JP2019154246A - Probe set, nucleic acid detection method using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、プローブセット、及びそれを用いた核酸検出方法に関する。 The present invention relates to a probe set and a nucleic acid detection method using the probe set.
近年、疾病に早期診断や治療効果の確認として、微量の体液からバイオマーカーとなる遺伝子などのコピー数変異を検出することが行われている。この検出には、目的とする塩基配列の絶対定量が可能なデジタルＰＣＲを用いた遺伝子発現解析が注目されている。 In recent years, copy number mutations such as genes serving as biomarkers have been detected from a small amount of body fluid as early diagnosis of diseases and confirmation of therapeutic effects. For this detection, gene expression analysis using digital PCR capable of absolute quantification of the target base sequence has attracted attention.
デジタルＰＣＲは、検量線を必要とせず、高感度かつ高精度な分析手法として、低濃度試料の定量や、遺伝子間での発現量の比較、レアバリアント解析などで活用されている。デジタルＰＣＲは、標的とする核酸が含まれている試料溶液を希釈して、多数の微小区画に分割し、分割した微小区画内でＰＣＲ反応を行うことで標的核酸の増幅を行い、増幅した標的核酸を蛍光検出により検出する方法である。このとき、ポアソン分布に基づき、微小区画に標的核酸が１分子又は１分子も入らないように試料溶液の濃度などの条件を調節し、標的核酸の増幅反応が行われた微小区画と、標的核酸の増幅反応が行われなかった微小区画を得ることができる。この標的核酸の増幅反応が行われた微小区画の数を計数することにより、試料溶液中に含まれる標的核酸の濃度を定量することができる。
さらに、デジタルＰＣＲを用いた検出において、複数の標的核酸を同じ反応系で検出するために、標的核酸毎に異なる蛍光ピーク波長を有するプローブを用いるマルチプレックス検出を行う技術が提案されてきている。
Digital PCR does not require a calibration curve, and is utilized as a highly sensitive and highly accurate analysis method for quantification of low concentration samples, comparison of expression levels between genes, rare variant analysis, and the like. In digital PCR, a sample solution containing a target nucleic acid is diluted and divided into a large number of microcompartments, and the target nucleic acid is amplified by performing a PCR reaction in the divided microcompartments. In this method, nucleic acid is detected by fluorescence detection. At this time, based on the Poisson distribution, the conditions such as the concentration of the sample solution are adjusted so that the target nucleic acid does not enter one molecule or one molecule in the micro compartment, and the target nucleic acid is subjected to the amplification reaction of the target nucleic acid. A microcompartment in which the amplification reaction was not performed can be obtained. The concentration of the target nucleic acid contained in the sample solution can be quantified by counting the number of microcompartments in which the target nucleic acid amplification reaction has been performed.
Furthermore, in the detection using digital PCR, in order to detect a plurality of target nucleic acids in the same reaction system, a technique for performing multiplex detection using probes having different fluorescence peak wavelengths for each target nucleic acid has been proposed.
例えば、標的核酸を含む試料溶液を区画化して、複数の微小液滴を形成し、形成した微小液滴中の標的核酸の異なる標的領域にそれぞれ相補的な配列を有するプローブを用いて試料溶液中に含まれる標的核酸の複数の標的領域の検出を行う方法に用いるプローブについて提案されている（例えば、特許文献１参照）。 For example, a sample solution containing a target nucleic acid is compartmentalized to form a plurality of microdroplets, and in the sample solution using probes each having a sequence complementary to a different target region of the target nucleic acid in the formed microdroplets. Has been proposed for use in a method for detecting a plurality of target regions of a target nucleic acid contained in (see, for example, Patent Document 1).
本発明は、複数の標的核酸を簡便に検出することができるプローブセットを提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a probe set that can easily detect a plurality of target nucleic acids.
課題を解決するための手段としての本発明のプローブセットは、
ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸を検出するためのプローブセットであって、
前記プローブセットは、
所定の塩基配列と蛍光ピーク波長との組合せを備えた蛍光プローブをｍ種（ｍはｎよりも小さな自然数）含み、
前記標的核酸に含まれる一の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有し、
前記標的核酸に含まれる前記一の標的核酸とは異なる他の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有する。
The probe set of the present invention as a means for solving the problem is
A probe set for detecting n types (n is a natural number of 3 or more) of target nucleic acids,
The probe set is
Including m types of fluorescent probes having a combination of a predetermined base sequence and a fluorescent peak wavelength (m is a natural number smaller than n),
The two or more fluorescent probes have a base sequence capable of hybridization to one target nucleic acid contained in the target nucleic acid,
Two or more kinds of the fluorescent probes have a base sequence capable of hybridization with another target nucleic acid different from the one target nucleic acid contained in the target nucleic acid.
本発明によると、複数の標的核酸を簡便に検出することができるプローブセットを提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a probe set that can easily detect a plurality of target nucleic acids.
（プローブセット）
本発明のプローブセットは、
ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸を検出するためのプローブセットであって、
前記プローブセットは、
所定の塩基配列と蛍光ピーク波長との組合せを備えた蛍光プローブをｍ種（ｍはｎよりも小さな自然数）含み、
前記標的核酸に含まれる一の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有し、
前記標的核酸に含まれる前記一の標的核酸とは異なる他の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有し、さらに必要に応じてその他の部位乃至成分を含む。
(Probe set)
The probe set of the present invention comprises:
A probe set for detecting n types (n is a natural number of 3 or more) of target nucleic acids,
The probe set is
Including m types of fluorescent probes having a combination of a predetermined base sequence and a fluorescent peak wavelength (m is a natural number smaller than n),
The two or more fluorescent probes have a base sequence capable of hybridization to one target nucleic acid contained in the target nucleic acid,
The two or more fluorescent probes have a base sequence that can be hybridized with another target nucleic acid different from the one target nucleic acid contained in the target nucleic acid, and further include other sites or components as necessary. Including.
本発明者らは、複数の標的核酸を簡便に検出することができるプローブセットについて検討したところ、以下の知見を得た。
上記特許文献１に記載の技術では、標的核酸中の標的領域毎に異なる蛍光物質を用いて検出を行うため、１つの標的領域に対して１つの蛍光物質が必要であり、それに伴い、蛍光の検出に必要な検出器の数も蛍光物質と同数必要となるため、一度の解析に必要な検出器の数を確保することが難しいという問題がある。
また、上記特許文献１の技術では、同色の蛍光物質でも、蛍光プローブに有する蛍光物質の濃度を変更し、得られる蛍光強度により識別することが記載されているが、細かな濃度条件の検討が必要なため、簡便さが十分ではなく、同時に解析できる標的核酸の数も十分ではないという問題がある。
When the present inventors examined the probe set which can detect a several target nucleic acid simply, the following knowledge was acquired.
In the technique described in Patent Document 1, detection is performed using a different fluorescent material for each target region in the target nucleic acid, and thus one fluorescent material is required for one target region. Since the number of detectors necessary for detection is the same as the number of fluorescent substances, there is a problem that it is difficult to secure the number of detectors necessary for one analysis.
Further, in the technique of the above-mentioned Patent Document 1, it is described that, even with the same color fluorescent substance, the concentration of the fluorescent substance in the fluorescent probe is changed and identified by the obtained fluorescence intensity. Since it is necessary, there is a problem that simplicity is not sufficient and the number of target nucleic acids that can be analyzed simultaneously is not sufficient.
本発明のプローブセットにおいては、ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸に対して、所定の塩基配列と蛍光ピーク波長との組合せを備えた蛍光プローブをｍ種（ｍはｎよりも小さな自然数）用いて、ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸に含まれる一の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有し、さらに、標的核酸に含まれる一の標的核酸とは異なる他の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有する。本発明の構成とすることにより、使用する蛍光ピーク波長の数を増やすことなく、標的核酸を検出するために使用できる蛍光プローブの種類を増やすことができる。即ち、標的核酸の種類よりも少ない数の蛍光ピーク波長の数を用いて簡便にマルチプレックス検出をすることができる。 In the probe set of the present invention, m types of fluorescent probes (m is more than n) than n types (n is a natural number of 3 or more) of target nucleic acids having a combination of a predetermined base sequence and a fluorescence peak wavelength. A small natural number), the two or more fluorescent probes have a base sequence capable of hybridizing to one target nucleic acid contained in n types (n is a natural number of 3 or more) of target nucleic acids; Two or more kinds of the fluorescent probes have a base sequence capable of hybridizing to another target nucleic acid different from one target nucleic acid contained in the nucleic acid. By adopting the configuration of the present invention, the types of fluorescent probes that can be used for detecting a target nucleic acid can be increased without increasing the number of fluorescent peak wavelengths to be used. That is, multiplex detection can be easily performed using the number of fluorescence peak wavelengths that is smaller than the number of types of target nucleic acids.
なお、本発明において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを使用することができる。その他にもＰＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡなどの人工的に合成した核酸類似体（人工核酸とも称することがある）なども使用することができる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。 In the present invention, DNA, RNA or the like can be used as the nucleic acid. In addition, artificially synthesized nucleic acid analogs (sometimes referred to as artificial nucleic acids) such as PNA, BNA, and LNA can also be used. These may be used alone or in combination of two or more.
本発明において、標的核酸とは、解析対象とする塩基配列を有する核酸分子を意味する。
標的核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ増幅産物、ＲＮＡ、人工合成したオリゴヌクレオチド、及びそれらの断片などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
In the present invention, the target nucleic acid means a nucleic acid molecule having a base sequence to be analyzed.
The target nucleic acid is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include genomic DNA, plasmid DNA, cDNA, PCR amplification product, RNA, artificially synthesized oligonucleotide, and fragments thereof. It is done. These may be used alone or in combination of two or more.
−蛍光プローブ−
蛍光プローブは、所定の塩基配列と蛍光ピーク波長との組合せを備えている。
-Fluorescent probe-
The fluorescent probe has a combination of a predetermined base sequence and a fluorescent peak wavelength.
所定の塩基配列としては、標的核酸と相補的な塩基配列を有していれば、塩基長、所定の塩基配列を構成する物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。 As the predetermined base sequence, as long as it has a base sequence complementary to the target nucleic acid, the base length and the substance constituting the predetermined base sequence are not particularly limited and may be appropriately selected according to the purpose. it can.
塩基長としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、２０ｍｅｒ以上３５ｍｅｒ以下などが好ましい。塩基長を２０ｍｅｒ以上３５ｍｅｒ以下とすることにより検出の特異性を向上させることができる。 There is no restriction | limiting in particular as base length, According to the objective, it can select suitably, For example, 20 mer or more and 35 mer or less etc. are preferable. The specificity of detection can be improved by setting the base length to 20 mer or more and 35 mer or less.
所定の塩基配列を構成する物質としては、標的核酸と相補的な塩基配列を構成することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを使用することができる。その他にもＰＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡなどの人工的に合成した核酸類似体（人工核酸とも称することがある）なども使用することができる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。 The substance constituting the predetermined base sequence is not particularly limited as long as it can form a base sequence complementary to the target nucleic acid, and can be appropriately selected according to the purpose. For example, DNA, RNA, etc. are used. can do. In addition, artificially synthesized nucleic acid analogs (sometimes referred to as artificial nucleic acids) such as PNA, BNA, and LNA can also be used. These may be used alone or in combination of two or more.
蛍光ピーク波長としては、核酸修飾に用いることができる蛍光物質の蛍光ピーク波長であれば特に制限はなく、目的に応じて定義選択することができ、例えば、Ｘ（ｎｍ）（ただし、Ｘは正の実数）の蛍光ピーク波長の蛍光物質を有する一の蛍光プローブに対して、Ｙ（ｎｍ）以上離れた他の蛍光ピーク波長とすることが好ましい。Ｙ（ｎｍ）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１８（ｎｍ）とすることなどが挙げられる。蛍光ピーク波長が、Ｘ（ｎｍ）（ただし、Ｘは正の実数）の蛍光ピーク波長の蛍光物質を有する一の蛍光プローブに対して、Ｙ（ｎｍ）以上離れた他の蛍光ピーク波長であると、蛍光プローブの検出精度を向上させることができる。 The fluorescence peak wavelength is not particularly limited as long as it is a fluorescence peak wavelength of a fluorescent substance that can be used for nucleic acid modification, and can be defined and selected according to the purpose. For example, X (nm) (where X is positive) It is preferable to set the other fluorescent peak wavelength apart by Y (nm) or more with respect to one fluorescent probe having a fluorescent substance having a fluorescent peak wavelength of (real number). Y (nm) is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include 18 (nm). The fluorescence peak wavelength is another fluorescence peak wavelength that is more than Y (nm) away from one fluorescent probe having a fluorescent substance having a fluorescence peak wavelength of X (nm) (where X is a positive real number). The detection accuracy of the fluorescent probe can be improved.
蛍光物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン（ＦＬＯ）、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＮＥＤ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＶＩＣ（登録商標）、ＰＥＴ、ＡＢＹ（登録商標）、ＪＵＮ（登録商標）、ＭＵＳＴＡＮＧ ＰＵＲＰＬＥ（登録商標）、などが挙げられる。これらの中でも、ＦＡＭ、ＲＯＸが好ましい。 There is no restriction | limiting in particular as a fluorescent substance, According to the objective, it can select suitably, For example, Fluorescein (FLO), FAM, HEX, TET, NED, TAMRA, ROX, VIC (trademark), PET, ABY ( Registered trademark), JUN (registered trademark), MUSTANG PURPLE (registered trademark), and the like. Among these, FAM and ROX are preferable.
蛍光プローブとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光プローブの所定の塩基配列の５’末端又は３’末端に蛍光物質を有し、かつ前記蛍光物質を有しない末端に蛍光物質の発光を抑制する消光物質を有するものなどが挙げられる。蛍光プローブの所定の塩基配列の５’末端又は３’末端に蛍光物質を有し、かつ前記蛍光物質を有しない末端に蛍光物質の発光を抑制する消光物質を有するものとしては、例えば、オリゴヌクレオチド（プローブ）の５’末端を蛍光物質、３’末端を消光物質（クエンチャー物質などと称することもある）で修飾したものなどが好ましい。具体的には、例えば、Ｔａｑ ｍａｎ（登録商標） ｐｒｏｂｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎなどの核酸プローブなどが挙げられる。 There is no restriction | limiting in particular as a fluorescent probe, According to the objective, it can select suitably, For example, it has a fluorescent substance in 5 'terminal or 3' terminal of the predetermined base sequence of a fluorescent probe, and said fluorescent substance is used. The thing which has the quencher which suppresses light emission of a fluorescent substance at the terminal which does not have is mentioned. Examples of those having a fluorescent substance at the 5 ′ end or 3 ′ end of a predetermined base sequence of a fluorescent probe and having a quenching substance that suppresses the emission of the fluorescent substance at the terminal not having the fluorescent substance include, for example, oligonucleotides Those obtained by modifying the 5 ′ end of (probe) with a fluorescent substance and the 3 ′ end with a quenching substance (sometimes referred to as a quencher substance) are preferred. Specific examples include nucleic acid probes such as Taq man (registered trademark) probe and Molecular Beacon.
消光物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＭＧＢ、ＱＳＹ（登録商標）などが挙げられる。 There is no restriction | limiting in particular as a quencher, According to the objective, it can select suitably, For example, MGB, QSY (trademark), etc. are mentioned.
本発明のプローブセットでは、ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸に対して、所定の塩基配列と蛍光ピーク波長との組合せを備えた蛍光プローブをｍ種（ｍはｎよりも小さな自然数）含み、標的核酸に含まれる一の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有し、標的核酸に含まれる一の標的核酸とは異なる他の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有する。このことについて、図１から図３を参照して具体的に説明する。 In the probe set of the present invention, m types (m is smaller than n) of fluorescent probes having a combination of a predetermined base sequence and a fluorescence peak wavelength with respect to n types (n is a natural number of 3 or more) of target nucleic acids. Other target nucleic acids that are different from the one target nucleic acid contained in the target nucleic acid, having two or more kinds of base sequences capable of hybridization to one target nucleic acid contained in the target nucleic acid. On the other hand, two or more kinds of the fluorescent probes have a base sequence capable of hybridization. This will be specifically described with reference to FIGS.
図１から図３は、標的核酸と標的核酸に相補的な塩基配列を有する蛍光プローブとの関係を示す図である。
図１は、標的核酸１０１と、標的核酸１０１に対する蛍光プローブ１１１との関係の一例を示す図であり、図２は、標的核酸１０２と、標的核酸１０２に対する蛍光プローブ１１２との関係の一例を示す図であり、図３は、標的核酸１０３に対する蛍光プローブ１１３及び１１４との関係の一例を示す図である。
図１から図３に示すように、ここでは、３種の標的核酸１０１、標的核酸１０２、及び標的核酸１０３に対して、２種の蛍光物質１２１又は蛍光物質１２２が修飾された蛍光プローブを用いている。蛍光プローブ１１１には蛍光物質１２１が、蛍光プローブ１１２には蛍光物質１２２が、蛍光プローブ１１３には蛍光物質１２１が、蛍光プローブ１１４には蛍光物質１２２がそれぞれ修飾されている。蛍光物質１２１、１２２、及び１２３は互いに異なる蛍光ピーク波長を有する。
図１及び図２に示すように、標的核酸１０１に蛍光プローブ１１１が、標的核酸１０２に蛍光プローブ１１２がハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有している。また、図３に示すように、標的核酸１０３に対して、異なる部位で２種の蛍光プローブ１１３及び蛍光プローブ１１４が同時にハイブリダイゼーション可能な塩基配列を有している。
このように、３種の標的核酸を２種の蛍光ピーク波長を有する蛍光プローブを用いて識別することができる。
1 to 3 are diagrams showing the relationship between a target nucleic acid and a fluorescent probe having a base sequence complementary to the target nucleic acid.
FIG. 1 is a diagram illustrating an example of a relationship between a target nucleic acid 101 and a fluorescent probe 111 for the target nucleic acid 101, and FIG. 2 illustrates an example of a relationship between the target nucleic acid 102 and a fluorescent probe 112 for the target nucleic acid 102. FIG. 3 is a diagram illustrating an example of a relationship between the target nucleic acid 103 and the fluorescent probes 113 and 114.
As shown in FIGS. 1 to 3, here, a fluorescent probe in which two kinds of fluorescent substances 121 or 122 are modified with respect to three kinds of target nucleic acid 101, target nucleic acid 102, and target nucleic acid 103 is used. ing. The fluorescent probe 111 is modified with a fluorescent substance 121, the fluorescent probe 112 is modified with a fluorescent substance 122, the fluorescent probe 113 is modified with a fluorescent substance 121, and the fluorescent probe 114 is modified with a fluorescent substance 122. The fluorescent materials 121, 122, and 123 have different fluorescence peak wavelengths.
As shown in FIGS. 1 and 2, the target nucleic acid 101 has a base sequence that allows the fluorescent probe 111 and the target nucleic acid 102 to hybridize with the fluorescent probe 112. In addition, as shown in FIG. 3, two types of fluorescent probes 113 and 114 have a base sequence capable of simultaneously hybridizing to the target nucleic acid 103 at different sites.
In this way, three types of target nucleic acids can be identified using fluorescent probes having two types of fluorescence peak wavelengths.
以上より、ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸に対して、所定の塩基配列と蛍光ピーク波長との組合せを備えた蛍光プローブをｍ種（ｍはｎよりも小さな自然数）含み、標的核酸に含まれる一の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有することにより、複数の標的核酸を簡便に検出することができる。 As described above, for n types (n is a natural number of 3 or more) of target nucleic acids, m types of fluorescent probes having a combination of a predetermined base sequence and a fluorescence peak wavelength (m is a natural number smaller than n) are included. When two or more fluorescent probes have a base sequence that can be hybridized to one target nucleic acid contained in the target nucleic acid, a plurality of target nucleic acids can be easily detected.
さらに、標的核酸に含まれる一の標的核酸とは異なる他の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有することにより、標的核酸を検出するバリエーションを増加させることができる。 Furthermore, the variation in detecting the target nucleic acid is increased by having two or more fluorescent probes having a base sequence capable of hybridization with another target nucleic acid different from one target nucleic acid contained in the target nucleic acid. Can do.
ここで、ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸に対して、所定の塩基配列と蛍光ピーク波長との組合せを備えた蛍光プローブをｍ種（ｍはｎよりも小さな自然数）含む蛍光プローブの種類について検討する。例えば、蛍光ピーク波長をＰとすると、３種の蛍光ピーク波長（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）を用いて、標的核酸を識別できる蛍光ピーク波長の組合せは、（Ｐ１／−／−）、（−／Ｐ２／−）、（−／−／Ｐ３）、（Ｐ１／Ｐ２／−）、（Ｐ１／−／Ｐ３）、（−／Ｐ２／Ｐ３）、及び（Ｐ１／Ｐ２／Ｐ３）の７種となる。このため、３種の蛍光ピーク波長を用いることにより、最大７種の標的核酸を識別することができる。
このことから、ｋ種（ｋはｎよりも小さな自然数）の蛍光ピーク波長を用いた場合に考えられる蛍光プローブの組合せは、最大で２ｋ−１種類となる。
Here, with respect to n types (n is a natural number of 3 or more) of target nucleic acids, fluorescence containing m types (m is a natural number smaller than n) of fluorescent probes having a combination of a predetermined base sequence and a fluorescence peak wavelength. Consider the type of probe. For example, assuming that the fluorescence peak wavelength is P, the combinations of fluorescence peak wavelengths that can identify a target nucleic acid using three types of fluorescence peak wavelengths (P1, P2, P3) are (P1 / − / −), (− / (P2 / −), (− / − / P3), (P1 / P2 / −), (P1 / − / P3), (− / P2 / P3), and (P1 / P2 / P3) . For this reason, a maximum of seven types of target nucleic acids can be identified by using three types of fluorescence peak wavelengths.
From this, the combination of fluorescent probes conceivable when k types (k is a natural number smaller than n) of fluorescent peak wavelengths is used is 2 k -1 at the maximum.
このとき、解析対象となる標的核酸の数に対して、蛍光プローブの種類が少なくなる場合がある。例えば、標的核酸の種類が８種、蛍光ピーク波長の種類が３種である場合、３種の蛍光ピーク波長を用いた蛍光プローブの組合せは７種となり、８種の標的核酸を識別することができない。そのため、ｋ種の蛍光ピーク波長を用いてｎ種の標的核酸を検出する場合において、ｍ種類の蛍光プローブによりｎ種の標的核酸を検出するためには、ｋは、２ｋ−１≧ｎを満たすこと、即ち、ｋ≧ｌｏｇ２（ｎ＋１）（ｎは３以上の自然数、ｋはｎよりも小さな自然数）を満たすことが好ましい。
したがって、本発明のプローブセットは、一の標的核酸に対して２種以上の蛍光プローブを用いて検出を行うことにより、標的核酸の種類が増加した場合であっても、標的核酸の種類よりも少ない数の蛍光物質で簡便に検出をすることができる。
At this time, the number of fluorescent probes may be reduced with respect to the number of target nucleic acids to be analyzed. For example, if there are 8 types of target nucleic acids and 3 types of fluorescence peak wavelengths, there are 7 combinations of fluorescent probes using 3 types of fluorescence peak wavelengths, and 8 types of target nucleic acids can be identified. Can not. Therefore, in the case of detecting n types of target nucleic acids using k types of fluorescence peak wavelengths, in order to detect n types of target nucleic acids using m types of fluorescent probes, k must satisfy 2 k −1 ≧ n. It is preferable to satisfy, that is, k ≧ log 2 (n + 1) (n is a natural number of 3 or more, k is a natural number smaller than n).
Therefore, the probe set of the present invention is more effective than the type of target nucleic acid even when the type of target nucleic acid is increased by performing detection using two or more types of fluorescent probes for one target nucleic acid. Detection can be easily performed with a small number of fluorescent substances.
（核酸検出方法）
本発明の核酸検出方法は、
ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸を検出するための方法であって、
一の標的核酸と、本発明のプローブセットと、を含む標的核酸含有試料を調製する標的核酸含有試料調製工程と、
前記標的核酸にハイブリダイゼーションした前記蛍光プローブ毎に、前記蛍光プローブに対する励起光を照射して前記蛍光プローブの蛍光を検出する検出工程と、
を含み、さらに必要に応じてその他の工程を含む。
(Nucleic acid detection method)
The nucleic acid detection method of the present invention comprises:
A method for detecting n types (n is a natural number of 3 or more) of target nucleic acids,
A target nucleic acid-containing sample preparation step of preparing a target nucleic acid-containing sample comprising one target nucleic acid and the probe set of the present invention;
For each fluorescent probe hybridized to the target nucleic acid, a detection step of detecting the fluorescence of the fluorescent probe by irradiating excitation light to the fluorescent probe;
And other steps as necessary.
＜標的核酸含有試料調製工程＞
標的核酸含有試料調製工程は、一の標的核酸と、本発明のプローブセットと、を含む標的核酸含有試料を調製する工程である。
<Target nucleic acid-containing sample preparation step>
The target nucleic acid-containing sample preparation step is a step of preparing a target nucleic acid-containing sample containing one target nucleic acid and the probe set of the present invention.
一の標的核酸と、本発明のプローブセットと、を含む標的核酸含有試料を調整する工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、デジタルＰＣＲにおいてマイクロ流路を利用するＷａｔｅｒ ｉｎ Ｏｉｌドロップレットを作製する方法、及びマイクロナノサイズのウェルを利用する方法などが挙げられる。具体的には、例えば、ドロップレットジェネレーター（装置名：Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ、バイオ・ラッド製）を用いたドロップレット生成方法、特許第３７４６７６６号公報に記載の方法などが挙げられる。 The step of preparing a target nucleic acid-containing sample containing one target nucleic acid and the probe set of the present invention is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples include a method for producing a Water in Oil droplet using a micron and a method using a micro-nano size well. Specific examples include a droplet generation method using a droplet generator (device name: Automated Drop Generator, manufactured by Bio-Rad), a method described in Japanese Patent No. 3746766, and the like.
図４は、マイクロ流路を用いて、一の標的核酸と、本発明のプローブセットと、を含む標的核酸含有試料を調製する一例を示す図である。図５から図８は、図４に示すマイクロ流路を用いて調整した標的核酸含有試料の一例を示す図である。 FIG. 4 is a diagram showing an example of preparing a target nucleic acid-containing sample containing one target nucleic acid and the probe set of the present invention using a microchannel. 5 to 8 are diagrams showing an example of a target nucleic acid-containing sample prepared using the microchannel shown in FIG.
図４に示すように、複数の標的核酸を含む試料溶液を図の右側の流路から供給し、プローブセットを含む反応試薬を含有する試料溶液を左側の流路から供給し、最終的に１本の流路に合流させることにより、２種の試料溶液を混合する。混合した試料溶液は、図４の左下から右下に向けて供給する連続相の流体と図４の中央部で合流する。このとき、混合した試料溶液は、連続相の流体のせん断力により、ドロップレットとして微小区画に微小区画化される。 As shown in FIG. 4, a sample solution containing a plurality of target nucleic acids is supplied from the channel on the right side of the figure, a sample solution containing a reaction reagent including a probe set is supplied from the channel on the left side, and finally 1 The two sample solutions are mixed by merging into the flow path of the book. The mixed sample solution merges with the continuous-phase fluid supplied from the lower left to the lower right of FIG. 4 at the center of FIG. At this time, the mixed sample solution is micropartitioned into microcompartments as droplets by the shearing force of the fluid in the continuous phase.
図５は、図４により生成された微小区画１４１の一例を示す図である。図５に示すように、微小区画１４１には、標的核酸１０１、蛍光プローブ１１１、１１２、１１３、及び１１４、並びに標的核酸の増幅に要するプライマーセット１５１、１５２、及び１５３を含有している。図６から図８においては、微小区画１４２、１４３、及び１４４に含まれる標的核酸がそれぞれ標的核酸１０２、１０３、なしの場合を示している。図５から図８に示す標的核酸１０１から１０３、及び蛍光プローブ１１１から１１４の対応関係は、図１から図３に示す関係と同様である。図５から図８に示すように、図４のマイクロ流路を用いて、微小区画内に標的核酸が１分子以下で入る条件にて生成した微小区画は、標的核酸が入っている、又は入っていないものとすることができる。
このように複数の標的核酸が含まれる試料溶液を微小区画化することにより、個々の微小区画で標的核酸の検出を行うことができる。
FIG. 5 is a diagram illustrating an example of the minute section 141 generated according to FIG. As shown in FIG. 5, the micro compartment 141 contains the target nucleic acid 101, the fluorescent probes 111, 112, 113, and 114, and the primer sets 151, 152, and 153 required for amplification of the target nucleic acid. 6 to 8 show cases where the target nucleic acids contained in the microcompartments 142, 143, and 144 are not the target nucleic acids 102 and 103, respectively. The correspondence relationship between the target nucleic acids 101 to 103 and the fluorescent probes 111 to 114 shown in FIGS. 5 to 8 is the same as the relationship shown in FIGS. As shown in FIG. 5 to FIG. 8, the micro compartment generated under the condition that the target nucleic acid is contained in 1 micro molecule or less in the micro compartment using the micro flow path of FIG. Can not be.
In this way, by dividing a sample solution containing a plurality of target nucleic acids into micro compartments, the target nucleic acid can be detected in each micro compartment.
＜検出工程＞
検出工程は、標的核酸にハイブリダイゼーションした蛍光プローブ毎に、蛍光プローブに対する励起光を照射して蛍光プローブの蛍光を検出する工程であり、検出手段により好適に実施することができる。
<Detection process>
The detection step is a step of detecting the fluorescence of the fluorescent probe by irradiating the fluorescent probe with the excitation light for each fluorescent probe hybridized to the target nucleic acid, and can be suitably performed by the detection means.
蛍光プローブの蛍光を検出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光プローブがハイブリダイゼーション可能な標的配列の領域を含むように核酸増幅反応を行い蛍光プローブの蛍光物質を遊離させ、遊離した蛍光物質に対し励起光を照射して、蛍光物質が発する蛍光を検出する方法などが挙げられる。具体的には、例えば、Ｔａｑ ｍａｎ（登録商標） ｐｒｏｂｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎなどの核酸プローブを用いる検出方法などが挙げられる。 The method for detecting the fluorescence of the fluorescent probe is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. For example, the fluorescent probe is subjected to a nucleic acid amplification reaction so as to include a target sequence region that can be hybridized to perform fluorescence. Examples include a method of detecting the fluorescence emitted from the fluorescent substance by releasing the fluorescent substance of the probe and irradiating the released fluorescent substance with excitation light. Specifically, for example, a detection method using a nucleic acid probe such as Taq man (registered trademark) probe or Molecular Beacon can be used.
核酸増幅反応としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＭＡＰ（Ｓｍａｒｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＨＣＲ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などが挙げられる。 The nucleic acid amplification reaction is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a PCR (Polymerase Chain Reaction) method, a NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) method, and a LAMP (Loop-Mediated Isomerization). ) Method, RCA (Rolling Circle Amplification) method, SMAP (Smart Amplification) method, RPA (Recombinase Amplification) method, HCR (Hybridization Chain Reaction) method and the like.
蛍光プローブに対する励起光を照射する手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、指向性が高いレーザー、ＬＥＤ、ハロゲンランプ、水銀灯等の光源などが挙げられる。これらの中でも、指向性が高いレーザーが好ましい。ＬＥＤ、ハロゲンランプ、水銀灯等の光源を用いる場合は、特定の周波数をカットするフィルターを光学系に組み込むことで利用が可能である。 There is no restriction | limiting in particular as a means to irradiate the excitation light with respect to a fluorescent probe, According to the objective, it can select suitably, For example, light sources, such as a laser with high directivity, LED, a halogen lamp, a mercury lamp, etc. are mentioned. Among these, a laser with high directivity is preferable. When a light source such as an LED, a halogen lamp, or a mercury lamp is used, it can be used by incorporating a filter that cuts a specific frequency into the optical system.
検出手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光顕微鏡、ＣＣＤカメラによる画像解析、光電子増倍管等の光センサによる電気信号等などが挙げられる。 There is no restriction | limiting in particular as a detection means, According to the objective, it can select suitably, For example, the electrical signal etc. by an optical sensor, such as image analysis by a fluorescence microscope and a CCD camera, a photomultiplier tube, etc. are mentioned.
蛍光を検出する方式としては、特に制限はなく、標的核酸含有試料を同一線上に並べて分画化して配し、標的核酸含有試料に対して励起光を照射して蛍光プローブの蛍光を検出するドロップレット方式と、分画化された各分画に標的核酸含有試料を配し、標的核酸含有試料に対して同時に励起光を照射して蛍光プローブの蛍光を検出するウェル方式が挙げられる。 The method for detecting fluorescence is not particularly limited, and the target nucleic acid-containing sample is arranged on the same line and fractionated, and the target nucleic acid-containing sample is irradiated with excitation light to detect the fluorescence of the fluorescent probe. A let method and a well method in which a target nucleic acid-containing sample is arranged in each fractionated fraction and the target nucleic acid-containing sample is irradiated with excitation light simultaneously to detect fluorescence of the fluorescent probe.
検出工程では、標的核酸含有試料調製工程により分画化した標的核酸含有試料には、標的核酸を１分子含むか否かの状態であるため、分画化した標的核酸含有試料毎の蛍光の検出結果により、簡便に複数の標的核酸を検出することができる。 In the detection step, the target nucleic acid-containing sample fractionated in the target nucleic acid-containing sample preparation step is in a state of whether or not the target nucleic acid-containing sample contains one molecule. Therefore, detection of fluorescence for each fractionated target nucleic acid-containing sample is detected. As a result, a plurality of target nucleic acids can be easily detected.
図９から図１１は、検出工程の一例を示す図である。図９から図１１では、ＰＣＲ法を用いるときの一例を示す。
分画化した標的核酸含有試料に含まれる標的核酸を検出するために、まず、分画化した標的核酸含有試料毎にＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ反応により、分画化した標的核酸含有試料毎に含まれる標的核酸に対する相補的な塩基配列を有する蛍光プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションした後に分解され、蛍光物質が遊離し、蛍光を検出できるようになる。
9 to 11 are diagrams illustrating an example of the detection process. 9 to 11 show an example when the PCR method is used.
In order to detect the target nucleic acid contained in the fractionated target nucleic acid-containing sample, first, a PCR reaction is performed for each fractionated target nucleic acid-containing sample. A fluorescent probe that has a complementary base sequence to the target nucleic acid contained in each fractionated target nucleic acid-containing sample is decomposed after hybridization to the target nucleic acid, and the fluorescent substance is released to detect fluorescence. become.
図９は、ドロップレット方式による蛍光検出方式の一例を示す図である。図９に示すように、ドロップレット方式においては、生成したドロップレット（分画と称することもある）を同一線上（ライン上）に配することができる移動手段と、蛍光プローブの蛍光物質に対する励起光を照射する照射手段と、励起した蛍光物質から発せられる蛍光を検出する検出器を用いる。
移動手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マイクロ流路などが挙げられる。
FIG. 9 is a diagram illustrating an example of a fluorescence detection method using a droplet method. As shown in FIG. 9, in the droplet method, generated droplets (sometimes referred to as fractions) can be arranged on the same line (on the line), and excitation of the fluorescent probe to the fluorescent substance. Irradiation means for irradiating light and a detector for detecting fluorescence emitted from the excited fluorescent substance are used.
There is no restriction | limiting in particular as a moving means, According to the objective, it can select suitably, For example, a microchannel etc. are mentioned.
例えば、図９に示すように、分画化した標的核酸含有試料を同一線上（ライン上）に並べて、分画化した標的核酸含有試料に蛍光プローブが有する蛍光物質に対する励起光を照射する。励起した蛍光物質から発せられる蛍光を分画毎に検出することにより、分画化した標的核酸含有試料毎に含まれる標的核酸の種類を特定する。
分画化した標的核酸含有試料に含まれる標的核酸の種類の特定は、図１０に示すように、蛍光Ａ’及び蛍光Ｂ’の検出器を同一線上（ライン上）に配し、供給される分画化した標的核酸含有試料に対して励起光Ａ及び励起光Ｂを順番に照射し、分画化した標的核酸含有試料毎に検出された蛍光の検出結果に基づいて、個々の分画化した標的核酸含有試料に含まれる標的核酸の種類を特定することができる。即ち、蛍光Ａ’のみ検出された分画は標的核酸１を、蛍光Ｂ’のみ検出された分画は標的核酸２を、蛍光Ａ’及び蛍光Ｂ’の両方を検出した分画は標的核酸３を含む分画であることが特定できる。
For example, as shown in FIG. 9, the fractionated target nucleic acid-containing samples are arranged on the same line (on the line), and the fractionated target nucleic acid-containing sample is irradiated with excitation light for the fluorescent substance possessed by the fluorescent probe. By detecting the fluorescence emitted from the excited fluorescent substance for each fraction, the type of target nucleic acid contained in each fractionated target nucleic acid-containing sample is specified.
As shown in FIG. 10, the types of target nucleic acids contained in the fractionated target nucleic acid-containing sample are supplied by arranging the detectors for fluorescence A ′ and fluorescence B ′ on the same line (on the line). The fractionated target nucleic acid-containing sample is irradiated with excitation light A and excitation light B in order, and individual fractionation is performed based on the fluorescence detection results detected for each fractionated target nucleic acid-containing sample. The type of target nucleic acid contained in the target nucleic acid-containing sample can be specified. That is, the fraction in which only fluorescence A ′ is detected is the target nucleic acid 1, the fraction in which only fluorescence B ′ is detected is the target nucleic acid 2, and the fraction in which both fluorescence A ′ and fluorescence B ′ are detected is the target nucleic acid 3. Can be identified.
図１１は、ウェル方式による蛍光検出方式の一例を示す図である。図１１に示すように、ウェル方式においては、分画化した標的核酸含有試料を分画（ウェル）に配して、ウェルに配した標的核酸含有試料に対して同時に蛍光プローブが有する蛍光物質に対する励起光を蛍光物質の種類毎に照射する。励起した蛍光物質から発せられる蛍光を、ウェルの位置に応じて検出する。得られた複数の蛍光の検出結果を統合し、ウェル毎に含まれる標的核酸の種類を特定する。例えば、図１１に示すように、複数のウェルに標的核酸含有試料を配し、配した標的核酸含有試料の全てに対して励起光を同時に照射し、ウェル毎に検出された蛍光の検出結果に基づいて、個々のウェルに含まれる標的核酸の種類を特定することができる。即ち、蛍光Ａ’のみ検出されたウェルは標的核酸１を、蛍光Ｂ’のみ検出されたウェルは標的核酸２を、蛍光Ａ’及び蛍光Ｂ’の両方を検出したウェルは標的核酸３を含む分画であることが特定できる。 FIG. 11 is a diagram illustrating an example of a fluorescence detection method using a well method. As shown in FIG. 11, in the well method, the fractionated target nucleic acid-containing sample is placed in a fraction (well), and simultaneously with the target nucleic acid-containing sample placed in the well, the fluorescent probe has a fluorescent substance. Excitation light is irradiated for each type of fluorescent substance. Fluorescence emitted from the excited fluorescent material is detected according to the position of the well. The obtained fluorescence detection results are integrated, and the type of target nucleic acid contained in each well is specified. For example, as shown in FIG. 11, target nucleic acid-containing samples are arranged in a plurality of wells, all of the arranged target nucleic acid-containing samples are simultaneously irradiated with excitation light, and fluorescence detection results detected for each well are obtained. Based on this, the type of target nucleic acid contained in each well can be identified. That is, a well in which only fluorescence A ′ is detected contains target nucleic acid 1, a well in which only fluorescence B ′ is detected contains target nucleic acid 2, and a well in which both fluorescence A ′ and fluorescence B ′ are detected contains target nucleic acid 3. Can be identified.
本発明の核酸検出方法は、本発明のプローブセットを用いることにより、複数の標的核酸を、簡便に検出することができるため、少ない検出器を用いる場合においてもマルチプレックス検出数を十分確保することができる。また、本発明の核酸検出方法は、分画化した標的核酸含有試料に含まれる標的核酸を１分子含むようにすることができるため、定量的な解析に用いることができる。 Since the nucleic acid detection method of the present invention can easily detect a plurality of target nucleic acids by using the probe set of the present invention, a sufficient number of multiplex detections can be ensured even when a small number of detectors are used. Can do. Further, the nucleic acid detection method of the present invention can be used for quantitative analysis because it can contain one molecule of target nucleic acid contained in the fractionated target nucleic acid-containing sample.
本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞ ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸を検出するためのプローブセットであって、
前記プローブセットは、
所定の塩基配列と蛍光ピーク波長との組合せを備えた蛍光プローブをｍ種（ｍはｎよりも小さな自然数）含み、
前記標的核酸に含まれる一の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有し、
前記標的核酸に含まれる前記一の標的核酸とは異なる他の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有する
ことを特徴とするプローブセットである。
＜２＞ Ｘ（ｎｍ）（ただし、Ｘは正の実数）の蛍光ピーク波長を有する一の蛍光プローブに対して、Ｙ（ｎｍ）（ただし、Ｙは実数である）以上離れた他の蛍光ピーク波長を有する他の蛍光プローブを有する前記＜１＞に記載のプローブセットである。
＜３＞ 前記標的核酸が、ＤＮＡ及びＲＮＡの少なくともいずれかである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のプローブセットである。
＜４＞ 前記蛍光プローブが、前記蛍光プローブの所定の塩基配列の５’末端又は３’末端に蛍光物質を有し、かつ前記蛍光物質を有しない末端に蛍光物質の発光を抑制する消光物質を有する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のプローブセットである。
＜５＞ ｎ種（ｎは３以上の自然数）の標的核酸を検出するための方法であって、
一の標的核酸と、請求項１から４のいずれかに記載のプローブセットと、を含む標的核酸含有試料を調製する標的核酸含有試料調製工程と、
前記標的核酸にハイブリダイゼーションした前記蛍光プローブ毎に、前記蛍光プローブに対する励起光を照射して前記蛍光プローブの蛍光を検出する検出工程と、
を含むことを特徴とする核酸検出方法である。
＜６＞ 前記標的核酸含有試料を同一線上に並べて分画化して配し、前記標的核酸含有試料に対して前記励起光を照射して前記蛍光プローブの蛍光を検出する前記＜５＞に記載の核酸検出方法である。
＜７＞ 分画化された各分画に前記標的核酸含有試料を配し、前記標的核酸含有試料に対して同時に前記励起光を照射して前記蛍光プローブの蛍光を検出する前記＜５＞に記載の核酸検出方法である。
As an aspect of this invention, it is as follows, for example.
<1> A probe set for detecting n types (n is a natural number of 3 or more) of target nucleic acids,
The probe set is
Including m types of fluorescent probes having a combination of a predetermined base sequence and a fluorescent peak wavelength (m is a natural number smaller than n),
The two or more fluorescent probes have a base sequence capable of hybridization to one target nucleic acid contained in the target nucleic acid,
Two or more kinds of the fluorescent probes have a base sequence capable of hybridizing to another target nucleic acid different from the one target nucleic acid contained in the target nucleic acid.
<2> Other fluorescent peaks separated by Y (nm) (where Y is a real number) or more with respect to one fluorescent probe having a fluorescent peak wavelength of X (nm) (where X is a positive real number) It is a probe set as described in said <1> which has another fluorescent probe which has a wavelength.
<3> The probe set according to any one of <1> to <2>, wherein the target nucleic acid is at least one of DNA and RNA.
<4> The fluorescent probe has a quenching substance that has a fluorescent substance at the 5 ′ end or the 3 ′ end of a predetermined base sequence of the fluorescent probe and suppresses the emission of the fluorescent substance at an end that does not have the fluorescent substance. The probe set according to any one of <1> to <3>.
<5> A method for detecting n types (n is a natural number of 3 or more) of target nucleic acids,
A target nucleic acid-containing sample preparation step of preparing a target nucleic acid-containing sample comprising one target nucleic acid and the probe set according to any one of claims 1 to 4;
For each fluorescent probe hybridized to the target nucleic acid, a detection step of detecting the fluorescence of the fluorescent probe by irradiating excitation light to the fluorescent probe;
A method for detecting a nucleic acid, comprising:
<6> The target nucleic acid-containing sample according to <5>, wherein the target nucleic acid-containing sample is arranged and fractionated, and the target nucleic acid-containing sample is irradiated with the excitation light to detect fluorescence of the fluorescent probe. It is a nucleic acid detection method.
<7> In the above <5>, the target nucleic acid-containing sample is arranged in each fractionated fraction, and the target nucleic acid-containing sample is simultaneously irradiated with the excitation light to detect fluorescence of the fluorescent probe. It is a nucleic acid detection method of description.
前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のプローブセット、前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載の核酸検出方法によると、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。 According to the probe set according to any one of <1> to <4> and the nucleic acid detection method according to any one of <5> to <7>, the conventional problems are solved, and Aim can be achieved.
１０１、１０２、１０３ 標的核酸
１１１、１１２、１１３、１１４ 蛍光プローブ
１２１、１２２、１２３ 蛍光物質
１４１、１４２、１４３ 標的核酸含有試料
101, 102, 103 Target nucleic acid 111, 112, 113, 114 Fluorescent probe 121, 122, 123 Fluorescent substance 141, 142, 143 Target nucleic acid-containing sample
Claims (7)
前記プローブセットは、
所定の塩基配列と蛍光ピーク波長との組合せを備えた蛍光プローブをｍ種（ｍはｎよりも小さな自然数）含み、
前記標的核酸に含まれる一の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有し、
前記標的核酸に含まれる前記一の標的核酸とは異なる他の標的核酸に対し、ハイブリダイゼーション可能な塩基配列を２種以上の前記蛍光プローブが有する
ことを特徴とするプローブセット。 A probe set for detecting n types (n is a natural number of 3 or more) of target nucleic acids,
The probe set is
Including m types of fluorescent probes having a combination of a predetermined base sequence and a fluorescent peak wavelength (m is a natural number smaller than n),
The two or more fluorescent probes have a base sequence capable of hybridization to one target nucleic acid contained in the target nucleic acid,
Two or more types of said fluorescent probes have a base sequence which can hybridize with the other target nucleic acid different from said one target nucleic acid contained in said target nucleic acid. The probe set characterized by the above-mentioned.
一の標的核酸と、請求項１から４のいずれかに記載のプローブセットと、を含む標的核酸含有試料を調製する標的核酸含有試料調製工程と、
前記標的核酸にハイブリダイゼーションした前記蛍光プローブ毎に、前記蛍光プローブに対する励起光を照射して前記蛍光プローブの蛍光を検出する検出工程と、
を含むことを特徴とする核酸検出方法。 A method for detecting n types (n is a natural number of 3 or more) of target nucleic acids,
A target nucleic acid-containing sample preparation step of preparing a target nucleic acid-containing sample comprising one target nucleic acid and the probe set according to any one of claims 1 to 4;
For each fluorescent probe hybridized to the target nucleic acid, a detection step of detecting the fluorescence of the fluorescent probe by irradiating excitation light to the fluorescent probe;
A nucleic acid detection method comprising:
The nucleic acid detection according to claim 5, wherein the target nucleic acid-containing sample is arranged in each fractionated fraction, and the excitation light is simultaneously irradiated to the target nucleic acid-containing sample to detect fluorescence of the fluorescent probe. Method.
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