記生成したIAタンパク質複合体を単離するステップ、および場合によって、
(e)IAタンパク質複合体を処理するステップ
を含む、本開示によるIAタンパク質複合体を生成する方法に関する。
別の重要な態様は、(i)少なくとも2つの組換え融合タンパク質、(ii)少なくとも2つの異なる抗原、(iii)少なくとも1つの異なるホモオリゴマー化および/またはヘテロオリゴマー化ドメインを含み、前記第1の組換え融合タンパク質が、前記第2の組換え融合タンパク質には存在しない少なくとも1つのホモオリゴマー化またはヘテロオリゴマー化ドメインを含む、ワクチンとして適切な単離されたIAタンパク質複合体に関する。
別の重要な態様は、本開示による少なくとも2つの異なるイムノアセンブリンタンパク質複合体、すなわち、種々の異なる抗原または抗原組成物を含む異なるIAタンパク質複合体の混合物を含むワクチン組成物に関する。
本開示を詳細に記載する前に、本明細書で使用した用語は、特定の実施形態を記載することを目的とするのみであって、限定するものではないことを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用したように、単数形「a」、「an」および「the」には、文脈が明確に他のことを指示していない限り、単数および/または複数の指示対象が含まれることに注意されたい。数値によって限定されたパラメーターの範囲が与えられた場合、その範囲はこれらの限定値を含むものとみなすことをさらに理解されたい。
前述したように、本開示は、組換え融合タンパク質単位を含むワクチンとして適切な新規タンパク質複合体に関する。本開示は、特に、単離された組換えイムノアセンブリン(IA)、特に、ウイルス、細菌および/または真核寄生生物に起因する感染症、自己免疫疾患およびがんに対する、動物またはヒトワクチンとして適切な、抗体様組換え融合タンパク質複合体に関し、IAは、病原体または細胞の表面上に提示されていることが好ましいが必須ではないタンパク質から得られる複数の抗原または抗原ドメインを含む。特に、組換えポリペプチドの新規種類の複合体には、単一または2つ以上の病原体の複数の異なる抗原、および/または同じ抗原の複数のバリアント、および/または病原体から得られない少なくとも1つの成分が含まれる。
特に、本開示の実施形態は、CH1ドメインおよび軽鎖を欠如した、Fcホモ二量体として伝統的に生成された古典的なイムノアドヘシン以外の組成物中における、CH1ドメインおよび軽鎖を含むイムノアセンブリン(IA)に関する。本開示のIAは、1つの単一の分子中に異なる重鎖および軽鎖融合タンパク質を組み立てる(図10参照)、または混合物もしくはカクテル中に様々な異なる融合ポリペプチドを一緒にする(図9、図16参照)ことができる。それによって、免疫学的に適当なコアを多数の重要なワクチン候補、治療薬またはその他の薬物を曝露するための骨格として提供するだけでなく、さらに、多成分ワクチンのために報告されてきた多大な苦労を現代のタンパク質設計によって手際よく解決することができる。
さらなる利点は、組換えポリペプチドの新種の複合体のこれらの混合物およびワクチンカクテルを、同じ発現宿主、組織および/または細胞内で数種のコーディング遺伝子を同時発現することによって(図16参照)、あるいは数種の遺伝子を個々に発現させ、その後一緒にすることによって作製することである。これらの混合物および得られたワクチン製剤(カクテル)は、多数のHC融合ポリペプチド単位および多数のLC融合ポリペプチド単位を含み、単一の一般的なクロマトグラフィー法、すなわち、プロテインAクロマトグラフィーを使用して精製することができる(図16参照)。これは、本発明によるIAは新規抗原を迅速に取り込むことが可能で、それによって季節的な種の変動またはその他の出現する疾患に対して迅速な応答が容易になることを示す。
さらに、本開示によるIAタンパク質複合体は、ヒトIgG1定常領域を含むことによって免疫学的な宿主応答性の改善をもたらし、作製したコンビナトリアル分子の免疫細胞とのエフェクター機能/相互作用を増加させる。さらに、IAタンパク質複合体を生成する方法(生成系)は、容易に規模を拡大することができる対費用効果の高い生成系であり、例えば、規制機関ならびに優良医薬品製造基準に関して、可能性があるタンパク質の組合せ全てについて単一の一般的なクロマトグラフィー法(プロテインAクロマトグラフィー)の利用を可能にする。
特に、新規種類のタンパク質複合体には、単一または2つ以上の病原体の複数の異なる抗原、および/または同じ抗原の複数のバリアント、および/または病原体から得られない少なくとも1つの成分が含まれる。さらに、本開示によるIAタンパク質複合体は、いくつかの機能的単位、すなわち、少なくとも1つの抗原、ホモもしくはヘテロマー組立て物を媒介する少なくとも2つの異なるタンパク質ドメイン、および免疫系の細胞上の受容体との相互作用を可能にする少なくとも1つのタンパク質ドメインを含むことができる。本開示の実施形態は、熱帯熱マラリアのためのワクチンとして適切なIAタンパク質複合体、ヒトIgG1定常重鎖および軽鎖ドメインに遺伝子的に融合したマラリア抗原およびその融合タンパク質から構成される組換えタンパク質に関する。組換えHCおよびLC融合タンパク質を含む異なるマラリア抗原を同時発現することによって、主要な熱帯熱マラリア原虫(plasmodium falciparum)生活環段階(前赤内期、無性生殖血液段階および有性生殖段階)全てを網羅する有効な多成分および多段階マラリアワクチン候補を作製し、ヒトにおいて防御免疫応答を誘発するために使用する。
本開示では、前述したワクチンの限界のいくつかの新たな解決法を示す。例えば、抗体定常ドメインまたは遺伝子操作したそれらのバリアントは、免疫細胞上のFc受容体と相互作用することによって免疫調節効果を発揮する。さらに、その他の免疫調節特性は、例えば、サイトカインまたはインターロイキン、トール様受容体リガンドとの融合または結合によって導入することができ、したがって、本開示による分子自体がアジュバント特性を示し、提供する。
この場合、驚くべきことに、提示される抗原全てに対して応答を誘導するために、本開示によるIAタンパク質複合体が特に適していることが認められた。さらに、本開示によるIAタンパク質複合体は、生産が容易で、したがって、対費用効果の高いワクチンアプローチとなる。本開示によるIAタンパク質複合体は、多数の抗原だけでなく抗原によって提示される多数の機能性、抗体定常ドメインおよび、イムノアドヘシンのポリペプチドに融合または結合し、アジュバントとして機能する、サイトカイン、インターロイキン、トール様受容体リガンドなどのその他のエフェクター分子を含むことができる。
本開示のイムノアドヘシンは、多くの病原体、特にウイルスの表面上に見いだされるホモオリゴマーおよびヘテロオリゴマータンパク質から得られた特有の組立て物を作製するために特に適している。標的分子には、例えば、限定はしないが、HIVの外被、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン、狂犬病ウイルス糖タンパク質、デングウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスなどのフラビウイルスのE−糖タンパク質、C型肝炎ウイルス外被糖タンパク質E1およびE2、エボラウイルスGP1、2、BMFP、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)の膜融合活性を有する基本的3量体コイルドコイルタンパク質、サルモネラ(Salmonella enterica)血清型TyphimuriumのYqiCが含まれる。本開示によれば、これらの組立て物は、同じまたは異なる病原体の1つまたは複数の抗原を含むことができ、同じ抗原の多数の配列バリアントを含むことができ、さらに、例えば、アジュバント特性を備えた1つまたは複数のその他の機能性を含むことができる。さらなる抗原の例は、配列番号105から配列番号107のアミノ酸配列のいずれか1つを含むポリペプチドである。
イムノアドヘシンは、キメラタンパク質、特に、例えば、ヒトIgG1重鎖のヒンジ、CH2およびCH3領域を含有するカルボキシ(C)末端に結合した目的の任意のタンパク質様分子(抗原)から構成されるアミノ(N)末端を有する抗体様分子である(図1参照)。キメラ分子の非Ig部分は、IgGの可変領域に機能が類似していてもよく、その役割は標的認識を媒介することである。Fc部分を含めることによって、再生新生児Fc受容体(FcRn)への結合、したがってリソソームによる分解の阻止によって標的タンパク質を再利用することによって、胎盤への移行、補体の固定および血清半減期の延長のようなヒト抗体の生物学的、免疫学的および薬理学的に有利な特性が付与される(Mekhaiel et al., 2011)。さらに、エフェクター機能は、免疫系のある種の細胞、例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞および抗原提示細胞(APC)上に存在するFc受容体との相互作用の結果としてもたらされる(Perez de la Lastra et al., 2009)。さらに、技術的な観点から、Fc領域は、プロテインA/Gアフィニティークロマトグラフィーによる、簡単で対費用効果が高い、より重要なことに一般性のある精製法の利用を可能にする。1989年にいくつかのCD4−イムノグロブリンハイブリッド分子がAIDS治療薬としての可能性を意図して生産され、初めて発表されてから(Capon et al.,1989)、IgG要素は拡張が可能で望ましくないことが見いだされたので、ほとんど全てのイムノアドヘシンは、想定/所望/標的とする単一の「機能性」のためにCH1ドメインおよび軽鎖を欠如したFcホモ二量体として発現された。
利点は、組換えポリペプチドの新種の複合体の混合物は、同じ発現宿主内でコードされるいくつかの遺伝子が同時発現することによって、あるいはいくつかの遺伝子を個々に発現させ、その後一緒にすることによって作製することができることである。組換えポリペプチドまたはその成分の新種の複合体は、個々に、または混合物として精製することができる。
さらに、本開示によるIAタンパク質複合体は、ヒトIgG1定常領域を含むことによって免疫学的な宿主応答性の改善をもたらし、作製したコンビナトリアル分子の免疫細胞とのエフェクター機能/相互作用を増加させる。さらに、IAタンパク質複合体を生成する方法(生成系)は、容易に規模を拡大することができる対費用効果の高い生産系であり、例えば、規制機関ならびに優良医薬品製造基準に関して、可能性があるタンパク質の組合せ全てについて単一の一般的なクロマトグラフィー法の利用を可能にする。
本開示によるIAタンパク質複合体は、複雑な生活環および多段階および多くの可能性がある標的抗原を有する病原体のワクチンとして適切である。したがって、複数の異なる抗原、特に2つ以上の生活環を表す抗原の使用は、着実な免疫を導く。
単一のポリペプチドから構成されるワクチン候補は主に、再現性があり着実で費用効率のよい生産に対する実際的、技術的および経済的需要によって所望される。しかし、当業者には、組換え発現タンパク質には大きさの制限があることも明らかである。タンパク質に特異的な違いも同様に考慮しなければならないが、ポリペプチドの長さが増大するにつれて発現レベルおよび収率が大きく減少する。多数の課題が大きさによって比例する以上に増大し、大きなタンパク質の全体的な特性は小さいタンパク質、ドメインまたは断片の特性よりもかなり最適化されにくい。これらの問題は全て、今までアピコンプレクサ(apicomplexan)寄生生物に対する効率的なワクチンの開発の重大なボトルネックであり、多数の線形エピトープ、1つまたは2つの生活環段階の1つまたは2つの抗原のみを含む最適以下の、圧倒的な数のワクチン候補が得られてきた。代替法として、化学的または遺伝的に弱毒化し、または不活性化した生ワクチンが提案されているが(例えば照射されたスポロゾイト)、このようなアプローチは、バッチ間の一貫性、規模を拡大した生産および最も重要なこととして生成物の安全性に取り組まなければならない。
全般的に、本明細書で使用した命名法および本発明において利用した実験室手順には、分子的、生化学的、微生物学的および組換えDNAの技術が含まれる。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、“Molecular Cloning: A laboratory Manual”Sambrook et al., (1989)、“Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)、Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)、Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988)、Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York、Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)、米国特許第4666828号、第4683202号、第4801531号、第5192659号および第5272057明細書に記載された方法、“Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)、“Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique” by Freshney, Wiley-Liss, N.Y. (1994), Third Edition、“Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)、Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, Conn. (1994)、Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W.H. Freeman and Co., New York (1980)参照。利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広範に記載されており、例えば、米国特許第3791932号、第3839153号、第3850752号、第3850578号、第3853987号、第3867517号、第3879262号、第3901654号、第3935074号、第3984533号、第3996345号、第4034074号、第4098876号、第4879219号、第5011771号および第5281521号明細書、“Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984)、“Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)、“Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984)、“Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986)、“Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986)、“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal, B., (1984) and “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press、“PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)、Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996)参照。その全ては本明細書において完全に記載されるかのように参考により組み込まれる。その他の一般的な参考文献は、本文書を通じて提供される。本明細書における手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供する。本明細書に含有される情報は全て参考により本明細書に組み込まれる。
本開示によるイムノアセンブリン(IA)複合体は、少なくとも3つの異なる組換え遺伝子の発現から生じるものを含むヘテロオリゴマータンパク質複合体である。異なる組換え遺伝子は、同じ発現宿主内で発現してもよく、発現しなくてもよい。有利な実施形態では、3つ以上の異なる組換え遺伝子は、同じ発現宿主中で発現する。
本開示の別の実施形態では、3つ以上の異なる組換え遺伝子は、同じ細胞内で同時発現する。しかし、当業者であれば、技術的および生物学的限界があること、3つ以上の異なる組換え遺伝子全てがどの単一細胞でも、すなわち、宿主細胞の100%で発現することを意味するのではないこと、本開示によれば、「同じ細胞内で同時発現した」とは、3つ以上の異なる組換え遺伝子が宿主細胞の大部分、すなわち、少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも85%で発現することを意味することを理解するだろう。
当業者であれば、3つ以上の異なる組換え遺伝子を発現するための遺伝子情報は、限定はしないが、プラスミドDNA、2本鎖DNA、DNA断片、1本鎖DNA、2本鎖RNAおよび1本鎖RNAを含む様々な核酸によってコードされ得ることを知っているであろう。核酸は、センスおよびアンチセンス、1本鎖または2本鎖、環状または直鎖状の両方であってもよく、遊離、すなわち、裸であってもよく、あるいはタンパク質、ポリマー、リポソームなどによって覆われていてもよい。さらに、遺伝子情報は、ウイルス、細菌またはその他の生物によって運搬されてもよい。当業者であればまた、遺伝子情報を細胞、組織および生物(細菌、微生物、植物およびほ乳類細胞)に送達するために様々な方法があることを理解している。さらに、3つ以上の融合タンパク質単位をコードする3つ以上の異なる組換え遺伝子または遺伝情報は、物理的に結合し、例えば、同じプラスミド上でコードされていてもよいが、別個の核酸上に分離していてもよく、または結合した、および結合していない配置の組合せを使用してもよい。
3つ以上の異なる組換え遺伝子の同時発現および得られた個々のポリペプチド鎖(融合タンパク質単位)の組立て物によって、例えば、ARC25の場合に示したように(実施例参照)、別個のタンパク質複合体を導くことができるが、可変量の融合タンパク質単位を含むタンパク質複合体の混合物を導くこともできる。単一のイムノアセンブリン(IA)複合体、または2つ以上のイムノアセンブリン(IA)複合体の形成は、発現中および/またはインキュベーション中および/または抽出中および/または、さらに下流処理中および/または製剤化中に行われてもよい。1つまたは複数のイムノアセンブリン(IA)複合体は、単一の上流処理を使用して生成する、または2つ以上の別々の上流処理を使用して生成することができる。同様に、1つまたは複数のイムノアセンブリン(IA)複合体が、例えば、限定はしないが、加熱、抽出、濾過、クロマトグラフィーまたはウイルス不活性化を含む同じ下流処理ステップ中に存在してもよく、それらのステップによって処理されてもよい。有利な実施形態では、イムノアセンブリン(IA)複合体(1つまたは複数)は、同じ精製方法から得られる。
本開示は、少なくとも2つの組換え融合タンパク質単位を含む、ワクチンとして適切な単離されたイムノアセンブリン(IA)タンパク質複合体に関し、
a)第1の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第1の抗原を含み、前記第1の抗原はイムノグロブリン重鎖定常ドメインのうちの少なくとも1つのN末端および/またはC末端に結合しており(HC融合ポリペプチド単位1、HC単位1)、
b)第2の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第2の抗原を含み、前記第2の抗原はCL−ドメインのN末端および/またはC末端に結合しており(LC融合ポリペプチド単位1、LC単位1)、
c)前記第1および前記第2の抗原は異なるアミノ酸配列
を含む。
a)第1の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第1の抗原を含み、前記第1の抗原はイムノグロブリン重鎖定常ドメインのうちの少なくとも1つのN末端および/またはC末端に結合しており(HC融合ポリペプチド単位1、HC単位1)、
b)第2の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第2の抗原を含み、前記第2の抗原はCL−ドメインのN末端および/またはC末端に結合しており(LC融合ポリペプチド単位1、LC単位1)、
c)前記第1および前記第2の抗原は異なるアミノ酸配列
を含む。
特に、本開示は、少なくとも3つの組換え融合タンパク質単位を含むワクチンとして適切な単離されたイムノアセンブリン(IA)タンパク質複合体に関し、
a)第1の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第1の抗原を含み、前記第1の抗原はイムノグロブリン重鎖定常ドメインのうちの少なくとも1つのN末端および/またはC末端に結合しており(HC融合ポリペプチド単位1、HC単位1)、
b)第2の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第2の抗原を含み、前記第2の抗原はCL−ドメインのN末端および/またはC末端に連結しており(LC融合ポリペプチド単位1、LC単位1)、
c)第3の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第3の抗原を含み、前記第3の抗原は前記第3の融合タンパク質のイムノグロブリン重鎖定常ドメインのN末端および/またはC末端に融合している、または
d)第3の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第3の抗原を含み、前記第3の抗原はCL−ドメインのN−またはC末端に融合しており、
e)前記3つの組換え融合タンパク質単位の前記抗原はアミノ酸配列が異なっている。
a)第1の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第1の抗原を含み、前記第1の抗原はイムノグロブリン重鎖定常ドメインのうちの少なくとも1つのN末端および/またはC末端に結合しており(HC融合ポリペプチド単位1、HC単位1)、
b)第2の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第2の抗原を含み、前記第2の抗原はCL−ドメインのN末端および/またはC末端に連結しており(LC融合ポリペプチド単位1、LC単位1)、
c)第3の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第3の抗原を含み、前記第3の抗原は前記第3の融合タンパク質のイムノグロブリン重鎖定常ドメインのN末端および/またはC末端に融合している、または
d)第3の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第3の抗原を含み、前記第3の抗原はCL−ドメインのN−またはC末端に融合しており、
e)前記3つの組換え融合タンパク質単位の前記抗原はアミノ酸配列が異なっている。
さらに有利な実施形態では、本開示による単離されたタンパク質複合体は、第3の組換え融合タンパク質単位としてイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第3の抗原を含み、前記第3の抗原は前記第3の融合タンパク質のイムノグロブリン重鎖定常ドメインのN末端および/またはC末端に融合している(HC単位2)。
さらに有利な実施形態では、本開示による単離されたタンパク質複合体は、イムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよびさらなる抗原を含む第4の組換え融合タンパク質単位を含み、前記さらなる抗原はCLドメインのN末端またはC末端に融合しており(LC単位2)、LC単位は好ましくは異なるアミノ酸配列を含む。
本開示によれば、第1の融合タンパク質単位(HC単位1)および第2の融合タンパク質単位(LC単位1)は互いに結合していてもよい。さらに、第1の融合タンパク質単位(HC単位1)および前記第3の融合タンパク質単位(HC単位2)は互いに結合していてもよい。さらに、第3の融合タンパク質単位(HC単位2)および第4の融合タンパク質単位(LC単位2)は互いに結合していてもよい。
本開示の一部のさらなる実施形態では、融合タンパク質単位は本開示のタンパク質複合体中で互いに共有結合または非共有結合することができる。本開示によれば、「共有結合した」という用語は、原子間の電子対の共有が関与する共有結合を含む。これらの電子対は、共有対または結合対として知られており、それらが電子を共有するとき、原子間の引力および反発力の安定したバランスが共有結合として知られている。「非共有結合した」という用語は、電子の共有は関与しないが、分子間または分子内の電磁気的相互作用のより分散した変動が関与する、共有結合とは異なる非共有結合的相互作用を含む。本開示の一部の有利な実施形態では、融合タンパク質はジスルフィド結合によって互いに共有結合している。
したがって、本開示では、「結合した」という用語は、2つ以上の分子間の非共有および共有結合を含む。結合は直接的であっても間接的であってもよい。2つの分子がヒンジ領域のような連結分子(リンカー)を介して結合しているとき、2つの分子は間接的に結合している。2つの分子を結合する介在分子がないとき、2つの分子は直接結合している。本開示によるIAタンパク質複合体に含まれる融合タンパク質単位は、互いに共有結合または非共有結合していてもよい。一部の有利な実施形態では、本開示によるIAタンパク質複合体に含まれる融合タンパク質単位は、ジスルフィド結合によって互いに共有結合していてもよい。
本開示による「タンパク質複合体」は、2つ以上のポリペプチドを含む組成物である。本開示の有利な実施形態では、「タンパク質複合体」という用語は、2つ以上の関連したポリペプチド鎖の群を対象とする。異なるポリペプチド鎖は異なる機能を有していてもよい。タンパク質複合体は、4次構造の形態であってもよい。タンパク質複合体中のタンパク質は、共有結合的および/または非共有結合的タンパク質−タンパク質相互作用によって結合していてもよく、異なるタンパク質複合体は経時的に安定性の程度が異なっていてもよい。本開示の有利な実施形態では、タンパク質複合体は抗体様タンパク質複合体である。
典型的な抗体は、4つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって内部連結した2つの重(H)鎖(完全長のとき約50〜70kDa)および2つの軽(L)鎖(完全長のとき約25kDa)から構成されるイムノグロブリン分子である。軽鎖は、カッパおよびラムダに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンに分類され、抗体アイソタイプをそれぞれIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEと定義する。
各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではVHと略す)および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、IgG、IgDおよびIgAでは3つのドメイン(CH1、CH2およびCH3)から構成され、IgMおよびIgEでは4つのドメイン(CH1、CH2、CH3およびCH4)から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではVLと略す)および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、1ドメイン、CLから構成される。VHおよびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と称する、より保存された領域が組み入れられた相補性決定領域(CDR)と称する超可変の領域にさらに分割される。各VHおよびVLは、アミノ末端からカルボキシ末端まで、以下の順番:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置された3個のCDRおよび4個のFRから構成される。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、周知のやり方に従う(Chothia and Lesk 1987; Chothia et al. n.d.; Kabat et al. 1992)。抗体が特定の抗原に結合する機能的能力は、概ねCDRによって決定される。
一部の有利な実施形態では、本開示のイムノアセンブリン(IA)タンパク質複合体は、少なくとも2つの重鎖定常領域CH1およびCH3、特に3つの重鎖定常領域CH1、CH2およびCH3ならびにイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLを含む抗体様タンパク質複合体であり、抗原は重鎖定常領域に結合/融合し、別の抗原はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインに結合/融合している。
しかし、有利な実施形態では、本開示によるワクチンとして適切なイムノアセンブリン(IA)タンパク質複合体は、抗体様タンパク質複合体であるが、抗体のVHおよび/またはVL領域は含まない。
一部の有利な実施形態では、IAタンパク質複合体は単離されたタンパク質複合体である。「単離された」という用語は、タンパク質複合体、タンパク質または核酸に関連して使用された場合、天然材料において通常関連している少なくとも1つの混入物(それぞれ、核酸またはタンパク質)から同定し、分離した核酸配列、タンパク質またはタンパク質複合体を意味する。単離した核酸またはタンパク質は、天然において見いだされるものとは異なる形態または状況で存在する。対照的に、単離していない核酸またはタンパク質は、天然に存在する状態で見いだされる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」または「タンパク質」という用語は、隣接する残基のアルファアミノ基とカルボキシル基の間のペプチド結合によって一方が他方に連結した線状のアミノ酸残基を示すために、本明細書では同義に使用される。アミノ酸残基は、好ましくは天然の「L」型異性体である。しかし、所望する機能的特性がポリペプチドに保持されている限り、「D」型異性体の残基を任意のL−アミノ酸残基と置換することができる。さらに、アミノ酸には、20個の「標準的」アミノ酸に加えて、修飾された稀なアミノ酸が含まれる。
一部の有利な実施形態では、本開示による単離されたIAタンパク質複合体は、ワクチンとして、特にヒトおよび/または動物ワクチンとして適切である。「ワクチン」は、例えば、対象に投与したとき、免疫応答を誘導する物質分子の組成物である。ワクチンは、ポリヌクレオチド分子、ポリペプチド分子および炭水化物分子ならびに糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、2つ以上のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの融合物などのそれぞれの誘導体および組合せ物を含むことができる。
一部のさらなる実施形態では、ワクチンとして適切な単離されたIAタンパク質複合体は少なくとも2つの組換えタンパク質を含む。「組換えタンパク質」という語句には、タンパク質、特に、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現したタンパク質などの組換え手段によって調製、発現、生成または単離された組換え融合タンパク質が含まれる。
一部の有利な実施形態では、ワクチンとして適切な単離されたIAタンパク質複合体は少なくとも2つの組換えタンパク質を含む。「組換え融合タンパク質」という用語は特に、異なるタンパク質、異なるタンパク質ドメインまたは異なる生物などの異種原料由来のセグメント、すなわち、アミノ酸配列を含む、組換え技術によって生成したタンパク質を意味する。セグメントは、互いにペプチド結合を介して直接的または間接的に結合している。間接的結合とは、ペプチドリンカーなどの介在性アミノ酸配列がセグメント間に並置されて融合タンパク質を形成することを意味する。組換え融合タンパク質は、1つの遺伝子の異なる領域から得られたヌクレオチド配列を遺伝子的に結合することによって、および/または2つ以上の別々の遺伝子から得られたヌクレオチド配列を結合することによって得られるヌクレオチド配列によってコードされる。これらのヌクレオチド配列は、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)から得ることができるが、その他の生物、クローニング手順のために使用したプラスミド、またはその他のヌクレオチド配列からも得ることができる。
さらに、コーディングヌクレオチド配列は、最初に鋳型DNA試料を必要とすることなく、例えば、デジタル遺伝子配列からのオリゴヌクレオチド合成およびその後の得られた断片のアニーリングによって、インビトロにおいて合成することができる。所望するタンパク質配列は、例えば、適当なソフトウェアツールを使用して、「逆翻訳」することができる。汎用遺伝暗号の縮重のために、オープンリーディングフレーム(すなわち、組換えタンパク質コーディング領域)内の同義のコドンは、例えば、シス作用性不安定要素(例えば、AUUUA)を除去し、二次および三次mRNA構造(例えば、シュードノット、ステム−ループなど)を除去、導入または修飾し、転写後遺伝子サイレンシング(PGTS)を誘発し得る自己相補性領域を回避し、全体的なAT:GC含量を変化させ、または発現宿主にコドン使用を適応させるために、様々な方法で交換することができる。このような変化は手作業で、または適当なソフトウェアツールを使用して、または組合せによって設計することができる。
組換え融合タンパク質は、当技術分野で公知のように、適切な宿主細胞において組換えDNA法および発現を使用して調製された組換え生成物であってもよい(例えば、Sambrook et al., (2001) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y参照)。特定の単離されたタンパク質ドメインをコードするヌクレオチド配列は、例えば、単離に必要なドメインの5’および3’領域に対応する適当なオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに鋳型として単離されたタンパク質ドメイン配列の完全長コーディングを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、都合よく調製することができる。完全長コーディングタンパク質配列の供給源は、例えば、感染因子/病原体/病原体細胞またはクローニングされた完全長遺伝子を含有するプラスミドベクターから抽出されたDNAであってもよい。あるいは、タンパク質コード配列は、インビトロにおいて部分的に、もしくは完全に合成する、または様々なアプローチの組合せを使用することができる。
本開示によるイムノアセンブリン/タンパク質複合体の場合では、融合タンパク質単位のそれぞれは抗原を含んでいてもよい。本明細書では、「抗原」および「免疫原」という用語は同義に使用される。しかし、本開示によれば、抗原および免疫源はいずれも、生物の免疫系による免疫応答を誘発することができる分子を意味する。本開示を通じて、抗原という用語は、免疫応答の生成物−抗体に結合する分子を直接的に意味するので、使用される。IAタンパク質複合体中の抗原は、免疫応答を誘導することができる抗原である。適切な抗原は、例えば、固有の領域対関連のない領域の居住者から得られたヒト血液試料を、文献で公知の有望なタンパク質を生成する組換え体に対する反応性をスクリーニングして分析することによって同定することができる。本開示による抗原には、病原体のプロテオームの一部である、それらのバリアント、変異体、断片を含む任意の成分が含まれ、特に、抗原は病原体の表面タンパク質または表面構造から得られる。「抗原」という用語には、例えば、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、トール様受容体、ペプチドおよび抗体可変ドメインを含めることができる。
例えば、本開示による抗原は、腫瘍抗原、自己抗原、食物アレルゲン、チクングニアウイルス、狂犬病ウイルス、連鎖球菌(Streptococcus)、ナイセリア(Neisseria)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、クロストリジウム(Clostridiu)、トリパノソーマ(Trypanosoma)、リーシュマニア(Leishmania)、サルモネラ(Salmonella)、フラビウイルス(Flavivirus)、フィロウイルス(Filiovirus)の群から選択される病原体から得られる抗原および/またはマラリア、トキソプラズマ症のようなアピコンプレクサ(Apicomplexan)寄生生物から生じる感染性疾患、および/またはエボラ、HIV、HPV、肝炎、結核、ジカ熱、インフルエンザまたは百日咳のようなウイルス感染に関与する1つまたは複数の病原体から得られる、および/またはがんを生じる悪性腫瘍を引き起こす疾患から得られる抗原である。例えば、「熱帯熱マラリア原虫(plasmodium falciparum)表面タンパク質から得られる抗原」には、完全長熱帯熱マラリア原虫(plasmodium falciparum)表面タンパク質、または特に、特定のドメインもしくはその他の部分のような完全長タンパク質の一部のみのアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。
前述したように、本開示によるIAタンパク質複合体の異なる融合タンパク質に含まれる抗原は、異なるアミノ酸配列を含み、すなわち、前記組換え融合タンパク質単位の前記抗原はアミノ酸配列が異なっている。特に、HC融合ポリペプチド中のイムノグロブリン重鎖定常ドメインのうちの少なくとも1つのN末端および/またはC末端に融合/結合している第1の抗原は、LC融合ポリペプチド中のCL−ドメインのN末端および/またはC末端に結合している第2の抗原とはアミノ酸配列が異なっている。したがって、IAの融合タンパク質単位に含まれる抗原は、異なるアミノ酸配列を含む異なる抗原である。
一部の有利な実施形態では、前記抗原のタンパク質配列は、99%以下、好ましくは98%以下、より好ましくは95%以下、さらにより好ましくは90%以下、さらにより好ましくは80%以下、最も好ましくは70%以下の配列同一性を有する。
アミノ酸またはポリヌクレオチド配列に関して、「パーセント配列同一性」とは、配列を最適に整列させたとき、2つの配列において同一である残基の比率を意味する。したがって、80%アミノ酸配列同一性とは、最適に整列させた2つのポリペプチド配列においてアミノ酸の80%が同一であることを意味する。パーセント同一性は、例えば、配列を整列させ、2つの整列した配列の間の一致の正確な数を計数し、短い方の配列の長さによって除し、その結果に100を乗じることによって、2分子間の配列情報を直接比較して決定することができる。ペプチド分析のためのSmith and Waterman (1981) Advances in Appl. Math. 2:482-489の局所相同性アルゴリズムに適応した、ALIGN, Dayhoff, M.O.の"Atlas of Protein Sequence and Structure", M.O. Dayhoff et., Suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DCなどの容易に利用可能なコンピュータプログラムを分析のために使用することができる。ヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラムは、同様にSmithおよびWatermanアルゴリズムに基づくウィスコンシン配列解析パッケージ、バージョン8(Genetics Computer Group、Madison、WIから利用可能)における、例えば、BESTFIT、FASTAおよびGAPプログラムを利用することができる。これらのプログラムは、製造者によって推奨され、上記のウィスコンシン配列解析パッケージに記載された初期パラメーター5を用いて容易に利用される。配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの一例は、Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されたBLASTアルゴリズムである。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通じて公的に入手可能である。
一部の有利な実施形態では、本開示によるタンパク質複合体は、異なる株、単離株、対立遺伝子バリアント、変異体および/または一塩基多型を表す同じ抗原の2つ以上のバリアントを含む。非常に特異的なワクチンを開発するための標的抗原のほとんどが、特にB細胞およびT細胞エピトープに位置することが多い多型を示すという事実は厄介である(Proietti and Doolan, 2014)。これらの天然のバリアントは、対立遺伝子多型(例えば、MSP1:観察された対立遺伝子は全て、MAD20およびWellcomeハプロタイプのような2種の対立遺伝子に明確に分けられる)、抗原多型(古典的な突然変異/組換え事象によって生じる抗原をコードする遺伝子の多数の遺伝子的に安定な別の形態)、または抗原変動を導く同じクローンの寄生生物系列による抗原の別の形態、例えば、PfEMP−1およびrifins(Roy et al., 2008)の時系列発現によって生じ得る。第2世代ワクチンは主要な生活環段階の多数の重要な抗原を含まなければならないだけでなく、天然株を超える獲得免疫を模倣した望ましい種を実現しなければならず、次世代RTS,Sは、当分野の別の循環株全てに対して確実に有効であるために、抗原または対立遺伝子標的バリアントに対しても効果的でなければならないことは疑う余地がない(Moorthy and Kieny, 2010)。最近、抗原多様性および対立遺伝子特異性を克服するという試みによって、(108個の免疫原−寄生生物の組合せ全てを試験することによって)4つまたは5つの異なるAMA1対立遺伝子を組み合わせた非常に多型のワクチン候補AMA1が、天然に認められる多型の大部分を網羅し、インビトロにおいて株特異的な障害を克服するために十分であることが示された(Proietti, C. and D. L. Doolan (2014). "The case for a rational genome-based vaccine against malaria." Front Microbiol 5: 741, Roy, S. W.et al., (2008). "Evolution of allelic dimorphism in malarial surface antigens." Heredity (Edinb) 100(2): 103-110, Moorthy, V. S. and M. P. Kieny (2010). "Reducing empiricism in malaria vaccine design." Lancet Infect Dis 10(3): 204-211, Miura, K. et al., (2013). "Overcoming allelic specificity by immunization with five allelic forms of plasmodium falciparum apical membrane antigen 1." Infect Immun 81(5): 1491-1501参照)。
さらに、一部の実施形態では、本開示によるタンパク質複合体は2つの異なる病原体から得られた抗原を含む。
好ましくは、本開示によるタンパク質複合体に含まれる抗原は、アピコンプレクサ(Apicomplexan)寄生生物から得られた抗原である。アピコンプレクサ(Apicomplexa)(Apicomplexiaとも称する)は、原生動物の大きな群で、そのほとんどはアピコプラストと呼ばれる特有の細胞器官および宿主細胞の貫通に関与する頂端複合体構造を有する。これらは、コクシジウム(coccidia)、グレガリナ(gregarine)、ピロプラズマ(piroplasm)、ヘモグレガリナ(haemogregarine)およびマラリア原虫(plasmodia)(熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、卵形マラリア原虫(Plasmodium ovale)、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)、二日熱マラリア原虫(Plasmodium knowlesi))などの生物を含む多様な群である。アピコンプレクサ(Apicomplexan)生物によって引き起こされる疾患には、限定はしないが、バベシア症(バベシア(Babesia))、マラリア(プラスモディウム(Plasmodium))、クリプトスポリジウム症(クリプトスポリジウム・パルバム(Cryptosporidium parvum))を含むコクシジウム病、シクロスポラ症(シクロスポラ・カイエタネンシス(Cyclospora cayetanensis))、イソスポーラ症((戦争イソスポーラ(Isospora belli))およびトキソプラズマ症(トキソプラズマ原虫(Toxoplasma gondii))が含まれる。例えば、本開示によるタンパク質複合体に含まれる抗原には、アピコンプレクサ(Apicomplexa)門の寄生生物の表面上に提示される細胞表面構造から得られた抗原が含まれる。
アピコンプレクサ(Apicomplexa)表面構造および/または表面タンパク質は、好ましくは膜結合もしくは膜関連タンパク質または分泌することが知られているタンパク質である。これらのタンパク質は、例えば、一般的に利用可能なソフトウェアツールを使用して、N末端シグナルペプチドの存在、PEXELモチーフの存在、GPIアンカーモチーフの存在あるいは1つまたは複数の膜貫通ドメインの存在についてゲノムまたは公知の遺伝子を分析することによって同定することができる。これらのタンパク質およびそれらの相同体には、例えば、限定はしないが以下が含まれる:
− CelTOS(オーキネートおよびスポロゾイトの細胞横断タンパク質)、抗原2(PfAg2、PvAg2、PoAg2など)
− CSP(スポロゾイト周囲タンパク質)
− EBA175(赤血球結合抗原175)
− EXP1(輸送タンパク質1);別称:CRA1(スポロゾイト周囲関連抗原−1/交差反応抗原−1)、AG5.1(輸送された抗原5.1)、QF119
− MSP1(メロゾイト表面タンパク質1);別称:MSA1(メロゾイト表面抗原1)、PMMSA、p190、p195、gp190、gp195
− MSP2(メロゾイト表面タンパク質2);
− MSP3(メロゾイト表面タンパク質3);別称:SPAM(メロゾイトに関連した分泌型多型抗原)
− MSP4(メロゾイト表面タンパク質4)
− MSP5(メロゾイト表面タンパク質5)
− MSP7(メロゾイト表面タンパク質7)
− MSP8(メロゾイト表面タンパク質8)
− MSP9(メロゾイト表面タンパク質9)
− MSP10(メロゾイト表面タンパク質10)
− MTRAP(メロゾイトTRAP相同体、メロゾイトTRAP相同体、メロゾイトTRAP様タンパク質)
− Pf38;別称:6−システインタンパク質
− Rh2a(網状赤血球結合タンパク質2相同体a)
− Rh2b(網状赤血球結合タンパク質2相同体b)
− Rh4(網状赤血球結合タンパク質相同体4)
− Rh5(網状赤血球結合タンパク質相同体5)
− Ripr、PfRipr(Rh5相互作用タンパク質)
− Ron2(ロプトリー頸部タンパク質2)
− Ron4(ロプトリー頸部タンパク質4)
− Ron5(ロプトリー頸部タンパク質5)
− Ron6(ロプトリー頸部タンパク質6)
− TRAMP(トロンボスポンジン関連頂端膜タンパク質);別称:PTRAMP
− TRAP(トロンボスポンジン関連匿名タンパク質);別称:SSP2(スポロゾイト表面タンパク質2)
− AMA1(頂端膜抗原1)
− GLURP(グルタミン豊富なタンパク質)
− RhopH2(高分子量ロプトリータンパク質2)
− RhopH3(高分子量ロプトリータンパク質3)
− CelTOS(オーキネートおよびスポロゾイトの細胞横断タンパク質)、抗原2(PfAg2、PvAg2、PoAg2など)
− CSP(スポロゾイト周囲タンパク質)
− EBA175(赤血球結合抗原175)
− EXP1(輸送タンパク質1);別称:CRA1(スポロゾイト周囲関連抗原−1/交差反応抗原−1)、AG5.1(輸送された抗原5.1)、QF119
− MSP1(メロゾイト表面タンパク質1);別称:MSA1(メロゾイト表面抗原1)、PMMSA、p190、p195、gp190、gp195
− MSP2(メロゾイト表面タンパク質2);
− MSP3(メロゾイト表面タンパク質3);別称:SPAM(メロゾイトに関連した分泌型多型抗原)
− MSP4(メロゾイト表面タンパク質4)
− MSP5(メロゾイト表面タンパク質5)
− MSP7(メロゾイト表面タンパク質7)
− MSP8(メロゾイト表面タンパク質8)
− MSP9(メロゾイト表面タンパク質9)
− MSP10(メロゾイト表面タンパク質10)
− MTRAP(メロゾイトTRAP相同体、メロゾイトTRAP相同体、メロゾイトTRAP様タンパク質)
− Pf38;別称:6−システインタンパク質
− Rh2a(網状赤血球結合タンパク質2相同体a)
− Rh2b(網状赤血球結合タンパク質2相同体b)
− Rh4(網状赤血球結合タンパク質相同体4)
− Rh5(網状赤血球結合タンパク質相同体5)
− Ripr、PfRipr(Rh5相互作用タンパク質)
− Ron2(ロプトリー頸部タンパク質2)
− Ron4(ロプトリー頸部タンパク質4)
− Ron5(ロプトリー頸部タンパク質5)
− Ron6(ロプトリー頸部タンパク質6)
− TRAMP(トロンボスポンジン関連頂端膜タンパク質);別称:PTRAMP
− TRAP(トロンボスポンジン関連匿名タンパク質);別称:SSP2(スポロゾイト表面タンパク質2)
− AMA1(頂端膜抗原1)
− GLURP(グルタミン豊富なタンパク質)
− RhopH2(高分子量ロプトリータンパク質2)
− RhopH3(高分子量ロプトリータンパク質3)
ヒトにおけるマラリア疾患は、例えば、5種のプラスモジウム属(Plasmodium)寄生生物:熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)、三日熱マラリア原虫(P. vivax)、卵形マラリア原虫(P. ovale)、四日熱マラリア原虫(P. malariae)および二日熱マラリア原虫(P. knowlesi)によって引き起こされ、最も蔓延しているのは熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)および三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax))である。熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)によって引き起こされるマラリア(悪性マラリア、熱帯熱マラリアまたは熱帯性マラリアとも呼ばれる)は最も危険な形態のマラリアであり、合併症の割合および死亡率が最高である。ほとんど全てのマラリアによる死亡は熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)によって引き起こされる。
したがって、一部の有利な実施形態では、本開示によるIAタンパク質複合体に含まれる抗原は、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)、三日熱マラリア原虫(P. vivax)、卵形マラリア原虫(P. ovale)、二日熱マラリア原虫(P. knowlesi)および四日熱マラリア原虫(P. malariae)からなる群から選択される少なくとも1つのプラスモジウム(Plasmodium)寄生生物から得られた抗原である。特に、本開示によるタンパク質複合体に含まれる抗原は、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)から得られた抗原である。一部の実施形態では、本開示によるタンパク質複合体に含まれる抗原は、配列番号1から31からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれらからなる抗原である。
さらに、本開示によるタンパク質複合体および組成物は、病原体、特に、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)および/または卵形マラリア原虫(Plasmodium ovale)を含むプラスモディウム(Plasmodium)属の寄生生物に対するヒトおよび/または動物ワクチンとして適切である。有利な実施形態では、寄生生物は熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)である。
熱帯熱マラリア原虫(plasmodium falciparum)に対するヒトワクチンとして適切な、特に、本開示によるタンパク質複合体の融合タンパク質を含む、またはそれらからなる有利な抗原を以下の表1に挙げる。
簡単に説明すると、ヒトにおけるマラリア原虫の生活環(図2)は、ハマダラカ属(Anopheles)の蚊が刺して数個のスポロゾイトが播種されることによって開始する。数分内にスポロゾイトは肝細胞に侵入して発達を開始し、シゾゴニーによって増殖する(肝臓段階または前赤内期段階)。マラリア原虫の種に応じて5〜14日の期間の後、シゾントは何千ものメロゾイトに発達し、これが血流中に放出され、赤血球(RBC)に侵入し、血液段階を開始する。RBC中で、各メロゾイトがトロホゾイトに発達し、マラリア原虫の種に応じて42〜72時間以内に成熟、分裂し、シゾントが生じ、これが十分に成熟した後、最大32個のメロゾイトを生じさせる。血流中に放出されたメロゾイトはその他のRBCに侵入し、その生活環を維持することとなる。いくつかのメロゾイトはRBCに侵入した後、有性型の雄または雌のガメトサイトに発達し、これも成熟および赤血球破裂後に血流に入る。雌のハマダラカ属(Anopheles)の蚊が吸血し、ガメトサイトを摂取すると、感染することとなり、プラスモジウム属(Plasmodium)生活環の有性生殖段階を開始する。蚊の腸では、雄ガメトサイトは雌ガメトサイトと融合してオーキネートを形成し、それが腸壁と結合して通過し、その外面に付着したままオーシストに変換する。オーシストはスポロゴニーによって分裂し、数千ものスポロゾイトを生じ、それらが蚊の体腔中に放出され、最終的にその唾液腺に移動し、ここでスポロゾイトは成熟し、蚊が吸血のために宿主を刺すときにヒトにおいて新規感染を開始できるようになる。
一部の実施形態では、本開示によるタンパク質複合体に含まれる抗原は、寄生生物の表面上に提示される少なくとも2つの異なるタンパク質から得られる抗原である。特に、抗原は、前記寄生生物の少なくとも2つの異なる生活環主要段階において前記寄生生物の表面上に提示される少なくとも2つの異なるタンパク質から得られる。
一部の有利な実施形態では、本開示によるタンパク質複合体は細胞表面構造から得られた抗原を含み、この細胞表面構造は前赤内期段階、有性生殖段階および/または血液段階のようなアピコンプレクサ(Apicomplexa)生活環段階の少なくとも1つの主要段階において、寄生生物の表面上に提示される。好ましくは、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)表面タンパク質は、赤内期段階および/または血液段階において寄生生物の表面上に提示される。
前赤内期主要段階:
a)スポロゾイト
スポロゾイトは、肝細胞に侵入する前の非常に短い期間血流中に存続する。スポロゾイト中に発現したプラスモジウム(Plasmodium)タンパク質抗原の例は、スポロゾイトの外膜の主要な構成物であるスポロゾイト周囲タンパク質(CSP)である(Nussenzweig and Nussenzweig., 1989)。誘導された抗体は、肝細胞へのスポロゾイトの結合および進入をブロックすることができる。
a)スポロゾイト
スポロゾイトは、肝細胞に侵入する前の非常に短い期間血流中に存続する。スポロゾイト中に発現したプラスモジウム(Plasmodium)タンパク質抗原の例は、スポロゾイトの外膜の主要な構成物であるスポロゾイト周囲タンパク質(CSP)である(Nussenzweig and Nussenzweig., 1989)。誘導された抗体は、肝細胞へのスポロゾイトの結合および進入をブロックすることができる。
b)肝臓段階
この段階中、免疫はほとんど、CD8+T細胞、CD4+T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞およびγδT細胞が関与する細胞依存性機構によって媒介される。CSPは、スポロゾイト中および肝臓段階中の両方で発現する。したがって、CSPに関する研究の多くは、体液性応答を誘導する免疫優性反復から細胞傷害性T細胞応答を誘導できる領域に転換した。その他の同定された肝臓段階抗原には、特に、肝臓段階抗原1(LSA−1)、LSA−2、LSA−3、SALSAおよびSTARPが含まれる(Garcia, Puentes et al. 2006)。
この段階中、免疫はほとんど、CD8+T細胞、CD4+T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞およびγδT細胞が関与する細胞依存性機構によって媒介される。CSPは、スポロゾイト中および肝臓段階中の両方で発現する。したがって、CSPに関する研究の多くは、体液性応答を誘導する免疫優性反復から細胞傷害性T細胞応答を誘導できる領域に転換した。その他の同定された肝臓段階抗原には、特に、肝臓段階抗原1(LSA−1)、LSA−2、LSA−3、SALSAおよびSTARPが含まれる(Garcia, Puentes et al. 2006)。
無性生殖血液主要段階:
c)メロゾイト
スポロゾイトの他に、メロゾイトはマラリア寄生生物が細胞外にあるヒト宿主における唯一の段階である。スポロゾイトとは対照的に、数回のメロゾイト放出がマラリア感染中に起こり、それらを利用できることが多い。熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)における主要なリガンドは、ミクロネームに位置する赤血球結合抗原−175(EBA−175)である(Sim, Toyoshima et al. 1992)。数個のメロゾイト表面タンパク質(MSP)が同定されたことがあるが、それらのほとんどにおいてその機能はまださらなる解明が待たれる。MSP−1と称する主要なMSPの場合、役割はRBCへのメロゾイト結合および侵入に関与するその後の生化学的機構にあるとみなされたことがある。このタンパク質は、後期シゾント段階における185〜210kDaの前駆体として合成され、プロセシングされて分子量が異なる数種のポリペプチドを生じる。42kDaのポリペプチド(MSP1−42)は、メロゾイト膜に付着し続け、さらにプロセシングされて19kDaのポリペプチド(MSP1−19)を生じ、これが宿主細胞中に入る。MSP−1の他に、少なくとも8つのその他のMSP:MSP−2、MSP−3、MSP−4、MSP−5、MSP−6、MSP−7、MSP−8およびMSP−10が熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)において記載された。別のメロゾイト表面関連抗原は酸性−塩基性反復抗原(ABRA)である。メロゾイト頂端細胞内小器官に位置するタンパク質も同定された(例えば、ロプトリータンパク質頂端膜抗原−1(AMA−1)、ロプトリー関連タンパク質−1(RAP−1)およびRAP−2)。
c)メロゾイト
スポロゾイトの他に、メロゾイトはマラリア寄生生物が細胞外にあるヒト宿主における唯一の段階である。スポロゾイトとは対照的に、数回のメロゾイト放出がマラリア感染中に起こり、それらを利用できることが多い。熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)における主要なリガンドは、ミクロネームに位置する赤血球結合抗原−175(EBA−175)である(Sim, Toyoshima et al. 1992)。数個のメロゾイト表面タンパク質(MSP)が同定されたことがあるが、それらのほとんどにおいてその機能はまださらなる解明が待たれる。MSP−1と称する主要なMSPの場合、役割はRBCへのメロゾイト結合および侵入に関与するその後の生化学的機構にあるとみなされたことがある。このタンパク質は、後期シゾント段階における185〜210kDaの前駆体として合成され、プロセシングされて分子量が異なる数種のポリペプチドを生じる。42kDaのポリペプチド(MSP1−42)は、メロゾイト膜に付着し続け、さらにプロセシングされて19kDaのポリペプチド(MSP1−19)を生じ、これが宿主細胞中に入る。MSP−1の他に、少なくとも8つのその他のMSP:MSP−2、MSP−3、MSP−4、MSP−5、MSP−6、MSP−7、MSP−8およびMSP−10が熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)において記載された。別のメロゾイト表面関連抗原は酸性−塩基性反復抗原(ABRA)である。メロゾイト頂端細胞内小器官に位置するタンパク質も同定された(例えば、ロプトリータンパク質頂端膜抗原−1(AMA−1)、ロプトリー関連タンパク質−1(RAP−1)およびRAP−2)。
d)感染したRBC
一旦RBCに侵入すると、寄生生物は留まるのに安全な場所を見いだしたと考えられる。最も研究された分子の1つは、リング赤血球表面抗原(RESA)である。さらに、セリンが豊富なタンパク質(SERPまたはSERA)はシゾント段階で発現し、寄生体胞中に分泌される可溶性タンパク質である。RBC膜に位置するその他のタンパク質は、赤血球膜タンパク質−1(EMP−1)、EMP−2およびEMP−3である。内皮においてCD36などの受容体に結合するPfEMP−1は、いわゆるvar遺伝子によってコードされるタンパク質のファミリーである。
一旦RBCに侵入すると、寄生生物は留まるのに安全な場所を見いだしたと考えられる。最も研究された分子の1つは、リング赤血球表面抗原(RESA)である。さらに、セリンが豊富なタンパク質(SERPまたはSERA)はシゾント段階で発現し、寄生体胞中に分泌される可溶性タンパク質である。RBC膜に位置するその他のタンパク質は、赤血球膜タンパク質−1(EMP−1)、EMP−2およびEMP−3である。内皮においてCD36などの受容体に結合するPfEMP−1は、いわゆるvar遺伝子によってコードされるタンパク質のファミリーである。
一部の実施形態では、成分Aはアピコンプレクサ(Apicomplexa)門の寄生生物の表面上に提示される細胞表面構造または寄生された宿主細胞上に提示される寄生生物抗原のいずれかに対して結合活性を有する。
有性生殖主要段階:
e)胞子形成サイクル
Ps25、Ps28、Ps48/45またはPs230などのその他のプラスモディウム(Plasmodium)タンパク質抗原は、有性に分化した寄生生物段階で発現する。これらの有性生殖段階タンパク質に対する抗体は、蚊における寄生生物の発達をブロックすることができる。
e)胞子形成サイクル
Ps25、Ps28、Ps48/45またはPs230などのその他のプラスモディウム(Plasmodium)タンパク質抗原は、有性に分化した寄生生物段階で発現する。これらの有性生殖段階タンパク質に対する抗体は、蚊における寄生生物の発達をブロックすることができる。
有利な実施形態では、熱安定性断片のそれぞれは、プラスモディウム(Plasmodium)生活環の少なくとも2つの異なる段階で発現した異なるプラスモディウム(Plasmodium)表面タンパク質由来である。
有利な実施形態では、熱安定性断片は、MSP1、MSP4、MSP8、MSP10、PfRiprおよびPfs25のEGF様ドメインを含む熱安定性断片からなる群から選択する。
さらに有利な実施形態では、熱安定性断片は、CSP、MTRAP、TRAPおよびTRAMPから選択されるTSRドメインを含む熱安定性断片からなる群から選択される。
その他の有利な実施形態では、熱安定性断片は、Pfs230、Pfs45/48、CelTosおよびRon2、MSP119およびEXP1の熱安定性断片からなる群から選択される。
前述したように、一部の有利な実施形態では、抗原は寄生生物、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)から得られ、抗原は前赤内期主要段階および血液主要段階において寄生生物の表面上に提示される細胞表面タンパク質から得られる。
別の有利な実施形態では、抗原は、寄生生物の表面上に提示される少なくとも3つの異なるタンパク質から得られる。特に、抗原は、寄生生物の少なくとも3つの異なる生活環主要段階において寄生生物の表面上に提示される少なくとも3つの異なるタンパク質から得られる。特に、寄生生物は熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)であり、異なる生活環主要段階は前赤内期段階、血液段階および有性生殖段階である。3つの抗原の例は、Pfs25 FKO、AMA1 GKOおよびCSP_TSR GKOである。
本開示によれば、抗原は本開示のタンパク質複合体における融合タンパク質中/へのN末端および/またはC末端(例えば、イムノグロブリン重鎖定常ドメインのうちの少なくとも1つおよびCL−ドメインへのN末端および/またはC末端)に結合していてもよい。
前述のように、「結合した」とは、2つ以上の分子間の非共有および共有結合を意味する。結合は直接的であっても間接的であってもよい。2つの分子が、連結分子(リンカー)を介して結合しているとき、この2つの分子は間接的に結合している。2つの分子を結合する介在分子がないとき、この2つの分子は直接結合している。前述のように、融合タンパク質単位は、好ましくはペプチド結合またはジスルフィド結合を介して、直接的または間接的に互いに結合している。間接的共有結合の一例は、ペプチドリンカーなどの介在性アミノ酸配列がセグメント間に並置されて融合タンパク質を形成することである。本開示による「結合した」には、特にまた、1つのタンパク質が別のタンパク質に融合し、融合タンパク質または融合タンパク質単位を生じることを含む。したがって、好ましくは、抗原は、本開示によるIAタンパク質複合体の融合タンパク質単位において、イムノグロブリン重鎖定常ドメインのうちの少なくとも1つのN末端および/またはC末端ならびにCL−ドメインのN末端および/またはC末端に融合している。
本開示の一部のさらなる実施形態では、融合タンパク質は本開示のタンパク質複合体中で互いに共有結合または非共有結合することができる。本開示によれば、「共有結合した」という用語は、原子間の電子対の共有が関与する共有結合を含む。これらの電子対は、共有対または結合対として知られており、電子を共有するときの原子間の引力および反発力の安定したバランスが共有結合として知られている。「非共有結合した」という用語は、電子の共有は関与しないが、分子間または分子内の電磁気的相互作用のより分散した変動が関与する、共有結合とは異なる非共有結合的相互作用を含む。本開示の一部の有利な実施形態では、融合タンパク質はジスルフィド結合によって互いに共有結合している。
一部の有利な実施形態では、第1の融合タンパク質単位(HC単位1)および第2の融合タンパク質単位(LC単位1)は互いに共有結合または非共有結合しており、特に、第1および第2の融合タンパク質単位はジスルフィド結合によって互いに共有結合している。
前述のように、一部の有利な実施形態では、本開示によるIAタンパク質複合体は、イムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第3の抗原を含む第3の組換え融合タンパク質単位を含み、前記第3の抗原は、前記第3の融合タンパク質のイムノグロブリン重鎖定常ドメインのN末端および/またはC末端に融合している(第2のHC融合ポリペプチド単位2、HC単位2)。
一部の有利な実施形態では、第1の融合タンパク質単位(HC単位1)および第3の融合タンパク質単位(HC単位2)は互いに共有結合または非共有結合しており、特に、第1および第3の融合タンパク質単位はジスルフィド結合によって互いに共有結合している。
別の有利な実施形態では、本開示によるIAタンパク質複合体は、イムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第4の抗原を含む第4の組換え融合タンパク質単位を含み、前記第4の抗原はCLドメインのN末端またはC末端に融合している(第2のLC融合ポリペプチド単位、LC単位2)。
一部の有利な実施形態では、第3の融合タンパク質単位(HC単位2)および第4の融合タンパク質単位(LC単位2)は互いに共有結合または非共有結合しており、特に、第3および第4の融合タンパク質単位はジスルフィド結合によって互いに共有結合している。
特に、一部の有利な実施形態はIAタンパク質複合体に関し、第1の融合タンパク質(HC単位1)および第2の融合タンパク質(LC単位1)は互いに結合しており、第3の融合タンパク質(HC単位2)および第4の融合タンパク質(LC単位2)は互いに結合しており、第1の融合タンパク質(HC単位1)および第3の融合タンパク質(HC単位2)は互いに結合している(例えば、図3参照)。この構築物は、抗体様タンパク質複合体と呼ばれることがある。特に、融合タンパク質単位はジスルフィド結合によって互いに共有結合している。
一部の実施形態では、本開示による単離されたIAタンパク質複合体は異なるアミノ酸配列を含む少なくとも3つの抗原を含む。
有利な実施形態では、本開示による単離されたタンパク質複合体は少なくとも4つの組換え融合タンパク質を含み、
a)第1の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第1の抗原を含み、前記第1の抗原はCH1−ドメインのN末端に結合しており(HC単位1)、
b)第2の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第2の抗原を含み、前記第2の抗原はCL−ドメインのN末端に融合しており(LC単位1)、前記第1および前記第2の融合タンパク質単位は、特に少なくとも1つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、
c)第3の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第3の抗原を含み、前記第3の抗原は前記融合タンパク質単位のCH1−ドメインのN末端に融合しており(HC単位2)、前記HC単位1およびHC単位2は、特に少なくとも1つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合しており、
d)第4の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第4の抗原を含み、前記第4の抗原は前記第4の融合タンパク質のCL−ドメインのN末端に融合しており(LC単位2)、前記第3および前記第4の融合タンパク質単位は、特に少なくとも1つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合している。
a)第1の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第1の抗原を含み、前記第1の抗原はCH1−ドメインのN末端に結合しており(HC単位1)、
b)第2の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第2の抗原を含み、前記第2の抗原はCL−ドメインのN末端に融合しており(LC単位1)、前記第1および前記第2の融合タンパク質単位は、特に少なくとも1つのジスルフィド結合によって互いに共有結合しており、
c)第3の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第3の抗原を含み、前記第3の抗原は前記融合タンパク質単位のCH1−ドメインのN末端に融合しており(HC単位2)、前記HC単位1およびHC単位2は、特に少なくとも1つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合しており、
d)第4の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第4の抗原を含み、前記第4の抗原は前記第4の融合タンパク質のCL−ドメインのN末端に融合しており(LC単位2)、前記第3および前記第4の融合タンパク質単位は、特に少なくとも1つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合している。
一部の実施形態では、融合タンパク質はさらに追加的抗原を含み、前記追加的抗原は前記組換え融合タンパク質のN末端および/またはC末端に融合している(図5参照)。
A)HC融合ポリペプチド
前述のように、一部の有利な実施形態では、本開示による単離されたIAタンパク質複合体は、少なくとも2つ組換え融合タンパク質を含み、第1の融合タンパク質はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第1の抗原を含み、前記第1の抗原は、イムノグロブリン重鎖定常ドメインのN末端および/またはC末端に結合/融合している(HC融合ポリペプチド単位またはHC単位1)。
前述のように、一部の有利な実施形態では、本開示による単離されたIAタンパク質複合体は、少なくとも2つ組換え融合タンパク質を含み、第1の融合タンパク質はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第1の抗原を含み、前記第1の抗原は、イムノグロブリン重鎖定常ドメインのN末端および/またはC末端に結合/融合している(HC融合ポリペプチド単位またはHC単位1)。
さらに有利な実施形態では、本開示による単離されたタンパク質複合体はさらに、イムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第3の抗原を含む第3の組換え融合タンパク質を含み、前記第3の抗原は前記第3の融合タンパク質のイムノグロブリン重鎖定常ドメインのN末端および/またはC末端に融合している(HC単位2)。
以下では、第1および第2のHC融合ポリペプチド単位はHC融合ポリペプチドと称する。
典型的に、本開示による単離されたタンパク質複合体に含まれるHC融合ポリペプチドは、IgG、IgMもしくはIgA重鎖定常領域のアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。特に、イムノグロブリン重鎖定常ドメインのそれぞれは、ほ乳類重鎖定常ドメイン、好ましくはヒト重鎖定常ドメインのアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。好ましくは、イムノグロブリン重鎖定常ドメインのそれぞれは、IgG重鎖定常ドメイン、好ましくはヒトIgG、好ましくはヒトIgG1のアミノ酸またはそのバリアントを含む(例えば、配列番号32参照)。
「重鎖」または「イムノグロブリン重鎖」という語句には、任意の生物のイムノグロブリン重鎖定常領域配列が含まれる。特に指定しなければ、重鎖可変ドメインには、3つの重鎖CDRおよび4つのFR領域が含まれる。重鎖の断片には、CDR、CDRおよびFRならびにそれらの組合せが含まれる。典型的な重鎖は、可変ドメイン(N末端からC末端まで)に続いて、CH1ドメイン、ヒンジ、CH2ドメインおよびCH3ドメインを有する(Kapelski et al., Malaria Journal 2015, 14:50参照)。Kabat番号付けスキームによれば、位置は、HC_hIgG1についてはEU/Kabat番号:121〜447/117〜478で、hLCカッパについてはEU/Kabat番号:111〜214である。重鎖の1機能断片の例には、細胞で発現して細胞から分泌され得るエピトープを特異的に認識することができ(例えば、マイクロモル、ナノモルまたはピコモルの範囲のKDでエピトープを認識する)、少なくとも1個のCDRを含む断片が含まれる。
「イムノグロブリン重鎖定常ドメイン」という用語は、天然のイムノグロブリン重鎖領域から得られたポリペプチドまたはそのバリアントもしくは断片である。典型的に、イムノグロブリン重鎖定常ドメインは、イムノグロブリンのFc部分を典型的に含むFc受容体結合部分の一部またはその断片もしくはバリアントである。
「Fc部分」という用語には、IgGのヒンジ領域で作用する酵素パパインによる制限タンパク質分解によって得られるIgG分子の断片が含まれる。この方法で得られたFc部分は、IgGの重鎖CH2およびCH3ドメインを含有するペプチドに結合した、それぞれCy2およびCy3ドメインとも称される2つの同一のジスルフィドを含有する。2つのペプチドは、ペプチドのN末端部分中のシステイン残基間の2つのジスルフィド結合によって結合することができる。「Fc部分」はまた、その他の4つのイムノグロブリン種のいずれか、すなわち、IgM、IgA、IgDまたはIgEの対応する部分を含む。IgMのFc部分は、2つの同一のジスルフィドで結合した、Cp2、Cp3およびCp4とも称されるペプチド重鎖CH2、CH3およびCH4ドメインを含有する。ペプチドは、Cp2およびCp3ドメインの間にあるシステイン残基でジスルフィド結合されていてもよい。IgAのFc部分は、2つの同一のジスルフィドで結合した、Ca2およびCa3とも称されるペプチド重鎖CH2およびCH3ドメインを含有する。ペプチドは、N末端にあるシステイン残基でCp2ドメインにジスルフィド結合されている。IgG、IgMおよびIgAで記載したジスルフィド結合の配置は、天然のヒト抗体に関する。その他のほ乳類種の抗体ではいくつかの変動があり得るが、このような抗体は本発明の場合に適切であり得る。抗体はまた、鳥類、は虫類および両生類において発見され、それらも同様に適切であり得る。ヒトFcIgGのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、Ellison et al. (1982) NUCLEIC AIDS RES. 10: 4071- 4079に開示されている。マウスFcIgG2aのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、Bourgois et al. (1974) EUR. J. BIOCHEM. 43; 423-435に開示されている。
一部の実施形態では、HC融合ポリペプチドはFc受容体結合部分を含む。Fc受容体結合部分の例は、配列番号32、配列番号76および配列番号77またはそれらのバリアントである。
典型的に、本開示によるタンパク質複合体に含まれるHC融合ポリペプチドにおいて、イムノグロブリン重鎖定常領域のそれぞれは、IgG、IgMもしくはIgA重鎖定常領域のアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。典型的に、イムノグロブリン重鎖定常領域のそれぞれは、ほ乳類重鎖定常領域、好ましくはヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。イムノグロブリン重鎖定常領域のそれぞれは、IgG重鎖定常領域、好ましくはヒトIgGのアミノ酸配列を含むことが適切である。適切なヒトIgGサブタイプは、IgG1、IgG2、IgG3およびlgG4であるが、IgG1またはlgG3が好ましい。
本開示によれば、CH1およびCH3は、本開示によるHC融合ポリペプチドにおいて互いに結合することができる。本開示では、「結合した」という用語は、2つ以上の分子間の非共有および共有結合を意味する。結合は直接的であっても間接的であってもよい。2つの分子がヒンジ領域のような連結分子(リンカー)を介して結合しているとき、2つの分子は間接的に結合している。2つの分子を結合する介在分子がないとき、2つの分子は直接結合している。
前述のように、本開示によるHC融合ポリペプチドにおけるイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3は、好ましくはペプチド結合またはジスルフィド結合を介して、直接的または間接的に互いに結合することができる。間接的共有結合の一例は、ペプチドリンカーなどの介在性アミノ酸配列がセグメント間に並置されて融合タンパク質を形成することである。
一部の実施形態では、CH1およびCH3は、互いに直接結合している。その他の実施形態では、CH1およびCH3は15個のアミノ酸(EU番号E216〜P230;Kabat番号E226〜P243)を含むヒトIGG1ヒンジ領域を介して互いに間接的に結合しており、一部の例では、リンカーは、20個以下のアミノ酸、特に2から6個のアミノ酸の大きさのポリペプチドである。例えば、CH1およびCH3は天然のイムノグロブリンのCH1とCH2ドメインの間で通常生じるイムノグロブリンのヒンジ領域によって互いに間接的に結合することができる。さらに、一部の有利な実施形態では、イムノグロブリン重鎖定常ドメインCH2は、第1の融合タンパク質におけるCH1とCH3の間であってもよい。しかし、一部の有利な実施形態では、第1の融合タンパク質(HC単位1)はCH2ドメインおよび/または重鎖可変領域ドメイン(VH)が欠如している。
その他の有利な実施形態では、本開示のタンパク質によるHC融合ポリペプチドはまた、イムノグロブリン重鎖定常ドメインCH2を含む。これらの実施形態では、CH1およびCH2は互いに直接結合している、またはCH1およびCH2は前述したヒンジ領域のようなリンカーを介して互いに間接的に結合している。例えば、CH1およびCH2は天然のイムノグロブリンのCH1とCH2ドメインの間で生じるイムノグロブリンのヒンジ領域によって互いに間接的に結合することができる。このような適切なヒンジ領域の例は、免疫遺伝学および免疫情報学において世界的に参考にされているINTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION SYSTEM (http://www.imgt.org)のIMGT Repertoireデータベースにおいて示される。
したがって、一部の実施形態では、HC融合ポリペプチドはヒンジ領域を含む。特に、HC融合ポリペプチドは、CH1−ドメインとCH3−ドメインの間にヒンジ領域を含む。その他の実施形態では、HC融合ポリペプチドは、CH1−ドメインとCH2−ドメインの間にヒンジ領域を含む。一部のその他の実施形態では、HC融合ポリペプチド(HC単位1および2)は、CH1−ドメインとCH2−ドメインの間にイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1、CH2およびCH3ならびにヒンジ領域を含む。
前述のように、本開示の有利な実施形態では、単離されたタンパク質複合体における第1の融合タンパク質は、イムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第1の抗原を含む。
本開示によれば、第1の抗原は、第1の融合タンパク質のイムノグロブリン重鎖定常ドメインのN末端および/またはC末端に結合/融合していてもよい(HC融合ポリペプチド)。抗原は、第1の融合タンパク質のCH1ドメインのN末端に、および/またはCH3ドメインのC末端に直接的または間接的に結合していてもよい。一部の実施形態では、第1の抗原はCH1ドメインのN末端に結合し、別の抗原はCH3のC末端に結合している。その他の抗原は、同じまたは異なるポリペプチドから得ることができ、例えば、CH1ドメインのN末端に結合した抗原は、CH3ドメインのC末端に結合した抗原と同一であるまたは少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の有利な実施形態では、CH1ドメインのN末端に結合した抗原は、CH3ドメインのC末端に結合した抗原と異なるアミノ酸配列を含む。したがって、より高い可変性がタンパク質複合体にもたらされる。
別の実施形態では、第3の抗原は、第3の融合タンパク質のイムノグロブリン重鎖定常ドメインのN末端および/またはC末端に結合/融合していてもよい(HC単位2)。抗原は、第1の融合タンパク質のCH1ドメインのN末端に、および/またはCH3ドメインのC末端に直接的または間接的に結合していてもよい。一部の実施形態では、第1の抗原はCH1ドメインのN末端に結合し、別の抗原はCH3のC末端に結合している。その他の抗原は、同じまたは異なるポリペプチドから得ることができ、例えば、CH1ドメインのN末端に結合した抗原は、CH3ドメインのC末端に結合した抗原と同一であるまたは少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の有利な実施形態では、CH1ドメインのN末端に結合した抗原は、CH3ドメインのC末端に結合した抗原と異なるアミノ酸配列を含む。したがって、より高い可変性がタンパク質複合体にもたらされる。特に、前記第1の融合タンパク質における第1の抗原は、CH1−ドメインのN末端に融合し、前記第1の融合タンパク質のさらなる抗原はCH3−ドメインのC末端に融合している。
一部の有利な実施形態では、前記第3の融合タンパク質における第3の抗原はCH1−ドメインのN末端に融合し、前記第3の融合タンパク質のさらなる抗原はCH3−ドメインのC末端に融合している(HC単位2)。特に、融合/結合した抗原は異なるアミノ酸配列を含む。
以下の表2に、HC融合ポリペプチドの例を示す。
以下の表3に、追加的C末端融合ポリペプチドを含むHC融合ポリペプチドの例を示す。
以下の表4に、Fcヘテロ二量体化のために修飾したCH3領域を有するHC融合ポリペプチドの例を示す。
以下の表5に、Fcヘテロ二量体化のために修飾したCH3領域および追加的なC末端融合した(第2または第4の)マラリア抗原を有するさらなるHC融合ポリペプチドの例を示す。
B)LC融合ポリペプチド
前述のように、一部の有利な実施形態では、本開示の単離されたIAタンパク質複合体は、少なくとも2つの組換え融合タンパク質単位を含み、第2の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第2の抗原を含み、前記第2の抗原はCLドメインのN末端および/またはC末端に結合している(LC融合ポリペプチド単位、LC単位1)。
前述のように、一部の有利な実施形態では、本開示の単離されたIAタンパク質複合体は、少なくとも2つの組換え融合タンパク質単位を含み、第2の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第2の抗原を含み、前記第2の抗原はCLドメインのN末端および/またはC末端に結合している(LC融合ポリペプチド単位、LC単位1)。
一部の有利な実施形態では、本開示による単離されたタンパク質複合体は、イムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第4の抗原を含む第4の組換え融合タンパク質単位を含み、前記第4の抗原はCLドメインのN末端またはC末端に融合している(第2のLC融合ポリペプチド単位、LC単位2)。
以下では、第1および第2のLC融合ポリペプチド単位はLC融合ポリペプチドと称する。
典型的に、本開示による単離されたタンパク質複合体に含まれるLC融合ポリペプチド(LC単位1および/またはLC単位2)は、IgG、IgMもしくはIgAイムノグロブリン軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。特に、イムノグロブリン軽鎖定常ドメインは、ほ乳類軽鎖定常ドメイン、好ましくはヒト軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。好ましくは、イムノグロブリン軽鎖定常ドメインのそれぞれは、IgG軽鎖定常ドメイン、好ましくはヒトカッパまたはラムダ軽鎖のアミノ酸またはそのバリアントを含む。
「軽鎖」という語句には、任意の生物のイムノグロブリン軽鎖配列が含まれ、特に指定しない限り、ヒトκおよびλ軽鎖およびVpreBならびに代替軽鎖が含まれる。特に指定しなければ、軽鎖可変(VL)ドメインには典型的に、3つの軽鎖CDRおよび4つのフレームワーク(FR)領域が含まれる。
一般的に、完全長軽鎖には、アミノ末端からカルボキシル末端まで、FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4を含むVLドメインおよびカッパまたはラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインが含まれる。軽鎖には、例えば、エピトープ結合タンパク質が選択的に結合して出現する第1および第2のエピトープのいずれにも選択的に結合しない軽鎖が含まれる。軽鎖にはまた、エピトープ結合タンパク質が選択的に結合して出現する1つまたは複数のエピトープに結合して認識し、重鎖がそれらに結合し認識するのを援助する軽鎖が含まれる。
「イムノグロブリン軽鎖定常ドメイン」という用語は、イムノグロブリンカッパ遺伝子座(IGK@)によってコードされるカッパ(κ)鎖またはイムノグロブリンラムダ遺伝子座(IGL@)によってコードされるラムダ(λ)鎖のような天然のイムノグロブリン軽鎖から得られるポリペプチドまたはそれらのバリアントもしくは断片である(例えば、Kapelski et al., Malaria Journal 2015, 14:50参照)。Kabat番号付けスキームによれば、位置は、hLCカッパ:EU/Kabat番号:111〜214である。抗体定常領域の例は、免疫遺伝学および免疫情報学において世界的に参考にされているINTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION SYSTEM(http://www.imgt.org)のIMGT Repertoireデータベースにおいて示される。
一部の有利な実施形態では、第2の融合タンパク質はVLドメインを有さないイムノグロブリン軽鎖配列から得られたイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLを含む。
一部の有利な実施形態では、CL−ドメインはヒトカッパ軽鎖またはラムダ軽鎖、特に、配列番号50のアミノ酸配列を含むCL−ドメインである。
典型的に、LC融合ポリペプチド(LC融合ポリペプチドおよび/または第2のLC融合ポリペプチド)は、IgG、IgMもしくはIgA軽鎖定常領域のアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。典型的に、イムノグロブリン軽鎖定常領域のそれぞれは、ほ乳類軽鎖定常領域、好ましくはヒト軽鎖定常領域のアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。イムノグロブリン軽鎖定常領域は、IgG軽鎖定常領域、好ましくはヒトIgGのアミノ酸配列を含むことが適切である。適切なヒトIgGサブタイプは、IgG1、IgG2、IgG3およびlgG4であるが、IgG1またはlgG3が好ましい。
本開示によれば、抗原は、第2の融合タンパク質のイムノグロブリン軽鎖定常ドメインのN末端および/またはC末端に融合していてもよい(LC融合単位1)。抗原は、CLのN末端および/またはC末端に直接的または間接的に結合していてもよい。一部の実施形態では、第2の抗原はCLのN末端に結合し、別の抗原はCLのC末端に結合している。その他の抗原は、同じまたは異なるポリペプチドから得ることができ、例えば、CLのN末端に結合した抗原は、CLのC末端に結合した抗原と同一であるまたは少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の有利な実施形態では、CLのN末端に結合した抗原は、CLのC末端に結合した抗原と異なるアミノ酸配列を含む。したがって、より高い可変性がタンパク質複合体にもたらされる。
以下の表6に、HC融合ポリペプチドの例を示す。
本開示によるIAタンパク質複合体の実施形態
一部の有利な実施形態では、本開示による単離されたイムノアセンブリン(IA)タンパク質複合体は、少なくとも2つの組換え融合タンパク質単位を含み、マラリアワクチンとして適切であり、
a)第1の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第1の抗原を含み、前記第1の抗原はイムノグロブリン重鎖定常ドメインのうちの少なくとも1つのN末端および/またはC末端に結合しており(HC融合ポリペプチド単位1、HC単位1)、
b)第2の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第2の抗原を含み、前記第2の抗原はCL−ドメインのN末端および/またはC末端に結合しており(LC融合ポリペプチド単位1、LC単位1)、
c)前記第1および前記第2の抗原は異なるアミノ酸配列を含み、抗原はPfs25FKO、AMA1GKOおよびCSP_TSRGKOである。
一部の有利な実施形態では、本開示による単離されたイムノアセンブリン(IA)タンパク質複合体は、少なくとも2つの組換え融合タンパク質単位を含み、マラリアワクチンとして適切であり、
a)第1の融合タンパク質単位はイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第1の抗原を含み、前記第1の抗原はイムノグロブリン重鎖定常ドメインのうちの少なくとも1つのN末端および/またはC末端に結合しており(HC融合ポリペプチド単位1、HC単位1)、
b)第2の融合タンパク質単位はイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第2の抗原を含み、前記第2の抗原はCL−ドメインのN末端および/またはC末端に結合しており(LC融合ポリペプチド単位1、LC単位1)、
c)前記第1および前記第2の抗原は異なるアミノ酸配列を含み、抗原はPfs25FKO、AMA1GKOおよびCSP_TSRGKOである。
一部の有利な実施形態では、本開示による単離されたイムノアセンブリン(IA)タンパク質複合体は、抗原AMA1GKOおよびCSP_TSRGKOを含むHC単位1を含み、AMA1GKOはCH1−ドメインにN末端融合しており、CSP_TSRGKOはCH3−ドメインにC末端融合しており、前記第2の融合タンパク質は抗原Pfs25FKOを含み、Pfs25FKOはCL−ドメインにN末端融合している。
一部の有利な実施形態では、本開示による単離されたイムノアセンブリン(IA)タンパク質複合体は、
a)配列番号33から配列番号52、配列番号67から配列番号75および配列番号78から配列番号104の群から選択されるアミノ酸配列を有する第1の融合タンパク質単位(HC単位1)、および
b)配列番号51から配列番号66の群から選択されるアミノ酸配列を有する第2の融合タンパク質単位(LC単位1)を含む。
a)配列番号33から配列番号52、配列番号67から配列番号75および配列番号78から配列番号104の群から選択されるアミノ酸配列を有する第1の融合タンパク質単位(HC単位1)、および
b)配列番号51から配列番号66の群から選択されるアミノ酸配列を有する第2の融合タンパク質単位(LC単位1)を含む。
一部の有利な実施形態では、本開示による単離されたイムノアセンブリン(IA)タンパク質複合体は、
a)第1の融合タンパク質単位(HC単位1):配列番号97
b)第2の融合タンパク質単位(LC単位1):配列番号53
のアミノ酸配列を有する2つの組換え融合タンパク質を含む。
a)第1の融合タンパク質単位(HC単位1):配列番号97
b)第2の融合タンパク質単位(LC単位1):配列番号53
のアミノ酸配列を有する2つの組換え融合タンパク質を含む。
一部のさらに有利な実施形態では、本開示による単離されたイムノアセンブリン(IA)タンパク質複合体はFC−受容体結合部分を含み、第1の融合タンパク質単位に含まれるFc受容体結合部分は、配列番号32のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、
a)配列番号32と比較して少なくとも2つの置換を有し、前記置換が配列番号32のGlu356およびAsp399の位置で生じており、
b)Glu356およびAsp399の位置のアミノ酸が正電荷アミノ酸で置換されており、
c)第3の融合タンパク質に含まれるFc受容体結合部分は、配列番号32のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、
d)配列番号32と比較して少なくとも2つの置換を有し、前記置換が配列番号32のLys392およびLys409の位置で生じており、
e)Lys392およびLys409の位置のアミノ酸が負電荷アミノ酸で置換されている。
a)配列番号32と比較して少なくとも2つの置換を有し、前記置換が配列番号32のGlu356およびAsp399の位置で生じており、
b)Glu356およびAsp399の位置のアミノ酸が正電荷アミノ酸で置換されており、
c)第3の融合タンパク質に含まれるFc受容体結合部分は、配列番号32のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、
d)配列番号32と比較して少なくとも2つの置換を有し、前記置換が配列番号32のLys392およびLys409の位置で生じており、
e)Lys392およびLys409の位置のアミノ酸が負電荷アミノ酸で置換されている。
一部の有利な実施形態では、第1および/または第3の融合タンパク質単位に含まれるFc受容体結合部分は、配列番号76または配列番号77のアミノ酸配列を含む。
一部のさらに有利な実施形態では、本開示による単離されたIAタンパク質複合体は、
a)抗原AMA1GKOおよびCSP_TSRGKOを含む第1の融合タンパク質単位(HC単位1)であって、AMA1GKOはCH1−ドメインにN末端融合しており、CSP_TSRGKOはCH3−ドメインにC末端融合しており、第1の融合タンパク質単位に含まれるFc受容体結合部分が、配列番号32のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、配列番号32と比較して少なくとも2つの置換を有し、前記置換が配列番号32のGlu356およびAsp399の位置で生じており、Glu356およびAsp399の位置のアミノ酸が正電荷アミノ酸で置換されている第1の融合タンパク質単位、
b)抗原Pfs25FKOを含む第2の融合タンパク質単位(LC単位1)であって、Pfs25FKOはCL−ドメインにN末端融合している第2の融合タンパク質単位、
c)CH1−ドメインにN末端融合した抗原Rh2GKOを含む第3の融合タンパク質単位(HC単位2)であって、第1の融合タンパク質単位に含まれるFc受容体結合部分は、配列番号32のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、配列番号32と比較して少なくとも2つの置換を有し、前記置換が配列番号32のLys392およびLys409の位置で生じている第3の融合タンパク質単位
を含む。
a)抗原AMA1GKOおよびCSP_TSRGKOを含む第1の融合タンパク質単位(HC単位1)であって、AMA1GKOはCH1−ドメインにN末端融合しており、CSP_TSRGKOはCH3−ドメインにC末端融合しており、第1の融合タンパク質単位に含まれるFc受容体結合部分が、配列番号32のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、配列番号32と比較して少なくとも2つの置換を有し、前記置換が配列番号32のGlu356およびAsp399の位置で生じており、Glu356およびAsp399の位置のアミノ酸が正電荷アミノ酸で置換されている第1の融合タンパク質単位、
b)抗原Pfs25FKOを含む第2の融合タンパク質単位(LC単位1)であって、Pfs25FKOはCL−ドメインにN末端融合している第2の融合タンパク質単位、
c)CH1−ドメインにN末端融合した抗原Rh2GKOを含む第3の融合タンパク質単位(HC単位2)であって、第1の融合タンパク質単位に含まれるFc受容体結合部分は、配列番号32のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、配列番号32と比較して少なくとも2つの置換を有し、前記置換が配列番号32のLys392およびLys409の位置で生じている第3の融合タンパク質単位
を含む。
一部のさらに有利な実施形態では、本開示による単離されたIAタンパク質複合体は、
a)配列番号33から配列番号52、配列番号67から配列番号75および配列番号78から配列番号104の群から選択されるアミノ酸配列を有する第1の融合タンパク質単位(HC単位1)、および
b)配列番号51から配列番号66の群から選択されるアミノ酸を有する第2の融合タンパク質単位(LC単位1)、および
c)配列番号33から配列番号52、配列番号67から配列番号75および配列番号78から配列番号104の群から選択されるアミノ酸配列を有する第3の融合タンパク質単位(HC単位22)を含む。
a)配列番号33から配列番号52、配列番号67から配列番号75および配列番号78から配列番号104の群から選択されるアミノ酸配列を有する第1の融合タンパク質単位(HC単位1)、および
b)配列番号51から配列番号66の群から選択されるアミノ酸を有する第2の融合タンパク質単位(LC単位1)、および
c)配列番号33から配列番号52、配列番号67から配列番号75および配列番号78から配列番号104の群から選択されるアミノ酸配列を有する第3の融合タンパク質単位(HC単位22)を含む。
一部のさらなる有利な実施形態では、本開示による単離されたIAタンパク質複合体は、
a)第1の融合タンパク質単位(HC単位1):配列番号97
b)第2の融合タンパク質単位(LC単位1):配列番号53
c)第3の融合タンパク質単位(HC単位2):配列番号88を含む。
a)第1の融合タンパク質単位(HC単位1):配列番号97
b)第2の融合タンパク質単位(LC単位1):配列番号53
c)第3の融合タンパク質単位(HC単位2):配列番号88を含む。
一部のさらに有利な実施形態では、本開示による単離されたIAタンパク質複合体は第4の融合タンパク質単位を含み、第4のタンパク質単位(LC単位2)は抗原Pfs25FKOを含む第2の融合タンパク質単位(LC単位1)と同一で、Pfs25FKOは第4の融合タンパク質単位のCL−ドメインにN末端融合している。
一部のさらに有利な実施形態では、本開示による単離されたIAタンパク質複合体は、
a)配列番号33から配列番号52、配列番号67から配列番号75および配列番号78から配列番号104の群から選択されるアミノ酸配列を有する第1の融合タンパク質単位(HC単位1)、および
b)配列番号51から配列番号66の群から選択されるアミノ酸を有する第2の融合タンパク質単位(LC単位1)、および
c)配列番号33から配列番号52、配列番号67から配列番号75および配列番号78から配列番号104の群から選択されるアミノ酸配列を有する第3の融合タンパク質単位(HC単位2)、および
d)配列番号51から配列番号66の群から選択されるアミノ酸配列を有する第4の融合タンパク質単位(LC単位2)を含む。
a)配列番号33から配列番号52、配列番号67から配列番号75および配列番号78から配列番号104の群から選択されるアミノ酸配列を有する第1の融合タンパク質単位(HC単位1)、および
b)配列番号51から配列番号66の群から選択されるアミノ酸を有する第2の融合タンパク質単位(LC単位1)、および
c)配列番号33から配列番号52、配列番号67から配列番号75および配列番号78から配列番号104の群から選択されるアミノ酸配列を有する第3の融合タンパク質単位(HC単位2)、および
d)配列番号51から配列番号66の群から選択されるアミノ酸配列を有する第4の融合タンパク質単位(LC単位2)を含む。
一部のさらに有利な実施形態では、本開示による単離されたIAタンパク質複合体は、
a)第1の融合タンパク質単位(HC単位1):配列番号97、および
b)第2の融合タンパク質単位(LC単位1):配列番号53、および
c)第3の融合タンパク質単位(HC単位2):配列番号88、配列番号99または配列番号100、および
d)第4の融合タンパク質単位(LC単位2):配列番号53を含む。
a)第1の融合タンパク質単位(HC単位1):配列番号97、および
b)第2の融合タンパク質単位(LC単位1):配列番号53、および
c)第3の融合タンパク質単位(HC単位2):配列番号88、配列番号99または配列番号100、および
d)第4の融合タンパク質単位(LC単位2):配列番号53を含む。
さらに、本開示は、IAタンパク質複合体をコードする核酸分子もしくは核酸またはその一部、特に、本開示による前記組換え融合タンパク質単位および核酸分子を含むベクターおよび前記組換え融合タンパク質単位をコードする核酸分子またはベクターを含む宿主細胞に関する。本開示はまた、組換え発現系における前記IAタンパク質複合体および/または融合タンパク質単位の製造方法に関する。
したがって、本開示は本開示による1つまたは複数の融合タンパク質単位をコードするコーディング部分を含む核酸分子および前記ヌクレオチド分子のうちの少なくとも1つを含む発現ベクターおよび前記ベクターのうちの少なくとも1つまたは前記核酸分子のうちの少なくとも1つを含む宿主細胞に関する。特に、前記宿主細胞は、本開示による単離されたIAタンパク質複合体に含まれる融合タンパク質単位をコードする少なくとも1つまたは好ましくは全部の核酸分子を含む。
組換え発現系において本開示による融合タンパク質(融合タンパク質単位)を発現するために、遺伝子が動作可能に転写および翻訳コントロール配列に結合するように、融合タンパク質をコードするDNAまたはその一部を発現ベクターに挿入することができる。この文脈では、「動作可能に結合した」という用語は、ベクター内の転写および翻訳コントロール配列がタンパク質遺伝子の転写および翻訳を調節する目的の機能を果たすように、タンパク質遺伝子がベクターに連結されることを意味する。発現ベクターおよび発現コントロール配列は、使用した発現宿主細胞と適合するように選択する。単離されたタンパク質ドメイン配列は典型的に、同じ発現ベクターに挿入する。タンパク質遺伝子は、標準的方法によって発現ベクターに挿入する。さらに、組換え発現ベクターは、新生ポリペプチド鎖の小胞体(ER)への同時翻訳的転位を容易するシグナルペプチドをコードすることができる。折り畳まれたポリペプチド(本開示による組換え融合タンパク質)は宿主細胞から分泌されてもよい、または宿主細胞内に保持されていてもよい。細胞内での保持またはターゲッティングは、ER検索のためのC末端KDELタグなどの適当なターゲッティングペプチドの使用によって達成することができる。
一般的に、当業者であればおそらく、ベクターを構築し、組換え遺伝子発現のための方法を設計することができる(Sambrook, Maniatis et al. 1989,またはこの文献の後著、Ausubel 1992)。
「ベクター」という用語は、それが結合した別の核酸を輸送することができる核酸分子を含む。ベクターの1種は「プラスミド」で、これは追加的DNAセグメントを連結することができる環状2本鎖DNAループを意味する。ベクターの別の種類はウイルスベクターで、追加的DNAセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。ある種のベクターは、導入された宿主細胞において自己複製することができる(例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソームほ乳類ベクター)。その他のベクター(例えば、非エピソームほ乳類ベクター)は、宿主細胞内に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれることが可能で、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、動作可能に結合した遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現システム」または「組換え発現ベクター」(または、単に「発現ベクター」)と称する。一般的に、組換えDNA技術において実用的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは最も一般的に使用されるベクターの形態なので、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は同義に使用することができる。しかし、本開示は、同等の機能を果たすウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)などの発現ベクターのこのようなその他の形態を含むものとする。
本開示はまた、本開示による組換え融合タンパク質を含むベクターを有する宿主細胞を対象とする。「組換え宿主細胞」(または単に「宿主細胞」)という語句は、組換え発現ベクターが導入された細胞を含む。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代も意味するものと理解されたい。ある種の変更は、変異または環境の影響のいずれかによって後世代で生じる可能性があるので、そのような後代は、実際には、親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも本明細書では「宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。
宿主細胞は単一の宿主細胞の後代を含み、後代は天然の、偶発的または計画的な突然変異および/または変化により、元の親細胞と必ずしも完全に同一でない場合もある(形態において、または全DNA相補性において)。宿主細胞には、本開示の組換えベクターまたはポリヌクレオチドを用いて、インビボまたはインビトロにおいてトランスフェクトされた、または感染した細胞が含まれる。本開示の組換えベクターを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれることもある。
「宿主細胞(複数可)」という用語は、本開示による組換えタンパク質を精製する方法において使用することができる細胞(複数可)を意味する。このような宿主細胞は目的のタンパク質(POI)を有する。宿主細胞はまた、タンパク質発現細胞と呼ばれることがある。本発明による宿主細胞は、限定はしないが、原核細胞、真核細胞、古細菌、細菌細胞、昆虫細胞、酵母、哺乳細胞および/または植物細胞であってもよい。宿主細胞として想定される細菌は、グラム陰性またはグラム陽性のいずれか、例えば、大腸菌(Escherichia coli)、エルウィニア(Erwinia)種、クレブジエラ(Klebsellia)種、ラクトバチルス(Lactobacillus)種、枯草菌(Bacillus subtilis)またはシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)であってもよい。典型的な酵母宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)からなる群から選択される。一部の有利な実施形態では、宿主細胞は、HEK293T細胞またはHEK293−6E細胞などのHEK293細胞である。
原核細胞(細菌)および真核細胞発現系(酵母、バキュロウイルス、植物、ほ乳類およびその他の動物細胞、トランスジェニック動物ならびにハイブリドーマ細胞など)、ならびにファージディスプレイ発現系を含む多種多様な宿主発現系は、IAタンパク質複合体に含まれるIAタンパク質複合体または融合タンパク質単位を発現するために使用することができる。適切な細菌発現ベクターの一例はpUCl19(Sfi)であり、適切な真核細胞発現ベクターは弱めたDHFR選択系を有する修飾されたpcDNA3.1ベクターである。適切な真核細胞発現ベクターの別の例は、ゼオシン耐性およびIRES部位を有するように修飾されたpMSベクターである(Stocker et al. 2003)。適切な発現ベクターの別の例は、改善されたCMV発現カセットおよびHEK293−6E細胞における複製を増強するためのoriP部位を有するpTTベクター系である(Durocher et al. 2002)。植物発現ベクターの一例は、アグロバクテリウムにエレクトロポレーションした後タバコ植物に浸潤するpTRAktである(Boes et al. 2011)。その他の抗体または抗体様発現系も当技術分野では知られており、本明細書で検討する。
さらに、EBV形質転換ヒトリンパ芽球様B細胞株は、発現系として使用することができ、あるいは、抗体またはそれらの結合部分は、例えば、大腸菌(E. coli)抽出物から得られた無細胞タンパク質合成系において発現することができる。
有利な実施形態では、宿主細胞はベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)植物細胞、タバコ(Nicotiana tabacum)植物細胞またはそれらのBY2細胞であり、ほ乳類ならば、CHO、COS、NSOまたは293細胞が好ましく、酵母ならば、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)が好ましい。
本開示によって使用するための植物には、被子植物(Angiosperms)、コケ植物(Bryophytes)(例えば、ゼニゴケ類(Hepaticae)、スギゴケ類(Musci)など)、シダ植物(Ptepdophytes)(例えば、シダ類(ferns)、ツクシ(horsetails)、ヒゲノカズラ(lycopods))、裸子植物(Gymnosperms)(例えば、針葉樹(conifers)、サイカセ(cycase)、銀杏(Ginko)、グネツム目(Gnetales))および藻類(Algae)(例えば、緑藻類(Chlorophyceae)、褐藻類(Phaeophyceae)、紅藻類(Rhodophyceae)、藍藻類(Myxophyceae)、黄緑藻類(Xanthophyceae)およびユーグレナ藻類(Euglenophyceae))が含まれる。例となる植物は、マメ科(Leguminosae)(マメ科(Fabaceae)、例えば、エンドウマメ、アルファルファ、ダイズ)、イネ科(Gramineae)(イネ科(Poaceae)、例えばトウモロコシ、コムギ、ニー)、ナス科(Solanaceae)、特にトマト属(Lycopersicon)(例えば、トマト)、ナス属(Solarium)(例えば、ジャガイモ、ナス)、トウガラシ属(Capsium)(例えば、コショウ)またはタバコ属(Nicotiana)(例えば、タバコ)、セリ科(Umbelhferae)、特にニンジン属(Daucus)(例えば、ニンジン)、オランダミツバ属(Apium)(例えば、セロリ)、またはミカン科(Rutaceae)(例えば、オレンジ)、キク科(Compositae)、特に、アキノノゲシ属(Lactuca)(例えば、レタス)、アブラナ科(Brassicaceae)(アブラナ科(Cruciferae))、特に、ブラシカ属(Brassica)またはシロガラシ属(Sinapis)のメンバーである。ある種の態様では、本発明による植物は、アブラナ属(Brassica)またはシロイヌナズナ属(Arabidopsis)の種であってもよい。いくつかの例となるアブラナ科(Brassicaceae)のメンバーには、ブラシカ・カンペストンス(Brassica campestns)、カンナタ(B cannata)、カラシナ(B juncea)、アブラナ(B napus)、クロガラシ(B nigra)、オレラセアエ(B oleraceae)、トウニフォルツ(B tournifortu)、シロガラシ(Sinapis alba)およびダイコン(Raphanus sativus)が含まれる。形質転換を受け入れることができ、発芽実生として食用できるいくつかの適切な植物には、アルファルファ、リョクトウ、ラディッシュ、コムギ、マスタード、ホウレンソウ、ニンジン、ビート、タマネギ、ニンニク、セロリ、ダイオウ、キャベツまたはレタスなどの葉物植物、オランダカラシまたはクレス、パセリ、ミントまたはクローバーなどのハーブ、カリフラワー、ブロッコリー、ダイズ、レンティル、ヒマワリなど食用花などが含まれる。
有利な実施形態では、宿主細胞はベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)、タバコ(Nicotiana tabacum)もしくはタバコBY2細胞株から得られる、またはオオムギ(Hordeum vulgare L.)、トウモロコシ(Zea mays)またはコムギ(Triticum)種から得られる。
したがって、有利な実施形態では、発現ベクターは公知の技術に従って植物に送達することができる。例えば、ベクター自体を植物に直接適用することができる(例えば、こすりつけ接種、機械化した噴霧接種、真空浸潤、微粒子銃またはエレクトロポレーションによって)。あるいは、またはさらに、ウイルス粒子を調製することができ(例えば、すでに感染した植物から)、公知の技術に従ってその他の植物に適用することができる。様々な植物種に感染する多種多様なウイルスが公知であり、本開示によるポリヌクレオチド発現のために使用することができる(例えば、いずれも参考として本明細書に組み込んだ、Classification and Nomenclature of Viruses, "Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses" (Ed Murphy et al), Springer Verlag New York, 1995, Grierson et al, Plant Molecular Biology, Blackie, London, pp 126-146, 1984, Gluzman er al, Communications in Molecular Biology Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sppng Harbor, NY, pp 172-189, 1988,およびMathew, Plant Viruses Online参照)。ある種の実施形態では、単一ウイルスベクターを植物細胞に送達するよりも、一緒になるとウイルスベクター(複数可)の複製(場合によって、細胞から細胞および/または長距離移動)を可能にする多数の異なるベクターを送達する。タンパク質の一部または全ては、トランスジェニック植物のゲノムによってコードすることができる。本明細書でさらに詳細に記載するある種の態様では、これらの系は1つまたは複数のウイルスベクター成分を含む。
本開示はまた、本開示によるIAタンパク質複合体および薬学的に許容される担体および/またはアジュバントを含むワクチン組成物(ヒトおよび/または動物ワクチン)に関する。有利な実施形態では、本開示によるIAタンパク質複合体および/または組成物は、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)および/または卵形マラリア原虫(Plasmodium ovale)を含むプラスモディウム(Plasmodium)属の寄生生物に対するヒトおよび/または動物ワクチンとして適切である。有利な実施形態では、寄生生物は熱帯熱マラリア原虫(plasmodium falciparum)である。
本開示はまた、本開示によるIAタンパク質複合体を含むワクチン組成物に関する。このようなワクチン組成物の最適な性能を確実にするために、免疫学的および薬学的に許容される担体、ビヒクルまたはアジュバントを含むことが好ましい。ワクチン組成物および担体は、生理学的に許容される媒体に入れることが好ましい。
「ワクチン」は、対象に投与したとき、免疫応答を誘導する製剤を含む物質の組成物である。ワクチンはポリヌクレオチド分子、ポリペプチド分子および炭水化物分子ならびに糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物−タンパク質コンジュゲート、2つ以上のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの融合物などのそれぞれの誘導体および組合せ物を含むことができる。当業者には容易に理解されるように、ワクチンはさらに、希釈剤、アジュバント、担体またはそれらの組合せを含むことができる。例えば、Fc受容体部分、サイトカインまたはインターロイキン、トール様受容体リガンドと融合または結合して導入したために、本開示によるIAタンパク質複合体自体はアジュバント特性を示して提供する。一実施形態では、したがって、本開示のワクチン組成物はさらにアジュバントを含まない。
本開示のIAタンパク質複合体が動物によって認識される効果的なワクチンは、動物モデルにおいて、ワクチン接種していない動物と比較して、血液および/または標的器官での寄生生物負荷を低減し、例えば、マラリア寄生生物に曝露した後の生存時間を延長し、および/または体重減少を軽減することができる。
さらに、本開示の融合タンパク質単位は、炭水化物または脂質部分、例えば、担体に連結する、またはその他の方法で修飾、例えばアセチル化することができる。
適切な担体は、ポリペプチド(複数可)が疎水性非共有結合的相互作用によって結合しているプラスチック、例えば、ポリスチレンなどのポリマー、またはポリペプチド(複数可)が共有結合している多糖もしくはポリペプチド、例えば、ウシ血清アルブミン、オボアルブミンもしくはキーホールリンペットヘマトシアニンなどのポリマーからなる群から選択される。適切なビヒクルは、希釈剤および懸濁剤からなる群から選択される。アジュバントは、好ましくは、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDA)、Quil A、ポリI:C、水酸化アルミニウム、フロイントの不完全アジュバント、IFN−ガンマ、IL−2、IL−12、モノホスホリルリピドA(MPL)、トレハロースジミコール酸(TDM)、トレハロースジベヘナートおよびムラミルジペプチド(MDP)からなる群から選択される。
活性成分としてペプチド配列を含有するワクチンの調製は、全てを参考として本明細書に組み込んだ、米国特許第4608251号明細書、第4601903号明細書、第4599231号明細書および第4599230号明細書によって例示されるように、一般的に当技術分野で十分に理解されている。
ワクチンのアジュバント効果を達成するその他の方法には、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム(ミョウバン)などの薬剤の使用、糖の合成ポリマー(カーボポール)、熱処理によるワクチン中のタンパク質の凝集、アルブミンに対するペプシン処理された(Fab)抗体による再活性化による凝集、C.パルバム(parvum)などの細菌細胞またはグラム陰性菌の内毒素もしくはリポ多糖類成分との混合が含まれ、モノオレイン酸マンニド(Aracel A)などの生理学的に許容されるオイルビヒクル中のエマルジョンまたはブロック代用物として使用されるパーフルオロカーボン(Fluosol−DA)の20%溶液を有するエマルジョンも使用することができる。その他の可能性には、上記のアジュバントと組み合わせたサイトカインまたはポリI:Cなどの合成IFN−ガンマ誘導因子などの免疫調節物質の使用が含まれる。
アジュバント効果を達成するための別の可能性は、Gosselin et al, 1992に記載された技術を使用することである。簡単に説明すると、本発明の抗原などの関連抗原は、単球/マクロファージ上のFc受容体に対する抗体(または抗原結合抗体断片)とコンジュゲートすることができる。
ワクチンは、投薬製剤と適合する方法で、治療上有効となり免疫原性となるような量で投与する。投与する量は、例えば、免疫応答を開始する個体の免疫系の能力および所望する防御の程度を含む、治療対象によって左右される。適切な投薬量範囲は、ワクチン接種当たり数百マイクログラム程度の活性成分、好ましくは約0.1マイクロgから1000マイクロgの範囲、例えば、約1マイクロgから300マイクロgの範囲、特に、約10マイクロgから50マイクロgの範囲である。最初の投与および追加投与のための適切な投与計画も可変性であるが、最初の投与と、それに続くその後の接種またはその他の投与が典型的である。適用の方法は大きく変化し得る。従来のワクチン投与法のいずれも適用可能である。これらは、固体の生理学的に許容される基剤での、または生理学的に許容される分散物中での経口適用、注射などによる非経口的投与を含むと考えられている。ワクチンの投薬量は投与経路に左右され、ワクチン接種するヒトの年齢、程度は少ないがワクチン接種するヒトの大きさに応じて変化する。
ワクチンは、注射、例えば皮下注射または筋肉内注射のいずれかによって、従来通り非経口的に投与する。その他の投与様式に適切なさらなる製剤には、坐剤、場合によっては、経口製剤が含まれる。坐剤について、伝統的な結合剤および担体には、例えば、ポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドを含めることができ、このような坐剤は、0.5パーセントから10パーセント、好ましくは1〜2パーセントの範囲の活性成分を含有する混合物から形成することができる。経口製剤には、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤が含まれる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤または散剤の形態をとり、有利には10〜95パーセント、好ましくは25〜70%の活性成分を含有する。
多くの場合、ワクチンの多回投与が必要であろう。特に、ワクチンはマラリアの感染を防ぐために、および/または確定したマラリア感染を治療するために投与することができる。感染を防ぐために投与する場合、ワクチンは感染の決定的な臨床徴候または症状が存在する前に、予防的に投与する。
「薬学的に許容される担体」という用語には、当業者には公知なように、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤(例えば、抗菌剤、抗真菌剤)、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、矯臭剤、色素、このような物質およびそれらの組合せが含まれる。
薬学的に許容される担体は、好ましくは、ヒトへの投与のために処方されるが、ある種の実施形態では、イヌなどの非ヒト動物への投与のために処方されるがヒトへの投与には許容されない(例えば、政府規制のため)薬学的に許容される担体を使用することが望ましいことがある。いかなる従来の担体も、活性成分と適合しない場合を除いて、治療または医薬組成物におけるその使用を検討する。
対象に投与する本開示の組成物の実際の投薬量は、体重、状態の重症度、治療する疾患の種類、これまでのまたは同時に行っている治療的介入、患者の特発性疾患および投与経路などの物理的および生理学的要素によって決定することができる。投与に責任のある医師が、いかなる事象においても、組成物中の活性成分(複数可)の濃度および個々の対象に適当な用量(複数可)を決定するものとする。
有利な実施形態では、本開示による融合タンパク質は、マラリア、特に熱帯熱マラリアを予防または治療するための医薬品を調製するために使用する。
本開示はまた、
a)本開示による宿主細胞を、前記組換え融合タンパク質を生成するために適切な条件下、適切な培養培地中で培養するステップであって、宿主細胞が、本開示による単離されたタンパク質複合体の融合タンパク質単位をコードする全核酸分子を含み、前記IAタンパク質複合体が宿主細胞によって形成されるステップ、
b)前記タンパク質複合体を単離するステップ、および場合によって、
c)前記タンパク質複合体を処理するステップ
を含む、本開示によるIAタンパク質複合体を生成する方法に関する。
a)本開示による宿主細胞を、前記組換え融合タンパク質を生成するために適切な条件下、適切な培養培地中で培養するステップであって、宿主細胞が、本開示による単離されたタンパク質複合体の融合タンパク質単位をコードする全核酸分子を含み、前記IAタンパク質複合体が宿主細胞によって形成されるステップ、
b)前記タンパク質複合体を単離するステップ、および場合によって、
c)前記タンパク質複合体を処理するステップ
を含む、本開示によるIAタンパク質複合体を生成する方法に関する。
別の実施形態では、本開示は、
(a)本開示による複数の宿主細胞を、前記組換え融合タンパク質を生成するために適切な条件下、適切な培養培地中で培養するステップ、
(b)前記生成した融合タンパク質を単離するステップ、
(c)前記タンパク質複合体を生成するために前記融合タンパク質を混合するステップ、
(d)前記生成したタンパク質複合体を単離するステップ、および場合によって、
(e)タンパク質複合体を処理するステップ
を含む、本開示によるタンパク質複合体を生成する方法に関する。
(a)本開示による複数の宿主細胞を、前記組換え融合タンパク質を生成するために適切な条件下、適切な培養培地中で培養するステップ、
(b)前記生成した融合タンパク質を単離するステップ、
(c)前記タンパク質複合体を生成するために前記融合タンパク質を混合するステップ、
(d)前記生成したタンパク質複合体を単離するステップ、および場合によって、
(e)タンパク質複合体を処理するステップ
を含む、本開示によるタンパク質複合体を生成する方法に関する。
一部の有利な実施形態では、異なる抗原を含む複数の異なるHCおよびLC融合ポリペプチドを生成し、好ましくは、病原体の少なくとも2つまたは3つの異なる生活環主要段階において、好ましくは病原体の表面上に提示される、異なるタンパク質から得られる複数の異なる抗原を含むヘテロ多量体IAタンパク質複合体を得るために生成したHCおよびLC融合ポリペプチドを混合した。
上記で論じたように、本開示によれば、組換えタンパク質単位および/またはIAタンパク質複合体全体は任意の所望する系において生成することができる。ベクター構築物および発現系は当技術分野では周知であり、本明細書において提供した組換え融合ポリペプチドの使用を組み入れるために適応させることができる。例えば、トランスジェニック植物作出は公知であり、構築物の作製および植物作出は当技術分野で公知の技術に従って適応させることができる。一部の実施形態では、植物における一時的な発現系が望ましい(国際特許出願番号第10037063A2号参照)。
一般的に、組換えポリペプチドの生成のために、本開示による植物、植物細胞および/または植物組織(例えば、クローン植物、クローン植物細胞、クローン根、クローン根株、スプラウト、発芽実生、植物など)を培養または増殖させるために、当技術分野で公知の標準法を使用することができる。毛根細胞、根細胞株および植物細胞を培養するために、多種多様な培養培地およびバイオリアクターが使用されたことがある(例えば、Rao et al, 2002, Biotechnol Adv, 20 101参照)。
ある種の実施形態では、本明細書による組換えポリペプチドは任意の公知の方法によって生成することができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は植物またはその一部において発現する。タンパク質は、当技術分野で公知の従来の条件および技術に従って単離および精製することができる。これらには、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの方法が含まれる。本発明は、当技術分野で公知であり、本明細書において提供する多種多様な植物発現系のいずれかを使用する、組換えポリペプチド(複数可)の生成物の精製および手頃な規模拡大を含む。
本開示の一部の実施形態では、ワクチン生成物のために組換えポリペプチド(複数可)を単離することが望まれるだろう。本開示によるタンパク質を、それらを発現する植物組織(複数可)またはその一部、例えば、根、根細胞、植物、植物細胞から生成する場合は、植物材料からの部分的または完全な単離のいずれかのために、当技術分野で公知の方法を使用することができる。発現生成物を発現する植物細胞または組織の一部、または全部から発現生成物を単離することが望ましい場合は、任意の利用可能な精製技術を使用することができる。当業者は、幅広い分画および分離手順に精通している(例えば、それぞれ本明細書に参考として組み込んだ、Scopes et al, Protein Purification Principles and Practice, 3 rd Ed, Janson et al, 1993, Protein Purification Principles High Resolution Methods, and Applications, Wiley- VCH, 1998, Springer-Verlag, NY, 1993, and Roe, Protein Purification Techniques, Oxford University Press, 2001参照)。当業者ならば、所望の組換え融合ポリペプチド(複数可)生成物(複数可)を得る方法が抽出によることを理解するだろう。植物材料(例えば、根、葉など)は、残りのバイオマスから所望の生成物を取り出すために抽出し、それによって生成物の濃度および純度を高めることができる。植物は緩衝溶液中で抽出することができる。例えば、植物材料は、例えば、リン酸緩衝液で緩衝されたある量の氷冷水中に、重量で1対1の割合で移すことができる。必要に応じて、プロテアーゼ阻害剤を添加することができる。植物材料は、緩衝溶液中に懸濁しながら激しく混ぜるかまたはすりつぶすことによって破壊し、濾過または遠心分離によって取り出したバイオマスを抽出することができる。溶液中に得られた生成物は、追加ステップによってさらに精製する、または凍結乾燥もしくは沈殿によって乾燥粉末に変換することができる。抽出物は圧搾することによって得ることができる。植物または根は、プレス機での圧搾によって、または密接した間隔のローラーを通すときに潰すことによって抽出することができる。潰した植物または根から得られた流体を集め、当技術分野で周知の方法に従って処理する。圧搾による抽出によって、より濃縮された形態での生成物の放出が可能となる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、限定はしないが、陰イオン交換クロマトグラフィー(Qカラム)または限外濾過を含むクロマトグラフィー法によってさらに精製することができる。Hisタグを含有するポリペプチドは、標準法によってニッケル交換クロマトグラフィーを使用して精製することができる。一部の実施形態では、生成したタンパク質またはポリペプチドは植物組織から単離されず、むしろ生きた植物(例えば、発芽実生)の状態で供給される。一部の実施形態では、植物が食用である場合、発現したタンパク質またはポリペプチドを含有する植物組織は消費のために直接に供給される。したがって、本開示は、発現したタンパク質またはポリペプチドを含有する食用の若い植物バイオマス(例えば、食用発芽実生)を提供する。
ほ乳類細胞には、リポフェクションなどの任意の適切な技術によってトランスフェクトすることができる。あるいは、当業者によく理解されている標準的なリン酸カルシウムトランスフェクションまたはエレクトロポレーションを使用することができる。これらの発現系から生成した組換え抗体および本開示の核酸分子は、好ましくは実質的に純粋かまたは均一な形態で提供される。
組換え抗体は、任意の適切な方法、選択したmABまたはプロテインAセファロースを使用したアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。場合によって、この後、例えば、Superdex200を使用したゲル濾過ステップを行ってもよい。
本開示による抗体様組換え融合タンパク質複合体または抗体様組換え融合タンパク質単位を発現するために、前述した通りに得られたイムノグロブリン軽鎖定常ドメインおよび/またはイムノグロブリン重鎖定常ドメインをコードするDNAは、その遺伝子が転写および翻訳コントロール配列に動作可能に結合するように、発現ベクターに挿入することができる。この文脈では、「動作可能に結合した」という用語は、ベクター内の転写および翻訳コントロール配列がイムノグロブリン遺伝子の転写および翻訳を調節する目的の機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターに連結することを意味する。発現ベクターおよび発現コントロール配列は、使用した発現宿主細胞と適合するように選択する。イムノグロブリン軽鎖定常ドメイン遺伝子および/またはイムノグロブリン重鎖定常ドメイン遺伝子は、別々のベクターに挿入する、あるいは、より典型的には、両遺伝子は同じ発現ベクターに挿入する。イムノグロブリン遺伝子は、標準的方法によって発現ベクターに挿入する。さらに、組換え発現ベクターは、イムノグロブリン軽鎖定常ドメインおよび/またはイムノグロブリン重鎖定常ドメインの宿主細胞からの分泌を容易するシグナルペプチドをコードすることができる。イムノグロブリン軽鎖定常ドメインおよび/またはイムノグロブリン重鎖定常ドメイン遺伝子は、シグナルペプチドがイムノグロブリン鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで動作可能に結合するように、ベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、イムノグロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチドであってもよい。
抗体重鎖および/または軽鎖遺伝子(複数可)に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子(複数可)の発現を制御する調節配列を有する。「調節配列」という用語は、必要ならば、抗体鎖遺伝子(複数可)の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むものとする。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルのような要素に左右され得る。ほ乳類宿主細胞発現のために好ましい調節配列には、ほ乳類細胞における高レベルのタンパク質発現を対象とする、サイトメガロウイルス(CMV)、サルウイルス40(SV40)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP))およびポリオーマウイルスから得られたプロモーターおよび/またはエンハンサーなどのウイルス要素が含まれる。
抗体重鎖および/または軽鎖遺伝子および調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列(例えば、複製開始点)および1つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子などの追加配列を有することができる。選択マーカー遺伝子は、ベクターを導入した宿主細胞の選択を容易にする。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子はG418、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートなどの薬物に対する耐性をベクターが導入した宿主細胞に与える。
選択マーカー遺伝子のさらなる例には、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子(DHFRを含まない宿主細胞においてメトトレキセート選択/増幅を使用するため)、neo遺伝子(G418選択のため)およびグルタミン合成酵素(GS)陰性細胞株(NSOなど)における選択/増幅のためのGSが含まれる。
軽鎖および/または重鎖の発現のために、重鎖および/または軽鎖をコードする発現ベクター(複数可)を標準的技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、DEAE−デキストラントランスフェクションなどによって宿主細胞にトランスフェクトする。
本開示のIAタンパク質複合体またはそれらに含まれる融合タンパク質単位は、理論的に、原核または真核宿主細胞のいずれかにおいて、好ましくは真核細胞において、最も好ましくはほ乳類宿主細胞において、発現することができる。このような細胞が、適切に折り畳まれた免疫学的に活性のある抗体を組み立てて分泌しやすいからである。本発明の組換え抗体の発現のために好ましいほ乳類宿主細胞には、DHFR選択マーカーと共に使用したチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)(DHFR−CHO細胞32を含む)、例えば、前述したような33NSO骨髄腫細胞、COS細胞およびSP2/0細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターをほ乳類宿主細胞に導入する場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現、または、より好ましくは、宿主細胞が増殖する培養培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって生成される。抗体は、標準的精製方法を使用して、宿主細胞および/または培養培地から回収することができる。一部の実施形態では、融合タンパク質単位および/またはIAタンパク質複合体は、プロテインA/G/Lクロマトグラフィーを使用して単離する。
本開示はまた、本開示によるIAタンパク質複合体またはそれらに含まれる組換え融合タンパク質単位に結合する単離された抗体またはそれらの断片を含む抗体組成物に関する。
本開示によれば、「抗体」という用語には、限定はしないが、組換え抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、1本鎖抗体、ヒト化抗体、ミニボディ、ダイアボディ、トリボディならびにFab’、Fab、F(ab’)2および前述したような1ドメイン抗体などの本開示による抗体の抗原結合部分を含む抗体断片が含まれる。
前述したように、本開示は、(i)少なくとも2つの組換え融合タンパク質、(ii)少なくとも2つの異なる抗原、(iii)少なくとも1つの異なるホモオリゴマー化および/またはヘテロオリゴマー化ドメインを含み、前記第1の組換え融合タンパク質が、前記第2の組換え融合タンパク質には存在しない少なくとも1つのホモオリゴマー化またはヘテロオリゴマー化ドメインを含む、ワクチンとして適切な単離されたIAタンパク質複合体に関する。一部の有利な実施形態では、ホモオリゴマー化および/またはヘテロオリゴマー化ドメインは、抗体可変ドメインを含むイムノグロブリンドメイン、T細胞受容体可変および定常ドメイン、コイルドコイルドメイン、ロイシンジッパードメイン、コラーゲン関連トリプルヘリックス、T4バクテリオファージフィブリチンフォルドン(Fd)3量体化ドメイン、PDZおよびPDZ様ドメインからなる群から選択される。
方法および実施例
以下の実施例では、本開示の材料および方法を提供する。これらの実施例は単に例示のためであって、決して本開示を限定するものではないことを理解されたい。本明細書において引用した刊行物、特許および特許出願は全て、その全文が参考として本明細書に組み込まれる。
以下の実施例では、本開示の材料および方法を提供する。これらの実施例は単に例示のためであって、決して本開示を限定するものではないことを理解されたい。本明細書において引用した刊行物、特許および特許出願は全て、その全文が参考として本明細書に組み込まれる。
最初の実施例として、PfMSP119(配列番号1)およびhIgG1(配列番号32))を特徴とする、PfMSP119−HC((配列番号33)と称する融合タンパク質、遺伝子的にhLCカッパ(配列番号50))に結合した主要な有性生殖段階ワクチン候補Pfs25_FKO(配列番号6)を含む融合タンパク質、Pfs25_FKO−LC((配列番号53)ならびにPfs28(配列番号8)およびhLCカッパ(配列番号50))を特徴とする融合タンパク質、Pfs28−LC((配列番号55)の3つの異なる組換え融合ポリペプチドを、それぞれ1:1のHC/LC比に従ってベンサミアナタバゴ(N. benthamiana)植物で同時生成した。精製後、これらの第1のタンパク質を使用して植物におけるそれらの蓄積ならびに2つの別個の発達段階の少なくとも2つの異なるプラスモディウム(plasmodial)抗原を組み込んだ抗体様分子への組立てを検証した。この最初の概念実証を図4および図9に例示的に示し、さらに本明細書で記載した本発明に備わっているコンビナトリアルの可能性を例示する。
後の時点で、数種の異なる重鎖(配列番号34〜49、67〜75、78〜107)および軽鎖融合ポリペプチド鎖(配列番号51〜66)をクローニングして生成した後、熱帯熱マラリア原虫(plasmodium falciparum)寄生生物の3つの主要な発達段階:図2に示した前赤内期、無性生殖血液段階ならびに有性生殖段階を網羅する、2つの異なる重鎖および1つの特定の軽鎖融合ポリペプチド(ARC25−HC1.2(配列番号97)からなる特定の組合せ(本明細書では、以後ARC25と呼ぶ):C末端融合したPfCSP_TSR(配列番号9)とインフレームであるヒトIgG1重鎖(配列番号76)を含有する、修飾したCH3に遺伝子的に結合したPfAMA1_GKO(配列番号23)からなる融合タンパク質;ARC25−HC2.2(配列番号88):ヒトIgG1重鎖(配列番号77)を含有する第2の修飾したCH3にN末端融合したPfRh2a15(配列番号25)を含有する融合タンパク質;および前述のPfs25_FKO−LC(配列番号53))は、ベンサミアナタバゴ(N. benthamiana)植物においてそれぞれ1:1:1のHC1.2/HC2.2/LC比で生成した。精製後、この特定のMIAの組合せを凍結乾燥し、ミョウバンとともに製剤化し、ウサギの免疫化に使用した。得られた免疫血清からの抗体調製物は、異なる方法によって異なる段階の熱帯熱マラリア原虫(plasmodium falciparum)寄生生物に対して免疫原性および阻害効果を示すことが特徴である。
天然のイムノグロブリン重鎖および軽鎖の組立て/組合せ理論に基づいて、多数のヘテロおよびホモポリマーIAタンパク質複合体の混合物(図9)を構成する、2つを超える同一ではないHC(n=>2)融合ポリペプチド単位および2つを超える同一ではないLC(n=>2)融合ポリペプチド単位からなる融合タンパク質カクテルから構成されるIAタンパク質複合体の一例として、PfAMA1_GKO−HC(配列番号48)、MSP3A−HC(配列番号42)およびテトラ_MSP119−HC(配列番号34)と称する3つの異なる組換えHC融合ポリペプチド単位ならびにPfMTRAP_TSR−LC(配列番号57)、Pfs25_FKO−LC(配列番号53)およびPfExp1−LC(配列番号63)と称する3つの異なる組換えLC融合ポリペプチド単位を、等モル比(1:1:1:1:1:1)でベンサミアナタバゴ(N. benthamiana)植物の葉において同時生成した。3つの異なるHCおよび3つの異なるLC融合ポリペプチド単位のこの混合物は、「HexaMix」と呼ばれ、精製後、このカクテルを使用して3つの主な発達段階全ての6つの異なるプラスモディウム(plasmodial)抗原を一緒に組み込んだ植物における6つのポリペプチド単位全ての蓄積を評価する。クーマシー染色PAAゲル分析および6つのHCおよびLC融合ポリペプチド単位内に組み込まれたマラリア抗原に特異的な抗体を利用したイムノブロットに基づいて、成功したプロテインAクロマトグラフィーの結果を図16に例示した。
図16は、「HexaMix」(左側)の精製物の試料のクーマシー染色したポリアクリルアミドゲルおよびプールして透析したE1〜E6溶出画分(右側)を使用した個々の成分のイムノブロット分析を示す。3つのマラリアHC融合ポリペプチド単位(pTRAkc−AMA1GKO−HC−ER、pTRAkc−MSP3A−HC−ER、pTRAkc−テトラ_msp119−hC−ER)および3つのマラリアLC融合ポリペプチド単位(pTRAkc−MTRAP_TSR−LCカッパ、pTRAkc−Pfs25_FKO−LCカッパ、pTRAkc−Exp1−LCカッパ)の発現ベクターを保有する等量のアグロバクテリウム(Agrobacteria)を一緒にして、得られた懸濁液をベンサミアナタバゴ(N. benthamiana)の葉に浸透させた。浸透した葉を浸透して5日後に収穫し、抽出およびその後のプロテインAクロマトグラフィーのために使用した。精製試料を還元SDS試料緩衝液で5倍に希釈し、電気泳動によって分離した(40mA、45分)。ウェスタンブロッティング(100V、60分)後の免疫染色は、示した1次および2次検出抗体を使用して実施した。M:Pageルーラー、L:添加物(処理した植物抽出物)、F:素通り画分、E1−6:中和した溶出画分、Rα−:ウサギ抗−、Mα−:マウス抗−、mAb5.2:PfMSP119に特異的なマウスIgG、mAb4B7:Pfs25に特異的なマウスIgG、GαM/R−AP:ヤギ抗マウス/ウサギ−アルカリホスファターゼ標識。
(今までのところ以前の実施例におけるように)マラリアだけでなく多数の疾患に対するワクチンとして適切な少なくとも3つの組換え融合タンパク質単位を含む単離されたIAタンパク質複合体の一例として、2つの異なる重鎖(MPT64−HC1(配列番号105)、HVR1−HC2(配列番号106))および1つの特定の軽鎖融合ポリペプチド単位(CLCT−LCedlkwa(配列番号107))からなる特定の組合せ(本明細書では以後mDIAと呼ぶ)を、それぞれ1:1:1のHC1/HC2/LC比でベンサミアナタバゴ(N. benthamiana)において生成した。数種の細菌、ウイルスおよび寄生生物抗原を組み込むことによって、唯一の単離されたIAタンパク質複合体、mDIAを使用することによって、結核(MPT64)、C型肝炎(HVR1)、マラリア(CLCT)およびHIV(eldkwa)の疾患をそれぞれ標的とすることができた。植物を浸透して6日後に、浸透した葉を収穫し、抽出するために使用した。図17に例示したように、組換えmDIAタンパク質複合体は、プロテインAクロマトグラフィーによって精製し、精製試料は全てSDS−PAGEおよびウェスタンブロッティングによって分析した。
図17は、多疾患IA精製試料のクーマシー染色したPAAゲルおよび透析した溶出試料E1のイムノブロットを示す。2つのHC融合ポリペプチド単位(pTRAkc−MPT64−HC−ERおよびpTRAkc−HVR1−HC−ER)および1つのLC融合ポリペプチド単位(pTRAkc−CLCT−LCカッパ−ELDEKWA)の発現ベクターを保有するアグロバクテリウム(Agrobacteria)を使用して、ベンサミアナタバゴ(N. benthamiana)の葉に等モル比(1:1:1)で浸透させた。浸透して5日後に葉を収穫し、抽出およびその後のプロテインAクロマトグラフィーのために使用した。精製試料を還元SDS試料緩衝液で5倍に希釈し、電気泳動によって分離した(40mA、45分)。ウェスタンブロッティング(100V、60分)後の免疫染色は、示した1次および2次検出抗体を使用して実施した。M:Pageルーラー、L:添加物(処理した植物抽出物)、F:素通り画分、E1:中和し、透析した溶出画分。MPT64:結核菌(Mycobacterium tuberculosis)から分泌されたタンパク質、HVR1:C型肝炎ウイルス(HCV)抗原E2の超可変領域1、CLCT:PfCelTos−Long_Repeats+PfCSP−TRAPTSRのTSR、ELDKWA:mAb2F5に対して反応するHIV1−gp41のエピトープ、Rα−:ウサギ抗−、Mα−:マウス抗−、mAb5.2:PfMSP119に特異的なマウス−IgG、mAb4B7:Pfs25に特異的なマウス−IgG、GαM/R−AP:ヤギ抗マウス/ウサギ−アルカリホスファターゼ標識。
1.発現構築物のクローニング
表1に挙げた抗原断片配列(配列番号1〜31)は、植物発現(GeneArt)のために最適化した。図3に概略を示したようにマラリア抗原を組み込んでいるヒトHCおよびLC融合ポリペプチドのためのMIA開始ベクターを作製するために、シャトルベクターpUC57−HCgammaおよびPCR鋳型としてpUC57−LCカッパを使用してヒトIgG1定常ドメインおよびヒト軽鎖カッパ定常ドメインの遺伝子情報を増幅した。増幅した配列をNotIおよびBamHI断片として植物発現ベクターpTRAkc−MSP119_3D7−ERHに挿入し、pTRAkc−MSP119_3D7−HC_hIgG1−ERおよびpTRAkc−MSP119_3D7−hLCカッパと呼ぶ植物発現ベクターを生成した。マラリア抗原/リガンド/機能的成分ORFをN末端で交換するために、最後に構築した、記載したMSP119_3D7遺伝子を含有する植物発現MIA開始ベクター(pTRAkc−MSP119_3D7−HC_hIgG1−ERおよびpTRAkc−MSP119_3D7−hLCカッパそれぞれ)をNcoIおよびNotIで処理して、このプレースホルダーマラリア抗原を除去し、以下の抗原/リガンド/機能的成分ORF全てをNcoIおよびNotI消化断片として挿入した。この方法で作製した重鎖融合ポリペプチド構築物は全て、C末端にER検索用のSEKDELタグを有した(Pelham、1990)。インビボおよび植物中における重鎖および軽鎖融合ポリペプチドの理論的組立てのため、後で記載したものは前記C末端タグの追加は行わなかった。pTRAkcプラスミドの詳細な説明は、Boes等(Boes et al., 2011)に報告されている。
表1に挙げた抗原断片配列(配列番号1〜31)は、植物発現(GeneArt)のために最適化した。図3に概略を示したようにマラリア抗原を組み込んでいるヒトHCおよびLC融合ポリペプチドのためのMIA開始ベクターを作製するために、シャトルベクターpUC57−HCgammaおよびPCR鋳型としてpUC57−LCカッパを使用してヒトIgG1定常ドメインおよびヒト軽鎖カッパ定常ドメインの遺伝子情報を増幅した。増幅した配列をNotIおよびBamHI断片として植物発現ベクターpTRAkc−MSP119_3D7−ERHに挿入し、pTRAkc−MSP119_3D7−HC_hIgG1−ERおよびpTRAkc−MSP119_3D7−hLCカッパと呼ぶ植物発現ベクターを生成した。マラリア抗原/リガンド/機能的成分ORFをN末端で交換するために、最後に構築した、記載したMSP119_3D7遺伝子を含有する植物発現MIA開始ベクター(pTRAkc−MSP119_3D7−HC_hIgG1−ERおよびpTRAkc−MSP119_3D7−hLCカッパそれぞれ)をNcoIおよびNotIで処理して、このプレースホルダーマラリア抗原を除去し、以下の抗原/リガンド/機能的成分ORF全てをNcoIおよびNotI消化断片として挿入した。この方法で作製した重鎖融合ポリペプチド構築物は全て、C末端にER検索用のSEKDELタグを有した(Pelham、1990)。インビボおよび植物中における重鎖および軽鎖融合ポリペプチドの理論的組立てのため、後で記載したものは前記C末端タグの追加は行わなかった。pTRAkcプラスミドの詳細な説明は、Boes等(Boes et al., 2011)に報告されている。
マラリア抗原/リガンド/機能的成分の図5で示したような重鎖ポリペプチド融合物へのさらなるC末端付加を可能にするために、第1ステップでは、pTRAkc−MSP119−ERHのベクターをPCR鋳型として使用して、MSP119_3D7(配列番号1)ORFを増幅し、それのN末端にPciI制限部位を備え付けた。同様に、第2のステップでは、テトラ_MSP119−HC(配列番号34)の遺伝子情報を含有するプラスミドをPCRによって濃縮し、C末端にPciI認識配列をもたらした。PciIで実施した消化がNcoIと互換性がある末端を生じることを認識すべきである。最初に言及した単位複製配列をPciI/NotIで処理し、第2のPCR生成物をNcoI/PciI消化し、両切断断片をNcoI/NotIで処理したpTRAkcプラスミドに挿入し、こうして本明細書で以後「PciIベクター」と呼ぶMIA−C開始ベクターpTRAkc−テトラ_MSP119−HC−PciI−MSP119_3D7−ERHを得た。マラリア抗原/リガンド/機能的成分ORFをC末端で交換するために、最後に構築したPciIベクターをさらにPciI/NotI処理して、MSP119_3D7(配列番号1)のこのプレースホルダーマラリア抗原を確実に除去し、以下の抗原/リガンド/機能的成分ORF全てをNcoIおよびNotI消化断片として挿入した。遺伝子的なC末端付加による抗原レパートリー伸長について記載した図6A+Bは、2段階を網羅する候補テトラ_MSP119−HC−CSPTSR−ERHを例として示す。含まれるマラリア抗原全ての利用しやすさは、特異的な抗体を使用してELISAおよびSPRによって実証した。
コンビナトリアル能/潜在力をさらに増強するため、および図7Aで概略を示したような2つの異なる(マラリア)重鎖融合ポリペプチドが静電的撹拌効果によってホモ二量体化せず、ほぼヘテロ二量体のみを形成できるようにするために、MSP119_3D7−HC(配列番号33)およびAMA1_GKO−HC(配列番号48)の発現ベクターを、ヒトIgG1のCH3部分の2つの特異的なアミノ酸位置それぞれにおいてPCR部位特異的変異誘発によって遺伝子的に修飾した。MSP119_3D7−HC(配列番号33)のE356およびD399の負電荷残基対を正電荷Lysと交換してMSP119_3D7−HC1.2−ER(配列番号78)を生成した。AMA1_GKO−HC(配列番号48)のK392およびK409位の正電荷残基は、同様に負電荷Aspに転換し、発現ベクターAMA1_GKO−HC2.2(配列番号85)を作製した。適用したアミノ酸置換は、野生型残基のKabat(Kabat et al., 1991)/結晶構造番号付けシステムおよび1文字コードでの変異残基を使用した位置に従って指定している。適用した変化を検証し、ホモおよびヘテロ二量体の形成収率を評価するために、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施し、予想に合致する結果を図7B+Cに示す。前述の電荷対修飾を含むMIAおよびMIA−C重鎖ポリペプチドをさらに作製するために、発現ベクターMSP119_3D7−HC1.2−ER(配列番号78)およびAMA1_GKO−HC2.2(配列番号85)ならびに選択したマラリア抗原HC融合ポリペプチドのプラスミドをKasI/NsiI(重鎖定常ドメイン内のシングルカッター)処理した。電荷対変異を有するIgG1定常ドメインは元の未修飾物と交換し、Fcヘテロ二量体化のために修飾したCH3領域を有するMIA(配列番号76〜92)およびMIA−C(配列番号93〜104)構築物を多数生じた。
組換え遺伝子構築物は全て、配列決定によって確認し、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)株GV3101中に導入した(pMP90RK)。組換えアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)は、以前に記載されたように培養した(Vaquero et al., 1999, Sack et al., 2007)。培養物の光学密度(OD)を決定し、発現株をサイレンシング抑制因子p19を有するアグロバクテリウム(agrobacterium)株(Plant Bioscience Limited、Norwich、England)と5:1の比で混合し、最終ODを1とした。
図8は、異なるMIA構築物形式の概略図であり、図13A+Bは、ヒトワクチン接種のために望ましい、最適化して伸長したARC25ベースのMIAの概念を示す。
2.一時的な発現
各構築物のために、それぞれの発現カセットを含有する組換え細菌を別々に培養した。ロックウール中で成長した6〜8週齢のベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)植物に手作業または真空で注射する前に、(マラリア)重鎖および軽鎖融合ポリペプチドを有する発現株を1:1(:1)比で混合して最終ODを1とした(サイレンシング抑制因子p19を全浸透培地の5:1の比で供給した)。浸透したベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)植物を16時間の光周期で、22℃で5日間インキュベートした。植物葉組織をタンパク質抽出および精製のために収穫した。
各構築物のために、それぞれの発現カセットを含有する組換え細菌を別々に培養した。ロックウール中で成長した6〜8週齢のベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)植物に手作業または真空で注射する前に、(マラリア)重鎖および軽鎖融合ポリペプチドを有する発現株を1:1(:1)比で混合して最終ODを1とした(サイレンシング抑制因子p19を全浸透培地の5:1の比で供給した)。浸透したベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)植物を16時間の光周期で、22℃で5日間インキュベートした。植物葉組織をタンパク質抽出および精製のために収穫した。
3.タンパク質抽出
葉組織を乳鉢および乳棒を使用して液体窒素中で破砕し、可溶性タンパク質を葉材料1g当たり抽出緩衝液(2硫化ナトリウム10mMを供給したPBS pH7.4)2mlを用いて抽出した。不溶性物質を遠心分離(16000×g、20分、4℃)によって除去した。他の植物宿主細胞成分を効率的に除去するために塩追加(NaCl500mMを含むPBS、pH7.4)およびpHシフト(最高pH8.0)を、マラリアHCおよびLC融合ポリペプチド全てについて実施した。その後、不溶性物質を2回目の遠心分離(16000×g、20分、4℃)およびその後の一連の濾過ステップ(Miracloth,Merck Darmstadt,Germany;Whatman Klariflex 0.22μmPESフィルター単位、GE Healthcare、Germany)によって除去した。
葉組織を乳鉢および乳棒を使用して液体窒素中で破砕し、可溶性タンパク質を葉材料1g当たり抽出緩衝液(2硫化ナトリウム10mMを供給したPBS pH7.4)2mlを用いて抽出した。不溶性物質を遠心分離(16000×g、20分、4℃)によって除去した。他の植物宿主細胞成分を効率的に除去するために塩追加(NaCl500mMを含むPBS、pH7.4)およびpHシフト(最高pH8.0)を、マラリアHCおよびLC融合ポリペプチド全てについて実施した。その後、不溶性物質を2回目の遠心分離(16000×g、20分、4℃)およびその後の一連の濾過ステップ(Miracloth,Merck Darmstadt,Germany;Whatman Klariflex 0.22μmPESフィルター単位、GE Healthcare、Germany)によって除去した。
4.プロテインA精製
目的のタンパク質の組合せは全て、プロテインAクロマトグラフィー(GE Healthcare、Germany)を使用して精製した。標的タンパク質は、プロテインAを負荷したキレーティングセファロースで捕捉した。NaCl500mMを含むPBSによる洗浄ステップ後、pH8.0に調整し、標的タンパク質はddH2Oに溶解したグリシン100mM、pH3.0を使用して溶出した。その後の中和は、溶出体積の1/10の1M TRIS pH8.8で達成した。
目的のタンパク質の組合せは全て、プロテインAクロマトグラフィー(GE Healthcare、Germany)を使用して精製した。標的タンパク質は、プロテインAを負荷したキレーティングセファロースで捕捉した。NaCl500mMを含むPBSによる洗浄ステップ後、pH8.0に調整し、標的タンパク質はddH2Oに溶解したグリシン100mM、pH3.0を使用して溶出した。その後の中和は、溶出体積の1/10の1M TRIS pH8.8で達成した。
5.固定した金属イオンクロマトグラフィー(IMAC)
C末端ヘキサヒスチジンおよびER検索タグ用のC末端SEKDELタグを特徴とする単一のマラリア抗原/リガンド/機能的ポリペプチド成分(異なるMIA構築物を作製するために使用した(配列番号1〜31))は、固定した金属イオンクロマトグラフィー(IMAC)によって精製した。抽出物のpHをpH8.0に調整し、NaClを最終濃度500mMまで添加した後、標的タンパク質をニッケルを負荷したキレーティングセファロースで捕捉した。pH8.0に調整したPBSによる洗浄ステップ後、標的タンパク質はPBS、pH8.0に溶解したイミダゾール15mM、50mMおよび250mMのステップ勾配で溶出した。
C末端ヘキサヒスチジンおよびER検索タグ用のC末端SEKDELタグを特徴とする単一のマラリア抗原/リガンド/機能的ポリペプチド成分(異なるMIA構築物を作製するために使用した(配列番号1〜31))は、固定した金属イオンクロマトグラフィー(IMAC)によって精製した。抽出物のpHをpH8.0に調整し、NaClを最終濃度500mMまで添加した後、標的タンパク質をニッケルを負荷したキレーティングセファロースで捕捉した。pH8.0に調整したPBSによる洗浄ステップ後、標的タンパク質はPBS、pH8.0に溶解したイミダゾール15mM、50mMおよび250mMのステップ勾配で溶出した。
6.ウサギの免疫
精製したポリペプチド混合物ARC25(配列番号97、88、53)を生理食塩水1.150μLに導入して200μg/mlを含有する溶液を調製し、次に、ALPHA1−4LSC装置(Christ、Osterode am Harz、Germany)を用いて陰圧0.310mbarを72時間加えて直接凍結乾燥した。凍結乾燥したARC25試料をBiogenes(Berlin、Germany)に送り、ウサギの免疫のために使用した。動物にワクチン接種する前に、この凍結乾燥混合物を解凍し、アジュバントAlhydrogel(登録商標)2%(Brenntag Biosector、Frederikssund、Denmark)1.150μLでさらに希釈し、相対的ARC25濃度を100μg/mLにした。この製剤を使用して、0、28および56日目に、製剤化したARC25 500μL(ARC25 50μg/免疫ステップの用量となる)を用いてウサギを免疫した。70日目、最後の追加免疫の2週間後に、ワクチン接種した動物の最終採血血清を入手し、その後の実験のために使用した。
精製したポリペプチド混合物ARC25(配列番号97、88、53)を生理食塩水1.150μLに導入して200μg/mlを含有する溶液を調製し、次に、ALPHA1−4LSC装置(Christ、Osterode am Harz、Germany)を用いて陰圧0.310mbarを72時間加えて直接凍結乾燥した。凍結乾燥したARC25試料をBiogenes(Berlin、Germany)に送り、ウサギの免疫のために使用した。動物にワクチン接種する前に、この凍結乾燥混合物を解凍し、アジュバントAlhydrogel(登録商標)2%(Brenntag Biosector、Frederikssund、Denmark)1.150μLでさらに希釈し、相対的ARC25濃度を100μg/mLにした。この製剤を使用して、0、28および56日目に、製剤化したARC25 500μL(ARC25 50μg/免疫ステップの用量となる)を用いてウサギを免疫した。70日目、最後の追加免疫の2週間後に、ワクチン接種した動物の最終採血血清を入手し、その後の実験のために使用した。
ARC25に加えて、同量のAMA1_GKO(配列番号23)およびPfs25_FKO(配列番号6)を特徴とする、本明細書で以後BSSCと称した対照を、ARC25ワクチン組成物に含め、前述のようにARC25と同様に調製し使用した。
7.ウサギ血清の抗体のプロテインA精製
免疫処置後、ウサギ抗血清から得られた抗体を、プロテインAクロマトグラフィーによって精製した。簡単に説明すると、血清試料をPBSで1:5希釈し、精製前に0.45μmフィルターで濾過した。抗体をプロテインA樹脂(GE Healthcare)上に結合させ、結合していない不純物をPBS pH7.4による洗浄ステップによって除去した。結合した抗体をグリシン 100mM pH3.0で溶出し、溶出体積の1/10のTRIS 1M pH8.8で直接中和した。HEPES 25mMを含有し、L−グルタミン(E15−041、PAA)を含有しないRPMI1640に対する緩衝液交換を、HiPrep脱塩カラムを使用して実施し、抗体を、遠心濃縮装置(VivaSpin15R 30.000MWCO、Sartoruis)によって、12mg/mlを超える濃度に濃縮し、滅菌濾過した。抗体を4℃で保存した。
免疫処置後、ウサギ抗血清から得られた抗体を、プロテインAクロマトグラフィーによって精製した。簡単に説明すると、血清試料をPBSで1:5希釈し、精製前に0.45μmフィルターで濾過した。抗体をプロテインA樹脂(GE Healthcare)上に結合させ、結合していない不純物をPBS pH7.4による洗浄ステップによって除去した。結合した抗体をグリシン 100mM pH3.0で溶出し、溶出体積の1/10のTRIS 1M pH8.8で直接中和した。HEPES 25mMを含有し、L−グルタミン(E15−041、PAA)を含有しないRPMI1640に対する緩衝液交換を、HiPrep脱塩カラムを使用して実施し、抗体を、遠心濃縮装置(VivaSpin15R 30.000MWCO、Sartoruis)によって、12mg/mlを超える濃度に濃縮し、滅菌濾過した。抗体を4℃で保存した。
8.SDS−PAGEおよびイムノブロット分析
タンパク質を、自分で注入したSDS(8%、12%もしくは15%)または市販の4〜12%(w/v)勾配ゲル(Invitrogen)で還元および/または非還元条件下で分離し、Fairbanksプロトコール(Wong et al. 2000)に従ってクーマシーR−250で染色した。分離したタンパク質をニトロセルロース膜(Whatman、Dassel、Germany)上にブロッティングし、PBSに溶解した5%(w/v)脱脂粉乳を用いてブロックした。MIAは、いずれもアルカリホスファターゼで標識した検出抗体ヤギ抗ヒトFcおよびヤギ抗ヒトLCカッパで探索した。力価決定のために望ましい単一のマラリア抗原/リガンド/機能的ポリペプチド成分は、一次抗体として1:5000希釈したウサギ抗His6タグで探索した。この場合、適用した二次抗体は、アルカリホスファターゼ標識したヤギ抗ウサギH+Lであった。バンドは、NBT/BCIP(基質緩衝液:NaCl 150mM、MgCl2 2mM、Tris−HCl 50mM、pH9.6中、1mg/mL)で視覚化した。インキュベーションステップの間に、膜を0.05%(v/v)Tween−20を補給したPBSで3回洗浄した。
タンパク質を、自分で注入したSDS(8%、12%もしくは15%)または市販の4〜12%(w/v)勾配ゲル(Invitrogen)で還元および/または非還元条件下で分離し、Fairbanksプロトコール(Wong et al. 2000)に従ってクーマシーR−250で染色した。分離したタンパク質をニトロセルロース膜(Whatman、Dassel、Germany)上にブロッティングし、PBSに溶解した5%(w/v)脱脂粉乳を用いてブロックした。MIAは、いずれもアルカリホスファターゼで標識した検出抗体ヤギ抗ヒトFcおよびヤギ抗ヒトLCカッパで探索した。力価決定のために望ましい単一のマラリア抗原/リガンド/機能的ポリペプチド成分は、一次抗体として1:5000希釈したウサギ抗His6タグで探索した。この場合、適用した二次抗体は、アルカリホスファターゼ標識したヤギ抗ウサギH+Lであった。バンドは、NBT/BCIP(基質緩衝液:NaCl 150mM、MgCl2 2mM、Tris−HCl 50mM、pH9.6中、1mg/mL)で視覚化した。インキュベーションステップの間に、膜を0.05%(v/v)Tween−20を補給したPBSで3回洗浄した。
図10:本実施例による精製組換えタンパク質ARC25のSDS−PAGE分析。ARC25は還元条件下で分離した。図10は、熱帯熱マラリア原虫(plasmodium falciparum)の主要な発達段階を網羅するARC25および含まれる成分の概略を示した図である。図11は、ARC25のクーマシー染色および脱染色したSDS−PAGEゲルを示しており、1番目はプロテインA後、2番目はサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)後である。分子量標準物は左側に示されている。
図11の略語は:
M:PAGEルーラーとして予め染色したタンパク質ラダー(Thermo Scientific)
L:添加物(処理した抽出物)
F:素通り画分
W:洗浄(1×PBS、pH7.4)
E1〜E6:標的タンパク質(複数可)を含有するプロテインA溶出画分
A7−A11:標的タンパク質(複数可)を含有するSEC溶出画分
HC1:ARC25−HC1.2(配列番号97)
HC2:ARC25−HC2.2(配列番号88)
LC:Pfs25_FKO−LC(配列番号53)
M:PAGEルーラーとして予め染色したタンパク質ラダー(Thermo Scientific)
L:添加物(処理した抽出物)
F:素通り画分
W:洗浄(1×PBS、pH7.4)
E1〜E6:標的タンパク質(複数可)を含有するプロテインA溶出画分
A7−A11:標的タンパク質(複数可)を含有するSEC溶出画分
HC1:ARC25−HC1.2(配列番号97)
HC2:ARC25−HC2.2(配列番号88)
LC:Pfs25_FKO−LC(配列番号53)
9.ELISA
免疫処置のために使用したタンパク質ARC25(配列番号97、88、53)に対する血清における特異的抗体(IgG)力価、ならびに単一のマラリア抗原/リガンド/機能的ポリペプチド成分全てに対する反応性を、100ng/mlの濃度の組換えタンパク質でコーティングした高結合性96ウェルプレート(Greiner bio−one、Frickenhausen、Germany)を使用してELISAによって測定した。室温で1時間インキュベーションした後、ウェルをPBSに溶かした5%(w/v)脱脂粉乳でブロックし、再度室温で1時間インキュベートした。血清および免疫前血清(陰性対照として、および差し引いたブランクとして)の段階希釈を96ウェルプレートに適用し、室温で1時間インキュベートした。抗原が結合した抗体をHRPO標識ヤギ抗ウサギIgG Fcで探索し、30分後にABTS基質を用いて405nmで検出した。各ステップの間に、プレートを0.05%(v/v)Tween−20を補給したPBSで3回洗浄した。特異的IgG力価は、免疫前血清の値の1.5倍のOD405nmを生じる希釈として規定した。
免疫処置のために使用したタンパク質ARC25(配列番号97、88、53)に対する血清における特異的抗体(IgG)力価、ならびに単一のマラリア抗原/リガンド/機能的ポリペプチド成分全てに対する反応性を、100ng/mlの濃度の組換えタンパク質でコーティングした高結合性96ウェルプレート(Greiner bio−one、Frickenhausen、Germany)を使用してELISAによって測定した。室温で1時間インキュベーションした後、ウェルをPBSに溶かした5%(w/v)脱脂粉乳でブロックし、再度室温で1時間インキュベートした。血清および免疫前血清(陰性対照として、および差し引いたブランクとして)の段階希釈を96ウェルプレートに適用し、室温で1時間インキュベートした。抗原が結合した抗体をHRPO標識ヤギ抗ウサギIgG Fcで探索し、30分後にABTS基質を用いて405nmで検出した。各ステップの間に、プレートを0.05%(v/v)Tween−20を補給したPBSで3回洗浄した。特異的IgG力価は、免疫前血清の値の1.5倍のOD405nmを生じる希釈として規定した。
10.免疫蛍光アッセイ(IFA)
熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)寄生生物の異なる発達段階を視覚化するために、間接IFAを以前に記載されたように実施した(Pradel et al, 2004)。熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)株NF54の無性生殖段階およびガメトサイトの培養は、以前に記載されたように実施した(Ifediba and Vanderberg, 1981)。寄生生物調製物を8ウェル診断用スライド(Thermo scientific)上で風乾させ、−80℃のメタノールを用いて10分間固定化した。非特異的結合をブロックし膜を透過処理するために、固定した細胞を、PBSに溶かした0.5%BSA、0.01%サポニン中で、室温で30分間、続いてPBSに溶かした0.5%BSA、0.01%サポニン、1%中性ヤギ血清中で、室温で30分間インキュベートした。ヤギ血清を含まないブロッキング溶液で希釈したARC25に特異的な精製抗体で、試料を37℃で1時間インキュベートした。精製した抗体を50μg/mlの最終濃度で使用した。異なる熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)生活環段階の対比染色のために、PfCSP_TSR(スポロザイトの対比染色)、MSP119(シゾントの対比染色)またはPfs25(マクロガメートおよび接合子の対比染色)の単一の熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)抗原断片に特異的なマウス抗血清はFraunhofer IMEによって作製され、20μg/mLの最終濃度で使用した。ヤギ血清を含まないブロッキング溶液中において蛍光をコンジュゲートしたAlexa Fluor488ヤギ抗マウス(Invitrogen#A−11001;1:100)またはAlexa Fluor594(JIR 111−585−144;1:200)ヤギ抗ウサギ抗体で細胞をインキュベートすることによって、一次抗体を視覚化した。核を強調するために、試料を0.01%サポニンを供給したPBSに溶かしたヘキスト33342(10μg/mL)でインキュベートした。最後に、細胞を抗退色溶液ProLong(登録商標)Gold Antifade Mountant(Invitrogen #P36934)とともにマウントし、マニキュア液で密閉した。ライカTCS−SP8スペクトル共焦点顕微鏡を使用して、標識された細胞の検査および画像の読み取りを実施した。本開示によるARC25に対して生じた精製ウサギ抗体を用いた、異なる熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)段階の免疫蛍光アッセイの例を図12に例示する。図の各部分では、左側にARC25に対して生じた精製ウサギpAbによる染色(Alexa594で標識した抗ウサギpAbで検出)を示し、左から2番目に陽性対照染色(マウス対照pAb、Alexa488で標識した抗マウスpAbで検出)、左から3番目にヘキスト核染色を示す。一番右側に混合して重ね合わせた画像を示す。陰性対照(免疫前のウサギ血清を使用して実施)は、最後の行に示す。
熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)寄生生物の異なる発達段階を視覚化するために、間接IFAを以前に記載されたように実施した(Pradel et al, 2004)。熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)株NF54の無性生殖段階およびガメトサイトの培養は、以前に記載されたように実施した(Ifediba and Vanderberg, 1981)。寄生生物調製物を8ウェル診断用スライド(Thermo scientific)上で風乾させ、−80℃のメタノールを用いて10分間固定化した。非特異的結合をブロックし膜を透過処理するために、固定した細胞を、PBSに溶かした0.5%BSA、0.01%サポニン中で、室温で30分間、続いてPBSに溶かした0.5%BSA、0.01%サポニン、1%中性ヤギ血清中で、室温で30分間インキュベートした。ヤギ血清を含まないブロッキング溶液で希釈したARC25に特異的な精製抗体で、試料を37℃で1時間インキュベートした。精製した抗体を50μg/mlの最終濃度で使用した。異なる熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)生活環段階の対比染色のために、PfCSP_TSR(スポロザイトの対比染色)、MSP119(シゾントの対比染色)またはPfs25(マクロガメートおよび接合子の対比染色)の単一の熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)抗原断片に特異的なマウス抗血清はFraunhofer IMEによって作製され、20μg/mLの最終濃度で使用した。ヤギ血清を含まないブロッキング溶液中において蛍光をコンジュゲートしたAlexa Fluor488ヤギ抗マウス(Invitrogen#A−11001;1:100)またはAlexa Fluor594(JIR 111−585−144;1:200)ヤギ抗ウサギ抗体で細胞をインキュベートすることによって、一次抗体を視覚化した。核を強調するために、試料を0.01%サポニンを供給したPBSに溶かしたヘキスト33342(10μg/mL)でインキュベートした。最後に、細胞を抗退色溶液ProLong(登録商標)Gold Antifade Mountant(Invitrogen #P36934)とともにマウントし、マニキュア液で密閉した。ライカTCS−SP8スペクトル共焦点顕微鏡を使用して、標識された細胞の検査および画像の読み取りを実施した。本開示によるARC25に対して生じた精製ウサギ抗体を用いた、異なる熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)段階の免疫蛍光アッセイの例を図12に例示する。図の各部分では、左側にARC25に対して生じた精製ウサギpAbによる染色(Alexa594で標識した抗ウサギpAbで検出)を示し、左から2番目に陽性対照染色(マウス対照pAb、Alexa488で標識した抗マウスpAbで検出)、左から3番目にヘキスト核染色を示す。一番右側に混合して重ね合わせた画像を示す。陰性対照(免疫前のウサギ血清を使用して実施)は、最後の行に示す。
図12:熱帯熱マラリア原虫(P.falciparum)の前赤内期段階および無性生殖血液段階の、ARC25およびBSSCに対して作製したウサギ免疫血清による免疫標識。IFAは、メタノール固定したスポロゾイトおよび血液段階シゾントについて、ARC25またはBSSCのいずれかで免疫して70日後に収集したウサギ血清試料のプロテインA精製ウサギIgGを使用して実施した。示した例は、2つのウサギIgG試料(ウサギ24701番(ARC25について)、ウサギ24704番)で免疫標識したスポロゾイトの全表面ならびにシゾントによって封入されたメロゾイトの頂端極である(赤)。スポロゾイト表面を検出するためにマウス抗PfCSP_TSRモノクローナル抗体6.75Mを適用し、メロゾイト原形質膜を対比染色するためにマウス抗PfMSP119抗血清を使用し(緑)、寄生生物の核はHoechst 33342で強調した(青)。免疫したウサギの精製したIgG画分を15mg/mLの濃度で使用し、天然の熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)表面への結合を評価した(赤)。
11.スポロゾイト滑走運動(SGM)、肝細胞通過(HCT)およびスポロゾイト侵入および肝臓段階での発達(SILSD)の阻害
滑走運動および細胞通過アッセイは、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)スポロゾイトの滑走能力および肝細胞通過能力に対する免疫したウサギから得られた精製IgG画分の効果を試験するために実施した。いずれのアッセイも、Behet et al. (2014)に記載されたものを少し変更して実施した。滑走運動アッセイでは、抗CSPmAb3SP2 30μgで予めコーティングした96ウェルのガラス底黒色プレートを使用してshedCSPタンパク質を捕捉した。10000個の熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)スポロゾイトを、ウサギIgG((抗ARC25:プールしたARC25試料;抗BSSC)10mgと共に3連で予めインキュベートし、30分間氷上にプールし、次いで3SP2コーティングしたスライド上に移した。37℃で5%CO2中で90分インキュベートした後、スポロゾイトを洗浄除去した。滑走痕跡を4%パラホルムアルデヒド(PFA)でRTで20分間固定し、抗CSPビオチン、続いてストレプトアビジン−AF594を用いて染色した。1000倍の倍率で蛍光顕微鏡によって滑走痕跡を視覚化し、画像をFIJIイメージングソフトウェアを用いて分析した。
滑走運動および細胞通過アッセイは、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)スポロゾイトの滑走能力および肝細胞通過能力に対する免疫したウサギから得られた精製IgG画分の効果を試験するために実施した。いずれのアッセイも、Behet et al. (2014)に記載されたものを少し変更して実施した。滑走運動アッセイでは、抗CSPmAb3SP2 30μgで予めコーティングした96ウェルのガラス底黒色プレートを使用してshedCSPタンパク質を捕捉した。10000個の熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)スポロゾイトを、ウサギIgG((抗ARC25:プールしたARC25試料;抗BSSC)10mgと共に3連で予めインキュベートし、30分間氷上にプールし、次いで3SP2コーティングしたスライド上に移した。37℃で5%CO2中で90分インキュベートした後、スポロゾイトを洗浄除去した。滑走痕跡を4%パラホルムアルデヒド(PFA)でRTで20分間固定し、抗CSPビオチン、続いてストレプトアビジン−AF594を用いて染色した。1000倍の倍率で蛍光顕微鏡によって滑走痕跡を視覚化し、画像をFIJIイメージングソフトウェアを用いて分析した。
HCTについては、肝細胞株HC−04細胞を96ウェル透明底黒色プレートに播種し、コンフルエントになるまで増殖させた。ウェル当たり50000個の熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)スポロゾイトをウサギIgG10mgと30分間予めインキュベートし、次いでローダミン−デキストランの存在下で肝細胞に重層した。3時間インキュベートした後、スポロゾイトを洗浄除去した。スポロゾイト通過の結果としてのローダミン−デキストランの摂取は、プレートリーダーで蛍光シグナルを測定することによって定量した(励起:540/35nm、放射:600/40nm)。
免疫したウサギから精製してプールしたIgG画分の、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)スポロゾイトがヒト初代肝細胞に感染する能力に対する効果を試験するために、SILSDアッセイをvan Schaijk et al. (2008)に従って実施した。50000個の凍結保存したヒト初代肝細胞を96ウェル透明底黒色プレートに播種し、毎日2日間リフレッシュしたので、わずかな適応が実施された。唾液腺スポロゾイトを熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)NF54に感染した蚊から単離した。ウェル当たり50000個のスポロゾイトをIgGと30分間氷上で予めインキュベートして、その後肝細胞上に移した。3時間後、侵入してないスポロゾイトを洗浄除去し、肝細胞を毎日6日間リフレッシュした。細胞を洗浄し、細胞内を固定して染色した。ビヒクルおよび3SP2試料は、DAPIおよびウサギ抗PfHSP70で染色した。ビヒクルおよびウサギIgG試料は、DAPIならびにPfBip(結合タンパク質、ERマーカー)、PfExp1(輸送されたタンパク質1)、PfHSP70(熱ショックタンパク質70)およびPfMSP1(メロゾイト特異的タンパク質1)に特異的なマウスmAbで染色した。陽性に染色した感染肝細胞の数は、自動顕微鏡によって、25領域で100倍の倍率でFIJIイメージ分析ソフトウェアを使用して判定した。本開示によるARC25に対して生じた精製ウサギ抗体のSGM、HCTおよびSILSDアッセイの結果を以下の表8に挙げる。
12.成長阻害アッセイ(GIA)
プラスモジウム属(Plasmodium)寄生生物に対する成長阻害の可能性を、標準化された方法を使用して実施した。熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)寄生生物株3D7A(MR4によって提供された)を、37℃および5%CO2、5%O2および90%N2で、10%AlbumaxII(Invitrogen)、Hepes 25mM、ゲンタマイシン12μg/mlおよびヒポキサンチン100μΜを補給したRPMI培地中において、4%のヘマトクリットで、5%未満の寄生虫血症の培養で維持した。培養備置を日常的な作業で維持し、ギムザ染色によって寄生虫血症を推定した。アッセイに使用した赤血球は15人のマラリア無感作血液ドナーから混合し、それらは3週間以内のものだった。赤血球はSAG−マンニトール中、4℃で保存した。寄生生物を、侵襲後1〜16時間の時間枠内で10%ソルビトール処理によって同調させた。アッセイには、侵襲後36〜40時間の高度に同調した培養物のみを使用した。
プラスモジウム属(Plasmodium)寄生生物に対する成長阻害の可能性を、標準化された方法を使用して実施した。熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)寄生生物株3D7A(MR4によって提供された)を、37℃および5%CO2、5%O2および90%N2で、10%AlbumaxII(Invitrogen)、Hepes 25mM、ゲンタマイシン12μg/mlおよびヒポキサンチン100μΜを補給したRPMI培地中において、4%のヘマトクリットで、5%未満の寄生虫血症の培養で維持した。培養備置を日常的な作業で維持し、ギムザ染色によって寄生虫血症を推定した。アッセイに使用した赤血球は15人のマラリア無感作血液ドナーから混合し、それらは3週間以内のものだった。赤血球はSAG−マンニトール中、4℃で保存した。寄生生物を、侵襲後1〜16時間の時間枠内で10%ソルビトール処理によって同調させた。アッセイには、侵襲後36〜40時間の高度に同調した培養物のみを使用した。
寄生生物、新鮮なRBCおよび抗体を、だいたい0.1%の最終寄生虫血症および2%の最終ヘマトクリットを有するように、96ウェルプレート中で混合した。バックグラウンド対照のために、寄生生物を含まないRBCのみを寄生生物と同一条件下で培養して維持した。添加せずに熱帯熱マラリア原虫(plasmodium falciparum)寄生生物を培養することによって、寄生生物成長をモニタリングするための成長制御を実施した。試料は全て3連で測定した。陰性対照として、マラリア無感作ウサギおよびヒト血漿を得て、精製した抗体を試験した。完全な侵襲阻害の陽性対照として、EDTA(最終濃度4mM)およびBG98ウサギ抗AMA−1ポリクローナル抗体を使用した。プレートは、37℃、95%湿度、5%CO2、5%O2および90%N2で40から44時間インキュベートした。収集時に、冷PBSを用いて1回ウェルを洗浄し、凍結した。寄生生物成長はMalstat(商標)アッセイ32によって推定した。吸光度は分光光度計を使用して655nmの波長で30分後に測定した。阻害能は以下の式によって推定した:
阻害%=100%−((A655 IgG試料−A655 RBC対照))/((A655シゾント対照−A655 RBC対照))*100%
阻害%=100%−((A655 IgG試料−A655 RBC対照))/((A655シゾント対照−A655 RBC対照))*100%
上記のように、成長阻害アッセイは、抗体の阻害の可能性を評価するための標準のインビトロアッセイである。アッセイは、無性生殖段階/血液段階をシミュレートする。ARC25およびBSSCに対して生じた精製ウサギ抗体のGIA結果を表5に挙げる。
13.ルミネセント標準膜栄養アッセイ(TropIQ Health Science、Nijmegen、Netherlands)
熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)段階Vガメトサイトがアンフェレス・ステファンシ(Anopheles stephensi)蚊に感染する能力に対する免疫したウサギから精製したIgG画分の効果を評価するために、膜栄養アッセイを実施した(Bishop and Gilchrist, 1946)。簡単に説明すると、試験試料を熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)株NF54−hsp70−lucの段階Vガメトサイト、ヒト赤血球細胞と一緒にして、アンフェレス・ステファンシ(Anopheles stephensi)蚊に給餌した。実験は活性補体の存在下で実施した。8日後、個々の蚊におけるルシフェラーゼ発現を分析した。
熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)段階Vガメトサイトがアンフェレス・ステファンシ(Anopheles stephensi)蚊に感染する能力に対する免疫したウサギから精製したIgG画分の効果を評価するために、膜栄養アッセイを実施した(Bishop and Gilchrist, 1946)。簡単に説明すると、試験試料を熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)株NF54−hsp70−lucの段階Vガメトサイト、ヒト赤血球細胞と一緒にして、アンフェレス・ステファンシ(Anopheles stephensi)蚊に給餌した。実験は活性補体の存在下で実施した。8日後、個々の蚊におけるルシフェラーゼ発現を分析した。
・ 試料希釈当たり1回投与、試料/給餌当たり蚊24匹のルミネセンス強度を分析(N=1、n=24)
・ ルミネセンスバックグラウンドレベルを決定するために感染していない蚊24匹を分析
・ 2連の対照:PBSビヒクルおよび伝染をブロックするmAb85RF45.1、IC90
・ ルミネセンスバックグラウンドレベルを決定するために感染していない蚊24匹を分析
・ 2連の対照:PBSビヒクルおよび伝染をブロックするmAb85RF45.1、IC90
データ分析および報告
・ データは、ルミネセンス強度として表現する(秒当たりのカウント(cps))
・ 報告したデータには、分析した蚊の数、ビヒクル対照における蚊当たりのオーシストの数、オーシスト強度およびオーシスト有病率、生データが含まれる。
・ データは、ルミネセンス強度として表現する(秒当たりのカウント(cps))
・ 報告したデータには、分析した蚊の数、ビヒクル対照における蚊当たりのオーシストの数、オーシスト強度およびオーシスト有病率、生データが含まれる。
アッセイ品質基準
・陰性対照給餌のうちの少なくとも1つにおける70%オーシスト有病率
・給餌の少なくとも50%で20回の観察(蚊)を行い、最少でも各給餌について15回観察した。
・IC90の陽性対照mAb85RF45.1によるルシフェラーゼシグナルの少なくとも75%阻害
・陰性対照給餌のうちの少なくとも1つにおける70%オーシスト有病率
・給餌の少なくとも50%で20回の観察(蚊)を行い、最少でも各給餌について15回観察した。
・IC90の陽性対照mAb85RF45.1によるルシフェラーゼシグナルの少なくとも75%阻害
2つのPBS餌を給餌された蚊は、1匹当たり平均42.4のオーシストを示し、これは秒当たり約5755ルミネセンスカウントに対応した。mAb85RF45.1 5μg/mlの餌を給餌した蚊は、秒当たり平均約292ルミネセンスカウントを示した。
様々な濃度のNRSを含有する血液食を給餌した蚊は、NRS濃度が増加するにつれて用量依存的にルミネセンスカウントの減少を示したが、これらはいずれもPBS対照と同等であった。
ARC25(ウサギ#24700〜#24702のプール)0.5mg/mlまたはBSSC(#24703〜#24705)0.5mg/mlのいずれかを含有する血液食を給餌した蚊は、NRS0.5mg/mlと比較して、それぞれ92%および93%の著しい阻害を示した。
ARC25およびBSSCに対して生じた精製ウサギ抗体の段階Vガメトサイトに対するSMFA結果を表9に含めてまとめる。
結果は、3種のプラスモジウム属(Plasmodium)生活環段階の熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)表面タンパク質またはタンパク質ドメインに基づいて、本開示による例示的抗原の生成を実現する可能性を示す。生成は、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)植物において達成された。精製後、組換えタンパク質ARC25は、動物においてバランスが保たれた抗体反応を誘発し、力価は2×104を上回っていた。免疫蛍光アッセイによって、誘導された抗体は天然プラスモジウム属(Plasmodium)抗原に特異的に結合することが確認された。さらに、機能アッセイによって、対応するプラスモジウム属(Plasmodium)生活環段階全てにおいて30〜100%の範囲の特異的な寄生生物阻害が示された。
参考文献
本明細書を通じて引用した文献参考文献、発行された特許および公開された特許出願を含む引用した参考文献全ての内容は、参考により本明細書に明確に組み込む。
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Claims (67)
- a)第1の融合タンパク質単位がイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第1の抗原を含み、前記第1の抗原が前記イムノグロブリン重鎖定常ドメインのうちの少なくとも1つのN末端および/またはC末端に結合しており(HC融合ポリペプチド単位1、HC単位1)、
b)第2の融合タンパク質単位がイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第2の抗原を含み、前記第2の抗原がCL−ドメインのN末端および/またはC末端に結合しており(LC融合ポリペプチド単位1、LC単位1)、
c)第3の融合タンパク質単位がイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第3の抗原を含み、前記第3の抗原が前記第3の融合タンパク質の前記イムノグロブリン重鎖定常ドメインのN末端および/またはC末端に融合している、または
d)第3の融合タンパク質単位がイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第3の抗原を含み、前記第3の抗原がCL−ドメインのNまたはC末端に融合しており、
e)前記3つの組換え融合タンパク質単位の前記抗原のアミノ酸配列が異なっている、
少なくとも3つの組換え融合タンパク質単位を含むワクチンとして適切な単離されたイムノアセンブリン(IA)タンパク質複合体。 - 前記第1の融合タンパク質単位(HC単位1)および前記第2の融合タンパク質単位(LC単位1)が互いに共有結合または非共有結合している、請求項1に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記第1および第2の融合タンパク質単位が互いにジスルフィド結合によって共有結合している、請求項1または2に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記第3の融合タンパク質単位がイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第3の抗原を含み(第2のHC融合ポリペプチド単位2、HC単位2)、前記第3の抗原が前記第3の融合タンパク質の前記イムノグロブリン重鎖定常ドメインのN末端および/またはC末端に融合している、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記第1の融合タンパク質単位(HC単位1)および前記第3の融合タンパク質単位(HC単位2)が互いに共有結合または非共有結合している、請求項4に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記第1および第3の融合タンパク質単位が互いにジスルフィド結合によって共有結合している、請求項1から5のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記IAタンパク質複合体がイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第4の抗原を含む第4の組換え融合タンパク質単位を含み、前記第4の抗原がCLドメインのN末端またはC末端に融合している(第2のLC融合ポリペプチド単位、LC単位2)、請求項4から6のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記第3の融合タンパク質単位(HC単位2)および前記第4の融合タンパク質単位(LC単位2)が互いに共有結合または非共有結合している、請求項7に記載のIAタンパク質複合体。
- 前記第3および第4の融合タンパク質単位が互いにジスルフィド結合によって共有結合している、請求項7または8に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記抗原のタンパク質配列が、99%以下、好ましくは98%以下、より好ましくは95%以下、さらにより好ましくは90%以下、さらにより好ましくは80%以下、最も好ましくは70%以下の配列同一性を有する、請求項1から9のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記第1の融合タンパク質単位および/または前記第3の融合タンパク質単位がFc受容体結合部分を含む、請求項4から10のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記Fc受容体結合部分が、配列番号32、配列番号76および配列番号77からなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれらのバリアントを含む、請求項11に記載のIAタンパク質複合体。
- 1つまたは複数の前記融合タンパク質単位がヒンジ領域を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記ヒンジ領域が前記第1および/または前記第3の融合タンパク質単位の前記CH1−ドメインと前記CH3−ドメインの間に位置する、請求項13に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記第1の融合タンパク質単位および/または前記第3の融合タンパク質単位がイムノグロブリン重鎖定常ドメインCH2をさらに含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記第1の融合タンパク質単位および/または前記第3の融合タンパク質単位が前記CH1−ドメインと前記CH2−ドメインの間にヒンジ領域を含む、請求項15に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記第1の融合タンパク質単位および/または前記第3の融合タンパク質単位が前記イムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1、CH2およびCH3ならびにヒンジ領域を前記CH1−ドメインと前記CH2−ドメインの間に含む、請求項16に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- a)前記第1の融合タンパク質単位が前記イムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第1の抗原を含み、前記第1の抗原が前記CH1−ドメインのN末端に融合しており(HC単位1)、
b)前記第2の融合タンパク質単位がイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第2の抗原を含み、前記第2の抗原が前記CL−ドメインのN末端に融合しており(LC単位1)、前記第1および前記第2の融合タンパク質単位が、特に少なくとも1つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合しており、
c)前記第3の融合タンパク質単位が前記イムノグロブリン重鎖定常ドメインCH1およびCH3ならびに第3の抗原を含み、前記第3の抗原が前記第3の融合タンパク質単位の前記CH1−ドメインのN末端に融合しており(HC単位2)、前記HC単位1およびHC単位2が、特に少なくとも1つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合しており、
d)前記第4の融合タンパク質単位がイムノグロブリン軽鎖定常ドメインCLおよび第4の抗原を含み、前記第4の抗原が前記第4の融合タンパク質の前記CL−ドメインのN末端に融合しており(LC単位2)、前記第3および前記第4の融合タンパク質単位が、特に少なくとも1つのジスルフィド結合によって、互いに共有結合している、
請求項7から17のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。 - 前記融合タンパク質単位のうちの少なくとも1つが追加的抗原を含み、前記追加的抗原が前記融合タンパク質単位のN末端および/またはC末端に結合している、請求項1から18のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記第1の融合タンパク質単位における前記第1の抗原が前記CH1−ドメインのN末端に結合し、前記第1の融合タンパク質のさらなる抗原が前記CH3−ドメインのC末端に結合している、請求項1から19のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記第3の融合タンパク質単位における前記第3の抗原が前記CH1−ドメインのN末端に結合し、前記第3の融合タンパク質単位のさらなる抗原が前記CH3−ドメインのC末端に結合している、請求項4から20のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記組換え融合タンパク質単位の前記抗原のアミノ酸配列が異なっている、請求項21に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記イムノグロブリン重鎖定常ドメインのそれぞれが、IgG、IgMもしくはIgA重鎖定常ドメインのアミノ酸配列またはそのバリアントを含む、請求項1から22のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記イムノグロブリン重鎖定常ドメインのそれぞれが、ほ乳類重鎖定常ドメイン、好ましくはヒト重鎖定常ドメインのアミノ酸配列またはそのバリアントを含み、前記イムノグロブリン軽鎖定常ドメインが、ほ乳類軽鎖定常ドメイン、好ましくはヒト軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列またはそのバリアントを含む、請求項1から23のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記イムノグロブリン重鎖定常ドメインおよび前記イムノグロブリン軽鎖定常ドメインのそれぞれが、IgG重鎖定常または軽鎖定常ドメイン、好ましくはヒトIgG、好ましくはヒトIgG1のアミノ酸配列またはそのバリアントを含む、請求項1から24のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記CL−ドメインがヒトカッパ軽鎖またはヒトラムダ軽鎖である、請求項1から25のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記CL−ドメインが配列番号50のアミノ酸配列を含む、請求項1から26のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記抗原が、腫瘍抗原、自己抗原、食物アレルゲン、チクングニアウイルス、狂犬病ウイルス、連鎖球菌(Streptococcus)、ナイセリア(Neisseria)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、クロストリジウム(Clostridiu)、トリパノソーマ(Trypanosoma)、リーシュマニア(Leishmania)、サルモネラ(Salmonella)、フラビウイルス(Flavivirus)、フィロウイルス(Filiovirus)の群から選択される病原体から得られる抗原および/またはマラリア、トキソプラズマ症のようなアピコンプレクサ(Apicomplexan)寄生生物から生じる感染性疾患、および/またはエボラ、HIV、HPV、肝炎、結核、ジカ熱、インフルエンザまたは百日咳のようなウイルス感染に関与する1つまたは複数の病原体から得られる、および/またはがんを生じる悪性腫瘍を引き起こす疾患から得られる抗原である、請求項1から27のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 異なる株、単離株、対立遺伝子バリアント、変異体および/または一塩基多型を表す同じ抗原の2つ以上のバリアントを含む、請求項1から28のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 2つの異なる病原体から得られた抗原を含む、請求項1から29のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記抗原が、プラスモジウム(Plasmodium)寄生生物のようなアピコンプレクサ(Apicomplexan)寄生生物から得られた抗原である、請求項1から30のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記プラスモジウム(Plasmodium)寄生生物が、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)、三日熱マラリア原虫(P. vivax)、卵形マラリア(P. ovale)、二日熱マラリア原虫(P. knowlesi)および四日熱マラリア原虫(P. malariae)からなる群から選択される、請求項31に記載のIAタンパク質複合体。
- 前記プラスモジウム(Plasmodium)寄生生物が熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)である、請求項32に記載のIAタンパク質複合体。
- 前記抗原が、配列番号1から配列番号31からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項32に記載のIAタンパク質複合体。
- 前記抗原が、前記寄生生物の表面上に提示される少なくとも2つの異なるタンパク質から得られる、請求項31から34のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記抗原が、前記寄生生物の少なくとも2つの異なる生活環主要段階において前記寄生生物の表面上に提示される少なくとも2つの異なるタンパク質から得られる、請求項31から35のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記寄生生物が熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)であり、前記異なる生活環主要段階が前赤内期段階および血液段階である、請求項36に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記抗原が、前記寄生生物の表面上に提示される少なくとも3つの異なるタンパク質から得られる、請求項31から37のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記抗原が、前記寄生生物の少なくとも3つの異なる生活環主要段階において前記寄生生物の表面上に提示される少なくとも3つの異なるタンパク質から得られる、請求項31から38のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記寄生生物が、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)であり、前記異なる生活環主要段階が前赤内期段階、血液段階および有性生殖段階である、請求項39に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 抗原Pfs25FKO、AMA1GKOおよびCSP_TSRGKOを含む、請求項40に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記HC単位1が抗原AMA1GKOおよびCSP_TSRGKOを含み、前記AMA1GKOが前記CH1−ドメインにN末端融合しており、前記CSP_TSRGKOが前記CH3−ドメインにC末端融合しており、前記第2の融合タンパク質が抗原Pfs25FKOを含み、前記Pfs25FKOが前記CL−ドメインにN末端融合している、請求項41に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- a)配列番号33から配列番号52、配列番号67から配列番号75および配列番号78から配列番号104の群から選択されるアミノ酸配列を有する第1の融合タンパク質単位(HC単位1)、ならびに
b)配列番号51から配列番号66の群から選択されるアミノ酸配列を有する第2の融合タンパク質単位(LC単位1)
を含む、請求項1から42のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。 - 前記の2つの組換え融合タンパク質が、
a)第1の融合タンパク質単位(HC単位1):配列番号97
b)第2の融合タンパク質単位(LC単位1):配列番号53
のアミノ酸配列を有する、請求項1から43のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。 - 前記第1の融合タンパク質単位に含まれるFc受容体結合部分が、配列番号32のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、
a)配列番号32と比較して少なくとも2つの置換を有し、前記置換が配列番号32のGlu356およびAsp399の位置で生じており、
b)Glu356およびAsp399の位置のアミノ酸が正電荷アミノ酸で置換されており、
c)前記第3の融合タンパク質に含まれる前記Fc受容体結合部分が、配列番号32のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、
d)配列番号32と比較して少なくとも2つの置換を有し、前記置換が配列番号32のLys392およびLys409の位置で生じており、
e)Lys392およびLys409の位置のアミノ酸が負電荷アミノ酸で置換されている、
請求項11から44のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。 - 前記第1および/または第3の融合タンパク質単位に含まれる前記Fc受容体結合部分が、配列番号76または配列番号77のアミノ酸配列を含む、請求項11から45のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- a)前記第1の融合タンパク質単位(HC単位1)が抗原AMA1GKOおよびCSP_TSRGKOを含み、前記AMA1GKOがCH1−ドメインにN末端融合しており、CSP_TSRGKOがCH3−ドメインにC末端融合しており、前記第1の融合タンパク質単位に含まれる前記Fc受容体結合部分が、配列番号32のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、配列番号32と比較して少なくとも2つの置換を有し、前記置換が配列番号32のGlu356およびAsp399の位置で生じており、Glu356およびAsp399の位置のアミノ酸が正電荷アミノ酸で置換されており、
b)前記第2の融合タンパク質単位(LC単位1)が抗原Pfs25FKOを含み、Pfs25FKOが前記CL−ドメインにN末端融合しており、
c)前記第3の融合タンパク質単位(HC単位2)が、前記CH1−ドメインにN末端融合した抗原Rh2GKOを含み、前記第1の融合タンパク質に含まれる前記Fc受容体結合部分が、配列番号32のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、配列番号32と比較して少なくとも2つの置換を有し、前記置換が配列番号32のLys392およびLys409の位置で生じている、
請求項4から46のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。 - a)配列番号33から配列番号52、配列番号67から配列番号75および配列番号78から配列番号104の群から選択されるアミノ酸配列を有する第1の融合タンパク質単位(HC単位1)、ならびに
b)配列番号51から配列番号66の群から選択されるアミノ酸を有する第2の融合タンパク質単位(LC単位1)、ならびに
c)配列番号33から配列番号52、配列番号67から配列番号75および配列番号78から配列番号104の群から選択されるアミノ酸配列を有する第3の融合タンパク質単位(HC単位2)
を含む、請求項4から47のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。 - 前記融合タンパク質が、
a)第1の融合タンパク質単位(HC単位1):配列番号97
b)第2の融合タンパク質単位(LC単位1):配列番号53
c)第2の融合タンパク質単位(HC単位2):配列番号88
のアミノ酸配列を有する、請求項48に記載の単離されたIAタンパク質複合体。 - 前記第4の融合タンパク質単位(LC単位2)が、抗原Pfs25FKOを含む第2の融合タンパク質単位(LC単位1)と同一で、Pfs25FKOが前記第4の融合タンパク質単位の前記CL−ドメインにN末端融合している、請求項7から49のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- a)配列番号33から配列番号52、配列番号67から配列番号75および配列番号78から配列番号104の群から選択されるアミノ酸配列を有する第1の融合タンパク質単位(HC単位1)、ならびに
b)配列番号51から配列番号66の群から選択されるアミノ酸を有する第2の融合タンパク質単位(LC単位1)、ならびに
c)配列番号33から配列番号52、配列番号67から配列番号75および配列番号78から配列番号104の群から選択されるアミノ酸配列を有する第3の融合タンパク質単位(HC単位2)、ならびに
d)配列番号51から配列番号66の群から選択されるアミノ酸配列を有する第4の融合タンパク質単位(LC単位2)
を含む、請求項7から50のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体。 - a)第1の融合タンパク質単位(HC単位1):配列番号97、および
b)第2の融合タンパク質単位(LC単位1):配列番号53、および
c)第3の融合タンパク質単位(HC単位2):配列番号88、配列番号99または配列番号100、および
d)第4の融合タンパク質単位(LC単位2):配列番号53
を含む、請求項51に記載の単離されたIAタンパク質複合体。 - 請求項1から52のいずれか一項に記載の1つまたは複数の組換え融合タンパク質をコードするコード部分を含む核酸分子。
- 請求項53に記載のヌクレオチド分子を含む発現ベクター。
- 請求項1から52のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体の1つまたは複数の融合タンパク質をコードする少なくとも1つまたは好ましくは全部の核酸分子を含む、請求項54に記載のベクターまたは請求項53に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
- ほ乳類細胞、酵母細胞または植物細胞である、請求項55に記載の宿主細胞。
- 前記ほ乳類細胞がチャイニーズ卵巣細胞(CHO)またはヒト胚性腎293細胞(HEK−293)である、請求項56に記載の宿主細胞。
- 前記酵母がピキア・パストリス(Pichia pastoris)である、請求項56に記載の宿主細胞。
- 前記植物細胞が、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)、タバコ(Nicotiana tabacum)、もしくはタバコBY2細胞株から得られる、またはオオムギ(Hordeum vulgare L.)、トウモロコシ(Zea mays)またはコムギ(Triticum)種から得られる、請求項56に記載の宿主細胞。
- 請求項1から52のいずれか一項に記載のイムノアセンブリンタンパク質複合体および薬学的に許容される担体および/またはアジュバントを含むワクチン組成物。
- a)請求項55から59のいずれか一項に記載の宿主細胞を、前記組換え融合タンパク質を生成するために適切な条件下、適切な培養培地中で培養するステップであって、前記宿主細胞が、請求項1から52のいずれか一項に記載の単離されたIAタンパク質複合体の前記融合タンパク質単位をコードする全核酸分子を含み、前記IAタンパク質複合体が前記宿主細胞中で形成されるステップ、
b)前記IAタンパク質複合体を単離するステップ、および場合によって、
c)前記IAタンパク質複合体を処理するステップ
を含む、請求項1から52のいずれか一項に記載のIAタンパク質複合体を生成する方法。 - (a)請求項55から59のいずれか一項に記載の複数の宿主細胞を、前記組換え融合タンパク質を生成するために適切な条件下、適切な培養培地中で培養するステップ、
(b)前記生成した融合タンパク質を単離するステップ、
(c)前記IAタンパク質複合体を生成するために前記融合タンパク質を混合するステップ、
(d)前記生成したIAタンパク質複合体を単離するステップ、および場合によって、
(e)前記IAタンパク質複合体を処理するステップ
を含む、請求項1から52のいずれか一項に記載のIAタンパク質複合体を生成する方法。 - 異なる抗原を含む複数の異なるHCおよびLC融合ポリペプチドを生成し、好ましくは、病原体の少なくとも2つまたは3つの異なる生活環主要段階において、好ましくは前記病原体の表面上に提示される異なるタンパク質から得られる複数の異なる抗原を含むヘテロ多量体IAタンパク質複合体を得るために前記生成したHCおよびLC融合ポリペプチドを混合する、請求項61または62に記載の方法。
- 前記融合タンパク質単位および/またはIAタンパク質複合体を、プロテインA/G/Lクロマトグラフィーを使用して単離する、請求項61から63のいずれか一項に記載の方法。
- (i)少なくとも2つの組換え融合タンパク質、(ii)少なくとも2つの異なる抗原、(iii)少なくとも1つの異なるホモオリゴマー化および/またはヘテロオリゴマー化ドメインを含み、前記第1の組換え融合タンパク質が、前記第2の組換え融合タンパク質には存在しない少なくとも1つのホモオリゴマー化またはヘテロオリゴマー化ドメインを含む、ワクチンとして適切な単離されたIAタンパク質複合体。
- 前記ホモオリゴマー化および/またはヘテロオリゴマー化ドメインが、抗体可変ドメインを含むイムノグロブリンドメイン、T細胞受容体可変および定常ドメイン、コイルドコイルドメイン、ロイシンジッパードメイン、コラーゲン関連トリプルヘリックス、T4バクテリオファージフィブリチンフォルドン(Fd)3量体化ドメイン、PDZおよびPDZ様ドメインからなる群から選択される、請求項65に記載の単離されたIAタンパク質複合体。
- 請求項1から52のいずれか一項に記載の少なくとも2つの異なるイムノアセンブリンタンパク質複合体を含むワクチン組成物。
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