JP2019180335A - Novel mediator - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、フェニレンジアミン系化合物のメディエータとしての用途及び、当該化合物を含む電極改変剤、当該化合物を含む電極、当該電極を含む酵素センサー、及び電池に関する。また本発明は、フェニレンジアミン系化合物および酸化還元酵素を用いた電気化学的測定、フェニレンジアミン系化合物および酸化還元酵素を含む組成物、フェニレンジアミン系化合物を含む電極に関する。 The present invention relates to a use as a mediator of a phenylenediamine compound, an electrode modifying agent containing the compound, an electrode containing the compound, an enzyme sensor containing the electrode, and a battery. The present invention also relates to an electrochemical measurement using a phenylenediamine compound and an oxidoreductase, a composition containing a phenylenediamine compound and an oxidoreductase, and an electrode containing a phenylenediamine compound.
酵素電極においてメディエータは、酵素による酸化還元反応によって発生した電子を、電極に受け渡すための媒介物質として利用されている。酵素から電極への効率的な電子伝達のためには、メディエータが電極の近傍に局在化していることが望ましい。そのため、電極とメディエータを化学結合させる方法や、メディエータ自体を高分子化する方法など、電極にメディエータを固定化させる様々な手法が利用されている。しかしながら、化学結合法はメディエータの側鎖官能基に制限があり、メディエータ自体を高分子化する方法はメディエータの酸化還元電位が変化する可能性があるなど、従来の手法は汎用性に欠けていた。なお、グラッシーカーボン電極を強酸で処理することで表面の官能基を活性化させ、キノン類等のメディエータを吸着固定することも報告されているが、産業界ではほとんど実用化されていない。 In an enzyme electrode, a mediator is used as a mediator for transferring electrons generated by an oxidation-reduction reaction by an enzyme to the electrode. For efficient electron transfer from the enzyme to the electrode, it is desirable that the mediator be localized in the vicinity of the electrode. Therefore, various methods for immobilizing the mediator on the electrode, such as a method of chemically bonding the electrode and the mediator and a method of polymerizing the mediator itself, are used. However, the chemical bonding method has a limitation on the side chain functional group of the mediator, and the method of polymerizing the mediator itself may change the redox potential of the mediator. . It has been reported that the glassy carbon electrode is treated with a strong acid to activate the functional group on the surface and adsorb and fix mediators such as quinones, but it has hardly been put into practical use in the industry.
さらに、いずれの方法もメディエータの電極への固定化のために煩雑な工程が必要であり、高コストとなるという問題もあった。そこで、電極への固定化に煩雑な工程を必要としない、簡便に使用できる電子メディエータが望まれていた。 Furthermore, each method has a problem that a complicated process is required for immobilizing the mediator to the electrode, resulting in high cost. Therefore, there has been a demand for an easily usable electron mediator that does not require a complicated process for immobilization on an electrode.
特許文献１（特開平７−２３４２０１）は、電気化学的測定方法に用いる電子メディエータとしてｐ-フェニレンジアミン化合物を記載している。開示されているｐ-フェニレンジアミン化合物は、ヒドロキシル基、メルカプト基、カルボキシル基、ホスホノオキシ基およびスルホ基からなる群より選ばれる１以上の基を有するｐ-フェニレンジアミン誘導体である。 Patent Document 1 (Japanese Patent Laid-Open No. 7-234201) describes a p-phenylenediamine compound as an electron mediator used in an electrochemical measurement method. The disclosed p-phenylenediamine compound is a p-phenylenediamine derivative having one or more groups selected from the group consisting of hydroxyl group, mercapto group, carboxyl group, phosphonooxy group and sulfo group.
特許文献２（国際公開第２００４／０１１９２９号パンフレット）は、炭素粒子を酸処理して表面を活性化させた後、当該酸処理済炭素粉末にN,N'-ジフェニル-p-フェニレンジアミン（DPPD）を添加し、この炭素粉末を炭素電極に固定化すること、及び該電極を用いた溶液中の硫化水素やチオールの検出を報告している。 Patent Document 2 (WO 2004/011929 pamphlet) discloses that carbon particles are acid-treated to activate the surface, and then the acid-treated carbon powder is mixed with N, N′-diphenyl-p-phenylenediamine (DPPD). ) To fix the carbon powder to the carbon electrode, and to detect hydrogen sulfide and thiol in the solution using the electrode.
特許文献３（特表２００７−５２６４７４）は、N,N'-ジフェニル-p-フェニレンジアミンで誘導化した炭素を含む電極、及び当該電極を用いたpHセンサーを記載している。 Patent Document 3 (Special Table 2007-526474) describes an electrode containing carbon derivatized with N, N′-diphenyl-p-phenylenediamine, and a pH sensor using the electrode.
特許文献４（特開２００８−１８５５３４）は、メディエータとしてフェニレンジアミン系化合物である2,3,5,6-テトラメチル-1,4-フェニレンジアミンまたはN,N-ジメチル-p-フェニレンジアミン、及びこれを用いたエタノール測定を記載している。 Patent Document 4 (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-185534) discloses 2,3,5,6-tetramethyl-1,4-phenylenediamine or N, N-dimethyl-p-phenylenediamine, which is a phenylenediamine compound as a mediator, and The ethanol measurement using this is described.
特許文献５（特開２０１６−０４２０３２）は、メディエータとしてN,N,N',N'-テトラメチル-1,4-フェニレンジアミン、及びこれを用いたグルコース測定を記載している。
N-イソプロピル-N'-フェニル-p-フェニレンジアミン（IPPD）、N,N'-ジフェニル-ｐ-フェニレンジアミン（DPPD）、N-(1,3-ジメチルブチル)-N'-フェニル-p-フェニレンジアミン（6PPD）は、いずれもゴムの老化防止剤として知られている（非特許文献２、日本ゴム協会誌、82巻、第2号、2009、p. 45-49）。
Patent Document 5 (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-042032) describes N, N, N ′, N′-tetramethyl-1,4-phenylenediamine as a mediator and glucose measurement using the same.
N-isopropyl-N'-phenyl-p-phenylenediamine (IPPD), N, N'-diphenyl-p-phenylenediamine (DPPD), N- (1,3-dimethylbutyl) -N'-phenyl-p- Phenylenediamine (6PPD) is known as an anti-aging agent for rubber (
非特許文献１（Analyst, 2003, 128, 473-479）は、炭素粉末を0.1 M塩酸で酸処理し炭素表面を活性化させた後、当該酸処理済炭素粉末にDPPDを添加し、この炭素粉末を炭素電極(基底平面熱分解グラファイト電極、BPPG電極)に固定化すること、及び該電極を用いたスルフィドの検出を報告している。 Non-Patent Document 1 (Analyst, 2003, 128, 473-479) discloses that carbon powder is acid-treated with 0.1 M hydrochloric acid to activate the carbon surface, and then DPPD is added to the acid-treated carbon powder. We report the immobilization of powder on a carbon electrode (base plane pyrolytic graphite electrode, BPPG electrode) and the detection of sulfide using the electrode.
本発明は、上記の問題を解決しうる、新規メディエータを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a novel mediator that can solve the above problems.
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意努力した結果、フェニレンジアミン系化合物が、驚くべきことに、酸処理等の特別な処理を必要とせずに電極表面に吸着可能であり、かつ、該化合物がメディエータとして機能しうることを見出し、本発明を完成させた。本発明者らの知る限り、IPPD、DPPD、6PPDが電極に吸着するメディエータであることはこれまでに報告されておらず、これは驚くべき知見である。 As a result of diligent efforts to solve the above problems, the present inventors have surprisingly been able to adsorb phenylenediamine compounds to the electrode surface without requiring special treatment such as acid treatment, And it discovered that this compound could function as a mediator, and completed this invention. As far as the present inventors know, it has not been reported so far that IPPD, DPPD, and 6PPD are mediators adsorbed on electrodes, which is a surprising finding.
本発明は以下の実施形態を包含する：
[１] 酸化還元酵素、及び、式Iの構造を有する化合物を含む、組成物
R1、R2及びR7は、それぞれ独立に、水素、場合により1以上のXにより置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖のC1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C3-9シクロアルキル、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、アントラセニル又はフェナントレニル、であり、
R3、R4、R5及びR6は、それぞれ独立に、水素、場合により1以上のYにより置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖のC1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C1-6アルコキシ、ハロ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、スルホン又はアミノであり、
R8は、場合により１以上のXにより置換されてもよい、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、アントラセニル及びフェナントレニル、からなる群より選択され、
ここでXは水素、場合によりハロ、アミノ、シアノ、カルボキシ、カルボニル、アルコキシ及びスルホンからなる群より選択される置換基により置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖の、C1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C1-6アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルホン又はアミノであり、
Yはハロ、アミノ、シアノ、カルボキシ、カルボニル、アルコキシ及びスルホンからなる群より選択される］。
[２] 酸化還元酵素、及び、式Iの構造を有する化合物を含む、電極
R1、R2及びR7は、それぞれ独立に、水素、場合により1以上のXにより置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖のC1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C3-9シクロアルキル、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、アントラセニル又はフェナントレニル、であり、
R3、R4、R5及びR6は、それぞれ独立に、水素、場合により1以上のYにより置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖のC1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C1-6アルコキシ、ハロ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、スルホン又はアミノであり、
R8は、場合により１以上のXにより置換されてもよい、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、アントラセニル及びフェナントレニル、からなる群より選択され、
ここでXは水素、場合によりハロ、アミノ、シアノ、カルボキシ、カルボニル、アルコキシ及びスルホンからなる群より選択される置換基により置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖の、C1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C1-6アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルホン又はアミノであり、
Yはハロ、アミノ、シアノ、カルボキシ、カルボニル、アルコキシ及びスルホンからなる群より選択される］。
[３] 前記酸化還元酵素が電極に固定化されている、２に記載の電極。
[４] ２若しくは３に記載の電極を有する、酵素センサー。
[５] １に記載の組成物又は２若しくは３に記載の電極又は４に記載のセンサーを用いる、電気化学的測定方法。
[６] １に記載の組成物を電極に接触させる工程を含む、電極を改変又は修飾する方法。
[７] 式Iで表される化合物が、
[８] 式Iで表される化合物が、
[９] 式Iで表される化学構造を有する電子伝達促進剤
R1、R2及びR7は、それぞれ独立に、水素、場合により1以上のXにより置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖のC1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C3-9シクロアルキル、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、アントラセニル又はフェナントレニル、であり、
R3、R4、R5及びR6は、それぞれ独立に、水素、場合により1以上のYにより置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖のC1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C1-6アルコキシ、ハロ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、スルホン又はアミノであり、
R8は、場合により１以上のXにより置換されてもよい、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、アントラセニル及びフェナントレニル、からなる群より選択され、
ここでXは水素、場合によりハロ、アミノ、シアノ、カルボキシ、カルボニル、アルコキシ及びスルホンからなる群より選択される置換基により置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖の、C1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C1-6アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルホン又はアミノであり、
Yはハロ、アミノ、シアノ、カルボキシ、カルボニル、アルコキシ及びスルホンからなる群より選択される］。
[１０] 式Iで表される化合物が、
[1] A composition comprising an oxidoreductase and a compound having the structure of formula I
R 1 , R 2 and R 7 are each independently hydrogen, optionally substituted by one or more X, linear or branched C 1-6 alkyl, C 1-6 alkenyl, C 1 -6 alkynyl, C 3-9 cycloalkyl, phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, anthracenyl or phenanthrenyl,
R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are each independently hydrogen, optionally substituted by one or more Y, straight or branched C 1-6 alkyl, C 1-6 alkenyl. C 1-6 alkynyl, C 1-6 alkoxy, halo, nitro, cyano, carboxy, sulfone or amino;
R 8 is selected from the group consisting of phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, anthracenyl and phenanthrenyl, optionally substituted by one or more X;
Where X is hydrogen, optionally halo, amino, cyano, carboxy, carbonyl, alkoxy and sulfone, optionally substituted by a substituent selected from the group consisting of linear or branched C 1-6 alkyl C 1-6 alkenyl, C 1-6 alkynyl, C 1-6 alkoxy, halo, hydroxy, nitro, carboxy, cyano, sulfone or amino;
Y is selected from the group consisting of halo, amino, cyano, carboxy, carbonyl, alkoxy and sulfone.
[2] An electrode comprising an oxidoreductase and a compound having the structure of formula I
R 1 , R 2 and R 7 are each independently hydrogen, optionally substituted by one or more X, linear or branched C 1-6 alkyl, C 1-6 alkenyl, C 1 -6 alkynyl, C 3-9 cycloalkyl, phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, anthracenyl or phenanthrenyl,
R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are each independently hydrogen, optionally substituted by one or more Y, straight or branched C 1-6 alkyl, C 1-6 alkenyl. C 1-6 alkynyl, C 1-6 alkoxy, halo, nitro, cyano, carboxy, sulfone or amino;
R 8 is selected from the group consisting of phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, anthracenyl and phenanthrenyl, optionally substituted by one or more X;
Where X is hydrogen, optionally halo, amino, cyano, carboxy, carbonyl, alkoxy and sulfone, optionally substituted by a substituent selected from the group consisting of linear or branched C 1-6 alkyl C 1-6 alkenyl, C 1-6 alkynyl, C 1-6 alkoxy, halo, hydroxy, nitro, carboxy, cyano, sulfone or amino;
Y is selected from the group consisting of halo, amino, cyano, carboxy, carbonyl, alkoxy and sulfone.
[3] The electrode according to 2, wherein the oxidoreductase is immobilized on the electrode.
[4] An enzyme sensor having the electrode according to 2 or 3.
[5] An electrochemical measurement method using the composition according to 1, the electrode according to 2 or 3, or the sensor according to 4.
[6] A method for modifying or modifying an electrode, comprising the step of bringing the composition according to 1 into contact with the electrode.
[7] The compound represented by Formula I is:
[8] The compound represented by Formula I is:
[9] Electron transfer promoter having a chemical structure represented by formula I
R 1 , R 2 and R 7 are each independently hydrogen, optionally substituted by one or more X, linear or branched C 1-6 alkyl, C 1-6 alkenyl, C 1 -6 alkynyl, C 3-9 cycloalkyl, phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, anthracenyl or phenanthrenyl,
R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are each independently hydrogen, optionally substituted by one or more Y, straight or branched C 1-6 alkyl, C 1-6 alkenyl. C 1-6 alkynyl, C 1-6 alkoxy, halo, nitro, cyano, carboxy, sulfone or amino;
R 8 is selected from the group consisting of phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, anthracenyl and phenanthrenyl, optionally substituted by one or more X;
Where X is hydrogen, optionally halo, amino, cyano, carboxy, carbonyl, alkoxy and sulfone, optionally substituted by a substituent selected from the group consisting of linear or branched C 1-6 alkyl C 1-6 alkenyl, C 1-6 alkynyl, C 1-6 alkoxy, halo, hydroxy, nitro, carboxy, cyano, sulfone or amino;
Y is selected from the group consisting of halo, amino, cyano, carboxy, carbonyl, alkoxy and sulfone.
[10] The compound represented by formula I is:
本発明のフェニレンジアミン系化合物は、p-フェニレンジアミンのような従来のメディエータと異なり、電極の酸処理や、メディエータ自体の高分子化等の特別な処理を必要とせずに、そのまま電極表面に吸着可能であり、そのため、簡便に電極に固定化することができる。またこのような電極は電気化学的測定に用いることができる。またこのような電極は電池に応用することができる。 Unlike conventional mediators such as p-phenylenediamine, the phenylenediamine compound of the present invention is adsorbed directly on the electrode surface without the need for special treatment such as acid treatment of the electrode or polymerization of the mediator itself. Therefore, it can be simply immobilized on the electrode. Moreover, such an electrode can be used for electrochemical measurements. Such an electrode can be applied to a battery.
（フェニレンジアミン系化合物）
（フェニレンジアミン系化合物が吸着した電極）
ある実施形態において本発明はフェニレンジアミン系化合物を提供する。別の実施形態において本発明はフェニレンジアミン系化合物を含む、電極改変剤を提供する。この電極改変剤は電極表面に吸着可能であり、電極の電子受容性を改変し得る。別の実施形態において本発明はフェニレンジアミン系化合物又は本発明の電極改変剤が吸着した電極を提供する。別の実施形態において本発明はフェニレンジアミン系化合物又は本発明の電極改変剤を含む電気化学的測定用組成物を提供する。別の実施形態において本発明は、フェニレンジアミン系化合物又は本発明の電極改変剤を含む電気化学的測定用キットを提供する。
(Phenylenediamine compounds)
(Electrode adsorbed with phenylenediamine compound)
In certain embodiments, the present invention provides phenylenediamine-based compounds. In another embodiment, the present invention provides an electrode modifier comprising a phenylenediamine compound. This electrode modifier can be adsorbed on the electrode surface and can modify the electron acceptability of the electrode. In another embodiment, the present invention provides an electrode on which a phenylenediamine compound or the electrode modifier of the present invention is adsorbed. In another embodiment, the present invention provides a composition for electrochemical measurement comprising a phenylenediamine compound or the electrode modifier of the present invention. In another embodiment, the present invention provides an electrochemical measurement kit comprising a phenylenediamine compound or the electrode modifier of the present invention.
本発明のフェニレンジアミン系化合物は、電極と接触させることで電極表面に吸着することができる。このとき、電極に吸着させるために、電極表面を酸処理して活性化するなどの特別の操作は必要ない。さらに、本発明のフェニレンジアミン系化合物は、酸化還元酵素により触媒される酸化還元反応において、メディエータとして機能する。酸化還元酵素としては、EC第1群に分類される各種の酸化還元酵素、例えばグルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アマドリアーゼ(フルクトシルペプチドオキシダーゼまたはフルクトシルアミノ酸オキシダーゼともいう)、ペルオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、D-またはL-アミノ酸オキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、D-またはL-乳酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、チトクロムオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、D-またはL-乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、17Bヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、エストラジオール17Bデヒドロゲナーゼ、D-またはL-アミノ酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、3-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、カタラーゼ、グルタチオンレダクターゼ、チトクロムb5レダクターゼ、アドレノキシンレダクターゼ、チトクロムb5レダクターゼ、アドレノドキシンレダクターゼ、硝酸レダクターゼ、リン酸デヒドロゲナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ピラノースオキシダーゼ、ピラノースデヒドロゲナーゼ、タウロピンデヒドロゲナーゼ等が挙げられるが、これに限らない。また、複数の酵素の組合せであってもよい。上記酵素の補酵素としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)、ピロロキノリンキノン等が挙げられる。上記に挙げた酸化還元酵素は、例えばMethods in Enzymology(1〜602巻)に記載の方法で、種々の基質を用いた活性測定を行うことができる。
The phenylenediamine compound of the present invention can be adsorbed on the electrode surface by contacting with the electrode. At this time, in order to make it adsorb | suck to an electrode, special operation, such as acid-treating and activating the electrode surface, is unnecessary. Furthermore, the phenylenediamine compound of the present invention functions as a mediator in a redox reaction catalyzed by an oxidoreductase. As the oxidoreductase, various oxidoreductases classified into
本明細書において、メディエータとして機能するとは、フェニレンジアミン系化合物が電子移動に与ることをいい、例えば電極を用いる系では、本発明のフェニレンジアミン系化合物は、酸化還元酵素から電子を受け取って還元型となり、電極に電子を渡して酸化型に戻る。このような観点から、本発明のフェニレンジアミン系化合物のことを電子移動媒介剤、電子伝達促進剤、或いは電子メディエータ（単にメディエータともいう）と呼ぶこともできる。本明細書においてこれらの用語は同義とする。 In this specification, functioning as a mediator means that a phenylenediamine compound is subjected to electron transfer. For example, in a system using an electrode, the phenylenediamine compound of the present invention receives an electron from an oxidoreductase and reduces it. It becomes a mold, passes electrons to the electrode, and returns to the oxidized form. From such a viewpoint, the phenylenediamine compound of the present invention can also be referred to as an electron transfer mediator, an electron transfer accelerator, or an electron mediator (also simply referred to as a mediator). In the present specification, these terms are synonymous.
ある実施形態において、本発明の電極から、酸処理した炭素粉末又は炭素粒子を有する電極は除かれる。 In certain embodiments, electrodes having acid-treated carbon powder or carbon particles are excluded from the electrodes of the present invention.
ある実施形態において、本発明の電極と共に用いられる酸化還元酵素は、当該電極に固定化されていてもよい。すなわち、この実施形態において本発明は、酸化還元酵素が固定化され、本発明の電極改変剤が吸着した電極を提供する。ある実施形態において本発明は、酸化還元酵素が固定化され、本発明の電極改変剤が吸着した電極を含む、酵素センサーを提供する。 In an embodiment, the oxidoreductase used with the electrode of the present invention may be immobilized on the electrode. That is, in this embodiment, the present invention provides an electrode on which an oxidoreductase is immobilized and the electrode modifier of the present invention is adsorbed. In one embodiment, the present invention provides an enzyme sensor comprising an electrode on which an oxidoreductase is immobilized and the electrode modifying agent of the present invention is adsorbed.
本発明のフェニレンジアミン系化合物又は該フェニレンジアミン系化合物を含む電極改変剤は、特別な処理を必要とすることなく、電極表面に吸着することができる。したがってある実施形態では、改変された電極を作製するために、予め本発明のフェニレンジアミン系化合物又は該フェニレンジアミン系化合物を含む電極改変剤を電極に吸着させてもよい。別の実施形態では、電気化学的測定を行う際に、本発明のフェニレンジアミン系化合物又は該フェニレンジアミン系化合物を含む電極改変剤、及び酸化還元酵素を含む測定溶液（組成物）を使用することができる。この実施形態では、本発明のフェニレンジアミン系化合物又は該フェニレンジアミン系化合物を含む電極改変剤、及び酸化還元酵素を含む組成物を電極に物理的に接触させると、本発明のフェニレンジアミン系化合物又は該フェニレンジアミン系化合物を含む電極改変剤が電極に吸着し、電気化学的特性が改変された電極が、測定時にその場で作製される。 The phenylenediamine compound of the present invention or the electrode modifier containing the phenylenediamine compound can be adsorbed on the electrode surface without requiring special treatment. Therefore, in one embodiment, in order to produce a modified electrode, the phenylenediamine compound of the present invention or an electrode modifying agent containing the phenylenediamine compound may be adsorbed to the electrode in advance. In another embodiment, when the electrochemical measurement is performed, the measurement solution (composition) containing the phenylenediamine compound of the present invention or the electrode modifier containing the phenylenediamine compound and the oxidoreductase is used. Can do. In this embodiment, when the phenylenediamine compound of the present invention or an electrode modifier containing the phenylenediamine compound and a composition containing an oxidoreductase are brought into physical contact with the electrode, the phenylenediamine compound of the present invention or An electrode modifying agent containing the phenylenediamine compound is adsorbed on the electrode, and an electrode whose electrochemical characteristics are modified is produced in situ at the time of measurement.
ある実施形態では、本発明のフェニレンジアミン系化合物又は該フェニレンジアミン系化合物を含む電極改変剤を電極に吸着させるに当たり、電極を酸で前処理しない。別の実施形態では、本発明のフェニレンジアミン系化合物又は該フェニレンジアミン系化合物を含む電極改変剤を電極に吸着させるに当たり、電極を酸で前処理してもよい。また、ある実施形態では、本発明のフェニレンジアミン系化合物又は該フェニレンジアミン系化合物を含む電極改変剤を、高分子に包摂して、電極に吸着させてもよい。 In an embodiment, the electrode is not pretreated with an acid when the phenylenediamine compound of the present invention or the electrode modifier containing the phenylenediamine compound is adsorbed to the electrode. In another embodiment, the electrode may be pretreated with an acid when the phenylenediamine compound of the present invention or the electrode modifier containing the phenylenediamine compound is adsorbed to the electrode. In one embodiment, the phenylenediamine compound of the present invention or an electrode modifier containing the phenylenediamine compound may be included in a polymer and adsorbed on the electrode.
ある実施形態において、本発明のフェニレンジアミン系化合物は下記の一般式Ｉの化合物でありうる：
R1、R2及びR7は、それぞれ独立に、水素、場合により1以上のXにより置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖のC1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C3-9シクロアルキル、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、アントラセニル又はフェナントレニル、であり、
R3、R4、R5及びR6は、それぞれ独立に、水素、場合により1以上のYにより置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖のC1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C1-6アルコキシ、ハロ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、スルホン又はアミノであり、
R8は、場合により１以上のXにより置換されてもよい、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、アントラセニル及びフェナントレニル、からなる群より選択され、
ここでXは水素、場合によりハロ、アミノ、シアノ、カルボキシ、カルボニル、アルコキシ及びスルホンからなる群より選択される置換基により置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖の、C1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C1-6アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルホン又はアミノであり、
Yはハロ、アミノ、シアノ、カルボキシ、カルボニル、アルコキシ及びスルホンからなる群より選択される］。
In certain embodiments, the phenylenediamine-based compounds of the present invention can be compounds of general formula I:
R 1 , R 2 and R 7 are each independently hydrogen, optionally substituted by one or more X, linear or branched C 1-6 alkyl, C 1-6 alkenyl, C 1 -6 alkynyl, C 3-9 cycloalkyl, phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, anthracenyl or phenanthrenyl,
R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are each independently hydrogen, optionally substituted by one or more Y, straight or branched C 1-6 alkyl, C 1-6 alkenyl. C 1-6 alkynyl, C 1-6 alkoxy, halo, nitro, cyano, carboxy, sulfone or amino;
R 8 is selected from the group consisting of phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, anthracenyl and phenanthrenyl, optionally substituted by one or more X;
Where X is hydrogen, optionally halo, amino, cyano, carboxy, carbonyl, alkoxy and sulfone, optionally substituted by a substituent selected from the group consisting of linear or branched C 1-6 alkyl C 1-6 alkenyl, C 1-6 alkynyl, C 1-6 alkoxy, halo, hydroxy, nitro, carboxy, cyano, sulfone or amino;
Y is selected from the group consisting of halo, amino, cyano, carboxy, carbonyl, alkoxy and sulfone.
ある実施形態において、本発明のフェニレンジアミン系化合物は、N-イソプロピル-N'-フェニル-p-フェニレンジアミン（IPPD）
ある実施形態において、本発明のフェニレンジアミン系化合物は、N,N'-ジフェニル-p-フェニレンジアミン（DPPD）
ある実施形態において、本発明のフェニレンジアミン系化合物は、N-(1,3-ジメチルブチル)-N'-フェニル-p-フェニレンジアミン（6PPD）
本発明のフェニレンジアミン系化合物から、以下の構造
本発明のフェニレンジアミン系化合物に酵素と共有結合させるための官能基を修飾してもよい。フェニレンジアミン系化合物と官能基の間にC1〜C20のアルキルやアミノ酸、ペプチド等をリンカーとして入れても良い。リンカーの間に適宜、ヒドロキシル基やアミノ基、アルケン等が含まれていてもよい。官能基として、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、ヒドラジノ基、チオシアネート基、エポキシ基、ビニル基、ハロゲン基、酸エステル基、リン酸基、チオール基、ジスルフィド基、ジチオカルバメート基、ジチオホスフェート基、ジチオホスホネート基、チオエーテル基、チオ硫酸基、スクシンイミド基、マレイミド基及びチオ尿素基等が挙げられる。 A functional group for covalently bonding to an enzyme may be modified in the phenylenediamine compound of the present invention. A C1-C20 alkyl, amino acid, peptide or the like may be inserted as a linker between the phenylenediamine compound and the functional group. A hydroxyl group, an amino group, an alkene, or the like may be appropriately included between the linkers. Examples of functional groups include hydroxyl groups, carboxyl groups, amino groups, aldehyde groups, hydrazino groups, thiocyanate groups, epoxy groups, vinyl groups, halogen groups, acid ester groups, phosphate groups, thiol groups, disulfide groups, and dithiocarbamate groups. , Dithiophosphate groups, dithiophosphonate groups, thioether groups, thiosulfate groups, succinimide groups, maleimide groups, thiourea groups, and the like.
フェニレンジアミン系化合物には、酸化還元状態及びイオン化状態があり得る。上記の化学式では、本発明のフェニレンジアミン系化合物を、中性型で還元型の形態で記載した。しかしながらこの形態のみならず、本発明のフェニレンジアミン系化合物は、酸化型（ジイミン型）、半酸化型、又は還元型（ジアミン型）であり得る。また、本発明のフェニレンジアミン系化合物は、中性型、又はカチオン型でありうる。便宜上、本発明のフェニレンジアミン系化合物、例えば上記化学式で表される本発明のフェニレンジアミン系化合物という場合、これは、中性型、又はカチオン型の、酸化型、半酸化型、又は還元型の形態のものを包含するものとする。例えば、測定系に、本発明のフェニレンジアミン系化合物として中性型で酸化型の化合物を添加した後、溶液のpHや電子授受によりそれが酸化型でカチオン型の化合物に変化することがあり得るが、そのような化合物も本発明のフェニレンジアミン系化合物に包含されるものとする。 A phenylenediamine compound may have a redox state and an ionized state. In the above chemical formula, the phenylenediamine compound of the present invention is described in a neutral and reduced form. However, not only in this form, the phenylenediamine compound of the present invention can be in an oxidized form (diimine type), a semi-oxidized form, or a reduced form (diamine type). In addition, the phenylenediamine compound of the present invention can be neutral or cationic. For convenience, when referring to the phenylenediamine compound of the present invention, for example, the phenylenediamine compound of the present invention represented by the above chemical formula, this is a neutral type or a cation type, an oxidized type, a half oxidized type, or a reduced type. It shall be included in the form. For example, after adding a neutral and oxidized compound as the phenylenediamine compound of the present invention to the measurement system, it may be changed to an oxidized and cationic compound by pH or electron transfer of the solution. However, such a compound is also included in the phenylenediamine compound of the present invention.
本発明のフェニレンジアミン系化合物は、人工合成してもよく、天然物を取得してもよい。また市販されているものであってもよい。合成する場合は、慣用の有機合成手法を用いて有機合成を行い、NMR、IR、質量分析等により生成物を確認することができる。 The phenylenediamine compound of the present invention may be artificially synthesized or a natural product may be obtained. Moreover, what is marketed may be used. In the case of synthesis, organic synthesis is performed using a conventional organic synthesis method, and the product can be confirmed by NMR, IR, mass spectrometry or the like.
（酸化還元酵素の固定化方法）
酸化還元酵素は任意の公知の方法により固相に固定化されうる。例えば酸化還元酵素をビーズや膜、電極表面に固定化してもよい。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、ポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて酸化還元酵素をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。固定化する酸化還元酵素の量は、電気化学的測定或いは燃料電池発電に必要な電流を生じうる量とすることができ、適宜決定しうる。
(Method for immobilizing oxidoreductase)
The oxidoreductase can be immobilized on the solid phase by any known method. For example, oxidoreductase may be immobilized on beads, membranes, or electrode surfaces. Examples of the immobilization method include a method using a crosslinking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, a redox polymer, and the like. It may be adsorbed and fixed on top, or a combination of these may be used. Typically, oxidoreductase is immobilized on a carbon electrode using glutaraldehyde, and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde. The amount of the oxidoreductase to be immobilized can be an amount that can generate an electric current required for electrochemical measurement or fuel cell power generation, and can be determined as appropriate.
（本発明のフェニレンジアミン系化合物の吸着方法）
ある実施形態において、本発明のフェニレンジアミン系化合物は、溶液中に遊離した状態で存在していてもよく、また、ビーズや膜、電極表面に吸着、例えば物理的に吸着されていてもよい。本発明のフェニレンジアミン系化合物が電極表面に吸着していることを、電極表面に固定化されている、ということもあるが、本明細書においてこれらは同義とする。吸着方法としては、本発明のフェニレンジアミン系化合物を適当な媒体中に溶解させ、その溶液を電極と物理的に接触させる工程を含む方法が挙げられる。別の実施形態では、本発明のフェニレンジアミン系化合物を電極に噴霧してもよい。吸着させるフェニレンジアミン系化合物の量は、電気化学的測定或いは電池発電に必要な電流を生じうる量とすることができ、適宜決定しうる。
(Adsorption method of phenylenediamine compound of the present invention)
In an embodiment, the phenylenediamine compound of the present invention may be present in a free state in a solution, and may be adsorbed, for example, physically adsorbed on the surface of a bead, membrane, or electrode. Although the fact that the phenylenediamine compound of the present invention is adsorbed on the electrode surface may be said to be immobilized on the electrode surface, these are synonymous in this specification. Examples of the adsorption method include a method comprising a step of dissolving the phenylenediamine compound of the present invention in an appropriate medium and physically bringing the solution into contact with an electrode. In another embodiment, the phenylenediamine compound of the present invention may be sprayed onto the electrode. The amount of the phenylenediamine compound to be adsorbed can be an amount that can generate an electric current necessary for electrochemical measurement or battery power generation, and can be appropriately determined.
ある実施形態では、電極に本発明のフェニレンジアミン系化合物が吸着され、さらに酸化還元酵素が固定化されていてもよい。この場合、先に本発明のフェニレンジアミン系化合物を吸着させ次いで酸化還元酵素を固定化してもよく、又は先に酸化還元酵素を固定化させ次いで本発明のフェニレンジアミン系化合物を吸着してもよく、又は酸化還元酵素を固定化する操作においてフェニレンジアミン系化合物を同時に吸着させてもよい。 In an embodiment, the phenylenediamine compound of the present invention may be adsorbed on the electrode, and the oxidoreductase may be immobilized. In this case, the phenylenediamine compound of the present invention may be first adsorbed and then the oxidoreductase may be immobilized, or the oxidoreductase may be immobilized first and then the phenylenediamine compound of the present invention may be adsorbed. Alternatively, the phenylenediamine compound may be adsorbed simultaneously in the operation of immobilizing the oxidoreductase.
試料溶液に添加する本発明のフェニレンジアミン系化合物の終濃度は特に限定されず、例えば、0.01μM〜10mM、0.02μM〜5mM、0.03μM〜1mM、0.04μM〜800μM 、0.05μM〜600μM 、0.06μM〜500μM 、0.08μM〜400μM 、0.1μM〜300μM 、0.15μM〜200μM 、0.2μM〜100μM 、0.3μM〜50μM 、例えば0.05μM〜100μMの範囲であり得る。試料溶液に添加する本発明のフェニレンジアミン系化合物の終濃度は特に限定されず、例えば0.000001〜0.5%(w/v)、0.000003〜0.3%(w/v)、0.000005〜0.1%(w/v)、0.00001〜0.05%(w/v)、0.00002〜0.03%(w/v)、0.00003〜0.01%(w/v)であり得る。なお、フェニレンジアミン系化合物と他の試薬との添加順序は制限されず、同時でも逐次添加でもよい。 The final concentration of the phenylenediamine compound of the present invention to be added to the sample solution is not particularly limited.For example, 0.01 μM to 10 mM, 0.02 μM to 5 mM, 0.03 μM to 1 mM, 0.04 μM to 800 μM, 0.05 μM to 600 μM, 0.06 μM It can be in the range of ˜500 μM, 0.08 μM to 400 μM, 0.1 μM to 300 μM, 0.15 μM to 200 μM, 0.2 μM to 100 μM, 0.3 μM to 50 μM, such as 0.05 μM to 100 μM. The final concentration of the phenylenediamine compound of the present invention to be added to the sample solution is not particularly limited. For example, 0.000001 to 0.5% (w / v), 0.000003 to 0.3% (w / v), 0.000005 to 0.1% (w / v ), 0.00001-0.05% (w / v), 0.00002-0.03% (w / v), 0.00003-0.01% (w / v). The order of addition of the phenylenediamine compound and other reagents is not limited, and they may be added simultaneously or sequentially.
ある実施形態において酸化還元反応を行う時間又は電気化学的測定を行う時間は、60分以下、30分以下、10分以下、5分以下、又は1分以下とすることができる。または、長期間測定する酵素センサーや電池等においては、酸化還元反応を行う時間は、60分以上、120分以上、1日以上、2日以上、3日以上、1週間以上、2週間以上、3週間以上とすることができる。例えばフェニレンジアミン系化合物を酸化還元酵素と共に使用する場合、試料に含まれる又は試料中に生成すると推定される還元型のメディエータの濃度範囲に対応して、電気化学的測定用試薬の各成分の濃度を調節することができる。 In an embodiment, the time for performing the oxidation-reduction reaction or the time for performing the electrochemical measurement can be 60 minutes or less, 30 minutes or less, 10 minutes or less, 5 minutes or less, or 1 minute or less. Or, for enzyme sensors and batteries that measure for a long time, the oxidation-reduction reaction time is 60 minutes or more, 120 minutes or more, 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 1 week or more, 2 weeks or more It can be 3 weeks or more. For example, when a phenylenediamine compound is used with an oxidoreductase, the concentration of each component of the reagent for electrochemical measurement corresponds to the concentration range of the reduced mediator contained in the sample or estimated to be generated in the sample. Can be adjusted.
特に断らない限り、本発明の組成物に含まれる酸化還元酵素或いは本発明の電極に固定化された酸化還元酵素は、精製された酵素である。酸化還元酵素を含む細胞抽出物や細胞破砕液、粗酵素抽出液は、酸化還元酵素以外にも様々な夾雑物質を含む。例えば微生物では粗酵素抽出液中のリボフラビン量は約53〜133μMとの報告がある(J Indust Micro Biotech 1999, 22, pp. 8-18)。このような粗酵素抽出液等は、そのまま電気化学的測定に供すると、夾雑物質が電子を受け取るなどして電極への電子の授受が妨害されるため、粗酵素抽出液において、このリボフラビン濃度では正確な電気化学的測定は困難である。そこで本発明の電気化学的測定法では、夾雑物質が除去された酸化還元酵素を使用することができる。本明細書において酸化還元酵素が精製されている、又は精製酵素である、とは、必ずしもタンパク質が純品である必要はなく、電気化学的測定が可能な程度に酵素標品から夾雑物質が除去されていることをいう。 Unless otherwise specified, the oxidoreductase contained in the composition of the present invention or the oxidoreductase immobilized on the electrode of the present invention is a purified enzyme. Cell extracts, cell disruptions, and crude enzyme extracts containing oxidoreductases contain various contaminants in addition to oxidoreductases. For example, it has been reported that the amount of riboflavin in the crude enzyme extract is about 53 to 133 μM in microorganisms (J Indust Micro Biotech 1999, 22, pp. 8-18). If such a crude enzyme extract or the like is subjected to electrochemical measurement as it is, since contaminants receive electrons and the transfer of electrons to the electrode is hindered, in the crude enzyme extract, this riboflavin concentration is Accurate electrochemical measurements are difficult. Therefore, in the electrochemical measurement method of the present invention, an oxidoreductase from which impurities are removed can be used. In this specification, the expression that the oxidoreductase is purified or is a purified enzyme does not necessarily mean that the protein is a pure product, and impurities are removed from the enzyme preparation to the extent that electrochemical measurement is possible. It means being done.
（酸化還元酵素の活性測定）
酸化還元酵素の活性測定を説明するに当たり、具体的な酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）を例とする。GDH(EC 1.1.99.10)は、グルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。このとき電子受容体が電子を受け取り、還元型電子受容体になる。GDHの活性は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート(PMS)及び2,6-ジクロロインドフェノール(DCIP)を用いた以下の測定系を用いて測定することができる。
（反応１） D-グルコ−ス ＋ PMS（酸化型）
→ D-グルコノ-δ-ラクトン ＋ PMS（還元型）
（反応２） PMS（還元型） ＋ DCIP（酸化型）
→ PMS（酸化型） ＋ DCIP（還元型）
(Measurement of oxidoreductase activity)
In describing the measurement of oxidoreductase activity, glucose dehydrogenase (GDH) is taken as an example of a specific enzyme. GDH (EC 1.1.99.10) catalyzes a reaction that oxidizes the hydroxyl group of glucose to produce glucono-δ-lactone. At this time, the electron acceptor receives electrons and becomes a reduced electron acceptor. The activity of GDH can be measured using this principle of action, for example, using the following measurement system using phenazine methosulfate (PMS) and 2,6-dichloroindophenol (DCIP) as electron acceptors. .
(Reaction 1) D-glucose + PMS (oxidized form)
→ D-glucono-δ-lactone + PMS (reduced)
(Reaction 2) PMS (reduced) + DCIP (oxidized)
→ PMS (oxidation type) + DCIP (reduction type)
具体的には、まず、（反応１）において、D-グルコースの酸化に伴い、PMS（還元型）が生成する。続いて進行する（反応２）により、PMS（還元型）が酸化されるのに伴ってDCIPが還元される。この「DCIP（酸化型）」の消失度合を波長600nmにおける吸光度の変化量として検知し、この変化量に基づいて酵素活性を求めることができる。 Specifically, first, in (Reaction 1), PMS (reduced form) is generated as D-glucose is oxidized. By continuing (reaction 2), DCIP is reduced as PMS (reduced form) is oxidized. The disappearance degree of this “DCIP (oxidized type)” is detected as the amount of change in absorbance at a wavelength of 600 nm, and the enzyme activity can be determined based on this amount of change.
GDHの活性は、以下の手順に従って測定することができる。100mM リン酸緩衝液(pH7.0) 2.05mL、1M D-グルコース溶液 0.6mLおよび2mM DCIP溶液 0.15mLを混合し、37℃で5分間保温する。次いで、15mM PMS溶液 0.1mL及び酵素サンプル溶液0.1mLを添加し、反応を開始する。反応開始時、および、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う600nmにおける吸光度の１分間あたりの減少量(ΔA600)を求め、次式に従いGDH活性を算出する。この際、GDH活性は、37℃において濃度200mMのD-グルコース存在下で１分間に1μmolのDCIPを還元する酵素量を１Ｕと定義する。 The activity of GDH can be measured according to the following procedure. Mix 2.05 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0), 0.6 mL of 1M D-glucose solution and 0.15 mL of 2 mM DCIP solution, and incubate at 37 ° C. for 5 minutes. Then 0.1 mL of 15 mM PMS solution and 0.1 mL of enzyme sample solution are added to start the reaction. The absorbance at the start of the reaction and with time is measured to determine the amount of decrease in absorbance per minute (ΔA600) at 600 nm accompanying the progress of the enzyme reaction, and the GDH activity is calculated according to the following formula. At this time, the GDH activity is defined as 1 U of the amount of enzyme that reduces 1 μmol of DCIP per minute in the presence of D-glucose at a concentration of 200 mM at 37 ° C.
なお、式中の3.0は反応試薬＋酵素試薬の液量(mL)、16.3は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数(cm2/μmol)、0.1は酵素溶液の液量(mL)、1.0はセルの光路長(cm)、ΔA600blankは100mM リン酸緩衝液(pH7.0)を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の600nmにおける吸光度の１分間あたりの減少量、dfは希釈倍数を表す。 In the formula, 3.0 is the reaction reagent + enzyme reagent solution volume (mL), 16.3 is the millimolar molecular extinction coefficient (cm 2 / μmol) under the conditions of this activity measurement, 0.1 is the enzyme solution solution volume (mL), and 1.0 is Cell optical path length (cm), ΔA600 blank is the amount of decrease in absorbance at 600 nm per minute when reaction is started by adding 100 mM phosphate buffer (pH 7.0) instead of enzyme sample solution, df is dilution Represents a multiple.
本発明の電気化学的測定用キットは、少なくとも１回のアッセイに十分な量の本発明のフェニレンジアミン系化合物又は該フェニレンジアミン系化合物を含む電極改変剤を含む。典型的には、本発明の電気化学的測定用は、本発明のフェニレンジアミン系化合物に加えて、酸化還元酵素、アッセイに必要な緩衝液、キャリブレーションカーブ作製のための基質標準溶液、ならびに指針を含む。例えば酸化還元酵素はGDHであってもよく、この場合、基質標準溶液はグルコース標準溶液であり得る。 The kit for electrochemical measurements of the present invention contains a sufficient amount of the phenylenediamine compound of the present invention or an electrode modifying agent containing the phenylenediamine compound for at least one assay. Typically, for the electrochemical measurement of the present invention, in addition to the phenylenediamine compound of the present invention, an oxidoreductase, a buffer necessary for the assay, a substrate standard solution for preparing a calibration curve, and a guideline including. For example, the oxidoreductase may be GDH, in which case the substrate standard solution may be a glucose standard solution.
ある実施形態において、本発明の電気化学的測定用キットは、本発明のフェニレンジアミン系化合物と酸化還元酵素とを同一試薬として含む。別の実施形態において、本発明の電気化学的測定用キットは、フェニレンジアミン系化合物と酸化還元酵素とを別々の試薬として含む。別の実施形態では、酸化還元酵素は電極に固定化されていてもよく、そのような電極に対して用いる本発明の電気化学的測定用キットはフェニレンジアミン系化合物を単一試薬として含む。ただしここでいう単一試薬とは、当該試薬がフェニレンジアミン系化合物以外の物質を含まないことを意味するものではない。本発明のフェニレンジアミン系化合物が単一試薬中で溶解するよう、該単一試薬は、適当な媒体を含み得る。媒体は本発明のフェニレンジアミン系化合物が溶解するものであればどのようなものでもよく、水、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、アセトニトリルなどが挙げられるがこれに限らない。本発明のフェニレンジアミン系化合物は種々の形態で、例えば、粉末固体状の試薬として、ビーズや電極表面に固定化された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液、例えば遮光されている溶液として提供することができる。 In one embodiment, the electrochemical measurement kit of the present invention contains the phenylenediamine compound of the present invention and an oxidoreductase as the same reagent. In another embodiment, the electrochemical measurement kit of the present invention contains a phenylenediamine compound and an oxidoreductase as separate reagents. In another embodiment, the oxidoreductase may be immobilized on an electrode, and the electrochemical measurement kit of the present invention used for such an electrode contains a phenylenediamine compound as a single reagent. However, the single reagent here does not mean that the reagent does not contain a substance other than the phenylenediamine compound. The single reagent may contain a suitable medium so that the phenylenediamine-based compound of the present invention dissolves in the single reagent. The medium may be any medium as long as it dissolves the phenylenediamine compound of the present invention, and examples thereof include water, methanol, ethanol, propanol, acetone, and acetonitrile, but are not limited thereto. The phenylenediamine compound of the present invention can be used in various forms, for example, as a powdered solid reagent, as a reagent immobilized on a bead or electrode surface, or as a solution in an appropriate storage solution, for example, a light-shielded solution. Can be provided.
電気化学的測定の一例としてグルコース濃度の測定が挙げられる。グルコース濃度の測定は、比色式電気化学的測定用の場合は、例えば、以下のように行うことができる。電気化学的測定用の反応層にはグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)、そして反応促進剤としてN-(2-アセトアミド）イミド２酢酸(ADA)、ビス(2-ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン(Bis-Tris)、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。ここで、必要に応じてpH緩衝剤、発色試薬（変色試薬）を添加する。ここにグルコースを含む試料を加え、一定時間反応させる。この間、GDHより電子を直接受け取ることによって重合し生成する色素もしくは還元された色素の最大吸収波長に相当する吸光度をモニタリングする。レート法であれば、吸光度の時間あたりの変化率から、エンドポイント法であれば、試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化から、予め標準濃度のグルコース溶液を用いて作製したキャリブレーションカーブを元にして、試料中のグルコース濃度を算出することができる。 An example of electrochemical measurement is measurement of glucose concentration. In the case of the colorimetric electrochemical measurement, the glucose concentration can be measured as follows, for example. The reaction layer for electrochemical measurement includes glucose dehydrogenase (GDH), and N- (2-acetamido) imidodiacetic acid (ADA), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis) as reaction accelerators -Tris), a liquid or solid composition containing one or more substances selected from the group consisting of sodium carbonate and imidazole. Here, a pH buffering agent and a coloring reagent (discoloring reagent) are added as necessary. A sample containing glucose is added to this and allowed to react for a certain time. During this time, the absorbance corresponding to the maximum absorption wavelength of the dye produced by polymerization or reduction by directly receiving electrons from GDH is monitored. In the case of the rate method, from the rate of change of absorbance per time, in the case of the endpoint method, the calibration was made in advance using a standard concentration glucose solution from the change in absorbance up to the point when all the glucose in the sample was oxidized. Based on the calibration curve, the glucose concentration in the sample can be calculated.
この方法において使用できる発色試薬（変色試薬）としては、例えば2,6-ジクロロインドフェノール(DCIP)を電子受容体として添加し、600nmにおける吸光度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、発色試薬としてニトロテトラゾリウムブルー(NTB)を加え、570nm吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、グルコース濃度を算出することが可能である。なお、いうまでもなく、使用する発色試薬（変色試薬）はこれらに限定されない。 As a coloring reagent (color changing reagent) that can be used in this method, for example, glucose can be quantified by adding 2,6-dichloroindophenol (DCIP) as an electron acceptor and monitoring the decrease in absorbance at 600 nm. . Further, nitrotetrazolium blue (NTB) is added as a coloring reagent, and the amount of diformazan produced can be determined by measuring the absorbance at 570 nm, and the glucose concentration can be calculated. Needless to say, the coloring reagent (color changing reagent) to be used is not limited to these.
（酵素センサー）
ある実施形態において本発明は、酸化還元酵素が固定化され、本発明の電極改変剤が吸着した電極を含む、酵素センサーを提供する。酵素センサーの電極としては、例えばカーボン電極、金電極、白金電極などが挙げられ、この電極上に酸化還元酵素を塗布または固定化することができる。さらに、導電性材料としてCo、Pd、Rh、Ir、Ru、Os、Re、Ni、Cr、Fe、Mo、Ti、Al、Cu、V、Nb、Zr、Sn、In、Ga、Mg、Pbのうち少なくとも一種類の元素を含む金属微粒子が含まれていてもよく、これらは、合金であっても、めっきを施したものであってよい。カーボンとして、カーボンナノチューブやカーボンブラック、グラファイト、フラーレン、及びその誘導体等も含まれる。酸化還元酵素の固定化方法としては、上記の「酸化還元酵素の固定化方法」の段落を参照のこと。
(Enzyme sensor)
In one embodiment, the present invention provides an enzyme sensor comprising an electrode on which an oxidoreductase is immobilized and the electrode modifying agent of the present invention is adsorbed. Examples of the electrode of the enzyme sensor include a carbon electrode, a gold electrode, and a platinum electrode, and an oxidoreductase can be applied or immobilized on the electrode. Furthermore, Co, Pd, Rh, Ir, Ru, Os, Re, Ni, Cr, Fe, Mo, Ti, Al, Cu, V, Nb, Zr, Sn, In, Ga, Mg, Pb as conductive materials Among them, fine metal particles containing at least one kind of element may be contained, and these may be alloys or plated. Examples of carbon include carbon nanotubes, carbon black, graphite, fullerene, and derivatives thereof. For the method of immobilizing oxidoreductase, see the paragraph of “Method of immobilizing oxidoreductase” above.
ある実施形態において、本発明の酵素センサーの一例としてグルコースセンサーが挙げられる。このグルコースセンサーは、電極に吸着された本発明のフェニレンジアミン系化合物及び電極に固定化されたGDH又はグルコースオキシダーゼ(GOD)を有しうる。該グルコースセンサーは持続血糖測定や連続グルコースモニタリングに使用可能である。 In certain embodiments, an example of an enzyme sensor of the present invention includes a glucose sensor. The glucose sensor may have the phenylenediamine compound of the present invention adsorbed on the electrode and GDH or glucose oxidase (GOD) immobilized on the electrode. The glucose sensor can be used for continuous blood glucose measurement and continuous glucose monitoring.
本発明の電極、酵素センサー、及び電気化学的測定用組成物は、ポテンショスタットやガルバノスタットなどを用いることにより、種々の電気化学的な測定手法に用いることができる。電気化学的測定法としては、アンペロメトリー、例えばクロノアンペロメトリー、ボルタンメトリー、例えばサイクリックボルタンメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリーなどの様々な手法が挙げられる。例えば測定対象基質がグルコースであれば、アンペロメトリー法により、グルコースが還元される際の電流を測定することで、試料中のグルコース濃度を算出することができる。印加電圧は条件や装置の設定にもよるが、例えば-1000mV〜+1000mV(vs. Ag/AgCl)などとすることができる。 The electrode, enzyme sensor, and electrochemical measurement composition of the present invention can be used in various electrochemical measurement methods by using a potentiostat, a galvanostat, or the like. Electrochemical measurement methods include various techniques such as amperometry, such as chronoamperometry, voltammetry, such as cyclic voltammetry, potentiometry, coulometry. For example, if the measurement target substrate is glucose, the glucose concentration in the sample can be calculated by measuring the current when glucose is reduced by amperometry. Although the applied voltage depends on conditions and apparatus settings, it can be set to, for example, -1000 mV to +1000 mV (vs. Ag / AgCl).
なお、試験化合物が電極に吸着するか否かは、サイクリックボルタンメトリーにより確認することができる。掃引速度を変化させ、例えば10mV/secから50mV/secの範囲で変化させ、酸化電流の最大値(IOmax)および還元電流の最大値(IRmax)がどのように変化するか調べる。一般的に、メディエータが電極に吸着している場合、サイクリックボルタンメトリーの掃引速度とIOmaxおよびIRmaxの値は比例関係になることが知られている。メディエータが拡散している場合は、掃引速度の0.5乗にIOmaxおよびIRmaxが比例する。IOmaxおよびIRmaxと、掃引速度の関係から、化合物が吸着しているか、拡散しているかを決定する。 Whether or not the test compound is adsorbed on the electrode can be confirmed by cyclic voltammetry. By changing the sweep rate, for example, in the range of 10 mV / sec to 50 mV / sec, it is examined how the maximum value (I Omax ) of the oxidation current and the maximum value (I Rmax ) of the reduction current change. In general, when the mediator is adsorbed on an electrode, it is known that the sweep rate of cyclic voltammetry and the values of I Omax and I Rmax are in a proportional relationship. When the mediator is diffused, I Omax and I Rmax are proportional to the sweep speed to the 0.5th power. Whether the compound is adsorbed or diffused is determined from the relationship between I Omax and I Rmax and the sweep rate.
電気化学的測定の一例としてグルコースの電気化学的測定が挙げられる。ある実施形態において、本発明は、グルコースを含みうる試料と、フェニレンジアミン系化合物と、精製されたグルコースオキシダーゼ又は精製されたグルコースデヒドロゲナーゼとを接触させる工程及び電流を測定する工程を含む、グルコースの電気化学的測定方法を提供する。該フェニレンジアミン系化合物は溶液中に存在するか又は電極に吸着されていてもよく、酵素は電極に固定化されていてもよい。 An example of electrochemical measurement is electrochemical measurement of glucose. In one embodiment, the present invention relates to a method of contacting glucose, comprising contacting a sample that may contain glucose, a phenylenediamine-based compound with purified glucose oxidase or purified glucose dehydrogenase, and measuring a current. A chemical measurement method is provided. The phenylenediamine compound may be present in the solution or adsorbed on the electrode, and the enzyme may be immobilized on the electrode.
例えばグルコース濃度の電気化学的測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。作用電極としてGDH又はGODを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばAg/AgCl電極やAg/Ag+電極）を用いる。反応液に本発明のフェニレンジアミン系化合物を添加する。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。印加する電位は、例えば+800mV以下、+700mV以下、+600mV以下、+500mV以下、+400mV以下、+300mV以下、+200mV以下、+100mV以下、+50mV以下とすることができ、-200mV以上、-100mV以上、-50mV以上、例えば0mV以上、とすることができ、例えば+800mV〜-200mV、+800mV〜-100mV、+800mV〜-50mV、+600mV〜0mV、+500mV〜0mV、+400mV〜0mV、+300mV〜0mV、+200mV〜0mVとすることができる（いずれも銀塩化銀参照電極に対し）。グルコースが含まれる測定溶液のpHはpH3〜10の範囲内であり得る。例えば、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10であり、溶液中に緩衝剤として、グリシン、酢酸、クエン酸、リン酸、炭酸、グッド緩衝剤等が含まれていてもよい。GDHやGOD以外の酵素、及びグルコース以外の基質を用いる場合でも適宜、pHを変えて測定することができる。
For example, electrochemical measurement of glucose concentration can be performed as follows. Put buffer in constant temperature cell and maintain at constant temperature. An electrode on which GDH or GOD is immobilized is used as a working electrode, and a counter electrode (for example, a platinum electrode) and a reference electrode (for example, an Ag / AgCl electrode or an Ag / Ag + electrode) are used. The phenylenediamine compound of the present invention is added to the reaction solution. After a constant voltage is applied to the carbon electrode and the current becomes steady, a sample containing glucose is added and the increase in current is measured. The glucose concentration in the sample can be calculated according to a calibration curve prepared with a standard concentration glucose solution. The applied potential can be, for example, + 800mV or less, + 700mV or less, + 600mV or less, + 500mV or less, + 400mV or less, + 300mV or less, + 200mV or less, + 100mV or less, + 50mV or less, -200mV or more -100 mV or more, -50 mV or more, for example 0 mV or more, for example +800 mV to -200 mV, +800 mV to -100 mV, +800 mV to -50 mV, +600 mV to 0 mV, +500 mV to 0 mV, +400 mV ˜0 mV, +300 mV to 0 mV, +200 mV to 0 mV (all with respect to the silver-silver chloride reference electrode). The pH of the measurement solution containing glucose can be in the range of pH 3-10. For example,
具体的な例としては、グラッシーカーボン(GC)電極に0.2U〜150U、例えば0.5U〜100UのGDH又はGODを固定化し、グルコース濃度に対する応答電流値を測定する。電解セル中に、100mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.0)10.0mlを添加する。GC電極をポテンショスタットBAS100B/W(BAS製）に接続し、37℃で溶液を撹拌し、銀塩化銀参照電極に対して+500mVを印加する。これらの系に1M D-グルコース溶液を終濃度が5、10、20、30、40、50mMになるよう添加し、添加ごとに定常状態の電流値を測定する。この電流値を既知のグルコース濃度（5、10、20、30、40、50mM）に対してプロットし、検量線を作成する。これよりGDH又はGOD酵素固定化電極でグルコースの定量が可能となる。 As a specific example, 0.2 U to 150 U, for example, 0.5 U to 100 U of GDH or GOD is immobilized on a glassy carbon (GC) electrode, and the response current value with respect to the glucose concentration is measured. In the electrolytic cell, add 10.0 ml of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0). Connect the GC electrode to potentiostat BAS100B / W (manufactured by BAS), stir the solution at 37 ° C., and apply +500 mV to the silver-silver chloride reference electrode. A 1M D-glucose solution is added to these systems to a final concentration of 5, 10, 20, 30, 40, 50 mM, and a steady-state current value is measured for each addition. This current value is plotted against a known glucose concentration (5, 10, 20, 30, 40, 50 mM) to create a calibration curve. Accordingly, glucose can be quantified with the GDH or GOD enzyme-immobilized electrode.
さらに電気化学測定のために印刷電極を用いることもできる。これにより測定に必要な溶液量を低減することができる。電極は絶縁基板上に形成しうる。具体的には、フォトリゾグラフィ技術や、スクリーン印刷、グラビア印刷、フレキソ印刷などの印刷技術により、電極を基板上に形成させ得る。絶縁基板の素材としては、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルなどが挙げられ、各種の溶媒や薬品に対する耐性の強いものを用いることができる。作用極の面積は、所望の応答電流に応じて設定することができる。例えばある実施形態では、作用極の面積を1mm2以上、1.5mm2以上、2mm2以上、2.5mm2以上、3mm2以上、4mm2以上、5mm2以上、6mm2以上、7mm2以上、8mm2以上、9mm2以上、10mm2以上、12mm2以上、15mm2以上、20mm2以上、30mm2以上、40mm2以上、50mm2以上、1cm2以上、2cm2以上、3cm2以上、4cm2以上、5cm2以上、例えば10cm2以上とすることができる。ある実施形態では、作用極の面積を10cm2以下、5cm2以下、例えば1cm2以下、とすることができる。対極も同様でありうる。 Furthermore, a printed electrode can also be used for electrochemical measurements. As a result, the amount of solution required for measurement can be reduced. The electrode can be formed on an insulating substrate. Specifically, the electrodes can be formed on the substrate by a photolithographic technique, a printing technique such as screen printing, gravure printing, or flexographic printing. Examples of the material for the insulating substrate include silicon, glass, ceramic, polyvinyl chloride, polyethylene, polypropylene, polyester, and the like, and those having strong resistance to various solvents and chemicals can be used. The area of the working electrode can be set according to a desired response current. For example, in one embodiment, the area of the working electrode is 1 mm 2 or more, 1.5 mm 2 or more, 2 mm 2 or more, 2.5 mm 2 or more, 3 mm 2 or more, 4 mm 2 or more, 5 mm 2 or more, 6 mm 2 or more, 7 mm 2 or more, 8 mm 2 or more, 9mm 2 or more, 10mm 2 or more, 12mm 2 or more, 15mm 2 or more, 20mm 2 or more, 30mm 2 or more, 40mm 2 or more, 50mm 2 or more, 1cm 2 or more, 2cm 2 or more, 3cm 2 or more, 4cm 2 or more , 5 cm 2 or more, for example, 10 cm 2 or more. In an embodiment, the area of the working electrode can be 10 cm 2 or less, 5 cm 2 or less, such as 1 cm 2 or less. The counter electrode can be similar.
（本発明の電池）
ある実施形態において本発明は、本発明のフェニレンジアミン系化合物、又は、フェニレンジアミン系化合物を含む電極改変剤を有する電池を提供する。ある実施形態において、本発明の電池では、本発明の化合物が当該電池の電極に固定化されている。ある実施形態において、本発明の電池は酸化還元酵素を有する。ある実施形態において酸化還元酵素は電池の有する電極に固定化されていてもよい。ある実施形態において本発明は、本発明の電池を用いる発電方法を提供する。
(Battery of the present invention)
In one embodiment, the present invention provides a battery having an electrode modifier comprising the phenylenediamine compound of the present invention or a phenylenediamine compound. In one embodiment, in the battery of the present invention, the compound of the present invention is immobilized on the electrode of the battery. In certain embodiments, the battery of the present invention has an oxidoreductase. In one embodiment, the oxidoreductase may be immobilized on the electrode of the battery. In one embodiment, the present invention provides a power generation method using the battery of the present invention.
（本発明の燃料電池）
ある実施形態において本発明は、本発明のフェニレンジアミン系化合物や、フェニレンジアミン系化合物を含む電極改変剤を有する燃料電池用のアノード又はカソード及び当該アノード又はカソードを備えた燃料電池を提供する。ある実施形態において本発明は、本発明のフェニレンジアミン系化合物や、フェニレンジアミン系化合物が吸着した電極を使用した発電方法やGDHやGODなどといった酸化還元酵素をアノード電極に固定化し、酸化還元酵素に対応した基質、例えばグルコースを燃料とする発電方法を提供する。適宜、上記に示した酸化還元酵素を固定化した場合に、固定化した酸化還元酵素の基質となる化合物を燃料とすることができる。
(Fuel cell of the present invention)
In one embodiment, the present invention provides an anode or cathode for a fuel cell having the phenylenediamine compound of the present invention or an electrode modifier containing the phenylenediamine compound, and a fuel cell comprising the anode or cathode. In an embodiment, the present invention provides a method for generating electricity using the phenylenediamine compound of the present invention or an electrode on which a phenylenediamine compound is adsorbed, or an oxidoreductase such as GDH or GOD, which is immobilized on the anode electrode. A power generation method using a corresponding substrate, for example, glucose as a fuel is provided. As appropriate, when the oxidoreductase shown above is immobilized, a compound that becomes a substrate of the immobilized oxidoreductase can be used as a fuel.
ある実施形態において、本発明の燃料電池は、本発明のフェニレンジアミン系化合物が吸着したアノード又はカソード、燃料槽、カソード、酸化還元酵素を有するアノード、及び電解質を備えている。また本発明の燃料電池は、必要に応じて、アノードとカソードとの間に負荷抵抗を配置することができ、そのための配線を備えうる。ある実施形態において負荷抵抗は、本発明の燃料電池の一部である。ある実施形態において、負荷抵抗は、本発明の燃料電池の一部ではなく、本発明の燃料電池は、適当な負荷抵抗に接続できるよう構成されている。本発明の燃料電池において酸化還元酵素はアノードの一部を構成する。例えば酸化還元酵素はアノードに近接若しくは接触していてもよく、固定化されていてもよく、又は吸着していてもよい。燃料槽は電極に固定化された酸化還元酵素の基質となる化合物を含む。例えば、グルコースデヒドロゲナーゼを電極に固定化した場合、燃料はグルコースであり得る。ある実施形態において本発明の燃料電池はアノードとカソードを分離するイオン交換膜を有し得る。イオン交換膜は1nm〜20nmの孔を有し得る。アノードは炭素電極のような一般的な電極であり得る。例えば、カーボンブラック、グラファイト、活性炭等の導電性炭素質からなる電極や、金、白金等の金属からなる電極を用いることができる。具体的には、カーボンペーパー、グラッシーカーボン、HOPG（高配向性熱分解グラファイト）等が挙げられる。対をなすカソードとしては、例えば、白金や白金合金等、燃料電池において一般的に用いられている電極触媒を、カーボンブラック、グラファイト、活性炭のような炭素質材料、又は金、白金等からなる導電体に担持させた電極や、白金や白金合金等の電極触媒そのものからなる導電体をカソード電極として用い、酸化剤（カソード側基質、酸素等）を電極触媒に供給するような形態とすることができる。 In one embodiment, the fuel cell of the present invention includes an anode or cathode to which the phenylenediamine compound of the present invention is adsorbed, a fuel tank, a cathode, an anode having an oxidoreductase, and an electrolyte. Moreover, the fuel cell of this invention can arrange | position load resistance between an anode and a cathode as needed, and can be equipped with the wiring for it. In some embodiments, the load resistance is part of the fuel cell of the present invention. In some embodiments, the load resistance is not part of the fuel cell of the present invention, and the fuel cell of the present invention is configured to connect to an appropriate load resistance. In the fuel cell of the present invention, the oxidoreductase constitutes a part of the anode. For example, the oxidoreductase may be close to or in contact with the anode, may be immobilized, or may be adsorbed. The fuel tank contains a compound serving as a substrate for the oxidoreductase immobilized on the electrode. For example, when glucose dehydrogenase is immobilized on an electrode, the fuel can be glucose. In certain embodiments, the fuel cell of the present invention may have an ion exchange membrane that separates the anode and cathode. The ion exchange membrane can have pores between 1 nm and 20 nm. The anode can be a common electrode such as a carbon electrode. For example, an electrode made of a conductive carbon such as carbon black, graphite, activated carbon, or an electrode made of a metal such as gold or platinum can be used. Specific examples include carbon paper, glassy carbon, and HOPG (highly oriented pyrolytic graphite). As a pair of cathodes, for example, an electrode catalyst generally used in a fuel cell such as platinum or a platinum alloy, a carbonaceous material such as carbon black, graphite, activated carbon, or a conductive material made of gold, platinum, or the like. An electrode carried on a body or a conductor made of an electrode catalyst such as platinum or a platinum alloy is used as a cathode electrode, and an oxidizing agent (cathode side substrate, oxygen, etc.) is supplied to the electrode catalyst. it can.
別の実施形態では、上記のような基質酸化型酵素電極からなるアノードと対をなすカソードとして、基質還元型酵素電極を使用しうる。酸化剤を還元する酸化還元酵素としては、ラッカーゼやビリルビンオキシターゼなど公知の酵素が挙げられる。酸化剤を還元する触媒として酸化還元酵素を用いる場合には、必要に応じて、公知の電子伝達メディエータを用いてもよい。カソード用メディエータはアノード用メディエータと同一でも異なってもよい。酸化剤としては、酸素、過酸化水素等が挙げられる。 In another embodiment, a substrate-reducing enzyme electrode can be used as the cathode paired with the anode comprising the substrate-oxidizing enzyme electrode as described above. Examples of the oxidoreductase that reduces the oxidizing agent include known enzymes such as laccase and bilirubin oxidase. When an oxidoreductase is used as a catalyst for reducing the oxidant, a known electron transfer mediator may be used as necessary. The cathode mediator may be the same as or different from the anode mediator. Examples of the oxidizing agent include oxygen and hydrogen peroxide.
ある実施形態において、カソードにおける電極反応を妨害する不純物（アスコルビン酸や尿酸等）による影響を回避するために、酸素選択性の膜（例えばジメチルポリシロキサンの膜）をカソード電極の周囲に配置することができる。 In some embodiments, an oxygen selective membrane (eg, dimethylpolysiloxane membrane) is placed around the cathode electrode to avoid the effects of impurities (such as ascorbic acid and uric acid) that interfere with the electrode reaction at the cathode. Can do.
本発明の発電方法は、酸化還元酵素を有するアノードに燃料となる酸化還元酵素の基質となる化合物を供給する工程を含む。酸化還元酵素を有するアノードに燃料が供給されると、基質が酸化され、同時に生成した電子を、酸化還元酵素は、該酸化酵素と電極との間の電子伝達を仲介する電子伝達メディエータ、例えばフェニレンジアミン系化合物へと受け渡し、該電子伝達メディエータによって導電性基材（アノード電極）へ電子が受け渡される。アノード電極から配線（外部回路）を通って電子がカソード電極に到達することで、電流が発生する。 The power generation method of the present invention includes a step of supplying a compound serving as a substrate of a redox enzyme serving as a fuel to an anode having a redox enzyme. When fuel is supplied to an anode having an oxidoreductase, the substrate is oxidized and simultaneously generated electrons are converted into electron transfer mediators such as phenylene, which are mediated by the oxidoreductase and the oxidase and the electrode. The electrons are transferred to the diamine compound, and electrons are transferred to the conductive substrate (anode electrode) by the electron transfer mediator. When electrons reach the cathode electrode through the wiring (external circuit) from the anode electrode, a current is generated.
上記過程において発生するプロトン(H+)は、電解質溶液内をカソード電極まで移動する。そして、カソード電極では、電解質溶液内をアノードから移動してきたプロトンと、外部回路を経てアノード側から移動してきた電子と、酸素や過酸化水素等の酸化剤（カソード側基質）とが反応して水が生成される。これを利用し発電を行うことができる。 Protons (H + ) generated in the above process move to the cathode electrode in the electrolyte solution. In the cathode electrode, protons that have moved from the anode through the electrolyte solution, electrons that have moved from the anode side through an external circuit, and an oxidizing agent (cathode side substrate) such as oxygen or hydrogen peroxide react. Water is produced. This can be used to generate electricity.
本発明のフェニレンジアミン系化合物を含む電極改変剤や、該電極改変剤が吸着した電極は、種々の電気化学的測定に用いることができる。また、該電極は、酸化還元酵素を固定化することで、酵素センサーに利用することができる。さらに本発明のフェニレンジアミン系化合物を含む電極改変剤や、該電極改変剤が吸着した電極は、燃料電池に用いることができる。これらは例示であり、本発明のフェニレンジアミン系化合物を含む電極改変剤又は該電極改変剤が吸着した電極の用途はこれに限らない。 The electrode modifier containing the phenylenediamine compound of the present invention and the electrode on which the electrode modifier is adsorbed can be used for various electrochemical measurements. The electrode can be used for an enzyme sensor by immobilizing an oxidoreductase. Furthermore, the electrode modifier containing the phenylenediamine compound of the present invention and the electrode on which the electrode modifier is adsorbed can be used in a fuel cell. These are merely examples, and the application of the electrode modifier containing the phenylenediamine compound of the present invention or the electrode to which the electrode modifier is adsorbed is not limited thereto.
以下の実施例により、本発明をさらに例証する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。 The following examples further illustrate the invention. However, the technical scope of the present invention is not limited by these examples.
実施例１．Mucor属由来GDH遺伝子の宿主への導入とGDH活性の確認
特許第4648993号に記載のMucor属由来GDH(MpGDH)のアミノ酸配列を配列番号１に、塩基配列を配列番号２に示す。MpGDHにN66Y/N68G/C88A/A175C/N214C/Q233R/T387C/G466D/E554D/L557V/S559Kの各変異を導入した改変GDH(MpGDH-M2)をコードする遺伝子を取得した。MpGDH-M2のアミノ酸配列は配列番号３に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号４に示す。プラスミドpUC19のマルチクローニングサイトに対象遺伝子であるMpGDH-M2遺伝子を常法により挿入させたDNAコンストラクトを作製した。具体的には、pUC19は、In-Fusion HD Cloning Kit（クロンテック社）に付属されているpUC19 linearized Vectorを用いた。pUC19のマルチクローニングサイトにあるIn-Fusion Cloning Siteにて、MpGDH-M1遺伝子を、上記したIn-Fusion HD Cloning Kitを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、コンストラクト用プラスミド(pUC19-MpGDH-M2)を得た。
Example 1. Introduction of Mucor gene-derived GDH gene into host and confirmation of GDH activity The amino acid sequence of Mucor gene-derived GDH (MpGDH) described in Japanese Patent No. 4468993 is shown in SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 2. A gene encoding modified GDH (MpGDH-M2) in which each mutation of N66Y / N68G / C88A / A175C / N214C / Q233R / T387C / G466D / E554D / L557V / S559K was introduced into MpGDH was obtained. The amino acid sequence of MpGDH-M2 is shown in SEQ ID NO: 3, and the base sequence of the gene is shown in SEQ ID NO: 4. A DNA construct was prepared by inserting the target gene MpGDH-M2 gene into the multicloning site of plasmid pUC19 by a conventional method. Specifically, pUC19 used was pUC19 linearized Vector attached to In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech). At the In-Fusion Cloning Site at the multi-cloning site of pUC19, the MpGDH-M1 gene was ligated using the In-Fusion HD Cloning Kit described above according to the protocol attached to the kit, and the plasmid for construction (pUC19 -MpGDH-M2) was obtained.
これらの遺伝子をコウジカビ（Aspergillus sojae；アスペルギルス・ソーヤ）で発現させ、そのGDH活性を評価した。 These genes were expressed in Aspergillus sojae and their GDH activity was evaluated.
具体的には、MpGDH-M2を取得することを目的として、GDH遺伝子を用いて、Double-joint PCR(Fungal Genetics and Biology,2004年，第41巻，p.973-981）を行い、5’アーム領域−pyrG遺伝子−TEF1プロモーター遺伝子−フラビン結合型GDH遺伝子−3’アーム領域から成るカセットを構築し、下記の手順でアスペルギルス・ソーヤNBRC4239株由来pyrG破壊株（pyrG遺伝子の上流48bp、コード領域896bp、下流240bp欠損株）の形質転換に用いた。なお、pyrG遺伝子はウラシル栄養要求性マーカーである。500ml容三角フラスコ中の20mMウリジンを含むポリペプトンデキストリン液体培地100mlに、アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株由来pyrG破壊株の分生子を接種し、30℃で約20時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び20μgの対象遺伝子挿入DNAコンストラクトを用いて、プロトプラストPEG法により形質転換を行い、次いで0.5%(w/v)寒天及び1.2Mソルビトールを含むCzapek-Dox最少培地（ディフコ社；pH6）を用いて、30℃、5日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。 Specifically, for the purpose of obtaining MpGDH-M2, double-joint PCR (Fungal Genetics and Biology, 2004, Vol. 41, p.973-981) was performed using the GDH gene, and 5 ' A cassette composed of arm region-pyrG gene-TEF1 promoter gene-flavin-binding GDH gene-3 'arm region was constructed, and the following procedure was followed by a pyrG-disrupted strain derived from Aspergillus soja NBRC4239 strain (48 bp upstream of the pyrG gene, coding region 896 bp , Downstream 240 bp deletion strain). The pyrG gene is a uracil auxotrophic marker. Inoculate a 100g polypeptone dextrin liquid medium containing 20mM uridine in a 500ml Erlenmeyer flask with conidia of the pyrG-disrupted strain derived from Aspergillus soja NBRC4239 strain, and after shaking culture at 30 ° C for about 20 hours, It was collected. Protoplasts were prepared from the collected cells. The obtained protoplast and 20 μg of the target gene-inserted DNA construct were used for transformation by protoplast PEG method, and then Czapek-Dox minimal medium (Difco; pH 6; containing 0.5% (w / v) agar and 1.2 M sorbitol. ) Was incubated at 30 ° C. for 5 days or longer to obtain transformed Aspergillus soya as having colony-forming ability.
得られた形質転換アスペルギルス・ソーヤは、ウリジン要求性を相補する遺伝子であるpyrGが導入されることにより、ウリジン無添加培地に生育できるようになることで、目的の遺伝子が導入された株として選択できた。得られた菌株の中から目的の形質転換体を、PCRで確認して選抜した。 The resulting transformed Aspergillus sojae is selected as a strain into which the target gene has been introduced by introducing pyrG, a gene that complements uridine requirement, so that it can grow in a uridine-free medium. did it. The target transformant was selected from the obtained strains after confirmation by PCR.
MpGDH変異体の遺伝子により形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤを用いて、それぞれのGDH生産を行った。 Each GDH was produced using transformed Aspergillus soya transformed with the gene of the MpGDH mutant.
200ml容三角フラスコ中のDPY液体培地(1%(w/v)ポリペプトン、2%(w/v)デキストリン、0.5%(w/v)酵母エキス、0.5%(w/v)KH2PO4、0.05%(w/v)MgSO4・7H20；pH未調整）40mlに、各菌株の分生子を接種し、30℃で4日間、160rpmで振とう培養を行った。次いで、培養後の培養物から菌体をろ過し、得られた培地上清画分をAmicon Ultra-15, 30K NMWL（ミリポア社製）で10mLまで濃縮し、150mM NaClを含む20mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.5)で平衡化したHiLoad 26/60 Superdex 200pg（GEヘルスケア社製）にアプライし、同緩衝液で溶出させ、GDH活性を示す画分を回収し、MpGDH-M2の精製標品を得た。なお、この酵素はそのFAD結合部位を介してFADと結合している状態のものである（ホロ酵素）。
DPY liquid medium (1% (w / v) polypeptone, 2% (w / v) dextrin, 0.5% (w / v) yeast extract, 0.5% (w / v) KH 2 PO4, 0.05 in 0.05
実施例２．フェニレンジアミン系化合物と炭素電極との吸着性確認
３種のフェニレンジアミン系化合物（N-イソプロピル-N'-フェニル-p-フェニレンジアミン（IPPD、東京化成工業社製、製品コードP0327）、N,N'-ジフェニル-p-フェニレンジアミン（DPPD、東京化成工業社製、製品コードD0609）、N-(1,3-ジメチルブチル）-N'-フェニル-p-フェニレンジアミン(6PPD、東京化成工業社製、製品コードD3331)を用いて、印刷電極によるサイクリックボルタンメトリー（CV）を行った。具体的には、カーボンの作用電極(12.6mm2)、銀の参照電極が印刷されてなる、SCREEN-PRINTED ELECTRODES(DropSens社製、製品番号DRP-C110)上に、終濃度10μg/mlのIPPD 10%エタノール水溶液を3μl塗布し、室温で乾燥させた。その後電極を純水で洗浄し、専用コネクター（DropSens社製、DRP-CAC)を用いて、ALS 電気化学アナライザー 814D（BAS社製）に接続した。印刷電極を作用極とし、銀塩化銀電極（BAS社製）を参照極、白金電極（BAS社製）を対極として、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)10mL中に浸漬させた。この溶液を650rpmで撹拌させながら、-200mVから+400mV(vs.Ag/AgCl)の範囲で電圧を掃引したサイクリックボルタンメトリーを行った。掃引速度を10mV/secから50mV/secの範囲で変化させ、酸化電流の最大値(IOmax)および還元電流の最大値(IRmax)がどのように変化するか調べた。一般的に、メディエータが電極に吸着している場合、サイクリックボルタンメトリーの掃引速度とIOmaxおよびIRmaxの値は比例関係になることが知られている。メディエータが拡散している場合は、掃引速度の0.5乗にIOmaxおよびIRmaxが比例する。
Example 2 Adsorption confirmation of phenylenediamine compound and carbon electrode Three phenylenediamine compounds (N-isopropyl-N'-phenyl-p-phenylenediamine (IPPD, manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., product code P0327), N, N '-Diphenyl-p-phenylenediamine (DPPD, manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., product code D0609), N- (1,3-dimethylbutyl) -N'-phenyl-p-phenylenediamine (6PPD, manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) The product code D3331) was used for cyclic voltammetry (CV) with printed electrodes, specifically, a carbon working electrode (12.6mm 2 ) and a silver reference electrode printed on it, SCREEN-PRINTED On ELECTRODES (DropSens, product number DRP-C110), 3 μl of
IPPDを用いたサイクリックボルタンメトリーを実施し、掃引速度とIOmaxおよびIRmaxをプロットした結果を図１に示す。その結果、掃引速度とIOmaxおよびIRmaxが比例関係にあることが確認され、IPPDがカーボン電極に吸着することが示された。 FIG. 1 shows the results of cyclic voltammetry using IPPD and plotting the sweep rate and I Omax and I Rmax . As a result, it was confirmed that the sweep rate and I Omax and I Rmax were in a proportional relationship, and it was shown that IPPD was adsorbed on the carbon electrode.
IPPDの代わりにDPPD、6PPDを用いて同様の試験を行った結果を図２、図３に示す。いずれの化合物においても掃引速度とIOmaxおよびIRmaxが比例関係にあることが確かめられ、IPPDと同様、カーボン電極に吸着することが示された。 The results of similar tests using DPPD and 6PPD instead of IPPD are shown in FIGS. In any compound, it was confirmed that the sweep rate and I Omax and I Rmax were in a proportional relationship, and it was shown to be adsorbed on the carbon electrode as in the case of IPPD.
比較例（ｐ−フェニレンジアミン）
なお、本発明のジフェニルアミン系化合物の代わりに、メディエータとして機能することが既に知られているｐ−フェニレンジアミンを用いて同様の測定を実施すると、酸化波、還元波のいずれも観測されない。水による電極の洗浄、あるいはリン酸カリウム緩衝液への浸漬により、ｐ−フェニレンジアミンが電極から剥離したためと考えられる。
Comparative example (p-phenylenediamine)
In addition, when the same measurement is carried out using p-phenylenediamine already known to function as a mediator instead of the diphenylamine compound of the present invention, neither an oxidation wave nor a reduction wave is observed. This is probably because p-phenylenediamine was peeled off from the electrode by washing the electrode with water or dipping in a potassium phosphate buffer.
終濃度100μg/mlのp-フェニレンジアミン10%エタノール溶液10μl、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)10μlを上記の印刷電極に載せ、-200mVから+400mV(vs.Ag/Ag+)の範囲で電圧を掃引したサイクリックボルタンメトリーを行ったところ、図４および５に示すようにIOmaxおよびIRmaxが掃引速度の０．５乗に比例することが確認された。これは、ｐ−フェニレンジアミンが電極に吸着せず、拡散していることを示している。
実施例３．フェニレンジアミン系化合物を用いた電気化学的評価
FAD依存性GDHと3種のフェニレンジアミン系化合物（IPPD、DPPD、6PPD）を用いて、印刷電極を用いたサイクリックボルタンメトリーを行った。具体的には、カーボンの作用電極(12.6mm2)、銀塩化銀の参照電極が印刷されてなる、SCREEN-PRINTED ELECTRODES(DropSens社製、製品番号DRP-110)を、専用コネクター(DropSens社製、DRP-CAC)を用いて、ALS 電気化学アナライザー 814D（BAS社製）に接続し、2000U/mlのGlucose Dehydrogenase(FAD-dependent)(BBI社製、Product Code:GLD3、以下GLD3と表記する）溶液5μl、1.5Mの塩化カリウムを含有した50mMのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)20μl、フェニレンジアミン系化合物の10%エタノール水溶液25μlを電極上に載せた。化合物の終濃度は、IPPDは2.5μＭ、DPPDおよび6PPDは0.5μＭとした。そして、-200mVから400mV(vs. Ag/AgCl)の範囲で電圧を掃引したサイクリックボルタンメトリーを行った。掃引速度は30mV/secとした。続いて、種々の終濃度になるようにグルコース溶液を添加し、同様にサイクリックボルタンメトリーを行った。また対照実験として、フェニレンジアミン系化合物を含まない条件で、上記と同様にサイクリックボルタンメトリーを行った。
Example 3 FIG. Electrochemical evaluation using phenylenediamine compounds
Cyclic voltammetry using printed electrodes was performed using FAD-dependent GDH and three phenylenediamine compounds (IPPD, DPPD, 6PPD). Specifically, the SCREEN-PRINTED ELECTRODES (manufactured by DropSens, product number DRP-110) on which a carbon working electrode (12.6 mm 2 ) and a silver / silver chloride reference electrode are printed are connected to a dedicated connector (manufactured by DropSens , DRP-CAC), connected to ALS Electrochemical Analyzer 814D (BAS), 2000U / ml Glucose Dehydrogenase (FAD-dependent) (BBI, Product Code: GLD3, hereinafter referred to as GLD3) 5 μl of the solution, 20 μl of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 1.5 M potassium chloride, and 25 μl of a 10% aqueous ethanol solution of a phenylenediamine compound were placed on the electrode. The final compound concentration was 2.5 μM for IPPD and 0.5 μM for DPPD and 6PPD. Then, cyclic voltammetry was performed by sweeping the voltage in the range of −200 mV to 400 mV (vs. Ag / AgCl). The sweep speed was 30 mV / sec. Subsequently, glucose solutions were added so as to have various final concentrations, and cyclic voltammetry was similarly performed. In addition, as a control experiment, cyclic voltammetry was performed in the same manner as described above under a condition not containing a phenylenediamine compound.
フェニレンジアミン系化合物としてIPPDを用いた際のサイクリックボルタモグラムを図６に示す。また、IPPD、DPPD、6PPDを用いた際の、グルコース終濃度と300mVにおける酸化電流値の関係をプロットしたものを図７、８、９に示す。IPPD、DPPD、6PPDのいずれの化合物を用いた場合でも、グルコースに対する応答電流が観測される。一方で、これらの化合物を含まない場合は応答電流が観測されなかったことから、IPPD、DPPD、6PPDはいずれもメディエータとして機能していることが示された。したがって、アノード電極としても利用できることが示された。 A cyclic voltammogram when IPPD is used as the phenylenediamine compound is shown in FIG. 7, 8, and 9 are plots of the relationship between the final glucose concentration and the oxidation current value at 300 mV when IPPD, DPPD, and 6PPD are used. Even when any compound of IPPD, DPPD, and 6PPD is used, a response current to glucose is observed. On the other hand, when these compounds were not included, no response current was observed, indicating that IPPD, DPPD, and 6PPD all functioned as mediators. Therefore, it was shown that it can also be used as an anode electrode.
続いて上記と同様に、FADGDH-AA（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号60100）またはGlucose Dehydrogenase(FAD-dependent)(BBI社製、Product Code:GLD1、以下GLD1と表記する）とIPPDを混合し、-200mVから+400mV(vs. Ag/AgCl)の範囲で電圧を掃引したサイクリックボルタンメトリーを行った。ただしIPPD終濃度は、FADGDH-AAとの組み合わせでは5μM、GLD1との組み合わせでは2.5μMとした。結果を図１０、１１に示す。IPPD添加時のみグルコースに対する応答電流が観測されたことから、IPPDがメディエータとして機能していることが分かった。したがって、アノード電極としても利用できることが示された。 Subsequently, as described above, FAPDDH-AA (Kikkoman Biochemifa, product number 60100) or Glucose Dehydrogenase (FAD-dependent) (BBI, Product Code: GLD1, hereinafter referred to as GLD1) and IPPD are mixed. The cyclic voltammetry was performed by sweeping the voltage in the range of −200 mV to +400 mV (vs. Ag / AgCl). However, the final IPPD concentration was 5 μM in combination with FADGDH-AA and 2.5 μM in combination with GLD1. The results are shown in FIGS. The response current to glucose was observed only when IPPD was added, indicating that IPPD functions as a mediator. Therefore, it was shown that it can also be used as an anode electrode.
続いて、GOD from A.niger Type X-S（Sigma-Aldrich社製、製品番号G7141、以下ＧＯＤと表記する）とIPPDを混合し、上記と同様にサイクリックボルタンメトリーを行った。結果を図１２に示す。IPPD添加時のみグルコースに対する応答電流が観測されたことから、IPPDがメディエータとして機能していることが分かった。したがって、アノード電極としても利用できることが示された。 Subsequently, GOD from A. niger Type XS (manufactured by Sigma-Aldrich, product number G7141, hereinafter referred to as GOD) and IPPD were mixed, and cyclic voltammetry was performed as described above. The results are shown in FIG. The response current to glucose was observed only when IPPD was added, indicating that IPPD functions as a mediator. Therefore, it was shown that it can also be used as an anode electrode.
実施例４．その他の酸化還元酵素について
続いて、Fructosyl-peptide Oxidase (FPOX-CE)（キッコーマンバイオケミファ社製、製品番号60123、以下FPOX-CEと表記する）とIPPDを用いて、印刷電極によるクロノアンペロメトリーを行った。具体的には、0.79U/mlのFPOX-CE溶液5μｌ、3Mの塩化ナトリウムを含有した100mMのリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)35μｌ、10ng/μlのIPPDの10%エタノール溶液5μｌを電極上に載せた。さらに、9mMのフルクトシルグリシン溶液を1μlずつ添加した。そして、+250mV(vs. Ag/AgCl)を印加し、120秒間の応答電流値変化を観測した。
Example 4 Other oxidoreductases Subsequently, chronoamperometry using printed electrodes using Fructosyl-peptide Oxidase (FPOX-CE) (manufactured by Kikkoman Biochemifa, product number 60123, hereinafter referred to as FPOX-CE) and IPPD Went. Specifically, 5 μl of 0.79 U / ml FPOX-CE solution, 35 μl of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) containing 3 M sodium chloride, and 5 μl of 10% ethanol solution of 10 ng / μl IPPD were used as electrodes. I put it on top. Further, 1 μl of 9 mM fructosylglycine solution was added. Then, +250 mV (vs. Ag / AgCl) was applied, and the response current value change for 120 seconds was observed.
印加後から10秒後の値を記録したところ、図１３に示すように、フルクトシルグリシンの濃度が増加するにつれて応答電流値が増加することがわかった。したがって、IPPDはFPOX-CEに対してもメディエータとして機能していることが示された。したがって、アノード電極としても利用できることが示された。
When the
実施例５．フェニレンジアミン系化合物・GDH固定化センサーを用いたグルコース測定
SCREEN-PRINTED ELECTRODES(DropSens社製、製品番号DRP-C110)上に、５％ポリエチレンイミン（平均分子量10000）を3μl塗布し、室温乾燥させた。引き続き、IPPD（10%エタノール溶解）を３μｌ、GDH-M2を30U分も塗布し、室温乾燥させた。最後に、2.5mg/dlのポリエチレングルコールジグリシジルエーテル（平均分子量500）を１μｌ塗布し、4℃で一晩静置した。得られた電極を純粋で洗浄し、IPPD・GDH固定化電極とした。次に、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7)中にIPPD・GDH固定化電極とAg/AgCl参照極、白金対極を浸漬させ、CV測定を行った。掃印速度は10mV/secとした。2Mグルコースを適宜添加し、各グルコース濃度における+200mVにおける酸化電流値を算出した。その結果を図１４に示す。グルコース濃度が増加するにつれて、応答電流値も増加することが分かった。したがって、濃度が既知のグルコースを測定し、検量線を作成することでグルコース濃度を定量することができるといえる。また、アノード電極としても利用できることが示された。
On SCREEN-PRINTED ELECTRODES (DropSens, product number DRP-C110), 3 μl of 5% polyethyleneimine (average molecular weight 10000) was applied and dried at room temperature. Subsequently, 3 μl of IPPD (dissolved in 10% ethanol) and 30 U of GDH-M2 were applied and dried at room temperature. Finally, 1 μl of 2.5 mg / dl polyethylene glycol diglycidyl ether (average molecular weight 500) was applied and allowed to stand at 4 ° C. overnight. The obtained electrode was pure and washed to obtain an IPPD / GDH fixed electrode. Next, the IPPD / GDH fixed electrode, the Ag / AgCl reference electrode, and the platinum counter electrode were immersed in a 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7), and CV measurement was performed. The sweep rate was 10 mV / sec. 2M glucose was added as appropriate, and the oxidation current value at +200 mV at each glucose concentration was calculated. The result is shown in FIG. It was found that the response current value increased as the glucose concentration increased. Therefore, it can be said that the glucose concentration can be quantified by measuring glucose having a known concentration and creating a calibration curve. It was also shown that it can be used as an anode electrode.
実施例６ 炭素以外の電極素材を用いた際の吸着確認試験
IPPDとGDH-M2を含むpH7のリン酸緩衝液中に金電極(BAS社製、Cat No. 002421)、Ag/AgCl参照極、白金対極を浸漬させ、CV測定を行った。掃印速度を10〜100mV/secとし、掃印速度とIOmaxおよびIRmaxをプロットした。その結果、掃引速度とIOmaxおよびIRmaxが比例関係にあることが確認され、IPPDが金電極に吸着することが示された。
同様に、金電極の代わりに白金電極(BAS社製、Cat No. 002422)を用いた際にも、掃引速度とIOmaxおよびIRmaxが比例関係にあることが確認され、IPPDが白金電極に吸着することが示された。
Example 6 Adsorption confirmation test when using electrode materials other than carbon
A gold electrode (manufactured by BAS, Cat No. 002421), an Ag / AgCl reference electrode, and a platinum counter electrode were immersed in a
Similarly, when a platinum electrode (Catalog No. 002422) was used instead of the gold electrode, it was confirmed that the sweep speed and I Omax and I Rmax were in a proportional relationship, and IPPD was applied to the platinum electrode. Adsorption was shown.
実施例７．燃料電池の構築
精製GDHをカーボン電極にグルタルアルデヒドによる架橋固定化することでアノード電極を作製する。その際、IPPD（10%エタノール溶液）をアノードに接触させ、IPPDを電極に吸着させる。場合により接触後、アノードを室温乾燥させる。また、ビリルビンオキシダーゼ（BOD、天野エンザイム社製）を多孔質カーボン電極に固定化することでカソード電極を作製する。アノード電極とカソード電極との間に固体高分子電解質膜としてナフィオン膜を挟んだ、バイオ電池を構築する。また、アノード電極とカソード電極を結ぶ配線の間に、一定の負荷抵抗と電圧計をそれぞれ直列と並列に挿入する。アノード側には、１Ｍ リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)、400mM D-グルコースを含む電解質溶液を入れ、グルコースを供給し、３０℃，ｐＨ７の条件で作動させ、電流が流れるようにする。
Example 7 Construction of a fuel cell An anode electrode is fabricated by immobilizing purified GDH on a carbon electrode by crosslinking with glutaraldehyde. At that time, IPPD (10% ethanol solution) is brought into contact with the anode, and IPPD is adsorbed on the electrode. Optionally, after contact, the anode is dried at room temperature. In addition, a cathode electrode is prepared by immobilizing bilirubin oxidase (BOD, Amano Enzyme) on a porous carbon electrode. A biobattery is constructed in which a Nafion membrane is sandwiched as a solid polymer electrolyte membrane between an anode electrode and a cathode electrode. In addition, a constant load resistance and a voltmeter are respectively inserted in series and in parallel between the wirings connecting the anode electrode and the cathode electrode. On the anode side, an electrolyte solution containing 1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) and 400 mM D-glucose is added, glucose is supplied, and the operation is performed at 30 ° C. and
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明の燃料電池について以下のように考察される。すなわち、実施例３において本発明の化合物を吸着させた電極を用いてグルコースが定量できた。したがって例えば酸素を用いる燃料電池であれば、燃料槽にメディエータを添加せずに簡便な設計で電気を流すことを可能とすることが期待される。これは種々の用途において有利となる。 While not wishing to be bound by any particular theory, the fuel cell of the present invention is considered as follows. That is, glucose could be quantified using the electrode to which the compound of the present invention was adsorbed in Example 3. Therefore, for example, in the case of a fuel cell using oxygen, it is expected to allow electricity to flow with a simple design without adding a mediator to the fuel tank. This is advantageous in various applications.
本発明のフェニレンジアミン系化合物を含む電極改変剤又は該電極改変剤が吸着した電極を用いることにより、電池等の各種の電気化学的測定を行うことができる。 By using an electrode modifier containing the phenylenediamine compound of the present invention or an electrode on which the electrode modifier is adsorbed, various electrochemical measurements of batteries and the like can be performed.
本明細書で言及又は引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。 All publications, patents and patent applications mentioned or cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.
配列の簡単な説明
配列番号１ Mucor prainii由来GDH（aa）
配列番号２ Mucor prainii由来GDH（DNA）
配列番号３ MpGDH-M2（aa）
配列番号４ MpGDH-M2（DNA）
BRIEF DESCRIPTION OF THE SEQUENCES SEQ ID NO: 1 Mucor prainii-derived GDH (aa)
SEQ ID NO: 2 Mucor prainii-derived GDH (DNA)
SEQ ID NO: 3 MpGDH-M2 (aa)
SEQ ID NO: 4 MpGDH-M2 (DNA)
Claims (10)
R1、R2及びR7は、それぞれ独立に、水素、場合により1以上のXにより置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖のC1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C3-9シクロアルキル、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、アントラセニル又はフェナントレニル、であり、
R3、R4、R5及びR6は、それぞれ独立に、水素、場合により1以上のYにより置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖のC1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C1-6アルコキシ、ハロ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、スルホン又はアミノであり、
R8は、場合により１以上のXにより置換されてもよい、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、アントラセニル及びフェナントレニル、からなる群より選択され、
ここでXは水素、場合によりハロ、アミノ、シアノ、カルボキシ、カルボニル、アルコキシ及びスルホンからなる群より選択される置換基により置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖の、C1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C1-6アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルホン又はアミノであり、
Yはハロ、アミノ、シアノ、カルボキシ、カルボニル、アルコキシ及びスルホンからなる群より選択される］。 A composition comprising an oxidoreductase and a compound having the structure of formula I
R 1 , R 2 and R 7 are each independently hydrogen, optionally substituted by one or more X, linear or branched C 1-6 alkyl, C 1-6 alkenyl, C 1 -6 alkynyl, C 3-9 cycloalkyl, phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, anthracenyl or phenanthrenyl,
R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are each independently hydrogen, optionally substituted by one or more Y, straight or branched C 1-6 alkyl, C 1-6 alkenyl. C 1-6 alkynyl, C 1-6 alkoxy, halo, nitro, cyano, carboxy, sulfone or amino;
R 8 is selected from the group consisting of phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, anthracenyl and phenanthrenyl, optionally substituted by one or more X;
Where X is hydrogen, optionally halo, amino, cyano, carboxy, carbonyl, alkoxy and sulfone, optionally substituted by a substituent selected from the group consisting of linear or branched C 1-6 alkyl C 1-6 alkenyl, C 1-6 alkynyl, C 1-6 alkoxy, halo, hydroxy, nitro, carboxy, cyano, sulfone or amino;
Y is selected from the group consisting of halo, amino, cyano, carboxy, carbonyl, alkoxy and sulfone.
R1、R2及びR7は、それぞれ独立に、水素、場合により1以上のXにより置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖のC1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C3-9シクロアルキル、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、アントラセニル又はフェナントレニル、であり、
R3、R4、R5及びR6は、それぞれ独立に、水素、場合により1以上のYにより置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖のC1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C1-6アルコキシ、ハロ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、スルホン又はアミノであり、
R8は、場合により１以上のXにより置換されてもよい、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、アントラセニル及びフェナントレニル、からなる群より選択され、
ここでXは水素、場合によりハロ、アミノ、シアノ、カルボキシ、カルボニル、アルコキシ及びスルホンからなる群より選択される置換基により置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖の、C1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C1-6アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルホン又はアミノであり、
Yはハロ、アミノ、シアノ、カルボキシ、カルボニル、アルコキシ及びスルホンからなる群より選択される］。 An electrode comprising an oxidoreductase and a compound having the structure of formula I
R 1 , R 2 and R 7 are each independently hydrogen, optionally substituted by one or more X, linear or branched C 1-6 alkyl, C 1-6 alkenyl, C 1 -6 alkynyl, C 3-9 cycloalkyl, phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, anthracenyl or phenanthrenyl,
R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are each independently hydrogen, optionally substituted by one or more Y, straight or branched C 1-6 alkyl, C 1-6 alkenyl. C 1-6 alkynyl, C 1-6 alkoxy, halo, nitro, cyano, carboxy, sulfone or amino;
R 8 is selected from the group consisting of phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, anthracenyl and phenanthrenyl, optionally substituted by one or more X;
Where X is hydrogen, optionally halo, amino, cyano, carboxy, carbonyl, alkoxy and sulfone, optionally substituted by a substituent selected from the group consisting of linear or branched C 1-6 alkyl C 1-6 alkenyl, C 1-6 alkynyl, C 1-6 alkoxy, halo, hydroxy, nitro, carboxy, cyano, sulfone or amino;
Y is selected from the group consisting of halo, amino, cyano, carboxy, carbonyl, alkoxy and sulfone.
R1、R2及びR7は、それぞれ独立に、水素、場合により1以上のXにより置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖のC1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C3-9シクロアルキル、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、アントラセニル又はフェナントレニル、であり、
R3、R4、R5及びR6は、それぞれ独立に、水素、場合により1以上のYにより置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖のC1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C1-6アルコキシ、ハロ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、スルホン又はアミノであり、
R8は、場合により１以上のXにより置換されてもよい、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、アントラセニル及びフェナントレニル、からなる群より選択され、
ここでXは水素、場合によりハロ、アミノ、シアノ、カルボキシ、カルボニル、アルコキシ及びスルホンからなる群より選択される置換基により置換されてもよい、直鎖又は分枝鎖の、C1-6アルキル、C1-6アルケニル、C1-6アルキニル、C1-6アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、カルボキシ、シアノ、スルホン又はアミノであり、
Yはハロ、アミノ、シアノ、カルボキシ、カルボニル、アルコキシ及びスルホンからなる群より選択される］。 Electron transfer promoter having a chemical structure represented by Formula I
R 1 , R 2 and R 7 are each independently hydrogen, optionally substituted by one or more X, linear or branched C 1-6 alkyl, C 1-6 alkenyl, C 1 -6 alkynyl, C 3-9 cycloalkyl, phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, anthracenyl or phenanthrenyl,
R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are each independently hydrogen, optionally substituted by one or more Y, straight or branched C 1-6 alkyl, C 1-6 alkenyl. C 1-6 alkynyl, C 1-6 alkoxy, halo, nitro, cyano, carboxy, sulfone or amino;
R 8 is selected from the group consisting of phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, anthracenyl and phenanthrenyl, optionally substituted by one or more X;
Where X is hydrogen, optionally halo, amino, cyano, carboxy, carbonyl, alkoxy and sulfone, optionally substituted by a substituent selected from the group consisting of linear or branched C 1-6 alkyl C 1-6 alkenyl, C 1-6 alkynyl, C 1-6 alkoxy, halo, hydroxy, nitro, carboxy, cyano, sulfone or amino;
Y is selected from the group consisting of halo, amino, cyano, carboxy, carbonyl, alkoxy and sulfone.
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