JP2019116429A - 抗ウイルス薬 - Google Patents
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Abstract
Description
以下の発明は以上の成果及び考察に基づく。
[1]ウイルス後期遺伝子の発現を阻害する化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有し、β−ヘルペスウイルス又はγ−ヘルペスウイルスを標的とした抗ウイルス薬。
[2]転写開始複合体(vPIC)の形成阻害を介してウイルス後期遺伝子の発現を阻害する、[1]に記載の抗ウイルス薬。
[3]有効成分が、サイクリン依存性キナーゼ2(CDK2)阻害剤又はその薬学的に許容される塩である、[1]又は[2]に記載の抗ウイルス薬。
[4]CDK2阻害剤が、Olomoucine、Alsterpaullone, 2-cyanoethyl、Cdk1/2 inhibitor III、Cdk2/9 inhibitor及びAlsterpaulloneからなる群より選択される化合物である、[3]に記載の抗ウイルス薬。
[5]β−ヘルペスウイルスがサイトメガロウイルス(CMV)、ヒトヘルペスウイルス6A(HHV-6A)、ヒトヘルペスウイルス6B(HHV-6B)又はヒトヘルペスウイルス7(HHV-7)であり、γ−ヘルペスウイルスがエプスタイン・バーウイルス(EBV)又はカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)である、[1]〜[4]のいずれか一項に記載の抗ウイルス薬。
[6]標的ウイルスのウイルス粒子の産生を抑制する、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の抗ウイルス薬。
[7]β−ヘルペスウイルス関連疾患又はγ−ヘルペスウイルス関連疾患の治療又は予防に用いられる、[1]〜[6]のいずれか一項に記載の抗ウイルス薬。
[8]β−ヘルペスウイルス関連疾患がCMV関連疾患であり、γ−ヘルペスウイルス関連疾患がEBV関連疾患である、[7]に記載の抗ウイルス薬。
[9]ウイルスゲノムの複製阻害によって薬効を発揮する抗ウイルス薬と併用される、[1]〜[8]のいずれか一項に記載の抗ウイルス薬。
[10]β−ヘルペスウイルス関連疾患又はγ−ヘルペスウイルス関連疾患の患者、或いはβ−ヘルペスウイルス関連疾患又はγ−ヘルペスウイルス関連疾患の高リスク者に対して、ウイルス後期遺伝子の発現を阻害する化合物又はその薬学的に許容される塩を治療上有効量投与するステップを含む、β−ヘルペスウイルス関連疾患又はγ−ヘルペスウイルス関連疾患の治療又は予防法。
Doxycyclinの添加によりウイルス産生感染を誘導できるEBV陽性細胞株(Tet-BZLF1/B95-8細胞)(Kudoh et al., J Virol, 2003, 77, 851-861)をDoxycyclinと小分子化合物(3μM)を含む培地で48時間ほど培養し、細胞からDNAおよびRNAを回収した。DNAとRNAをqPCRで解析(Watanabe et al., J Virol, 2015, 89, 10120-10124)し、ウイルス複製、E遺伝子の発現およびL遺伝子の発現を定量した。ウイルス複製とE遺伝子の発現がともに抑制されず、L遺伝子の発現のみ抑制する化合物を、ウイルス後期遺伝子を特異的に阻害する小分子として同定した。
続いて、スクリーニング結果を検証するため、他のEBV陽性細胞(293/EBV細胞)を用い、同定したキナーゼ阻害剤がウイルス後期遺伝子の発現とウイルス粒子産生に与える影響を調べた。
293/EBV細胞にBZLF1をトランスフェクションし、ウイルス産生感染を誘導した。トランスフェクション24時間後にCDK阻害剤(CDK2/9i(0.5μM)、A2CE(1μM))を添加し、さらに24時間培養し、細胞を回収した。細胞からRNAを抽出して、初期遺伝子(BALF5)の発現をリアルタイムPCRで定量した。CDK阻害剤処理で初期遺伝子の発現は変化しなかった(図3)。
293/EBV細胞にBZLF1をトランスフェクションし、ウイルス産生感染を誘導した。トランスフェクション24時間後にCDK阻害剤(CDK2/9i(0.5μM)、A2CE(1μM))を添加し、さらに24時間培養し、細胞を回収した。細胞からRNAを抽出して、後期遺伝子(gp350)の発現をリアルタイムPCRで定量した。CDK阻害剤処理で後期遺伝子の発現が抑制された(図4)。
293/EBV細胞にBZLF1をトランスフェクションし、ウイルス産生感染を誘導した。トランスフェクション24時間後にCDK阻害剤(CDK2/9i(0.5μM)、A2CE(1μM))を添加し、さらに24時間培養し、細胞を回収した。細胞からDNAを抽出して、ウイルスゲノム量をリアルタイムPCRで定量した。CDK阻害剤処理はウイルスゲノム複製に影響を及ぼさなかった(図5)。
293/EBV細胞にBZLF1をトランスフェクションし、ウイルス産生感染を誘導した。トランスフェクション24時間後にCDK阻害剤(CDK2/9i(0.5μM)、A2CE(1μM))を添加し、さらに24時間培養し、細胞を回収した。細胞からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロットにて各ウイルス遺伝子産物(タンパク質)を検出した。CDK阻害剤で処理すると、前初期遺伝子産物および初期遺伝子産物の発現は変化が見られないが、後期遺伝子産物の発現が特異的に抑制された(図6)。
293/EBV細胞にBZLF1をトランスフェクションし、ウイルス産生感染を誘導した。トランスフェクション24時間後にCDK阻害剤(CDK2/9i(0.5μM)、A2CE(1μM))を添加し、さらに24時間培養し、細胞と上清を回収した。回収した上清と細胞を凍結融解させ、その上澄みをウイルス液として使用した。EBV陰性B細胞株(Akata細胞)にウイルス液を加え、3時間ほど室温で転倒混和させ、培地交換し培養した(48時間、37℃、5% CO2)。感染48時間後に、FACSで感染細胞を測定し、感染力価(ウイルス力価)を算出した。CDK阻害剤処理でウイルス粒子産生が抑制された(図7)。
EBVでは6つのウイルス遺伝子産物により構成されるvPICがウイルス後期遺伝子のプロモーターに結合し、RNAポリメラーゼIIをリクルートすることでウイルス後期遺伝子は転写される(図8)。vPICはβ−ヘルペスウイルスとγ−ヘルペスウイルスで保存されている(図9)。同定した化合物(CDK阻害剤)によるウイルス産生阻害メカニズムを解明すべく、以下の検討を行った。
293細胞にFLAGタグをつけたBDLF4を発現させ、細胞を回収し、タンパク質を抽出した。脱リン酸化酵素(λ-フォスファターゼ)処理をし、phos-tag(登録商標)ゲル(和光純薬工業株式会社)および通常のSDS-PAGEゲルで電気泳動し、ウエスタンブロットで検出した。脱リン酸化処理によりBDLF4の移動度が上昇したため(図10)、BDLF4は細胞内でリン酸化されていることが分かった。
293細胞にFLAGタグをつけたBDLF4を発現させ、トランスフェクション後24時間でCDK2/9i(0.5μM)とMG132(10μM)を培地に添加し、24時間培養した。その後細胞を回収し、ウエスタンブロットにてBDLF4タンパク質を検出した。CDK阻害剤処理でBDLF4タンパク質は不安定化した(図11)。
293細胞にFLAGタグをつけたBDLF4発現ベクターとshRNA発現ベクター(shRNA expression plasmids against CDK1: shCDK1#1, TRCN0000583及びshCDK1#2, TRCN0196602、shRNA expression plasmids against CDK2: shCDK2#1, TRCN0039961及びshCDK2#2, TRCN0010470)(Sigma-Aldrich社)をコトランスフェクトし、トランスフェクション48時間後に細胞を回収した。ウエスタンブロットにて、各タンパク質の発現量を比較した。CDK2の発現抑制によってBDLF4タンパク質量が減少し(図12)、CDK2がBDLF4タンパク質の安定化に寄与していることが明らかとなった。
293細胞にFLAGタグをつけたBDLF4発現ベクターとshRNA発現ベクターをコトランスフェクトし、トランスフェクション24時間後にMG132(10μM)を添加し、トランスフェクション48時間後に細胞を回収した。ウエスタンブロットにて、各タンパク質の発現量を比較した。MG132により、CDK2の発現抑制によるBDLF4の不安定化が阻害された(図13)。CDK2によるBDLF4のリン酸化はBDLF4をユビキチン依存的な分解から守っていることが示唆された。
活性化型サイクリンA1/CDK2複合体、活性化型サイクリンE1/CDK2複合体、または活性化型サイクリンB1/CDK1複合体とGST-BDLF4を混合し、放射性同位体を使わない検出系(ATP-γ-S (ab138911) (abcam社)の取り込みと、p-Nitrobenzyl mesylate (ab138910) (abcam社)によるチオリン酸基のアルキル化を使用)でin vitroのリン酸化について解析した。CDK2複合体はin vitroでBDLF4タンパク質をリン酸化した(図14)。
同定したCDK阻害剤の生体でのウイルス阻害効果を検証した。実験には、重度免疫不全マウス(NOGマウス)に、EBVを感染させた臍帯血由来単核球を腹腔内に移植することでEBV感染B細胞がマウスの体内に腫瘍を形成し、マウスが死亡するというEBV関連腫瘍実験モデルを用いた。生理食塩水で希釈したAlsterpaullone(Alp)(コントロールにはDMSO)を5mg/kgの投与量、所定の投与スケジュール(図16)でマウスの腹腔内に投与した。
EBV感染臍帯血由来単核球の移植3週後にマウスから採血し、全血中に含まれるEBV量をリアルタイムPCRで定量した。CDK阻害剤(Alsterpaullone)の投与によりマウス末梢血中のEBV量が抑制された(図17)。
CDK阻害剤(Alsterpaullone)を投与したEBV感染マウス(6匹)と投与しないEBV感染マウス(6匹)の生存率をカプランマイヤー生存曲線で比較評価した。CDK阻害剤投与によりEBV腫瘍形成によるマウスの死亡が抑制された(図18)。
Claims (10)
- ウイルス後期遺伝子の発現を阻害する化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有し、β−ヘルペスウイルス又はγ−ヘルペスウイルスを標的とした抗ウイルス薬。
- 転写開始複合体(vPIC)の形成阻害を介してウイルス後期遺伝子の発現を阻害する、請求項1に記載の抗ウイルス薬。
- 有効成分が、サイクリン依存性キナーゼ2(CDK2)阻害剤又はその薬学的に許容される塩である、請求項1又は2に記載の抗ウイルス薬。
- CDK2阻害剤が、Olomoucine、Alsterpaullone, 2-cyanoethyl、Cdk1/2 inhibitor III、Cdk2/9 inhibitor及びAlsterpaulloneからなる群より選択される化合物である、請求項3に記載の抗ウイルス薬。
- β−ヘルペスウイルスがサイトメガロウイルス(CMV)、ヒトヘルペスウイルス6A(HHV-6A)、ヒトヘルペスウイルス6B(HHV-6B)又はヒトヘルペスウイルス7(HHV-7)であり、γ−ヘルペスウイルスがエプスタイン・バーウイルス(EBV)又はカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗ウイルス薬。
- 標的ウイルスのウイルス粒子の産生を抑制する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗ウイルス薬。
- β−ヘルペスウイルス関連疾患又はγ−ヘルペスウイルス関連疾患の治療又は予防に用いられる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗ウイルス薬。
- β−ヘルペスウイルス関連疾患がCMV関連疾患であり、γ−ヘルペスウイルス関連疾患がEBV関連疾患である、請求項7に記載の抗ウイルス薬。
- ウイルスゲノムの複製阻害によって薬効を発揮する抗ウイルス薬と併用される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗ウイルス薬。
- β−ヘルペスウイルス関連疾患又はγ−ヘルペスウイルス関連疾患の患者、或いはβ−ヘルペスウイルス関連疾患又はγ−ヘルペスウイルス関連疾患の高リスク者に対して、ウイルス後期遺伝子の発現を阻害する化合物又はその薬学的に許容される塩を治療上有効量投与するステップを含む、β−ヘルペスウイルス関連疾患又はγ−ヘルペスウイルス関連疾患の治療又は予防法。
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Citations (3)
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WO2000006170A1 (en) * | 1998-07-31 | 2000-02-10 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Inhibitors of herpesvirus gene expression, replication and pathogenesis |
JP2006174704A (ja) * | 2004-12-20 | 2006-07-06 | Japan Health Science Foundation | Ebウイルス核抗原−2に対するモノクローナル抗体 |
JP2017502013A (ja) * | 2013-12-20 | 2017-01-19 | バイオメッド バレー ディスカバリーズ,インコーポレイティド | Cdk阻害剤およびerk阻害剤の組み合わせを使用するがん処置 |
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