JP2019167342A

JP2019167342A - ドラスタチン１０の誘導体及びその応用

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Publication number: JP2019167342A
Application number: JP2019077466A
Authority: JP
Inventors: ニャンヘハン; Nianhe Han; デチャンアン; Deqiang An; ペンズ; Peng Zhu; チェンギュホー; Chengyu Hou; ハンヤン; Jang Han; リジャン; Zhang Li; ヤン　チュン; Chun Yang; チュンヤン
Original assignee: Newbio Therapeutics Inc
Current assignee: Newbio Therapeutics Inc
Priority date: 2015-05-29
Filing date: 2019-04-16
Publication date: 2019-10-03
Anticipated expiration: 2036-05-17
Also published as: US10351593B2; US20180141973A1; CN106279352B; WO2016192527A1; CN106279352A; JP2018516977A; JP6743236B2; EP3303366A1; EP3303366B1; EP3303366A4

Abstract

【課題】ドラスタチン１０の誘導体及びその医薬等への利用方法の提供。【解決手段】下記式ＩＩＩで表される化合物、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその塩の溶媒和物。（Ｒ１〜Ｒ１５は特定の構造を有する基、ｍ、ｎはそれぞれ２〜４の範囲から選ばれる整数、ｐは１〜８の範囲から選ばれる整数）【選択図】なし

Description

本発明は、ドラスタチン１０（Dolastatin 10）の誘導体類細胞毒性薬の設計合成、及
び抗体薬物複合体（Antibody-drug Conjugates, ADCs）における応用に関する。

近年、新規な標的治療薬として、抗体薬物複合体（ADC）が急速に発展し、アメリカ食
品医薬品局（FDA）によって3種類のADC薬物（Mylotarg、Adcetris、及びKadcyla）が承認されて上場し、また、他の30以上のADC薬物が臨床試験段階に入っている。

抗体薬物複合物は、一般的に、抗体又は抗体類リガンド、高活性細胞毒性薬、及びリガンドと細胞毒性薬を接合するリンカーの三つの部分からなる。その作用メカニズムは下記のようである。つまり、抗体又は抗体類リガンドが特異的に細胞表面の抗体を認識しそれと結合する；形成された複合体は、エンドサイトーシスで細胞内に入った同時に、高活性細胞毒性薬も持って入る；抗体の酵素分解又はリンカー自体の切断により、高活性細胞毒性薬が適切な活性成分の形態で放出されて、標的細胞を殺す。

抗体薬物複合体が採用した細胞毒性薬の活性は非常に高く、一般的に現在で臨床応用している化学療法剤の活性より10〜1000倍以上高い。抗体薬物複合体に用いられる細胞毒性薬は主にチューブリン及びDNA標的に作用する。チューブリンに作用する細胞毒性薬は細
胞の有糸分裂を抑制して細胞アポトーシスを招く、この種類の細胞毒性薬は主にマイタンシノイド類（Maytansinoids、EP 0425235； US 5208020、5416064； 7276497、7473796、7851432； US 2007/0269447、 2011/0158991； WO 2004/103272、2012/061590)及びオー
リスタチン類(Auristatins, ドラスタチン１０の誘導体、US 6884869、7498298)を含む。DNAに作用する細胞毒性薬はDNA合成の抑制、DNA小溝結合アルキル化及び切断などのメカ
ニズムにより細胞のアポトーシスを招き、主にドキソルビシン類 (Doxorubicins、Bioconjugate Chem. 2002、13、855-869)、カリケアミシン類 (Calicheamicins、US 5606040、5770710)、デュオカルマイシン類抗生物質類(Duocarmycins及びCC-1065類、US 7129261)、及びピロロベンゾジアゼピンダイマー類 (PBD dimers、WO 2005/040170)などを含む。

現在、上場され、臨床試験段階にある抗体薬物複合体において、約70〜80％は、オーリスタチン類及びマイタンシノイド類の高活性細胞毒性薬が弾頭として選択されている。マイタンシノイド類薬物の主な原料は、アンサマイトシン（Ansamitocin P-3）であり、細
菌発酵によって生成され、菌株及び発酵生産条件に対する要求が高い。オーリスタチン類薬物は、全部合成する方法により製造することができるため、大規模生産及び普及に適している。

オーリスタチン類の代表的な薬物は、モノメチルオーリスタチンE(MMAE、US6884869)及びモノメチルオーリスタチンF(MMAF、US7498298)であり、両者ともドラスタチン１０化合物に基づいて構造の修飾により得られたペンタペプチド系誘導体であり、後者は、海洋生物である海兎体内から抽出した高活性細胞毒性を有する化合物である。上記の広幅く使用されているMMAE、MMAFの以外に、ドラスタチン１０の構造に対して行った他の修飾も報告されている。WO2006/132670には、N末端でアミノ安息香酸でバリンを取り替えた誘導体が開示されている。WO2007/008603、WO2007/008848、US2013/0123456及びWO2013/173393に
は、C末端のフェニルアラニン(phenylalanine)の側鎖に対して修飾を行った一連の誘導体が開示されている。WO2011/154359及びWO2012/041805には、MMAF化合物のN末端及びC末端に対して構造の修飾を行った一連の誘導体が開示されている。

細胞毒性薬の高活性の要求のため、現在抗体複合薬物の分野における候補細胞毒性薬分子の種類と数量が比較的に少なくて、抗体複合薬物の発展をある程度制限している。従って、本分野では高活性を有する細胞毒性薬を更に多く提供することが切望されている。既存の細胞毒性薬に基づいて、新規な細胞毒性薬を開発することは、非常に重要な意義と応用見込みを持っている。

本発明の目的は、新規なドラスタチン１０(Dolastatin 10) 誘導体類細胞毒性薬及びその抗体薬物複合体における応用を提供することである。

本発明の第１の方面において、式Iで表される化合物を提供する。

ただし、R₁、R₂はH、-C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれ、又はR₁、R₂は連結されて環を形成し、-(CR₁₄R₁₅)n-Z-(CR₁₆R₁₇)m-構造を有し、ただし、R₁₄、R₁₅、R₁₆及びR₁₇
はH、-C₁-C₈アルキルからなる群より選ばれ；ZはO、NR₁₈、CR₁₉R₂₀からなる群より選ばれ、ただし、R₁₈、R₁₉、R₂₀はH、-C₁-C₈アルキルからなる群より選ばれ；n、mはぞれぞれ0〜8の範囲から選ばれる整数であり、0、1、2、3、4、5、6、7及び8を含む；
R₃、R₄、R₆はH、-C₁〜C₈アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基からなる群より選ばれる；
R₅、R₉、R₁₀、R₁₁はH、-C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれる；
R₇、R₈はH、-OH、-C₁-C₈アルキル、又は-O-(C₁-C₈アルキル)からなる群より選ばれる；
R₁₂, R₁₃はH、-C₁-C₈アルキル、-OR₂₁、-R₂₂Xからなる群より選ばれ、又はR₁₂、R₁₃が
連結されて環を形成し、-(CR₂₃R₂₄)_p-W-(CR₂₅R₂₆)_q-構造を有し、ただし、WはO、NR₂₇、CR₂₈R₂₉からなる群より選ばれ；Xは-OH、-NR₃₀R₃₁からなる群より選ばれ；p、qはそれぞれ0〜8の範囲から選ばれる整数であり、0、1、2、3、4、5、6、7及び8を含む；
R₂₁はH、-C₁-C₈アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基からなる群より選ばれる；
R₂₂はアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、-(CH₂CH₂O)_r-(CH₂)_s-、又はこれらの任意の組み合わせからなる群より選ばれる；
r、sはそれぞれ0〜8の範囲から選ばれる整数であり、0、1、2、3、4、5、6、7及び8を
含む；
R₂₃、R₂₄、R₂₅、R₂₆、R₂₇、R₂₈、R₂₉及びR₃₀は、H、-C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれる；
R₃₁はH、-C₁〜C₈アルキル、-OR₃₂からなる群より選ばれ、ただし、R₃₂はH、-C₁〜C₈ア
ルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基からなる群より選ばれる。

他の好ましい例において、式IIで表される化合物を提供する。

ただし：
R₁、R₂はH、-C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれ、又はR₁、R₂は連結されて環を形成し、-(CR₁₄R₁₅)_n-Z-(CR₁₆R₁₇)_m-構造を有し、ただし、R₁₄、R₁₅、R₁₆及びR₁₇はH、-C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれ；ZはO、NR₁₈、CR₁₉R₂₀からなる群より選ばれ、ただし、R₁₈、R₁₉、R₂₀はH、-C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれ；n、mはぞれぞれ0〜8の範囲
から選ばれる整数であり、0、1、2、3、4、5、6、7及び8を含む。

R₁₂, R₁₃はH、-C₁〜C₈アルキル、-OR₂₁、-R₂₂Xからなる群より選ばれ、又はR₁₂、R₁₃が連結されて環を形成し、-(CR₂₃R₂₄)_p-W-(CR₂₅R₂₆)_q-構造を有し、ただし、WはO、NR₂₇、CR₂₈R₂₉からなる群より選ばれ；Xは-OH、-NR₃₀R₃₁からなる群より選ばれ；p、qはそれぞれ0〜8の範囲から選ばれる整数であり、0、1、2、3、4、5、6、7及び8を含む；
R₂₁はH、-C₁〜C₈アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリ
ールアルキル基からなる群より選ばれる；
R₂₂はアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、-(CH₂CH₂O)_r-(CH₂)_s-、又はこれらの任意の組み合わせからなる群より選ばれる；
r、sはそれぞれ0〜8の範囲から選ばれる整数であり、0、1、2、3、4、5、6、7及び8を
含む；
R₂₃、R₂₄、R₂₅、R₂₆、R₂₇、R₂₈、R₂₉及びR₃₀は、H、-C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれる；
R₃₁はH、-C₁〜C₈アルキル、-OR₃₂からなる群より選ばれ、ただし、R₃₂はH、-C₁〜C₈ア
ルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基からなる群より選ばれる。

他の好ましい例において、以下の構造式で表される化合物を提供する。

本発明の第２の方面において、式IIIで表される化合物を提供する。

ただし：
R₁、R₂、R₃、R₄はH、-C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれる；
n、mはそれぞれ2〜4の範囲から選ばれる整数であり、2、3及び4を含む。

R₅、R₆、R₈はH、-C₁-C₈アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテ
ロアリールアルキル基からなる群より選ばれる；
R₇、R₁₁、R₁₂はH、-C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれる；
R₉、R₁₀はH、-OH、-C₁〜C₈アルキル、又は-O-(C₁〜C₈アルキル)からなる群より選ばれ
る；
R₁₃、R₁₄はH、-OH、-OR₁₆、-C₁〜C₈アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基からなる群より選ばれる；
R₁₆はH、-C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれる；
ｐはそれぞれ1〜8の範囲から選ばれる整数であり、1、2、3、4、5、6、7及び8を含む；
R₁₅は-C₃〜C₈アルキル、アリール、-C₃〜C₈ヘテロ環基、-COOH、-C(=O)NR₁₇R₁₈からな
る群より選ばれる；
R₁₇, R₁₈はH、-C₁〜C₈アルキル、-OH、-OR₁₉からなる群より選ばれ、又はR₁、R₂が連結されて環を形成し、-(CR₂₀R₂₁)_p-Z-(CR₂₂R₂₃)_q-の構造を有し、ただし、R₁₉、R₂₀、R₂₁、R₂₂及びR₂₃はH、-C₁〜C₈アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基からなる群より選ばれ；ZはO、NR₂₄、CR₂₅R₂₆からなる群より選ばれ
、ただし、R₂₄、R₂₅及びR₂₆はH、 -C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれ；p、qはそれぞれ0〜8の範囲から選ばれる整数であり、0、1、2、3、4、5、6、7及び8を含む。

他の好ましい例において、式IVで表される化合物を提供する。

ただし：
n、mはそれぞれ2〜4の範囲から選ばれる整数であり、2、3及び4を含む。

R₁はH、-C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれる；
R₂、R₃はH、-OH、-OR₅、-C₁〜C₈アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル
基、ヘテロアリールアルキル基からなる群より選ばれる；
R₅はH、-C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれる；
ｐはそれぞれ1〜8の範囲から選ばれる整数であり、1、2、3、4、5、6、7及び8を含む；
R₄は-C₃〜C₈アルキル、アリール、-C₃〜C₈ヘテロ環基、-COOH、-C(=O)NR₆R₇からなる群より選ばれる；
R₆、R₇はH、-C₁〜C₈アルキル、-OH、-OR₈からなる群より選ばれ、又はR₆、R₇が連結さ
れて環を形成し、-(CR₉R₁₀)_p-Z-(CR₁₁R₁₂)_q-の構造を有し、ただし、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁及びR₁₂はH、-C₁〜C₈アルキル、Ｈ、-C₁〜C₈アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキル基からなる群より選ばれ；ZはO、NR₁₃、CR₁₄R₁₅から
なる群より選ばれ、ただし、R₁₃、R₁₄及びR₁₅はH、 -C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれ；p、qはそれぞれ0〜8の範囲から選ばれる整数であり、0、1、2、3、4、5、6、7及び8
を含む。

本発明の第３の方面において、上記の本発明により提供される化合物から形成される薬学的に許容される塩、溶媒和物、又は塩の溶媒和物を提供する。

本発明の第４の方面において、上記の本発明により提供される化合物、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物、又は塩の溶媒和物及び薬学的に許容される担体を含む医薬が提供される。

本発明の第５の方面において、構造式が式Ｖで表される抗体薬物複合体を提供する。

ただし、 Lは抗体、抗体断片、又はタンパク質であり；Aはリンカー部分であり；Dは上
記の本発明により提供される化合物であり; nは0〜8の範囲内の整数であり、0、1、2、3
、4、5、6、７及び8を含む。

本発明の第６の方面において、腫瘍、自己免疫疾患及び抗炎症の分野における上記の本発明により提供される抗体薬物複合体の応用が提供される。

従って、本発明は高活性を有する新規な細胞毒性薬を提供する。

発明者は、既存のオーリスタチン系細胞毒性薬分子（AE、MMAE、MMAFなど）を基礎として、それぞれN末端とC末端に対して革新的な構造修飾を行って、新規な高活性の細胞毒性薬を得た。これに基づいて、本発明を完成した。

構造にカルボキシル基を有する細胞毒性分子は、インビトロ実験において電荷を持っているため、細胞膜を通って細胞に侵入することが困難であり、細胞毒性データの歪みをもたらし、他の電荷を持っていない細胞毒性分子の活性と対照することができない。

上記の理由から、本発明の全ての細胞毒性分子活性の測定は、抗体薬物複合体（同じ抗体、例えば抗体H；同じ切断可能性リンカー、例えばvcリンカー）の方法で、インビトロ
細胞増殖障害試験を行って、その細胞毒性を間接に比較する。これに基づいて、切断不可能性リンカー（例えばMCリンカー）を用いた場合の抗体薬物複合体の細胞毒性も考察した。

略語
Ab 抗体
Ac アセチル
ACN アセトニトリル
BOC (Boc) tert-ブトキシカルボニル
BrOP ブロモトリ（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファ
イト
Bu ブチル
t-Bu tert-ブチル
℃ セルシウス度
DCM ジクロロメタン
DEA ジエチルアミン
DEPC ジエチルシアノホスホン酸
DIEA ジイソプロピルエチルアミン
DMF N,N-ジメチルホルムアミド
DTT ジチオトレイトール
Et エチル
EtOAc 酢酸エチル
Eq 当量
Fmoc 9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基
g グラム
h 時間
HATU o-(7-アザベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘ
キサフルオロホスファイト
HOBt 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HOSu N-ヒドロキシスクシンイミド
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
LC-MS 液体クロマトグラフ質量分析計
Linker リンカー
Me メチル
MeOH メタノール
mAb モノクローナル抗体
min 分間
mL ミリリットル
μL マイクロリットル
PE 石油エーテル
prep-RP-HPLC 分取逆相-高速液体クロマトグラフ
rt 室温
Rt 保持時間
TEA トリエチルアミン
TFA トリフルオロ酢酸
THF テトラヒドロフラン
TLC 薄層クロマトグラフィー
TsCl 塩化パラトルエンスルホニル
定義
本文に用いた用語「アルキル基」は、ノルマル、第２級、第３級又は環状炭素原子を含む飽和炭化水素基であり、例えば、メチル基、エチル基、1-プロピル基、２-プロピル（
イソプロピル基）、シクロヘキシル基などである。

「アルケニル基」は、ノルマル、第２級、第３級又は環状炭素原子を含む不飽和炭化水素基であり、少なくとも１つの炭素-炭素sp²二重結合(C=C)を含み、例えば、ビニル基、
アリル基などである。

「アルキニル基」は、ノルマル、第２級、第３級又は環状炭素原子を含む不飽和炭化水素基であり、少なくとも１つの炭素-炭素sp三重結合(C≡C)を含み、例えば、エチニル基
、プロパルギル基などである。

「アリール基」は母体芳香環系から１つの炭素原子上の１つの水素原子を除去して得られた６〜１２個炭素原子の１価芳香族炭化水素基であり、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントラセン基、ビフェニル基などである。

「ヘテロアリール基」は、前記「アリール」骨格上の１つ又は複数の炭素原子が、ヘテロ原子N、O、P及びSにより置換されて形成されたものであり、例えば、ピリジニル基、チオフェニル基、フラニル基などである。

「ヘテロ環」は、母体芳香環又は非芳香環系の１つ又は複数の炭素原子が、ヘテロ原子
N、O、P及びSに置換されて形成されたものであり、例えば、ピリジン、チオフェン、フラン、ヘキサヒドロピリジン（ピペリジン）、及びテトラヒドロフランなどである。

「ヘテロ環基」は、前記「ヘテロ環」の骨格上の１つの炭素原子又はヘテロ原子上の水素原子を除去して形成された炭化水素基であり、例えば、ピリジニル基、チオフェニル基、フラニル基、ヘキサヒドロピリジニル基（ピペリジニル基）、テトラヒドロフラニル基などである。

「アリールアルキル基」は、末端又はsp³炭素原子に連結された１つの水素原子がアリ
ール基に置換された脂肪族アルキル基であり、例えば、ベンジル基、3-フェニルプロピル基などである。アリールアルキル基のアルキル基部分はアルケニル基又はアルキニル基を含んでもよい。

「ヘテロアリールアルキル基」は、末端又はsp³炭素原子に連結された１つの水素原子
がヘテロアリール基により置換された脂肪族アルキル基であり、例えば、2-ピリジニルエチル基、3-フラニルプロピル基などである。ヘテロアリールアルキル基のアルキル基部分はアルケニル基又はアルキニル基を含んでもよい。

「アルキレン基」は、直鎖状、分岐状又は炭素環を含む飽和炭化水素基であり、母体アルキルの同じ又は二つの異なる炭素原子上の二つの水素原子が除去されて、二つの一価基のラジカルセンターが生成される。例えば、メチレン基(-CH₂-)、1,2-エチレン基(-CH₂CH₂-)、1,3-プロピレン基（-CH₂CH₂CH₂-)などである。

「アルケニレン基」は、直鎖状、分岐状又は炭素環を含む不飽和炭化水素基であり、母体アルケンの同じ又は二つの異なる炭素原子上の二つの水素原子が除去されて、二つの一価基のラジカルセンターが生成される。例えば、1,2-エチレン基(-CH=CH-)、1,3-プロピ
レン基(-CH₂CH=CH-)などである。

「アルキニレン基」は、直鎖状、分岐状又は炭素環を含む不飽和炭化水素基であり、母体アルキンの同じ又は二つの異なる炭素原子上の二つの水素原子が除去されて、二つの一価基のラジカルセンターが生成される。例えば、アセチレン基(-CH≡CH-)、1,3-プロパルギル基(-CH₂C≡CH-)などである。

「アリーレン」は、６〜１２炭素原子の芳香族炭化水素基であり、母体芳香族系の二つの異なる炭素原子上の二つの水素原子が除去されて、二つの１価ラジカルセンターが生成され、例えば、1,2-フェニレン基、1,3-フェニレン基、1,4-フェニレン基などである。

「置換アルキル基」、「置換アルケニル基」、「置換アルキニル基」、「置換アリール基」、「置換ヘテロアリール基」、「置換ヘテロ環基」、「置換アリールアルキル基」、「置換ヘテロアリールアルキル基」は、それぞれ「アルキル基」、「アルケニル基」、「アルキニル基」、「アリール基」、「ヘテロアリール基」、「ヘテロ環基」、「アリールアルキル基」、「ヘテロアリールアルキル基」の１つ又は複数の水素原子がそれぞれ独立に置換基により置換されたものである。置換基は、一般的に-X、-OR、-NR₂、-NO₂、-CN、-SO₃R、-CO₂Rなどを含むが、これらに限定されない。ただし、Xはハロゲン原子である；RはH、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、保護基又はプロドラッグ部分である。前記
アルキレン、アルケニレン、及びアルキニレンも同じように置換されてもよい。

「その中の任意の組み合わせ」は、二つ又は複数の置換基が所定の連結方法により組み合わせて形成された１つの新規な置換基であり、例えば、ベンジル基(フェニル基+メチレン基)、3-フェニルプロピル基(フェニル基+1,3-プロピレン基)、2-シクロヘキシルプロピ
ル基(シクロヘキシル基+1,2-プロピレン基)、及び3-(3-ピリジニル基)プロピル基(3-ピリジニル基+1,3-プロピレン基)などである。

本文の前記用語「薬学的に許与される塩」は、例示的な化合物の薬学的に許与される有機塩又は無機塩を指す。例示的な化合物は、少なくとも１つのアミノ基を含有して、酸と塩を形成する。例示的な塩は、塩酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、硫酸塩などを含むが、これらに限定されない。薬学的に許与される塩は、１つ又は複数の電荷を帯びた原子を有することができるため、１つ又は複数の対イオンを有し、後者は親化合物の電荷を安定化させる任意の有機又は無機部分である。

「薬学的に許与される溶媒和物」又は「溶媒和物」は、１つ又は複数の溶媒分子と本発明の化合物からなる結合体である。薬学的に許与される溶媒和物を形成する溶媒の例としては、水、エタノール、イソプロパノール、酢酸などが含まれるが、これらに限定されない。

「薬学的に許容される担体」は、様々な賦形剤及び希釈剤を含む治療薬の投与に用いられる担体を指す。この用語は、本質的に活性成分ではなく、投与後に過度に毒性ではない多数の医薬担体を指す。適切な担体は、当業者に周知である。薬学的に許容される賦形剤の十分な検討は、"Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Pub.Co.、N.J.1991"か
ら見出すことができる。

本文で使用されるように、「抗体」又は「抗体単位」はその属する範囲内で抗体構造の任意の部分を含む。この単位は、受容体、抗原、又は標的細胞群が有する他の受容体単位と結合、反応的に関連、又は複合することができる。抗体は、治療又は生物学的に改変
しようとする細胞集団の一部と結合、複合又は反応することができる任意のタンパク質又はタンパク質類分子である。

本明細書において、抗体薬物複合体を構成する抗体は、元々の野生状態時の抗原結合能を保持していることが好ましい。従って、本発明における抗体は、好ましくは特異的に抗原に結合することができる。関連する抗原は、例えば、、腫瘍関連抗原（TAA）、細胞表
面受容体タンパク質及び他の細胞表面分子、細胞生存調節因子、細胞増殖調節因子、組織増殖及び分化に関連する分子（例えば、既知又は予測機能性）、リンホカイン、サイトカイン、細胞周期調節に関与する分子、血管新生に関与する分子、及び血管新生に関連する分子（例えば、既知又は予測機能性）を含む。腫瘍関連因子は、クラスター分化因子（例えば、CDタンパク質）であることができる。本発明に記載される抗体に結合する抗原は
、上記分類の1つ又はサブセットであることができるが、他のサブセットは、（標的抗原
と比較して）特定の性質の他の分子/抗原を含む。

抗体薬物複合体に使用される抗体には、細胞表面受容体及び腫瘍関連抗原に対する抗体が含まれるが、これらに限定されない。このような腫瘍関連抗原は本分野で周知であり、本分野の周知の抗体調製方法及び情報により調製することができる。癌の診断及び治療のための有効な細胞レベルの標的を開発するために、研究者らは、膜貫通又は他の腫瘍関連ポリペプチドの発見を試みた。これらの標的は、1つ又は複数の癌細胞表面上で特異的に
発現することができ、1つ又は複数の非癌細胞の表面上にほとんど又は全く発現しない。
一般的に、このような腫瘍関連ポリペプチドは、非癌細胞の表面に比べて、癌細胞表面上でより過剰発現される。このような腫瘍関連因子を同定することにより、腫瘍の抗体治療に基づく特異的な標的特性を大幅に高めることができる。

腫瘍関連抗原には、以下に列挙する腫瘍関連抗原（1）〜（36）が含まれるが、これら
に限定されない。便宜上、業界に知られている抗原関連情報は以下のように、名称、他の
名称、ジェンバンク（Genbank）登録番号を含む。腫瘍関連抗原に対応する核酸及びタン
パク質の配列は、Genbankなどの公開データベースを参照することができる。抗体標的が
対応する腫瘍関連抗原には、参考文献で同定された配列と少なくとも70％、80％、85％、90％又は95％の相同性を有する全てのアミノ酸配列変異体及び相同体が含まれ、或いは引用文献中の腫瘍関連抗原配列と完全に一致した生物学的性質及び特徴を有する。

腫瘍関連抗原（１）〜（36）：
（1）BMPR1B(骨形態形成タンパク質受容体-1B、Genbank登録番号 NM_001203)；
（2）E16 (LAT1、SLC7A5、Genbank登録番号NM_003486)；
（３）STEAP1（6つの膜貫通前立腺上皮抗原、Genbank登録番号NM_012449）；
（４）0772P (CA125、MUC16、Genbank登録番号AF361486)；
（５）MPF (MPF、MSLN、SMR、巨核球増強剤、メソテリン、Genbank登録番号NM_005823)；（6）Napi3b (NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質キャリアファミリー34（リン酸ナトリウ
ム）メンバー2、タイプIIナトリウム依存性リン酸トランスポーター3b、Genbank登録番号NM_006424)；
（７）Sema 5b (FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、セマフォリン5b Hlog
，semaドメイン、7つのトロンボスポンジンリピート（タイプ1及びタイプ1類）、膜貫通
ドメイン（TM）及び短い細胞質内ドメイン（セマフォリン）5B、Genbank登録番号AB040878)；
（８）PSCA hlg (2700050C12Rik、C530008016Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、 RIKEN cDNA
2700050C12遺伝子、Genbank登録番号AY358628)；
（9）ETBR (エンドセリンペプチドタイプB受容体、Genbank登録AY275463);
（10）MSG783 (RNF124、偽タンパク質FLJ20315、Genbank登録番号NM_017763)；
（１１）STEAP2 (HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前立腺癌関連
遺伝子1、前立腺癌関連タンパク質1、6つの膜貫通前立腺上皮抗原2、6つの貫通前立腺タ
ンパク質、Genbank登録番号AF455138)；
（12）TrpM4 (BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、一過性受容体電位カチオンチャネル
、サブファミリーM、メンバー4、Genbank登録番号NM_017636)；
（13）CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、テラトカルシノーマ由来増殖因子、Genbank登録番号NP_003203又はNM_003212)；
（1４）CD21(CR2(補体受容体2)又はC3DR(C3d/EBウイルス受容体)又はHs.73792, Genbank
登録番号M26004)；
（1５）CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫グロブリン関連β)、B29、Genbank登録番号NM_000626)；
（16）FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(ホスファターゼアンカータンパク質1a含有SH2ドメイン)、SPAP1B、SPAP1C、Genbank登録番号NM_030764)；
（17）HER2 (ErbB2、Genbank登録番号M11730)；
（1８）NCA (CEACAM6, Genbank登録番号M18728)；
（1９）MDP (DPEP1, Genbank登録番号BC017023)；
（２０）IL20Rα(IL20Ra、ZCYTOR7、Genbank登録番号AF184971)；
（２１）ブレビカン(BCAN、BEHAB、Genbank登録番号AF229053)；
（２２）EphB2R (DRT、ERK、Hek5、EPHT3、Tyro5、Genbank登録番号NM_004442)；
（２３）ASLG659 (B7h、Genbank登録番号AX092328)；
（２４）PSCA(前立腺幹細胞抗原前駆体、Genbank登録番号AJ297436)；
（２５）GEDA (Genbank登録番号AY260763)；
（２６）BAFF-R(B細胞活性化因子受容体、BLyS受容体3、BR3、Genbank登録番号AF116456)；
（27）CD22 (B細胞受容体CD22-Bアイソフォーム、Genbank登録番号AK026467)；
（28）CD79a(CD79A、CD79α、免疫グロブリン関連α、Igβ(CD79B)と共有結合役割を果たし、表面でIgM分子と複合体を形成することができ、B細胞分化シグナルの形質導入に関与
するB細胞特異的タンパク質、Genbank登録番号NP_001774.1)；
（29）CXCR5(バーキット（Burkitt’s）リンパ腫受容体1、CXCL13ケモカインにより活性
化されたGタンパク質共役受容体、リンパ球遊走及び体液性防御において役割を果たし、HIV-2感染及びAIDS、リンパ腫、骨髄腫、及び白血病で作用を発揮する、Genbank登録番号NP_001701.1)；
(30)HLA-DOB（MHCII系分子のβサブユニット（Ia抗原）、これはペプチドと結合してCD4+Tリンパ細胞に呈する、Genbank登録番号NP_002111.1）；
（31）P2X5（プリン受容体P2Xリガンド開口性イオンチャネル5、細胞外ATP開口性イオン
チャネルによってシナプス伝達及び神経発生に関与し、その欠陥によって特発性排尿筋不安定の病態生理学的状態の発生可能性がある、Genbank登録番号NP_002552.2）；
（32）CD72(B細胞分化抗原CD72、Lyb-2、Genbank登録番号NP_001773.1)；
（33）LY64（リンパ球抗原64（RP105）、ロイシンリッチリピートのI型膜タンパク質（LRR）ファミリー、B細胞の活性化及びアポトーシスを調節し、機能の喪失は全身性エリテマトーデスの患者の疾病の活動の増加に関連する、Genbank登録番号 NP_005573.1）；
（34）FcRHl（Fc受容体タンパク質1、C2型Ig様及びITAMドメインを含む推定上の免疫グロブリンFcドメイン受容体、Bリンパ球分化において役割を果たす可能性がある、Genbank登録番号NP_443170.1）；
（35）IRTA2（転座関連免疫グロブリンスーパーファミリーの受容体2、推定上の免疫受容体、B細胞の発達及びリンパ腫の生成において役割を果たす可能性がある；転座により引
き起こされる遺伝子障害は、あるB細胞悪性疾患で発生する、Genbank登録番号NP_112571.1）；
（36）TENB2（推定上の膜貫通型プロテオグリカン、成長因子EGF/ヘレグリン（heregulin）ファミリー及びフォリスタチン(follistatin)と関連する、Genbank登録番号AF179274）；
本文で使用されるように、「薬物」又は符号「D」は、一般的に所望の生物活性を有し
、且つ反応性官能基を有するので本発明の前記複合物の化合物を容易に製造できるものを指す。所望の生物活性は、ヒト又は他の動物の疾患の診断、治癒、緩和、治療、予防を含む。従って、必要な反応性官能基を具備することであれば、用語「薬物」に係る化合物は、公式の国家薬局方、及び例えば米国公式の同種療法薬局方、公式の全国処方集、又は他の任意の増補版などで確認された薬物を含む。典型的な薬物は医師用卓上参考書（PDR）
及び米国食品医薬品局（FDA）のオレンジブックに掲載されている。新薬の途切れない発見及び開発により、本特許はこれらの薬物も本発明の前記複合体薬物のプロドラッグに組み込むべきであると規定している。

好ましくは、薬物は下記のものを指す。つまり、癌治療のための細胞毒性薬；所望の生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチド、例えば、アブリン、リシンA、緑膿菌
外毒素、ジフテリア毒素のような毒素；腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子及び、リンホカイン、インターロイキン-1（IL-1）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-6（IL-6）のような生物応答調節剤、顆粒球単球コロニー刺激因子（GM-CSF）
、顆粒球コロニー刺激因子、又は他の成長因子を含む他の適切なタンパク質。

一方では、薬物は、メイタンシン(maytansine)又はメイタンシノイド(maytansinoids)
である。メイタンシン化合物は、微小管蛋白質の微小管形成を阻害することによって細胞増殖を阻害する（Science 1975,189,1002-1005; US 5208020）。メイタンシノイドはメ
イタンシンの誘導体である。メイタンシンとメイタンシノイドは、いずれも高い細胞毒性を持つが、癌の臨床治療において大きな制限があり、これはこれらの分子の腫瘍に対する低い選択性に起因する。しかしながら、この高い細胞毒性は、抗体薬物複合体の好ましい薬物部分とするように促す。以下は、メイタンシン、メイタンシノイド、及び抗体薬物複合体の応用で常に使用される3つのメイタンシノイド分子の構造である。

合成メイタンシノイドの主な原料は、主にアンサマイトシン（ansamitocins）によって加水分解されるメイタンシノール(maytansinol)である。アンサマイトシンは発酵によっ
て調製することができる。報告によると、アンサマイトシン誘導体(WO2012/061590)とア
ラニルメイタンシノール（US 2012/0121615）も抗体薬物複合体としての薬物「弾頭」と
することができる（これらの2種類の分子構造は以下の図を参照する）。

一方では、薬物は、オーリスタチン類(auristatins)薬物である。オーリスタチン系薬
物はドラスタチン１０（dolastatin 10）の誘導体であり、後者は海洋軟体動物である海
兎体内から単離された生物活性を有するポリペプチドである（US7498298）。ドラスタチン１０はチューブリン（ビンクリスチンと同じ結合領域）を結合することによってチューブリン重合を阻害する。ドラスタチン１０、オーリスタチンPE、オーリスタチンEは、何
れも線状ポリペプチドであり、４つのアミノ酸（その中の3つのアミノ酸は、ドラスタチ
ン類化合物の特有のものである）とC-末端アミド基を含む。２つの代表的なオーリスタチン系化合物であるモノメチルオーリスタチンE (MMAE)及びモノメチルオーリスタチンＦ(MMAF)は、いずれも抗体薬物複合体の好ましい薬物部分である。

本発明において、特に好ましいオーリスタチン系(auristatins)薬物は、本発明により
提供される構造が式I、II、III及びIVで表される化合物であり、好ましくは、本発明により提供される構造が化合物１〜４５である化合物である。

一方では、薬物はツブリシン（Tubulysins）系薬物である。ツブリシンは、粘液細菌から抽出された天然産物の一種であり、チューブリンの重合を効果的に阻害することができるため、抗細胞有糸分裂の活性を有し、その中でツブリンジンDの活性が最も優れている
。ツブリシンDは複雑なテトラペプチド化合物であり、その構造にO-アシル/N、O-アセタ
ール官能基が含まれるため、酸性及びアルカリ性の条件下で何れも不安定である。US2011/0021568とUS2013/0224228は、それぞれ一連のツブリシンの類似体を開示しており、その構造で上記不安定な官能基が除去されると共に、高い細胞活性も有する。

一方では、薬物はカリケアミシン系(calicheamicins)薬物である。カリケミシリン系薬物は抗腫瘍抗生物質であり、DNA小溝結合と結合し、特異的部位の二重らせんDNA切断を促進することにより、アポトーシスを引き起こす。カリケミシリン系薬物は、in vitroサブピコモル級別の高活性を有するが、低い治療指数は、臨床適用の見通しを排除した。しかしながら、このような高活性により、これらは抗体薬物複合体のための理想的な候補薬物（例えば、イノツズマブオゾガマイシン（Inotuzumab Ozogamicin））となる。

一方では、薬物はドキソルビシン系(doxorubicins)である。ドキソルビシンはDNA二重
らせん構造に挿入することによりDNA複製を阻止するため、化学療法剤として使用される
。しかしながら、ドキソルビシン系の低い細胞毒性（ヒト癌細胞株について、半数阻害濃度は0.1〜0.2マイクロモルであり、抗体薬物複合体に利用される細胞毒性薬の活性は通常
サブナノモル級である）のため、抗体薬物複合体における応用が一般的ではない。

一方では、薬物はベンゾジピロール系抗生物質（デュオカルマイシン（duocarmycins）、CC-1065など）と他のシクロプロパピロロインド-4-オン(cyclopropapyrroloind-4-one
、CPI)誘導体である。この種類の化合物は効率的なDNA小溝結合-アルキル化剤である。シクロプロパベンズインドール-4-オン（cyclopropabenzindol-4-one、CBI）類似体の化学
構造はより安定で、生物学的活性もより高く、天然CPIアルキル化サブユニットを含むそ
れらの親化合物よりも容易に合成できる。１つの代表的なCBI誘導体は、フェノール性ヒドロキシル保護誘導体CBI（下記の図を参照）であり、弱化されたプロドラッグ毒性及び
増加された水溶性を有する。

一方面で、薬物はピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン系(pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodi-azepines,PBDs）又はPBD二量体（PBD dimers）である。 PBDはストレプトマイセス（Streptomyces）によって産生される天然産物であり、そのユニークな特徴は、DNA小溝で、正確にはプリン-グアニン-プリン配列で曲がっていない共有結合を形成することである。PBDの使用で一部分の小分子戦略としてDNA配列を標的としてロッキングし、及び新規な抗癌剤及び抗菌剤として、ますます関心を集めている（Biochemistry 2008,47,11818〜11829）。柔軟な炭素鎖を使用して2つのPBDユニットのC8/C8'ヒドロキシル基を連結し、得ら
れる二量体は増加された生物活性を有する（WO2011/130616）。 PBD二量体は、逆順の5'-Pu-GATC-Py-3¢鎖間架橋のような配列選択可能なDNA損傷を生じることにより、その生物
学的活性をもたらすと考えられる。これらの化合物は、非常に強力な細胞毒性薬であることが証明されており、抗体薬物複合体の代替薬物とすることができる。

他の方面で、薬物は上記の種類のみに限定されず、抗体薬物複合体に用いることができる全ての薬物も含む。

本文で使用する用語「リンカー」又は「抗体薬物複合体のリンカー」は二官能基又は多官能基を有する分子を指し、それぞれタンパク質/抗体分子及び薬物分子と反応すること
ができるため、「リンク」としてタンパク質/抗体を薬物分子に結合させる。細胞内での
薬物放出の機序に応じて、「リンカー」又は「抗体薬物複合体のリンカー」は、切断不可能性リンカー（(non-cleavable linker)）及び切断可能性リンカー（cleavable linker）の2つの種類に分けることができる。

切断不可能性リンカーは比較的安定なリンカーであり、その構造は体内環境で分解しにくい。切断不可能性リンカーを含む抗体薬物複合体において、薬物放出機序は、複合体が抗原に結合し、細胞によってエンドサイトーシスされた後、抗体はリソソームで消化されて、小分子薬物、リンカー及び抗体アミノ酸残基からなる活性分子を放出する。これによる薬物分子構造の変化はその細胞毒性を減少させないが、活性分子が電荷を帯びる（アミノ酸残基）ため、隣接する細胞に浸透することが困難である。従って、このような活性薬物は、隣接した標的抗原を発現しない（抗原陰性細胞）腫瘍細胞を殺すことが困難である（傍観者効果、bystander effect）（Bioconjugate Chem. 2010,21,5-13）。一般的なリ
ンカーは、例えばＭＣリンカー及びMCCリンカーなどがあり、下記図に示す。

切断可能性リンカーは、読んで字のごとく、標的細胞内で切断され、活性薬物（小分子薬物自体）を放出することができる。切断可能性リンカーは、化学的に不安定なリンカーと酵素不安定なリンカーの2つの主な種類に分けることができる。

化学的に不安定なリンカーは、血漿及び細胞質特性の差異により選択的に切断することができる。そのような特性には、pH、グルタチオン濃度などが含まれる。

pH感受性リンカーは、一般的に酸分解リンカーとも称する。このようなリンカーは、血液の中性環境で比較的安定である（pH7.3〜7.5）が、弱酸性エンドソーム（pH5.0〜6.5）及びリソソーム（pH4.5〜5.0）で加水分解される。第1世代抗体薬物複合体は、例えばヒ
ドラゾン、カーボネート、アセタール、ケタールのようなリンカーを主に使用している。酸切断リンカーの血漿安定性が限られているため、このようなリンカーに基づく抗体薬物複合体は、一般により短い半減期（2〜3日）を有する。このような短い半減期は、新世代の抗体薬物複合体におけるpH感受性リンカーの使用をある程度制限している。

グルタチオン感受性リンカーは、ジスルフィドリンカーとも称する。薬物放出は、細胞内グルタチオンの高濃度（ミリモル範囲）と血液内比較的低いグルタチオン濃度（マイクロモル範囲）の差異により引き起こす。これは特に腫瘍細胞に当てはまり、その低い酸素含有量はレダクターゼ活性を増加させ、より高いグルタチオン濃度をもたらす。ジスルフィド結合は、熱力学的安定性を有するため、血漿中で良好な安定性を有する。

ペプチドリンカーのような酵素不安定なリンカーは、薬物放出をより良好に制御することができる。ペプチドリンカーは、カテプシンB(Cathepsin B)又はプラスミン（ある腫瘍組織において、このような酵素の量が増加される）のようなリソソームエンドプロテアーゼによって効果的に切断される。このペプチド結合は、細胞外の不適切なpH及び血清プロテアーゼインヒビターによって、プロテアーゼが細胞外側では生存できないため、血漿循環において非常に安定であると考えられる。高い血漿安定性及び良好な細胞内切断の選択性と有効性の観点から、酵素不安定リンカーは、抗体薬物複合体の切断可能性リンカーとして広く使用されている。典型的な酵素不安定性リンカーは、例えばvcなどである。

自殺性リンカーは、一般的に切断可能性リンカーと活性薬物との間にはめ込まれる、又はその自体が切断可能性リンカーの一部である。自殺性リンカーの作用機序は下記のようである。つまり、切断可能性リンカーが適切な条件下で切断された後、自殺性リンカーが自発的に構造の再配列を行って、それが結合している活性薬物を放出することができる。一般的な自殺性リンカーは、例えばp-アミノベンジルアルコール（PAB）などがある。

抗体薬物複合体
本発明によって提供される抗体薬物複合体は、抗体、リンカー及び薬物からなり、前記リンカーは、切断可能性リンカーの組み合わせ又は切断不可能性リンカーを含む。

使用
本発明は、抗体薬物複合体の分野に幅広く応用され、「生物学的ミサイル弾頭」となる高活性細胞毒性薬を提供する。

本発明は、特定の細胞群を標的として、細胞表面の特異的なタンパク質（抗原）と結合し、結合体は細胞内にエンドサイトーシスされ、細胞内へ活性形態で薬物を放出する前記細胞毒性薬に基づく抗体薬物複合体を提供する。

本発明は、特定の細胞群を標的として、細胞表面の特異的なタンパク質（抗原）と結合して効果を生じさせ、又は細胞外で薬物を放出し、薬物が細胞内に浸透して効果が発生する前記細胞毒性薬に基づく抗体薬物複合体を提供する。

本発明は、有効量の薬物複合体及び薬学的に許容される担体又は媒体を含む複合体を提供する。

本発明は、治療有効量の本発明により提供された抗体薬物複合体を癌又は他の腫瘍に罹患している動物に投与する、動物体内の癌又は他の腫瘍を治療する方法を提供する。

本発明は、自己免疫疾患又は炎症性疾患に罹患している患者に治療有効量の本発明により提供される抗体薬物複合体を使用する、自己免疫疾患又は炎症性疾患を治療するための治療方法を提供する。

上述の特徴又は実施例で述べた特徴は、任意に組み合わせることができる。本明細書に開示された全ての特徴を任意の組成物の形態と併用して使用することができ、明細書に開示された各特徴は、同様、同等或いは類似した目的の代わりの特徴により置換されることができる。従って、特に説明しない限り、開示された特徴は、同等又は類似の特徴の一般的な一例に過ぎない。

以下、具体的な実施例を組み合わせて、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いるもので、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるべきである。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常、普通の条件、或いはメーカーの薦めの条件で行われた。全ての反応は、何れも窒素保護下で実施した（水素化反応以外に）ため、実施例には示されていない。

別途に定義しない限り、文中に使用される全ての専門・科学用語は、本分野の熟練者によく知られる意味と同じである。また、記載される内容に類似或は同等の方法及び材料はいずれも本発明に使用することができる。文中に記載の好ましい実施形態及び材料は例示だけのためである。

本発明の下記実施例で採用した一般的な工程は下記のようである。

一般的な工程A： DEPC縮合剤を用いたアミド反応
適量のカルボン酸及びアミン（1〜2当量）をDCMに溶解し、DIEA又はTEA（2〜5当量）及びDEPC（1〜2当量）を順次に添加する。反応が完了するまで、反応物を室温で撹拌する（TLC又はLC-MS測定）。反応液を濃縮して溶媒を除去し、残留物をカラムクロマトグラフィー又は逆相高速液体クロマトグラフィーで精製して、目的物を得る。

一般的な工程B： HATU縮合剤を用いたアミド反応
適量のカルボン酸及びアミン（1〜2当量）をDCMに溶解し、DIEA又はTEA（2〜5当量）とHATU（1〜2当量）を順次に添加する。反応が完了するまで、反応物を室温で撹拌する（TLC又はLC-MS測定）。反応液を濃縮して溶媒を除去し、残留物をカラムクロマトグラフィ
ー又は逆相高速液体クロマトグラフィーで精製して、目的物を得る。

一般的な工程C：アミン保護基Boc脱保護
Boc保護基を有するアミン化合物をTFA/DCM混合溶液（v/v 1：1又は他の割合）に溶解し、反応が完了するまで室温で撹拌する（TLC又はLC-MS測定）。反応液を濃縮して溶媒を除去し、得られた標的生成物のトリフルオロ酢酸塩をそのまま次の反応に用いる。又はトリフルオロ酢酸塩を炭酸水素ナトリウム水溶液で中和した後、有機溶媒で抽出し、有機相を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して粗生成物を得、これをカラムクロマトグラフィー又は逆相高速液体クロマトグラフィーで精製して標的生成物を得る。

一般的な工程D：アミン保護基Fmoc脱保護
Fmoc保護基を有するアミン化合物をDEA/DCM混合溶液（v/v 1：2又は他の割合）に溶解
し、反応が完了するまで室温で撹拌する（TLC又はLC-MS測定）。反応液を濃縮して溶媒を
除去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィー又は逆相高速液体クロマトグラフィーで精製して、目的物を得る。

一般的な工程E：アミノ酸/カルボン酸t-ブチルエステルの合成
アミノ酸/カルボン酸を適量の酢酸t-ブチルエステルに溶解し、溶液を0℃に冷却する。溶液に過塩素酸（1.5当量）を徐々に加える。反応が完了するまで、反応物を室温で撹拌する（TLC又はLC-MS測定）。反応液を水と1.0M塩酸水で順次に洗浄し、合わせた水層を炭酸カリウム溶液でpH9に調整した後、DCMで適当な回数抽出する。合わせた有機相を水で洗浄し、乾燥し、濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィー又は逆相高速液体クロマトグラフィーで精製して標的生成物を得る。

一般的な工程Ｆ：カルボン酸t-ブチルエステル脱保護
カルボン酸t-ブチルエステルをTFA/DCM混合溶液（v/v 1：1又は他の割合）に溶解し、
反応が完了するまで室温で撹拌する（TLC又はLC-MS測定）。反応液を濃縮して溶媒を除去し、粗生成物をそのまま次の反応に用い、又はカラムクロマトグラフィー又は逆相高速液体クロマトグラフィーで精製して、標的生成物を得る。

一般的な工程G：ビス（p-ニトロベンゼン）カーボネートを用いたアルコール性ヒドロキシル基の活性化
適量なアルコール、ス（p-ニトロベンゼン）カーボネート（２当量）とTEA又はDIEA(3
当量)を順次にDCMに添加し、反応液を室温（又は適切な温度）下で所定時間攪拌する。アルコールが完全に反応しない場合、アルコールが完全に反応するまで（TLC又はLCMS）、
より多くのビス（p-ニトロベンゼン）カーボネートを補充して添加し、より長い時間反応させることができる。反応液を濃縮して溶媒を除去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィー又は逆相高速液体クロマトグラフィーで精製して、標的生成物を得る。

一般的な工程H：アミンはp-ニトロベンゼンカーボネート（活性アルコール）と反応してカルバメートを形成する。

アミンと一般工程Fで得られるp-ニトロフェニルカーボネート（活性化アルコール）（1〜2当量）をDCMに溶解し、室温で反応を完了させる（TLC又はLCMS測定）。反応液を濃縮
して溶媒を除去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィー又は逆相高速液体クロマトグラフィーで精製して、標的生成物を得る。

一般的な工程Ｉ：アミンはp-ニトロベンゼンカーボネート（活性アルコール）と反応
してカルバメートを形成する。

アミン、一般的な工程Fから得られるp-ニトロベンゼンカーボネート（活性化アルコー
ル）（1〜2当量）及びHOBtをピリジン/ DMF混合溶液に溶解する。反応が完了するまで、
反応物を室温で撹拌する（TLC又はLC-MS測定）。反応液を濃縮して溶媒を除去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィー又は逆相高速液体クロマトグラフィーで精製して、標的生成物を得る。

一般的な工程J：抗体薬物複合体の製造
抗体溶液（10mg/mL、25mMホウ酸-ホウ酸ナトリウム緩衝液、25mM塩化ナトリウム、1mM
ジエチレントリアミン五酢酸、pH8.0）にDTT（1〜100当量、好ましくは、 2.7当量である、2対の鎖間ジスルフィド結合の還元に使用されて、複合に利用可能な4個のシステインメルカプト基（平均値）を生成し、ストック溶液濃度は10mMである）を添加する。反応液を37℃のクライオスタット中で2時間インキュベートする。

反応液から還元剤を限外ろ過又は脱塩カラムにより除去し、同時に抗体をリン酸緩衝液PBS（100mM、10mM塩化ナトリウム、1mMジエチレントリアミンペンタ酢酸、pH7.0）に置換する。

反応液におけるジメチルスルホキシドの量が約15％を占めるように、10℃に冷却した還元抗体溶液にジメチルスルホキシドとリンカー-薬物化合物（ジメチルスルホキシドスト
ック溶液、1〜10当量、好ましくは8当量）を加える。カップリング反応を10℃で0.5時間
行う。

過剰のシステイン溶液を反応溶液に加えて、未反応のリンカー-薬物化合物をクエンチ
する。クエンチ反応は10℃で30分間行う。反応液から限外ろ過又は分離カラムによってリンカー-薬物-システイン付加物及び過剰のシステインを除去した後、0.2mm孔のフィルタ
で菌を除去し、4℃条件で保存する。

一般的な工程K：酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）
間接的ELISA法を用いて、テスト抗体又は抗体薬物複合体と対応する抗原の結合能を調
べる。抗原を固相担体（96ウェルプレート）と連結して固相抗原を形成し、洗浄して未結合の抗原を除去する。段階希釈した抗体又はテスト用抗体薬物複合体において、特異的抗体が抗原に結合して固相抗原-抗体複合体を形成し、固相抗原に結合しない抗体又は抗体
薬物複合体は洗浄により除去される。酵素複合抗抗体を添加して、固相抗原に結合した抗体又はADC抗体と結合させ、結合していない抗抗体を洗浄により除去する。基質溶液を加
え、マイクロプレートリーダーを用いて450nm/630nmにおける光学密度を読み取って曲線
を作成して、EC₅₀を計算する。

一般的な工程L：細胞増殖阻害アッセイ(Cell Proliferation Inhibition Assay)
一般的に、抗体又は抗体薬物複合体の細胞障害活性は、下記の方法により測定する。即ち、細胞培養培地中で、腫瘍関連抗原又は受容体タンパク質を発現する哺乳動物細胞を、抗体又は抗体薬物複合体と接触させる;細胞を2〜5日間インキュベートし、細胞数を測定
し、曲線を作成して、IC₅₀を計算する。

特に説明しない限り、全ての無水試薬は、供給元から直接に購入したものであり、窒素下で保管する。購入した全ての他の試薬及び溶媒は高純度であり、使用前にさらに精製しない。

NMRスペクトルは、Bruker Avance III 500-M核磁気共鳴分光計で収集する。化学シフト（δ）の単位はppmであり、テトラメチルシランを基準系（化学シフトは0）とし、カップリング定数（J）はHzである。

液体クロマトグラフ質量分析法において、低分解能質量分析データは、HP Agilent 1200高速液体クロマトグラフィーとインターフェースしたAgilent 6110（酸性）又は6120B（アルカリ性）質量分析計から収集する。

方法一（方法1）：酸性の高速液体クロマトグラフィーとして、WatersのSunfire C18
逆相カラム（4.60´50mm、3.5μm）を用いて分離し、溶離液の勾配は、1.4分間で5％〜95％のB相（アセトニトリル、0.01％TFA含有）がA相（0.01％TFAを含有する水相）中にあることであり、流速は2.3mL/分で、カラム温度は50℃である。

方法二（方法2）：アルカリ性高速液体クロマトグラフィーとして、WatersのXbridge C18逆相カラム（4.60´50mm、3.5μm）を用いて分離し、溶離液の勾配は、1.5分で5％〜95％のB相（アセトニトリル）がA相（10mMの炭酸水素アンモニウムを含む水相）中にある
ことであり、流速は2.0mL/分で、カラム温度は４0℃である。

逆相-高速液体クロマトグラフィー精製（分取-RP-HPLC）は、ギルソン（Gilson）機器
で実施し、使用される分離カラムは、Waters Sunfire C18逆相カラム（250´19mm、10μm）である。

方法三(方法3) 酸性法で調製する。移動相：A：0.1％TFAを含む水相; B：ACN。流速：20mL /分。

方法四(方法4) アルカリ性法で調製する。移動相：A：10mM炭酸水素アンモニウムを含む水相; B：ACN。流速：20mL/分。

使用した細胞系はSK-BR-3ヒト乳癌細胞である。当該細胞株はATCCから得たものである
。Her2抗原は義翹神州会社（Sino Biological Inc.、北京）から購入した。抗体H（ハー
セプチンバイオシミラー）は、嘉和生物薬業有限会社（Jiahe Biological Pharmaceutical Co.、Ltd.、上海）から購入した。酵素結合抗抗体はSigma（上海）から購入した。基質溶液は、Decent生物技術会社（上海）から購入した。Cell Counting Kit-8（CCK-8）の細胞増殖-毒性検出キットは、同仁堂化学社（Dojindo上海）から購入した。

重要な中間体(Key Intermediates、KIs)
本発明で使用する重要な中間体を以下に示す。ただし、AE、Fmoc-MMAE、MC、MC-Val-Cit-PABC-PNP、KI-1、KI-2、KI-3、KI-4、KI-5は、何れも文献（US5635483、 6884869、7498298）に報告された方法により合成される。

重要な中間体KI-7の合成

合成工程１
ジエタノールアミン（4.0g、38.0mmol）とTEA（19.2g、190mmol）をDCM（300mL）に溶
解し、次いでTsCl（26.1g、137mmol）を徐々に加えた。反応液を室温で18時間撹拌した。有機相を10％クエン酸溶液、水及び飽和食塩水で順次に洗浄した後、乾燥させ、濾過し、濃縮して、白色固体47（19.5g）を得、これを次の反応に直接に使用した。LC-MS (方法1)
:R_t = 2.12 min; m/z (ES⁺) = 568.0 (M+H)⁺。

合成工程2
化合物47（2.0g、3.52mmol）及びtert-ブチルL-バリン（0.74g、3.52mmol）をDIEA（20mL）に溶解し、反応液を127℃で18時間激しく撹拌した。濃縮して溶媒を除去し、残留物
に水（100mL）を加えた後、酢酸エチル（40mL×3）で抽出した。合わせた有機相を水で洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 15
：1）で精製して淡黄色固体48（1.1g）を得た。LC-MS (方法2): R_t= 2.45 min; m/z (ES⁺) = 397.3 (M+H)⁺。

合成工程3
臭化水素酸の酢酸溶液（33％、3.9mL）に、化合物48（900mg、2.27mmol）及びp-ヒドロキシ安息香酸（1.04g、7.5mmol）を加えた。反応液を室温で一晩攪拌した。反応溶液にEtOAc（10mL）を加え、撹拌を5分間続けた。沈殿物をろ別により回収し、酢酸エチル（20mL）で洗浄した。ケーキを乾燥して、白色固体49（500mg）を得、これを次の反応に直接に
使用した。LC-MS (方法2): R_t = 0.46 min; m/z (ES⁺) = 187.2 (M+H)⁺。

合成工程4
化合物49（500mg、2.69mmol）を1,4-ジオキサン/水混合溶液（v/v 3：1、20mL）に溶解し、続いて炭酸水素ナトリウム（1.35g、16.1mmol）と9-フルオレニルメチルクロロホル
メート（Fmoc-Cl、829mg、3.22mmol）を加えた。反応液を室温で一晩攪拌した。10％クエン酸溶液で反応液のpHを2〜3に調整した後、酢酸エチル（20mL×3）で抽出した。合わせ
た有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 3：1、次にDCM/MeOH 15：1）で精製した。粗生成物
を分取RP-HPLC（方法3：8分間で35％〜50％B→95％B; R_t：5.7〜7.1分間）によりさらに
精製して、白色固体50（190mg）を得た。LC-MS (方法1): R_t = 1.74 min; m/z (ES⁺) = 409.3 (M+H)⁺。¹H NMR (500 MHz, CDCl3) d 7.75 (dd, 2H), 7.53 (d, 2H), 7.39 (d, 2H), 7.33 (d, 2H), 4.59 (d, 2H), 4.21 (t, 1H), 3.79-3.67 (m, 4H), 3.37-3.02 (m, 4H), 2.25 (m, 1H), 1.18 (d, 3H), 1.04 (d, 3H)。A:水 0.1% TFA, B:8分間でACN 35%〜50%
ACN、続いて20mL/分の速度で95％、保持時間：5.7〜7.1分間。

合成工程5
化合物50（280mg、0.69mmol）及びKI-1（245mg、0.69mmol）をDCM（6mL）に溶解し、DIEA（265mg、2.06mmol）とDEPC（168mg、1.03mmol）を順次に添加した。反応液を室温で3
時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 4：1）で精製して無色油状物51（280mg）を得た。 LC-MS (方法2): R_t = 2.65 min; m/z (ES⁺) N/A。

合成工程6
化合物51（270mg）をDCM（3mL）に溶解し、溶液を10℃に冷却した。トリフルオロ酢酸
（3mL）を加え、反応液を10℃で4時間撹拌した。溶媒を濃縮により除去し、粗生成物（260mg）を得て、次の反応に直接に使用した。LC-MS (方法2): R_t= 1.96 min; m/z (ES⁺) = 693.3 (M+H)⁺。

重要な中間体KI-8の合成

合成工程１
2-シアノエチルグリシン（6.5g、50.8mmol）を6M塩酸溶液（50mL）に加え、反応物を100℃で2日間撹拌した。濃縮して溶媒を除去して粗生成物を得、50℃で真空で乾燥して、白色固体52（8.5g）を得た。LC-MS (方法1): R_t = 0.19 min; m/z (ES⁺) = 148.1 (M+H)⁺。

合成工程2
化合物52（8.5g）をMeOH（100mL）に溶解し、溶液を0℃に冷却した。この溶液に、塩化チオニル（13.63g、115.6mmol）を滴下した。反応液を還流下で2時間加熱し、濃縮して溶媒を除去して53粗生成物（塩酸塩、12.5g）を得、これを次の反応に直接に使用した。LC-MS (方法1): R_t = 0.34 min; m/z (ES⁺) = 176.1 (M+H)⁺。

合成工程3
化合物53（12.5g）をDCM（300mL）に懸濁し、TEA（21.64g、214.3mmol）とTsCl（17.7g、92.9mmol）を順次に加えた。反応液を室温で18時間撹拌した。有機相を水、飽和塩化ナトリウム溶液で順次に洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 4：1）で精製して無色油状物54（13.0 g）を得た。LC-MS (方法1): R_t = 1.48 min; m/z (ES⁺) = 330.0 (M+H)⁺。

合成工程4
化合物54（13.0 g）をTHF無水物（200 mL）に溶解し、溶液を0℃に冷却した。50分間かけて水素化アルミニウムリチウム（2.99g、78.9mmol）を上記溶液に加え、反応液を0℃で3時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム溶液（3mL）を加えて反応を停止させ、反応液を濃縮して溶媒を除去した。残留物を飽和塩化アンモニウム溶液（150mL）とイソプロパノー
ル/クロロホルム（v/v 3：1、150mL）の混合溶液に懸濁し、析出物をろ別し、ろ液中の水層を分離した後、プロパノール/クロロホルム（v/v 3：1,100mL）で抽出を続けた。有機
層を合わせた後乾燥し、濃縮して淡黄色油状物５５（11.5ｇ）を得、次の反応に直接に使用した。LC-MS (方法2): R_t = 1.61 min; m/z (ES⁺) = 274.2 (M+H)⁺。

合成工程5
化合物55（4.2 g）をDCM（100 mL）に懸濁し、TEA（6.21 g、61.5 mmol）とTsCl（7.04
g、36.9 mmol）を順次に加えた。反応液を室温で一晩攪拌した。有機相を水、飽和塩化
ナトリウム溶液で順次に洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 4：1）で精製して淡黄色油状物56（3.7 g）を得た。LC-MS (方法2
): R_t = 2.27 min; m/z (ES⁺) = 599.2 (M+NH₄)⁺。

合成工程6
化合物56（3.7g）及びL-バリンt-ブチルエステル（1.33g、6.37mmol）をDIEA（30mL）
に加え、反応液を127℃で18時間激しく撹拌した。濃縮して溶媒を除去し、50ml水を加え
、EtOAc（50ml×3）で抽出した。有機相を合わせて、水で洗浄し、乾燥し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc/DCM 15：1：1）により精製し
て、黄色油状物57（2.3g）を得、これを次の反応に直接に使用した。LC-MS (方法2): R_t = 2.47 min; m/z (ES⁺) = 411.3 (M+H)⁺。

合成工程7
臭化水素酸の酢酸（33％、20mL）溶液に、化合物57（2.8g、6.82mmol）とp-ヒドロキシ安息香酸（3.1g、22.5mmol）を加えた。反応液を室温で24時間撹拌した。反応溶液にEtOAc（200 mL）を加え、混合物を5分間撹拌した。沈殿物をろ別し、酢酸エチル（50mL）で洗浄した。フィルターケーキを真空中で乾燥させて白色固体58（臭化水素酸塩、630mg）を
得た。LC-MS (方法 1): R_t = 0.17 min; m/z (ES⁺) = 201.2 (M+H)⁺。

合成工程8
化合物58（630mg、3.15mmol）をTHF/H₂O（v/v 5：1 12mL）に溶解し、続いて炭酸水素
ナトリウム（0.26g、3.15mmol）、TEA（0.95g、9.45mmol）及び9-フルオレニルメチルス
クシンイミジルカーボネート（Fmoc-OSu、1.38g、4.09mmol）を加えた。反応液を室温で18時間撹拌した。 10％クエン酸溶液で応液のpHを2〜3に調整した後、酢酸エチル（20mL×3）で抽出した。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、乾燥し、濃縮した。粗生成
物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 30：1）で精製して、白色固体59（530mg）を得た。LC-MS (方法2): R_t = 1.76 min; m/z (ES⁺) = 423.3 (M+H)⁺。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) d 7.75 (d, 2 H), 7.55 (d, 2 H), 7.40 (m, 2 H), 7.33 (m, 2 H), 4.72-4.55 (m, 2 H), 4.21 (m, 1 H), 3.82-3.10 (m, 9 H), 2.20-2.08 (m, 3 H), 1.18 (t,
3 H), 1.05-1.00 (dd, 3 H)。

合成工程9
化合物59（400mg、0.95mmol）とKI-1（339mg、0.95mmol）をDCM（10mL）に溶解し、TEA（287mg、2.8mmol）及びDEPC（200mg、1.23mmol）を順次に添加した。反応液を室温で18
時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 40：1）で精製して、白色固体60（610mg）を得た。LC-MS (方法1): R_t= 1.77 min; m/z (ES⁺) = 763.3 (M+H)⁺。

合成工程10
化合物60（610mg）をDCM（3mL）に溶解し、溶液を0℃に冷却した。TFA（1.5mL）を加え、反応液を10℃で4時間撹拌した。濃縮して溶媒を除去して、粗生成物（600mg）を得、次の反応に直接に使用した。 LC-MS (方法 1): R_t = 1.57 min; m/z (ES⁺) = 707.4 (M+H)⁺。

実施例１
化合物１の合成

合成工程1
AE（350mg、0.48mmol）及びビス（p-ニトロベンゼン）カーボネート（91mg、0.96mmol
）のDCM（10mL）溶液にDIEA（185mg、1.43mmol）を加え、反応液を室温で18時間撹拌した。反応液にビス（p-ニトロベンゼン）カーボネート（142mg、0.46mmol）を加え、混合液
を24時間続いて攪拌した。濃縮して溶媒を除去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（EtOAc/PE 4：1→DCM/MeOH 30：1）で精製して、白色固体61（340mg）を得た。LC-MS (方法 1): R_t = 1.66 min; m/z (ES⁺) = 897.5 (M+H) ⁺。

合成工程2
化合物61（160mg、0.18mmol）をDCM（6mL）に溶解し、次いでt-ブチル2-（メチルアミ
ノ）エチルカルバメート（67mg、0.36mmol）とDIEA(69mg、0.54mmol)を加えた。反応液を室温で18時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 30：1）で精製して、淡黄色固体62（105mg）を得た。LC-MS (方法2): R_t= 2.33 min; m/z (ES⁺) = 946.7 (M+H) ⁺。

合成工程3
化合物62（105mg）をDCM（3mL）に溶解し、10℃に冷却し、次いでTFA（3mL）を添加し
た。反応液を10℃で4時間攪拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をEtOAc（20mL）に
溶解し、次いで飽和炭酸水素ナトリウム溶液で3回洗浄した。有機相を乾燥させ、濃縮し
て、淡黄色固体1（75mg）を得た。LC-MS (方法1): R_t = 1.38 min; m/z (ES⁺) = 846.6 (M+H) ⁺。

実施例2
化合物2、3、4の合成
化合物2、3、4の合成は、化合物１と類似した合成工程を用い、LC-MSの特性データを表1に示す。

実施例3
化合物5の合成

合成工程１
1,5-ペンタンジオール（2.0g、19mmol）とTEA（6.72g、66.5mmol）をDCM（100mL）に溶解し、次いでTsCl（8.69g、45.6mmol）を徐々に加えた。反応液を室温で18時間撹拌し、
次いで10％クエン酸溶液、水及び飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。有機相を乾燥し、濃縮して、白色固体63（8.0 g）を得た。粗生成物を次の反応に直接に使用する。LC-MS (方法1): R_t= 2.10 min; m/z (ES⁺) = 413.1 (M+H)⁺。

合成工程2
DIEA（20mL）に化合物63（4.8g、11.7mmol）、L-バリンt-ブチルエステル塩酸塩（2.43g、11.7mmol）を加えた。反応液を127℃で18時間激しく撹拌した。冷却後、反応液を濃縮して溶媒を除去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 5：1）で
精製し、黄色油状物64（2.8g）を得た。LC-MS (方法1): R_t = 1.14 min; m/z (ES⁺) = 242.3 (M+H)⁺。

合成工程3
化合物64（2.8g）をDCM（5mL）に溶解し、次いでTFA（5mL）を添加した。反応液を室温で一晩攪拌した。濃縮して溶媒を除去して、褐色固体65（1.2g）を得、これを次の反応に直接に使用した。少量の粗生成物を核磁気共鳴分光法のためにRP-HPLCにより精製して純
粋物を得た。LC-MS (方法1): R_t = 0.36 min; m/z (ES⁺), 186.2 (M+H)⁺。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) d 3.82 (d, 1 H), 3.65 (d, 1 H), 3.54 (d, 1 H), 3.37 (t, 1 H), 3.03 (t, 1 H), 3.33 (m, 1 H), 2.10-1.80 (m, 5 H), 1.55-1.40 (m, 1 H), 1.17 (d, 3 H), 1.06 (d, 3 H)。

合成工程4
化合物65（200mg、50％純度、0.54mmol）、KI-1（194mg、0.54mmol）をDCM（9mL）に溶解した後、DIEA（272mg、2.7mmol）及びDEPC（114ｍｇ、0.70mmol）を順次に加えた。反
応液を室温で18時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 5：1）で精製して無色油状液体66（250mg）を得た。LC-MS (方
法1): R_t= 1.49 min; m/z (ES⁺), 526.4 (M+H)⁺。

合成工程5
化合物66（250mg）をDCM（3mL）に溶解し、溶液を0℃に冷却した。TFA（3mL）を加え、反応液を10℃で4時間撹拌した。濃縮して溶媒を除去して、粗生成物67（220mg）を得、次の反応に直接に使用した。LC-MS (方法 1): R_t = 1.56 min; m/z (ES⁺), 470.7 (M+H)⁺。

合成工程6
化合物67（220mg、0.47mmol）及び化合物KI-3（160mg、0.47mmol）をDCM（8mL）に溶解し、0℃に冷却した。混合物にTEA（142mg、1.41mmol）及びDEPC（99mg、0.61mmol）を順
次に加えた。反応液を室温で18時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 40：1）で精製して淡黄色固体5（190mg）を得
た。LC-MS (方法1): R_t = 1.32 min; m/z (ES⁺), 772.5 (M+H)⁺。

実施例4
化合物6の合成

合成工程１
ジエチレングリコール（2.0g、18.9mmol）及びTEA（6.69g、66mmol）をDCM（100mL）に溶解し、次いでTsCl（8.63g、45.3mmol）を徐々に加えた。反応液を室温で18時間撹拌し
、次いで10％クエン酸溶液、水及び飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。有機相を乾燥し、濃縮して、白色固体68（8.0g）を得た。粗生成物を次の反応に直接に使用する。LC-MS (方法1): R_t = 2.02 min; m/z (ES⁺) = 415.1 (M+H)⁺。

合成工程2
化合物68（2.95g、7.18mmol）、L-バリンtert-ブチルエステル塩酸塩（1.5g、7.18mmol）をDIEA（15mL）に加えた。反応液を127℃で18時間激しく撹拌した。冷却後、濃縮して
溶媒を除去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 5：1）で精製
し、黄色油状液体69（0.9 g）を得た。LC-MS (方法1): R_t= 1.33 min; m/z (ES⁺) = 244.3 (M+H)⁺。

合成工程3
化合物69（0.9g）をDCM（2mL）に溶解し、次いでTFA（2mL）を添加した。反応液を室温で一晩攪拌した。濃縮して溶媒を除去して、グレー固体70（400mg）を得、これを次の反
応に直接に使用した。少量の粗生成物を核磁気共鳴分光法のためにRP-HPLCにより精製し
て純粋物を得た。LC-MS (方法1): R_t= 0.35, 0.43 min; m/z (ES⁺) = 188.2 (M+H)⁺。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) d4.04 (s, 4 H), 3.80 (d, 1 H), 3.60 (br s, 2 H), 3.36 (br s, 2 H), 2.37 (m, 1 H), 1.20 (d, 3 H), 1.08 (d, 3 H)。

合成工程4
化合物70（200mg、50％純度、0.54mmol）、KI-1（194mg、0.54mmol）をDCM（9mL）に溶解した後、DIEA（272mg、2.7mmol）及びDEPC（114ｍｇ、0.70mmol）を順次に加えた。反
応液を室温で18時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 5：1）で精製して無色油状液体71（200mg）を得た。LC-MS (方
法1): R_t= 1.74 min; m/z (ES⁺) = 528.4 (M+H)⁺。

合成工程5
化合物71（200mg）をDCM（3mL）に溶解し、溶液を0℃に冷却した。TFA（3mL）を加え、反応液を10℃で3時間撹拌した。濃縮して溶媒を除去して、粗生成物72（190mg）を得、次の反応に直接に使用した。LC-MS (方法1): R_t = 1.22 min; m/z (ES⁺) = 472.4 (M+H)⁺。

合成工程6
化合物72（190mg、0.38mmol）及びKI-3（140mg、0.41mmol）をDCM（8mL）に溶解し、0
℃に冷却した。混合物にTEA（115mg、1.14mmol）及びDEPC（80mg、0.49mmol）を順次に加えた。反応液を室温で18時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 40：1）で精製して淡黄色固体6（200mg）を得た。LC-MS (方法1): R_t = 1.36 min; m/z (ES⁺) = 774.5 (M+H)⁺。

実施例5
化合物7の合成

合成工程１
化合物KI-4（200mg、0.48mmol）及びビス（p-ニトロベンゼン）カーボネート（298mg、0.96mmol）をDCM（5mL）に溶解し、次いでDIEA（124mg、11mmol）を加えた。反応液を室
温で18時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 25：1）で精製して淡黄色固体73（200mg）を得た。LC-MS (方法2): R_t= 2.28 min; m/z (ES⁺) = 586.3 (M+H)⁺。

合成工程2
化合物73（200mg、0.34mmol）をジクロロメタン（6mL）に溶解し、1-メチルピペラジン（38mg、0.38mmol）及びDIEA（49mg、0.38mmol）を順次に添加した。反応液を室温で18時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物を分取RP-HPLC（方法3：8分間で40％〜60％
B→95％ B; R_tが4.2〜5.1分間）により精製して、白色固体74（135mg）を得た。LC-MS
(方法2): R_t = 2.01 min; m/z (ES⁺) = 547.3 (M+H)⁺。

合成工程3
化合物74（135mg）をDCM（6mL）/TFA（3mL）の混合溶液に加えた。反応液を室温で18時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去して淡黄色油状液体75（112mg）を得た、これを次の反応
に直接に使用した。

合成工程4
化合物75（112mg、0.25mmol）とKI-6（159mg、0.25mmol）をDCM（5mL）に溶解し、TEA
（25mg、0.25mmol）及びDEPC（41mg、0.25mmol）を順次に添加した。反応液を室温で18時間撹拌し、DCM（25mL）を加えて希釈し、水及び飽和塩化ナトリウム溶液で順次に洗浄し
、乾燥し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DEM/MeOH 20：1）で精製して白色固体76（210mg）を得た。LC-MS (方法1): Rt = 1.80 min; m/z (ES+) = 534.0 [1/2(M+2H)]⁺。

合成工程5
化合物76（86mg、0.081mmol）をDEA（1mL）/DCM（3mL）の混合溶液に添加し、反応液を室温で16時間撹拌した。濃縮して溶媒を除去し、残留物を分取RP-HPLC(方法4:８分間で40%〜60% B→95% B; R_t:5.1〜5.8分間)により精製して、白色固体7（40mg）を得た。LC-MS (方法2): R_t = 1.97 min; m/z (ES⁺) = 844.5 (M+H)⁺。

実施例6
化合物8の合成

合成工程１
化合物Fmoc-MMAE（220mg、0.23mmol）とビス（p-ニトロベンゼン）カーボネート（142mg、0.46mmol）をDCM（20mL）に溶解し、DIEA（91mg、0.70mmol）を加えた。反応液を室温
で18時間撹拌し、ビス（p-ニトロベンゼン）カーボネート（142mg）を補充して添加した
。濃縮して溶媒を除去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（EtOAc/PE 4：1）で精製して、白色固体77（200mg）を得た。LC-MS (方法1): R_t= 2.41 min; m/z (ES⁺)
N/A (M+H)⁺。

合成工程2
化合物77（70mg、0.063mmol）をDCM（6mL）に溶解し、続いてモルホリン（0.5mL）とDIEA（16mg、0.13mmol）を加えた。反応液を室温で21時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物を分取RP-HPLC（方法3：8分間で30％〜50％ B→95％ B; R_tが9〜9.8分間）に
より精製して、白色固体8（26 mg）を得た。LC-MS (方法1): R_t = 1.52 min; m/z (ES⁺) = 831.5 (M+H)⁺。

実施例7
化合物9〜16の合成
化合物9〜16の合成は、化合物8と類似した合成工程を用い、LC-MS特性データを表2に示す。

実施例8
化合物17の合成

合成工程１
化合物KI-7（80mg、0.12mmol）をDCM（6mL）に溶解した後、0℃に冷却し、DIEA（44mg
、0.35mmol）、KI-3（41mg、0.13mmol）及びDEPC（28ｍｇ、0.17mmol）を加えた。反応液を室温で4時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去し、粗生成物78を次の反応に直接に使用した
。LC-MS (方法1): R_t = 1.95 min; m/z (ES⁺) = 995.6 (M+H)⁺。

合成工程2
合成工程１で得られた化合物7８の粗生成物にDEA(0.5mL)和DCM(1mL)を加えた。反応液を室温下一晩攪拌し、濃縮して溶媒を除去し、残留物を分取RP-HPLC(方法4:8分間で35%〜60% B→95% B; Rt:4.5〜5.5分間)により精製して、白色固体17（60 mg）を得た。 LC-MS (方法1): R_t = 1.49 min; m/z (ES⁺) = 773.5 (M+H)⁺。

実施例9
化合物18の合成

合成工程１
化合物KI-8（287mg、0.41mmol）とKI-3（130mg、0.41mmol）をDCM（10mL）に溶解した
後、0℃に冷却し、TEA（207mg、20.5mmol）及びDEPC（87ｍｇ、0.53mmol）を順次に加え
た。反応液を室温で一晩攪拌した。有機相を順次に水（10mL×2）で洗浄し、乾燥し、濃
縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 30：1）で精製して
、白色固体79（200mg）を得た。

合成工程2
化合物79（200mg、0.20mmol）をDCM（3mL）/DEA（0.5mL）混合溶液に加えた。反応液を室温下一晩攪拌し、濃縮して溶媒を除去し、残留物を分取RP-HPLC(方法4:８分間で30%〜45% B→95% B; R_t:5.0〜6.0分間)により精製して、白色固体（110 mg）を得た。LC-MS (方法1): R_t = 1.40 min; m/z (ES⁺) = 787.5 (M+H)⁺。

実施例10
化合物19〜21の合成

合成原料80b（WO2013/072813）及び80c（WO2007/008848）は、文献に報告された方法（軽微な変更）に従って合成される。

化合物21の合成
合成工程１
化合物80c（210mg、1.11mmol）及びKI-2（351mg、1.22mmol）をDCM（20mL）に溶解し、0℃に冷却した。溶液にTEA（336mg、3.33mmol）及びDEPC（235mg、1.44mmol）を順次に加えた。反応液を室温で18時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 10：1）で精製して淡黄色固体81c（150mg）を得た。LC-MS (方法1): R_t = 1.89 min; m/z (ES⁺) = 459.3 (M+H)⁺。

合成工程2
化合物81c（150mg）をDCM（2mL）に溶解し、溶液を0℃に冷却した。TFA（1mL）を加え
、反応液を10℃で3時間撹拌した。濃縮して溶媒を除去して、粗生成物82c（TFA塩、120mg）を得、これを次の反応に直接に使用した。LC-MS (方法1): R_t = 1.21 min; m/z (ES⁺) = 359.2 (M+H)⁺。

合成工程3
化合物82c（120mg、0.335mmol）及び化合物KI-7（231mg、0.335mmol）をDCM（10mL）に溶解した。溶液を0℃に冷却し、DIEA（216mg、1.68mmol）及びDEPC（71mg、0.435mmol）
を順次に添加した。反応液を室温で18時間撹拌した。有機相を順次に水で洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 40：1〜15：1）で精製して、淡黄色油状物83c（400mg）を得た。LC-MS (方法1): R_t= 2.12 min; m/z (ES⁺) = 517.5 [1/2(M+2H)]⁺。

合成工程4
化合物83c（400mg、0.387mmol）をDCM（1.5mL）に溶解し、次いでDEA（0.5mL）を添加
した。反応液を室温で18時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物を分取RP-HPLC（
方法4：8分間で35％〜65％B→４分間で95％B; R_t：4.0〜5.0分間）で精製して白色固体21（65mg）を得た。LC-MS (方法1): R_t= 1.81min; m/z (ES⁺) = 811.6 (M+H)⁺。

化合物20〜21の合成は、化合物19の合成と類似した合成工程をとる。 LC-MSの特性データを表3に示す。

実施例11
化合物22の合成

合成工程１
化合物KI-7（166mg、0.24mmol）及びKI-5（103mg、0.27mmol）をDCM（10mL）に溶解し
、0℃に冷却し、DIEA（93mg、0.72mmol）及びDEPC（60ｍg、0.36mmol）を加えた。反応
液を室温で4時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。粗生成物を次の反応に直接に使用す
る。LC-MS (方法 1): R_t = 2.09 min; m/z (ES⁺) = 1065.7 (M+H)⁺。

合成工程2
化合物84の粗生成物にDCM（3mL）及びDEA（1mL）を添加し、反応液を室温で一晩撹拌した。濃縮して溶媒を除去し、残留物を分取RP-HPLC（方法4：8分で40％〜70％B→4分で95
％B; R_t：7.3〜8.3分間）で精製して、白色固体85（60mg）をを得た。LC-MS (方法 1): R_t = 1.66 min; m/z (ES⁺) = 843.6 (M+H)⁺。

合成工程3
化合物85（8mg）をDCM（0.6mL）に溶解し、次いで溶液を0℃に冷却し、TFA(0.2mL)を加えた。反応液を10℃で3時間攪拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物を分取RP-HPLC（方法3：8分間で20％〜30％B→4分間で95％B; R_t：8.2〜9.0分間）で精製して、白色固体22
（5mg）を得た。LC-MS (方法 1): R_t= 1.36 min; m/z (ES⁺) = 787.5 (M+H)⁺。

実施例12
化合物23の合成

合成工程１
化合物KI-8（314mg、0.45mmol）及びKI-5（173mg、0.45mmol）をDCM（10mL）に溶解し
、0℃に冷却し、次いでTEA（135mg、1.34mmol）及びDEPC（94ｍg、0.58mmol）を順次に添加した。反応液を室温で一晩撹拌し、順次に水で洗浄し、乾燥し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 30：1）で精製して、白色固体86（200mg）を得た。

合成工程2
化合物86（400mg、0.37mmol）をDCM（3mL）/DEA（1mL）に溶解し、反応液を室温で一晩撹拌した。濃縮して溶媒を除去し、残留物を分取RP-HPLC（方法3：8分間で33％〜58％B→4分間で95％B; R_t：7.5〜9.5分間）で精製して、白色固体87（240mg）を得た。LC-MS (方法 1): R_t = 1.51 min; m/z (ES⁺), 857.5 (M+H)⁺。

合成工程3
化合物87（10mg、0.012mmol）をDCM（0.6mL）に溶解し、次いで溶液を0℃に冷却し、TFA（0.2mL）を添加した。反応液を10℃で2.5時間攪拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留
物を分取RP-HPLC（方法3：8.2分間で20％〜30％B、4分間で95％B、R_t：7.7〜8.8分間）で精製して、白色固体23（5mg）を得た。LC-MS (方法 1): R_t = 1.36 min; m/z (ES⁺) = 801.5 (M+H)⁺。

実施例13
化合物24〜30の合成

合成工程1：アミノ酸t-ブチルエステルの合成
化合物89aの合成
化合物88a（500mg、2.5mmol）を酢酸t-ブチル（5mL）に溶解し、0℃に冷却した。溶液
に過塩素酸（21mL、3.76mmol）を徐々に加えた。反応液を室温で12時間撹拌した。有機
相を水（10mL）と1.0M塩酸（15mL）で洗浄し、合わせた水相を10％炭酸カリウム溶液でpH9に調整し、次いでDCM（20mL×3）で抽出した。合わせた有機相を乾燥し、濃縮し、残留
物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（EtOAc/PE 1：5）で精製して、無色油状物89a（430mg）を得た。LC-MS (方法 1): R_t = 1.57 min; m/z (ES⁺), 256.1 (M+H)⁺。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 8.61 (s, 2 H), 7.47 (d, 1 H), 7.38-7.32 (m, 3 H), 4.15 (m,
1 H), 3.21 (m, 2 H), 1.22 (s, 9 H)。

化合物89bの合成
化合物88b（500mg、2.5mmol）から89aの合成と類似した反応工程により、無色油状物89b（42mg）を得た。LC-MS (方法 2): R_t= 1.65 min; m/z (ES⁺), 229.2 (M+H)⁺ 。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 9.11 (s, 1 H), 8.40 (s, 2 H), 7.56 (s, 1 H), 4.27 (s, 1 H), 3.32 - 3.19 (m, 2 H), 1.32 (s, 9 H)。

化合物89cの合成
化合物88c（1.0g、6.71mmol）を酢酸t-ブチル（6mL）に溶解し、0℃に冷却した。溶液
に過塩素酸（0.81mL、10.1mmol）を徐々に加えた。反応液を室温で18時間撹拌した。白色沈殿物をろ別し、酢酸エチルで洗浄した。ろ液を濃縮して、無色油状物89c（130mg）を得、次の反応に直接に使用した。LC-MS (方法 1): R_t = 1.17 min; m/z (ES⁺) = 206.1 (M+H)⁺。

化合物89dの合成
化合物88d（塩酸塩、500mg、2.32mmol）から89aの合成と類似した反応工程により、無
色油状物89d（340mg）を得た。 LC-MS (方法 1): R_t = 1.82 min; m/z (ES⁺) = 236.2 (M+H)⁺。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 8.36 (s, 1 H), 7.33-7.25 (m, 3 H), 7.17 (d, 2 H
), 3.70 (s, 1 H), 3.22 (m, 1 H), 2.85 (m, 1 H), 2.60-2.55 (m, 2 H), 1.42 (s, 9 H)。

化合物89eの合成
化合物88e（260mg、1.45mmol）から89a合成と類似した反応工程により、89e（83mg）を得た。LC-MS (方法 1): R_t= 1.62 min; m/z (ES⁺) = 236.2 (M+H)⁺ 。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 8.08 (s, 2 H), 7.30-7.19 (m, 3 H), 7.14 (d, 2 H), 3.06-2.96 (m, 4 H), 2.87 (dd, 1 H), 1.37 (s, 9 H)。

化合物89fの合成
化合物88f（塩酸塩、500mg、2.18mmol）から89aの合成と類似した反応工程により、無
色油状物89f（320mg）を得た。LC-MS (方法 1): R_t = 1.88 min; m/z (ES⁺) = 250.2 (M+H)⁺。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 8.03 (s, 2 H), 7.34-7.27 (m, 2 H), 7.21-7.20 (m, 3 H), 3.46 (m, 1 H), 2.75-2.60 (m, 4 H), 1.83 (m, 2 H), 1.41 (s, 9 H)。

化合物89gの合成
文献（Tetrahedron 2005、61、11132〜11140）に報告された方法を参照して合成した。LC-MS (方法1): R_t = 1.66 min; m/z (ES⁺) = 236.2 (M+H)⁺。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ7.33 - 7.20 (m, 5H), 3.93 (dd, 1 H), 3.38 (dd, 1 H), 3.16 (dd, 1 H), 2.72 (s, 3 H), 1.30 (s, 9 H)。

化合物24の合成
合成工程2
化合物89a（235mg、0.92mmol）とKI-2（220mg、0.77mmol）をDCM（4mL）に溶解し、次
いでDIEA（267μL、1.53mmol）とDEPC（134μL、0.92mmol）を順次に添加した。反応液を室温で18時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 4：1）で精製して、化合物90a（276mg）を得た。LC-MS (方法 2): R_t=
2.36 min; m/z (ES⁺) = 525.3 (M+H)⁺。

合成工程3
化合物90a（276mg、0.53mmol）をDCMに溶解し、0℃に冷却した。TFA（1mL、25当量）を加え、反応液を室温で3時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物を飽和炭酸水素ナ
トリウム溶液で中和し、次いでDCM（20mL×3）で抽出した。合わせた有機相を乾燥させ、濃縮して粗生成物91a（115mg）を得、次の反応に直接に使用した。LC-MS (方法 2): R_t =
1.96 min; m/z (ES⁺) = 425.3 (M+H)⁺ 。

合成工程4
化合物91a（100mg、0.24mmol）とKI-7（163mg、0.24mmol）をDCM（4mL）に溶解し、次
いでDIEA（82μL、0.47mmol）とDEPC（41μL、0.28mmol）を順次に添加した。反応液を室温で一晩撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 50：1）で精製して、化合物92a（163mg）を得た。LC-MS (方法 1): R_t = 2.21 min; m/z (ES⁺) = 519.4 (M+H)⁺。

合成工程5
化合物92a（163mg、0.15mmol）をDEA（1mL）/DCM（3mL）の混合溶液に添加した。反応
液を室温で一晩撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH/NH₃・H₂O 15：1：0.1）で精製して、化合物93a（84mg）を得た。 LC-MS (方法 2): R_t= 2.35 min; m/z (ES⁺) = 877.5 (M+H)⁺。

合成工程6
化合物93a（2.0mg、0.0023mmol）をDCM（0.4mL）に溶解し、続いてTFA（0.2mL）を加えた。反応液を室温で2時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物を分取RP-HPLC（方法3：8分間で15％〜60％B→4分間で95％B; Rt：9.6分間）で精製して、純粋品24を得た。LC-MS (方法 1):R_t= 1.56 min; m/z (ES⁺) = 821.3 (M+H)⁺。

化合物25〜30の合成
化合物25〜30の合成は、化合物24の合成と類似した合成工程を用い、LC-MS特性データ
を表4に示す。

実施例14
化合物31〜46の合成

合成工程１：化合物94a-oの合成
化合物94aの合成
化合物N-Boc-L-フェニルアラニン（155mg、0.58mmol）とO-メチルヒドロキシルアミン
塩酸塩（98mg、1.17mmol）をDCM（2mL）に溶解し、次いでTEA（235mg 、2.32mmol）とDEPC（114mg、0.70mmol）を徐々に加えた。反応液を室温で一晩攪拌した。濃縮して溶媒を除去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 50：1）で精製して、白色固体94a (133 mg)を得た。LC-MS (方法 2): R_t = 1.83 min; m/z (ES⁺) = 317.0 (M+Na)⁺。

化合物94ｂの合成
94aと類似した合成工程を用いて、白色固体94bを得た。LC-MS (方法2): R_t = 1.89 min; m/z (ES⁺) = 331.2 (M+Na)⁺。

化合物94cの合成
94aと類似した合成工程を用いて、白色固体94ｃを得た。LC-MS (方法 2): R_t= 2.06 min; m/z (ES⁺) = 393.0 (M+Na)⁺。

化合物94eの合成
化合物N-Boc-L-フェニルアラニン（200mg、0.75mmol）をTHF（2mL）に溶解し、-10℃に冷却し、次いでN-メチルモルホリン（83mg、0.82mmol）及びクロロギ酸メチル（77mg、0.82mmol）を加えた。反応液を20分間撹拌し、エチルアミン（33％水溶液、307mg、2.25mmol）を添加した。反応液を室温で一晩撹拌し、次いで濃縮して溶媒を除去した。残留物を
シリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 50：1）で精製して、白色固体94e（217mg）を得た。LC-MS (方法 2): R_t = 1.92 min; m/z (ES⁺) = 315.3 (M+Na)⁺。

化合物94fの合成
化合物N-Boc-L-フェニルアラニン（265mg、1mmol）をTHF（4mL）に溶解し、-20℃に冷
却し、次いでN-メチルモルホリン（101mg、1mmol）とクロロギ酸イソブチル（137mg、1mmol）を順次に加えた。反応液を3分間撹拌した後、メチルアミン（30％水溶液、220μL、1.3mmol）を添加した。反応液を1時間続いて撹拌し、次いで5％炭酸水素ナトリウム溶液
（4ml）を添加した。室温で30分間撹拌した後、DCM（20mL×3）で抽出した。合わせた有
機相を飽和食塩水で洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 2：1）で精製して、94f（173mg）を得た。LC-MS (方法 2): R_t= 1.85 min; m/z (ES⁺) = 179.2 (M+H-100)⁺。

化合物94gの合成
化合物N-Boc-L-フェニルアラニン（150mg、0.57mmol）、t-ブチルアミン（42mg、0.57mmol）及びTEA（115mg、1.14mmol）をTHF（5mL）に溶解した。溶液を0℃に冷却し、次いでBOP試薬（328mg、0.74mmol）を添加した。反応液を0℃で2時間撹拌し、次いで室温まで昇温させて一晩攪拌した。反応を水でクエンチし、濃縮して揮発性溶媒を除去した。水相をEtOAc（20mL×3）で抽出した。合わせた有機相を飽和食塩水で洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（PE/EtOAc 3：1）で精製して、94g（137mg）を得た。LC-MS (方法 2): R_t= 2.10 min; m/z (ES⁺) = 321.3 (M+H)⁺。

化合物94ｈの合成
94aと類似した合成工程を用いて、白色固体94ｈを得た。LC-MS (方法 2): R_t= 1.99 min; m/z (ES⁺) = 329.3 (M+Na)⁺。

化合物94iの合成
94aと類似した合成工程を用いて、白色固体94iを得た。LC-MS (方法 2): R_t= 2.11 min; m/z (ES⁺) = 321.3 (M+H)⁺。

化合物94jの合成
化合物N-Boc-L-フェニルアラニン（350mg、1.32mmol）とN-ヒドロキシスクシンイミド
（182mg、1.58mmol）をTHF（8mL）に溶解し、溶液を0℃に冷却し、次いでDCC（326mg、1.58mmol）を添加した。反応液を0℃で30分間撹拌し、次いで室温に昇温させて6時間攪拌した。ろ過により固体を除去し、ろ液を0℃に冷却し、次いでジメチルアミン水溶液（33％
、4.9mL、31.7mmol）を添加した。反応液を0℃で30分間撹拌し、次いで室温に昇温させて一晩攪拌した。濃縮して揮発性溶媒を除去し、水相を酢酸エチルで抽出した。有機相を5
％クエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、及び飽和食塩水で順次に洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（EtOAc/PE 1：4）で精製して94jを得た。LC-MS (方法 2): R_t= 1.96 min; m/z (ES⁺) = 293.2 (M+H)⁺。

化合物94kの合成
化合物N-Boc-L-フェニルアラニン（159mg、0.60mmol）をDMF（5mL）に溶解し、0℃に冷却した。溶液に化合物931（150mg、1.20mmol、合成参考文献J. Chem. Soc. 1942,432）、HOBt（122mg、0.90mmol）、EDCI（138mg、0.72mmol）及びDIEA（314μL、1.80mmol）を加えた。反応液を室温まで昇温させて24時間撹拌し、半飽和塩化アンモニウム水溶液とEtOAcの混合溶液に注いだ。有機相を分離した後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び飽和塩化
ナトリウム溶液で順次に洗浄し、乾燥し、濃縮して、94k（167mg）を得た。LC-MS (方法 1): R_t = 1.95 min; m/z (ES⁺) = 357.2 (M+Na)⁺。

化合物94ｌの合成
化合物N-Boc-L-フェニルアラニン（187mg、0.71mmol）をDMF（5mL）に溶解し、0℃に冷却した。溶液に2-（2-（2-アミノエトキシ）エトキシ）エタノール（150mg、0.78mmol）
、HOBt（95mg、0.71mmol）及びEDCI（135mg、0.71mmol）を順次に加えた。反応液を室温
まで昇温させて24時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物を酢酸エチルに溶解し、
次いで水、1N塩酸、1N水酸化ナトリウム溶液、飽和食塩水で順次に洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 50：1）で精製して、化合物94ｌ（278mg）を得た。LC-MS (方法 1 ): R_t= 1.67 min; m/z (ES⁺) = 441.3 (M+H)⁺。

化合物94mの合成
化合物N-Boc-L-フェニルアラニン（99mg、0.42mmol）をDMF（3mL）に溶解し、0℃に冷
却した。溶液に14-アミノ-3,6,9,12-テトラオキサテトラデカノール（100mg、0.38mmol）、HOBt（51mg、0.38mmol）及びEDCI（73mg、0.38mmol）を順次に加えた。反応液を室温まで昇温させて24時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物を酢酸エチルに溶解し、水、1N塩酸、1N水酸化ナトリウム溶液、及び飽和塩化ナトリウム溶液で順次に洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 30：1）で精製して、化合物94ｍ（215mg）を得た。LC-MS (方法 1): R_t= 1.39 min; m/z (ES⁺) = 485.3
(M+H)⁺。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 8.49 (t, 1 H), 8.20 (s, 2 H), 7.33-7.23 (m, 5 H), 3.97 (m, 1 H), 3.52-3.27 (m, 20 H), 3.17-3.15 (m, 1 H), 3.01-2.98 (m, 2 H)。

化合物94nの合成
化合物N-Boc-L-フェニルアラニン（80mg、0.28mmol）をDMF（3mL）に溶解し、0℃に冷
却した。溶液に17-アミノ-3,6,9,12,15-ペンタオキサヘプタデカサノール（68mg、0.26mmol）、HOBt(35mg、0.26mmol)及びEDCI(50mg、0.26mmol)を順次に添加した。反応液を室温まで昇温させて24時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物を酢酸エチルに溶解し、水、1N塩酸、1N水酸化ナトリウム溶液、及び飽和塩化ナトリウム溶液で順次に洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 30：1）で精製して、化合物94n（90mg）を得た。LC-MS (方法 1): R_t= 1.40 min; m/z (ES⁺) = 529.3
(M+H)⁺。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.30-7.20 (m, 5 H), 4.36 (br s, 1 H), 3.75-3.40 (m, 21 H), 3.25-2.90 (m, 6 H), 1.39 (s, 9 H)。

化合物94oの合成
化合物N-Boc-L-フェニルアラニン（44 mg、0.17 mmol）をDMF（3mL）に溶解し、0℃に
冷却した。溶液に2-（2-（2-メトキシエトキシ）エトキシ）エチル-1-アミン（30mg、0.17mmol）、HOBt（23mg、0.17mmol）及びEDCI（32mg、0.17mmol）を順次に加えた。反応液
を室温まで昇温させて24時間撹拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物を酢酸エチルに溶解し、水、1N塩酸、1N水酸化ナトリウム溶液、及び飽和塩化ナトリウム溶液で順次に洗浄し、乾燥し、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 50：1）で精製して、化合物94o（59mg）を得た。LC-MS (方法 2): R_t = 1.90 min; m/z (ES⁺) = 411.3 (M+H)⁺。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 7.96 (t, 1 H), 7.30-7.23 (m, 4 H), 7.19 (m, 1 H), 6.87 (d, 1 H), 4.12 (m, 1 H), 3.50 (m, 6 H), 3.44-3.39 (m, 4 H), 3.26-3.16 (m, 5 H), 2.92 (dd, 1 H), 2.71 (dd, 1 H), 1.29 (s, 9 H)。

化合物43の合成
合成工程2
化合物94l（278mg、0.63mmol）をDCM（5mL）に溶解し、溶液を0℃に冷却した。TFA（1.2mL、16mmol）を加え、反応液を室温で3時間撹拌した。濃縮して溶媒を除去し、残留物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で中和し、次いでDCM（20mL×3）で抽出した。合わせた有機相を乾燥し、濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH 20：1）で精製して、95l（158mg）を得た。LC-MS (方法 1): R_t= 0.98 min; m/z (ES⁺) = 341.1 (M+H)⁺。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 7.91 (t, 1H), 7.27-7.19 (m, 5H), 4.61 (s, 1H), 3.50 -3.47 (m, 10H), 3.41 - 3.34 (m, 5H), 3.25-3.16 (m, 2H), 2.91 (dd, 1H), 2.60 (dd, 1H), 1.71 (br s, 2H)。

合成工程3
化合物95ｌ（35mg、0.10mmol）及びKI-2（27mg、0.092mmol）をDCM（2mL）に溶解し、
次いでDIEA（33μL、0.18mmol）及びDEPC（16μL、0.11mmol）を順次に添加した。反応液を室温で一晩攪拌した。DCM(20mL)を添加し、溶液を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、
水相をDCM（20mL×2）で抽出し、合わせた有機相を乾燥させ、濃縮して粗生成物96l（83mg）を得、次の反応に直接に使用した。LC-MS (方法 1): R_t = 1.47 min; m/z (ES⁺) = 610.4 (M+H)⁺。

合成工程4
化合物96ｌ（83mg、0.14mmol）をDCM（3mL）に溶解し、溶液を0℃に冷却した。TFA（0.30 mL、4.1 mmol）を加え、反応液を室温で3時間撹拌した。濃縮して溶媒を除去し、残留物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で中和し、次いでDCM（20mL×3）で抽出した。合わせた有機相を乾燥し、濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH/NH₃・H₂O 10:1:0.1）で精製して、97l（43mg）を得た。LC-MS (方法 1): R_t= 1.08 min; m/z
(ES⁺) = 510.4 (M+H)⁺。

合成工程5
化合物97l（43mg、0.084mmol）とKI-7（58mg、0.084 mmol）をDCM（4mL）に溶解し、次いでDIEA（30μL、0.17mmol）とDEPC（15μL、0.10mmol）を順次に添加した。反応液を室温下で一晩攪拌し、飽和塩化ナトリウム溶液（30ml）を加え、DCMで抽出した(20mL×3)。合わせた有機相を乾燥させ、濃縮して粗生成物98l（70mg）を得、次の反応に直接に使用
した。LC-MS (方法 1): R_t = 1.63 min; m/z (ES⁺) = 1184.6 (M+H)⁺。

合成工程6
化合物98l(75mg、0.059mmol)にDCM（3mL）及びDEA（3mL）を添加し、反応液を室温で一晩撹拌した。濃縮して溶媒を除去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（DCM/MeOH/NH₃・H₂O 10:1:0.1）で精製して、42（35mg）を得た。LC-MS (方法 2): R_t = 1.63 min; m/z (ES⁺) = 962.5 (M+H)⁺。

化合物31〜41、43〜45の合成
化合物94a-k、94m-oから開始して、化合物４２と類似した合成方法を用いて、化合物31〜41、43〜45を得た。LC-MSの特性データを表５に示す。

実施例15
リンカー-薬物vc-17の合成

ピリジン（0.6mL）/DMF（3mL）の混合溶液に化合物MC-Val-Cit-PABA-PNP（43mg）、17
（30mg）及びHOBt（1mg）を加え、反応物を室温で24時間攪拌した。生成物を分取RP-HPLC（方法3：8分間で35％〜55％B→4分間で95％B; R_t：6.2〜7.0分間）により精製して、白
色固体vc-17（22mg）を得た。LC-MS (方法 1): R_t = 1.61 min; m/z (ES⁺) = 686.5 [1/2(M+2H)]⁺。

実施例16
他のリンカー-薬物vc-薬物の合成はvc-17と類似した合成工程を用い、LC-MS特性データは表６を参照する。

実施例17
リンカー-薬物vc-22の合成

合成工程１
ピリジン（0.6mL）/DMF（3mL）の混合溶液に化合物MC-Val-Cit-PABA-PNP（39mg）、85
（30mg）及びHOBt（1mg）を加え、反応液を室温で24時間攪拌した。生成物を分取RP-HPLC（方法3：8分間で40％〜70％B→4分間で95％B; Rt：7.4〜8.4分間）により精製して白色
固体vc-85（30mg）を得た。LC-MS (方法 1): R_t = 1.72 min; m/z (ES⁺) = 721.3 [1/2(M
+2H)]⁺。

合成工程2
化合物vc-85（30mg）をDCM（2mL）に溶解し、0℃に冷却し、次いでTFA（1mL）を添加した。反応液を10℃で4時間攪拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物を分取RP-HPLC（方
法3：8分間で37％〜65％B→4分間で95％B; Rt：5.0〜6.0分間）で精製してvc-22（18mg）を得た。 LC-MS (方法 1): R_t = 1.66 min; m/z (ES⁺) = 693.5 [1/2(M+2H)]⁺。

実施例18
他のリンカー-薬物vc-薬物の合成はMC-vc-17と類似した合成工程を用い、LC-MS特性デ
ータは表7を参照する。

実施例19
リンカー-薬物MC-22の合成

合成工程１
化合物MC（10mg）と85（30mg）をDCM（5mL）に溶解し、次いでDIEA（14mg）とHATU（27mg）を順序に添加した。生成物を分取RP-HPLC（方法3：8分間で40％〜70％B→4分間で95
％B; Rt：7.4〜8.6分間）により精製して、白色固体MC-85（30mg）を得た。LC-MS (方法 1): R_t = 1.75 min; m/z (ES⁺) = 1036.5 (M+H)⁺。

合成工程2
化合物MC-85（30mg）をDCM（2mL）に溶解し、0℃に冷却し、次いでTFA（1mL）を添加した。反応液を10℃で4時間攪拌し、濃縮して溶媒を除去した。残留物を分取RP-HPLC（方法3：8分間で35％〜60％B→4分間で95％B; Rt：5.5〜6.5分間）で精製してMC-22（20mg）を得た。LC-MS (方法 1): R_t = 1.68 min; m/z (ES⁺) = 980.5 (M+H)⁺。

実施例20
他のリンカー-薬物MC-薬物の合成はMC-22と類似した合成工程を用い、LC-MS特性データは表8を参照する。

実施例21
抗体薬物複合体の合成は、一般的な工程Ｊにより提供された複合方法を採用した、得られた抗体薬物複合体の平均DARは約4である。得られた抗体薬物複合体の細胞増殖障害試験（一般的な工程L）の結果を表9、表10に示した。

その結果、ある抗体薬物複合体は高い細胞増殖阻害活性を有し、それらの利用されたドラスタチン１０誘導体はさらなる開発と応用が期待される。

各文献が独立に引用されて参照になるように、本発明で言及された全ての文献は、参照により本明細書に引用される。当業者であれば、本発明の教示を読んだ後に本発明に対して様々な変更や修正を行うことができ、これらの等価形態も本明細書に添付された特許請求の範囲に含まれることが理解されるべきである。

Claims

式IIIで表される化合物、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその塩の溶媒和物。

ただし、
R₁、R₂、R₃、R₄はH、-C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれる；
ｍ、ｎはそれぞれ2〜４の範囲から選ばれる整数である；
R₅、R₆、R₈はH、-C₁-C₈アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれる；
R₇、R₁₁、R₁₂はH、-C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれる；
R₉、R₁₀はH、-OH、-C₁〜C₈アルキル、又は-O-(C₁〜C₈アルキル)からなる群より選ばれる；
R₁₃、R₁₄はH、-OH、-OR₁₆、-C₁〜C₈アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれる；
R₁₆はH、-C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれる；
Pは１〜８の範囲から選ばれる整数である；
R₁₅は-C₃〜C₈アルキル、アリール、-C₃〜C₈ヘテロ環基、-COOH、-C(=O)NR₁₇R₁₈からなる群より選ばれる；
R₁₇, R₁₈はH、-C₁〜C₈アルキル、-OH、-OR₁₉からなる群より選ばれ、又はR₁、R₂が連結されて環を形成し、-(CR₂₀R₂₁)_p-Z-(CR₂₂R₂₃)_q-の構造を有し、ただし、R₁₉、R₂₀、R₂₁、R₂₂及びR₂₃はH、-C₁〜C₈アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれ；ZはO、NR₂₄、CR₂₅R₂₆からなる群より選ばれ、ただし、R₂₄、R₂₅及びR₂₆はH、-C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれ；p、qはそれぞれ0〜8から選ばれる整数である。
構造が式IVで表される、請求項１に記載された化合物、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその塩の溶媒和物。

ただし、
ｍ、ｎはそれぞれ2〜４の範囲内から選ばれる整数である；
R₁₂はH、-C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれる；
R₁₃、R₁₄はH、-OH、-OR₁₆、-C₁〜C₈アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれる；
R₁₆はH、-C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれる；
ｐは１〜８の範囲から選ばれる整数である；
R₁₅は-C₃〜C₈アルキル、アリール、-C₃〜C₈ヘテロ環基、-COOH、-C(=O)NR₁₇R₁₈からなる群より選ばれる；
R₁₇, R₁₈はH、-C₁〜C₈アルキル、-OH、-OR₁₉からなる群より選ばれ、又はR₁、R₂が連結されて環を形成し、-(CR₂₀R₂₁)_p-Z-(CR₂₂R₂₃)_q-の構造を有し、ただし、R₁₉、R₂₀、R₂₁、R₂₂及びR₂₃はH、-C₁〜C₈アルキル、アリール、ヘテロ環基、アリールアルキル基、ヘテロアリールアルキルからなる群より選ばれ；ZはO、NR₂₄、CR₂₅R₂₆からなる群より選ばれ、ただし、R₂₄、R₂₅及びR₂₆はH、-C₁〜C₈アルキルからなる群より選ばれ；p、qはそれぞれ0〜8から選ばれる整数である。
化合物の構造が下記式で表される、請求項２に記載された化合物、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその塩の溶媒和物。
請求項１〜３のいずれか一項に記載された化合物、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその塩の溶媒和物及び薬学的に許与される担体を含む医薬組成物。
式Ｖで表される抗体薬物複合体である。

ただし、Lは抗体、抗体断片又はタンパク質であり；Aはリンカー部分であり；Dは上記請求項１〜３のいずれか一項に記載された化合物、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその塩の溶媒和物であり; nは0〜8の範囲内の整数である。
腫瘍、自己免疫疾患及び抗炎症の分野における請求項５に記載された抗体薬物複合体の応用。