JP2010249576A - Method of measuring sugar chain with high sensitivity using mass analyzer - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、質量分析装置を用いた糖鎖の高感度測定法に関する。 The present invention relates to a sugar chain high-sensitivity measurement method using a mass spectrometer.
これまでに、ＭＡＬＤＩ質量分析測定に用いるターゲットとして、その表面に特殊な疎水性／親水性の皮膜処理が施されたものが販売されている。このような類のターゲットは、フォーカス（focusing）という現象を利用することによって試料とマトリックスとの混合結晶調製を可能にするものであり、フォーカスターゲットと呼称されている。フォーカスとは、試料とマトリックスとを溶媒中に含む液滴がターゲット上に滴下された後、時間経過によって当該液滴の体積減少とともにターゲット上における当該液滴の広がり面積の縮小が起き、それにより、当該液滴に含まれる不揮発分が、その広がり面積の中央付近へ集まる現象をいう。
このように試料とマトリックスとの液滴がフォーカスされることによって、高感度な測定が可能とされている。
So far, a target whose surface has been subjected to a special hydrophobic / hydrophilic film treatment has been sold as a target used for MALDI mass spectrometry measurement. This kind of target enables the preparation of a mixed crystal of a sample and a matrix by utilizing a phenomenon called focusing, and is called a focus target. Focusing means that after a droplet containing a sample and a matrix in a solvent is dropped on the target, the volume of the droplet decreases with time, and the spreading area of the droplet on the target decreases. The phenomenon that the non-volatile content contained in the droplets gathers near the center of the spreading area.
Thus, highly sensitive measurement is possible by focusing the droplets of the sample and the matrix.
フォーカスターゲットを用いたＭＡＬＤＩ質量分析法の一例として、測定対象をタンパク質・ペプチドとした場合に、液体マトリックスである３−アミノキノリン/α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（３−アミノキノリンとα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を含む液体物質；3AQ/CHCA）をグリセロールとともに用い、さらに添加剤としてリン酸アンモニウムを加えることで、高感度な測定ができたことが報告されている。このような高感度測定は、リン酸アンモニウムを加えることで、マトリックスクラスターといった非特異的なイオンや付加イオンの形成を抑え、その結果、試料由来イオンの感度が上昇したことによって実現されるものであると考えられている（非特許文献１：Proteomics 2005, 5, 360-370参照）。 As an example of MALDI mass spectrometry using a focus target, when a measurement object is a protein / peptide, 3-aminoquinoline / α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (3-aminoquinoline and α It has been reported that a liquid substance containing cyano-4-hydroxycinnamic acid; 3AQ / CHCA) was used together with glycerol, and ammonium phosphate was further added as an additive, so that highly sensitive measurement could be performed. Such high-sensitivity measurement is realized by adding ammonium phosphate to suppress the formation of non-specific ions such as matrix clusters and adduct ions, and as a result, the sensitivity of sample-derived ions has increased. It is considered to exist (see Non-Patent Document 1: Proteomics 2005, 5, 360-370).
また、フォーカスターゲットを用いたＭＡＬＤＩ質量分析法の他の一例として、測定対象を糖鎖とした場合に、液体マトリックスである１，１，３，３−テトラメチルグアニジン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸(G2CHCA)や、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン／ｐ−クマル酸(G3CA)を用いることによって、一般的に糖鎖の測定に使用されている固体マトリックスである２，５−ゲンシジン酸(DHB)よりも比較的高感度な測定ができたことが報告されている（非特許文献２：Anal. Chem. 2008, 80, 2171-2179参照）。 As another example of MALDI mass spectrometry using a focus target, 1,1,3,3-tetramethylguanidine / α-cyano-4-hydroxy, which is a liquid matrix, when a measurement target is a sugar chain By using cinnamic acid (G2CHCA) and 1,1,3,3-tetramethylguanidine / p-coumaric acid (G3CA), it is a solid matrix generally used for measuring sugar chains. It has been reported that measurement with relatively higher sensitivity than 5-gencidic acid (DHB) was possible (see Non-Patent Document 2: Anal. Chem. 2008, 80, 2171-2179).
さらに、フォーカスターゲットを用いたＭＡＬＤＩ質量分析法のさらなる他の一例として、測定対象を糖鎖とした場合に、液体マトリックスである３−アミノキノリン/α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（3AQ/CHCA）を用いることができることが開示されている（特許文献１：特開２００８−２６１８２５号公報参照）。 Furthermore, as yet another example of MALDI mass spectrometry using a focus target, when a measurement target is a sugar chain, 3-aminoquinoline / α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (3AQ / (CHCA) can be used (see Patent Document 1: Japanese Patent Laid-Open No. 2008-261825).
一方、通常のサンプルターゲットを用いたＭＡＬＤＩ質量分析においては、測定対象を糖鎖とした場合に、マトリックスとして固体塩であるハルミン、ハルマン、ノルハルマン、ハルマリンなどを用い、さらに添加剤として塩化アンモニウムを加えることで、好感度な測定ができたことが報告されている（非特許文献３：J. Mass Spectrom. Soc. Jpn., Vol. 55, No. 3, 2007, 137-144参照）。 On the other hand, in MALDI mass spectrometry using a normal sample target, when a measurement target is a sugar chain, a solid salt such as harmine, harman, norharman, or harmine is used as a matrix, and ammonium chloride is added as an additive. Thus, it has been reported that favorable measurement was possible (see Non-Patent Document 3: J. Mass Spectrom. Soc. Jpn., Vol. 55, No. 3, 2007, 137-144).
近年、バイオマーカー探索などといった研究分野において、ごく微量の糖鎖測定を可能にする技術の確立が要求されている。
しかし、これまで、一般的に使用されている糖鎖測定用マトリックスであるDHBでは感度が不十分であった。具体的には、フォーカスターゲットを用いた場合であっても、その感度はフェムトモルオーダー（ポジティブモード、ネガティブモード共に）である。
また、3AQ/CHCAが高感度測定を可能にするとはいっても、それ単独で糖鎖測定に用いられる場合、その感度はフェムトモルオーダー（ポジティブモードの場合）又はピコモルオーダー（ネガティブモードの場合）の範囲にとどまる。一方、当該3AQ/CHCAがグリセロールとともに用いられ且つ添加剤と組み合わされてタンパク質・ペプチド測定に用いられる場合においても、その感度はなおフェムトモルオーダー（ポジティブモード）の範囲内にとどまる。
In recent years, in research fields such as biomarker search, it has been required to establish a technique that enables measurement of a very small amount of sugar chains.
However, until now, the sensitivity of DHB, which is a commonly used matrix for measuring sugar chains, has been insufficient. Specifically, even when a focus target is used, the sensitivity is in femtomole order (both positive mode and negative mode).
In addition, even though 3AQ / CHCA enables high-sensitivity measurement, when used alone for sugar chain measurement, the sensitivity is in femtomol order (in positive mode) or picomolar order (in negative mode). Stay in range. On the other hand, even when the 3AQ / CHCA is used with glycerol and combined with an additive for protein / peptide measurement, the sensitivity still falls within the femtomole order (positive mode).
そこで本発明の目的は、微量の糖鎖を検出することができる、質量分析を用いた糖鎖の高感度測定法を提供することにある。 Therefore, an object of the present invention is to provide a sugar chain sensitive measurement method using mass spectrometry, which can detect a minute amount of sugar chains.
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、アミノキノリンタイプの液体マトリックスを使用し、添加剤としてアンモニウム塩を組み合わせることによって、糖鎖の測定感度が飛躍的に上昇することを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies, the present inventors have found that the measurement sensitivity of sugar chains is dramatically increased by using an aminoquinoline type liquid matrix and combining ammonium salts as additives. It came to complete.
本発明は、以下の発明を含む。
（１）
（i）糖鎖分子を含む解析すべき試料と、
アミノキノリンと酸性基含有物質とを含む液体物質である液体マトリックスと、
添加剤としてのアンモニウム塩と、
を溶媒中に含む混合液の液滴をターゲットプレート上に形成する工程と、
（ii）前記混合液の液滴から前記溶媒を除去して、前記液滴の体積の減少とともに、前記ターゲットプレートと前記混合液の液滴とが接する面積を縮小させることによって、前記混合液中に含まれる前記解析すべき試料と前記液体マトリックスと前記添加剤とを前記面積の一部へ集め、前記解析すべき試料と前記液体マトリックスと前記添加剤とを含む混合物のフォーカススポットを得る工程と、
（iii）前記混合物のフォーカススポットをＭＡＬＤＩ質量分析測定に供する工程と、
を含む、糖鎖の高感度ＭＡＬＤＩ質量分析法。
The present invention includes the following inventions.
(1)
(I) a sample to be analyzed containing sugar chain molecules;
A liquid matrix that is a liquid substance containing an aminoquinoline and an acidic group-containing substance;
An ammonium salt as an additive;
Forming a droplet of a mixed solution containing a solvent in a solvent on a target plate;
(Ii) removing the solvent from the droplets of the mixed solution, and reducing the volume of the droplets and reducing the area where the target plate and the droplets of the mixed solution are in contact with each other; Collecting the sample to be analyzed, the liquid matrix, and the additive contained in a part of the area to obtain a focus spot of a mixture including the sample to be analyzed, the liquid matrix, and the additive; ,
(Iii) subjecting the focus spot of the mixture to MALDI mass spectrometry measurement;
Sensitive MALDI mass spectrometry of sugar chains, comprising:
本明細書においては、上記（１）のように液体マトリックスとして用いることができる液状物質である「アミノキノリンと酸性基含有物質とを含む液体物質」を、「アミノキノリン／酸性基含有物質」と記載することがある。 In the present specification, “a liquid substance containing an aminoquinoline and an acidic group-containing substance”, which is a liquid substance that can be used as a liquid matrix as described in (1) above, is referred to as an “aminoquinoline / acidic group-containing substance”. May be described.
「前記混合液の液滴から前記溶媒を除去」することに伴う「前記液滴の体積の減少」は、前記混合液が濃縮されること、すなわち混合液中の「前記解析すべき試料と前記液体マトリックスと前記添加剤」の濃度が高くなることを意味する。本発明では、当該濃縮が、「前記ターゲットプレートと前記混合液の液滴とが接する面積を縮小させること」とともに起こる（この現象を「フォーカス現象」と記載することがある）ため、「前記混合液中に含まれる前記解析すべき試料と前記液体マトリックスと前記添加剤を前記面積の一部へ集め」ることができる。混合液中の溶媒の大部分或いは全てが除去されれば、残渣として、「前記面積の一部」に、前記「混合物のフォーカススポット」が得られる。
すなわち、「解析すべき試料」と「液体マトリックス」と「添加剤」と「溶媒」とを含む「混合液」から、「溶媒」が除去されて残る残渣を「混合物」として得る。
The “reduction of the volume of the droplet” associated with “removing the solvent from the droplet of the mixed solution” means that the mixed solution is concentrated, that is, the “sample to be analyzed and the sample in the mixed solution” This means that the concentration of the “liquid matrix and the additive” is increased. In the present invention, the concentration occurs together with “reducing the area where the target plate and the droplets of the mixed solution are in contact with each other” (this phenomenon may be referred to as “focus phenomenon”). The sample to be analyzed, the liquid matrix, and the additive contained in the liquid can be collected in a part of the area. If most or all of the solvent in the mixed solution is removed, the “focus spot of the mixture” is obtained as “a part of the area” as a residue.
That is, from the “mixed solution” including the “sample to be analyzed”, “liquid matrix”, “additive”, and “solvent”, the residue remaining after the “solvent” is removed is obtained as the “mixture”.
「混合物のフォーカススポット」（フォーカススポット：focused spot）は、混合液中に含まれる解析すべき試料とイオン性液体と添加剤とが、前記広がり面積領域の一部を占める微小な面積領域（すなわち下記（６）における「混合物のフォーカススポットとターゲットプレートとが接する面積」に相当する領域）へ集積されることによって形成されたものである。
「混合物のフォーカススポット」は、ＭＡＬＤＩ質量分析に供されるべき調製物であって、すなわちレーザー光を照射されるべき対象物である。
A “focus spot of the mixture” (focused spot) is a minute area region (that is, a sample to be analyzed, an ionic liquid, and an additive contained in a mixed solution that occupy a part of the expanded area region (that is, a focused spot). It is formed by being integrated into “the area corresponding to the area where the focus spot of the mixture and the target plate are in contact” in (6) below.
The “focus spot of the mixture” is the preparation to be subjected to MALDI mass spectrometry, ie the object to be irradiated with laser light.
（２）
前記アンモニウム塩が、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム及びリン酸アンモニウムからなる群から選ばれる、（１）に記載の糖鎖の高感度ＭＡＬＤＩ質量分析法。
(2)
The high-sensitivity MALDI mass spectrometry method for sugar chains according to (1), wherein the ammonium salt is selected from the group consisting of ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium phosphate.
（３）
前記工程（i）における前記アンモニウム塩としてリン酸アンモニウムを用いる場合、
前記工程（iii）における質量分析測定をネガティブモードで行い、［Ｍ−Ｈ］−イオンと、［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオン及び／又は［Ｍ＋ＰＯ３］−イオンと、からなるピークを検出することによって、前記解析すべき試料から前記糖鎖に由来するイオンを特異的に検出する、（２）に記載の糖鎖の高感度ＭＡＬＤＩ質量分析法。
(3)
When using ammonium phosphate as the ammonium salt in the step (i),
The mass spectrometric measurement in the step (iii) is performed in a negative mode, and a peak composed of [M−H] − ion, [M + H 2 PO 4 ] − ion and / or [M + PO 3 ] − ion is detected. The glycan high-sensitivity MALDI mass spectrometry method according to (2), wherein ions derived from the glycan are specifically detected from the sample to be analyzed.
すなわち、上記（３）の方法のように、液体マトリックスの添加剤としてリン酸アンモニウムを用いる場合には、質量分析測定をネガティブモードで行うと、解析すべき試料中に含まれる糖鎖のイオンが、［Ｍ−Ｈ］−イオンとしてだけでなく、［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオンや［Ｍ＋ＰＯ３］−イオンとしても検出される。当該［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオン及び［Ｍ＋ＰＯ３］−イオンは、糖鎖に特有のものとして検出され、糖鎖以外の分子種からは検出されない。 That is, when ammonium phosphate is used as an additive for the liquid matrix as in the method (3) above, if mass spectrometry is performed in the negative mode, the sugar chain ions contained in the sample to be analyzed are , [M−H] − ions as well as [M + H 2 PO 4 ] − ions and [M + PO 3 ] − ions are detected. The [M + H 2 PO 4 ] − ion and [M + PO 3 ] − ion are detected as unique to sugar chains, and are not detected from molecular species other than sugar chains.
上記（３）の工程（iii）では、具体的には、［Ｍ−Ｈ］−イオンと［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオン；［Ｍ−Ｈ］−イオンと［Ｍ＋ＰＯ３］−イオン；又は、［Ｍ−Ｈ］−イオンと［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオンと［Ｍ＋ＰＯ３］−イオンを検出する。［Ｍ−Ｈ］−イオンと［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオンとの間には９８Ｄａ、［Ｍ−Ｈ］−イオンと［Ｍ＋ＰＯ３］−イオンとのに間は８０Ｄａの質量差がある。従って、糖鎖の検出・同定は、これら特徴的なピークが有する一定の質量差（すなわち、９８Ｄａ差；８０Ｄａ差；又は、９８Ｄａ差及び８０Ｄａ差の両方）の情報を利用することによって行うことができる。このことによって、解析すべき試料が糖鎖と糖鎖以外の分子との混合物であっても、糖鎖を容易に検出・同定することができる。 In step (iii) of the above (3), specifically, [M−H] − ion and [M + H 2 PO 4 ] − ion; [M−H] − ion and [M + PO 3 ] − ion; or [M−H] − ions, [M + H 2 PO 4 ] − ions and [M + PO 3 ] − ions are detected. There is a mass difference of 98 Da between [M−H] − ion and [M + H 2 PO 4 ] − ion, and 80 Da between [M−H] − ion and [M + PO 3 ] − ion. Therefore, detection and identification of sugar chains can be performed by using information of a certain mass difference (that is, 98 Da difference; 80 Da difference; or both 98 Da difference and 80 Da difference) possessed by these characteristic peaks. it can. Thus, even when the sample to be analyzed is a mixture of sugar chains and molecules other than sugar chains, the sugar chains can be easily detected and identified.
（４）
前記アミノキノリンが、３−アミノキノリン及びその構造異性体からなる群から選ばれる、（１）〜（３）のいずれかに記載の糖鎖の高感度ＭＡＬＤＩ質量分析法。
(4)
The sugar chain highly sensitive MALDI mass spectrometry method according to any one of (1) to (3), wherein the aminoquinoline is selected from the group consisting of 3-aminoquinoline and structural isomers thereof.
「３−アミノキノリン」の「構造異性体」には、２−アミノキノリン、４−アミノキノリン、５−アミノキノリン、６−アミノキノリン、７−アミノキノリン、及び８−アミノキノリンが含まれる。 “Structural isomers” of “3-aminoquinoline” include 2-aminoquinoline, 4-aminoquinoline, 5-aminoquinoline, 6-aminoquinoline, 7-aminoquinoline, and 8-aminoquinoline.
（５）
前記酸性基含有物質はα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）及び２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）からなる群から選ばれる、（１）〜（４）のいずれかに記載の糖鎖の高感度ＭＡＬＤＩ質量分析法。
(5)
The acidic group-containing substance is selected from the group consisting of α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) and 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB), according to any one of (1) to (4). Highly sensitive MALDI mass spectrometry of sugar chains.
前記混合物のフォーカススポットと前記ターゲットプレートとが接する面積は、形成された直後の前記混合液の液滴と前記ターゲットプレートが接する面積の８０％以下に縮小されうる。 The area where the focus spot of the mixture is in contact with the target plate may be reduced to 80% or less of the area where the droplet of the mixed liquid just formed is in contact with the target plate.
上記の縮小率（８０％以下）について、その下限値としては特に限定されるものではないが、例えば０．００１％である。 The lower limit of the reduction ratio (80% or less) is not particularly limited, but is, for example, 0.001%.
本発明によると、微量の糖鎖を検出することができる、質量分析を用いた糖鎖の高感度測定が可能になる。例えばポジティブモードでアトモルオーダー、ネガティブモードでフェムトモルオーダーの検出感度での糖鎖測定が可能になる。 According to the present invention, it is possible to measure sugar chains with high sensitivity using mass spectrometry, which can detect a minute amount of sugar chains. For example, sugar chains can be measured with detection sensitivity of attomole order in the positive mode and femtomol order in the negative mode.
［１．混合液の液滴調製］
［１−１．液体マトリックス］
［１−１−１．液体マトリックスの種類］
本発明においては、マトリックスとして、室温で液体状のマトリックス（すなわち液体マトリックス）を用いる。
液体マトリックスとしては、アミノキノリンと酸性基含有物質とから構成される液体物質（アミノキノリン／酸性基含有物質）を用いる。
アミノキノリンとしては、具体的には、３−アミノキノリン及びその構造異性体が挙げられる。当該構造異性体には、２−アミノキノリン、４−アミノキノリン、５−アミノキノリン、６−アミノキノリン、７−アミノキノリン、及び８−アミノキノリンが含まれる。
[1. Preparation of mixed liquid droplets]
[1-1. Liquid matrix]
[1-1-1. Types of liquid matrix]
In the present invention, a matrix that is liquid at room temperature (that is, a liquid matrix) is used as the matrix.
As the liquid matrix, a liquid substance (aminoquinoline / acidic group-containing substance) composed of aminoquinoline and an acidic group-containing substance is used.
Specific examples of aminoquinoline include 3-aminoquinoline and structural isomers thereof. Such structural isomers include 2-aminoquinoline, 4-aminoquinoline, 5-aminoquinoline, 6-aminoquinoline, 7-aminoquinoline, and 8-aminoquinoline.
酸性基含有物質としては、特に限定されず、酸性基含有有機物質であってもよいし、酸性基含有無機物質であってもよい。
酸性基含有有機物質としては、例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、ｐ−クマル酸、α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸、４−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、３−ヒドロキシピコリン酸、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸（シナピン酸）、４−ヒドロキシ−３−メトキシケイ皮酸（フェルラ酸）、カフェイン酸（３，４−ジヒドロキシケイ皮酸）、５−メトキシサリチル酸、２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸、ニコチン酸、ピコリン酸、３−アミノピコリン酸、３−ヒドロキシピコリン酸、２−アミノ安息香酸、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸、６−アザ−２−チオチミン、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン、１，４−ジヒドロ−２−ナフトエ酸、３−インドールアクリル酸、インドール−２−カルボン酸、チオグリコール酸などから選択されうる。好ましくは、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸や２，５−ジヒドロキシ安息香酸が選択される。
酸性基含有無機物質は、例えば、リン酸、ホウ酸、硫酸、ケイ酸などから選択されうる。
The acidic group-containing substance is not particularly limited, and may be an acidic group-containing organic substance or an acidic group-containing inorganic substance.
Examples of the acidic group-containing organic substance include α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 2,5-dihydroxybenzoic acid, p-coumaric acid, α-cyano-3-hydroxycinnamic acid, and 4-hydroxybenzoic acid. P-hydroxybenzoic acid, p-hydroxyphenylpyruvic acid, 3-hydroxypicolinic acid, 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid (sinapic acid), 4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid (ferulic acid) ), Caffeic acid (3,4-dihydroxycinnamic acid), 5-methoxysalicylic acid, 2- (4-hydroxyphenylazo) benzoic acid, nicotinic acid, picolinic acid, 3-aminopicolinic acid, 3-hydroxypicolinic acid 2-aminobenzoic acid, 3-amino-4-hydroxybenzoic acid, 6-aza-2-thiothymine, 2,4,6-trihydroxyacetate It may be selected from tophenone, 1,4-dihydro-2-naphthoic acid, 3-indoleacrylic acid, indole-2-carboxylic acid, thioglycolic acid and the like. Preferably, α-cyano-4-hydroxycinnamic acid and 2,5-dihydroxybenzoic acid are selected.
The acidic group-containing inorganic substance can be selected from, for example, phosphoric acid, boric acid, sulfuric acid, silicic acid and the like.
［１−１−２．液体マトリックスの調製］
液体マトリックスの調製方法としては特に限定されるものではない。具体的な調製方法としては、当該液状物質をマトリックスとして用いる質量分析分野や、当該液状物質を、有機合成反応の溶媒、液−液抽出における液相、ガスクロマトグラフィーにおける固定相、その他の化学的・生化学的等の用途として用いるさまざまな分野において、当業者によって調製されてきた方法に準じることができる。
[1-1-2. Preparation of liquid matrix]
The method for preparing the liquid matrix is not particularly limited. Specific preparation methods include mass spectrometry using the liquid substance as a matrix, the liquid substance as a solvent for organic synthesis reactions, a liquid phase in liquid-liquid extraction, a stationary phase in gas chromatography, and other chemicals. -It can apply to the method prepared by those skilled in the art in various fields used for biochemical and other uses.
例えば、もっとも簡便な調製法の一つとしては、液体マトリックスを構成するアミノキノリンの由来元となるアミノキノリン類と、酸性基含有物質の由来元となる酸物質とを混合して反応させる方法が挙げられる。 For example, as one of the simplest preparation methods, there is a method in which an aminoquinoline that is a source of aminoquinoline constituting a liquid matrix and an acid substance that is a source of an acidic group-containing substance are mixed and reacted. Can be mentioned.
双方の物質を反応させるためには、酸物質をアミノキノリン類に加えても良いし、アミノキノリン類を酸物質に加えても良い。当該双方の物質の反応は、溶媒中で行うことができる。そのため、酸物質及びアミノキノリン類の少なくとも一方を予め溶液として調製して、酸物質をアミノキノリン類に加えても良いし、アミノキノリン類を酸物質に加えても良い。或いは、溶媒に酸物質及びアミノキノリン類を同時に加えても良い。 In order to react both substances, the acid substance may be added to the aminoquinolines, or the aminoquinolines may be added to the acid substance. The reaction of both substances can be carried out in a solvent. Therefore, at least one of the acid substance and aminoquinolines may be prepared in advance as a solution, and the acid substance may be added to the aminoquinolines, or the aminoquinolines may be added to the acid substance. Alternatively, the acid substance and aminoquinolines may be added simultaneously to the solvent.
互いに反応させるべきアミノキノリン類と酸物質との比は、モル比で表して１００：１〜１：１０、好ましくは２０：１〜１：１と設定することができる。溶媒中どのような濃度で双方の物質を反応させるかについては、当業者が適宜決定すればよい。 The ratio of the aminoquinolines to be reacted with each other and the acid substance can be set at a molar ratio of 100: 1 to 1:10, preferably 20: 1 to 1: 1. The concentration of both substances in the solvent to be reacted may be appropriately determined by those skilled in the art.
溶媒中で反応させた場合は、反応後、溶媒を除去することができる。溶媒の除去は、留去、好ましくは減圧下における留去によって行うことができる。溶媒の除去を行った後、液状の物質を液体マトリックスとして得ることができる。或いは、液体マトリックス調製に用いる溶媒と、液滴に含ませるべき溶媒とが同じである場合は、当該溶媒の全てを除去しないことも許容する。 When the reaction is carried out in a solvent, the solvent can be removed after the reaction. The solvent can be removed by distillation, preferably by distillation under reduced pressure. After removing the solvent, a liquid substance can be obtained as a liquid matrix. Alternatively, if the solvent used for preparing the liquid matrix is the same as the solvent to be included in the droplets, it is allowed not to remove all of the solvent.
［１−１−３．混合液中の液体マトリックスの濃度］
混合液中における液体マトリックスの濃度は、当業者が適宜決定することができるものである。液体マトリックスの好ましい濃度は特に限定されず、使用するターゲットプレートの表面状態に対して、相対的に決めることができる。
[1-1-3. Liquid matrix concentration in the mixture]
The concentration of the liquid matrix in the mixed solution can be appropriately determined by those skilled in the art. The preferable concentration of the liquid matrix is not particularly limited, and can be determined relatively to the surface state of the target plate to be used.
例えば、後述の１−５で挙げるように、表面処理として物理的処理又は化学的処理が施されたターゲットプレートを使用する場合は、混合液中の不揮発分として含まれる物質の種類や、当該不揮発分の総量などの要因によって変動しうるものであるが、混合液中、１００μＭ〜３０Ｍ、好ましくは１ｍＭ〜１０Ｍ、更に好ましくは１０ｍＭ〜１Ｍとすることができる。 For example, as described later in 1-5, when using a target plate that has been subjected to physical treatment or chemical treatment as a surface treatment, the type of substance contained as a non-volatile content in the mixed solution, Although it may vary depending on factors such as the total amount of the minute, it can be 100 μM to 30 M, preferably 1 mM to 10 M, more preferably 10 mM to 1 M in the mixed solution.
［１−２．解析すべき試料］
［１−２−１．解析すべき試料の種類］
本発明においては、糖鎖分子を含む試料を解析すべき試料とする。
糖鎖分子としては特に限定されない。例えば、中性糖鎖、硫酸化糖鎖やシアル化糖鎖（シアロ糖鎖）などの酸性糖鎖、及びそれらの修飾体が挙げられる。当該修飾体としては、当業者が扱いうるあらゆる修飾糖鎖が含まれる。例えば糖鎖のラベル化体などが挙げられ、そのごく一例として、ピリジルアミノ化糖鎖が挙げられる。
解析すべき試料中には、上記例示した糖鎖分子が単独で又は複数種が混合されて含まれてよい。
[1-2. Sample to be analyzed]
[1-2-1. Sample types to be analyzed]
In the present invention, a sample containing a sugar chain molecule is a sample to be analyzed.
The sugar chain molecule is not particularly limited. Examples thereof include neutral sugar chains, acidic sugar chains such as sulfated sugar chains and sialylated sugar chains (sialog sugar chains), and modified products thereof. The modified body includes all modified sugar chains that can be handled by those skilled in the art. For example, a labeled form of a sugar chain can be mentioned, and a pyridylaminated sugar chain can be mentioned as one example.
In the sample to be analyzed, the sugar chain molecules exemplified above may be contained singly or as a mixture of plural kinds.
解析すべき試料は、上記の糖鎖分子を単独で含むもののほか、糖鎖以外の非糖鎖分子が含まれたものであってもよい。当該非糖鎖分子としては、生体分子であってもよいし、合成分子であってもよい。生体分子としては、タンパク質、ペプチド、脂質など、及びそれらの修飾体などが挙げられる。合成分子としては、解析すべき試料の調製工程において含まれうる又は生じうるいかなるものも含まれる。例えば、当該調製工程終了までに用いた試薬分子、脱離した修飾基などに由来する分子が挙げられる。
解析すべき試料中には、非糖鎖分子が含まれる場合、上記例示した非糖鎖分子が単独で又は複数種が混合されて含まれてよい。
The sample to be analyzed may be one containing non-glycan molecules other than sugar chains in addition to the above-mentioned sugar chain molecules alone. The non-sugar chain molecule may be a biomolecule or a synthetic molecule. Examples of biomolecules include proteins, peptides, lipids, and modified forms thereof. Synthetic molecules include anything that can or can occur in the process of preparing the sample to be analyzed. For example, the molecule | numerator derived from the reagent molecule | numerator used by the end of the said preparation process, the modified | denatured modification group etc. is mentioned.
When a non-glycan molecule is contained in the sample to be analyzed, the non-glycan molecules exemplified above may be contained singly or as a mixture of plural kinds.
［１−２−２．解析すべき試料の調製］
解析すべき試料の具体例としては、糖鎖分子単体を水などの溶媒に溶解して得られる試料、糖鎖分子調製を行った後、調製された糖鎖分子を分離又は精製を行って得られる試料、糖鎖分子調製を行った後、調製された糖鎖分子を分離・精製することなく得られる試料などが挙げられる。
[1-2-2. Preparation of sample to be analyzed]
Specific examples of samples to be analyzed include a sample obtained by dissolving a sugar chain molecule alone in a solvent such as water, and after preparing a sugar chain molecule, it is obtained by separating or purifying the prepared sugar chain molecule. And a sample obtained after preparing the sugar chain molecule without separating and purifying the prepared sugar chain molecule.
糖鎖分子調製を行った後、調製された糖鎖分子を分離・精製することなく得られる試料は、通常、糖鎖分子と非糖鎖分子とが混合されたものとして得られる。このような糖鎖分子調製の方法としては、当業者に公知のいかなる方法も含まれる。例えば、糖鎖合成法や、糖鎖含有分子を少なくとも脱糖鎖処理に供する方法が挙げられる。 After the preparation of the sugar chain molecules, a sample obtained without separating and purifying the prepared sugar chain molecules is usually obtained as a mixture of sugar chain molecules and non-sugar chain molecules. Such methods for preparing sugar chain molecules include any methods known to those skilled in the art. Examples thereof include a sugar chain synthesis method and a method of subjecting a sugar chain-containing molecule to at least deglycosylation treatment.
糖鎖含有分子を少なくとも脱糖鎖処理に供する方法の具体例としては、糖タンパク質や糖ペプチドなどの糖鎖含有分子を、必要に応じペプチド鎖の断片化処理に供して、脱糖鎖処理に供する方法が挙げられる。ペプチド鎖の断片化処理としては、酵素的手法（例えばタンパク質分解酵素による消化法）及び化学的手法（例えばブロモシアンなどの試薬による化学的分解法）を問わない。脱糖鎖処理としても、酵素的手法（脱糖鎖酵素による分解法）及び化学的手法（例えばピリジルアミノ化法などの糖鎖切り出し法）を問わない。 As a specific example of a method for subjecting a sugar chain-containing molecule to at least deglycosylation treatment, a sugar chain-containing molecule such as a glycoprotein or glycopeptide is subjected to peptide chain fragmentation treatment as necessary for deglycosylation treatment. The method to provide is mentioned. Peptide chain fragmentation may be performed using an enzymatic method (eg, a digestion method using a proteolytic enzyme) or a chemical method (eg, a chemical decomposition method using a reagent such as bromocyanide). As the deglycosylation treatment, any enzymatic method (decomposition method using a deglycosylase) and chemical method (for example, a sugar chain cleaving method such as a pyridylamination method) may be used.
［１−２−３．混合物中の解析すべき試料の濃度］
混合液中の解析すべき試料の量としては、特に限定されるものではない。例えば、液体マトリックス５０ｎｍｏｌに対し、試料の量は、１ａｍｏｌ以上、例えば約数ａｍｏｌ〜数百ｐｍｏｌ、具体的には１ａｍｏｌ〜５００ｐｍｏｌの広い範囲で許容される。
[1-2-3. Concentration of sample to be analyzed in the mixture]
The amount of the sample to be analyzed in the mixed solution is not particularly limited. For example, with respect to 50 nmol of liquid matrix, the amount of the sample is allowed in a wide range of 1 amol or more, for example, about several amol to several hundred pmol, specifically 1 amol to 500 pmol.
［１−３．添加剤］
［１−３−１．添加剤の種類］
添加剤としては、アンモニウム塩が用いられる。アンモニウム塩としては特に限定されるものではないが、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、過塩素酸アンモニウム、臭化アンモニウム、ヨウ化アンモニウム、フッ化アンモニウム、過マンガン酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩；及びクエン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウムなどの有機カルボン酸のアンモニウム塩などが挙げられる。
[1-3. Additive]
[1-3-1. Type of additive]
As the additive, an ammonium salt is used. The ammonium salt is not particularly limited. For example, inorganic salts such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium nitrate, ammonium perchlorate, ammonium bromide, ammonium iodide, ammonium fluoride, and ammonium permanganate. Ammonium salts; and ammonium salts of organic carboxylic acids such as ammonium citrate, ammonium acetate, ammonium carbonate, and ammonium hydrogen carbonate.
［１−３−２．混合液中の添加剤の濃度］
混合液中の添加剤の量としては、特に限定されるものではない。例えば、液体マトリックス５０ｎｍｏｌに対し、４ｐｍｏｌ〜４μｍｏｌ、或いは１ｎｍｏｌ〜５００ｎｍｏｌの量で用いることができる。
[1-3-2. Concentration of additives in the mixture]
The amount of the additive in the mixed solution is not particularly limited. For example, it can be used in an amount of 4 pmol to 4 μmol or 1 nmol to 500 nmol with respect to 50 nmol of the liquid matrix.
［１−３−３．添加剤がもたらしうる作用］
添加剤がもたらす作用として考えられるものの例として、マトリックスクラスターなどの非特異的なイオンや付加イオンの形成抑制が挙げられる。このような例を含めた添加剤の作用は、検出すべき糖鎖由来イオンの感度が顕著に上昇するという効果の一因となっていると考えられる。
[1-3-3. Actions that additives can bring]
Examples of what can be considered as an effect of the additive include suppression of formation of non-specific ions such as matrix clusters and additional ions. It is considered that the action of the additive including such an example contributes to the effect of significantly increasing the sensitivity of the sugar chain-derived ions to be detected.
上記添加剤の中でも、リン酸アンモニウムを用いた場合は、ネガティブイオンモードでの質量分析測定工程において、糖鎖由来イオンが、特定の質量差を有する特徴的なピークを呈するものとして特異的に検出される（後述３−１）という効果をもたらす。 Among the above additives, when ammonium phosphate is used, sugar chain-derived ions are specifically detected as exhibiting a characteristic peak with a specific mass difference in the mass spectrometric measurement process in negative ion mode. (To be described later 3-1).
［１−４．溶媒］
［１−４−１．溶媒の種類］
混合液中に用いられる溶媒としては、特に限定されるものではなく、当業者が適宜決定することができる。例えば、上記解析すべき試料、液体マトリックス、及び添加剤の全てを溶解することができる溶媒を選択することができる。より具体的は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、トルエン、ジクロロメタン、クロロホルムなどの有機溶媒、及び水から１種又は複数種を選択して用いることができる。例えば、アセトニトリル−水系が好ましい。
[1-4. solvent]
[1-4-1. Solvent type]
It does not specifically limit as a solvent used in a liquid mixture, A person skilled in the art can determine suitably. For example, a solvent capable of dissolving all of the sample to be analyzed, the liquid matrix, and the additive can be selected. More specifically, one or more kinds of organic solvents such as acetonitrile, methanol, ethanol, propanol, acetone, ethyl acetate, tetrahydrofuran, diethyl ether, toluene, dichloromethane, chloroform, and water can be selected and used. For example, an acetonitrile-water system is preferable.
［１−４−２．溶媒の組成］
溶媒中には水が含まれていることが好ましい。例えば、溶媒全体の１０〜１００体積％、好ましくは３０〜１００体積％を占めるように、水を含ませることができる。溶媒中に水が含まれることは、後述のフォーカス効果を特に効果的に得ることができる点、より再現性良くフォーカススポットを調製することができるという点などから好ましい。
[1-4-2. Solvent composition]
It is preferable that water is contained in the solvent. For example, water can be included so as to occupy 10 to 100% by volume, preferably 30 to 100% by volume of the entire solvent. It is preferable that water is contained in the solvent from the viewpoint that a focus effect described later can be obtained particularly effectively and a focus spot can be prepared with higher reproducibility.
［１−４．液滴の体積］
上述のように、混合液は、上記溶媒中に、液体マトリックスが１００μＭ〜３０Ｍ、解析すべき試料が液体マトリックス５０ｎｍｏｌに対し１ａｍｏｌ〜５００ｐｍｏｌとなる量、添加剤が液体マトリックス５０ｎｍｏｌに対し４ｐｍｏｌ〜４μｍｏｌとなる量で含まれる組成を有するものとして調製されうる。
１個のフォーカススポットを形成するための混合液の液滴の体積としては、特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。
ターゲットプレート上にウェルが設けられている場合、混合液の液滴は、ウェル内に形成することができる。この場合、液滴は、当該ウェル内に収まる程度の体積をもって形成される。具体的には、１０ｎＬ〜１０μＬ程度、例えば０．５μＬ程度の液滴を形成することができる。
[1-4. Droplet volume]
As mentioned above, the liquid mixture is 100 μM to 30 M in the above solvent, the amount of the sample to be analyzed is 1 amol to 500 pmol with respect to 50 nmol of liquid matrix, and the additive is 4 pmol to 4 μmol with respect to 50 nmol of liquid matrix. Can be prepared as having a composition contained in a quantity.
The volume of the droplet of the mixed liquid for forming one focus spot is not particularly limited, and can be determined as appropriate by those skilled in the art.
When a well is provided on the target plate, a droplet of the mixed solution can be formed in the well. In this case, the droplet is formed with a volume that can be accommodated in the well. Specifically, a droplet of about 10 nL to 10 μL, for example, about 0.5 μL can be formed.
［１−５．ターゲットプレート］
ターゲットプレートとしては、後述２−２に記載のフォーカス現象を起こすことが可能なもの（すなわちフォーカスターゲット）であれば特に限定されない。通常ＭＡＬＤＩ質量分析に使用されるステンレス鋼ターゲットプレートなどや、化学的及び／又は物理的に表面処理がなされたターゲットプレートなど、さまざまなものを使用することができる。
[1-5. Target plate]
The target plate is not particularly limited as long as the target plate can cause a focus phenomenon described in 2-2 (that is, a focus target). Various materials can be used, such as a stainless steel target plate ordinarily used for MALDI mass spectrometry, and a target plate that has been chemically and / or physically surface treated.
化学的に表面処理がなされたものとしては、ターゲットプレート上の各ウェルの中心部が親水性処理、当該中心部以外の周辺部が疎水性処理されているものが挙げられる。親水性処理の態様としては、親水性膜による表面皮膜処理、疎水性処理の態様としては、疎水性膜による表面皮膜処理が挙げられる。例えば、ウェルにおいて、ターゲットプレート上に疎水性膜が設けられ、当該中心部のみ、さらに親水性膜が当該疎水性膜の上に設けられている膜構造を有するものや、ウェルにおいて、ターゲットプレート上に親水性膜が設けられ、当該周辺部のみ、さらに疎水性膜が当該親水性膜の上に設けられている膜構造を有するものなどが挙げられる。表面皮膜処理を行うための方法は特に限定されるものではなく、当業者に公知の方法によって行われる。詳しくは２−３で後述するが、このようなターゲットプレートを用いることによって、フォーカス現象を効果的に起こすことができる。 Examples of the chemical surface treatment include those in which the central portion of each well on the target plate is subjected to hydrophilic treatment and the peripheral portion other than the central portion is subjected to hydrophobic treatment. Examples of the hydrophilic treatment include a surface film treatment with a hydrophilic film, and examples of the hydrophobic treatment include a surface film treatment with a hydrophobic film. For example, in a well, a hydrophobic film is provided on a target plate on the target plate, and only the central part and a hydrophilic film is provided on the hydrophobic film. And the like having a membrane structure in which a hydrophilic membrane is provided, and only the peripheral portion, and further a hydrophobic membrane is provided on the hydrophilic membrane. The method for performing the surface film treatment is not particularly limited, and is performed by a method known to those skilled in the art. Although details will be described later in 2-3, the use of such a target plate can effectively cause a focus phenomenon.
物理的に表面処理がなされたものとしては、ターゲットプレート表面の表面粗さを所望の程度にする処理がなされたものが挙げられる。そのような表面処理としては、例えば、研磨処理や鏡面仕上げ処理が挙げられる。例えば、ターゲットプレート表面の表面粗さがより小さいものは、フォーカス現象をより効果的に起こすという観点から好ましい。 Examples of the material that has been physically surface-treated include those that have been subjected to a treatment that makes the surface roughness of the target plate surface a desired level. Examples of such surface treatment include polishing treatment and mirror finish processing. For example, a target plate having a smaller surface roughness is preferable from the viewpoint of more effectively causing the focus phenomenon.
本発明におけるターゲットプレートとしては、当業者によって適宜調製されたものを使用してもよいし、市販のものを使用してもよい。市販のターゲットプレートとしては、（株）島津製作所、ハドソン・サーフィス・テクノロジー（Hudson Surface Technology）社、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社、ブルカー・ダルトニクス（Bruker Daltonics）社、マステック（MassTech）社、アマシャム・バイオサイエンス（Amersham Bioscience）社などから市販されているものが挙げられる。 As the target plate in the present invention, those appropriately prepared by those skilled in the art may be used, or commercially available ones may be used. Commercially available target plates include Shimadzu Corporation, Hudson Surface Technology, Applied Biosystems, Bruker Daltonics, MassTech, Examples include those commercially available from Amersham Bioscience.
［１−６．混合液の液滴調製方法］
混合液の液滴をターゲットプレート上に形成する具体的方法としては特に限定されない。たとえば、まず液体マトリックス及び添加剤を含む溶液と、試料溶液とを別々に調製し、両溶液を任意の順番で混合することができる。例えば、両溶液を別々に調製した後、当該両溶液を互いに混合させて混合液を得て、得られた混合液をターゲットプレート上に滴下することによって、混合液の液滴を形成することができる。また、両溶液のうち、試料溶液をターゲットプレート上に滴下して試料溶液の液滴を形成し、形成された試料溶液の液滴に液体マトリックス−添加剤溶液を滴下することによってターゲットプレート上で両溶液を混合し、混合液の液滴を形成することができる。この場合、試料溶液と液体マトリックス溶液との滴下順序を逆にしても良い。
[1-6. Liquid droplet preparation method for mixed liquid]
There is no particular limitation on the specific method for forming the liquid droplets on the target plate. For example, first, a solution containing a liquid matrix and an additive and a sample solution can be prepared separately, and both solutions can be mixed in any order. For example, after both solutions are prepared separately, the two solutions are mixed with each other to obtain a mixed solution, and the obtained mixed solution is dropped onto a target plate to form droplets of the mixed solution. it can. In addition, of both solutions, the sample solution is dropped on the target plate to form a sample solution droplet, and the liquid matrix-additive solution is dropped on the formed sample solution droplet on the target plate. Both solutions can be mixed to form liquid droplets. In this case, the dropping order of the sample solution and the liquid matrix solution may be reversed.
ここで、液体マトリックス及び添加剤を含む溶液の調製は、液体マトリックスと、それとは別途用意された添加剤とを互いに混合する方法によって行っても良いし、液体マトリックスの調製の途中で添加剤を加え、液体マトリックスの調製完了と同時に、液体マトリックス及び添加剤を含む溶液が調製されるという方法によって行ってもよい。液体マトリックスの調製法の例として述べた上述の１−１−２の方法（すなわちアミノキノリン類と酸性基含有物質とを混合する方法）を元にする場合、酸性基含有物質と添加剤とをあらかじめ混合させた後、当該混合された酸性基含有物質をアミノキノリン類と混合させることができる。 Here, the solution containing the liquid matrix and the additive may be prepared by a method in which the liquid matrix and an additive separately prepared are mixed with each other, or the additive is added during the preparation of the liquid matrix. In addition, it may be performed by a method in which a solution containing a liquid matrix and an additive is prepared at the same time as the preparation of the liquid matrix is completed. When the above-described method 1-1-2 (ie, a method of mixing aminoquinolines and an acidic group-containing substance) described as an example of a method for preparing a liquid matrix is used, an acidic group-containing substance and an additive are used. After mixing in advance, the mixed acidic group-containing substance can be mixed with aminoquinolines.
一方、液体マトリックス溶液と、添加剤溶液と、試料溶液とを別々に調製し、同様に任意の順番で混合することもできる。 On the other hand, a liquid matrix solution, an additive solution, and a sample solution can be prepared separately and similarly mixed in any order.
形成されたターゲットプレート上の混合液液滴は、ある程度の広がり面積をもってターゲットプレートと接している。以下、液滴とターゲットプレートとが接する面積を、液滴の広がり面積と記載することがある。 The formed mixed liquid droplets on the target plate are in contact with the target plate with a certain spread area. Hereinafter, the area where the droplet and the target plate are in contact may be referred to as a spread area of the droplet.
［２．試料−液体マトリックス−添加剤混合物のフォーカススポット形成］
［２−１．フォーカススポット］
試料−液体マトリックス混合物は、解析すべき試料と、液体マトリックスと、添加剤を溶媒中に含む混合液の液滴をターゲットプレート上に形成する工程と、形成された前記混合液の液滴から前記溶媒を大部分又は全部除去し、前記混合液中の不揮発分（すなわち少なくとも試料と液体マトリックスと添加剤）を残渣として得る工程とによって得ることができるものである。本発明においては、当該混合物を、フォーカススポットの形状で得る。
[2. Focus spot formation of sample-liquid matrix-additive mixture]
[2-1. Focus spot]
The sample-liquid matrix mixture is formed from a sample to be analyzed, a liquid matrix, a droplet of a mixed solution containing an additive in a solvent on a target plate, and the liquid droplet formed from the formed droplet of the mixed solution. The solvent can be obtained by removing most or all of the solvent and obtaining the non-volatile content (that is, at least the sample, the liquid matrix, and the additive) in the mixed solution as a residue. In the present invention, the mixture is obtained in the form of a focus spot.
（フォーカススポット：focused spot）は、ターゲットプレート上の混合液中に含まれる解析すべき試料と液体マトリックスと添加剤とが、当該混合液のターゲットプレート上における広がり面積領域の一部を占める微小な面積領域へ集積されること（すなわち後述２−２のフォーカス現象）によって形成されたものである。 The (focused spot) is a minute spot in which the sample to be analyzed, the liquid matrix, and the additive contained in the liquid mixture on the target plate occupy a part of the spread area of the liquid mixture on the target plate. It is formed by being integrated into the area region (that is, the focus phenomenon of 2-2 described later).
通常、このように形成された混合物すなわちフォーカススポットは、当該広がり面積領域の一部において盛り上がった微小な塊状の形態で存在する。ここで塊状とは、フォーカス現象を経ることなく形成された場合の混合物が有する扁平な形状に比べ、厚さがより大きく（すなわちターゲットプレート面からの高さがより高く）、面がより狭い（すなわちターゲットプレートとの接触面積がより小さい）形状、すなわちより盛り上がった形状をいう。通常、ターゲットプレートにおけるウェル面積より狭い面積の領域において、当該混合物が、集積或いは堆積したように盛り上がった微小な塊の状態で調製される。このような形状の混合物を、混合物のフォーカススポットと記載することがある。 Usually, the mixture, that is, the focus spot formed in this way exists in the form of a minute lump that rises in a part of the spread area. Here, the lump is thicker (that is, higher from the target plate surface) and narrower than the flat shape of the mixture when formed without passing through the focus phenomenon ( That is, a shape having a smaller contact area with the target plate, that is, a raised shape. Usually, in the area | region of an area smaller than the well area in a target plate, the said mixture is prepared in the state of the minute lump which rose as if it accumulated or deposited. The mixture having such a shape may be described as a focus spot of the mixture.
［２−２．フォーカス現象］
本発明のフォーカススポットは、以下のような過程を経て形成される。
ターゲットプレート上の混合液の液滴から溶媒が除去されるに伴い、液滴の体積が減少する。溶媒の除去としては、溶媒の自然蒸発を含む。これにより、混合液中の不揮発分（試料、液体マトリックス及び添加剤が少なくとも含まれる）の濃度が高くなる。すなわち混合液液滴が濃縮される。それに伴い、混合液液滴の広がり面積を縮小させる。混合液液滴の濃縮と混合液液滴の広がり面積の縮小とが相伴って起こるため、濃縮がより進行すれば、当該広がり面積領域のより小さい面積領域へ、混合液中の不揮発分がより濃い濃度で集められる。混合液中の溶媒の大部分或いは全てが除去されることによって濃縮が完了すれば、残渣として、試料−液体マトリックス−添加剤混合物の微小な濃縮スポットが当該広がり面積の一部に残る。この状態は、室温下及び真空下でも維持される。
[2-2. Focus phenomenon]
The focus spot of the present invention is formed through the following process.
As the solvent is removed from the droplets of the mixed solution on the target plate, the volume of the droplets decreases. Solvent removal includes spontaneous evaporation of the solvent. Thereby, the density | concentration of the non volatile matter (A sample, a liquid matrix, and an additive are contained at least) in a liquid mixture becomes high. That is, the liquid mixture droplet is concentrated. Accordingly, the spread area of the mixed liquid droplet is reduced. Concentration of the mixed liquid droplets and reduction of the spread area of the mixed liquid droplets occur together. Collected in high concentration. When the concentration is completed by removing most or all of the solvent in the mixed solution, a minute concentrated spot of the sample-liquid matrix-additive mixture remains as a residue in a part of the spread area. This state is maintained even at room temperature and under vacuum.
本発明においては、混合液液滴の濃縮とともに混合液液滴の広がり面積の縮小が起きる現象を、混合液中に含まれる不揮発分が、混合液液滴の広がり面積の一部へ集まることから、フォーカス現象と呼ぶ。フォーカス現象を利用することの利点は、試料−液体マトリックス−添加剤混合物を小さい面積領域に集中させることができることにある。混合物が小さい面積領域に集中することは、レーザーを照射するポイントに存在する試料を密にすることであるため、高感度計測を可能にする。しかも、そのようにして得られた塊状混合物の表面は比較的均質な状態で保たれているため、混合物スポットの場所によるイオン化の偏りがほとんどないコンディションで計測を行うことが可能である。 In the present invention, the phenomenon in which the spread area of the mixed liquid droplet is reduced with the concentration of the mixed liquid droplet is caused by the fact that the non-volatile content contained in the mixed liquid collects in a part of the spread area of the mixed liquid droplet. This is called the focus phenomenon. The advantage of utilizing the focus phenomenon is that the sample-liquid matrix-additive mixture can be concentrated in a small area. Concentration of the mixture in a small area region means that the sample existing at the point where the laser is irradiated is dense, and thus high-sensitivity measurement is possible. Moreover, since the surface of the massive mixture thus obtained is kept in a relatively homogeneous state, measurement can be performed in a condition in which there is almost no ionization bias depending on the location of the mixture spot.
［２−３．フォーカスの度合い］
フォーカス現象によってターゲットプレート上の液滴がどの程度縮小するかに関する具体的な量としては特に限定されるものではない。例えば、混合物のフォーカススポットとターゲットプレートとが接する面積が、形成された直後の混合液の液滴とターゲットプレートが接する面積の８０％以下、好ましくは５０％以下、更に好ましくは１０％以下に縮小されれば、当該フォーカス効果は特に効果的に得られたといえる。当該縮小率の下限値としては特に限定されるものではないが、例えば０．００１％である。
[2-3. Degree of focus]
The specific amount related to how much the droplet on the target plate is reduced by the focus phenomenon is not particularly limited. For example, the area where the focus spot of the mixture is in contact with the target plate is reduced to 80% or less, preferably 50% or less, more preferably 10% or less of the area where the droplet of the mixed liquid just formed is in contact with the target plate. If this is the case, it can be said that the focus effect was obtained particularly effectively. The lower limit value of the reduction ratio is not particularly limited, but is 0.001%, for example.
すでに述べたように、フォーカス現象によって、試料−液体マトリックス−添加剤混合物が小さい面積領域に集中するため、レーザーを照射するポイントに存在する試料が密になり、従って高感度計測をおこなうことが可能になる。
このため、形成された直後の混合液の液滴の広がり面積がフォーカス現象によってより小さい面積に縮小すると（すなわちより大きいフォーカス効果を得ると）、より密に凝集した試料−液体マトリックス−添加剤混合物が得られる。このことは、高感度計測の点から好ましい。
As already mentioned, the focus phenomenon concentrates the sample-liquid matrix-additive mixture in a small area, so that the sample present at the point where the laser is irradiated becomes dense, thus enabling high-sensitivity measurement. become.
For this reason, when the spreading area of the liquid droplet immediately after formation is reduced to a smaller area by the focus phenomenon (that is, when a larger focus effect is obtained), the sample-liquid matrix-additive mixture more densely aggregated Is obtained. This is preferable from the viewpoint of high sensitivity measurement.
本発明におけるフォーカス効果を効果的に得るためのアプローチの一例として、試料、液体マトリックス及び添加剤を含む混合液中の液体マトリックス濃度を考慮することができる。この場合、例えば前述１−１−３で挙げたように、液体マトリックス濃度をより低く設定することができる。
当該アプローチの他の一例として、使用する溶媒の種類を考慮することができる。この場合、例えば前述１−４−２で挙げたように、混合液調製に用いられる溶媒における水の割合をより多く設定することができる。
As an example of an approach for effectively obtaining the focus effect in the present invention, the concentration of the liquid matrix in the mixed liquid containing the sample, the liquid matrix, and the additive can be considered. In this case, for example, as described in 1-1-3 above, the liquid matrix concentration can be set lower.
As another example of this approach, the type of solvent used can be considered. In this case, for example, as mentioned above in 1-4-2, the ratio of water in the solvent used for the mixed liquid preparation can be set more.
当該アプローチの更なる他の一例として、ターゲットプレートの表面の状態を考慮することができる。この場合、例えば前述１−５で挙げたように、ターゲットプレート上の各ウェルの中心部が親水性処理、当該中心部以外の部分が疎水性処理されているものや、ターゲットプレートの表面粗さがより小さいものを用いることができる。 As yet another example of the approach, the surface condition of the target plate can be considered. In this case, for example, as described in 1-5 above, the center portion of each well on the target plate is subjected to hydrophilic treatment, and the portion other than the center portion is subjected to hydrophobic treatment, or the surface roughness of the target plate A smaller one can be used.
ウェルの中心部が親水性処理、当該中心部以外の部分が疎水性処理されているターゲットプレートを使用する場合は、ウェル上に滴下する混合液を、当該疎水性処理部分よりも相対的に親水性となる組成のものとして調製することができる。すなわち、混合液調製に用いられる溶媒における親水性溶媒の割合をより多く設定することができる。例えば、前述と同様、混合液調製に用いられる溶媒における水の割合をより多く設定することができる。 When using a target plate with hydrophilic treatment at the center of the well and hydrophobic treatment at other parts than the center, the liquid mixture dropped on the well is more hydrophilic than the hydrophobic treatment. It can be prepared as a composition having a property. That is, the ratio of the hydrophilic solvent in the solvent used for liquid mixture preparation can be set more. For example, as described above, the proportion of water in the solvent used for preparing the mixed solution can be set higher.
このような混合液は、ウェル上に滴下されたときに、その広がり面積が、ウェル中央部の親水性部分とその周辺部の疎水性部分との両方にまたがるような量で用いられることが通常である。そして、その液滴は、溶媒除去に伴う自身の体積の減少とともに、疎水性部分との接触から逃れるように、親水性部分の範囲内のみにその広がり面積が収まるように縮小する。親水性−疎水性表面処理を施したターゲットプレートを用いた場合は、このように、液滴がターゲットプレート上の疎水性部分との接触から逃れるように動く作用を生じることによって、フォーカス現象をより効果的に生じさせる。 Such a mixed solution is usually used in such an amount that when it is dropped on the well, its spreading area spans both the hydrophilic part in the center of the well and the hydrophobic part in the periphery. It is. Then, as the volume of the droplet decreases with the removal of the solvent, the droplet shrinks so that its spreading area is accommodated only within the range of the hydrophilic portion so as to escape from contact with the hydrophobic portion. When a target plate with a hydrophilic-hydrophobic surface treatment is used, the focus phenomenon is further improved by causing the droplet to move away from contact with the hydrophobic portion on the target plate. To produce effectively.
［３．質量分析測定］
上記の混合物のフォーカススポットは、ＭＡＬＤＩ質量分析に供される。すなわち、質量分析においては、当該フォーカススポットにレーザー光が照射される。
［３−１．検出イオン種］
本発明においては、質量分析測定は、ポジティブイオンモードで行ってもよいし、ネガティブイオンモードで行ってもよい。
[3. Mass spectrometry measurement]
The focus spot of the above mixture is subjected to MALDI mass spectrometry. That is, in mass spectrometry, the focus spot is irradiated with laser light.
[3-1. Detected ion species]
In the present invention, the mass spectrometry measurement may be performed in the positive ion mode or in the negative ion mode.
特に、添加剤としてリン酸アンモニウムを用いた場合にネガティブイオンモードで質量分析測定を行うと、解析すべき試料中に含まれる糖鎖のイオンが、以下のような一定の質量差を持つ特徴的なピークとして検出される。 In particular, when ammonium phosphate is used as an additive and mass spectrometry is performed in negative ion mode, the sugar chain ions contained in the sample to be analyzed have the following characteristic mass differences: Detected as a peak.
具体的には、糖鎖イオンは、分子量関連イオン［Ｍ−Ｈ］−とともに、そのリン酸付加イオン［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−や当該リン酸付加イオンが脱水したイオン［Ｍ＋ＰＯ３］−としても検出される。より具体的には、［Ｍ−Ｈ］−イオンと［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオン；［Ｍ−Ｈ］−イオンと［Ｍ＋ＰＯ３］−イオン；又は、［Ｍ−Ｈ］−イオンと［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオンと［Ｍ＋ＰＯ３］−イオンとして検出される。
当該［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオン及び［Ｍ＋ＰＯ３］−イオンは、糖鎖に特有のものとして検出され且つ糖鎖以外の分子種からは検出されない、すなわち糖鎖特異的なピークである。
Specifically, the sugar chain ion may be used as the molecular weight related ion [M−H] − as well as the phosphate addition ion [M + H 2 PO 4 ] − or the ion [M + PO 3 ] − dehydrated from the phosphate addition ion. Detected. More specifically, [M−H] − ion and [M + H 2 PO 4 ] − ion; [M−H] − ion and [M + PO 3 ] − ion; or [M−H] − ion and [M + H]. 2 PO 4 ] − ions and [M + PO 3 ] − ions.
The [M + H 2 PO 4 ] − ion and [M + PO 3 ] − ion are detected as unique to sugar chains and are not detected from molecular species other than sugar chains, that is, sugar chain-specific peaks.
ここで、［Ｍ−Ｈ］−イオンと［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオンとの間には９８Ｄａ、［Ｍ−Ｈ］−イオンと［Ｍ＋ＰＯ３］−イオンとの間には８０Ｄａの質量差がある。従って、糖鎖の検出は、これら特徴的なピークが有する一定の質量差（すなわち、９８Ｄａ差；８０Ｄａ差；又は、９８Ｄａ差及び８０Ｄａ差の両方）の情報を利用することによって行うことができる。また。このような質量差の情報の取得に当たっては、当該質量差を自動判定するプログラムなどを使用することができる。
このことによって、解析すべき試料が糖鎖と糖鎖以外の分子との混合物であっても、特徴的な質量差を有するピークを検出することによって、糖鎖の識別を容易に行うことが可能である。また、当該ピークに基づいて、例えば多段階ＭＳ測定（すなわちＭＳの２乗以上のＭＳ測定）を行うことよって、当該識別された糖鎖を同定することが可能である。
Here, there is a mass difference of 98 Da between [M−H] − ion and [M + H 2 PO 4 ] − ion, and 80 Da between [M−H] − ion and [M + PO 3 ] − ion. is there. Therefore, the detection of sugar chains can be performed by utilizing information of a certain mass difference (that is, 98 Da difference; 80 Da difference; or both 98 Da difference and 80 Da difference) possessed by these characteristic peaks. Also. In acquiring such mass difference information, a program for automatically determining the mass difference can be used.
As a result, even if the sample to be analyzed is a mixture of sugar chains and molecules other than sugar chains, it is possible to easily identify sugar chains by detecting peaks having characteristic mass differences. It is. In addition, based on the peak, for example, the identified sugar chain can be identified by performing multi-stage MS measurement (that is, MS measurement of MS squared or higher).
［３−２．質量分析装置］
質量分析装置としては、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法による装置であれば特に限定されない。例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型）質量分析装置（例えば（株）島津製作所製ＡＸＩＭＡ(R)シリーズ）などが挙げられる。このような質量分析装置の具体例としては、マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ型）質量分析装置（例えば（株）島津製作所製ＡＸＩＭＡ(R)−ＱＩＴ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間／飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ型）質量分析装置（例えば（株）島津製作所製ＡＸＩＭＡ(R)−ＴＯＦ２）などが挙げられる。
[3-2. Mass spectrometer]
The mass spectrometer is not particularly limited as long as it is a matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) method. Examples include a matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF type) mass spectrometer (for example, AXIMA (R) series manufactured by Shimadzu Corporation). As a specific example of such a mass spectrometer, a matrix-assisted laser desorption ionization quadrupole ion trap type time-of-flight (MALDI-QIT-TOF type) mass spectrometer (for example, AXIMA (R) manufactured by Shimadzu Corporation ) -QIT), matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight / time-of-flight (MALDI-TOF / TOF type) mass spectrometer (for example, AXIMA (R) -TOF 2 manufactured by Shimadzu Corporation), and the like.
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。以下において、％で表される量は、体積を基準として示す。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples. In the following, the amount expressed in% is based on volume.
［実施例１−ポジティブイオンモード測定］
この実施例では、試料として中性ピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖を、液体マトリックスとして３−アミノキノリン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（３−アミノキノリンとα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を含む液状物質；３ＡＱ／ＣＨＣＡ）を、添加剤としてリン酸アンモニウム、塩化アンモニウム又は硫酸アンモニウムを用いた場合について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ−ＭＳ）のポジティブイオンモードで分析を行った。
[Example 1-Positive ion mode measurement]
In this example, a neutral pyridylamino (PA) sugar chain is used as a sample, and 3-aminoquinoline / α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (3-aminoquinoline and α-cyano-4-hydroxysilicate is used as a liquid matrix. A liquid substance containing cinnamate; 3AQ / CHCA) using ammonium phosphate, ammonium chloride or ammonium sulfate as an additive, matrix-assisted laser desorption ionization quadrupole ion trap time-of-flight mass spectrometer (MALDI) -QIT-TOF-MS) in positive ion mode.
中性ピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖としては、以下の２種類をそれぞれ検討した。
ＰＡ化糖鎖01（Ｎ−アセチルラクトサミンタイプ、二分枝構造） 分子量1718
ＰＡ化糖鎖04（Ｎ−アセチルラクトサミンタイプ、四分枝構造） 分子量2448
上記ＰＡ化糖鎖はMilliQに溶解し、さまざまな濃度の水溶液に調製した。
The following two types of neutral pyridylamino (PA) sugar chains were examined.
PA sugar chain 01 (N-acetyllactosamine type, bifurcated structure) Molecular weight 1718
PA sugar chain 04 (N-acetyllactosamine type, quadrant structure) Molecular weight 2448
The PA sugar chain was dissolved in MilliQ and prepared into aqueous solutions of various concentrations.
液体マトリックスとしては、３−アミノキノリン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（３ＡＱ／ＣＨＣＡ）を用い、添加剤としては、下記の３種を用いた。この実施例においては、３ＡＱ／ＣＨＣＡと添加剤とはあらかじめ互いに混合された混合液（以下、３ＡＱ／ＣＨＣＡ−添加剤混合液と記載する）として調製された。具体的には、以下のように調製した。 As the liquid matrix, 3-aminoquinoline / α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (3AQ / CHCA) was used, and the following three types were used as additives. In this example, 3AQ / CHCA and the additive were prepared in advance as a mixed solution (hereinafter referred to as 3AQ / CHCA-additive mixed solution). Specifically, it was prepared as follows.
1) ５０％アセトニトリル水溶液５４０μＬに、１００ｍＭの下記a、b又はcの添加剤水溶液６０μＬを加え１０ｍＭ 添加物の５０％アセトニトリル水溶液を調整し、さらにα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）１０ｍｇを加えることによって、添加物混合ＣＨＣＡ飽和溶液を調製した。
2) 上記1)で得られた添加物混合ＣＨＣＡ飽和溶液１５０μＬに、３−アミノキノリン（３ＡＱ）２０ｍｇを加え、３ＡＱ／ＣＨＣＡと添加剤との混合液を調製した。
3) 上記2)で得られた混合液を、５０％アセトニトリル水溶液を用いて１／１０の濃度に希釈した。
1) To 50% acetonitrile aqueous solution 540 μL, 100 mM of the following a, b or c additive aqueous solution 60 μL was added to prepare 10 mM additive 50% acetonitrile aqueous solution, and α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA). An additive mixed CHCA saturated solution was prepared by adding 10 mg.
2) To 150 μL of the additive-mixed CHCA saturated solution obtained in 1) above, 20 mg of 3-aminoquinoline (3AQ) was added to prepare a mixed solution of 3AQ / CHCA and additive.
3) The mixture obtained in 2) above was diluted to a concentration of 1/10 using 50% acetonitrile aqueous solution.
３ＡＱ／ＣＨＣＡ−添加剤混合液調製に使用された添加剤水溶液は、以下のとおりである。
a. １００ｍＭリン酸アンモニウム 分子量115
b. １００ｍＭ塩化アンモニウム 分子量53.5
c. １００ｍＭ硫酸アンモニウム 分子量132
The additive aqueous solution used for the preparation of the 3AQ / CHCA-additive mixture was as follows.
a. 100 mM ammonium phosphate, molecular weight 115
b. 100 mM ammonium chloride molecular weight 53.5
c. 100 mM ammonium sulfate molecular weight 132
試料水溶液と３ＡＱ／ＣＨＣＡ−添加剤混合液とを１：１の体積比で混合し、Pre mix（すなわち、試料、液体マトリックス及び添加剤を含む混合液）を調製した。 The sample aqueous solution and 3AQ / CHCA-additive mixture were mixed at a volume ratio of 1: 1 to prepare Pre mix (ie, a mixture containing the sample, liquid matrix and additive).
ターゲットプレートとして、ハドソン・サーフィス・テクノロジー（Hudson Surface Technology, Inc. (HST)）社製、μfocusターゲットを用いた。このターゲットプレートは、各ウェル（円形）の中心部が親水性処理、当該中心部以外の部分が疎水性処理されている。この実施例では、疎水性処理された中心部の直径が1000μmであるものを用いた。このターゲットプレートのウェルに、上記調製されたPre mixを1μL滴下し、自然乾燥させることにより、フォーカススポットを得た。 As the target plate, a μfocus target manufactured by Hudson Surface Technology, Inc. (HST) was used. In this target plate, the center portion of each well (circular shape) is subjected to a hydrophilic treatment, and the portion other than the center portion is subjected to a hydrophobic treatment. In this example, the one having a hydrophobic treated center part with a diameter of 1000 μm was used. 1 μL of the above prepared Premix was dropped into the well of the target plate and allowed to dry naturally to obtain a focus spot.
糖鎖濃度の異なるそれぞれのフォーカススポットについて、（株）島津製作所製ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴを用い、positive, mid massモードで質量分析測定を行った。
この実施例における糖鎖の検出限界を、後述の比較例１及び比較例２の結果とともに、下記の表１（測定結果Ａ）に示す。
For each focus spot with a different sugar chain concentration, mass spectrometry was performed in positive and mid mass modes using AXIMA-QIT manufactured by Shimadzu Corporation.
The detection limits of sugar chains in this Example are shown in the following Table 1 (Measurement Results A) together with the results of Comparative Examples 1 and 2 described later.
［比較例１］
この比較例では、試料として中性ピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖を、液体マトリックスの代わりに固体マトリックスである２，５−ジヒドロ安息香酸（ゲンシジン酸；ＤＨＢ）を用い、添加剤は用いなかった場合について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ−ＭＳ）のポジティブイオンモードで分析を行った。
[Comparative Example 1]
In this comparative example, neutral pyridylamino (PA) sugar chain was used as a sample, solid matrix 2,5-dihydrobenzoic acid (gencidic acid; DHB) was used instead of liquid matrix, and no additive was used Was analyzed in the positive ion mode of a matrix-assisted laser desorption ionization quadrupole ion trap type time-of-flight mass spectrometer (MALDI-QIT-TOF-MS).
具体的には、３ＡＱ／ＣＨＣＡ−添加剤混合液の代わりに、５０％アセトニトリル水溶液にＤＨＢを３ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解して調製したＤＨＢ混合液を用いたことを除いては、実施例１と同じ操作を行った。
この実施例における糖鎖の検出限界を、実施例１及び後述の比較例２の結果とともに、下記の表１（測定結果Ａ）に示す。
Specifically, Example 1 was used except that a DHB mixed solution prepared by dissolving DHB in a 50% acetonitrile aqueous solution at a concentration of 3 mg / mL was used instead of the 3AQ / CHCA-additive mixed solution. The same operation was performed.
The detection limits of sugar chains in this example are shown in the following Table 1 (measurement result A) together with the results of Example 1 and Comparative Example 2 described later.
［比較例２］
この比較例では、試料として中性ピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖を、液体マトリックスとして３−アミノキノリン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（３ＡＱ／ＣＨＣＡ）を用い、添加剤は用いなかった場合について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ−ＭＳ）のポジティブイオンモードで分析を行った。
[Comparative Example 2]
In this comparative example, neutral pyridylamino (PA) sugar chain was used as a sample, 3-aminoquinoline / α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (3AQ / CHCA) was used as a liquid matrix, and no additive was used. Cases were analyzed in positive ion mode of a matrix-assisted laser desorption ionization quadrupole ion trap time-of-flight mass spectrometer (MALDI-QIT-TOF-MS).
具体的には、３ＡＱ／ＣＨＣＡ−添加剤混合液の調製の際に、添加剤水溶液を加える代わりに、５０％アセトニトリル水溶液を加えたことを除いて、実施例１と同じ操作を行った。
この比較例における糖鎖の検出限界を、実施例１及び比較例１の結果とともに、下記の表１（測定結果Ａ）に示す。
Specifically, in the preparation of the 3AQ / CHCA-additive mixture, the same operation as in Example 1 was performed except that a 50% acetonitrile aqueous solution was added instead of the additive aqueous solution.
The detection limits of sugar chains in this comparative example are shown in the following Table 1 (measurement result A) together with the results of Example 1 and Comparative Example 1.
測定結果Ａより、ポジティブモードでの糖鎖測定においては、従前、ペプチド・タンパク質の高感度測定を可能にする添加剤として報告されていたリン酸アンモニウムだけでなく、塩化アンモニウムや硫酸アンモニウムを添加剤として用いた場合も、アトモルオーダーの高感度測定が可能であることが示された。
また、液体マトリックスを用いた糖鎖測定において添加剤を加えることによって、添加剤を加えなかった場合に比べ、２００〜２，０００倍の高感度で測定を行うことが可能であることが示された。
さらに、本発明の方法では、一般的に糖鎖測定用のマトリックスとして広く使用されている固体マトリックスＤＨＢを用いた場合に比べ、１００〜１，０００倍の高感度で測定を行うことが可能であることが示された。
From the measurement result A, in the sugar chain measurement in the positive mode, not only ammonium phosphate, which has been reported as an additive that enables highly sensitive measurement of peptides and proteins, but also ammonium chloride and ammonium sulfate as additives. When used, it was shown that high sensitivity measurement of attomole order is possible.
In addition, it is shown that by adding an additive in sugar chain measurement using a liquid matrix, measurement can be performed with a sensitivity 200 to 2,000 times higher than when no additive is added. It was.
Furthermore, in the method of the present invention, it is possible to perform measurement at a sensitivity 100 to 1,000 times higher than that in the case of using a solid matrix DHB that is generally widely used as a matrix for sugar chain measurement. It was shown that there is.
［実施例２−ネガティブイオンモード測定］
この実施例では、試料として中性ピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖を、液体マトリックスとして３−アミノキノリン／α−シアノー４−ヒドロキシケイ皮酸（３ＡＱ／ＣＨＣＡ）を、添加剤としてリン酸アンモニウムを用いた場合について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間／飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ）のネガティブイオンモードで分析を行った。
[Example 2-Negative ion mode measurement]
In this example, neutral pyridylamino (PA) sugar chain is used as a sample, 3-aminoquinoline / α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (3AQ / CHCA) is used as a liquid matrix, and ammonium phosphate is used as an additive. The analysis was performed in the negative ion mode of a matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight / time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF / TOF).
中性ピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖としては、以下について検討した。
ＰＡ化糖鎖01（Ｎ−アセチルラクトサミンタイプ、二分枝構造） 分子量1718
当該ＰＡ化糖鎖はMilliQに溶解し、水溶液を調製した。
The following were examined as neutral pyridylamino (PA) sugar chains.
PA sugar chain 01 (N-acetyllactosamine type, bifurcated structure) Molecular weight 1718
The PA sugar chain was dissolved in MilliQ to prepare an aqueous solution.
液体マトリックスとしては、３−アミノキノリン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（３ＡＱ／ＣＨＣＡ）を用い、添加剤としては、リン酸アンモニウムを用いた。この実施例においては、３ＡＱ／ＣＨＣＡとリン酸アンモニウムとはあらかじめ互いに混合された混合液として調製された。具体的には、以下のように調製した。 As the liquid matrix, 3-aminoquinoline / α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (3AQ / CHCA) was used, and as the additive, ammonium phosphate was used. In this example, 3AQ / CHCA and ammonium phosphate were prepared in advance as a mixed solution. Specifically, it was prepared as follows.
1) １０ｍＭ リン酸アンモニウムの５０％アセトニトリル水溶液６００μＬに、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）１０ｍｇを加えて、添加物混合ＣＨＣＡ飽和溶液を調製した。
2) 上記1)で得られた添加物混合ＣＨＣＡ飽和溶液１５０μＬに、３−アミノキノリン（３ＡＱ）２０ｍｇを加え、３ＡＱ／ＣＨＣＡとリン酸アンモニウムとの混合液を調製した。
3) 上記2)で得られた混合液を、５０％アセトニトリル水溶液を用いて１／１０の濃度に希釈した。
1) 10 mg of α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) was added to 600 μL of 50 mM acetonitrile aqueous solution of 10 mM ammonium phosphate to prepare an additive mixed CHCA saturated solution.
2) 20 mg of 3-aminoquinoline (3AQ) was added to 150 μL of the additive-mixed CHCA saturated solution obtained in 1) above to prepare a mixed solution of 3AQ / CHCA and ammonium phosphate.
3) The mixture obtained in 2) above was diluted to a concentration of 1/10 using 50% acetonitrile aqueous solution.
試料水溶液と３ＡＱ／ＣＨＣＡ−リン酸アンモニウム混合液とを１：１の体積比で混合し、Pre mix（すなわち、試料、液体マトリックス及び添加剤を含む混合液）を調製した。 A sample aqueous solution and a 3AQ / CHCA-ammonium phosphate mixed solution were mixed at a volume ratio of 1: 1 to prepare a Pre mix (that is, a mixed solution containing a sample, a liquid matrix and an additive).
ターゲットプレートとして、ハドソン・サーフィス・テクノロジー（Hudson Surface Technology, Inc. (HST)）社製、μfocusターゲットを用いた。このターゲットプレートは、各ウェル（円形）の中心部が親水性処理、当該中心部以外の部分が疎水性処理されている。この実施例では、疎水性処理された中心部の直径が1000μmであるものを用いた。このターゲットプレートのウェルに、上記調製されたPre mixを1μL滴下し、自然乾燥させることにより、フォーカススポットを得た。
このとき、フォーカススポット１個におけるＰＡ化糖鎖の量は５００ｆｍｏｌである
As the target plate, a μfocus target manufactured by Hudson Surface Technology, Inc. (HST) was used. In this target plate, the center portion of each well (circular shape) is subjected to a hydrophilic treatment, and the portion other than the center portion is subjected to a hydrophobic treatment. In this example, the one having a hydrophobic treated center part with a diameter of 1000 μm was used. 1 μL of the above prepared Premix was dropped into the well of the target plate and allowed to dry naturally to obtain a focus spot.
At this time, the amount of PA sugar chain in one focus spot is 500 fmol.
得られたフォーカススポットについて、（株）島津製作所ＡＸＩＭＡ(R)−ＴＯＦ２を用い、negative, linearモードで質量分析測定を行った。
ＭＳ測定の結果得られたマススペクトルを図１に示す。図１において、横軸は（質量／電荷）を表し、縦軸はイオンの相対強度を表す（以下、全てのマススペクトルにおいて同じ）。図１が示すように、分子量関連イオン［Ｍ−Ｈ］−に加えて、当該分子量関連イオンのリン酸付加体［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−（すなわち［Ｍ＋９７］−）と、当該リン酸付加体が脱水したイオン［Ｍ＋ＰＯ３］−（すなわち［Ｍ＋７９］−）とが検出された。すなわち、８０Ｄａ及び９８Ｄａの質量差を有する特徴的なピークが観測された。
About the obtained focus spot, Shimadzu Corporation AXIMA (R) -TOF 2 was used, and mass spectrometry measurement was performed in negative and linear mode.
The mass spectrum obtained as a result of MS measurement is shown in FIG. In FIG. 1, the horizontal axis represents (mass / charge), and the vertical axis represents the relative intensity of ions (hereinafter the same in all mass spectra). As shown in FIG. 1, in addition to the molecular weight related ion [M−H] − , the phosphoric acid adduct [M + H 2 PO 4 ] − (that is, [M + 97] − ) of the molecular weight related ion and the phosphoric acid adduct. Ion [M + PO 3 ] − (ie, [M + 79] − ) was detected. That is, a characteristic peak having a mass difference of 80 Da and 98 Da was observed.
［実施例３−ネガティブイオンモード測定］
この実施例では、試料として中性ピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖を、液体マトリックスとして３−アミノキノリン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（３ＡＱ／ＣＨＣＡ）を、添加剤としてリン酸アンモニウムを用いた場合について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ−ＭＳ）のネガティブイオンモードで分析を行った。
[Example 3-Negative ion mode measurement]
In this example, neutral pyridylamino (PA) sugar chain is used as a sample, 3-aminoquinoline / α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (3AQ / CHCA) is used as a liquid matrix, and ammonium phosphate is used as an additive. When used, analysis was performed in a negative ion mode of a matrix-assisted laser desorption ionization quadrupole ion trap type time-of-flight mass spectrometer (MALDI-QIT-TOF-MS).
中性ピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖としては、以下について検討した。
ＰＡ化糖鎖01（Ｎ−アセチルラクトサミンタイプ、二分枝構造） 分子量1718
当該ＰＡ化糖鎖はMilliQに溶解し、さまざまな濃度の水溶液に調製した。
なお、当該ＰＡ化糖鎖の構造は、以下のとおりである。（式中、ＰＡはピリジルアミノ基を示す。）
The following were examined as neutral pyridylamino (PA) sugar chains.
PA sugar chain 01 (N-acetyllactosamine type, bifurcated structure) Molecular weight 1718
The PA sugar chain was dissolved in MilliQ and prepared into aqueous solutions of various concentrations.
The structure of the PA sugar chain is as follows. (In the formula, PA represents a pyridylamino group.)
液体マトリックスとしては、３−アミノキノリン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（３ＡＱ／ＣＨＣＡ）を用い、添加剤としては、リン酸アンモニウムを用いた。この実施例においては、３ＡＱ／ＣＨＣＡとリン酸アンモニウムとはあらかじめ互いに混合された混合液として調製された。具体的には、以下のように調製した。
1) １０ｍＭ リン酸アンモニウムの５０％アセトニトリル水溶液６００μＬに、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）１０ｍｇを加えて、添加物混合ＣＨＣＡ飽和溶液を調製した。
2) 上記1)で得られた添加物混合ＣＨＣＡ飽和溶液１５０μＬに、３−アミノキノリン（３ＡＱ）２０ｍｇを加え、３ＡＱ／ＣＨＣＡとリン酸アンモニウムとの混合液を調製した。
3) 上記2)で得られた混合液を、５０％アセトニトリル水溶液を用いて１／１０の濃度に希釈した。
As the liquid matrix, 3-aminoquinoline / α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (3AQ / CHCA) was used, and as the additive, ammonium phosphate was used. In this example, 3AQ / CHCA and ammonium phosphate were prepared in advance as a mixed solution. Specifically, it was prepared as follows.
1) 10 mg of α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) was added to 600 μL of 50 mM acetonitrile aqueous solution of 10 mM ammonium phosphate to prepare an additive mixed CHCA saturated solution.
2) 20 mg of 3-aminoquinoline (3AQ) was added to 150 μL of the additive-mixed CHCA saturated solution obtained in 1) above to prepare a mixed solution of 3AQ / CHCA and ammonium phosphate.
3) The mixture obtained in 2) above was diluted to a concentration of 1/10 using 50% acetonitrile aqueous solution.
試料水溶液と３ＡＱ／ＣＨＣＡ−リン酸アンモニウム混合液とを１：１の体積比で混合し、Pre mix（すなわち、試料、液体マトリックス及び添加剤を含む混合液）を調製した。 A sample aqueous solution and a 3AQ / CHCA-ammonium phosphate mixed solution were mixed at a volume ratio of 1: 1 to prepare a Pre mix (that is, a mixed solution containing a sample, a liquid matrix and an additive).
ターゲットプレートとして、ハドソン・サーフィス・テクノロジー（Hudson Surface Technology, Inc. (HST)）社製、μfocusターゲットを用いた。このターゲットプレートは、各ウェル（円形）の中心部が親水性処理、当該中心部以外の部分が疎水性処理されている。この実施例では、疎水性処理された中心部の直径が1000μmであるものを用いた。このターゲットプレートのウェルに、上記調製されたPre mixを1μL滴下し、自然乾燥させることにより、フォーカススポットを得た。 As the target plate, a μfocus target manufactured by Hudson Surface Technology, Inc. (HST) was used. In this target plate, the center portion of each well (circular shape) is subjected to a hydrophilic treatment, and the portion other than the center portion is subjected to a hydrophobic treatment. In this example, the one having a hydrophobic treated center part with a diameter of 1000 μm was used. 1 μL of the above prepared Premix was dropped into the well of the target plate and allowed to dry naturally to obtain a focus spot.
糖鎖濃度の異なるそれぞれのフォーカススポットについて、（株）島津製作所製ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴを用い、negative, mid massモードで質量分析測定を行った。
ＭＳ測定の結果得られたマススペクトルを図２に示す（フォーカススポット中の糖鎖の濃度が5pmolの場合）。図２が示すように、分子量関連イオン［Ｍ−Ｈ］−に加えて、当該リン酸付加イオンが脱水したイオン［Ｍ＋ＰＯ３］−（以下、［Ｍ＋７９］−と記載する）が検出された。すなわち、８０Ｄａの質量差を有する特徴的なピークが観測された。
About each focus spot from which sugar chain density | concentrations differ, mass spectrometry measurement was performed in negative and mid mass mode using Shimadzu Corporation AXIMA-QIT.
The mass spectrum obtained as a result of MS measurement is shown in FIG. 2 (when the sugar chain concentration in the focus spot is 5 pmol). As shown in FIG. 2, in addition to the molecular weight related ion [M−H] − , an ion [M + PO 3 ] − (hereinafter referred to as [M + 79] − ) dehydrated from the phosphate addition ion was detected. That is, a characteristic peak having a mass difference of 80 Da was observed.
さらに、当該［Ｍ−Ｈ］−をプリカーサイオン（Pre）としてＭＳ２測定を行った結果と、当該［Ｍ＋７９］−をプリカーサイオン（Pre）としてＭＳ２測定を行った結果とを、図３に示す（フォーカススポット中の糖鎖の濃度が5pmolの場合）。 Further, FIG. 3 shows the result of MS 2 measurement using the [M-H] − as a precursor ion (Pre) and the result of MS 2 measurement using the [M + 79] − as a precursor ion (Pre). Shown (when the sugar chain concentration in the focus spot is 5 pmol).
図３の［Ｍ＋７９］−をプリカーサイオンとするＭＳ２において、Gal（MW 180）、GlcNAc（MW 221)、Man（MW 180)が脱離したフラグメントイオンをいくつか検出し、それらフラグメントイオン全てが、［Ｍ−Ｈ］−をプリカーサイオンとするＭＳ２におけるフラグメントイオンと対応し、且つ、当該対応するフラグメントイオン間のm/z差は全て８０であったことが示された。すなわち、［Ｍ＋７９］−は糖鎖にリン酸が付加したイオンであり、リン酸は付加したまま断片化されていることを意味する。
従って、［Ｍ＋７９］−は糖鎖のイオンであることが確認できた。
In MS 2 with [M + 79] − as a precursor ion in FIG. 3, several fragment ions from which Gal (MW 180), GlcNAc (MW 221), and Man (MW 180) are desorbed are detected. , [M−H] − corresponding to fragment ions in MS 2 having a precursor ion, and m / z differences between the corresponding fragment ions were all 80. That is, [M + 79] − is an ion in which phosphoric acid is added to the sugar chain, and means that the phosphoric acid is fragmented while being added.
Therefore, [M + 79] − was confirmed to be an ion of a sugar chain.
この実施例における糖鎖の［Ｍ＋７９］−イオンの検出限界を、後述の比較例３及び比較例４の結果とともに、下記の表２（測定結果Ｂ）に示す。 The detection limit of [M + 79] − ion of the sugar chain in this example is shown in the following Table 2 (measurement result B) together with the results of Comparative Examples 3 and 4 described later.
［比較例３］
この比較例では、試料として中性ピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖を、液体マトリックスの代わりに固体マトリックスである２，５−ジヒドロ安息香酸（ＤＨＢ）を用い、添加剤は用いなかった場合について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ−ＭＳ）のネガティブイオンモードで分析を行った。
具体的には、３ＡＱ／ＣＨＣＡ−添加剤混合液の代わりに、５０％アセトニトリル水溶液にＤＨＢを３ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解して調製したＤＨＢ混合液を用いたことを除いては、実施例３と同じ操作を行った。
この実施例における糖鎖の検出限界を、実施例３及び後述の比較例４の結果とともに、下記の表２（測定結果Ｂ）に示す。
[Comparative Example 3]
In this comparative example, a neutral pyridylamino (PA) sugar chain was used as a sample, a solid matrix 2,5-dihydrobenzoic acid (DHB) was used instead of a liquid matrix, and no additive was used. Analysis was performed in the negative ion mode of a assisted laser desorption ionization quadrupole ion trap type time-of-flight mass spectrometer (MALDI-QIT-TOF-MS).
Specifically, in place of the 3AQ / CHCA-additive mixture, Example 3 was used except that a DHB mixture prepared by dissolving DHB in a 50% acetonitrile aqueous solution at a concentration of 3 mg / mL was used. The same operation was performed.
The detection limits of sugar chains in this example are shown in the following Table 2 (measurement result B) together with the results of Example 3 and Comparative Example 4 described later.
［比較例４］
この比較例では、試料として中性ピリジルアミノ（ＰＡ）化糖鎖を、液体マトリックスとして３−アミノキノリン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（３ＡＱ／ＣＨＣＡ）を用い、添加剤は用いなかった場合について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ−ＭＳ）のネガティブイオンモードで分析を行った。
具体的には、３ＡＱ／ＣＨＣＡ−添加剤混合液の調製の際に、添加剤水溶液を加える代わりに、５０％アセトニトリル水溶液を加えたことを除いて、実施例３と同じ操作を行った。
この比較例における糖鎖の検出限界を、実施例３及び比較例３の結果とともに、下記の表２（測定結果Ｂ）に示す。
[Comparative Example 4]
In this comparative example, neutral pyridylamino (PA) sugar chain was used as a sample, 3-aminoquinoline / α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (3AQ / CHCA) was used as a liquid matrix, and no additive was used. Cases were analyzed in the negative ion mode of a matrix-assisted laser desorption ionization quadrupole ion trap time-of-flight mass spectrometer (MALDI-QIT-TOF-MS).
Specifically, in the preparation of the 3AQ / CHCA-additive mixture, the same operation as in Example 3 was performed except that a 50% acetonitrile aqueous solution was added instead of the additive aqueous solution.
The detection limits of sugar chains in this comparative example are shown in the following Table 2 (measurement result B) together with the results of Example 3 and Comparative Example 3.
測定結果Ｂより、ネガティブモードでの糖鎖測定においては、フェムトモルオーダーの高感度測定が可能であることが示された。
また、液体マトリックスを用いた糖鎖測定において添加剤を加えることによって、添加剤を加えなかった場合に比べ、１，０００倍の高感度で測定を行うことが可能であることが示された。
さらに、本発明の方法では、一般的に糖鎖測定用のマトリックスとして広く使用されている固体マトリックスＤＨＢを用いた場合に比べ、１００倍の高感度で測定を行うことが可能であることが示された。
From the measurement result B, it was shown that high sensitivity measurement of femtomole order is possible in the sugar chain measurement in the negative mode.
In addition, it was shown that by adding an additive in sugar chain measurement using a liquid matrix, measurement can be performed with a sensitivity 1,000 times higher than when no additive is added.
Furthermore, it is shown that the method of the present invention can measure with 100 times higher sensitivity than the case of using a solid matrix DHB which is generally widely used as a matrix for sugar chain measurement. It was done.
［実施例４−ネガティブイオンモード測定］
この実施例では、試料として中性糖鎖を、液体マトリックスとして３−アミノキノリン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（３ＡＱ／ＣＨＣＡ）を、添加剤としてリン酸アンモニウムを用いた場合について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間／飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ）のネガティブイオンモードで分析を行った。
中性糖鎖としては、実施例１〜３で用いた中性ＰＡ化糖鎖のＰＡ非ラベル化体を用いた。試料として当該ＰＡ非ラベル化体を用いたことを除いては、実施例２と同じ操作を行った。
[Example 4-Negative ion mode measurement]
In this example, a neutral sugar chain is used as a sample, 3-aminoquinoline / α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (3AQ / CHCA) is used as a liquid matrix, and ammonium phosphate is used as an additive. Analysis was performed in the negative ion mode of a matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight / time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF / TOF).
As the neutral sugar chain, the PA-unlabeled form of the neutral PA sugar chain used in Examples 1 to 3 was used. The same operation as in Example 2 was performed except that the PA unlabeled product was used as a sample.
ＭＳ測定の結果、この実施例においては、分子量関連イオン［Ｍ−Ｈ］−に加えて、当該分子量関連イオンのリン酸付加体［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−（すなわち［Ｍ＋９７］−）と、当該リン酸付加体が脱水したイオン［Ｍ＋ＰＯ３］−（すなわち［Ｍ＋７９］−）とが検出された。すなわち、８０Ｄａ及び９８Ｄａの質量差を有する特徴的なピークが観測された（データ示さず）。 As a result of MS measurement, in this example, in addition to the molecular weight related ion [M−H] − , a phosphoric acid adduct [M + H 2 PO 4 ] − (that is, [M + 97] − ) of the molecular weight related ion, An ion [M + PO 3 ] − (that is, [M + 79] − ) dehydrated from the phosphate adduct was detected. That is, a characteristic peak having a mass difference of 80 Da and 98 Da was observed (data not shown).
［実施例５−ネガティブイオンモード測定］
この実施例では、試料として中性糖鎖を、液体マトリックスとして３−アミノキノリン／α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（３ＡＱ／ＣＨＣＡ）を、添加剤としてリン酸アンモニウムを用いた場合について、マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ−ＭＳ）のネガティブイオンモードで分析を行った。
中性糖鎖としては、実施例１〜３で用いた中性ＰＡ化糖鎖のＰＡ非ラベル化体を用いた。試料として当該ＰＡ非ラベル化体を用いたことを除いては、実施例３と同じ操作を行った。
[Example 5-Negative ion mode measurement]
In this example, a neutral sugar chain is used as a sample, 3-aminoquinoline / α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (3AQ / CHCA) is used as a liquid matrix, and ammonium phosphate is used as an additive. Analysis was performed in negative ion mode of a matrix-assisted laser desorption ionization quadrupole ion trap type time-of-flight mass spectrometer (MALDI-QIT-TOF-MS).
As the neutral sugar chain, the PA-unlabeled form of the neutral PA sugar chain used in Examples 1 to 3 was used. The same operation as in Example 3 was performed except that the PA unlabeled product was used as a sample.
ＭＳ測定の結果、この実施例においては、分子量関連イオン［Ｍ−Ｈ］−に加えて、当該分子量関連イオンのリン酸付加体［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−（すなわち［Ｍ＋９７］−）と、当該リン酸付加体が脱水したイオン［Ｍ＋ＰＯ３］−（すなわち［Ｍ＋７９］−）とが検出された。すなわち、８０Ｄａ及び９８Ｄａの質量差を有する特徴的なピークが観測された（データ示さず）。 As a result of MS measurement, in this example, in addition to the molecular weight related ion [M−H] − , a phosphoric acid adduct [M + H 2 PO 4 ] − (that is, [M + 97] − ) of the molecular weight related ion, An ion [M + PO 3 ] − (that is, [M + 79] − ) dehydrated from the phosphate adduct was detected. That is, a characteristic peak having a mass difference of 80 Da and 98 Da was observed (data not shown).
Claims (5)
アミノキノリンと酸性基含有物質とを含む液体物質である液体マトリックスと、
添加剤としてのアンモニウム塩と、
を溶媒中に含む混合液の液滴をターゲットプレート上に形成する工程と、
（ii）前記混合液の液滴から前記溶媒を除去して、前記液滴の体積の減少とともに、前記ターゲットプレートと前記混合液の液滴とが接する面積を縮小させることによって、前記混合液中に含まれる前記解析すべき試料と前記液体マトリックスと前記添加剤とを前記面積の一部へ集め、前記解析すべき試料と前記液体マトリックスと前記添加剤とを含む混合物のフォーカススポットを得る工程と、
（iii）前記混合物のフォーカススポットをＭＡＬＤＩ質量分析測定に供する工程と、
を含む、糖鎖の高感度ＭＡＬＤＩ質量分析法。 (I) a sample to be analyzed containing sugar chain molecules;
A liquid matrix that is a liquid substance containing an aminoquinoline and an acidic group-containing substance;
An ammonium salt as an additive;
Forming a droplet of a mixed solution containing a solvent in a solvent on a target plate;
(Ii) removing the solvent from the droplets of the mixed solution, and reducing the volume of the droplets and reducing the area where the target plate and the droplets of the mixed solution are in contact with each other; Collecting the sample to be analyzed, the liquid matrix, and the additive contained in a part of the area to obtain a focus spot of a mixture including the sample to be analyzed, the liquid matrix, and the additive; ,
(Iii) subjecting the focus spot of the mixture to MALDI mass spectrometry measurement;
Sensitive MALDI mass spectrometry of sugar chains, comprising:
前記工程（iii）における質量分析測定をネガティブモードで行い、［Ｍ−Ｈ］−イオンと、［Ｍ＋Ｈ２ＰＯ４］−イオン及び／又は［Ｍ＋ＰＯ３］−イオンと、からなるピークを検出することによって、前記解析すべき試料から前記糖鎖に由来するイオンを特異的に検出する、請求項２に記載の糖鎖の高感度ＭＡＬＤＩ質量分析法。 When using ammonium phosphate as the ammonium salt in the step (i),
The mass spectrometric measurement in the step (iii) is performed in a negative mode, and a peak composed of [M−H] − ion, [M + H 2 PO 4 ] − ion and / or [M + PO 3 ] − ion is detected. The sugar chain high-sensitivity MALDI mass spectrometry method according to claim 2, wherein ions derived from the sugar chain are specifically detected from the sample to be analyzed.
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