JP2019154396A - Nucleic acid detection method, target nucleic acid detection probe used therefor, and target nucleic acid detection device - Google Patents
Nucleic acid detection method, target nucleic acid detection probe used therefor, and target nucleic acid detection device Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019154396A JP2019154396A JP2018049471A JP2018049471A JP2019154396A JP 2019154396 A JP2019154396 A JP 2019154396A JP 2018049471 A JP2018049471 A JP 2018049471A JP 2018049471 A JP2018049471 A JP 2018049471A JP 2019154396 A JP2019154396 A JP 2019154396A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- target nucleic
- acid sequence
- acid detection
- target
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、核酸検出方法、並びに、それに用いる標的核酸検出用プローブ、及び標的核酸検出用デバイスに関する。 The present invention relates to a nucleic acid detection method, a target nucleic acid detection probe used therefor, and a target nucleic acid detection device.
核酸(デオキシリボ核酸(DNA)及びリボ核酸(RNA)の総称)は、様々な生命現象に関わっていることが知られており、特定の塩基配列を有する核酸のコピー数は生命現象を反映していると考えられている。そのため、特定の塩基配列のコピー数を定量解析することにより生体状態を把握することが試みられている。 Nucleic acids (a general term for deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA)) are known to be involved in various life phenomena, and the number of copies of nucleic acids having a specific base sequence reflects life phenomena. It is believed that For this reason, attempts have been made to grasp the biological state by quantitatively analyzing the copy number of a specific base sequence.
例えば、試料に含まれる特定の塩基配列を有する核酸(以下、標的核酸と称することがある)をポリメラーゼ連鎖反応(PCR;Polymerase Chain Reaction)により増幅し、検出することにより、増幅前の標的核酸のコピー数を推定するリアルタイムPCR法が広く行われている。 For example, a nucleic acid having a specific base sequence (hereinafter sometimes referred to as a target nucleic acid) contained in a sample is amplified by polymerase chain reaction (PCR) and detected to detect the target nucleic acid before amplification. A real-time PCR method for estimating the copy number is widely performed.
また、標的核酸の数を定量する方法としては、例えば、標的核酸と相補的な配列と検出ドメインを有するプローブとのハイブリダイゼーションを利用し、酵素不要、核酸増幅不要の標的核酸の数を定量する方法が提案されている(例えば、特許文献1参照)。 In addition, as a method for quantifying the number of target nucleic acids, for example, the number of target nucleic acids that do not require enzyme amplification or nucleic acid amplification is quantified by using hybridization between a sequence complementary to the target nucleic acid and a probe having a detection domain. A method has been proposed (see, for example, Patent Document 1).
本発明は、標的核酸を高精度に検出することができる核酸検出方法を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the nucleic acid detection method which can detect a target nucleic acid with high precision.
課題を解決するための手段としての本発明の核酸検出方法は、
標的核酸を含む核酸試料を、
所定の核酸配列及び人工核酸配列と、標識分子とを有し、基体上に配された標的核酸検出用プローブに付与する標的核酸試料付与工程と、
前記所定の核酸配列及び人工核酸配列が前記標的核酸と完全相補な二本鎖を形成可能な場合に形成される、前記所定の核酸配列及び人工核酸配列と前記標的核酸とによる完全相補な二本鎖に対し、
前記完全相補な二本鎖を特異的に認識し、前記二本鎖におけるDNA鎖を分解する核酸分解酵素を付与して前記完全相補な二本鎖を認識し、前記二本鎖におけるDNA鎖を分解する核酸分解工程と、
前記核酸分解酵素により分解され、前記基体から自由移動可能となった前記標識分子、及び、前記基体上に配された前記標的核酸検出用プローブにおける前記標識分子、のいずれかを検出する検出工程と、を含む。
As a means for solving the problems, the nucleic acid detection method of the present invention comprises:
A nucleic acid sample containing the target nucleic acid,
A target nucleic acid sample providing step for applying to a target nucleic acid detection probe disposed on a substrate, which has a predetermined nucleic acid sequence and an artificial nucleic acid sequence, and a labeled molecule;
Two complete complementary pairs of the predetermined nucleic acid sequence and the artificial nucleic acid sequence and the target nucleic acid, which are formed when the predetermined nucleic acid sequence and the artificial nucleic acid sequence can form a double strand that is completely complementary to the target nucleic acid. Against the chain
Recognize the fully complementary duplex by specifically recognizing the fully complementary duplex, providing a nucleolytic enzyme that degrades the DNA strand in the duplex to recognize the fully complementary duplex, A nucleic acid decomposing step for decomposing,
A detection step of detecting any of the labeled molecule that has been decomposed by the nucleolytic enzyme and is free to move from the substrate, and the labeled molecule in the target nucleic acid detection probe disposed on the substrate; ,including.
本発明によると、標的核酸を高精度に検出することができる核酸検出方法を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a nucleic acid detection method capable of detecting a target nucleic acid with high accuracy.
(核酸検出方法)
本発明の核酸検出方法は、
標的核酸を含む核酸試料を、
所定の核酸配列及び人工核酸配列と、標識分子とを有し、基体上に配された標的核酸検出用プローブに付与する標的核酸試料付与工程と、
前記所定の核酸配列及び人工核酸配列が前記標的核酸と完全相補な二本鎖を形成可能な場合に形成される、前記所定の核酸配列及び人工核酸配列と前記標的核酸とによる完全相補な二本鎖に対し、
前記完全相補な二本鎖を特異的に認識し、前記二本鎖におけるDNA鎖を分解する核酸分解酵素を付与して前記完全相補な二本鎖を認識し、前記二本鎖におけるDNA鎖を分解する核酸分解工程と、
前記核酸分解酵素により分解され、前記基体から自由移動可能となった前記標識分子、及び、前記基体上に配された前記標的核酸検出用プローブにおける前記標識分子、のいずれかを検出する検出工程と、
を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
(Nucleic acid detection method)
The nucleic acid detection method of the present invention comprises:
A nucleic acid sample containing the target nucleic acid,
A target nucleic acid sample providing step for applying to a target nucleic acid detection probe disposed on a substrate, which has a predetermined nucleic acid sequence and an artificial nucleic acid sequence, and a labeled molecule;
Two complete complementary pairs of the predetermined nucleic acid sequence and the artificial nucleic acid sequence and the target nucleic acid, which are formed when the predetermined nucleic acid sequence and the artificial nucleic acid sequence can form a double strand that is completely complementary to the target nucleic acid. Against the chain
Recognize the fully complementary duplex by specifically recognizing the fully complementary duplex, providing a nucleolytic enzyme that degrades the DNA strand in the duplex to recognize the fully complementary duplex, A nucleic acid decomposing step for decomposing,
A detection step of detecting any of the labeled molecule that has been decomposed by the nucleolytic enzyme and is free to move from the substrate, and the labeled molecule in the target nucleic acid detection probe disposed on the substrate; ,
In addition, other steps are included as necessary.
本発明者らは、標的核酸を高精度に検出することができる核酸検出方法について検討したところ、以下の知見を得た。
従来のポリメラーゼ連鎖反応を用いる技術では、増幅効率のわずかな変動や差の蓄積が検出結果に大きく影響してしまうという問題がある。さらに、標的核酸がRNAの場合には、cDNAへの変換が必要となり、定量解析においてはRNAからcDNAへの変換効率を正確に検討する必要があり、元の標的核酸の量を正確に検出することが難しいという問題がある。そのため、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる技術では、標的核酸を高精度に定量できないという問題がある。
さらに、上記特許文献1の技術では、標的核酸と相補的な塩基配列を有するプローブとのハイブリダイゼーションのみを利用して標的核酸を検出しているため、非特異的なハイブリダイゼーションによる誤検出を防ぐことができないという問題がある。そのため、標的核酸を高精度に定量することができないという問題がある。
When the present inventors examined the nucleic acid detection method which can detect a target nucleic acid with high precision, the following knowledge was acquired.
In the conventional technique using the polymerase chain reaction, there is a problem that slight fluctuations in amplification efficiency and accumulation of differences greatly affect the detection result. Furthermore, when the target nucleic acid is RNA, conversion to cDNA is necessary, and in quantitative analysis, it is necessary to accurately examine the conversion efficiency from RNA to cDNA, and the amount of the original target nucleic acid is accurately detected. There is a problem that it is difficult. Therefore, the technique using the polymerase chain reaction has a problem that the target nucleic acid cannot be quantified with high accuracy.
Furthermore, in the technique of the above-mentioned Patent Document 1, since the target nucleic acid is detected only using hybridization with a probe having a base sequence complementary to the target nucleic acid, erroneous detection due to non-specific hybridization is prevented. There is a problem that can not be. Therefore, there is a problem that the target nucleic acid cannot be quantified with high accuracy.
本発明においては、標的核酸と核酸検出用プローブとの完全相補な二本鎖を特異的に認識し、DNA鎖を特異的に分解する核酸分解酵素を用いることにより、核酸検出用プローブと部分的に相補的な所望の標的核酸と二本鎖を形成した場合における誤検出を防止することができるため、標的核酸を高精度に検出することができる。 In the present invention, a nucleic acid detection probe and a partial nucleic acid are partially recognized by using a nucleolytic enzyme that specifically recognizes a completely complementary double strand between a target nucleic acid and a nucleic acid detection probe and specifically degrades a DNA strand. Since it is possible to prevent erroneous detection when a double strand is formed with a desired target nucleic acid complementary to the target nucleic acid, the target nucleic acid can be detected with high accuracy.
なお、本発明において、核酸は、特に説明がない限りDNA、RNAなどを意味する。 In the present invention, the nucleic acid means DNA, RNA or the like unless otherwise specified.
本発明において、標的核酸とは、解析対象とする核酸を意味する。
標的核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲノムDNA、メッセンジャーRNA、マイクロRNA、プラスミドDNA、PCR増幅産物、人工合成した塩基配列などが挙げられる。
In the present invention, the target nucleic acid means a nucleic acid to be analyzed.
The target nucleic acid is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include genomic DNA, messenger RNA, microRNA, plasmid DNA, PCR amplification product, and artificially synthesized base sequence.
<標的核酸試料付与工程>
標的核酸試料付与工程は、標的核酸を含む核酸試料を、所定の核酸配列及び人工核酸配列と、標識分子とを有し、基体上に配された標的核酸検出用プローブに付与する工程であり、標的核酸試料付与手段により好適に実施される。
<Target nucleic acid sample application step>
The target nucleic acid sample applying step is a step of applying a nucleic acid sample containing a target nucleic acid to a target nucleic acid detection probe that has a predetermined nucleic acid sequence and an artificial nucleic acid sequence, and a labeled molecule, and is arranged on a substrate. It is preferably carried out by the target nucleic acid sample applying means.
基体上に配された標的核酸検出用プローブに核酸試料を付与する手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マイクロピペッター、インクジェット装置などが挙げられる。 There is no restriction | limiting in particular as a means to provide a nucleic acid sample to the target nucleic acid detection probe arrange | positioned on the base | substrate, According to the objective, it can select suitably, For example, a micropipette, an inkjet apparatus etc. are mentioned.
−核酸試料−
核酸試料としては、標的核酸を含むものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
核酸試料としては、標的核酸の他に、例えば、水、緩衝剤、塩、界面活性剤、標的核酸以外の核酸などを含有していてもよい。
-Nucleic acid sample-
The nucleic acid sample is not particularly limited as long as it contains the target nucleic acid, and can be appropriately selected according to the purpose.
As a nucleic acid sample, in addition to the target nucleic acid, for example, water, a buffer, a salt, a surfactant, a nucleic acid other than the target nucleic acid, and the like may be contained.
−標的核酸検出用プローブ−
標的核酸検出用プローブは、所定の核酸配列及び人工核酸配列と標識分子を有している。
-Probe for detecting target nucleic acid-
The target nucleic acid detection probe has a predetermined nucleic acid sequence, an artificial nucleic acid sequence, and a label molecule.
−−所定の核酸配列及び人工核酸配列−−
所定の核酸配列及び人工核酸配列は、目的とする標的核酸が有する塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸及び人工核酸のキメラ核酸からなる。
-Predetermined nucleic acid sequence and artificial nucleic acid sequence-
The predetermined nucleic acid sequence and the artificial nucleic acid sequence include a nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence of the target nucleic acid and a chimeric nucleic acid of the artificial nucleic acid.
所定の核酸配列及び人工核酸配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、一本鎖DNA配列と人工核酸配列とを有する配列などが挙げられる。 The predetermined nucleic acid sequence and the artificial nucleic acid sequence are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples thereof include a sequence having a single-stranded DNA sequence and an artificial nucleic acid sequence.
−−−人工核酸配列−−−
人工核酸配列としては、人工核酸からなる塩基配列である。
人工核酸とは、自然界に存在することのない、非天然の核酸であり、人工的に合成した核酸類似体である。
核酸類似体としては、例えば、PNA(Peptide Nucleic Acid)、BNA(Bridged Nucleic Acid)などが挙げられる。BNAとしては、例えば、LNA(Locked Nucleic Acid)などが挙げられる。これらは1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
--- Artificial nucleic acid sequence ---
The artificial nucleic acid sequence is a base sequence composed of an artificial nucleic acid.
An artificial nucleic acid is a non-natural nucleic acid that does not exist in nature, and is an artificially synthesized nucleic acid analog.
Examples of the nucleic acid analog include PNA (Peptide Nucleic Acid) and BNA (Bridged Nucleic Acid). Examples of the BNA include LNA (Locked Nucleic Acid). These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together.
人工核酸の合成方法としては、例えば、公知の核酸の化学合成法(例えば、「化学と教育」57巻7号第346頁−347頁:2009年など参照)である固相合成法などが挙げられる。 Examples of the method for synthesizing an artificial nucleic acid include a solid-phase synthesis method which is a known chemical synthesis method for nucleic acids (for example, see “Chemistry and Education” Vol. 57, No. 7, pages 346 to 347: 2009, etc.). It is done.
人工核酸は、標的核酸となるDNA又はRNAに対する結合親和性が高いことが知られている。また、人工核酸はヌクレアーゼ(核酸分解酵素)耐性を有する。 It is known that an artificial nucleic acid has a high binding affinity for DNA or RNA serving as a target nucleic acid. Artificial nucleic acids have nuclease (nucleolytic enzyme) resistance.
−−標識分子−−
標識分子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光分子、荷電分子、放射性分子などが挙げられる。
--Labeled molecule--
There is no restriction | limiting in particular as a labeled molecule, According to the objective, it can select suitably, For example, a fluorescent molecule, a charged molecule, a radioactive molecule etc. are mentioned.
蛍光分子としては、蛍光を発することができる分子であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光色素、蛍光タンパク質、蛍光標識された核酸分子などが挙げられる。 The fluorescent molecule is not particularly limited as long as it is a molecule that can emit fluorescence, and can be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include fluorescent dyes, fluorescent proteins, and fluorescently labeled nucleic acid molecules.
蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類などが挙げられる。これらのなかでも、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類が好ましい。
蛍光色素としては、市販品を用いることができる。市販品としては、フルオレセイン(FLO)、FITC、FAM、HEX、TET、NED、TAMRA、ROX、VIC(登録商標)、Texas Red、ROX、PET、ABY(登録商標)、JUN(登録商標)、MUSTANG PURPLE(登録商標)、などが挙げられる。これらは1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
The fluorescent dye is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include fluoresceins, azos, rhodamines, coumarins, pyrenes, and cyanines. Of these, fluoresceins, azos, and rhodamines are preferable.
A commercial item can be used as a fluorescent dye. Commercially available products include fluorescein (FLO), FITC, FAM, HEX, TET, NED, TAMRA, ROX, VIC (registered trademark), Texas Red, ROX, PET, ABY (registered trademark), JUN (registered trademark), MUSTANG PURPLE (registered trademark), and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
蛍光タンパク質としては、例えば、GFPなどが挙げられる。 Examples of the fluorescent protein include GFP.
荷電分子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、荷電した核酸などが挙げられる。 There is no restriction | limiting in particular as a charged molecule, According to the objective, it can select suitably, For example, a charged nucleic acid etc. are mentioned.
放射性分子としては、特に制限はなく、分子内に放射性同位体を含有するものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、32Pを取り込んだ標的配列とは非相補的な配列を有する核酸断片、35Sを含有するペプチドなどが挙げられる。 The radioactive molecule is not particularly limited, and is not particularly limited as long as it contains a radioisotope in the molecule, and can be appropriately selected according to the purpose. For example, a target sequence incorporating 32 P Examples thereof include a nucleic acid fragment having a non-complementary sequence and a peptide containing 35 S.
その他の部材としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、結合性分子などが挙げられる。 There is no restriction | limiting in particular as another member, According to the objective, it can select suitably, For example, a binding molecule etc. are mentioned.
結合性分子としては、基体と標的核酸検出用プローブに付与することが可能であり、標的核酸検出用プローブを基体に結合させることができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アビジン、ビオチンなどが挙げられる。
なお、標的核酸検出用プローブを基体に結合させる手段としては、上記の他にも、例えば、標的核酸検出用プローブと基体とをチオール基のジスルフィド結合で結合する結合法などが挙げられる。
The binding molecule can be imparted to the substrate and the target nucleic acid detection probe, and is not particularly limited as long as the target nucleic acid detection probe can be bound to the substrate, and can be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include avidin and biotin.
In addition to the above, the means for binding the target nucleic acid detection probe to the substrate includes, for example, a binding method in which the target nucleic acid detection probe and the substrate are bonded by a disulfide bond of a thiol group.
<核酸分解工程>
核酸分解工程は、所定の核酸配列及び人工核酸配列が標的核酸と完全相補な二本鎖を形成可能な場合に形成される、所定の核酸配列及び人工核酸配列と標的核酸とによる完全相補な二本鎖に対し、完全相補な二本鎖を特異的に認識し分解する核酸分解酵素を付与して完全相補な二本鎖を認識し分解する工程である。
<Nucleic acid degradation process>
The nucleic acid degradation step is a process in which a predetermined nucleic acid sequence and an artificial nucleic acid sequence and a target nucleic acid are completely complementary to each other, which is formed when the predetermined nucleic acid sequence and the artificial nucleic acid sequence can form a double strand that is completely complementary to the target nucleic acid. In this step, a nucleolytic enzyme that specifically recognizes and degrades a completely complementary duplex is added to the strand to recognize and degrade the completely complementary duplex.
核酸分解酵素を付与する手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マイクロピペッター、インクジェット装置などが挙げられる。 There is no restriction | limiting in particular as a means to provide a nucleolytic enzyme, According to the objective, it can select suitably, For example, a micropipetter, an inkjet apparatus, etc. are mentioned.
核酸分解酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖核酸特異的分解酵素などが挙げられる。
二本鎖核酸特異的分解酵素としては、カムチャッカガニの肝臓に由来する二本鎖DNA特異的分解酵素であるDuplex−specific nuclease(商品名:Duplex−specific nuclease,lyophilized、Evrogen社製)などが好ましい。二本鎖核酸特異的分解酵素がDuplex−specific nucleaseであると、完全相補な二本鎖と、一塩基のミスマッチを持つ(不完全相補)二本鎖とを区別して、完全相補な二本鎖のみを分解することができる。また、一本鎖DNA及びRNAには作用せず、二本鎖の核酸を特異的に認識し、二本鎖におけるDNA鎖を分解することが知られている。例えば、DNA−DNAの二本鎖核酸の場合には、二本鎖が分解され、DNA−RNAなどのハイブリッド核酸の場合には、DNA鎖の一本鎖のみが分解される。このため、標的核酸と標的核酸検出用プローブとの間に非特異的なハイブリダイゼーションが生じてしまった場合においても、非特異的なハイブリダイゼーションを生じた二本鎖には作用せず、完全相補な二本鎖のみを検出することができる。
There is no restriction | limiting in particular as a nucleolytic enzyme, According to the objective, it can select suitably, For example, a double stranded nucleic acid specific decomposing enzyme etc. are mentioned.
The double-stranded nucleic acid-specific degrading enzyme is preferably a duplex-specific nuclease (trade name: Duplex-specific nuclease, lyophilized, Evrogen), which is a double-stranded DNA-specific degrading enzyme derived from the liver of Kamchatka crab. . When the double-stranded nucleic acid-specific degrading enzyme is Duplex-specific nuclease, a completely complementary duplex is distinguished from a completely complementary duplex and a duplex having a single base mismatch (incomplete complement). Can only be disassembled. It is also known that double-stranded nucleic acids are specifically recognized and do not act on single-stranded DNA and RNA, and the double-stranded DNA strand is degraded. For example, in the case of a DNA-DNA double-stranded nucleic acid, the double strand is degraded, and in the case of a hybrid nucleic acid such as DNA-RNA, only a single strand of the DNA strand is degraded. For this reason, even if nonspecific hybridization occurs between the target nucleic acid and the target nucleic acid detection probe, it does not act on the double strand that has caused nonspecific hybridization, and is completely complementary. Only double strands can be detected.
<検出工程>
検出工程は、核酸分解酵素により分解され、基体から自由移動可能となった標識分子、及び、基体上に配された標的核酸検出用プローブにおける標識分子、のいずれかを検出する工程であり、検出手段により好適に実施することができる。
<Detection process>
The detection step is a step of detecting either a labeled molecule that has been decomposed by a nucleolytic enzyme and is free to move from the substrate, or a labeled molecule in a target nucleic acid detection probe arranged on the substrate. It can implement suitably by a means.
核酸分解酵素により分解され、基体から自由移動可能となった標識分子を検出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、基体から自由移動可能となった標識分子を回収し、回収した標識分子を検出する方法などが挙げられる。
また、核酸分解酵素により分解され、基体上に配された標的核酸検出用プローブにおける標識分子を検出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、核酸分解工程後に基体を洗浄し、基体上に残存した標識分子を検出する方法などが挙げられる。
There is no particular limitation on the method for detecting a labeled molecule that has been degraded by a nucleolytic enzyme and can be freely moved from the substrate, and can be appropriately selected according to the purpose. For example, it can be freely moved from the substrate. Examples include a method of recovering a labeled molecule and detecting the recovered labeled molecule.
In addition, the method for detecting a labeled molecule in a target nucleic acid detection probe that has been degraded by a nucleolytic enzyme and placed on a substrate is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples include a method of washing the substrate after the step and detecting a labeled molecule remaining on the substrate.
検出手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分光蛍光光度計、電位測定器、放射線測定器などが挙げられる。 There is no restriction | limiting in particular as a detection means, According to the objective, it can select suitably, For example, a spectrofluorimeter, an electric potential measuring device, a radiation measuring device etc. are mentioned.
(標的核酸検出用プローブ)
本発明の標的核酸検出用プローブは、本発明の標的核酸検出方法に用いられる標的核酸検出用プローブであって、所定の核酸配列及び人工核酸配列と、標識分子とを有し、さらに必要に応じてその他の部材を有する。
(Target nucleic acid detection probe)
The target nucleic acid detection probe of the present invention is a target nucleic acid detection probe used in the target nucleic acid detection method of the present invention, and has a predetermined nucleic acid sequence, an artificial nucleic acid sequence, and a labeled molecule, and further if necessary. And other members.
−所定の核酸配列及び人工核酸配列−
所定の核酸配列及び人工核酸配列としては、本発明の標的核酸検出方法に記載のものと同様のものを用いることができるため、その説明を省略する。
-Predetermined nucleic acid sequence and artificial nucleic acid sequence-
As the predetermined nucleic acid sequence and the artificial nucleic acid sequence, those similar to those described in the target nucleic acid detection method of the present invention can be used, and the description thereof is omitted.
−標識分子−
標識分子としては、本発明の標的核酸検出方法に記載のものと同様のものを用いることができるため、その説明を省略する。
-Labeled molecule-
As the labeling molecule, the same as that described in the target nucleic acid detection method of the present invention can be used, and the description thereof is omitted.
−その他の部材−
その他の部材としては、本発明の標的核酸検出方法に記載のものと同様のものを用いることができるため、その説明を省略する。
-Other components-
As other members, the same members as those described in the target nucleic acid detection method of the present invention can be used, and the description thereof is omitted.
(標的核酸検出用デバイス)
本発明の標的核酸検出用デバイスは、本発明の標的核酸検出用プローブを基体上に有し、更に必要に応じてその他の部材を有してなる。
(Target nucleic acid detection device)
The target nucleic acid detection device of the present invention has the target nucleic acid detection probe of the present invention on a substrate, and further includes other members as necessary.
基体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガラス、シリコン、アクリル、石英、ポリカーボネート、ポリスチレンなどが挙げられる。 There is no restriction | limiting in particular as a base | substrate, According to the objective, it can select suitably, For example, glass, a silicon | silicone, an acryl, quartz, a polycarbonate, a polystyrene etc. are mentioned.
基体には、結合性分子が特異的に結合する分子を表面に有していることが好ましい。
結合性分子としては、基体と標的核酸検出用プローブに付与することが可能であり、標的核酸検出用プローブを基体に結合させることができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アビジン、ビオチンなどが挙げられる。
なお、標的核酸検出用プローブを基体に結合させる手段としては、上記の他にも、例えば、標的核酸検出用プローブと基体とをチオール基のジスルフィド結合で結合する結合法などが挙げられる。
The substrate preferably has a molecule on the surface to which the binding molecule specifically binds.
The binding molecule can be imparted to the substrate and the target nucleic acid detection probe, and is not particularly limited as long as the target nucleic acid detection probe can be bound to the substrate, and can be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include avidin and biotin.
In addition to the above, the means for binding the target nucleic acid detection probe to the substrate includes, for example, a binding method in which the target nucleic acid detection probe and the substrate are bonded by a disulfide bond of a thiol group.
その他の部材としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、検出可能な標識分子の情報、並びに標的核酸検出用デバイスが有する標的核酸と相補的な核酸配列及び人工核酸配列の情報を有するバーコード、QRコード(登録商標)、メモリ、ICチップ、Radio Frequency Identifier(以下、「RFID」とも称することがある)、色分け、印刷などが挙げられる。 Other members are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. For example, information on detectable label molecules, a nucleic acid sequence complementary to a target nucleic acid included in a target nucleic acid detection device, and an artificial Examples thereof include barcodes having information on nucleic acid sequences, QR codes (registered trademark), memories, IC chips, radio frequency identifiers (hereinafter also referred to as “RFID”), color coding, printing, and the like.
以下、本発明の標的核酸検出方法について、本発明の標的核酸検出用プローブを有する標的核酸検出用デバイスを用いた実施形態を、図面を参照して詳細に説明する。なお、以下の説明においては、標的核酸としてRNAを用いた場合について説明を行う。 Hereinafter, embodiments of the target nucleic acid detection method of the present invention using a target nucleic acid detection device having the target nucleic acid detection probe of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. In the following description, the case where RNA is used as the target nucleic acid will be described.
<実施形態>
図1から図3は、標的核酸検出用プローブの一例を示す図である。
図1に示すように、標的核酸検出用プローブ10は、標識分子11と、所定の核酸配列12及び人工核酸配列13を有する一本鎖核酸である。また、図2に示すように、標的核酸検出用プローブ10は、標識分子11と逆側の末端に基体15と結合するための、結合性分子14を有していてもよい。結合性分子14を有しているときには、基体15表面に結合性分子14と特異的に結合する分子を備えていることが好ましい。
図3に示すように、基体15上に配される標的核酸検出用プローブ10は、結合性分子14を介して基体15に固定されている。基体15には、結合性分子14と特異的に結合する分子を予め配しておくことで、標的核酸検出用プローブ10を配する位置を制御することができる。
<Embodiment>
1 to 3 are diagrams illustrating an example of a target nucleic acid detection probe.
As shown in FIG. 1, the target nucleic acid detection probe 10 is a single-stranded nucleic acid having a label molecule 11, a predetermined nucleic acid sequence 12 and an artificial nucleic acid sequence 13. As shown in FIG. 2, the target nucleic acid detection probe 10 may have a binding molecule 14 for binding to the substrate 15 at the end opposite to the labeled molecule 11. When the binding molecule 14 is present, it is preferable that a molecule that specifically binds to the binding molecule 14 is provided on the surface of the substrate 15.
As shown in FIG. 3, the target nucleic acid detection probe 10 disposed on the substrate 15 is fixed to the substrate 15 via a binding molecule 14. By arranging in advance a molecule that specifically binds to the binding molecule 14 on the substrate 15, the position where the target nucleic acid detection probe 10 is arranged can be controlled.
図4から図8は、本発明の核酸検出方法の一例を示す図である。
図4は、核酸試料を付与した標的核酸検出用プローブと標的核酸との関係の一例を示す図であり、図5は、核酸分解酵素を付与した標的核酸検出用プローブと、標的核酸と、核酸分解酵素との関係の一例を示す図であり、図6は、核酸分解酵素により処理された標的核酸検出用プローブと、標的核酸との関係の一例を示す図であり、図7は、標的核酸検出用デバイスの一例を示す図であり、図8は、本発明の核酸検出方法により処理された、核酸検出用デバイスの一例を示す図である。
4 to 8 are diagrams showing an example of the nucleic acid detection method of the present invention.
FIG. 4 is a diagram illustrating an example of a relationship between a target nucleic acid detection probe to which a nucleic acid sample is applied and a target nucleic acid, and FIG. 5 illustrates a target nucleic acid detection probe to which a nucleolytic enzyme is applied, a target nucleic acid, and a nucleic acid. FIG. 6 is a diagram showing an example of a relationship with a degrading enzyme, FIG. 6 is a diagram showing an example of a relationship between a target nucleic acid detection probe treated with a nucleolytic enzyme and a target nucleic acid, and FIG. 7 is a diagram showing a target nucleic acid. FIG. 8 is a diagram illustrating an example of a detection device, and FIG. 8 is a diagram illustrating an example of a nucleic acid detection device processed by the nucleic acid detection method of the present invention.
図4に示すように、標的核酸検出用デバイスに標的核酸16を含む核酸試料を付与すると、核酸試料中の標的核酸16と、所定の核酸配列12及び人工核酸配列13を有する標的核酸検出用プローブ10が二本鎖を形成可能な場合にハイブリダイゼーションする。このように、標的核酸16は、核酸配列12及び人工核酸配列13の両方に対してハイブリダイゼーションする。
次に、完全相補の二本鎖核酸を特異的に認識し、二本鎖におけるDNA鎖を分解する核酸分解酵素17を標的核酸検出用デバイスに付与すると、図5に示すように、標的核酸16と完全相補の二本鎖を形成している核酸配列12を分解する。このとき、標的核酸16はRNAであるため、核酸分解酵素17によって分解されずに残存する。また、標的核酸16と完全相補な二本鎖を形成している人工核酸配列13においても、核酸分解酵素17によって分解されない。このため、図6に示すように、標的核酸16と完全相補な二本鎖を形成する核酸配列12のみが分解され、標識分子11が基体15から遊離する。このとき、人工核酸配列13の標的核酸16への高い親和性により標的核酸16が基体15上に保持される。
As shown in FIG. 4, when a nucleic acid sample containing the target nucleic acid 16 is applied to the target nucleic acid detection device, the target nucleic acid detection probe having the target nucleic acid 16, the predetermined nucleic acid sequence 12, and the artificial nucleic acid sequence 13 in the nucleic acid sample. Hybridization occurs when 10 can form a double strand. Thus, the target nucleic acid 16 hybridizes to both the nucleic acid sequence 12 and the artificial nucleic acid sequence 13.
Next, when a nucleic acid degrading enzyme 17 that specifically recognizes a completely complementary double-stranded nucleic acid and degrades the DNA strand in the double-stranded DNA is applied to the target nucleic acid detection device, as shown in FIG. The nucleic acid sequence 12 forming a double strand that is completely complementary to the nucleic acid 12 is degraded. At this time, since the target nucleic acid 16 is RNA, it remains without being degraded by the nuclease 17. In addition, the artificial nucleic acid sequence 13 that forms a double strand that is completely complementary to the target nucleic acid 16 is not degraded by the nucleolytic enzyme 17. Therefore, as shown in FIG. 6, only the nucleic acid sequence 12 that forms a double strand that is completely complementary to the target nucleic acid 16 is degraded, and the labeled molecule 11 is released from the substrate 15. At this time, the target nucleic acid 16 is held on the substrate 15 by the high affinity of the artificial nucleic acid sequence 13 to the target nucleic acid 16.
次に、核酸分解工程を行った後に、基体15から自由移動可能となった標識分子11、又は、基体15上に配された標的核酸検出用プローブ10における標識分子11、を検出するかのいずれかの方法を用いて検出することができる。ここでは、基体15上に配された標的核酸検出用プローブ10における標的分子11を検出する方法を用いた場合を示す。
図7に示すように、核酸分解工程後には、標的核酸検出用プローブ10は標識分子11が遊離した後も基体15上には存在するため、そのままではどの位置の核酸検出用プローブ10において完全相補な二本鎖を形成しているかが分からないが、基体15表面を洗浄し、標的核酸検出用プローブ10から遊離した標識分子11を洗い流すことで、図8に示すように、標的核酸16が特異的にハイブリダイゼーションした標的核酸検出用プローブ10のスポット17が消色するため、このスポット17の数を計数することにより、核酸試料中の標的核酸の量を定量することができる。
Next, either the labeled molecule 11 that can move freely from the substrate 15 after the nucleic acid degradation step or the labeled molecule 11 in the target nucleic acid detection probe 10 disposed on the substrate 15 is detected. It is possible to detect using this method. Here, the case where the method of detecting the target molecule 11 in the target nucleic acid detection probe 10 arranged on the substrate 15 is used is shown.
As shown in FIG. 7, after the nucleic acid decomposition step, the target nucleic acid detection probe 10 remains on the substrate 15 even after the labeled molecule 11 is released. Although it is not known whether a double strand is formed, the target nucleic acid 16 is specific as shown in FIG. 8 by washing the surface of the substrate 15 and washing away the labeled molecules 11 released from the target nucleic acid detection probe 10. Since the spot 17 of the target nucleic acid detection probe 10 that has been hybridized automatically disappears, the amount of the target nucleic acid in the nucleic acid sample can be quantified by counting the number of spots 17.
なお、本発明における核酸検出方法では、人工核酸を有する標的核酸検出用プローブを用いているため、一度ハイブリダイゼーションした標的核酸を核酸分解工程後にも保持し続けるため、同じ標的核酸がデバイス上の他の標的核酸検出用プローブに再度ハイブリダイゼーションし重複して検出することを防ぐことができる。そのため、精度の高い定量解析を行うことができる。 In the nucleic acid detection method of the present invention, since the target nucleic acid detection probe having an artificial nucleic acid is used, the target nucleic acid once hybridized continues to be retained after the nucleic acid degradation step. Thus, it can be prevented that the target nucleic acid detection probe is hybridized again and detected again. Therefore, highly accurate quantitative analysis can be performed.
さらに、本発明の核酸検出方法では、完全相補の二本鎖核酸を特異的に認識して分解する二本鎖核酸分解酵素を用いるため、標的核酸検出用プローブと相補的でない標的核酸による非特異的なハイブリダイゼーションが生じてしまった場合には標的核酸検出用プローブが分解されないため、標的核酸を特異的に検出することができ、標的核酸を高精度に検出することができる。 Furthermore, since the nucleic acid detection method of the present invention uses a double-stranded nucleolytic enzyme that specifically recognizes and degrades a completely complementary double-stranded nucleic acid, it is nonspecific by a target nucleic acid that is not complementary to the target nucleic acid detection probe. When the target hybridization occurs, the target nucleic acid detection probe is not decomposed, so that the target nucleic acid can be specifically detected, and the target nucleic acid can be detected with high accuracy.
本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
<1> 標的核酸を含む核酸試料を、
所定の核酸配列及び人工核酸配列と、標識分子とを有し、基体上に配された標的核酸検出用プローブに付与する標的核酸試料付与工程と、
前記所定の核酸配列及び人工核酸配列が前記標的核酸と完全相補な二本鎖を形成可能な場合に形成される、前記所定の核酸配列及び人工核酸配列と前記標的核酸とによる完全相補な二本鎖に対し、
前記完全相補な二本鎖を特異的に認識し、前記二本鎖におけるDNA鎖を分解する核酸分解酵素を付与して前記完全相補な二本鎖を認識し、前記二本鎖におけるDNA鎖を分解する核酸分解工程と、
前記核酸分解酵素により分解され、前記基体から自由移動可能となった前記標識分子、及び、前記基体上に配された前記標的核酸検出用プローブにおける前記標識分子、のいずれかを検出する検出工程と、
を含むことを特徴とする標的核酸検出方法である。
<2> 前記核酸分解酵素が、Duplex−specific nucleaseである前記<1>に記載の標的核酸検出方法である。
<3> 前記<1>から<2>のいずれかに記載の核酸検出方法に用いられる標的核酸検出用プローブであって、
所定の核酸配列及び人工核酸配列と、標識分子とを有することを特徴とする標的核酸検出用プローブである。
<4> 結合性分子を有する前記<3>に記載の標的核酸検出用プローブである。
<5> 前記標識分子が、蛍光分子である前記<3>から<4>のいずれかに記載の標的核酸検出用プローブである。
<6> 前記標識分子が、荷電分子である前記<3>から<4>のいずれかに記載の標的核酸検出用プローブである。
<7> 前記人工核酸配列が、PNA(Peptide Nucleic Acid)、BNA(Bridged Nucleic Acid)、及びLNA(Locked Nucleic Acid)の少なくともいずれかによる配列である前記<3>から<6>のいずれかに記載の標的核酸検出用プローブである。
<8> 前記標的核酸が、DNA及びRNAの少なくともいずれかである前記<3>から<7>のいずれかに記載の標的核酸検出用プローブである。
<9> 前記<3>から<8>のいずれかに記載の標的核酸検出用プローブを基体上に有することを特徴とする標的核酸検出用デバイスである。
As an aspect of this invention, it is as follows, for example.
<1> A nucleic acid sample containing a target nucleic acid,
A target nucleic acid sample providing step for applying to a target nucleic acid detection probe disposed on a substrate, which has a predetermined nucleic acid sequence and an artificial nucleic acid sequence, and a labeled molecule;
Two complete complementary pairs of the predetermined nucleic acid sequence and the artificial nucleic acid sequence and the target nucleic acid, which are formed when the predetermined nucleic acid sequence and the artificial nucleic acid sequence can form a double strand that is completely complementary to the target nucleic acid. Against the chain
Recognize the fully complementary duplex by specifically recognizing the fully complementary duplex, providing a nucleolytic enzyme that degrades the DNA strand in the duplex to recognize the fully complementary duplex, A nucleic acid decomposing step for decomposing,
A detection step of detecting any of the labeled molecule that has been decomposed by the nucleolytic enzyme and is free to move from the substrate, and the labeled molecule in the target nucleic acid detection probe disposed on the substrate; ,
A method for detecting a target nucleic acid, comprising:
<2> The target nucleic acid detection method according to <1>, wherein the nucleolytic enzyme is Duplex-specific nuclease.
<3> A target nucleic acid detection probe used in the nucleic acid detection method according to any one of <1> to <2>,
A target nucleic acid detection probe comprising a predetermined nucleic acid sequence, an artificial nucleic acid sequence, and a label molecule.
<4> The probe for detecting a target nucleic acid according to <3>, which has a binding molecule.
<5> The target nucleic acid detection probe according to any one of <3> to <4>, wherein the labeling molecule is a fluorescent molecule.
<6> The target nucleic acid detection probe according to any one of <3> to <4>, wherein the labeling molecule is a charged molecule.
<7> The above-described <3> to <6>, wherein the artificial nucleic acid sequence is a sequence of at least one of PNA (Peptide Nucleic Acid), BNA (Bridged Nucleic Acid), and LNA (Locked Nucleic Acid). The target nucleic acid detection probe described.
<8> The target nucleic acid detection probe according to any one of <3> to <7>, wherein the target nucleic acid is at least one of DNA and RNA.
<9> A target nucleic acid detection device comprising the target nucleic acid detection probe according to any one of <3> to <8> on a substrate.
前記<1>から<2>のいずれかに記載の標的核酸検出方法、前記<3>から<8>のいずれかに記載の標的核酸検出用プローブ、前記<9>に記載の標的核酸検出用デバイスによると、従来における前記諸問題、即ち、非特異的なハイブリダイゼーションによる誤検出を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。 The target nucleic acid detection method according to any one of <1> to <2>, the target nucleic acid detection probe according to any one of <3> to <8>, and the target nucleic acid detection according to <9> According to the device, the above-mentioned problems, that is, false detection due to nonspecific hybridization can be solved, and the object of the present invention can be achieved.
10 標的核酸検出用プローブ
11 標識分子
12 核酸配列
13 人工核酸配列
14 結合性分子
15 基体
16 標的核酸
17 核酸分解酵素
10 Probe for detecting target nucleic acid 11 Labeled molecule 12 Nucleic acid sequence 13 Artificial nucleic acid sequence 14 Binding molecule 15 Base 16 Target nucleic acid 17 Nucleolytic enzyme
Claims (9)
所定の核酸配列及び人工核酸配列と、標識分子とを有し、基体上に配された標的核酸検出用プローブに付与する標的核酸試料付与工程と、
前記所定の核酸配列及び人工核酸配列が前記標的核酸と完全相補な二本鎖を形成可能な場合に形成される、前記所定の核酸配列及び人工核酸配列と前記標的核酸とによる完全相補な二本鎖に対し、
前記完全相補な二本鎖を特異的に認識し、前記二本鎖におけるDNA鎖を分解する核酸分解酵素を付与して前記完全相補な二本鎖を認識し、前記二本鎖におけるDNA鎖を分解する核酸分解工程と、
前記核酸分解酵素により分解され、前記基体から自由移動可能となった前記標識分子、及び、前記基体上に配された前記標的核酸検出用プローブにおける前記標識分子、のいずれかを検出する検出工程と、
を含むことを特徴とする標的核酸検出方法。 A nucleic acid sample containing the target nucleic acid,
A target nucleic acid sample providing step for applying to a target nucleic acid detection probe disposed on a substrate, which has a predetermined nucleic acid sequence and an artificial nucleic acid sequence, and a labeled molecule;
Two complete complementary pairs of the predetermined nucleic acid sequence and the artificial nucleic acid sequence and the target nucleic acid, which are formed when the predetermined nucleic acid sequence and the artificial nucleic acid sequence can form a double strand that is completely complementary to the target nucleic acid. Against the chain
Recognize the fully complementary duplex by specifically recognizing the fully complementary duplex, providing a nucleolytic enzyme that degrades the DNA strand in the duplex to recognize the fully complementary duplex, A nucleic acid decomposing step for decomposing,
A detection step of detecting any of the labeled molecule that has been decomposed by the nucleolytic enzyme and is free to move from the substrate, and the labeled molecule in the target nucleic acid detection probe disposed on the substrate; ,
A method for detecting a target nucleic acid, comprising:
所定の核酸配列及び人工核酸配列と、標識分子とを有することを特徴とする標的核酸検出用プローブ。 A target nucleic acid detection probe used in the nucleic acid detection method according to claim 1,
A probe for detecting a target nucleic acid, comprising a predetermined nucleic acid sequence and an artificial nucleic acid sequence, and a labeled molecule.
9. A target nucleic acid detection device comprising the target nucleic acid detection probe according to claim 3 on a substrate.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018049471A JP2019154396A (en) | 2018-03-16 | 2018-03-16 | Nucleic acid detection method, target nucleic acid detection probe used therefor, and target nucleic acid detection device |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018049471A JP2019154396A (en) | 2018-03-16 | 2018-03-16 | Nucleic acid detection method, target nucleic acid detection probe used therefor, and target nucleic acid detection device |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019154396A true JP2019154396A (en) | 2019-09-19 |
Family
ID=67992397
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018049471A Pending JP2019154396A (en) | 2018-03-16 | 2018-03-16 | Nucleic acid detection method, target nucleic acid detection probe used therefor, and target nucleic acid detection device |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2019154396A (en) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005536983A (en) * | 2001-11-29 | 2005-12-08 | フォーカスゲノミクス ゲーエムベーハー | Method for detecting hybridization events in nucleic acids |
JP2010081934A (en) * | 2008-09-03 | 2010-04-15 | Nishikawa Rubber Co Ltd | Thermostable duplex-specific nuclease |
JP2017221172A (en) * | 2016-06-17 | 2017-12-21 | 富士レビオ株式会社 | Method for measuring target nucleic acid containing modified nucleobase |
-
2018
- 2018-03-16 JP JP2018049471A patent/JP2019154396A/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005536983A (en) * | 2001-11-29 | 2005-12-08 | フォーカスゲノミクス ゲーエムベーハー | Method for detecting hybridization events in nucleic acids |
JP2010081934A (en) * | 2008-09-03 | 2010-04-15 | Nishikawa Rubber Co Ltd | Thermostable duplex-specific nuclease |
JP2017221172A (en) * | 2016-06-17 | 2017-12-21 | 富士レビオ株式会社 | Method for measuring target nucleic acid containing modified nucleobase |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
BIOSENSORS & BIOELECTRONICS, vol. 83, JPN6021042701, 2016, pages 250 - 255, ISSN: 0004629643 * |
GENOME RESEARCH, vol. 12(12), JPN6021042699, 2002, pages 1935 - 1942, ISSN: 0004629642 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Brogan et al. | Optical fiber-based sensors: application to chemical biology | |
US20060008823A1 (en) | DNA profiling and SNP detection utilizing microarrays | |
US20120322669A1 (en) | Methods of marking materials | |
US8932811B2 (en) | Genomic selection and sequencing using encoded microcarriers | |
CN108660191A (en) | A kind of digitlization multiple nucleic acid detection method based on coding microball reactor | |
RU2265058C2 (en) | Method for detection of nucleic acid-target in sample | |
JP5519964B2 (en) | Substrates for gene analysis | |
JP2019154396A (en) | Nucleic acid detection method, target nucleic acid detection probe used therefor, and target nucleic acid detection device | |
JP2009060862A (en) | Label nucleic acid for preventing sample from being mixed-up | |
US10927405B2 (en) | Molecular tag attachment and transfer | |
WO2014156513A1 (en) | Method for detecting mutation | |
Hue-Roye et al. | Principles of PCR-based assays | |
Maldonado-Rodriguez et al. | Analysis of nucleic acids by tandem hybridization on oligonucleotide microarrays | |
JP5378724B2 (en) | Expression mRNA identification method | |
US20230099994A1 (en) | Digital polymerase chain reaction (dpcr) platforms on next generation sequencer patterned flow cell technology | |
CN1954085A (en) | Detection of RNA with micro-arrays | |
JP2005000127A (en) | Polymorphism detection method | |
JP2003125800A (en) | Method for detecting nucleic acid | |
US20130237450A1 (en) | Method for Detecting Nucleic Acids | |
Dunbar et al. | Bead array technologies for genetic disease screening and microbial detection | |
JP2008161111A (en) | Method for discriminating repeated motif in protein | |
de Miranda | Molecular methods: possibilities and limitations of molecular diagnostic techniques | |
Kharb | Scientific Writing Techniques and Project Management in Biotechnology | |
JP2003135069A (en) | Method for identifying nucleotide polymorphism | |
JP2008522638A (en) | Compositions and methods for nucleic acid analysis of sequences with insertions or deletions |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210118 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20211014 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211102 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20220419 |
|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20220601 |