JP2019211441A - Analysis method, matrix additive, mass spectrometry kit, sugar chain analysis matrix additive and sugar chain mass spectrometry kit - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、分析方法、マトリックス添加剤、質量分析用キット、糖鎖類分析用マトリックス添加剤および糖鎖類質量分析用キットに関する。 The present invention relates to an analysis method, a matrix additive, a mass spectrometry kit, a sugar chain analysis matrix additive, and a sugar chain mass spectrometry kit.
質量分析において、試料をイオン化して得られたイオンは、プロトン、カチオン（以下では、カチオンにプロトンは含まれないものとする）、アニオンの付加体、またはプロトンが脱離した脱プロトン化体等として検出される可能性がある。しかし、マススペクトルの解析においては、付加するイオンの種類が少ない方がピークの数が少なく解析がしやすいため、多くの場合、プロトン等の特定のイオンが優位に付加した付加体が生成されるようにイオン化が行われる。 In mass spectrometry, ions obtained by ionizing a sample include protons, cations (hereinafter, cation does not contain protons), adducts of anions, or deprotonated products from which protons are eliminated. May be detected. However, in the analysis of mass spectrum, since the number of ions to be added is smaller and the number of peaks is smaller and the analysis is easier, in many cases, adducts in which specific ions such as protons are added preferentially are generated. Thus, ionization is performed.
例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）により糖鎖をイオン化して質量分析を行う場合には、糖鎖と、ナトリウムやカリウム等との親和性の高さを利用し、ナトリウムやカリウム等の特定のカチオンが優位に付加したカチオン付加体を検出することが行われている。 For example, when mass analysis is performed by ionizing a sugar chain by matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI), the high affinity between the sugar chain and sodium or potassium is used. Detection of a cation adduct added with a specific cation predominantly has been performed.
糖鎖を含む試料とマトリックスとを含む質量分析用試料の調製において、マトリックス添加剤としてこれらのカチオンを添加しなくても、調製の途中に微量のカチオンが混入する等の理由により、イオン化によりカチオン付加体を生成することができる。しかし、糖鎖の種類や試料の調製方法によってはナトリウム、カリウム、またはその他のカチオンの付加体が同時に観測される場合もある。これらはマススペクトルを複雑化させ、解析の妨げになるので、一つのイオン種に統一する方が好ましい。このような場合に、固体マトリックスに対して、例えばＮａＣｌのようなナトリウム塩等を含むカチオン化剤を加える方法が知られている。 In the preparation of a sample for mass spectrometry including a sample containing a sugar chain and a matrix, a cation can be obtained by ionization due to a small amount of cations being mixed during the preparation without adding these cations as a matrix additive. Adducts can be generated. However, adducts of sodium, potassium, or other cations may be observed simultaneously depending on the type of sugar chain and the sample preparation method. Since these complicate the mass spectrum and hinder analysis, it is preferable to unify them into one ion species. In such a case, a method of adding a cationizing agent containing a sodium salt such as NaCl to a solid matrix is known.
一方で、糖鎖のほか様々な分子をイオン化するのに、固体マトリックスではなく液体マトリックスを用いる方法も提案されている。液体マトリックスは固体マトリックスに比べて均一性が高く、特に親水性の糖鎖についてはこれを感度良くイオン化するものが多い。液体マトリックスにマトリックス添加剤を加えて、特定のアニオンが優位に付加したイオンを生成する方法が報告されている（特許文献１参照）。 On the other hand, a method using a liquid matrix instead of a solid matrix has been proposed to ionize various molecules in addition to sugar chains. The liquid matrix is more uniform than the solid matrix, and many hydrophilic sugar chains are ionized with high sensitivity. There has been reported a method in which a matrix additive is added to a liquid matrix to generate ions in which specific anions are preferentially added (see Patent Document 1).
液体マトリックスを用いて質量分析用試料を調製する場合に、特定のカチオンが優位に付加したイオンを生成する方法は提案されていない。固体マトリックスについて行われるように、ＮａＣｌを液体マトリックスに加えると、感度が低下したり、ナトリウム由来の夾雑物に対応するピークが生じ、糖鎖のイオン化を妨げる問題があった。 In the case of preparing a sample for mass spectrometry using a liquid matrix, a method for generating ions in which a specific cation is added preferentially has not been proposed. When NaCl is added to a liquid matrix, as in the case of a solid matrix, there is a problem in that the sensitivity is reduced or peaks corresponding to sodium-derived impurities are generated, which impedes ionization of sugar chains.
本発明の好ましい実施形態による分析方法は、試料と、液体マトリックスを構成する物質を含むマトリックス試薬と、１以上のハロゲン原子を含むカルボン酸またはその塩を備えるマトリックス添加剤とを混合して質量分析用試料を調製することと、前記質量分析用試料にレーザー光を照射してイオン化を行うことと、前記イオン化により生じたイオンまたは前記イオンを解離したイオンを質量分離して検出することと、を備える。
さらに好ましい実施形態では、前記ハロゲン原子は、フッ素原子である。
さらに好ましい実施形態では、前記マトリックス添加剤は、トリフルオロ酢酸塩である。
さらに好ましい実施形態では、前記マトリックス添加剤は、ナトリウム塩またはカリウム塩である。
さらに好ましい実施形態では、前記マトリックス試薬は、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノンまたはクマル酸、および、アミンまたはその塩を含む。
さらに好ましい実施形態では、前記アミンは、１，１，３，３−テトラメチルグアニジンまたは３−アミノキノリンである。
さらに好ましい実施形態では、前記試料は、糖、糖鎖、および糖または糖鎖の誘導体のうち少なくとも一つを含む分子を備える。
本発明の好ましい実施形態によるマトリックス添加剤は、１以上のハロゲン原子を含むカルボン酸またはその塩を備え、液体マトリックスに添加するためのものである。
さらに好ましい実施形態では、前記ハロゲン原子は、フッ素原子である。
さらに好ましい実施形態では、前記カルボン酸は、トリフルオロ酢酸である。
さらに好ましい実施形態では、前記カルボン酸の塩は、ナトリウム塩またはカリウム塩である。
本発明の好ましい実施形態による質量分析用キットは、上述のマトリックス添加剤を備える。
本発明の好ましい実施形態による糖鎖類分析用マトリックス添加剤は、上述のマトリックス添加剤を備え、前記マトリックス添加剤は、糖鎖および糖鎖誘導体のうち少なくとも一つを含む分子を備える試料の質量分析に用いられる。
本発明の好ましい実施形態による糖鎖類質量分析用キットは、上述の糖鎖類分析用マトリックス添加剤を備える。
An analysis method according to a preferred embodiment of the present invention includes mass spectrometry by mixing a sample, a matrix reagent containing a substance constituting a liquid matrix, and a matrix additive containing a carboxylic acid containing one or more halogen atoms or a salt thereof. Preparing a sample for ionization, performing ionization by irradiating the sample for mass spectrometry with laser light, and detecting by mass-separating ions generated by the ionization or ions dissociated from the ions, Prepare.
In a further preferred embodiment, the halogen atom is a fluorine atom.
In a further preferred embodiment, the matrix additive is trifluoroacetate.
In a further preferred embodiment, the matrix additive is a sodium salt or a potassium salt.
In a further preferred embodiment, the matrix reagent comprises 2,4,6-trihydroxyacetophenone or coumaric acid and an amine or salt thereof.
In a further preferred embodiment, the amine is 1,1,3,3-tetramethylguanidine or 3-aminoquinoline.
In a further preferred embodiment, the sample comprises a molecule comprising at least one of a sugar, a sugar chain, and a sugar or sugar chain derivative.
A matrix additive according to a preferred embodiment of the present invention comprises a carboxylic acid or salt thereof containing one or more halogen atoms for addition to a liquid matrix.
In a further preferred embodiment, the halogen atom is a fluorine atom.
In a further preferred embodiment, the carboxylic acid is trifluoroacetic acid.
In a more preferred embodiment, the carboxylic acid salt is a sodium salt or a potassium salt.
A kit for mass spectrometry according to a preferred embodiment of the present invention includes the matrix additive described above.
A matrix additive for analyzing sugar chains according to a preferred embodiment of the present invention includes the matrix additive described above, and the matrix additive includes a mass of a sample including a molecule including at least one of a sugar chain and a sugar chain derivative. Used for analysis.
A sugar chain mass spectrometry kit according to a preferred embodiment of the present invention includes the above-described matrix additive for sugar chain analysis.
本発明によれば、液体マトリックスを用いて、特定のカチオンが優位に付加されたイオンが生成するように試料のイオン化を行う場合に、感度の低下や、夾雑物による悪影響を抑制し、より精度の高い分析を行うことができる。 According to the present invention, when ionization of a sample is performed using a liquid matrix so that ions to which a specific cation is preferentially added are generated, a decrease in sensitivity and an adverse effect due to impurities are suppressed, and more accuracy is achieved. High analysis can be performed.
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。 Hereinafter, embodiments for carrying out the present invention will be described with reference to the drawings.
図１は、本実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ１００１において、試料と、液体マトリックスを構成するマトリックス試薬と、１以上のハロゲン原子を含むカルボン酸またはその塩を備えるマトリックス添加剤とが用意される。 FIG. 1 is a flowchart showing the flow of the analysis method of this embodiment. In step S1001, a sample, a matrix reagent constituting a liquid matrix, and a matrix additive including a carboxylic acid containing one or more halogen atoms or a salt thereof are prepared.
（マトリックス添加剤）
本実施形態の分析方法で用いられるマトリックス添加剤は、液体マトリックスに添加するための添加剤である。マトリックス添加剤に含まれるカルボン酸またはその塩は、入手の容易さ等の観点から、フッ素原子を含むものが好ましい。マトリックス添加剤に含まれるカルボン酸は、トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと呼ぶ）が好ましい。液体マトリックスとＴＦＡイオンとを含む質量分析用試料を用いて質量分析を行うと、感度の低下や夾雑物による悪影響が抑制された測定データを得ることができる。
(Matrix additive)
The matrix additive used in the analysis method of the present embodiment is an additive for adding to the liquid matrix. The carboxylic acid or salt thereof contained in the matrix additive is preferably one containing a fluorine atom from the viewpoint of availability. The carboxylic acid contained in the matrix additive is preferably trifluoroacetic acid (hereinafter referred to as TFA). When mass spectrometry is performed using a sample for mass spectrometry including a liquid matrix and TFA ions, measurement data in which a decrease in sensitivity and adverse effects due to impurities are suppressed can be obtained.
マトリックス添加剤に含まれるカルボン酸の塩は、入手の容易さ等の観点から、ナトリウム塩またはカリウム塩が好ましい。さらに、これらの塩は、糖鎖や糖鎖誘導体等の糖関連分子（以下では、糖鎖および糖鎖誘導体を糖鎖類と呼び、糖、糖鎖、糖若しくは糖鎖の誘導体、またはこれらを含む分子を糖関連分子と呼ぶ）に対して親和性が高いため、試料が糖関連分子である場合に、これらのイオンが優位に付加されたイオンを特に生成しやすいので好適である。 The salt of the carboxylic acid contained in the matrix additive is preferably a sodium salt or a potassium salt from the viewpoint of easy availability. Further, these salts are sugar-related molecules such as sugar chains and sugar chain derivatives (hereinafter, sugar chains and sugar chain derivatives are referred to as sugar chains, sugars, sugar chains, sugars or sugar chain derivatives, or these This is suitable because when the sample is a sugar-related molecule, it is particularly easy to generate ions to which these ions are preferentially added.
マトリックス添加剤に含まれるカルボン酸の塩は、トリフルオロ酢酸ナトリウム（以下、ＮａＴＦＡと呼ぶ）がより好ましい。液体マトリックスにＮａＴＦＡを含むマトリックス添加剤を加えて質量分析用試料を調製すると、ナトリウムが優位に付加したイオンを生成することができ、さらに感度の低下や夾雑物による悪影響が抑制された測定データを得ることができる。
なお、トリフルオロ酢酸等のカルボン酸を含む溶液と、ナトリウムイオン等のカチオンを含む溶液とを別々に加えてもよい。カチオンを含む溶液としては、水酸化ナトリウム溶液等を用いることができる。
The carboxylic acid salt contained in the matrix additive is more preferably sodium trifluoroacetate (hereinafter referred to as NaTFA). When a sample for mass spectrometry is prepared by adding a matrix additive containing NaTFA to a liquid matrix, ions with a dominant addition of sodium can be generated, and measurement data with reduced sensitivity and adverse effects due to contaminants can be obtained. Can be obtained.
A solution containing a carboxylic acid such as trifluoroacetic acid and a solution containing a cation such as sodium ion may be added separately. As the solution containing a cation, a sodium hydroxide solution or the like can be used.
（マトリックス試薬）
液体マトリックスを構成するマトリックス試薬は、質量分析用試料において液体マトリックスの少なくとも一部を構成する分子を含む。液体マトリックスとは、通常のMALDI質量分析計のイオン源である１０−１Ｐａ以下等の高真空条件下でも固化・気化せずに液体を維持する特徴を持ったマトリックスのことで、多くの場合は常温融解塩に分類される。マトリックス試薬は、アミンまたはその塩、および、有機物質またはその塩を含み、アミンがプロトンの受容体として働き、有機物質がプロトンの供与体となるものが好ましい。例えば、当該有機物質は酸性基を含有することが好ましい。上記アミンおよび有機物質のいずれかは、紫外〜可視〜赤外領域等に対応する波長のレーザー光を吸収する。マトリックス試薬に含まれるアミンまたはその塩と、有機物質またはその塩とを溶媒中で混合し、適宜溶媒を蒸発させ、液体マトリックスを調整することができる。
なお、複数の液体マトリックスを混合して用いてもよい。
(Matrix reagent)
The matrix reagent constituting the liquid matrix contains molecules constituting at least a part of the liquid matrix in the sample for mass spectrometry. A liquid matrix is a matrix with the characteristic of maintaining a liquid without solidifying and vaporizing even under high vacuum conditions such as 10 −1 Pa or less, which is an ion source of a normal MALDI mass spectrometer. Is classified as room temperature molten salt. The matrix reagent preferably contains an amine or a salt thereof and an organic substance or a salt thereof, wherein the amine serves as a proton acceptor and the organic substance serves as a proton donor. For example, the organic material preferably contains an acidic group. Either the amine or the organic substance absorbs laser light having a wavelength corresponding to the ultraviolet to visible to infrared region. A liquid matrix can be prepared by mixing an amine or a salt thereof contained in a matrix reagent with an organic substance or a salt thereof in a solvent and evaporating the solvent as appropriate.
A plurality of liquid matrices may be mixed and used.
液体マトリックスを構成するアミンは、第１級アミンでは、窒素原子がＯＨ基で置換されていてもよい、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、イソヘプチル、ｎ−オクチル、イソオクチル、ｎ−ノニル、イソノニル、ｎ−デシル、イソデシル、ｎ−ウンデシル、またはイソウンデシルの残基、あるいはフェニル残基と結合している第１級アミンを含むことが好ましい。 The amine constituting the liquid matrix is a primary amine, in which a nitrogen atom may be substituted with an OH group, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, n-pentyl, isopentyl, n First bonded to a residue of -hexyl, isohexyl, n-heptyl, isoheptyl, n-octyl, isooctyl, n-nonyl, isononyl, n-decyl, isodecyl, n-undecyl, or isoundecyl, or a phenyl residue It preferably contains a secondary amine.
液体マトリックスを構成するアミンは、第２級または第３級アミンでは、窒素原子が、ＯＨ基で置換されていてもよい、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、イソヘプチル、ｎ−オクチル、およびイソオクチルの残基、ならびにフェニル残基からなる群より選択される、同種でも異種でもよい、２または３個の残基と結合している第２級または第３級アミンを含むことが好ましい。 The amine constituting the liquid matrix is a secondary or tertiary amine, in which a nitrogen atom may be substituted with an OH group, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, n- 2 or 3 residues, which may be the same or different, selected from the group consisting of pentyl, isopentyl, n-hexyl, isohexyl, n-heptyl, isoheptyl, n-octyl, and isooctyl residues, and phenyl residues It is preferred to include a secondary or tertiary amine bonded to the group.
液体マトリックスを構成するアミンは、３−アミノキノリン、ピリジン、イミダゾール、またはＣ−若しくはＮ−アルキル化イミダゾール誘導体を含むことも好ましい。 The amine constituting the liquid matrix also preferably contains 3-aminoquinoline, pyridine, imidazole, or C- or N-alkylated imidazole derivatives.
液体マトリックスを構成するアミンは、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）、ｎ−ブチルアミン（ＢＡ）、エチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン（ＤＥＡ）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルメチルアミン、ジエチルベンゼンアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン、トリエチルアミン、トリ−ｎ−ブチルアミン、トリ−ｎ−プロピルアミン、エタノールアミン、ポリエーテルテールドトリエチルアミン、ポリエステルテールドトリエチルアミン、ニトロフェノール、アニリン、２，４−ジニトロアニリン、２−ニトロフェニルオクチルエーテル、ピリジン、２−ピリジンプロパノール（２ＰＰ）、２−エチルピリジン（２ＥＰ）、２−アミノ−４−メチル−５−ニトロピリジン、３−アミノキノリン（３ＡＱ）、３−ヒドロキシピリジン、１−メチルイミダゾール、１−ブチル−３−メチルイミダゾール、１−（１−ヒドロキシプロピル）−３−メチルイミダゾール、１，３−ジメチルイミダゾール、１，５−ジアミノナフタレン、６−アザ−２−チオチミン、クマリン、６，７−ジヒドロキシクマリン、１，８−ジヒドロキシ−９［１０Ｈ］−アントラセノンおよびカルボリン類（ノルハルマン、ハルマン、ハルミン、ハルモル、ハルマリン、ハルマロールなど）からなる群から選択される少なくとも１つが好ましい。 The amine constituting the liquid matrix is 1,1,3,3-tetramethylguanidine (TMG), n-butylamine (BA), ethylamine, N, N-diethylamine (DEA), N, N-diethylaniline, N, N-diethylmethylamine, diethylbenzeneamine, N, N-dimethylamine, triethylamine, tri-n-butylamine, tri-n-propylamine, ethanolamine, polyether tailed triethylamine, polyester tailed triethylamine, nitrophenol, aniline, 2,4-dinitroaniline, 2-nitrophenyl octyl ether, pyridine, 2-pyridinepropanol (2PP), 2-ethylpyridine (2EP), 2-amino-4-methyl-5-nitropyridine, 3-aminoquinoline ( 3AQ), -Hydroxypyridine, 1-methylimidazole, 1-butyl-3-methylimidazole, 1- (1-hydroxypropyl) -3-methylimidazole, 1,3-dimethylimidazole, 1,5-diaminonaphthalene, 6-aza- Selected from the group consisting of 2-thiothymine, coumarin, 6,7-dihydroxycoumarin, 1,8-dihydroxy-9 [10H] -anthracenone and carbolines (Norharman, Harman, Harmine, Harmol, Harmarin, Halmalol, etc.) At least one is preferred.
液体マトリックスを構成するアミンは、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）および３−アミノキノリン（３ＡＱ）の少なくとも一方がより好ましい。これらのアミンを含むマトリックス試薬を用いて調製された液体マトリックスにＮａＴＦＡを加えて質量分析用試料を調製すると、ナトリウムが優位に付加したイオンが得られ、さらに感度の低下や夾雑物による悪影響が抑制された測定データを得ることができる。 The amine constituting the liquid matrix is more preferably at least one of 1,1,3,3-tetramethylguanidine (TMG) and 3-aminoquinoline (3AQ). When a sample for mass spectrometry is prepared by adding NaTFA to a liquid matrix prepared using a matrix reagent containing these amines, ions predominately added with sodium are obtained, and further reduction in sensitivity and adverse effects due to contaminants are suppressed. Measured data can be obtained.
液体マトリックスを構成する有機物質は、ｐ−クマル酸（ｐ−ＣＡ）、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ）、α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）若しくはその異性体、４−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、３−ヒドロキシピコリン酸、３，５−ジメソキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸（シナピン酸）、４−ヒドロキシ−３−メソキシケイ皮酸（フェルラ酸）、カフェイン酸（３，４−ジヒドロキシケイ皮酸）、５−メソキシサリチル酸、２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）、ニコチン酸、ピコリン酸、３−アミノピコリン酸、３−ヒドロキシピコリン酸、２−アミノ安息香酸、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸、６−アザ−２−チオチミン、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）若しくはその水和物、１，４−ジヒドロ−２−ナフトエ酸、３−インドールアクリル酸、インドール−２−カルボン酸、チオグリコール酸、２−ヒドロキシ−５−メトキシ安息香酸若しくはその異性体、５−クロロ− ２−メルカプトベンゾチアゾール、トリフルオロメタンスルホネート、２，６− ジヒドロキシアセトフェノン、９Ｈ−ピリド［３ ，４−ｂ］インドール、ジスラノール、オサゾン類、２，５−ジヒドロキシアセトフェノン、１−ニトロカルバゾール、７−アミノ−４−メチルクマリン、８−アミノピレン−２，３，４−トリススルホン酸、２［２Ｅ−３−（４−ｔｅｒｔ−ブチル−フェニル）−２−メチルプロプ− ２−エニリデン］マロノニトリル（ＤＣＴＢ）および４−メトキシ−３−ヒドロキシケイ皮酸からなる群から選択される少なくとも一つが好ましい。 Organic substances constituting the liquid matrix are p-coumaric acid (p-CA), α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (4-CHCA), α-cyano-3-hydroxycinnamic acid, 2,5- Dihydroxybenzoic acid (DHB) or its isomers, 4-hydroxybenzoic acid, p-hydroxybenzoic acid, p-hydroxyphenylpyruvic acid, 3-hydroxypicolinic acid, 3,5-dimesoxy-4-hydroxycinnamic acid (cinapin) Acid), 4-hydroxy-3-mesoxycinnamic acid (ferulic acid), caffeic acid (3,4-dihydroxycinnamic acid), 5-mesoxysalicylic acid, 2- (4-hydroxyphenylazo) benzoic acid (HABA) ), Nicotinic acid, picolinic acid, 3-aminopicolinic acid, 3-hydroxypicolinic acid, 2-aminobenzoic acid, 3-amino-4-hydro Xylbenzoic acid, 6-aza-2-thiothymine, 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) or its hydrate, 1,4-dihydro-2-naphthoic acid, 3-indoleacrylic acid, indole-2 -Carboxylic acid, thioglycolic acid, 2-hydroxy-5-methoxybenzoic acid or its isomer, 5-chloro-2-mercaptobenzothiazole, trifluoromethanesulfonate, 2,6-dihydroxyacetophenone, 9H-pyrido [3,4] -B] indole, disranol, osazones, 2,5-dihydroxyacetophenone, 1-nitrocarbazole, 7-amino-4-methylcoumarin, 8-aminopyrene-2,3,4-trissulfonic acid, 2 [2E-3 -(4-tert-butyl-phenyl) -2-methylprop-2- Nylidene] malononitrile (DCTB) and at least one selected from the group consisting of 4-methoxy-3-hydroxycinnamic acid is preferred.
液体マトリックスを構成する有機物質は、ｐ−クマル酸（ｐ−ＣＡ）ならびに２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）およびその水和物の少なくとも一つがより好ましい。これらの有機物質を含むマトリックス試薬を用いて調製された液体マトリックスにＮａＴＦＡを加えて質量分析用試料を調製すると、ナトリウムが優位に付加したイオンが得られ、さらに感度の低下や夾雑物による悪影響が抑制された測定データを得ることができる。液体マトリックスを構成する有機物質は、ｐ−クマル酸（ｐ−ＣＡ）が、イオン化の際に硫酸化糖鎖からの硫酸基の離脱を防ぐことができるためにさらに好ましい。 The organic substance constituting the liquid matrix is more preferably at least one of p-coumaric acid (p-CA) and 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) and hydrates thereof. When a sample for mass spectrometry is prepared by adding NaTFA to a liquid matrix prepared using a matrix reagent containing these organic substances, ions predominately added with sodium are obtained. Suppressed measurement data can be obtained. As the organic substance constituting the liquid matrix, p-coumaric acid (p-CA) is more preferable because it can prevent the detachment of sulfate groups from sulfated sugar chains during ionization.
液体マトリックスは、ＧＣＡ、Ｇ２ＣＡおよびＧ３ＣＡ等の１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）とｐ−クマル酸（ＣＡ）とを所定の割合で混合した混合物、ＧＴＨＡＰならびに３ＡＱ／ＣＡが好ましい。ＧＣＡは、モル換算で、ＣＡの量１に対しＴＭＧの量が０．５以上１．５未満の割合でＴＭＧおよびＣＡを含むものとする。Ｇ２ＣＡは、モル換算で、ＣＡの量１に対しＴＭＧの量が１．５以上２．５未満の割合でＴＭＧおよびＣＡを含むものとする。Ｇ３ＣＡは、モル換算で、ＣＡの量１に対しＴＭＧの量が２．５以上３．５未満の割合でＴＭＧおよびＣＡを含むものとする。ＧＴＨＡＰは、ＴＭＧと２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）とをモル比で１：０．５〜１：２、好ましくは１：１の割合で混合した液体マトリックスである。３ＡＱ／ＣＡは、ｐ−ＣＡと３−アミノキノリン（３ＡＱ）とをモル比で５：１〜２０：１の割合で混合した液体マトリックスである。これらの液体マトリックスにＮａＴＦＡを加えて質量分析用試料を調製すると、ナトリウムが優位に付加したイオンが得られ、さらに感度の低下や夾雑物による悪影響が抑制された測定データを得ることができる。
なお、ＧＣＡ、Ｇ２ＣＡおよびＧ３ＣＡの区別の方法は上記以外の割合に基づいてもよく、特に限定されない。また、ＧＣＡ、Ｇ２ＣＡおよびＧ３ＣＡ以外の、ＴＭＧとＣＡとの混合物を液体マトリックスとして用いてもよい。
The liquid matrix is preferably a mixture of 1,1,3,3-tetramethylguanidine (TMG) such as GCA, G2CA and G3CA and p-coumaric acid (CA) in a predetermined ratio, GTHAP and 3AQ / CA. . GCA shall contain TMG and CA in a ratio of 0.5 to 1.5 in terms of molar amount of TMG with respect to the amount of CA 1 in terms of mole. G2CA shall contain TMG and CA at a ratio of 1.5 to less than 2.5 in terms of moles with respect to CA amount 1. G3CA contains TMG and CA at a ratio of 2.5 to 3.5 in terms of molar amount of TMG with respect to the amount of CA 1 in terms of mole. GTHAP is a liquid matrix in which TMG and 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) are mixed in a molar ratio of 1: 0.5 to 1: 2, preferably 1: 1. 3AQ / CA is a liquid matrix in which p-CA and 3-aminoquinoline (3AQ) are mixed at a molar ratio of 5: 1 to 20: 1. When a sample for mass spectrometry is prepared by adding NaTFA to these liquid matrices, ions preferentially added with sodium can be obtained, and further, measurement data in which a decrease in sensitivity and an adverse effect due to impurities are suppressed can be obtained.
The method for distinguishing GCA, G2CA and G3CA may be based on a ratio other than the above, and is not particularly limited. Moreover, you may use the mixture of TMG and CA other than GCA, G2CA, and G3CA as a liquid matrix.
（分析対象の試料）
本実施形態の分析方法において分析対象となる試料は、液体マトリックスを用いてイオン化を行うことができれば特に限定されない。分析対象となる試料は、糖、糖鎖、糖若しくは糖鎖の誘導体、またはこれらを含む分子（糖関連分子）が好ましい。すなわち、当該試料は、糖、糖鎖、および糖または糖鎖の誘導体のうち少なくとも一つを含む分子を備えることが好ましい。糖関連分子は、酸性糖鎖、中性糖鎖、糖脂質、糖タンパク質および糖ペプチド等を含む。糖鎖誘導体を生成する際の誘導体化の方法は特に限定されず、例えば還元末端のピリジルアミノ化等による還元アミノ化を用いることができる。糖関連分子は、ナトリウム塩やカリウム塩等のカチオン塩との親和性が高いため、イオン化の際にこれらのカチオンが優位に付加されたイオンを効率的に生成することができる。
(Sample to be analyzed)
The sample to be analyzed in the analysis method of the present embodiment is not particularly limited as long as ionization can be performed using a liquid matrix. The sample to be analyzed is preferably a sugar, a sugar chain, a sugar or a sugar chain derivative, or a molecule containing these (sugar-related molecule). That is, the sample preferably includes a molecule containing at least one of a sugar, a sugar chain, and a sugar or a sugar chain derivative. Sugar-related molecules include acidic sugar chains, neutral sugar chains, glycolipids, glycoproteins, glycopeptides, and the like. The method of derivatization for producing the sugar chain derivative is not particularly limited, and for example, reductive amination such as pyridylamination at the reducing end can be used. Since sugar-related molecules have high affinity with cation salts such as sodium salt and potassium salt, ions to which these cations are preferentially added can be efficiently generated during ionization.
試料が遊離糖鎖を含む場合には、糖タンパク質や糖ペプチド、糖脂質から遊離させた糖鎖を用いることができる。糖鎖を糖タンパク質や糖ペプチド、糖脂質から遊離させる方法としては、Ｎ‐グリコシダーゼやＯ‐グリコシダーゼ、エンドグリコセラミダーゼなどを用いた酵素処理、ヒドラジン分解、アルカリ処理によるβ脱離等の方法を用いることができる。 When the sample contains free sugar chains, sugar chains released from glycoproteins, glycopeptides, and glycolipids can be used. As a method for releasing sugar chains from glycoproteins, glycopeptides, and glycolipids, methods such as enzyme treatment using N-glycosidase, O-glycosidase, endoglycoceramidase, hydrazine degradation, and β-elimination by alkali treatment are used. be able to.
ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３が開始される。ステップＳ１００３において、ステップＳ１００１で用意された、試料と、マトリックス試薬と、マトリックス添加剤とを混合して質量分析用試料が調製される。上述のステップＳ１００１およびステップＳ１００３は、分析を行う人間や、分注装置により行われる。 When step S1001 is completed, step S1003 is started. In step S1003, a sample, a matrix reagent, and a matrix additive prepared in step S1001 are mixed to prepare a sample for mass spectrometry. Steps S1001 and S1003 described above are performed by a person who performs analysis or a dispensing device.
質量分析用試料の調製方法では、後述の質量分析用キットを用いて調製することが好ましいが、特に限定されない。分析対象の試料が組織切片の場合は、この組織切片に対し、液体マトリックスおよびマトリックス添加剤を含む混合液を滴下したり、液体マトリックスを含む液体およびマトリックス添加剤を含む液体を任意の順序で順次滴下してもよい。あるいは、分析対象の試料が溶媒中に存在し、当該試料と、液体マトリックスを含む液体と、マトリックス添加剤を含む液体とを任意の順序で混合してもよい。この混合をウェルプレート等の任意の容器で行ってから、得られた混合液をＭＡＬＤＩ用試料プレートの試料配置部位に滴下してもよいし、ＭＡＬＤＩ試料プレート上で混合を行ってもよい。 In the method for preparing a sample for mass spectrometry, it is preferable to prepare using a mass spectrometry kit described later, but it is not particularly limited. When the sample to be analyzed is a tissue section, a liquid mixture containing a liquid matrix and a matrix additive is dropped on the tissue section, or a liquid containing a liquid matrix and a liquid containing a matrix additive are sequentially added in any order. It may be dripped. Alternatively, the sample to be analyzed may be present in a solvent, and the sample, the liquid containing the liquid matrix, and the liquid containing the matrix additive may be mixed in any order. After this mixing is performed in an arbitrary container such as a well plate, the obtained mixed solution may be dropped on the sample arrangement site of the MALDI sample plate, or may be mixed on the MALDI sample plate.
試料プレートの試料配置部位に、試料と、液体マトリックスと、マトリックス添加剤とを含む混合液の液滴が形成されたら、混合液の溶媒を除去し混合液を濃縮する操作が行われる。混合液を濃縮する方法は特に限定されず、例えば溶媒を大気圧またはそれより低い圧力の下で蒸発させることで濃縮を行うことができる。後に図２（Ｂ）に関して詳述するように、試料プレート上の混合液を濃縮する際に液滴が分布する面積が縮小するように混合液の濃縮を行うことが好ましい。これにより、質量分析用試料中の試料成分の濃度を上げ、質量分析の感度を高めることができる。混合液が濃縮され、試料−液体マトリックス−マトリックス添加剤の混合物が得られたら、当該混合物を質量分析用試料として、その調製を終了する。 When droplets of the mixed solution containing the sample, the liquid matrix, and the matrix additive are formed at the sample arrangement site of the sample plate, an operation of removing the solvent of the mixed solution and concentrating the mixed solution is performed. The method for concentrating the mixed solution is not particularly limited, and for example, the concentration can be performed by evaporating the solvent under atmospheric pressure or lower pressure. As will be described in detail later with reference to FIG. 2B, it is preferable to concentrate the mixed solution so that the area where droplets are distributed is reduced when the mixed solution on the sample plate is concentrated. Thereby, the density | concentration of the sample component in the sample for mass spectrometry can be raised, and the sensitivity of mass spectrometry can be improved. When the mixture is concentrated and a sample-liquid matrix-matrix additive mixture is obtained, the mixture is used as a sample for mass spectrometry, and the preparation is completed.
ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５が開始される。ステップＳ１００５において、質量分析計により、調製された質量分析用試料にレーザー光が照射され、試料成分のイオン化が行われる。 When step S1003 is completed, step S1005 is started. In step S1005, the mass spectrometer irradiates the prepared sample for mass spectrometry with laser light, and the sample components are ionized.
ステップＳ１００５で調製された質量分析用試料を、ＭＡＬＤＩ法によりイオン化し、正イオンモードで検出することができれば、用いる質量分析計の種類や分析条件等は特に限定されない。 If the sample for mass spectrometry prepared in step S1005 can be ionized by the MALDI method and detected in the positive ion mode, the type of mass spectrometer to be used, analysis conditions, and the like are not particularly limited.
例えば、質量分析用試料に照射するレーザー光は紫外〜可視〜赤外領域に対応する波長を有するレーザー光とすることができ、汎用的にはＮ２レーザ（波長３３７ｎｍ）等を適宜用いることができる。質量分析計は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を用いることができる。質量分析計はシングル四重極質量分析計や飛行時間型質量分析計の他、タンデム質量分析計を用いることができる。例えば、質量分析計は、イオントラップ型質量分析計、三連四重極型質量分析計、四重極−飛行時間型質量分析計、イオントラップ−飛行時間型質量分析計、四重極−イオントラップ型質量分析計、四重極−フーリエ変換型質量分析計、イオントラップ−フーリエ変換型質量分析計、四重極−オービトラップ型質量分析計、イオントラップ−オービトラップ型質量分析計、飛行時間−飛行時間型質量分析計等を用いることができる。質量分析計は、イオントラップを含む飛行時間型質量分析計が、糖鎖や糖ペプチド等の数千Ｄａ以上の高質量の分子を詳細に解析する上で好ましい。 For example, the laser beam applied to the sample for mass spectrometry can be a laser beam having a wavelength corresponding to the ultraviolet to visible to infrared region, and an N 2 laser (wavelength of 337 nm) or the like is appropriately used for general purposes. it can. As the mass spectrometer, a matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometer (MALDI-MS) can be used. As the mass spectrometer, a tandem mass spectrometer can be used in addition to a single quadrupole mass spectrometer and a time-of-flight mass spectrometer. For example, a mass spectrometer can be an ion trap mass spectrometer, a triple quadrupole mass spectrometer, a quadrupole-time-of-flight mass spectrometer, an ion trap-time-of-flight mass spectrometer, or a quadrupole-ion. Trap mass spectrometer, quadrupole-Fourier transform mass spectrometer, ion trap-Fourier transform mass spectrometer, quadrupole-orbitrap mass spectrometer, ion trap-orbitrap mass spectrometer, time of flight -A time-of-flight mass spectrometer or the like can be used. The mass spectrometer is preferably a time-of-flight mass spectrometer including an ion trap in order to analyze in detail a high-mass molecule of several thousand Da or more such as a sugar chain or a glycopeptide.
ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７が開始される。ステップＳ１００７において、イオン化により生じたイオンまたは当該イオンを解離したイオンが質量分析計により質量分離されて検出される。 When step S1005 is completed, step S1007 is started. In step S1007, ions generated by ionization or ions obtained by dissociating the ions are mass-separated and detected by a mass spectrometer.
分析対象の試料を詳細に分析するために、質量分析計としてタンデム質量分析計を用いてイオン化された試料を解離し、得られたフラグメントイオンを質量分離して検出することが好ましい。解離の方法は特に限定されず、ポストソース分解、低エネルギー衝突誘起解離および高エネルギー衝突誘起解離等の衝突誘起解離、赤外多光子解離、光誘起解離、ならびにラジカルを用いた解離法等を適宜用いることができる。解離はイオントラップや衝突セル等において行われる。解離を行う場合、質量分析計が、イオン化された試料成分をプリカーサーイオンとして質量分離し、質量分離されたプリカーサーイオンを解離反応に供し、解離反応により得られたフラグメントイオンをプロダクトイオンとして質量分離して検出することが好ましい。 In order to analyze the sample to be analyzed in detail, it is preferable to dissociate the ionized sample using a tandem mass spectrometer as a mass spectrometer and detect the fragment ions obtained by mass separation. The dissociation method is not particularly limited, and post-source decomposition, collision-induced dissociation such as low-energy collision-induced dissociation and high-energy collision-induced dissociation, infrared multiphoton dissociation, photo-induced dissociation, and a dissociation method using a radical are appropriately used. Can be used. Dissociation is performed in an ion trap or a collision cell. When performing dissociation, the mass spectrometer mass-separates the ionized sample components as precursor ions, supplies the mass-separated precursor ions to the dissociation reaction, and mass-separates the fragment ions obtained by the dissociation reaction as product ions. It is preferable to detect them.
ステップＳ１００７が終了したら、ステップＳ１００９が開始される。ステップＳ１００９において、ステップＳ１００７における検出で得られた測定データが解析される。質量分析計や質量分析計で取得された測定データを取得した解析装置により測定データが解析され、マススペクトルが作成されたり、予め取得されたデータに基づいてマススペクトルのピークが同定される。ステップＳ１００９が終了したら、処理が終了される。 When step S1007 is completed, step S1009 is started. In step S1009, the measurement data obtained by the detection in step S1007 is analyzed. The measurement data is analyzed by a mass spectrometer or an analyzer that has acquired the measurement data acquired by the mass spectrometer, and a mass spectrum is created, or the peak of the mass spectrum is identified based on the previously acquired data. When step S1009 ends, the process ends.
（質量分析用キット）
本実施形態の分析方法に好適に用いられる質量分析用キットが提供される。
(Mass analysis kit)
A kit for mass spectrometry that is suitably used for the analysis method of the present embodiment is provided.
図２（Ａ）は、本実施形態の質量分析用キットを示す概念図である。質量分析用キット１００は、マトリックス添加剤１０と、マトリックス添加剤１０が格納された容器（以下、添加剤用容器１１と呼ぶ）と、マトリックス試薬２０と、マトリックス試薬２０が格納された容器（以下、マトリックス用容器２１と呼ぶ）と、試料プレート３０とを備える。試料プレート３０は、試料配置部位３１を備える。
なお、質量分析用キット１００は、マトリックス添加剤１０やマトリックス試薬２０に加える溶媒等の、質量分析で用いられるその他の物品を含んでもよい。また、質量分析用キット１００は、マトリックス添加剤１０を備えれば、マトリックス試薬２０や試料プレート３０を備えなくともよい。また、添加剤用容器１１とマトリックス用容器２１の形状は特に限定されない。
FIG. 2A is a conceptual diagram showing the mass spectrometry kit of the present embodiment. The
The
質量分析用キット１００のマトリックス添加剤１０は、上述のステップＳ１００１で説明された、１以上のハロゲン原子を含むカルボン酸またはその塩を備え、液体マトリックスに添加するためのマトリックス添加剤である。マトリックス添加剤１０に含まれるカルボン酸またはその塩は、製造の容易さ等の観点から、フッ素原子を含むものが好ましい。マトリックス添加剤１０に含まれるカルボン酸は、ＴＦＡが好ましい。ＴＦＡをマトリックス添加剤として含む質量分析用キット１００を用いて質量分析用試料を調製し、質量分析を行うと、感度の低下や夾雑物による悪影響が抑制された測定データを得ることができる。
The
マトリックス添加剤１０に含まれるカルボン酸の塩は、製造の容易さ等の観点から、ナトリウム塩またはカリウム塩のいずれかが好ましい。さらに、これらの塩は、糖鎖や糖鎖誘導体等の糖関連分子に対して親和性が高い。従って、試料が糖関連分子である場合に、上記カルボン酸のナトリウム塩やカリウム塩をマトリックス添加剤として含む質量分析用キット１００を用いて質量分析用試料を調製し、質量分析を行うと、これらのイオンが優位に付加されたイオンを特に生成しやすいので好適である。
The salt of the carboxylic acid contained in the
マトリックス添加剤１０に含まれるカルボン酸の塩は、ＮａＴＦＡがより好ましい。ＮａＴＦＡをマトリックス添加剤として含む質量分析用キット１００を用いて質量分析用試料を調製すると、ナトリウムが優位に付加したイオンが得られ、さらに感度の低下や夾雑物による悪影響が抑制された測定データを得ることができる。
The salt of the carboxylic acid contained in the
マトリックス試薬２０は、上述のステップＳ１００１において説明された液体マトリックスを構成するアミンおよび有機物質の少なくとも一つを含むことが好ましい。これにより、質量分析用試料の調製に必要なマトリックス添加剤と液体マトリックスを構成する物質とを簡便に調達することができる。マトリックス試薬２０を含む質量分析キット１００の製造方法では、液体マトリックスを構成するアミンおよび有機物質の両方を含む場合、当該アミンおよび有機物質が混合され乾固された状態または液体の状態としてマトリックス用容器２１に配置されることができる。
The
試料プレート３０は、ＭＡＬＤＩ用の試料プレートであれば特に限定されない。試料プレート３０は、ステンレス鋼等の導電性を有する物質を主材料として備え、適宜化学的または物理的に表面処理がなされたものである。試料プレート３０は、９６個や３８４個等の所定の個数の試料配置部位３１を含む。試料プレート３０の試料配置部位３１が形成された表面は、表面粗さが小さいものが好ましく、鏡面仕上げであることが特に好ましい。これにより、均一に、濃縮された質量分析用試料を形成することができる。
The
図２（Ｂ）は、試料プレート３０の試料配置部位３１を模式的に示す上面図である。好適な例では、試料プレート３０の試料配置部位３１は、疎水性表面３２と、親水性表面３３とを備える。疎水性表面３２は、親水性表面３３を取り囲むように形成されている。これにより、疎水性表面３２と親水性表面３３とを合わせた範囲に滴下された、試料と、液体マトリックスと、マトリックス添加剤とを含む混合液は、溶媒が除去される際、疎水性表面３２よりも親水性表面３３の方に残りやすくなる。従って、混合液は親水性表面３３の部分に濃縮され、再現性良く目的の範囲に混合液が残り、均一で濃縮された質量分析用試料を得ることができる。
なお、試料プレート３０の表面の親水性を特に変化させず、試料配置部位３１に形成された円形の溝等により目的の範囲に混合液を残すようにしてもよい。
FIG. 2B is a top view schematically showing the
Note that the hydrophilicity of the surface of the
マトリックス添加剤１０は、糖関連分子を含む質量分析用試料の調製に用いると、感度の低下や夾雑物による悪影響が抑制された測定データを得ることができるため、糖鎖類分析用マトリックス添加剤として好適に用いることができる。
When the
質量分析用キット１００は、糖関連分子を含む質量分析用試料の調製に用いると、感度の低下や夾雑物による悪影響が抑制された測定データを得ることができるため、糖鎖類質量分析用キットとして好適に用いることができる。
When the
本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。 The present invention is not limited to the contents of the above embodiment. Other embodiments conceivable within the scope of the technical idea of the present invention are also included in the scope of the present invention.
以下に、実施例を示すが、本発明は下記の実施例における分析条件等に限定されるものではない。 Examples are shown below, but the present invention is not limited to the analysis conditions and the like in the following Examples.
（実施例１：G3CAマトリックスを用いたマトリックス添加剤の検討）
＜１−１．マトリックス添加剤の種類の検討＞
試料としてピリジルアミノ化されたNA4型糖鎖（タカラバイオ）（モノアイソトピック質量:2448.9）を用い、G3CAマトリックスに対するマトリックス添加剤（以下、単に添加剤と呼ぶ）の検討を行った。G3CAマトリックスは、p-クマル酸10mgを10mg/mLになるように50%アセトニトリル(ACN)に溶解し、1,1,3,3−テトラメチルグアニジンを23.1μＬ加えることにより調製した。MALDI試料プレートは、700um uFocus plate (Hudson Surface Technology) を用いた。それぞれのウェル（試料配置部位）に対して100fmol/μＬの試料溶液0.5μＬ、添加剤であるナトリウム塩（5mM）0.5μＬを滴下し、その後液体マトリックスを含むマトリックス溶液を0.5μＬ滴下し、余剰溶媒を風乾させることで質量分析用試料とした。添加剤については、(a)添加剤なしのコントロールの他、(b)塩化ナトリウム(NaCl)、(c)水酸化ナトリウム(NaOH)、(d)酢酸ナトリウム、(e)NaTFA、(f)リン酸水素二ナトリウム、(g)炭酸水素ナトリウム、(h)クエン酸二水素ナトリウムの各化合物を添加剤としてMALDI試料プレートに滴下した。(e)が実施例であり、その他は比較例である。質量分析は、MALDI−イオントラップ−飛行時間型質量分析計（MALDI-QIT-TOFMS） (AXIMA-Resonance, Shimadzu/Kratos)で行った。
(Example 1: Investigation of matrix additive using G3CA matrix)
<1-1. Study of types of matrix additives>
Using a NA4 type sugar chain (Takara Bio) (monoisotopic mass: 2448.9) pyridylaminated as a sample, a matrix additive for the G3CA matrix (hereinafter simply referred to as additive) was examined. The G3CA matrix was prepared by dissolving 10 mg of p-coumaric acid in 50% acetonitrile (ACN) to 10 mg / mL and adding 23.1 μL of 1,1,3,3-tetramethylguanidine. A 700 um uFocus plate (Hudson Surface Technology) was used as the MALDI sample plate. Add 0.5 μL of 100 fmol / μL sample solution and 0.5 μL of sodium salt (5 mM) as an additive to each well (sample placement site), and then add 0.5 μL of a matrix solution containing a liquid matrix to the excess solvent. Was air-dried to obtain a sample for mass spectrometry. In addition to (a) control without additives, (b) sodium chloride (NaCl), (c) sodium hydroxide (NaOH), (d) sodium acetate, (e) NaTFA, (f) phosphorus Each compound of disodium oxyhydrogen, (g) sodium bicarbonate, and (h) sodium dihydrogen citrate was added dropwise to the MALDI sample plate as an additive. (e) is an example and the others are comparative examples. Mass spectrometry was performed with a MALDI-ion trap-time-of-flight mass spectrometer (MALDI-QIT-TOFMS) (AXIMA-Resonance, Shimadzu / Kratos).
図３は、本実施例の質量分析で得られたマススペクトルである。上段から順に、上記(a)から(h)までの各条件に対応するマススペクトルを示した。図３の右側には、点線で囲まれたNA4型糖鎖に対応するピークを拡大して示した（矢印Ａ１）。各ピークに対応して示されているｍ／ｚの値は、当該ピークに対応するイオンのモノアイソトピック質量を示す（図４〜６も同様）。ナトリウム塩を添加していないG3CAを用いて質量分析試料を調製した場合、NA4型糖鎖に対応するナトリウム付加分子に加えてプロトン付加分子やカリウム付加分子、2ナトリウム付加分子等が観測された。添加剤として固体マトリックスに対して一般的に用いられるNaClをG3CAに加えた場合、NA4型糖鎖に対応するイオン種をナトリウム付加分子のみに収束させることができたが、低m/z領域に夾雑ピークが見られ、全体的な感度は低下した。一方でNaTFAの場合は、低m/z領域に夾雑ピークを生じることなく、NA4型糖鎖に対応するイオン種をナトリウム付加分子のみに収束することができた。他のナトリウム塩を添加した場合でも、NA4型糖鎖に対応するイオン種はナトリウム付加分子のみに収束できたが、低m/z領域に著しいクラスター状のピークが観測され、実用性を欠いた。リン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムを用いた場合は、ウェルに滴下したNA4型糖鎖 50fmolの検出が困難であった。 FIG. 3 is a mass spectrum obtained by mass spectrometry of this example. In order from the top, mass spectra corresponding to the above conditions (a) to (h) are shown. The right side of FIG. 3 shows an enlarged peak corresponding to the NA4 type sugar chain surrounded by a dotted line (arrow A1). The value of m / z shown corresponding to each peak indicates the monoisotopic mass of the ion corresponding to the peak (the same applies to FIGS. 4 to 6). When a mass spectrometric sample was prepared using G3CA to which no sodium salt was added, proton-added molecules, potassium-added molecules, disodium-added molecules, and the like were observed in addition to sodium-added molecules corresponding to NA4 type sugar chains. When NaCl, commonly used for solid matrices, was added to G3CA as an additive, the ionic species corresponding to the NA4 type sugar chain could be focused only on sodium-added molecules, but in the low m / z region. Contaminated peaks were seen and overall sensitivity was reduced. On the other hand, in the case of NaTFA, the ionic species corresponding to the NA4-type sugar chain was able to converge only on the sodium-added molecule without causing a contamination peak in the low m / z region. Even when other sodium salts were added, the ion species corresponding to the NA4 type sugar chain was able to converge only on the sodium-added molecule, but a remarkable cluster-like peak was observed in the low m / z region, which was not practical. . When sodium phosphate and sodium citrate were used, it was difficult to detect 50 fmol of NA4 type sugar chain dropped into the well.
＜１−２．試料の検出限界の検討＞
添加剤としてNaTFA(5mM)およびNaCl(5mM)を用い、各ウェルに試料として加えるNA4型糖鎖の量を変化させた他は、１−１と同様の条件で質量分析を行い、NA4型糖鎖の検出限界の比較を行った。NaTFAについては、各ウェルに10fmol, 5fmol, 2.5fmol, 1.3fmol, 0.7fmolおよび0.3fmolのNA4型糖鎖を加えて質量分析を行った(本実施例)。NaClについては、各ウェルに10fmol, 5fmol, 2.5fmolおよび1.3fmolのNA4型糖鎖を加えて質量分析を行った。(比較例)
<1-2. Examination of sample detection limit>
Using NATFA (5 mM) and NaCl (5 mM) as additives and changing the amount of NA4 type sugar chain added as a sample to each well, mass spectrometry was performed under the same conditions as in 1-1, and NA4 type sugar was used. Comparison of strand detection limits was performed. For NaTFA, 10 fmol, 5 fmol, 2.5 fmol, 1.3 fmol, 0.7 fmol, and 0.3 fmol of NA4 type sugar chain were added to each well, and mass spectrometry was performed (this example). For NaCl, mass spectrometry was performed by adding 10 fmol, 5 fmol, 2.5 fmol, and 1.3 fmol NA4 type sugar chains to each well. (Comparative example)
図４（Ａ）は、NaTFAと、上記各量のNA4型糖鎖とを含む、各ウェルに配置された質量分析用試料を質量分析して得られたマススペクトルである（実施例）。図４（Ｂ）は、NaClと、上記各量のNA4型糖鎖を含む、各ウェルに配置された質量分析用試料を質量分析して得られたマススペクトルである（比較例）。NaTFAの場合はNA4型糖鎖0.3fmolが検出限界であったが、NaClの場合はNA4型糖鎖2.5fmolの検出が難しかった。したがって、NaClと比べてNaTFAでは約一桁、検出限界が改善した。 FIG. 4 (A) is a mass spectrum obtained by mass spectrometry of a sample for mass spectrometry arranged in each well containing NaTFA and each amount of the NA4 type sugar chain (Example). FIG. 4 (B) is a mass spectrum obtained by mass spectrometry of a sample for mass spectrometry arranged in each well containing NaCl and the above-mentioned amounts of NA4 sugar chains (comparative example). In the case of NaTFA, detection limit was 0.3 fmol of NA4 type sugar chain, but detection of 2.5 fmol of NA4 type sugar chain was difficult in the case of NaCl. Therefore, the detection limit improved by about an order of magnitude with NaTFA compared with NaCl.
（実施例２：GTHAPマトリックスを用いた添加剤の検討）
糖鎖の質量分析の際に用いられる他の液体マトリックス（GTHAP）でも効果を確めた。GTHAPの調製では、2,4,6−トリヒドロキシアセトフェノン(2,4,6-Trihydroxyacetophenone) 10mgを50%ACN 1mLに溶解して10mg/mLとし、1,1,3,3−テトラメチルグアニジンを6.8μＬ加えてGTHAP液体マトリックス溶液とした。(a)ナトリウム塩を添加していないGTHAPとNA4型糖鎖 50fmolとを含む質量分析用試料、(b) NaCl(5mM)を添加剤として加えたGTHAPとNA4型糖鎖 50fmolとを含む質量分析用試料および、(c) NaTFA(5mM)を添加剤として加えたGTHAPとNA4型糖鎖 50fmolとを含む質量分析用試料を調製し、上記１−１と同様の方法で質量分析を行った。
(Example 2: Examination of additives using GTHAP matrix)
The effect was also confirmed with another liquid matrix (GTHAP) used for glycan mass spectrometry. For the preparation of GTHAP, 10 mg of 2,4,6-trihydroxyacetophenone (2,4,6-Trihydroxyacetophenone) was dissolved in 1 mL of 50% ACN to 10 mg / mL, and 1,1,3,3-tetramethylguanidine was added. 6.8 μL was added to obtain a GTHAP liquid matrix solution. (a) Mass spectrometric sample containing GTHAP to which sodium salt is not added and NA4
図５は、本実施例の各質量分析用試料を質量分析することにより得られたマススペクトルである。図５の右側には、点線で囲まれたNA4型糖鎖に対応するピークを拡大して示した（矢印Ａ２）。ナトリウム塩を添加していない質量分析用試料を質量分析すると、NA4型糖鎖に対応するナトリウム付加分子に加えてプロトン付加分子およびカリウム付加分子が観測された(a:比較例)。NaClを添加剤として加えた質量分析用試料ではナトリウム付加分子のみに収束させることができたが、感度が著しく低下し、低m/z領域に夾雑ピークが観測された(b:比較例)。NaTFAを添加剤として加えた質量分析用試料では、このような夾雑ピークが生じることなく、また感度を損なうことなくナトリウム付加分子のみにイオン種を収束させることができた(c:本実施例)。 FIG. 5 is a mass spectrum obtained by mass analysis of each sample for mass spectrometry of this example. On the right side of FIG. 5, the peak corresponding to the NA4 type sugar chain surrounded by a dotted line is shown enlarged (arrow A2). When mass spectrometry was performed on a sample for mass spectrometry to which no sodium salt was added, proton-added molecules and potassium-added molecules were observed in addition to sodium-added molecules corresponding to NA4 type sugar chains (a: comparative example). In the sample for mass spectrometry to which NaCl was added as an additive, it was possible to converge only on sodium-added molecules, but the sensitivity was remarkably reduced, and a contamination peak was observed in the low m / z region (b: comparative example). In the sample for mass spectrometry to which NaTFA was added as an additive, it was possible to focus the ion species only on the sodium-added molecule without causing such a contamination peak and without impairing the sensitivity (c: this example). .
（実施例３：3AQ/CAマトリックスを用いた添加剤の検討）
糖鎖の質量分析の際に用いられる他の液体マトリックス（3AQ/CA）でも効果を確かめた。p-クマル酸を100mM, 3-アミノキノリンを900mMの濃度で含む50%ACN溶液を調製し、この溶液をさらに50%ACNで1/5に希釈した溶液を3AQ/CA液体マトリックス溶液とした。(a)ナトリウム塩を添加していない3AQ/CAとNA4型糖鎖 500fmolとを含む質量分析用試料および、(b) NaTFA(5mM)を添加剤として加えた3AQ/CAとNA4型糖鎖500fmolとを含む質量分析用試料を調製し、質量分析を行った。
(Example 3: Examination of additives using 3AQ / CA matrix)
The effect was also confirmed with another liquid matrix (3AQ / CA) used for mass spectrometry of glycans. A 50% ACN solution containing 100 mM p-coumaric acid and 900 mM 3-aminoquinoline was prepared, and this solution was further diluted to 1/5 with 50% ACN to obtain a 3AQ / CA liquid matrix solution. (a) Sample for mass spectrometry containing 3AQ / CA without addition of sodium salt and 500 fmol of NA4 type sugar chain, and (b) 3AQ / CA and NA4 type sugar chain of 500 fmol with NaTFA (5 mM) added as an additive. The sample for mass spectrometry containing these was prepared, and mass spectrometry was performed.
図６は、本実施例の各質量分析用試料を質量分析することにより得られたマススペクトルである。図６の右側には、点線で囲まれたNA4型糖鎖に対応するピークを拡大して示した（矢印Ａ３）。ナトリウム塩を添加していない質量分析用試料を質量分析すると、NA4型糖鎖に対応するナトリウム付加分子に加えてプロトン付加分子とカリウム付加分子、その他多くのカチオン付加分子が観測された(a:比較例)。NaTFAを加えた質量分析用試料では、ナトリウム付加分子のみに観測されるイオン種を収束させることができた。また、低m/z領域に観測されていたクラスター状のピークも抑制することができた(b:本実施例)。 FIG. 6 is a mass spectrum obtained by mass analysis of each sample for mass spectrometry of this example. On the right side of FIG. 6, the peak corresponding to the NA4 type sugar chain surrounded by a dotted line is shown enlarged (arrow A3). When mass spectrometry was performed on a sample for mass spectrometry to which no sodium salt was added, proton-added molecules, potassium-added molecules, and many other cation-added molecules were observed in addition to sodium-added molecules corresponding to NA4 type sugar chains (a: Comparative example). In the sample for mass spectrometry to which NaTFA was added, the ion species observed only in the sodium addition molecule could be converged. Moreover, the cluster-like peak observed in the low m / z region could also be suppressed (b: this example).
１０…マトリックス添加剤、１１…添加剤用容器、２０…マトリックス試薬、２１…マトリックス用容器、３０…試料プレート、３１…試料配置部位、３２…疎水性表面、３３…親水性表面、１００…質量分析用キット。
DESCRIPTION OF
Claims (14)
前記質量分析用試料にレーザー光を照射してイオン化を行うことと、
前記イオン化により生じたイオンまたは前記イオンを解離したイオンを質量分離して検出することと、
を備える分析方法。 Preparing a sample for mass spectrometry by mixing a sample, a matrix reagent containing a substance constituting a liquid matrix, and a matrix additive comprising a carboxylic acid containing one or more halogen atoms or a salt thereof;
Performing ionization by irradiating the sample for mass spectrometry with laser light;
Mass separation and detection of ions generated by the ionization or ions dissociated from the ions;
An analysis method comprising:
前記ハロゲン原子は、フッ素原子である分析方法。 The analysis method according to claim 1,
The analysis method wherein the halogen atom is a fluorine atom.
前記マトリックス添加剤は、トリフルオロ酢酸塩である分析方法。 The analysis method according to claim 1 or 2,
The analytical method wherein the matrix additive is trifluoroacetate.
前記マトリックス添加剤は、ナトリウム塩またはカリウム塩である分析方法。 In the analysis method as described in any one of Claim 1 to 3,
The analytical method wherein the matrix additive is a sodium salt or a potassium salt.
前記マトリックス試薬は、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノンまたはクマル酸、および、アミンまたはその塩を含む分析方法。 In the analysis method as described in any one of Claim 1 to 4,
The analytical method wherein the matrix reagent contains 2,4,6-trihydroxyacetophenone or coumaric acid, and an amine or a salt thereof.
前記アミンは、１，１，３，３−テトラメチルグアニジンまたは３−アミノキノリンである分析方法。 The analysis method according to claim 5,
The analytical method wherein the amine is 1,1,3,3-tetramethylguanidine or 3-aminoquinoline.
前記試料は、糖、糖鎖、および糖または糖鎖の誘導体のうち少なくとも一つを含む分子を備える分析方法。 In the analysis method as described in any one of Claim 1-6,
The analysis method includes a molecule containing at least one of a sugar, a sugar chain, and a sugar or a sugar chain derivative.
液体マトリックスに添加するためのマトリックス添加剤。 Comprising a carboxylic acid or salt thereof containing one or more halogen atoms,
Matrix additive for addition to a liquid matrix.
前記ハロゲン原子は、フッ素原子であるマトリックス添加剤。 The matrix additive according to claim 8,
The matrix additive, wherein the halogen atom is a fluorine atom.
前記カルボン酸は、トリフルオロ酢酸であるマトリックス添加剤。 The matrix additive according to claim 8 or 9,
The matrix additive, wherein the carboxylic acid is trifluoroacetic acid.
前記カルボン酸の塩は、ナトリウム塩またはカリウム塩であるマトリックス添加剤。 In the matrix additive according to any one of claims 8 to 10,
The matrix additive, wherein the carboxylic acid salt is a sodium salt or a potassium salt.
前記マトリックス添加剤は、糖鎖および糖鎖誘導体のうち少なくとも一つを含む分子を備える試料の質量分析に用いられる糖鎖類分析用マトリックス添加剤。 A matrix additive according to any one of claims 8 to 10, comprising
The matrix additive is a matrix additive for analyzing sugar chains used for mass spectrometry of a sample having a molecule containing at least one of a sugar chain and a sugar chain derivative.
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