JP2019116456A - Anti-aging skin composition for external use - Google Patents
Anti-aging skin composition for external use Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019116456A JP2019116456A JP2017252175A JP2017252175A JP2019116456A JP 2019116456 A JP2019116456 A JP 2019116456A JP 2017252175 A JP2017252175 A JP 2017252175A JP 2017252175 A JP2017252175 A JP 2017252175A JP 2019116456 A JP2019116456 A JP 2019116456A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- composition
- liposome
- rice bran
- lecithin
- bran oil
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Abstract
Description
本発明は、抗皮膚老化外用組成物等に関する。 The present invention relates to an anti-skin aging external composition and the like.
近年、特に美容分野において、抗皮膚老化効果を奏する外用組成物の需要はますます高まってきている。中でも皮膚のシワ又はたるみの抑制への関心は非常に高い。 In recent years, in particular in the cosmetic field, the demand for an external composition that exerts an anti-skin aging effect is increasing more and more. Above all, interest in the control of skin wrinkles or sagging is very high.
皮膚においてシワやたるみが形成される一因として、光（紫外線、特にＵＶＡ）の皮膚照射が挙げられる。光の中でも紫外線（特にＵＶＡ）は真皮まで到達し、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を介して組織を傷害し、皮膚老化（例えば、表皮の肥厚、深く大きなシワの形成やたるみ）を引き起こすと考えられている（非特許文献１）。そのため、皮膚において抗酸化効果を奏する成分は、ＲＯＳの生成を抑制することにより、皮膚老化を抑制することが期待される。 One of the causes of the formation of wrinkles and sags in the skin is skin irradiation with light (ultraviolet light, particularly UVA). Among light, ultraviolet rays (especially UVA) reach the dermis, damage tissues through the generation of reactive oxygen species (ROS), and cause skin aging (eg, thickening of the epidermis, formation of deep wrinkles and sagging). It is considered (nonpatent literature 1). Therefore, a component that exerts an antioxidant effect in the skin is expected to suppress skin aging by suppressing the generation of ROS.
また、皮膚光老化には、真皮弾性繊維や膠原繊維の分解及び減少が関与している。そして、真皮構成成分の分解には、Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＭＭＰ）が関与しており、特にＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９は、基底膜を構成するＩＶ型コラーゲンや、真皮を構成するエラスチン、Ｉ型コラーゲン、及びＩＩＩ型コラーゲンを分解することが知られている。このＭＭＰ−２やＭＭＰ−９が真皮コラーゲンや基底膜を分解し、皮膚構造が保持できなくなることで皮膚は大きく陥没し、深いシワの形成に至る。ＭＭＰ−２やＭＭＰ−９はＵＶ照射やＲＯＳ暴露によりケラチノサイトや線維芽細胞から誘導されるとも考えられている（非特許文献１）。よって、ＲＯＳの生成を抑制する成分のなかでも、ＭＭＰ−２やＭＭＰ−９の誘導をも抑制できる成分が、特に抗皮膚老化に効果的であると期待される。 Also, skin photoaging involves the degradation and reduction of dermal elastic fibers and collagen fibers. And, Matrix metalloproteinase (MMP) is involved in the decomposition of the dermal component, and in particular, MMP-2 and MMP-9 are type IV collagen constituting the basement membrane, elastin constituting the dermis, type I collagen And are known to degrade type III collagen. The MMP-2 and MMP-9 degrade the dermal collagen and the basement membrane, and the skin structure can not be retained, resulting in a large depression of the skin, leading to the formation of deep wrinkles. MMP-2 and MMP-9 are also considered to be derived from keratinocytes and fibroblasts by UV irradiation and ROS exposure (Non-patent Document 1). Therefore, among the components that suppress the generation of ROS, components that can also suppress the induction of MMP-2 and MMP-9 are expected to be particularly effective for anti-skin aging.
本発明は、効率的に抗皮膚老化効果を得るための手法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for efficiently obtaining an anti-skin aging effect.
本発明者らは、米糠油をリポソームに内包して用いることにより、優れた抗皮膚老化効果を得ることができる可能性を見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。 The present inventors have found the possibility that an excellent anti-skin aging effect can be obtained by encapsulating rice bran oil in liposomes, and further improvement has been made to complete the present invention.
本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
米糠油内包リポソームを含む、抗皮膚老化外用組成物。
項２．
皮膚老化が、シワ又はたるみである、項１に記載の組成物。
項３．
皮膚老化が、光による皮膚老化である、項１又は２に記載の組成物。
項４．
リポソームに内包される米糠油の、当該組成物に対する含有量が、０．００５質量％以上１質量％未満である、項１〜３のいずれかに記載の組成物。
項５．
化粧品組成物である、項１〜４のいずれかに記載の組成物。
The present invention includes, for example, the subject matters described in the following sections.
Item 1.
The anti-skin aging external composition containing a rice bran oil inclusion liposome.
Item 2.
Item 2. The composition according to item 1, wherein the skin aging is wrinkles or sagging.
Item 3.
The composition according to Item 1 or 2, wherein the skin aging is skin aging by light.
Item 4.
The composition according to any one of Items 1 to 3, wherein the content of rice bran oil contained in the liposome with respect to the composition is 0.005% by mass or more and less than 1% by mass.
Item 5.
The composition according to any one of Items 1 to 4, which is a cosmetic composition.
本発明により、優れた抗皮膚老化効果が奏される外用組成物が提供される。 According to the present invention, there is provided an external composition which exhibits excellent anti-skin aging effects.
以下、本発明の各実施形態について、さらに詳細に説明する。 Hereinafter, each embodiment of the present invention will be described in more detail.
本発明に包含される抗皮膚老化組成物は、米糠油内包リポソームを含む外用組成物である。以下当該組成物を、本発明の抗皮膚老化外用組成物と呼ぶことがある。 The anti-skin aging composition included in the present invention is an external composition comprising rice bran oil-encapsulating liposomes. Hereinafter, the composition may be referred to as the anti-skin aging composition for external use of the present invention.
リポソームは、リン脂質を主体とした脂質を十分量の水で水和することにより形成される二分子膜を有する脂質小胞体である。リポソームは脂質分子膜層の数に基づいて分類され、具体的には、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）と一枚膜リポソーム（ＳＬＶ）に分類される。また、一枚膜リポソームは、脂質小胞体の大きさに応じて更に分類されることがあり、具体的には、大きさの小さいほうから順に、ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＬＵＶ（ｌａｒｇｅ ｎｉｌａｍｅｌｌａｖｅｓｉｃｌｅ）、ＧＵＶ（ｇｉａｎｔ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ ｖｅｓｉｃｌｅ）に分類される。本発明のリポソームは、これらのいずれであってもよい。好ましいのはＭＬＶである。本発明では、リポソームの大きさは、特に制限はされないが、平均粒子径として、例えば、３０〜１０００ｎｍが好ましく、３０〜６００ｎｍがより好ましく、５０〜３００ｎｍがさらに好ましい。 Liposomes are lipid vesicles having a bilayer membrane formed by hydration of a phospholipid-based lipid with a sufficient amount of water. Liposomes are classified based on the number of lipid molecule membrane layers, and specifically, they are classified into multilamellar liposomes (MLV) and unilamellar liposomes (SLV). In addition, unilamellar vesicles may be further classified according to the size of lipid vesicles, specifically, in order from the smaller size, SUV (small unilamella vesicle), LUV (large nilamellavesicle) And GUV (giant unilamella vesicle). The liposome of the present invention may be any of these. Preferred is MLV. In the present invention, the size of the liposome is not particularly limited, but as the average particle diameter, for example, 30 to 1000 nm is preferable, 30 to 600 nm is more preferable, and 50 to 300 nm is more preferable.
米糠油としては、米糠から得られる油であれば特に制限はされない。米糠油の製造には、溶媒（例えばｎ−ヘキサン）により米糠から抽出する方法（溶媒抽出法）や、米糠を圧搾法により圧搾処理する方法（圧搾法）等を用いることができる。本発明には、溶媒抽出米糠油、及び圧搾米糠油のいずれも用いることができ、特に圧搾米糠油を用いることが好ましい。圧搾処理の方法は公知であり、例えば加熱焙煎処理され１００〜１１５℃程度になった米糠を低温連続圧搾機（例えば（株）テクノシグマ社より販売されているミラクルチャンバー）により圧搾する方法が挙げられる。本発明ではこれに限られず公知の圧搾方法を適用できる。圧搾の程度は、特に限定はされないが、圧搾後の脱脂米糠中の脂質が５〜１５重量％、好ましくは５〜１４重量％、より好ましくは５〜１２重量％となる程度である。 The rice bran oil is not particularly limited as long as it is an oil obtained from rice bran. For the production of rice bran oil, a method of extracting from rice bran with a solvent (for example, n-hexane) (solvent extraction method), a method of pressing rice bran by compression method (compression method) or the like can be used. In the present invention, any of solvent-extracted rice bran oil and pressed rice bran oil can be used, and it is particularly preferable to use pressed rice bran oil. The method of squeezing treatment is known, for example, a method of squeezing the heated and roasted rice bran at about 100 to 115 ° C. with a low-temperature continuous press (for example, Miracle chamber sold by Techno Sigma Co., Ltd.) It can be mentioned. The present invention is not limited to this, and known squeezing methods can be applied. The degree of pressing is not particularly limited, but it is about 5 to 15% by weight, preferably 5 to 14% by weight, more preferably 5 to 12% by weight of lipids in defatted rice bran after pressing.
また、米糠油は、市販品を用いることもできる。市販品としては、例えばつや姫こめ油、こめ油白絞油、コメーユ（以上、三和油脂）、ライストリエノール、ライステロールエステル、米サラダ油（以上、築野食品）、コメヌカ油、オリザオイル（以上、オリザ油化）などが挙げられる。 Moreover, a commercial item can also be used for rice bran oil. Commercially available products include, for example, luster oil, rice oil white oil, rice oil (above, Sanwa oil), rice trienol, lysterol ester, rice salad oil (above, Tsukino food), rice bran oil, oriza oil ( As mentioned above, Oryza oil conversion etc. are mentioned.
また、米糠油にはγ−オリザノールが含まれることが知られている。通常、米糠油には０．１〜３質量％程度のγ−オリザノールが含まれている。本発明に用いる米糠油にはγ−オリザノールが０．１〜３質量％程度含まれることが好ましく、０．２〜２．５質量％程度含まれることがより好ましく、０．３〜２質量％程度含まれることがさらに好ましく、０．５〜１．５質量％程度含まれることがよりさらに好ましい。 Moreover, it is known that rice bran oil contains γ-oryzanol. Usually, rice bran oil contains about 0.1 to 3% by mass of γ-oryzanol. The rice bran oil used in the present invention preferably contains about 0.1 to 3% by mass, more preferably about 0.2 to 2.5% by mass, and more preferably 0.3 to 2% by mass of γ-oryzanol. It is further preferable to be contained in a certain degree, and it is further preferable to be contained in an amount of about 0.5 to 1.5% by mass.
リポソームに内包される米糠油量も特に制限はされないが、例えばリポソーム膜成分（好ましくはリポソームに含まれるリン脂質）１０質量部に対して、０．４〜６質量部、１〜５質量部程度、又は２〜４質量部程度が例示される。 The amount of rice bran oil contained in the liposome is not particularly limited, but for example, 0.4 to 6 parts by mass, about 1 to 5 parts by mass with respect to 10 parts by mass of the liposome membrane component (preferably phospholipid contained in the liposome) Or about 2 to 4 parts by mass.
また、米糠油内包リポソームを含む組成物において、米糠油は、当該組成物中に、例えば０．００５質量％以上１質量％未満、０．０１〜０．８質量％程度、０．０２〜０．５質量％程度、又は０．０５〜０．３質量％程度含まれることが好ましい。また、リポソームに内包される米糠油の、当該組成物に対する含有量が、例えば０．００５質量％以上１質量％未満、０．０１〜０．８質量％程度、０．０２〜０．５質量％程度、又は０．０５〜０．３質量％程度であることが好ましい。また、当該組成物に含まれる米糠油のうち、例えば、８０質量％〜１００質量％、９０質量％〜１００質量％、又は実質的に１００質量％が、米糠油内包リポソームに含まれることが好ましい。なお当該組成物に含まれる米糠油のうち、実質的に１００質量％が、米糠油内包リポソームに含まれるとは、リポソームに全ての米糠油を内包させるよう組成物を製造した場合において、不可避的にリポソーム外にも米糠油が存在する場合をも包含することを意味する。 In the composition containing rice bran oil inclusion liposome, rice bran oil is contained in the composition, for example, 0.005 mass% or more and less than 1 mass%, about 0.01 to 0.8 mass%, 0.02 to 0. It is preferable that about 0.5 mass% or about 0.05-0.3 mass% is contained. In addition, the content of rice bran oil contained in the liposome with respect to the composition is, for example, 0.005% by mass or more and less than 1% by mass, about 0.01 to 0.8% by mass, 0.02 to 0.5% It is preferable that it is about%, or about 0.05 to 0.3 mass%. In addition, it is preferable that, for example, 80% by mass to 100% by mass, 90% by mass to 100% by mass, or substantially 100% by mass of the rice bran oil contained in the composition is contained in the rice bran oil inclusion liposome . The fact that substantially 100% by mass of the rice bran oil contained in the composition is contained in the rice bran oil inclusion liposome means that the composition is produced so as to encapsulate all the rice bran oil in the liposome. In addition to liposomes, it is also meant to include the case where rice bran oil is present.
米糠油をリポソームに包含させる方法としては、公知の方法又は公知の方法から容易に想到できる方法を用いることができ、通常は水溶液中にリポソームが分散している状態、すなわちリポソーム懸濁液として得ることができる。リポソーム懸濁液の製造方法は特に限定されないが、例えば、次の方法が挙げられる。（１）リン脂質、リポソームに内包する成分（オリザノールを含む；以下同じ）、及び必要に応じてその他酸化防止剤などを均質に混合した後、水和し、リポソームを形成させる方法（当該水和は、好ましくはｐＨ調整剤、多価アルコール、糖類などを含む水溶液で行う）。（２）リン脂質、リポソームに内包する成分、及び必要に応じてその他酸化防止剤などをアルコール、多価アルコールなどに溶解し、ｐＨ調整剤、多価アルコール、糖類などを含む水溶液で水和し、リポソームを調製する方法。（３）超音波、フレンチプレスやホモジナイザーを用いて、リン脂質、リポソームに内包する成分、及び必要に応じてその他酸化防止剤などを水中で複合化させ、リポソームを調製する方法。（４）エタノールにリン脂質、リポソームに内包する成分、及び必要に応じてその他酸化防止剤などを混合溶解し、このエタノール溶液を塩化カリウム水溶液に添加した後にエタノールを除去しリポソームを調製する方法。米糠油は、そのまま使用してもよいし、少量の溶媒（例えば水又は水系溶媒）に予め溶解させた後に使用することができる。 As a method of incorporating rice bran oil into the liposome, a known method or a method easily conceived from a known method can be used, and usually, the liposome is dispersed in an aqueous solution, ie, obtained as a liposome suspension. be able to. The method for producing the liposome suspension is not particularly limited, and the following method may, for example, be mentioned. (1) A method of forming a liposome by uniformly mixing a phospholipid, a component to be encapsulated in a liposome (including an oryzanol; the same as the following), and, if necessary, other antioxidant etc. Is preferably performed in an aqueous solution containing a pH adjuster, a polyhydric alcohol, a saccharide and the like). (2) Dissolve phospholipids, components to be encapsulated in liposomes, and, if necessary, other antioxidants, etc. in alcohol, polyhydric alcohol, etc., and hydrate with aqueous solution containing pH adjuster, polyhydric alcohol, saccharides, etc. , A method of preparing liposomes. (3) A method of preparing a liposome by complexing phospholipids, a component to be encapsulated in a liposome and, if necessary, an antioxidant etc. in water using an ultrasonic wave, a French press or a homogenizer. (4) A method of preparing a liposome by mixing and dissolving a phospholipid, a component to be encapsulated in a liposome, and, if necessary, other antioxidants in ethanol, adding this ethanol solution to an aqueous potassium chloride solution and removing ethanol. Rice bran oil may be used as it is or may be used after being pre-dissolved in a small amount of solvent (eg, water or aqueous solvent).
使用するリン脂質としては、特に制限されないが、大豆レシチン、ナタネレシチン、コーンレシチン、綿実油レシチン、ひまわりレシチン、卵黄レシチン、卵白レシチン、ピーナッツレシチンなどが例示される。レシチンはホスファチジルコリン又は１，２−ジアシルグリセロール ３−ホスホコリンとも称され、一般的に、グリセロールの１位及び２位に脂肪酸が結合している。本発明では、例えば、１位及び２位の両方又は片方に炭素数１２〜２４の不飽和脂肪酸が結合しているレシチンを使用することが好ましく、１位に炭素数１２〜２４の飽和脂肪酸、２位に炭素数１２〜２４の不飽和脂肪酸が結合しているレシチンを使用することがより好ましい。ここで、飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸は直鎖状及び分枝状のいずれでもよい。また、レシチンに代えて又は加えて、レシチン誘導体を用いることもできる。レシチン誘導体としては、水素添加レシチンや、前記例示のレシチン中のリン脂質にポリエチレングリコール、アミノグリカン類等を導入した化合物が例示できる。このうち、大豆レシチン、卵黄レシチン、水素添加大豆レシチン、水素添加卵黄レシチンが好ましく、特に大豆レシチン、卵黄レシチンが好ましい。また、レシチン中に存在するリン脂質（例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン等）の純度を高めた精製レシチンも好ましく使用することができる。これらレシチン又はレシチン誘導体は１種または２種以上を組み合わせて使用することができる。本発明で使用するレシチンは、例えばＳＬＰ−ＰＣ３５（フォスファチジルコリン（以下ＰＣと略することがある）含量３５％）、ＳＬＰ−ＰＣ７０（ＰＣ含量７０％）、（ＳＬＰ−ホワイトリゾ（リゾレシチン）（以上、辻製油（株）社製）；卵黄レシチンＬＰＬ−２０Ｓ、２０Ｗ（リゾリン脂質含量約２０％）、卵黄レシチンＰＬ−３０Ｓ（フォスファチジルコリン含量約３０％）（以上、キューピー（株）社製）；大豆レシチン、卵黄レシチン、フォスファチジルコリン、フォスファチジルセリン、グリセロホスホコリン（以上、Ｈホススタイン社製）；Ｌｅｃｉｇｒａｎ（粉末レシチン）、Ｍｅｔａｒｉｎ（分画レシチン）、Ｌｅｃｉｍｕｌｔｈｉｎ（粉末リゾレシチン）（以上、Ｃａｒｇｉｌｌ社製）；レシオンＰ（リン脂質含量９０％以上）、レシオンＬＰ−１（レシチン含量約７０％）、レシマール（酵素分解レシチン、リン脂質含量５０％）（以上、理研ビタミン社製）；ニチユＰＳ２５（ホスファチジルセリン含量約２５％）、ニチユＰＳ５０（ホスファチジルセリン含量約５０％）；、サンレシチンＡ−１（酵素分解大豆レシチン、レシチン含量約３０％）などから商業的に入手することもできる。 The phospholipid to be used is not particularly limited, and soybean lecithin, rapeseed lecithin, corn lecithin, cottonseed oil lecithin, sunflower lecithin, egg yolk lecithin, egg white lecithin, peanut lecithin and the like are exemplified. Lecithin is also referred to as phosphatidylcholine or 1,2-diacylglycerol 3-phosphocholine, and generally, fatty acids are attached to the 1- and 2-positions of glycerol. In the present invention, for example, it is preferable to use a lecithin in which unsaturated fatty acid having 12 to 24 carbon atoms is bonded to one or both of the 1 and 2 positions, and saturated fatty acid having 12 to 24 carbon atoms at 1 position, It is more preferable to use a lecithin in which an unsaturated fatty acid having 12 to 24 carbon atoms is bound to the 2-position. Here, the saturated fatty acid and the unsaturated fatty acid may be linear or branched. Also, instead of or in addition to lecithin, lecithin derivatives can be used. Examples of lecithin derivatives include hydrogenated lecithin and compounds in which polyethylene glycol, aminoglycans and the like are introduced into the phospholipids in lecithin described above. Among these, soy bean lecithin, egg yolk lecithin, hydrogenated soy bean lecithin and hydrogenated egg yolk lecithin are preferable, and soy bean lecithin and egg yolk lecithin are particularly preferable. In addition, purified lecithin in which the purity of phospholipids (for example, phosphatidyl choline, phosphatidyl serine, phosphatidyl ethanolamine, phosphatidyl inositol, phosphatidyl glycerol, sphingomyelin, etc.) present in lecithin can be preferably used. These lecithin or lecithin derivatives can be used alone or in combination of two or more. The lecithin used in the present invention is, for example, SLP-PC35 (phosphate choline (hereinafter sometimes abbreviated as PC) content 35%), SLP-PC70 (PC content 70%), (SLP-white lyso (lyso lecithin) Egg yolk lecithin LPL-20S, 20 W (lysophospholipid content about 20%), egg yolk lecithin PL-30S (phosphatidyl choline content about 30%) (above, Kewpie Co., Ltd.) Soy lecithin, egg yolk lecithin, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, glycerophosphocholine (above, manufactured by H Phosstein); Lecigran (powder lecithin), Metarin (fraction lecithin), Lecimulthin (powder lysolecithin) (As mentioned above, Cargill company); Retiton P (phospholipid content 0% or more), Ration LP-1 (lecithin content: about 70%), Resimal (enzyme-degraded lecithin, phospholipid content: 50%) (above, manufactured by Riken Vitamin Co., Ltd.); It is also commercially available from PS50 (phosphatidylserine content: about 50%); San Lecithin A-1 (enzyme-degraded soy lecithin, about 30% lecithin content) and the like.
本発明の抗皮膚老化外用組成物は、皮膚老化の中でも、特に皮膚のシワ又はたるみに効果的であり、これらの抑制のために好ましく用いることができる。また、加齢による皮膚老化抑制のためにも用いることもできるが、特に光による皮膚老化抑制のために好ましく用いることができる。光の中でも、紫外線（特にＵＶＡ）の照射による皮膚老化を抑制するために好ましく用いることができる。 The anti-skin aging external composition of the present invention is particularly effective in skin aging, particularly against wrinkles or sagging of the skin, and can be preferably used to suppress these. Moreover, although it can also use also for skin aging suppression by aging, it can use preferably especially for skin aging suppression by light. Among light, it can be preferably used to suppress skin aging due to irradiation with ultraviolet light (especially, UVA).
本発明の抗皮膚老化外用組成物として、上記リポソーム懸濁液をそのまま用いることもできるし、他成分をさらに加えて用いることもできる。 The above-mentioned liposome suspension can be used as it is as the anti-skin aging external composition of the present invention, or other components can be further added and used.
他成分として、例えば、高分子、蛋白質及びその加水分解物、ムコ多糖類などを配合することができる。高分子としては、例えばカルボキシビニルポリマー、キサンタンガム、アルギン酸ナトリウムなどが例示できるが、これらに限定されるものでもない。カルボキシビニルポリマー、キサンタンガムが好ましく、特にカルボキシビニルポリマーが好ましい。これら高分子等は１種または２種以上を組み合わせて使用できる。高分子の配合量は特に限定しないが、０．００１〜２０％、好ましくは ０．００５〜１０％、特に好ましくは ０．０１〜５％である。蛋白質及びその加水分解物としては、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、カゼイン、それらの加水分解物、加水分解物の塩、加水分解物のエステル、あるいは酵素処理されたものが挙げられるが、特にコラーゲンが好ましい。蛋白質及びその加水分解物の配合量は特に限定しないが、０．００１〜５％、好ましくは０．０１〜１％である。ムコ多糖としては、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ムコイチン硫酸、ヘパリンとその誘導体、及びそれらの塩類などが挙げられるが、特にコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸及びこれらのナトリウム塩が好ましい。ムコ多糖の配合量は特に限定しないが、 ０．０００５〜５％、好ましくは０．００１〜１％である。 As other components, for example, polymers, proteins and their hydrolysates, mucopolysaccharides and the like can be blended. Examples of the polymer include, but are not limited to, carboxyvinyl polymer, xanthan gum, sodium alginate and the like. Carboxyvinyl polymers, xanthan gum are preferred, and in particular carboxyvinyl polymers are preferred. These polymers can be used alone or in combination of two or more. The blending amount of the polymer is not particularly limited, but is 0.001 to 20%, preferably 0.005 to 10%, and particularly preferably 0.01 to 5%. Examples of proteins and their hydrolysates include collagen, elastin, keratin, casein, their hydrolysates, salts of hydrolysates, esters of hydrolysates, and those treated with enzymes, with collagen being particularly preferred. . Although the compounding quantity of a protein and its hydrolyzate is not specifically limited, It is 0.001 to 5%, Preferably it is 0.01 to 1%. Mucopolysaccharides include chondroitin sulfate, hyaluronic acid, dermatan sulfate, heparan sulfate, mucoitin sulfate, heparin and derivatives thereof, salts thereof and the like, with chondroitin sulfate, hyaluronic acid and sodium salts thereof being particularly preferred. Although the compounding quantity of mucopolysaccharide is not specifically limited, It is 0.0005 to 5%, Preferably it is 0.001 to 1%.
また、この他にも、本発明の効果を損なわない範囲において、通常外用組成物に用いられる公知の成分を配合する（リポソーム分散液の連続相に含ませる）こともできる。このような成分としては、保湿剤、水溶性高分子、油成分、着色剤、酸化防止剤、金属封鎖剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、清涼剤、香料、紫外線吸収・散乱剤、抗酸化剤、薬効成分などが例示できる。 In addition to the above, known components which are usually used for the composition for external use can be blended (included in the continuous phase of the liposome dispersion liquid) within the range not impairing the effects of the present invention. Such components include moisturizers, water-soluble polymers, oil components, colorants, antioxidants, sequestering agents, preservatives, pH adjusters, fresheners, perfumes, ultraviolet light absorbing and scattering agents, antioxidants And medicinal ingredients.
また、本発明を外用組成物として用いる場合、リポソームの調製において、本発明の効果を損なわない範囲で、通常リポソームに含ませ得る成分を用いることもできる。例えば、アスコルビン酸などの抗酸化剤、乳酸、クエン酸などの有機酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミンなどの脂質、キトサン、フコイダン、ヒアルロン酸などの天然高分子、ポリエチレングリコール、カルボキシビニルポリマーなどの合成高分子、トレハロース、ラクチュロース、マルチトールなどの糖質、グリセリンなどのポリオール等が例示される。 When the present invention is used as a composition for external use, it is also possible to use, in preparation of the liposome, a component that can be generally contained in the liposome, as long as the effects of the present invention are not impaired. For example, antioxidants such as ascorbic acid, organic acids such as lactic acid and citric acid, lipids such as phosphatidylglycerol and phosphatidylethanolamine, natural polymers such as chitosan, fucoidan and hyaluronic acid, and synthesis of polyethylene glycol and carboxyvinyl polymer Examples thereof include macromolecules, saccharides such as trehalose, lactulose and maltitol, and polyols such as glycerin.
本発明の組成物は、外用組成物（特に皮膚に適用する組成物）として用いることが好ましい。外用組成物としては、例えば医薬組成物、医薬部外品組成物、及び化粧品組成物が例示される。剤形としては、特に限定するものではないが、フェイスパック、ペースト、軟膏、クリーム、ジェル、ローション、乳液、美容液、化粧水、スプレー剤などが挙げられる。 The composition of the present invention is preferably used as a composition for external use (in particular, a composition applied to the skin). Examples of the composition for external use include pharmaceutical compositions, quasi-drug compositions and cosmetic compositions. Examples of the dosage form include, but are not limited to, face pack, paste, ointment, cream, gel, lotion, milky lotion, cosmetic liquid, lotion, spray and the like.
本発明の組成物を外用組成物として用いる場合、適用対象は特に限定されないが、好ましくは抗皮膚老化（特にシワ又はたるみの抑制）を望むヒトである。 When the composition of the present invention is used as a composition for external use, the object of application is not particularly limited, but preferably it is a human who desires anti-skin aging (in particular, suppression of wrinkles or sag).
本発明の抗皮膚老化外用組成物は、抗酸化遺伝子発現亢進により活性酸素（ＲＯＳ）を抑制（特に減少）する効果、及び／又は、ＭＭＰ（Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）を抑制する効果、を奏することにより、抗皮膚老化を発揮する。よって、本発明は、米糠油内包リポソームを含む抗酸化遺伝子発現亢進用外用組成物、及び、米糠油内包リポソームを含むＭＭＰ抑制用外用組成物、をも包含する。 The anti-skin aging external composition of the present invention has the effect of suppressing (particularly reducing) reactive oxygen species (ROS) by enhancing antioxidant gene expression and / or the effect of suppressing MMP (Matrix Metalloproteinase). Demonstrate anti-skin aging. Therefore, the present invention also encompasses an anti-oxidant gene expression enhancing external composition containing rice bran oil-encapsulating liposome, and an MMP-suppressing external composition containing rice bran oil-encapsulating liposome.
抗酸化遺伝子としては、例えばＮｒｆ２（ＮＦＥ２ ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２）、Ｎｑｏ１（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ ｑｕｉｎｏｎｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ １）、ＨＯ−１（ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１）、及びＳＯＤ１（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ １）等が挙げられる。Ｎｒｆ２、Ｎｑｏ１、ＨＯ−１、及びＳＯＤ１からなる群より選択される少なくとも１種の抗酸化遺伝子亢進用であることが好ましく、特にＮｒｆ２遺伝子及び／又はＮｑｏ１遺伝子亢進用であることが好ましい。 Examples of the antioxidant gene include Nrf2 (NFE2 related factor 2), Nqo1 (NAD (P) H quinone oxidoreductase 1), HO-1 (heme oxygenase-1), SOD1 (Superoxide dismutase 1) and the like. It is preferably for at least one antioxidant gene promotion selected from the group consisting of Nrf2, Nqo1, HO-1, and SOD1, and particularly preferably for Nrf2 gene and / or Nqo1 gene promotion.
また、抑制されるＭＭＰとしては、特にＭＭＰ−２及び／又はＭＭＰ−９が好ましく挙げられる。 Moreover, as MMP to be suppressed, particularly, MMP-2 and / or MMP-9 are preferably mentioned.
なお、Ｎｒｆ２は、活性酸素等よって活性化され、高等動物における酸化ストレス適応反応を統一的に転写因子である。Ｎｒｆ２は、親電子性物質の解毒化酵素であるＧＳＴやＮｑｏ１などの異物代謝酵素、グルタチオン合成酵素などの遺伝子発現を増強して、親電子性物質を解毒化する。ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）は酸化ストレスを始めとする種々の急性ストレスにより誘導されることが知られており、Ｎｒｆ２標的遺伝子の１つでもある。スーパーオキシドディスムターゼ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）は、細胞内に発生した活性酸素を分解する酵素であって、哺乳動物には３種のＳＯＤが存在しており、ＳＯＤ１は細胞質に存在する。 Nrf2 is activated by active oxygen and the like, and is a transcription factor that unifies the oxidative stress adaptive response in higher animals. Nrf2 detoxifies electrophilic substances by enhancing gene expression of foreign substance metabolizing enzymes such as GST and Nqo1 which are detoxifying enzymes of electrophilic substances and glutathione synthetase. Heme oxygenase 1 (HO-1) is known to be induced by various acute stresses including oxidative stress, and is also one of Nrf2 target genes. Superoxide dismutase (SOD) is an enzyme that degrades active oxygen generated in cells, and there are three types of SOD in mammals, and SOD1 is in the cytoplasm.
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。 In the present specification, the term "comprising" also includes "consisting essentially of" and "consisting of" (The term "comprising" includes "consisting essentially of" and "consisting of.").
以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、以下、特に断らない限り、組成物における含有成分割合を示す％は質量％（ｗ／ｗ％）を表す。ＣＯ２濃度の％はｖ／ｖ％である。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically, but the present invention is not limited to the following examples. In addition, unless otherwise indicated,% which shows the component ratio in a composition represents mass% (w / w%). The% of CO 2 concentration is v / v%.
抗酸化遺伝子発現の検討
ＮＨＥＫ細胞（正常ヒト表皮角化細胞；新生児由来）を用いて、米糠油に含まれる抗酸化成分であるγ−オリザノールにより抗酸化遺伝子の発現が変化するかを検討した。なお、細胞、培地及び培地関連試薬については、全て市販品を購入して用いた（倉敷紡績株式会社又はシグマアルドリッチ）。
Examination of Antioxidant Gene Expression Using NHEK cells (normal human epidermal keratinocytes; derived from a newborn), it was examined whether the expression of the antioxidant gene was altered by γ-oryzanol which is an antioxidant component contained in rice bran oil. Commercially available products were purchased and used for cells, media and media-related reagents (Kurashiki Boseki Co., Ltd. or Sigma Aldrich).
＜増殖培地調製方法＞
３７℃に恒温化したＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２培地 ５００ｍＬに同じく恒温化したインスリン ０．５ｍｌ、ｈＥＧＦ ０．５ｍｌ、ハイドロコ−チゾル ０．５ｍｌ、ＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出液）２ｍｌ、ゲンタマイシン／アンフォテリシンＢ ０．５ｍｌ（抗菌剤）を加えた。これを緩やかに混合した後、４℃に保存した。
<Method for preparing growth medium>
0.5 ml of hEGF, 0.5 ml of hEGF, 0.5 ml of hydroco-tizole, 2 ml of BPE (bovine pituitary extract), gentamycin / amphotericin B 0. 5 ml (antimicrobial agent) was added. The mixture was gently mixed and then stored at 4 ° C.
＜凍結ＮＨＥＫ細胞の解凍及び培地交換方法＞
凍結ＮＨＥＫ細胞の入ったアンプル２本を３７℃の恒温槽で解凍した。解凍後、予め１５ｍｌチューブに分注した４℃のＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地 ６ｍｌに細胞溶液を混合した。予め３７℃に恒温化したＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地 ３９ｍｌを１３ｍｌずつ３つのフラスコに移した。混合した細胞溶液を接着細胞培養フラスコ（ＳＵＭＩＬＯＮ ２５０ｍＬ）に２ｍｌずつ移し、細胞が均一になるように混合させてから、しばらく静置した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。翌日以降、細胞密度が８０％コンフルエントになるまで１日１回培地交換を行なった。
<Method for thawing and medium replacement of frozen NHEK cells>
Two ampoules containing frozen NHEK cells were thawed in a 37 ° C. thermostat. After thawing, the cell solution was mixed with 6 ml of Humedia-KG2 medium at 4 ° C. previously aliquoted into a 15 ml tube. Thirty-nine ml of Humedia-KG2 medium, which had been preheated to 37 ° C., was transferred to three flasks of 13 ml each. The mixed cell solution was transferred to an adherent cell culture flask (SUMILON 250 mL) in 2 ml aliquots and allowed to mix so that the cells became homogeneous, and then allowed to stand for a while. The cells were cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. From the next day, the medium was changed once a day until the cell density reached 80% confluence.
＜ＮＨＥＫ細胞の継代培養方法＞
増殖培地を吸引し、３７℃に恒温化したＨＥＰＥＳ緩衝液を５ｍＬ加え、軽く細胞層を洗浄した。ＨＥＰＥＳ緩衝液を吸引し、０．２５％トリプシン溶液を２ｍＬ加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３分静置した。その後、フラスコ底面に接着している細胞をはがした（フラスコの淵を軽く叩き、細胞をはがす）。そこに３７℃に恒温化したトリプシン中和液を４ｍＬ加えてトリプシン酵素の反応を停止させた。細胞懸濁液を５０ｍｌファルコンに回収し、遠心した（ＲＴ、１，０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）。上清を吸引し、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地１０ｍｌに混合した後、血球計算盤で細胞数を計測した。その後、接着細胞２４ｗｅｌｌプレートに培地量９５０μＬ、細胞数が１．３３×１０５個になるよう蒔いた。翌日、培地交換を行なった。
<Method for Passaging NHEK Cells>
The growth medium was aspirated and 5 mL of HEPES buffer thermostated at 37 ° C. was added to gently wash the cell layer. The HEPES buffer was aspirated, 2 mL of a 0.25% trypsin solution was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 3 minutes. Then, the cells adhering to the bottom of the flask were peeled off (the bottom of the flask was tapped gently to peel off the cells). The reaction of the trypsin enzyme was stopped by adding 4 mL of a trypsin neutralization solution thermostated at 37 ° C. thereto. The cell suspension was collected in 50 ml Falcon and centrifuged (RT, 1,000 rpm, 5 min). The supernatant was aspirated and mixed with 10 ml of Humedia-KG2 medium, and then the number of cells was counted with a hemocytometer. Thereafter, the cells were plated in a 24-well plate of adherent cells so that the medium volume was 950 μL and the number of cells was 1.33 × 10 5 . The next day, the medium was replaced.
＜試料添加方法＞
増殖培地を吸引し、ＰＢＳ １ｍｌで洗浄した後、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＢ２培地 １ｍｌに混合した試料（γ−オリザノール又はＢＳＡ）を添加し、２４時間培養した。なお、γ−オリザノールは、培地中のγ−オリザノール終濃度が１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、又は１００μｇ／ｍｌ、となるように添加した。ＢＳＡは、終濃度約０．１４％となるように添加した。
<Sample addition method>
After the growth medium was aspirated and washed with 1 ml PBS, a sample (γ-oryzanol or BSA) mixed with 1 ml Humedia-KB2 medium was added and cultured for 24 hours. In addition, (gamma)-oryzanol was added so that the (gamma)-oryzanol final concentration in a culture medium might be 10 microgram / ml, 50 microgram / ml, or 100 microgram / ml. BSA was added to a final concentration of about 0.14%.
＜細胞回収方法＞
Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＢ２培地を吸引し、ＰＢＳ １ｍｌで洗浄した。ＰＢＳを吸引し、ＲＬＴ（細胞溶解液） ３５０μｌを加え、プレートシェイカーで３ｍｉｎ振盪した。２４ｗｅｌｌプレートの周りをビニールテープで覆い、−８０℃へ保存した。
<Cell collection method>
Humedia-KB2 medium was aspirated and washed with 1 ml PBS. The PBS was aspirated, 350 μl of RLT (cell lysate) was added, and the mixture was shaken for 3 minutes on a plate shaker. The 24 well plate was covered with vinyl tape and stored at -80 ° C.
＜ｃＤＮＡの作製＞
−８０℃から２４ｗｅｌｌプレートを取り出し、恒温槽で解凍した。７０％ ＥｔＯＨ ３５０μｌを加え、プレートシェイカーで３分振盪した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて抽出した。ＮＡＮＯＤＲＯＰ ２０００ Ｓｐｅｃｔｒｉｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）でＲＮＡ濃度を測定し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて、約５００ｎｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。
<Preparation of cDNA>
The 24-well plate was removed from -80 ° C and thawed in a thermostat bath. 350 μl of 70% EtOH was added and shaken for 3 minutes on a plate shaker. Total RNA samples were extracted using RNeasy Mini Kit (Qiagen). The RNA concentration was measured by NANODROP 2000 Spectriphotometer (Thermo SCIENTIFIC), and cDNA was prepared from about 500 ng of total RNA using PrimeScript RT reagent Kit (Takara Bio Inc.).
＜リアルタイムＰＣＲ＞
Ｐｒｉｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社）１０μｌにプライマー、ＲＯＸ ＤｙｅＩＩとＲＮＡ Ｆｒｅｅ水を加え、１８μｌの混液を調製し、２μｌ（約５０ｎｇ）のｃＤＮＡサンプルを加えて、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ測定サンプルを各プライマーごとに調製した。内在性コントロールとしてβ−ａｃｔｉｎ、又はＧＡＰＤＨ、ターゲット抗酸化遺伝子としてＮｒｆ２、Ｎｑｏ１、ＨＯ−１、及びＳＯＤ１を選択した。Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｔａｎｄａｒｄ７５００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、ターゲット遺伝子の発現解析（相対定量）を行なった。検量線法による解析結果を図１に示す。また、図１の結果は内在性コントロールとしてβ−ａｃｔｉｎを用いて解析した結果である。なお、図１は、ＢＳＡ添加培地での遺伝子発現量を１としたときの各培地における遺伝子発現量比を示す。また、図１において、＋、＊、＊＊、＊＊＊は、それぞれ、コントロール（ＢＳＡ添加）と比較して有意差が有ることを示す（＋：Ｐ＜０．１、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１）
<Real-time PCR>
Primers ROX Dye II and RNA Free water are added to 10 μl of Primix Ex Taq (Takara Bio Inc.), a mixture of 18 μl is prepared, 2 μl (about 50 ng) of cDNA sample is added, and Real-Time PCR measurement samples are added to each primer. Prepared. Β-actin or GAPDH was selected as an endogenous control, and Nrf2, Nqo1, HO-1 and SOD1 were selected as target antioxidant genes. Target gene expression analysis (relative quantification) was performed by Real-Time PCR Standard 7500 (Applied Biosystems). The analysis result by the calibration curve method is shown in FIG. Moreover, the result of FIG. 1 is the result analyzed using (beta) -actin as an endogenous control. In addition, FIG. 1 shows the gene expression level ratio in each culture medium when the gene expression level in the BSA addition culture medium is set to 1. Moreover, in FIG. 1, +, *, **, *** each show that there is a significant difference compared with a control (BSA addition) (+: P <0.1, *: P <0 .05, **: P <0.01, ***: P <0.001)
なお、ＰＣＲに用いた各プライマーの塩基配列は次の通りである。（Ｆ：はフォワードプライマーを、Ｒ：はリバースプライマーを示す。）
β−ａｃｔｉｎ
Ｆ：ＴＴＧＴＴＡＣＡＧＧＡＡＧＴＣＣＣＴＴＧＣＣ
Ｒ：ＡＴＧＣＴＡＴＣＡＣＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧ
ＧＡＰＤＨ
Ｆ：ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ
Ｒ：ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ
Ｎｒｆ２
Ｆ：ＣＴＴＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＧＴＧ
Ｒ：ＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧＧＧＴＴＧＴＡ
Ｎｑｏ１
Ｆ：ＧＧＡＴＴＧＧＡＣＣＧＡＧＣＴＧＧＡＡ
Ｒ：ＡＡＴＴＧＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＧＣＡＡＣ
ＨＯ−１
Ｆ：ＡＡＧＡＣＴＧＣＧＴＴＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣ
Ｒ：ＡＡＡＧＣＣＣＴＡＣＡＧＣＡＡＣＴＧＴＣＧ
ＳＯＤ１
Ｆ：ＡＧＴＧＣＡＧＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＴＴＣ
Ｒ：ＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＴＴＣＡＧＴＣＡＧ
The nucleotide sequence of each primer used for PCR is as follows. (F: indicates a forward primer, R: indicates a reverse primer.)
β-actin
F: TTGTTACAGGA AGTCCCTTGCC
R: ATGCTATCACCTCCCCCTGTGTG
GAPDH
F: GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
R: TGGTGAAGAGCCCAGTGGA
Nrf2
F: CTTGGCCTCAGTGATTCTGAAGTG
R: CCTGAGATGGTGACAAGGGTTGTA
Nqo1
F: GGGATTGGACCGAGCTGGAA
R: AATTGCAGTGAAGATGAAGGCAAC
HO-1
F: AAGACTGCGTTCCTCTCTCAAC
R: AAAGCCCTACAGCAACTGTCG
SOD1
F: AGTGCAGGGCATCATCAATTTC
R: CCATGCAGGCCTTCAGTCAG
３次元培養細胞及びリポソームを用いた抗酸化遺伝子発現の検討
＜リポソームの調製＞
表１に示す組成（合計１００％）となるよう原料を混合し、これを高圧乳化機（スターバーストミニＨＪＰ−２５００１：（株）スギノマシン社製）で２００Ｍｐａ、５パスの条件で処理し、リポソーム懸濁液（γ−オリザノール内包リポソームを含有する）を調製した。また、γ−オリザノールはオリザ油化株式会社から購入して用いた。レシチンは大豆レシチンを日油株式会社から購入して用いた。米糠油は「つや姫こめ油」を三和油脂株式会社から購入して用いた。また作成したリポソームは透過型電子顕微鏡 ＨＴ７７００（ＨＩＴＡＣＨＩ）にて存在を確認した。
Examination of antioxidant gene expression using three-dimensional cultured cells and liposome <Preparation of liposome>
The raw materials were mixed so as to obtain the composition shown in Table 1 (total 100%), and the mixture was treated with a high pressure emulsifier (Starburst mini HJP-25001: manufactured by Sugino Machine Co., Ltd.) at 200 Mpa for 5 passes. Liposomal suspension (containing γ-oryzanol containing liposome) was prepared. Also, γ-oryzanol was purchased from Oryza Yuka Co., Ltd. and used. Lecithin used soybean lecithin purchased from NOF Corporation. Rice bran oil used "Tsuyahimekome oil" purchased from Sanwa Yushi Co., Ltd. Moreover, the created liposome was confirmed by transmission electron microscope HT7700 (HITACHI).
以下の検討には、得られたリポソーム懸濁液（０．５％γオリザノール内包リポソーム懸濁液、１％米糠油内包リポソーム懸濁液、及び空リポソーム懸濁液）を用いた。なお、１％米糠油リポソーム懸濁液をイオン交換水で１０倍希釈し、０．１％米糠油内包リポソーム懸濁液を調製して、これも以下の検討に用いた。 The obtained liposome suspension (0.5% gamma oryzanol inclusion liposome suspension, 1% rice bran oil inclusion liposome suspension, and empty liposome suspension) was used for the following examination. A 1% rice bran oil liposome suspension was diluted 10 times with ion exchange water to prepare a 0.1% rice bran oil inclusion liposome suspension, which was also used in the following study.
＜細胞の３次元培養＞
３次元（３Ｄ）皮膚モデル作製用ツールであるＥｐｉｄｅｒｍ ２００Ｘキット及びＥＰＩ−１００ＭＭ培地（いずれもクラボウ社）を用いて、３次元皮膚モデルを作製した。
具体的には、Ｅｐｉｄｅｒｍ ２００Ｘキットを用いて、次の手順で作製した。接着細胞２４ｗｅｌｌプレートに予め３７℃に恒温化したＥＰＩ−１００ＭＭ ５００μｌを加えた。３次元皮膚モデルの入ったインサートカップを接着細胞２４ｗｅｌｌ プレートに泡が入らないよう移した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２〜３時間培養して、３Ｄ皮膚モデルを作製した。
<Three-dimensional culture of cells>
A three-dimensional skin model was produced using the Epiderm 200X kit and EPI-100 MM medium (both Kurabo Industries), which are tools for producing a three-dimensional (3D) skin model.
Specifically, it was produced in the following procedure using the Epidermm 200X kit. To a 24-well plate of adherent cells was added 500 μl of EPI-100MM previously thermostated at 37 ° C. An insert cup containing a three-dimensional skin model was transferred to the adherent cell 24 well plate so as not to contain bubbles. The cells were cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 2 to 3 hours to produce a 3D skin model.
＜遺伝子発現検討＞
３Ｄ皮膚モデル上部に試料（０．５％γオリザノール内包リポソーム懸濁液、１％米糠油内包リポソーム懸濁液、０．１％米糠油内包リポソーム懸濁液、又は空リポソーム懸濁液）を４０μｌ添加し、２４時間培養した。その後、培地を吸引し、３Ｄ皮膚モデル上部を組織が崩れないよう注意しながらＰＢＳで３回洗浄した。メスでインサートカップから３Ｄ皮膚モデルとメンブレンを切り出し、その後３Ｄ皮膚モデルからメンブレンを剥がした。細胞ストック用チューブに３Ｄ皮膚モデルを入れ、液体窒素で凍結し−８０℃で保存した。その後、上述した方法と同様にしてＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを作製しリアルタイムＰＣＲを行って遺伝子（Ｎｒｆ２及びＮｑｏ１）発現を解析した。Ｃｔ法による解析結果を図２に示す。また、図２の結果は内在性コントロールとしてＧＡＰＤＨを用いて解析した結果である。なお、図２において、＋、＊は、それぞれ、コントロール（空リポソーム）と比較して有意差が有ることを示す（＋：Ｐ＜０．１、＊：Ｐ＜０．０５）。
<Gene expression examination>
40 μl of sample (0.5% γ oryzanol inclusion liposome suspension, 1% rice bran oil inclusion liposome suspension, 0.1% rice bran oil inclusion liposome suspension, or empty liposome suspension) on top of 3D skin model It was added and cultured for 24 hours. The medium was then aspirated and the top of the 3D skin model was washed 3 times with PBS, taking care not to break up the tissue. The 3D skin model and membrane were cut out of the insert cup with a scalpel, and then the membrane was peeled off from the 3D skin model. The 3D skin model was placed in a tube for cell stock, frozen with liquid nitrogen and stored at -80 ° C. Thereafter, RNA was extracted and cDNA was prepared in the same manner as described above, and real-time PCR was performed to analyze gene (Nrf2 and Nqo1) expression. The analysis result by Ct method is shown in FIG. Moreover, the result of FIG. 2 is the result of analysis using GAPDH as an endogenous control. In addition, in FIG. 2, + and * respectively show that there is a significant difference compared with a control (empty liposome) (+: P <0.1, *: P <0.05).
＜マイクロアレイ解析＞
上記のようにして調製した３Ｄ皮膚モデル細胞のＲＮＡを用いて、ＤＮＡマイクロアレイ解析を行い、ＭＰＰ−２遺伝子及びＭＰＰ−９遺伝子の発現を検討した。ＤＮＡマイクロアレイとしてはＤＮＡチップジェノパール皮膚チップ（三菱ケミカル株式会社）を用いた。基準サンプル（すなわち、空リポソームを添加して培養した３Ｄ皮膚モデル細胞のＲＮＡ）の補正値を１としたときの、各試料を添加して培養した３Ｄ皮膚モデル細胞のＲＮＡの発現量を表２に示す。表２の数値の右肩の＊はコントロール（空リポソーム）に比して有意差があることを示す（Ｐ＜０．０５）。
<Microarray analysis>
DNA microarray analysis was performed using the RNA of the 3D skin model cells prepared as described above to examine the expression of the MPP-2 gene and the MPP-9 gene. As a DNA microarray, a DNA chip Genopal skin chip (Mitsubishi Chemical Corporation) was used. When the correction value of a reference sample (ie, RNA of 3D skin model cells cultured by adding empty liposomes) is 1, the expression level of RNA of 3D skin model cells cultured by adding each sample is shown in Table 2 Shown in. * In the right shoulder of the values in Table 2 indicates that there is a significant difference compared to the control (empty liposome) (P <0.05).
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017252175A JP2019116456A (en) | 2017-12-27 | 2017-12-27 | Anti-aging skin composition for external use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017252175A JP2019116456A (en) | 2017-12-27 | 2017-12-27 | Anti-aging skin composition for external use |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2019116456A true JP2019116456A (en) | 2019-07-18 |
Family
ID=67304008
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017252175A Withdrawn JP2019116456A (en) | 2017-12-27 | 2017-12-27 | Anti-aging skin composition for external use |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2019116456A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020180071A (en) * | 2019-04-25 | 2020-11-05 | サンスター株式会社 | Anti-skin aging composition for external use |
-
2017
- 2017-12-27 JP JP2017252175A patent/JP2019116456A/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020180071A (en) * | 2019-04-25 | 2020-11-05 | サンスター株式会社 | Anti-skin aging composition for external use |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| van Hoogevest et al. | Phospholipids in cosmetic carriers | |
| TWI537009B (en) | Composition and method for preparing stable unilamellar liposomal suspension | |
| JP5716243B2 (en) | Cosmetic composition containing at least two osmotic pressure regulating substances having a moisturizing effect or an anti-aging effect | |
| JP6028311B2 (en) | Use of tocopheryl phosphate as a drug to prevent or delay the appearance of skin aging effects | |
| KR102467709B1 (en) | Liposome composition | |
| EP2142199B1 (en) | A process to activate extracts derived from living organisms using long wave uv irradiation and compositions comprising said activated extract | |
| JP5863230B2 (en) | Liposomes encapsulating oxazolidin-2-one compounds | |
| KR101627051B1 (en) | Natural liposome comprising vitamin C, process for the preparation thereof, and cosmetic composition comprising the same | |
| CN111840097A (en) | Application of rice bran oil and application of liposome containing rice bran oil | |
| JP6746752B1 (en) | Anti-skin aging external composition | |
| JP2019116456A (en) | Anti-aging skin composition for external use | |
| JP2019116455A (en) | Anti-aging skin composition for external use | |
| TWI580438B (en) | Contains a composition of polyunsaturated fatty acids | |
| RU2746414C1 (en) | Emulsified liposomal composition and method for its preparation | |
| JP2020180070A (en) | Anti-skin aging composition for external use | |
| TWI793312B (en) | Uses of liposomes encapsulating rice bran oil | |
| JP6818927B2 (en) | Anti-skin aging topical composition | |
| WO2015154126A1 (en) | Liposomal compound and compositions containing the compound | |
| KR101842752B1 (en) | Natural liposome comprising colagen and hyaluronic acid, peocess for the preparation thereof, and cosmetic composition comprising the same | |
| KR101779671B1 (en) | Natural riposome comprising saccharomyces genus yeast extract, its preparation process, and food or pharmaceutical composition comprising it | |
| KR20190102753A (en) | elastic liposome composition for accelerating skin absorption, elastic liposome containing thereof and manufacturing method thereof | |
| TWI414529B (en) | Extraction of Polysaccharides and Preparation of Frozen Crystal | |
| JP2020093992A (en) | Liposome encapsulating oil and fat component | |
| CN111840301A (en) | Application of gamma-oryzanol and application of liposome containing gamma-oryzanol | |
| KR20240009259A (en) | Liposome composition for enhancing skin absorption and efficacy through adhesion enhancement and manufacturing method thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20200508 |