JP2019116441A - Drug delivery to autophagy cells and apoptotic cells by vesicles having protein-expressed surface - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞への薬剤送達の分野に関連する。特に、本発明は、オートファジーおよび／またはアポトーシスを受ける細胞および組織に、改変されたタンパク質が表面に発現させられる小胞、またはコンジュゲートされる小胞を介して薬剤を送達することに関連する。 The present invention relates to the field of drug delivery to cells. In particular, the invention relates to delivering agents to cells and tissues that undergo autophagy and / or apoptosis via vesicles on which the modified protein is expressed on the surface or vesicles to which they are conjugated. .
アポトーシスは、プログラム細胞死のよく研究された経路である。細胞排除の非アポトーシス形態には、壊死およびオートファジーの特徴を有する形態が含まれる。アポトーシスが、古い細胞、不要な細胞および不健康な細胞を排除することによって、身体の健康状態を発達させること、および維持することにおいて、非常に重要な役割を果たしている。過度に少ないアポトーシスまたは過度の多いアポトーシスが何らかの役割を多くの疾患において果たしている可能性がある。アポトーシスが正しく働かないときには、排除されるべき細胞が、例えば、ガンおよび白血病では残存し、不死性となる場合がある。アポトーシスが正常ではあるが、働き過ぎるときには、アポトーシスにより、過度に多くの細胞が死滅させられ、重大な組織損傷が引き起こされる。このことが、脳卒中および神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病およびパーキンソン病など）では当てはまる。 Apoptosis is a well-studied pathway of programmed cell death. Non-apoptotic forms of cell exclusion include forms with features of necrosis and autophagy. Apoptosis plays a very important role in developing and maintaining the health of the body by eliminating old cells, unwanted cells and unhealthy cells. Too little or too much apoptosis may play a role in many diseases. When apoptosis does not work properly, the cells to be eliminated may remain and be immortal, for example in cancer and leukemia. Although apoptosis is normal but overworked, it kills too many cells and causes significant tissue damage. This is true for stroke and neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease, Huntington's disease and Parkinson's disease.
オートファジー、すなわち、タンパク質およびオルガネラが、オートファゴソームと呼ばれる二重膜構造体に隔離され、分解のためのリソソームに送達されるプロセスが、様々な疾患において非常に重要である。ガンおよび神経変性に加えて、オートファジーの調節が、広範囲の様々なさらなる疾患および障害における治療戦略となっている。例えば、いくつかの肝臓疾患、心臓疾患および筋疾患が、誤って折り畳まれたタンパク質凝集物の蓄積に関連づけられている。そのような疾患では、細胞のオートファジーを増大させる薬剤は、疾患の原因となる凝集物のクリアランスを高め、それにより、処置への寄与および疾患重篤度の軽減をもたらす場合がある。さらに、オートファジーの阻害剤は、膵炎の処置において治療剤として機能する場合がある。 Autophagy, the process by which proteins and organelles are sequestered in a bilayer membrane structure called autophagosomes, and delivered to lysosomes for degradation, is of great importance in various diseases. In addition to cancer and neurodegeneration, modulation of autophagy has become a therapeutic strategy in a wide variety of additional diseases and disorders. For example, several liver diseases, heart diseases and muscle diseases have been linked to the accumulation of misfolded protein aggregates. In such diseases, agents that increase cellular autophagy may increase the clearance of the disease causing aggregates, thereby resulting in a treatment benefit and a reduction in disease severity. Furthermore, inhibitors of autophagy may function as therapeutic agents in the treatment of pancreatitis.
したがって、アポトーシスおよびオートファジーを細胞において調節し、それにより、オートファジーに伴う疾患を治療する手段または改善する手段を開発することが求められている。 Therefore, there is a need to modulate apoptosis and autophagy in cells, thereby developing means to treat or ameliorate diseases associated with autophagy.
本発明は、タンパク質コンジュゲート小胞であって、前記小胞の表面に発現させられる、またはコンジュゲートされる１つもしくは複数のレクチンまたはそのフラグメントと、必要な場合には薬剤とを含むタンパク質コンジュゲート小胞を提供する。 The present invention is a protein conjugate vesicle, wherein the protein conjugate comprises one or more lectins or fragments thereof to be expressed or conjugated on the surface of said vesicle and, if necessary, a drug. Provide gated vesicles.
１つの実施形態において、前記薬剤は前記小胞の内部に封入され、または、前記小胞の外側表面に結合される。前記小胞の具体的な実施形態には、リポソームおよびミセルが含まれる。前記小胞は人為的に改変することができ、または、細胞に由来することができる。 In one embodiment, the agent is encapsulated inside the vesicle or is bound to the outer surface of the vesicle. Specific embodiments of the vesicles include liposomes and micelles. The vesicles can be artificially modified or can be derived from cells.
前記レクチンまたはフラグメントの具体的な実施形態には、第１のタンパク質として使用される、カチオン依存性マンノース−６−リン酸受容体（Ｍ６ＰＲ）、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン−リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、ＣＤ２２、ＣＤ２０６、ガレクチン３、アネキシンＶ、ＣＤ３１、インテグリンαＬβ２、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ４４、ＣＤ３００ａ、ＣＤ４７、トロンボスポンジン１（ＴＳＰ１）およびＣＤ３６が含まれるが、これらに限定されない。 Specific embodiments of the lectin or fragment include cation-dependent mannose-6-phosphate receptor (M6PR), P-selectin, E-selectin, L-selectin, P- used as the first protein. -Selectin-Ligand-1 (PSGL-1), CD22, CD206, Galectin 3, Annexin V, CD31, Integrin αLβ2, VE-Cadherin, CD44, CD300a, CD47, Thrombospondin 1 (TSP1) and CD36 Not limited to these.
前記レクチンまたはフラグメントの具体的な実施形態には、第２のタンパク質として使用される、ＣＤ３００ａ、ＣＤ４７、トロンボスポンジン１（ＴＳＰ１）およびＣＤ３６、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）またはそのフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。 Specific embodiments of the lectin or fragment include CD300a, CD47, thrombospondin 1 (TSP1) and CD36, Toll-like receptor 4 (TLR4) or a fragment thereof, used as the second protein However, it is not limited to these.
前記レクチンまたはフラグメントの具体的な実施形態には、前記第１のタンパク質の１つまたは複数、および、前記第２のタンパク質の１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。 Specific embodiments of the lectin or fragment include, but are not limited to, one or more of the first protein and one or more of the second protein.
いくつかの実施形態において、前記小胞は、Ｍ６ＰＲを、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＰＳＧＬ−１またはガレクチン３との組合せで含む。いくつかの実施形態において、前記小胞は、Ｓｉｇｌｅｃ２を、Ｐ−セレクチン、ガレクチン３またはＣＤ３１との組合せで含む。 In some embodiments, the vesicle comprises M6PR in combination with P-selectin, E-selectin, PSGL-1 or galectin 3. In some embodiments, the vesicle comprises Siglec 2 in combination with P-selectin, galectin 3 or CD31.
いくつかの実施形態において、前記小胞は、Ｐ−セレクチンまたはＭ６ＰＲを、ＴＬＲ４、ガレクチン３、ＣＬＥＣ２、インテグリンαＬβ２またはＣＤ３１との組合せで含む。 In some embodiments, the vesicles comprise P-selectin or M6PR in combination with TLR4, galectin3, CLEC2, integrin αLβ2 or CD31.
前記薬剤の具体的な実施形態には、診断用造影剤、細胞生存強化剤、細胞生存抑制剤、細胞成分、オルガネラ、細胞、細胞傷害性薬剤、抗腫瘍薬物、毒素または抗体、脂質、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、治療剤またはナノ材料が含まれるが、これらに限定されない。 Specific embodiments of the agent include diagnostic imaging agents, cell survival enhancers, cell survival inhibitors, cellular components, organelles, cells, cytotoxic agents, antitumor drugs, toxins or antibodies, lipids, proteins, It includes but is not limited to DNA, RNA, therapeutic agents or nanomaterials.
本発明はまた、本発明の小胞と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物を提供する。 The invention also provides a pharmaceutical composition comprising the vesicles of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
本発明はまた、薬剤の送達を、オートファジー細胞および／またはアポトーシス細胞、ならびに前記細胞を含有する組織に対して標的化するための方法であって、本発明のタンパク質コンジュゲート小胞を対象に投与することを含む方法を提供する。 The present invention is also directed to a method for targeting drug delivery to autophagy cells and / or apoptotic cells, and tissues containing said cells, directed to the protein-conjugated vesicles of the present invention. Providing a method comprising administering.
本発明では、オートファジー細胞および／またはアポトーシス細胞への薬剤の特異的な標的化および送達のための小胞の表面に発現させられる、または小胞コンジュゲートされる改変された表面タンパク質がもたらされる。特に、本発明の小胞は、オートファジー細胞および／またはアポトーシス細胞、ならびに、オートファジー細胞および／またはアポトーシス細胞を含有する組織に対する標的化および薬物送達に関する相乗効果を達成することができる。 The present invention results in modified surface proteins that are expressed or vesicle conjugated on the surface of vesicles for specific targeting and delivery of agents to autophagy cells and / or apoptotic cells . In particular, the vesicles of the invention can achieve synergy for targeting and drug delivery to autophagy cells and / or apoptotic cells and tissues containing autophagy cells and / or apoptotic cells.
用語の定義が当該用語の一般に使用されている意味から逸脱する場合には、出願人は、具体的に示される場合を除き、下記において提供される定義を利用することを意図する。 Where the definition of terms deviates from the commonly used meaning of the term, applicant intends to utilize the definitions provided below unless specifically indicated.
本明細書および添付された請求項において使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈が反することを明らかに示す場合を除き、複数の言及物を包含する。 As used in the specification and the appended claims, the singular forms "a", "an" and "the" include plural referents unless the context clearly indicates otherwise. Do.
本明細書中で使用される場合、「または（もしくは、あるいは）」の使用は、別途明記される場合を除き、「および／または」を意味する。多数の従属請求項の状況においては、「または」の使用は、２つ以上の先行する独立請求項または従属請求項を択一的にだけ参照する。 As used herein, the use of “or (or)” means “and / or” unless stated otherwise. In the context of a number of dependent claims, the use of "or" refers only alternatively to two or more preceding independent or dependent claims.
本明細書中で使用される場合、用語「１つまたは（もしくは）複数」は、特にその慣用法の枠内で読み取られるときには当業者によって容易に理解される。 As used herein, the term "one or more" is readily understood by one of ordinary skill in the art, particularly when read within the context of the convention.
本明細書中で使用される場合、用語「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集物の生成によって形成される様々な単層脂質小胞および多重層脂質小胞を包含する総称用語である。リポソームは、一般にはリン脂質を含む二重層膜と、一般には水性組成物を含む内部媒体とを伴う小胞構造を有するとして特徴づけられる場合がある。 As used herein, the term "liposome" is a generic term including various unilamellar lipid vesicles and multilamellar lipid vesicles formed by the formation of encapsulated lipid bilayers or aggregates. is there. Liposomes may be characterized as having a vesicle structure, generally with a bilayer membrane comprising phospholipids and an internal medium generally comprising an aqueous composition.
本明細書中で使用される場合、用語「ミセル」は、液体コロイドに分散された界面活性分子の凝集体（または超分子集合体）を示す。水溶液中の典型的なミセルは、親水性の「頭部」領域が周囲の溶媒と接触している凝集物で、疎水性の単尾領域をミセル中心に閉じ込める凝集物を形成する。 As used herein, the term "micelle" refers to an aggregate (or supramolecular assembly) of surfactant molecules dispersed in a liquid colloid. Typical micelles in aqueous solution are aggregates in which the hydrophilic "head" region is in contact with the surrounding solvent, forming aggregates that trap the hydrophobic single-tailed region in the micelle center.
本明細書中で使用される場合、用語「薬剤」または用語「治療剤」は、状態または疾患の処置および／または改善をもたらすことができる薬品を示す。 As used herein, the term "agent" or the term "therapeutic agent" refers to an agent that can result in the treatment and / or amelioration of a condition or disease.
本明細書中で交換可能に使用されるように、用語「個体」、用語「対象」、用語「宿主」および用語「患者」は哺乳動物を示し、これには、ネズミ科動物（ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などが含まれるが、これらに限定されない。 As used interchangeably herein, the terms "individual", "subject", "host" and "patient" refer to mammals, including murine (rat, mouse) ), Non-human primates, humans, dogs, cats, ungulates (eg, horses, cows, sheep, pigs, goats) and the like, but is not limited thereto.
本明細書中で使用される場合、用語「治療効果的な量」または用語「有効量」は、疾患を処置するために哺乳動物または他の対象に投与されたとき、当該疾患のためのそのような処置をもたらすために十分である上記小胞の量を示す。 As used herein, the term "therapeutically effective amount" or the term "effective amount", when administered to a mammal or other subject to treat a disease, is that for that disease. Indicates the amount of vesicles that is sufficient to effect such treatment.
本明細書中で使用される場合、用語「処置」、用語「処置する」および同様な用語は、哺乳動物（特にヒト）における疾患の処置をどのような処置であっても包含し、（ａ）前記疾患が、前記疾患に罹りやすいかもしれないが、前記疾患を有するとは未だ診断されていない対象において生じることを防止すること、（ｂ）前記疾患を抑制すること、すなわち、その発達を停止させること、および、（ｃ）前記疾患を緩和すること、すなわち、前記疾患の退縮を引き起こすことを包含する。 As used herein, the terms "treatment", "treat" and like terms encompass any treatment of a disease in a mammal (especially a human), (a 2.) preventing the disease from occurring in a subject that may be susceptible to the disease but has not yet been diagnosed with the disease, (b) suppressing the disease, ie its development Arresting and (c) alleviating the disease, i.e. causing regression of the disease.
本明細書中で使用される場合、用語「コンジュゲート部位」は、２つの高分子の間で形成される共有結合の部位であり、主として末端−側鎖の枝分かれしたコンジュゲーションであり、また、場合によっては分子の頭−尾の線状コンジュゲーションである。 As used herein, the term "conjugate site" is a site of covalent attachment formed between two macromolecules, primarily branched conjugation of the end-to-side chain, and In some cases it is a linear head-to-tail conjugation of molecules.
１つの局面において、本発明は、小胞の表面に発現させられる、またはコンジュゲートされる１つもしくは複数のレクチンまたはそのフラグメントと、必要な場合には薬剤とを含む、タンパク質コンジュゲート小胞を提供する。 In one aspect, the invention provides a protein-conjugated vesicle comprising one or more lectins or fragments thereof that are expressed or conjugated to the surface of the vesicle and, where necessary, an agent. provide.
１つの実施形態において、前記薬剤は前記小胞の内部に封入され、または、前記小胞の外側表面に結合される。 In one embodiment, the agent is encapsulated inside the vesicle or is bound to the outer surface of the vesicle.
いくつかの実施形態において、前記小胞はリポソームまたはミセルである。前記小胞は人為的に改変することができ、または、細胞に由来することができる。 In some embodiments, the vesicles are liposomes or micelles. The vesicles can be artificially modified or can be derived from cells.
いくつかの実施形態において、前記レクチンまたはそのフラグメントは、カチオン依存性マンノース−６−リン酸受容体（Ｍ６ＰＲ）、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン−リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、ＣＤ２２、ＣＤ２０６、ガレクチン３、アネキシンＶ、ＣＤ３１、インテグリンαＬβ２、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３００ａ、ＣＤ４７、トロンボスポンジン１（ＴＳＰ１）およびＣＤ３６、またはそれらのフラグメントからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｍ６ＰＲ、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン−リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、ＣＤ２２、ＣＤ２０６、ガレクチン３、アネキシンＶ、インテグリンαＬβ２、ＶＥ−カドヘリンは単独で、オートファジー細胞および／またはアポトーシス細胞、ならびに、オートファジー細胞および／またはアポトーシス細胞を含有する組織への小胞標的化を行うために十分であり、第１のタンパク質（ＥＰ）として働く。さらなるいくつかの実施形態において、前記小胞は、Ｍ６ＰＲを、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＰＳＧＬ−１またはガレクチン３との組合せで含み、あるいは、Ｓｉｇｌｅｃ２をＰ−セレクチンまたはガレクチン３との組合せで含む。 In some embodiments, the lectin or fragment thereof comprises: cation dependent mannose-6-phosphate receptor (M6PR), P-selectin, E-selectin, L-selectin, P-selectin-ligand-1 (PSGL -1), CD22, CD206, galectin 3, annexin V, CD31, integrin αLβ2, VE-cadherin, CD300a, CD47, thrombospondin 1 (TSP1) and CD36, or fragments thereof. In some embodiments, M6PR, P-selectin, E-selectin, P-selectin-ligand-1 (PSGL-1), CD22, CD206, galectin 3, annexin V, integrin αLβ2, VE-cadherin alone, It is sufficient to perform vesicle targeting to autophagy cells and / or apoptotic cells, and tissues containing autophagy cells and / or apoptotic cells, and acts as a first protein (EP). In further embodiments, the vesicle comprises M6PR in combination with P-selectin, E-selectin, PSGL-1 or galectin 3, or alternatively, Siglec 2 in combination with P-selectin or galectin 3. Including.
いくつかの実施形態において、ＣＤ３００ａ、ＣＤ４７、トロンボスポンジン１（ＴＳＰ１）およびＣＤ３６はさらに、第２のタンパク質として働くことができる。したがって、本発明はさらに、Ｍ６ＰＲ、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン−リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）、ＣＤ２２、ＣＤ２０６、ガレクチン３、アネキシンＶ、ＣＤ３１、インテグリンαＬβ２およびＶＥ−カドヘリンからなる群から選択される第１のタンパク質の１つまたは複数と、ＣＤ３００ａ、ＣＤ４７、トロンボスポンジン１（ＴＳＰ１）、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）およびＣＤ３６ならびにそれらのフラグメントからなる群から選択される第２のタンパク質の１つまたは複数とを含む小胞を提供する。いくつかの実施形態において、前記小胞は、Ｍ６ＰＲまたはＰ−セレクチンを、ＴＬＲ４、ガレクチン３、ＣＬＥＣ２、インテグリンαＬβ２またはＣＤ３１との組合せで含む。タンパク質標識化の組合せを伴う上記小胞は、オートファジー細胞および／またはアポトーシス細胞、ならびに、オートファジー細胞および／またはアポトーシス細胞を含有する組織に対する標的化および薬物送達に関する相乗効果を達成することができる。標的化作用に関する相乗効果により、送達されるべき薬剤の効果的な投薬量が少なくなり、したがって、当該薬物の副作用を軽減することができる。 In some embodiments, CD300a, CD47, thrombospondin 1 (TSP1) and CD36 can additionally serve as the second protein. Thus, the present invention further provides M6PR, P-selectin, E-selectin, L-selectin, P-selectin-ligand-1 (PSGL-1), CD22, CD206, galectin 3, annexin V, CD31, integrin αLβ2 and VE. -From the group consisting of one or more of the first protein selected from the group consisting of cadherin and CD300a, CD47, thrombospondin 1 (TSP1), Toll-like receptor 4 (TLR4) and CD36 and fragments thereof Provided is a vesicle comprising one or more of the second proteins selected. In some embodiments, the vesicle comprises M6PR or P-selectin in combination with TLR4, galectin3, CLEC2, integrin αLβ2 or CD31. The vesicles with a combination of protein labeling can achieve synergy for targeting and drug delivery to autophagy cells and / or apoptotic cells and tissues containing autophagy cells and / or apoptotic cells . The synergistic effect on the targeting action can reduce the effective dosage of the drug to be delivered, and thus reduce the side effects of the drug.
１つの実施形態において、前記薬剤は診断剤または治療剤である。１つの実施形態において、前記薬剤は、オートファジーまたはアポトーシスを引き起こす薬物である。いくつかの実施形態において、前記薬剤の例には、抗マラリア薬物、オートファジー阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、本明細書中に記載されるＥＰまたはＡＰのアンタゴニスト、診断用造影剤、細胞生存強化剤（または細胞死抑制剤）、細胞生存抑制剤（または細胞死強化剤）、細胞（例えば、幹細胞および始原体細胞など）、細胞成分、オルガネラ、細胞傷害性薬剤、抗腫瘍薬物、毒素または抗体、脂質、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、治療剤、ならびにナノ材料が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、上述の第１のタンパク質または第２のタンパク質のアンタゴニスト（例えば、可溶性形態、対応するリガンド、ならびに中和抗体およびブロッキング抗体など）は、オートファジー細胞およびアポトーシス細胞、ならびに、オートファジー細胞およびアポトーシス細胞を含有する組織への小胞標的化を低下させるための解毒物として働くことができる。いくつかの実施形態において、前記薬剤は、バルドキソロンメチル、クロロキン、キニン、ヒドロクロロキン、ソラフェニブ、スニチニブ、Ｈｓｐ９０阻害剤、メトホルミンまたはクリゾチニブである。 In one embodiment, the agent is a diagnostic or therapeutic agent. In one embodiment, the agent is a drug that causes autophagy or apoptosis. In some embodiments, examples of the agent include antimalarial drugs, autophagy inhibitors, histone deacetylase (HDAC) inhibitors, antagonists of EP or AP described herein, diagnostic imaging. Agents, cell survival enhancers (or cell death inhibitors), cell survival inhibitors (or cell death enhancers), cells (eg, stem cells and primordial somatic cells), cell components, organelles, cytotoxic agents, antitumor agents Drugs, toxins or antibodies, lipids, proteins, DNA, RNA, therapeutic agents, as well as nanomaterials include, but are not limited to. In one embodiment, an antagonist of the first protein or the second protein described above (e.g. soluble form, corresponding ligand, and neutralizing and blocking antibodies etc.) are autophagy cells and apoptotic cells, and It can serve as an antidote to reduce vesicle targeting to tissues containing fuzzy cells and apoptotic cells. In some embodiments, the agent is bardoxolone methyl, chloroquine, kinin, hydrochloroquine, sorafenib, sunitinib, Hsp90 inhibitor, metformin or crizotinib.
本明細書中に提供されるリポソームには、単層リポソーム、多重層リポソームおよび多小胞リポソームが含まれる。本明細書中に提供されるリポソームは、正荷電のリン脂質、負荷電のリン脂質、または中性のリン脂質から構成される場合がある。 Liposomes provided herein include unilamellar vesicles, multilamellar vesicles and multivesicular liposomes. The liposomes provided herein may be composed of positively charged phospholipids, negatively charged phospholipids, or neutral phospholipids.
本発明において使用されるリポソームは、この技術分野において知られている種々の方法によって作製することができる。例えば、リン脂質（例えば、中性リン脂質のジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）および／またはＥＰＣなど）をアルコールまたは他の有機溶媒に溶解し、その後、脂質二重層における封入のための成分と混合することができる。この混合物はさらに、様々な界面活性剤を含む場合がある。典型的には、脂質混合物がボルテックス撹拌され、ドライアイス／アセトン浴で凍結され、一晩の凍結乾燥に供される。凍結乾燥された調製物は長期間にわたって−２０℃以下で貯蔵される。必要とされるときに、凍結乾燥されたリポソームは再構成される。 Liposomes used in the present invention can be made by various methods known in the art. For example, phospholipids (eg, neutral phospholipids such as dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and / or EPC) are dissolved in alcohol or other organic solvent and then encapsulated in the lipid bilayer Can be mixed with ingredients for The mixture may further include various surfactants. Typically, the lipid mixture is vortexed, frozen in a dry ice / acetone bath, and subjected to overnight lyophilization. The lyophilized preparation is stored at -20 ° C. or less for an extended period of time. Lyophilized liposomes are reconstituted when needed.
あるいは、リポソームを、脂質を容器（例えば、ガラス製のナシ型フラスコ）において溶媒に混合することによって調製することができる。容器は、容積がリポソームの予想される懸濁物の体積よりも１０倍大きくなければならない。ロータリーエバポレーターを使用して、溶媒が負圧下においておよそ４０℃で除かれる。溶媒は通常、リポソームの所望される体積に依存して、約５分から２時間のうちに除かれる。組成物は真空下のデシケーターにおいてさらに乾燥することができる。乾燥後の脂質は一般には、時間とともに劣化する傾向があるので、約１週間後には廃棄される。 Alternatively, the liposomes can be prepared by mixing the lipids in a solvent (eg, a pear-shaped flask made of glass) to a solvent. The container should have a volume 10 times larger than the volume of the expected suspension of liposomes. The solvent is removed at approximately 40 ° C. under negative pressure using a rotary evaporator. The solvent is usually removed in about 5 minutes to 2 hours, depending on the desired volume of the liposome. The composition can be further dried in a desiccator under vacuum. Lipids after drying are generally discarded after about one week because they tend to degrade with time.
ミセル構造がそれ自体は主に、ミセルを形成するために使用されるポリマー分子のタイプおよび組成、ならびに、ミセルの溶媒環境によって決定されるであろう。いくつかの実施形態において、ミセルが、親水性モノマーユニットおよび疎水性モノマーユニットの両方からなる非イオン性のトリブロックコポリマーを使用して製造される。本開示の実施形態においては、ポロキサマー、すなわち、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）のトリブロックコポリマーが使用される。いくつかの実施形態において、本開示のミセルは、様々なブロックサイズ（例えば、上記範囲の範囲内であるブロックサイズ）のＰＥＧ−ＰＬＡポリマーを使用して、また、様々な比率（例えば、約１：１０から約１０：１までの、または、どのような整数比であれ、前記比率の範囲内である整数比のＰＥＧ：ＰＬＡ）で調製することができる。 The micellar structure itself will be determined primarily by the type and composition of the polymer molecules used to form the micelles, as well as the solvent environment of the micelles. In some embodiments, micelles are prepared using non-ionic triblock copolymers consisting of both hydrophilic and hydrophobic monomer units. In embodiments of the present disclosure, poloxamers, ie, triblock copolymers of poly (ethylene oxide) -poly (propylene oxide) -poly (ethylene oxide) (PEO-PPO-PEO) are used. In some embodiments, the micelles of the present disclosure use PEG-PLA polymers of various block sizes (e.g., block sizes that are within the above range) and also have various ratios (e.g., about 1). It can be prepared with an integer ratio of PEG: PLA) which is within the range of 10: about 10: 1, or whatever integer ratio.
本明細書中に記載されるタンパク質を小胞内にコンジュゲートすることが、官能基で標識された脂質を、剪断力に基づく方法を使用して小胞内に補うことを介して行われる（Ｙｕ Ｂ、Ｌｅｅ ＲＪ、Ｌｅｅ ＬＪ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２００９；４６５：１２９〜１４１、および、Ｊｅｏｎｇ Ｄ、Ｊｏ Ｗ、Ｙｏｏｎ Ｊ他、Ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｆｒｏｍ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１４；３５（３４）：９３０２〜９３１０）。 Conjugating the proteins described herein into vesicles is accomplished via complementation of functional group-labeled lipids into vesicles using shear-based methods ( Yu B, Lee RJ, Lee LJ, Microfluidic methods for production of liposomes, Methods Enzymol., 2009; 465: 129-141, and Jeong D, Jo W, Yoon J et al., Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation, Biomaterials, 2014; 35 (34): 9302-9310).
別の局面において、本発明は、本発明の小胞と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物を提供する。本発明の小胞は、当業者に知られている様々な異なる様式で配合することができる。医薬的に許容され得るキャリアが一部は、投与される具体的な組成物によって、同様にまた、組成物を投与するために使用される具体的な方法によって決定される。したがって、本発明の医薬組成物の広範囲の様々な好適な配合物が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第２０版、２００３年、上掲）を参照のこと）。効果的な配合物には、経口配合物および鼻腔配合物、非経口投与のための配合物、ならびに、持続放出のために配合される組成物が含まれる。 In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the vesicle of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier. The vesicles of the invention can be formulated in a variety of different manners known to those skilled in the art. Pharmaceutically acceptable carriers are determined in part by the particular composition being administered, as well as by the particular method used to administer the composition. Thus, there is a wide variety of suitable formulations of the pharmaceutical composition of the invention (see, eg, Remington's Pharmaceutical Sciences (20th ed., 2003, supra)). Effective formulations include oral and nasal formulations, formulations for parenteral administration, and compositions formulated for sustained release.
投与のために、例えば、非経口投与のために、水溶性塩（例えば、ＮａＣｌ）の無菌の水溶液を用いることができる。さらなるキャリアまたは代替キャリアには、ゴマ油またはピーナッツ油、同様にまた、水性プロピレングリコールが含まれる場合がある。水溶液は、必要ならば、好適に緩衝化される場合があり、液体希釈剤は最初に、十分な生理食塩水またはグルコースにより等張性にすることができる。これらの水溶液は、静脈内注入、筋肉内注入、皮下注入、腹腔内注入および腫瘍内（ＩＴ）注入のためにとりわけ好適である。 For administration, for example, a sterile aqueous solution of a water-soluble salt (eg, NaCl) can be used, for parenteral administration. Additional carriers or alternative carriers may include sesame oil or peanut oil as well as aqueous propylene glycol. The aqueous solution may be suitably buffered, if necessary, and the liquid diluent first rendered isotonic with sufficient saline or glucose. These aqueous solutions are especially suitable for intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection and intratumoral (IT) injection.
経口投与のために好適である配合物は、（ａ）液体溶液、例えば、希釈剤（例えば、水、生理食塩水またはＰＥＧ４００など）に懸濁される効果的な量の本発明の化合物など、（ｂ）カプセル剤、サッシェ剤、デポ剤または錠剤（それぞれが、所定量の有効成分を、液体物、固体物、顆粒またはゼラチンとして含有する）、（ｃ）適切な液体における懸濁物、（ｄ）好適な乳化物、および、（ｅ）パッチからなることができる。上記の液体溶液は無菌の溶液であることが可能である。医薬用形態物は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、フィラー、バインダー、希釈剤、緩衝化剤、湿潤剤、保存剤、香味矯臭剤、色素、崩壊剤、ならびに、医薬上適合し得るキャリアの１つまたは複数を含むことができる。ロゼンジは有効成分を風味物（例えば、スクロース）に含むことができ、同様にまた、トローチ剤は有効成分を不活性基剤（例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア乳化物など）に含み、ゲル剤などは、有効成分に加えて、この技術分野で知られているキャリアを含有する。 Formulations suitable for oral administration include (a) a liquid solution, such as an effective amount of a compound of the invention suspended in a diluent such as water, saline or PEG 400 b) capsules, sachets, depots or tablets (each containing a predetermined amount of the active ingredient as a liquid, solid, granules or gelatin), (c) suspension in a suitable liquid, (d And (e) a suitable emulsion, and (e) a patch. The above liquid solution can be a sterile solution. Pharmaceutical forms include lactose, sucrose, mannitol, sorbitol, calcium phosphate, corn starch, potato starch, microcrystalline cellulose, gelatin, colloidal silicon dioxide, talc, magnesium stearate, stearic acid, and other excipients, colored One or more of the following may be included: agents, fillers, binders, diluents, buffers, wetting agents, preservatives, flavoring agents, dyes, disintegrants, and pharmaceutically compatible carriers. The lozenges can contain the active ingredient in flavors (eg sucrose), and likewise, the lozenges contain the active ingredient in an inert base (eg gelatin and glycerin or sucrose and acacia emulsions), gel The agent etc. contain, in addition to the active ingredient, a carrier known in the art.
別の局面において、本発明は、本発明のタンパク質コンジュゲート小胞を対象に投与することを含む、目的とする薬剤の送達を、オートファジー細胞および／またはアポトーシス細胞、ならびに前記細胞を含有する組織に対して標的化するための方法方法を提供する。１つの実施形態において、前記小胞を投与する前に、前記方法はさらに、オートファジー誘導剤および／またはアポトーシス誘導剤を標的細胞または標的組織に投与する工程を含む。この工程を使用することによって、標的細胞または標的組織において、オートファジーまたはアポトーシスが生じ、その結果、本発明の小胞は、オートファジーおよび／またはアポトーシスを受ける細胞または組織に対して標的化し、その後、目的とする薬剤をそのような細胞または組織に送達することができると考えられる。例えば、抗肥満抗体が最初に対象に投与され、その結果、脂肪細胞または脂肪組織がオートファジーおよび／またはアポトーシスを受けるようにされ、その後、抗肥満薬物を伴う小胞が、オートファジーおよび／またはアポトーシスを受ける脂肪細胞または脂肪組織を標的とするために投与され、その結果、これらの脂肪細胞または脂肪組織は前記抗肥満薬物によってさらに損傷されることが可能である。 In another aspect, the present invention provides autophagy cells and / or apoptotic cells, and tissues containing said cells, including the administration of the protein-conjugated vesicle of the present invention to a subject, for delivery of an agent of interest. Provide a method for targeting to. In one embodiment, before administering the vesicles, the method further comprises the step of administering an autophagy inducing agent and / or an apoptosis inducing agent to a target cell or target tissue. Using this step results in autophagy or apoptosis in the target cell or target tissue, such that the vesicles of the invention are targeted to cells or tissues undergoing autophagy and / or apoptosis, and then It is contemplated that the agent of interest can be delivered to such cells or tissues. For example, anti-obesity antibodies are initially administered to the subject such that the adipocytes or adipose tissue are subjected to autophagy and / or apoptosis, and then the vesicles with the anti-obesity drug are It is administered to target the adipocytes or adipose tissue undergoing apoptosis so that these adipocytes or adipose tissue can be further damaged by the anti-obesity drug.
オートファジーは、生存、分化、発達および恒常性のために必須であるリソソーム分解経路である。薬剤または治療剤を本発明の小胞とともにオートファジー細胞に送達することは、オートファジーの脱調節に伴う疾患に向けられる。オートファジーの脱調節に伴う疾患には、外傷、化学的および物理的な毒性因子への曝露、遺伝性疾患、老化関連疾患、心臓血管疾患、感染性疾患、腫瘍性疾患、神経変性疾患、代謝性疾患、老化（ＡＴＧ５が生物全体において過剰発現されるとき）、肥満（ＡＴＧ７またはオートファジー促進性転写因子ＥＢ［ＴＦＥＢ］が肝細胞において過剰発現されるとき）、ガン（ベクリン１がＫＲＡＳ誘導肺腺腫において発現されるとき）、β−アミロイドまたはα−シヌクレインまたは毒性により誘発される神経変性（ＴＦＥＢまたはベクリン１が脳において過剰発現されるとき、あるいは、シスタチンＢ（リソソームシステインプロテアーゼの阻害剤）がノックアウトされるとき）、筋変性状態（ＴＦＥＢまたはベクリン１が骨格筋に標的化されるとき）、および、嚢胞性線維症によって引き起こされる慢性の肺炎症（ベクリン１が肺において発現されるとき）が含まれるが、これらに限定されない。 Autophagy is a lysosomal degradation pathway that is essential for survival, differentiation, development and homeostasis. Delivery of drugs or therapeutics to autophagy cells with the vesicles of the present invention is directed to diseases associated with autophagy deregulation. Diseases associated with dysregulation of autophagy include trauma, exposure to chemical and physical toxic factors, hereditary diseases, aging related diseases, cardiovascular diseases, infectious diseases, neoplastic diseases, neurodegenerative diseases, metabolism Sexual disease, senescence (when ATG5 is overexpressed in whole organisms), obesity (when ATG7 or autophagy promoting transcription factor EB [TFEB] is overexpressed in hepatocytes), cancer (beclin 1 is KRAS induced lung When expressed in adenomas), beta-amyloid or alpha-synuclein or toxicity-induced neurodegeneration (TFEB or Beclin 1 is overexpressed in the brain, or cystatin B (an inhibitor of lysosomal cysteine protease)) When knocked out, the muscle degeneration condition (TFEB or Beclin 1 is targeted to skeletal muscle And chronic lung inflammation (when Beclin 1 is expressed in the lung) caused by cystic fibrosis, but is not limited thereto.
アポトーシスは、多数のアポトーシス促進性シグナルおよび抗アポトーシス性シグナルの統合によって制御される。本発明の小胞を用いて薬剤または治療剤をアポトーシス細胞に送達は、アポトーシスの変化に伴う疾患を対象にする。アポトーシスの変化に伴う疾患には、外傷、化学的および物理的な毒性因子への曝露、遺伝性疾患、老化関連疾患、老化関連疾患、心臓血管疾患、感染性疾患、腫瘍性疾患、神経変性疾患、代謝性疾患、老化、肥満、ガン、β−アミロイドもしくはα−シヌクレインにより誘発される神経変性（アルツハイマー、パーキンソン、ハンチントン、筋萎縮性側索硬化症）または毒性により誘発される神経変性、筋変性状態、あるいは、嚢胞性線維症によって引き起こされる慢性の肺炎症、心臓血管障害（例えば、虚血、心不全および感染性疾患など）および自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、自己免疫性リンパ増殖症候群、関節リウマチおよび甲状腺炎）が含まれるが、これらに限定されない。 Apoptosis is controlled by the integration of numerous pro- and anti-apoptotic signals. Delivery of drugs or therapeutics to apoptotic cells using the vesicles of the invention is directed to diseases associated with changes in apoptosis. Diseases associated with changes in apoptosis include trauma, exposure to chemical and physical toxic factors, hereditary diseases, aging related diseases, aging related diseases, cardiovascular diseases, infectious diseases, neoplastic diseases, neurodegenerative diseases Metabolic disease, aging, obesity, cancer, β-amyloid or α-synuclein-induced neurodegeneration (Alzheimer, Parkinson, Huntington, amyotrophic lateral sclerosis) or toxicity-induced neurodegeneration, muscle degeneration Or chronic lung inflammation caused by cystic fibrosis, cardiovascular disorders (eg, ischemia, heart failure and infectious diseases etc) and autoimmune diseases (systemic lupus erythematosus, autoimmune lymphoproliferative syndrome, rheumatoid arthritis And thyroiditis) but not limited thereto.
本発明の小胞は、診断剤または治療剤の投与を必要とする疾患をどのような疾患であっても処置するために、または診断するために使用することができる。好適な薬剤または治療剤はどのようなものであっても、本発明の小胞とともに使用することができる。加えて、本発明の小胞は、様々な病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌および寄生生物など）による感染を処置するために有用である。他の疾患を、本発明の小胞を使用して処置することができる。 The vesicles of the present invention can be used to treat or diagnose any disease that requires the administration of a diagnostic or therapeutic agent. Any suitable agent or therapeutic agent can be used with the vesicles of the invention. In addition, the vesicles of the invention are useful for treating infections with various pathogens, such as, for example, viruses, bacteria, fungi and parasites. Other diseases can be treated using the vesicles of the invention.
いくつかの実施形態において、本発明の小胞または医薬組成物は、局所投与、非経口投与、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、結腸投与、直腸投与または腹腔内投与を含めて様々な方式で患者に投与することができる。好ましくは、医薬組成物は、非経口投与、局所投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与または鼻腔投与（例えば、吸入など）によって投与される。 In some embodiments, the vesicles or pharmaceutical compositions of the invention can be administered topically, parenterally, intravenously, intradermally, subcutaneously, intramuscularly, colonically, rectally or intraperitoneally. It can be administered to patients in a variety of ways, including. Preferably, the pharmaceutical composition is administered by parenteral administration, topical administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, oral administration or nasal administration (eg, inhalation etc.).
ある実施形態において、タンパク質コンジュゲート小胞は、脂質、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、治療剤またはナノ材料を送達することができる。いくつかの実施形態において、治療剤は細胞生存強化剤（または細胞死抑制剤）である。細胞生存強化剤（または細胞死抑制剤）を対象に送達することにより、組織傷害の薬物媒介レスキューを行うことができる。 In certain embodiments, protein conjugated vesicles can deliver lipids, proteins, DNA, RNA, therapeutic agents or nanomaterials. In some embodiments, the therapeutic agent is a cell survival enhancer (or cell death inhibitor). By delivering a cell survival enhancer (or cell death inhibitor) to a subject, drug-mediated rescue of tissue injury can be performed.
いくつかの実施形態において、前記薬剤は、細胞生存抑制剤、細胞死強化剤または抗腫瘍剤である。細胞生存抑制剤（細胞死強化剤）または抗腫瘍剤の送達により、天然に存在するオートファジー細胞およびアポトーシス細胞を含有するそのような組織（例えば、腫瘍など）の標的細胞の生存を低下させることができ、または、、細胞傷害性薬剤（例えば、薬物、毒素、または組織特異的タンパク質に対する抗体など）を使用することで特定の組織においてオートファジー細胞およびアポトーシス細胞が人為的に誘導される選択された特定の組織を減少させることができる。 In some embodiments, the agent is a cell survival inhibitor, a cell death enhancer or an antitumor agent. To reduce the survival of target cells of naturally occurring autophagy cells and apoptotic cells (such as tumors) by delivery of cell survival inhibitors (cell death enhancers) or anti-tumor agents Selected, or autophagy cells and apoptotic cells are artificially induced in specific tissues by using cytotoxic agents (eg, drugs, toxins, or antibodies to tissue specific proteins). Specific tissues can be reduced.
いくつかの実施形態において、治療剤は幹細胞または始原体細胞である。幹細胞および始原体細胞の送達により、保護的な生理学的機能を発揮させ、オートファジー細胞およびアポトーシス細胞を含有する組織をレスキューすることができる。 In some embodiments, the therapeutic agent is a stem cell or progenitor cell. Delivery of stem cells and primordial somatic cells can exert protective physiological functions and rescue tissues containing autophagy cells and apoptotic cells.
本発明が、好ましい実施形態およびそれらの実施例を参照して記載されているが、本発明の範囲は、そのような記載された実施形態のみに限定されない。当業者には明らかであるように、上記の発明に対する様々な改変および適合化が、添付された特許請求の範囲によって定義および限定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。下記の実施例は、本発明の様々な実施形態および利点を例示するという趣旨のために提供されており、本発明の範囲を限定することは意図されない。 Although the present invention has been described with reference to the preferred embodiments and their examples, the scope of the present invention is not limited to only such described embodiments. As will be apparent to those skilled in the art, various modifications and adaptations to the above-described invention can be made without departing from the spirit and scope of the invention as defined and limited by the appended claims. . The following examples are provided for the purpose of illustrating various embodiments and advantages of the present invention, and are not intended to limit the scope of the present invention.
実施例１ インビトロにおけるオートファジー細胞へのリポソーム標的化
リポソームの調製
Example 1 Liposome Targeting to Autophagy Cells In Vitro Preparation of Liposomes
リポソームを、リポソームキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）およびそれぞれの脂質によって調製した。表面タンパク質のコンジュゲート形成が、官能基で標識された脂質を、剪断力に基づく方法を使用してリポソーム内に補うことを介して行われる（Ｙｕ Ｂ、Ｌｅｅ ＲＪ、Ｌｅｅ ＬＪ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２００９；４６５：１２９〜１４１、および、Ｊｅｏｎｇ Ｄ、Ｊｏ Ｗ、Ｙｏｏｎ Ｊ他、Ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｆｒｏｍ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１４；３５（３４）：９３０２〜９３１０）。タンパク質（Ｍ６ＰＲ、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＰＳＧＬ−１、ＣＤ２２、ＣＤ２０６、ガレクチン３、アネキシンＶ、インテグリンαＬβ２、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３００ａ、ＣＤ４７、ＴＳＰ１およびＣＤ３６）のリポソームへのタンパク質コンジュゲーションはは、製品によって提供される方法に基づいている。 Liposomes were prepared with a liposome kit (Sigma-Aldrich Co.) and the respective lipids. Conjugation of surface proteins is performed via complementation of functionally labeled lipids into liposomes using shear based methods (Yu B, Lee RJ, Lee LJ, Microfluidic methods for production of Liposomes, Methods Enzymol., 2009; 465: 129-141, and Jeong D, Jo W, Yoon J, et al., Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation, Biomaterials, 2014; 35 (34): 9302-9310) . The protein conjugation of the protein (M6PR, P-selectin, E-selectin, PSGL-1, CD22, CD206, galectin 3, annexin V, integrin αLβ2, VE-cadherin, CD300a, CD47, TSP1 and CD36) , Based on the method provided by the product.
オートファジー細胞およびアポトーシス細胞に対する相対的会合レベルの測定 Measurement of relative association levels for autophagy and apoptotic cells
マウスＢ１６−Ｆ１０細胞を４時間にわたって懸濁して、オートファジーおよびアポトーシスを誘導した。オートファジー細胞およびアポトーシス細胞を、Ｃｙｔｏ−ＩＤオートファジー検出キット（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（図１および図３を参照のこと）、および、ＣａｓｐＧＬＯＷＴＭ Ｒｅｄ活性カスパーゼ−３染色キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）（図２および図４を参照のこと）のキットをそれぞれ使用して、緑色蛍光色素（ＧＦＤ）で標識した。オートファジー細胞およびアポトーシス細胞を含有する集団が、蛍光色素のカルセイン−レッド（ＣＲ）で標識された様々なタンパク質コンジュゲートリポソームと会合した。Ｂ１６−Ｆ１０リポソーム会合集団（ＧＦＤおよびＣＲの二重陽性集団）の割合を、フローサイトメトリーを使用して求めた。非コンジュゲートの細胞と会合したリポソームおよび蛍光性ビーズ（「非コンジュゲート」群）のレベルを１００％に正規化した（図１および図２を参照のこと）。 Mouse B16-F10 cells were suspended for 4 hours to induce autophagy and apoptosis. Autophagy cells and apoptotic cells, Cyto-ID autophagy detection kit (Enzo Life Sciences) (see Figure 1 and Figure 3), and CaspGLOWTM Red active caspase-3 staining kit (BioVision) (Figure 2 and Figure) The green fluorescent dye (GFD) was labeled using each kit of 4). A population containing autophagy cells and apoptotic cells was associated with various protein conjugated liposomes labeled with the fluorescent dye calcein-red (CR). The percentage of B16-F10 liposome associated populations (double positive populations of GFD and CR) was determined using flow cytometry. The levels of liposomes and fluorescent beads ("non-conjugated" group) associated with unconjugated cells were normalized to 100% (see Figures 1 and 2).
実施例２ 様々なタンパク質コンジュゲートを介した損傷組織に対して特異的に標的化されるリポソーム
チオアセトアミド（ＴＡＡ）肝炎のマウスモデルにおける傷害された肝臓に対する改変リポソームの標的化
Example 2 Liposomes Specifically Targeted to Damaged Tissue Via Different Protein Conjugates Targeting Modified Liposomes to Injured Liver in a Mouse Model of Thioacetamide (TAA) Hepatitis
チオアセトアミド（ＴＡＡ）肝炎のマウスモデルにおいて、非コンジュゲートリポソーム（フルオレセイン含有）およびＭ６ＰＲコンジュゲートの改変リポソーム（フルオレセイン含有）を実験マウスにそれぞれ静脈内注入した。２４時間後において、蛍光レベルを、ＩＶＩＳシステムを使用して求めた（図５を参照のこと）。これらの結果は、Ｍ６ＰＲコンジュゲート改変リポソーム（フルオレセイン含有）はリポソーム搭載フルオレセインを肝臓内に特異的に送達することができることを示唆した。 In a mouse model of thioacetamide (TAA) hepatitis, unconjugated liposomes (containing fluorescein) and modified liposomes containing M6PR conjugate (containing fluorescein) were injected intravenously into experimental mice, respectively. After 24 hours, fluorescence levels were determined using an IVIS system (see FIG. 5). These results suggested that the M6PR conjugate modified liposome (containing fluorescein) can specifically deliver liposome-loaded fluorescein into the liver.
相乗作用アッセイを上述の方法に従って行った。結果が図６に示される。図に示されるように、Ｐ−ｓｅｌ、ｇａｌ−３、ｓｉｇｌｅｃ２、ＭＭＲ、αＬβ２、ＣＤ３１、アネキシンＶ、ＣＤ４４またはＶＥ−カドヘリンとの組合せでのＭ６ＰＲの肝臓における蛍光強度が、Ｍ６ＰＲのみよりも有意に高い。上記組合せにより、相乗効果が示される。 The synergy assay was performed according to the method described above. The results are shown in FIG. As shown in the figure, the fluorescence intensity in the liver of M6PR in combination with P-sel, gal-3, siglec2, MMR, αLβ2, CD31, annexin V, CD44 or VE-cadherin is more significant than M6PR alone. high. The above combination shows a synergistic effect.
マウスＢ１６−Ｆ１０細胞株に由来する固形腫瘍 Solid tumors derived from mouse B16-F10 cell line
マウスに、Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞（１＊１０６細胞／マウス）を鼠径部位に皮下注入した。３日目および８日目に、（フルオレセイン含有）コントロールリポソームおよびＭ６ＰＲコンジュゲート改変リポソームをマウスの眼窩静脈洞にそれぞれ注入した。マウスを１２日目に屠殺した。腫瘍の蛍光強度を、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒｕｍを使用して観測した。結果が図７に示される。図に示されるように、Ｍ６ＰＲコンジュゲート改変リポソームの腫瘍における蛍光強度が他の臓器における蛍光強度よりも有意に高く、このことは、Ｍ６ＰＲコンジュゲート改変リポソームは腫瘍部位を特定することができることを示す。 Mice were injected subcutaneously at the inguinal site with B16-F10 melanoma cells (1 * 10 6 cells / mouse). On days 3 and 8, control liposomes (containing fluorescein) and M6PR conjugated modified liposomes were injected into the orbital sinus of mice, respectively. The mice were sacrificed on day 12. Tumor fluorescence intensity was observed using IVIS® Spectrum. The results are shown in FIG. As shown in the figure, the fluorescence intensity in the tumor of M6PR conjugate modified liposome is significantly higher than the fluorescence intensity in other organs, which indicates that M6PR conjugate modified liposome can identify the tumor site .
相乗作用アッセイを上述の方法に従って行った。（フルオレセイン含有）コントロールリポソーム、Ｍ６ＰＲコンジュゲートリポソーム、Ｍ６ＰＲ−Ｐ−ｓｅｌコンジュゲートリポソームおよびＭ６ＰＲ−Ｇａｌ３コンジュゲート改変リポソームをマウスの眼窩静脈洞にそれぞれ注入した。マウスを１２日目に屠殺した。腫瘍の蛍光強度を、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒｕｍを使用して観測した。結果が図８に示される。図に示されるように、Ｍ６ＰＲコンジュゲートリポソーム、Ｍ６ＰＲ−Ｐ−ｓｅｌコンジュゲートリポソームおよびＭ６ＰＲ−Ｇａｌ３コンジュゲート改変リポソームの腫瘍における蛍光強度が他の臓器における蛍光強度よりも有意に高い。そのうえ、Ｍ６ＰＲ−Ｐ−ｓｅｌリポソームおよびＭ６ＰＲ−Ｇａｌ３コンジュゲート改変リポソームは、Ｍ６ＰＲコンジュゲート改変リポソームよりも良好な相乗作用効力を示す。 The synergy assay was performed according to the method described above. Control liposomes (containing fluorescein), M6PR-conjugated liposomes, M6PR-P-sel-conjugated liposomes and M6PR-Gal3-conjugated modified liposomes were respectively injected into the orbital sinus of mice. The mice were sacrificed on day 12. Tumor fluorescence intensity was observed using IVIS® Spectrum. The results are shown in FIG. As shown in the figure, the fluorescence intensities in the tumors of M6PR-conjugated liposomes, M6PR-P-sel-conjugated liposomes and M6PR-Gal3-conjugated modified liposomes are significantly higher than those in other organs. Moreover, M6PR-P-sel liposomes and M6PR-Gal3 conjugated modified liposomes show better synergistic efficacy than M6PR conjugated modified liposomes.
抗脂肪抗体を注射した後の脂肪組織 Adipose tissue after injection of anti-fat antibody
高脂肪食を摂るマウスに、コントロールＩｇまたは抗脂肪抗体（７５μｇ／マウス）を０時間および４８時間において眼窩静脈洞にそれぞれ注入した。（フルオレセイン含有）コントロールリポソーム、Ｍ６ＰＲコンジュゲートリポソーム、Ｍ６ＰＲ−Ｐ−ｓｅｌコンジュゲートリポソームおよびＭ６ＰＲ−Ｇａｌ３抱合コンジュゲートリポソームを、６時間、２４時間、５４時間および７２時間においてマウスの眼窩静脈洞にそれぞれ注入した。マウスを９６時間後に屠殺して、白色脂肪組織を取り出した。腫瘍の蛍光強度を、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒｕｍを使用して観測した。結果が図９に示される。図に示されるように、Ｍ６ＰＲコンジュゲートリポソーム、Ｍ６ＰＲ−Ｐ−ｓｅｌコンジュゲートリポソームおよびＭ６ＰＲ−Ｇａｌ３コンジュゲート改変リポソームの脂肪組織における蛍光強度がコントロールよりも有意に高い。そのうえ、Ｍ６ＰＲ−Ｐ−ｓｅｌリポソームおよびＭ６ＰＲ−Ｇａｌ３コンジュゲート改変リポソームは、Ｍ６ＰＲコンジュゲート改変リポソームよりも良好な相乗的効果を示す。 Mice receiving a high fat diet were injected with control Ig or anti-fat antibody (75 μg / mouse) at 0 and 48 hours, respectively, in the orbital sinus. Control liposomes (containing fluorescein), M6PR-conjugated liposomes, M6PR-P-sel-conjugated liposomes and M6PR-Gal3-conjugated conjugated liposomes are injected into the orbital sinus of mice at 6, 24, 54 and 72 hours respectively did. The mice were sacrificed 96 hours later to remove white adipose tissue. Tumor fluorescence intensity was observed using IVIS® Spectrum. The results are shown in FIG. As shown in the figure, the fluorescence intensity in adipose tissue of M6PR conjugated liposomes, M6PR-P-sel conjugated liposomes and M6PR-Gal3 conjugated modified liposomes is significantly higher than the control. Moreover, M6PR-P-sel liposomes and M6PR-Gal3 conjugate modified liposomes show better synergistic effect than M6PR conjugate modified liposomes.
傷害組織はオートファジー細胞およびアポトーシス細胞を含有する。 The injured tissue contains autophagy cells and apoptotic cells.
チオアセトアミド（ＴＡＡ）処置されたマウス肝臓 Thioacetamide (TAA) -treated mouse liver
チオアセトアミド（ＴＡＡ）肝炎のマウスモデルにおいて、非コンジュゲートリポソーム（フルオレセイン含有）およびＭ６ＰＲコンジュゲート改変リポソーム（フルオレセイン含有）を実験マウスの眼窩静脈洞にそれぞれ静脈内注入した。２４時間後において、オートファジーおよびアポトーシスの肝臓細胞を、Ｃｙｔｏ−ＩＤオートファジー検出キット（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および、ＣａｓｐＧＬＯＷＴＭ Ｒｅｄ活性カスパーゼ−３染色キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）のキットをそれぞれ使用して、緑色蛍光色素（ＧＦＤ）で標識した。オートファジーおよびアポトーシスの肝臓細胞を含有する集団が、Ｍ６ＰＲコンジュゲート改変リポソーム（これは蛍光色素のカルセイン−レッド（ＣＲ）で標識された）と会合した。肝臓細胞−リポソーム会合集団（ＧＦＤおよびＣＲの二重陽性集団）の割合を、フローサイトメトリーを使用して求めた。非コンジュゲートの細胞と会合したリポソームおよび蛍光性ビーズ（「非コンジュゲート」群）のレベルを１００％に正規化した（図１０を参照のこと）。 In a mouse model of thioacetamide (TAA) hepatitis, non-conjugated liposomes (containing fluorescein) and M6PR-conjugated modified liposomes (containing fluorescein) were respectively injected intravenously into the orbital vein of experimental mice. After 24 hours, autophagy and apoptotic liver cells are stained with green fluorescence using the Cyto-ID Autophagy Detection Kit (Enzo Life Sciences) and the CaspGLOWTM Red Activity Caspase-3 Staining Kit (BioVision) kit, respectively. Labeled with dye (GFD). A population containing autophagy and apoptotic liver cells was associated with M6PR conjugate modified liposomes (which were labeled with the fluorescent dye calcein-red (CR)). The percentage of liver cell-liposome associated population (double positive population of GFD and CR) was determined using flow cytometry. The levels of liposomes and fluorescent beads ("non-conjugated" group) associated with unconjugated cells were normalized to 100% (see Figure 10).
Ｂ１６−Ｆ１０細胞によって形成される固形腫瘍 Solid tumor formed by B16-F10 cells
マウスに、Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞（１＊１０６細胞／マウス）を鼠径部位に皮下注入した。３日目および８日目に、（フルオレセイン含有）コントロールリポソームおよびＭ６ＰＲコンジュゲート改変リポソームをマウスの眼窩静脈洞に注入した。マウスを１２日目に屠殺した。オートファジーおよびアポトーシスの腫瘍細胞を、Ｃｙｔｏ−ＩＤオートファジー検出キット（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および、ＣａｓｐＧＬＯＷＴＭ Ｒｅｄ活性カスパーゼ−３染色キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）のキットをそれぞれ使用して、緑色蛍光色素（ＧＦＤ）で標識した。オートファジーおよびアポトーシスの腫瘍細胞を含有する集団が、Ｍ６ＰＲコンジュゲート改変リポソーム（これは蛍光色素のカルセイン−レッド（ＣＲ）で標識された）と会合した。肝臓細胞−リポソーム会合集団（ＧＦＤおよびＣＲの二重陽性集団）の割合を、フローサイトメトリーを使用して求めた。非コンジュゲートの細胞と会合したリポソームおよび蛍光性ビーズ（「非コンジュゲート」群）のレベルを１００％に正規化した（図１１を参照のこと）。 Mice were injected subcutaneously at the inguinal site with B16-F10 melanoma cells (1 * 10 6 cells / mouse). On days 3 and 8, control liposomes (containing fluorescein) and M6PR conjugated modified liposomes were injected into the orbital sinus of mice. The mice were sacrificed on day 12. Autophagy and apoptotic tumor cells are treated with green fluorescent dye (GFD) using Cyto-ID autophagy detection kit (Enzo Life Sciences) and kit of CaspGLOWTM Red Active Caspase-3 Staining Kit (BioVision) respectively It was labeled. A population containing autophagy and apoptotic tumor cells was associated with the M6PR conjugate modified liposome (which was labeled with the fluorochrome calcein-red (CR)). The percentage of liver cell-liposome associated population (double positive population of GFD and CR) was determined using flow cytometry. The levels of liposomes and fluorescent beads ("non-conjugated" group) associated with unconjugated cells were normalized to 100% (see Figure 11).
抗脂肪抗体で処置された脂肪組織 Fat tissue treated with anti-fat antibody
高脂肪食を摂るマウスに、コントロールＩｇまたは抗脂肪抗体（７５μｇ／マウス）を０時間および４８時間において眼窩静脈洞にそれぞれ注入した。（フルオレセイン含有）コントロールリポソーム、Ｍ６ＰＲコンジュゲートリポソーム、Ｍ６ＰＲ−Ｐ−ｓｅｌコンジュゲートリポソームおよびＭ６ＰＲ−Ｇａｌ３コンジュゲート改変リポソームを、６時間、２４時間、５４時間および７２時間においてマウスの眼窩静脈洞にそれぞれ注入した。マウスを９６時間後に屠殺して、白色脂肪組織を取り出した。オートファジーおよびアポトーシスの脂肪細胞を、Ｃｙｔｏ−ＩＤオートファジー検出キット（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および、ＣａｓｐＧＬＯＷＴＭ Ｒｅｄ活性カスパーゼ−３染色キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）のキットをそれぞれ使用して、緑色蛍光色素（ＧＦＤ）で標識した。オートファジーおよびアポトーシスの脂肪細胞を含有する集団が、Ｍ６ＰＲコンジュゲート改変リポソーム（これは蛍光色素のカルセイン−レッド（ＣＲ）で標識された）と会合した。肝臓細胞−リポソーム会合集団（ＧＦＤおよびＣＲの二重陽性集団）の割合を、フローサイトメトリーを使用して求めた。非コンジュゲートの細胞と会合したリポソームおよび蛍光性ビーズ（「非コンジュゲート」群）のレベルを１００％に正規化した（図１２を参照のこと）。 Mice receiving a high fat diet were injected with control Ig or anti-fatty antibody (75 μg / mouse) at 0 and 48 hours, respectively, in the orbital sinus. Control liposomes (containing fluorescein), M6PR conjugated liposomes, M6PR-P-sel conjugated liposomes and M6PR-Gal3 conjugated modified liposomes are injected into the orbital sinus of mice at 6, 24, 54 and 72 hours respectively did. The mice were sacrificed 96 hours later to remove white adipose tissue. Autophagy and apoptotic adipocytes are treated with green fluorescent dye (GFD) using Cyto-ID autophagy detection kit (Enzo Life Sciences) and kit of CaspGLOWTM Red Active Caspase-3 Staining Kit (BioVision) respectively It was labeled. A population containing autophagy and apoptotic adipocytes was associated with the M6PR conjugate modified liposome (which was labeled with the fluorochrome calcein-red (CR)). The percentage of liver cell-liposome associated population (double positive population of GFD and CR) was determined using flow cytometry. The levels of liposomes and fluorescent beads ("non-conjugated" group) associated with unconjugated cells were normalized to 100% (see Figure 12).
実施例３ ブロッキング抗体、可溶性組換えタンパク質および可溶性Ｍ６Ｐの処置は、オートファジー細胞およびアポトーシス細胞に対して標的化するＭ６ＰＲコンジュゲート改変リポソーム／微小胞の標的化を阻止することができ、解毒物として働く場合がある
マウスＢ１６−Ｆ１０細胞を４時間にわたって懸濁し、その後、ブロッキング抗体または可溶性Ｍ６ＰＲ組換えタンパク質、加えて、さらなるＭ６ＰＲ＋Ｐ−セレクチンコンジュゲートリポソームにより処置した。オートファジーおよびアポトーシスの細胞を、Ｃｙｔｏ−ＩＤオートファジー検出キット（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および、ＣａｓｐＧＬＯＷＴＭ Ｒｅｄ活性カスパーゼ−３染色キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）のキットをそれぞれ使用して、緑色蛍光色素（ＧＦＤ）で標識した。オートファジー細胞およびアポトーシス細胞を含有する集団が、Ｍ６ＰＲ＋Ｐ−セレクチンとコンジュゲートリポソーム（これは蛍光色素のカルセイン−レッド（ＣＲ）で標識された）と会合した。Ｂ１６−Ｆ１０−リポソーム会合集団（ＧＦＤおよびＣＲの二重陽性集団）の割合を、フローサイトメトリーを使用して求めた。非コンジュゲートの細胞と会合したリポソームおよび蛍光性ビーズ（「非コンジュゲート」群）のレベルを１００％に正規化した（図１３および図１４を参照のこと）。
Example 3 Treatment of blocking antibody, soluble recombinant protein and soluble M6P can block targeting of M6PR conjugate modified liposomes / microvesicles targeting to autophagy cells and apoptotic cells, as an antidote Murine B16-F10 cells may be suspended for 4 hours and then treated with additional blocking antibody or soluble M6PR recombinant protein, plus additional M6PR + P-selectin conjugated liposomes. Autophagy and apoptotic cells are labeled with green fluorescent dye (GFD) using the Cyto-ID Autophagy Detection Kit (Enzo Life Sciences) and the CaspGLOWTM Red Active Caspase-3 Staining Kit (BioVision) Kit respectively did. A population containing autophagy cells and apoptotic cells was associated with M6PR + P-selectin and conjugated liposomes (which were labeled with the fluorescent dye calcein-red (CR)). The percentage of B16-F10-liposome associated population (double positive population of GFD and CR) was determined using flow cytometry. The levels of liposomes and fluorescent beads ("non-conjugated" group) associated with unconjugated cells were normalized to 100% (see Figures 13 and 14).
実施例４ インビトロにおいてオートファジー細胞およびアポトーシス細胞に対して特異的に標的化されるリポソーム搭載物（脂質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、薬物）
マウスＢ１６−Ｆ１０細胞を４時間にわたって懸濁して、アポトーシスを誘導し、その後、カスパーゼ−３阻害剤搭載のＭ６ＰＲコンジュゲートリポソームにより処置し、血清非含有培地とインキュベーションした。２４時間後において、アポトーシス細胞の割合を、フローサイトメトリーを使用して求めた（図１７を参照のこと）。
Example 4 Liposome loading specifically targeted to autophagy cells and apoptotic cells in vitro (lipid, DNA, RNA, protein, drug)
Mouse B16-F10 cells were suspended for 4 hours to induce apoptosis and then treated with caspase-3 inhibitor loaded M6PR conjugated liposomes and incubated with serum free medium. After 24 hours, the percentage of apoptotic cells was determined using flow cytometry (see FIG. 17).
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）標識化化学反応（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質標識キット；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．）を使用して、蛍光標識されたＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を調製した。蛍光性ＤＮＡ、蛍光性ＲＮＡおよび蛍光性タンパク質（Ｂｃｌ−ｘＬのＢＨ４モチーフ）を、細胞浸透性ペプチド（Ｒ８ １１）との複合体を介して、または、細胞浸透性ペプチド（Ｒ８ １１）とのコンジュゲート化（グルタルアルデヒド；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）によりリポソーム／ＭＶに送達した。これらの結果から、Ｍ６ＰＲコンジュゲートリポソームは、ＤＮＡ搭載リポソーム、ＲＮＡ搭載リポソームおよびタンパク質搭載リポソームのアポトーシス細胞への標的化を達成することができる（図１８を参照のこと）。
表１．単一の組換えタンパク質がコンジュゲートされたカスパーゼ−３阻害剤搭載リポソームを例として使用して、ＴＡＡ処置マウスの相乗的なレスキューを、低下したＡＬＴレベルによる検出を介して分析した（＋ Ｐ＜０．０５、＋＋ Ｐ＜０．０１）。
Table 1. Synaptic rescue of TAA-treated mice was analyzed via detection by reduced ALT levels, using caspase-3 inhibitor loaded liposomes conjugated with a single recombinant protein as an example (+ P < 0.05, ++ P <0.01).
実施例６ インビボにおけるリポソーム表面での様々なタンパク質コンジュゲートを介した傷害組織（ＩＶＩＳ）に特異的に標的化される改変リポソームの実証
チオアセトアミド（ＴＡＡ）肝炎のマウスモデルにおいて、Ｍ６ＰＲ、Ｍ６ＰＲ＋Ｐ−セレクチン抱合、Ｍ６ＰＲ＋Ｅ−セレクチン、および、Ｍ６ＰＲ＋ＰＳＧＬ−１とのコンジュゲートされたカスパーゼ−３阻害剤搭載リポソームを実験マウスに静脈内注入した。２４時間後において、血漿アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）レベルを分析した（図１９を参照のこと）。これらの結果は、セレクチンコンジュゲートリポソームは損傷後の組織に対して標的化することができるだけでなく、標的組織を治療するために薬物を運ぶことができることを示唆した（図１９を参照のこと）。
Example 6 Demonstration of Modified Liposomes Targeted Specifically to Injured Tissue (IVIS) Via Various Protein Conjugates at the Liposomal Surface in Vivo M6PR, M6PR + P-selectin in a Mouse Model of Thioacetamide (TAA) Hepatitis Conjugated, M6PR + E-selectin, and caspase-3 inhibitor loaded liposomes conjugated with M6PR + PSGL-1 were injected intravenously into experimental mice. After 24 hours, plasma aspartate transaminase (AST) levels were analyzed (see FIG. 19). These results suggested that selectin-conjugated liposomes could not only be targeted to the tissue after injury, but could also carry drugs to treat the target tissue (see FIG. 19). .
チオアセトアミド（ＴＡＡ）肝炎のマウスモデルにおいて、Ｍ６ＰＲ、Ｍ６ＰＲ＋Ｐ−セレクチン、Ｍ６ＰＲ＋Ｅ−セレクチン、および、Ｍ６ＰＲ＋ＰＳＧＬ−１とコンジュゲートされたＢｃｌ−２発現プラスミド搭載リポソームを実験マウスに静脈内注入した。２４時間後において、血漿アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）レベルを分析した（図２０を参照のこと）。これらの結果は、セレクチンコンジュゲートリポソームは損傷後の組織に対して標的化することができるだけでなく、標的組織を治療するためにプラスミドＤＮＡを運ぶことができることを示唆した。 In a mouse model of thioacetamide (TAA) hepatitis, experimental mice were injected intravenously with M6PR, M6PR + P-selectin, M6PR + E-selectin, and a Bcl-2 expression plasmid-loaded liposome conjugated with M6PR + PSGL-1. After 24 hours, plasma aspartate transaminase (AST) levels were analyzed (see FIG. 20). These results suggested that selectin-conjugated liposomes could not only be targeted to the tissue after injury, but could also carry plasmid DNA to treat the target tissue.
チオアセトアミド（ＴＡＡ）肝炎のマウスモデルにおいて、Ｍ６ＰＲ、Ｍ６ＰＲ＋Ｐ−セレクチン、Ｍ６ＰＲ＋Ｅ−セレクチン、および、Ｍ６ＰＲ＋ＰＳＧＬ−１とコンジュゲートされたカスパーゼ−３ｓｉＲＮＡ搭載リポソームを実験マウスに静脈内注入した。２４時間後において、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを分析した（図２１を参照のこと）。これらの結果は、これらのタンパク質コンジュゲートリポソームは損傷後の組織に対して標的化することができるだけでなく、標的組織を治療するためにＲＮＡを運ぶことができることを示唆した（図２１を参照のこと）。 In a mouse model of thioacetamide (TAA) hepatitis, M6PR, M6PR + P-selectin, M6PR + E-selectin, and caspase-3 siRNA loaded liposomes conjugated with M6PR + PSGL-1 were injected intravenously into experimental mice. After 24 hours, plasma alanine aminotransferase (ALT) levels were analyzed (see FIG. 21). These results suggested that these protein-conjugated liposomes could not only be able to target tissue after injury but could also carry RNA to treat the target tissue (see FIG. 21) about).
チオアセトアミド（ＴＡＡ）肝炎のマウスモデルにおいて、Ｍ６ＰＲ、Ｍ６ＰＲ＋Ｐ−セレクチン、Ｍ６ＰＲ＋Ｅ−セレクチン、および、Ｍ６ＰＲ＋ＰＳＧＬ−１とコンジュゲートされた抗アポトーシス性Ｂｃｌ−ｘＬ由来ＢＨ４モチーフ搭載リポソームを実験マウスに静脈内注入した。２４時間後において、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを分析した（図２２を参照のこと）。 M6PR, M6PR + P-selectin, M6PR + E-selectin, and anti-apoptotic Bcl-xL derived BH4 motif-loaded liposome conjugated with M6PR + PSGL-1 were intravenously injected into experimental mice in a mouse model of thioacetamide (TAA) hepatitis . After 24 hours, plasma alanine aminotransferase (ALT) levels were analyzed (see FIG. 22).
チオアセトアミド（ＴＡＡ）肝炎のマウスモデルにおいて、Ｍ６ＰＲ＋ガレクチン３、Ｍ６ＰＲ＋Ｐ−セレクチン、Ｓｉｇｌｅｃ２＋Ｐ−セレクチンと、および、Ｓｉｇｌｅｃ２＋ガレクチン３とコンジュゲートされたカスパーゼ−３阻害剤搭載リポソームを実験マウスに静脈内注入した。２４時間後において、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを分析した（図２３を参照のこと）。 In a mouse model of thioacetamide (TAA) hepatitis, experimental mice were injected intravenously with caspase-3 inhibitor loaded liposomes conjugated with M6PR + galectin3, M6PR + P-selectin, Siglec2 + P-selectin, and Siglec2 + galectin-3. After 24 hours, plasma alanine aminotransferase (ALT) levels were analyzed (see FIG. 23).
実施例７ 傷害部位への本発明のタンパク質コンジュゲートリポソームによるＣＤ３４＋細胞の標的化、および、ＣＤ３４＋細胞媒介レスキューに対するタンパク質コンジュゲートリポソームの相乗効果
蛍光（カルセインレッド）標識されたマウスＣＤ３４＋幹細胞（１×１０７細胞／マウス）を、Ｍ６ＰＲコンジュゲートリポソーム／ＭＶ、およびＭ６ＰＲ＋Ｐ−ｓｅｌコンジュゲートリポソーム／ＭＶ（マウスあたり２．５×１０９個のＭＶ）を伴って実験マウスに静脈内注入した。蛍光レベルを、ＩＶＩＳシステムを使用して求めた（図２４を参照のこと）。
Example 7 Targeting of CD34 + Cells by Protein-Conjugated Liposomes of the Invention to the Site of Injury and Synergistic Effect of Protein-Conjugated Liposomes on CD34 + Cell-Mediated Rescue Fluorescent (Calcein Red) -labeled Mouse CD34 + Stem Cells 10 7 cells / mouse) were intravenously injected into experimental mice with M6PR conjugated liposomes / MV and M6PR + P-sel conjugated liposomes / MV (2.5 × 10 9 MVs per mouse). Fluorescence levels were determined using an IVIS system (see FIG. 24).
チオアセトアミド（ＴＡＡ）肝炎のマウスモデルにおいて、マウスＣＤ３４＋幹細胞（１×１０７細胞／マウス）を、Ｍ６ＰＲ、Ｍ６ＰＲ＋Ｐ−セレクチン、Ｍ６ＰＲ＋Ｅ−セレクチン、および、Ｍ６ＰＲ＋ＰＳＧＬ−１とコンジュゲートされたリポソーム／ＭＶ（マウスあたり２．５×１０９個のＭＶ）とともに実験マウスに静脈内注入した。２４時間後において、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを分析した（図２５を参照のこと）。 In a mouse model of thioacetamide (TAA) hepatitis, mouse CD34 + stem cells (1 × 10 7 cells / mouse) were treated with M6PR, M6PR + P-selectin, M6PR + E-selectin, and liposomes / MV conjugated with M6PR + PSGL-1 Experimental mice were injected intravenously with 2.5 × 10 9 MVs per mouse). After 24 hours, plasma alanine aminotransferase (ALT) levels were analyzed (see FIG. 25).
実施例８ 本発明のタンパク質コンジュゲートリポソームによるガン細胞への抗ガン薬物または細胞抑制剤の標的化
マウスに、Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞（１＊１０６細胞／マウス）を鼠径部位に皮下注入した。３日目および８日目に、（ＭＶ（マイトマイシンＣ含有、０．２μｇ）およびＭＶ（２μｇ、シスプラチン含有）をマウスの眼窩静脈洞にそれぞれ注入した。マウスを１２日目に屠殺して、腫瘍を取り出した。腫瘍のサイズおよび重量を測定した（図２６Ａおよび図２６Ｂを参照のこと）。図２６に示されるように、ＭＶは抗ガン薬物を腫瘍に運搬し、また、抗ガン薬物を腫瘍の中に送達し、腫瘍成長の抑制または緩和、および、腫瘍サイズの縮小をもたらすことができる。
For targeting the mouse anticancer drugs or cell inhibitor to cancer cells by protein conjugate liposomes of Example 8 to the present invention it was subcutaneously injected B16-F10 melanoma cells (1 * 10 6 cells / mouse) in inguinal site. On days 3 and 8, (MV (containing mitomycin C, 0.2 μg) and MV (2 μg, containing cisplatin) were injected into the orbital sinus of the mouse, respectively. The size and weight of the tumor were measured (see FIGS. 26A and 26B), MV delivers the anti-cancer drug to the tumor, as shown in FIG. And may result in the suppression or alleviation of tumor growth and the reduction of tumor size.
上述の方法に従って、（ドキソルビシン含有）タンパク質コンジュゲート改変リポソームを、当該抗ガン薬物を運ぶキャリアとして使用した。図２７に示されるように、（ドキソルビシン含有）タンパク質コンジュゲート改変リポソームは腫瘍成長速度を抑制することができ（図２７Ａを参照のこと）、また、マウスの死亡率も低下させることができる（図２７Ｂ）。 According to the method described above, a (doxorubicin-containing) protein-conjugated modified liposome was used as a carrier for carrying the anticancer drug. As shown in FIG. 27, the protein conjugate modified liposome (containing doxorubicin) can suppress the tumor growth rate (see FIG. 27A) and can also reduce the mortality rate of mice (FIG. 27). 27B).
実施例９ 本発明のタンパク質コンジュゲートリポソームによる脂肪組織への薬物の標的化
高脂肪食を摂るマウスに、コントロールＩｇまたは抗脂肪抗体（７５μｇ／マウス）を０時間および４８時間において眼窩静脈洞にそれぞれ注入した。６時間、２４時間、５４時間および７２時間において、（ＭＶ（マイトマイシンＣ含有、０．２μｇ）およびＭＶ（シスプラチン含有、２μｇ）をマウスの眼窩静脈洞にそれぞれ注入した。マウスの重量を測定した。結果が図２８に示される。結果は、ＭＶ（マイトマイシンＣ含有、０．２μｇ）はマウスの重量増加率を低下させることができることを示す。
Example 9 Targeting Drugs to Adipose Tissue with the Protein-Conjugated Liposomes of the Invention For mice fed a high-fat diet, control Ig or anti-fatty antibody (75 μg / mouse) in the orbital sinus at 0 and 48 hours respectively Injected. At 6 hours, 24 hours, 54 hours and 72 hours, (MV (containing mitomycin C, 0.2 μg) and MV (containing cisplatin, 2 μg) were injected into the orbital sinus of the mouse, respectively. The results are shown in Figure 28. The results show that MV (containing mitomycin C, 0.2 μg) can reduce the rate of weight gain in mice.
上述の方法に従って、（ドキソルビシン含有）タンパク質コンジュゲート改変リポソームをアッセイにおいて使用した。図２９に示されるように、（ドキソルビシン含有）タンパク質コンジュゲート改変リポソームはマウスの重量増加率を低下させることができる（図２９Ａ）。加えて、抗脂肪抗体または（ドキソルビシン含有）リポソームは肝機能指標における増加を生じさせないであろう（図２９Ｂ）。 Protein conjugated modified liposomes (containing doxorubicin) were used in the assay according to the method described above. As shown in FIG. 29, (doxorubicin-containing) protein conjugate modified liposomes can reduce weight gain in mice (FIG. 29A). In addition, anti-fatty antibodies or liposomes (containing doxorubicin) will not cause an increase in liver function index (FIG. 29B).
実施例１０ 本発明のタンパク質抱合リポソームは、さらなる薬物／物質を搭載せずに、傷害組織に対するレスキューを媒介するだけである
血漿ＭＶは、血清ＭＶおよび細胞（Ｃ６／３６）由来ＭＶと比較して、Ｐ−セレクチンの相対的により高いレベルの表面Ｐ−セレクチンを発現する。フローサイトメトリーによって分析した（図３０を参照のこと）。
Example 10 The Protein-Conjugated Liposomes of the Invention Only Mediate Rescue to Injured Tissue Without Loading Additional Drugs / Substance Plasma MV Compared to Serum MV and Cell (C6 / 36) -Derived MV , Express relatively higher levels of surface P-selectin of P-selectin. Analyzed by flow cytometry (see Figure 30).
チオアセトアミド（ＴＡＡ）肝炎のマウスモデルにおいて、血漿ＭＶ、血清ＭＶおよび細胞（Ｃ６／３６）由来ＭＶ（マウスあたり２．５×１０９個のＭＶ）を実験マウスに静脈内注入した。２４時間後において、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを分析した（図３１を参照のこと）。 In a mouse model of thioacetamide (TAA) hepatitis, plasma MV, serum MV and cells (C6 / 36) derived MV (2.5 × 10 9 MVs per mouse) were injected intravenously into experimental mice. After 24 hours, plasma alanine aminotransferase (ALT) levels were analyzed (see Figure 31).
チオアセトアミド（ＴＡＡ）肝炎のマウスモデルにおいて、マウスＣＤ３４＋幹細胞（１×１０７細胞／マウス）を、血漿ＭＶ、血清ＭＶおよび細胞（Ｃ６／３６）由来ＭＶ（マウスあたり２．５×１０９個のＭＶ）を伴って実験マウスに静脈内注入した。２４時間後において、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを分析した（図３２を参照のこと）。 In a mouse model of thioacetamide (TAA) hepatitis, mouse CD34 + stem cells (1 × 10 7 cells / mouse), plasma MV, serum MV and cells (C6 / 36) derived MV (2.5 × 10 9 cells / mouse) The experimental mice were injected intravenously with MV). After 24 hours, plasma alanine aminotransferase (ALT) levels were analyzed (see Figure 32).
Claims (20)
Soluble forms, corresponding ligands, and antagonists of said first protein or of said second protein such as neutralizing and blocking antibodies, autophagy cells and / or apoptotic cells, and autophagy cells and / or apoptosis The vesicle of claim 1, which can serve as an antidote to reduce vesicle targeting to tissue containing cells.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2017251049A JP7253762B2 (en) | 2017-12-27 | 2017-12-27 | Drug delivery to autophagic and apoptotic cells by vesicles with surface-expressed proteins |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP2017251049A JP7253762B2 (en) | 2017-12-27 | 2017-12-27 | Drug delivery to autophagic and apoptotic cells by vesicles with surface-expressed proteins |
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