JP2019112338A

JP2019112338A - Mitochondrial disease therapeutic agent

Info

Publication number: JP2019112338A
Application number: JP2017246492A
Authority: JP
Inventors: 一仁富澤; Kazuhito Tomizawa; 范研魏; Hanken Gi
Original assignee: Kumamoto University NUC
Current assignee: Kumamoto University NUC
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2019-07-11

Abstract

To provide a mitochondrial disease therapeutic agent with a new action mechanism.SOLUTION: A pharmaceutical composition for the treatment and/or prevention of a hereditary mitochondrial disease contains, as an active ingredient, at least one compound selected from the group consisting of tauroursodeoxycholic acid (TUDC), phenylbutyrate (PBA), and a pharmaceutically acceptable salt thereof. The pharmaceutical composition is particularly useful for treating a mitochondrial disease caused by an abnormality in taurine modification of at least one mt-tRNA selected from the group consisting of mt-tRNA, mt-tRNA, mt-tRNA, mt-tRNA, and mt-tRNAor a mitochondrial disease caused by a mutation in Mot1 gene.SELECTED DRAWING: Figure 27

Description

本発明は、ミトコンドリア病の治療薬に関し、特には、遺伝子性変異に起因するミトコンドリア病に対する治療薬に関する。 The present invention relates to a therapeutic agent for mitochondrial disease, and in particular to a therapeutic agent for mitochondrial disease caused by genetic mutation.

ミトコンドリアは、真核生物細胞の細胞小器官の１つで、電子伝達系によるＡＴＰの生産を行っており、生体内で消費するエネルギーのほとんどは、ミトコンドリアから供給されている。ミトコンドリアは、それ以外に多様な機能に関与することが報告されており、例えば、細胞のアポトーシスにおいても重要な役割を果たしている。さらに最近、ミトコンドリアの異常と多数の疾患との関連が注目されるようになっている。 The mitochondrion is one of the organelles of eukaryotic cells, which is responsible for the production of ATP by the electron transfer system, and most of the energy consumed in vivo is supplied from the mitochondrion. Mitochondria have been reported to be involved in various functions other than that, and for example, play an important role also in cell apoptosis. More recently, the association between mitochondrial abnormalities and a number of diseases has come to the fore.

ミトコンドリア病は、ミトコンドリアの機能低下や障害に起因する疾患の総称である。ミトコンドリア病は、脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様症候群（ＭＥＬＡＳ）、赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群（ＭＥＲＲＦ）等のミトコンドリア脳筋症のように、ミトコンドリア遺伝子（ｍｔＤＮＡ）の遺伝的変異による先天性の疾患と考えられてきた。しかし最近では、環境因子や薬剤によるミトコンドリア機能障害や、神経変性疾患によるミトコンドリア異常等の後天的なミトコンドリア病も報告されている。 Mitochondrial disease is a generic term for diseases caused by mitochondrial dysfunction and disorders. Mitochondrial disease is congenital due to genetic mutation of mitochondrial gene (mtDNA) like mitochondrial encephalomyopathy such as encephalomyopathy, lactic acidosis, stroke-like syndrome (MELAS), red rag fiber and myoclonus epilepsy syndrome (MERRF) It has been considered a disease of However, recently, acquired mitochondrial diseases such as mitochondrial dysfunction due to environmental factors and drugs and mitochondrial abnormalities due to neurodegenerative diseases have also been reported.

哺乳動物のミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）は、２２個のミトコンドリアトランスファーＲＮＡ（ｍｔ−ｔＲＮＡ）をエンコードしており、これらのｍｔ−ｔＲＮＡは、１３種類のミトコンドリアタンパク質を翻訳している。これらのｍｔＤＮＡ由来のタンパク質は、素早く呼吸系複合体に取り込まれ、電子伝達に関与している。ｍｔＤＮＡは、好気性呼吸において必須の役割を果たしており、ｍｔＤＮＡにおける変異は、ミトコンドリア病を含む種々の代謝疾患と関連している。ｍｔ−ｔＲＮＡをエンコードするｍｔＤＮＡにおけるいくつかの点変異をもつ患者は、重篤なミトコンドリアの機能障害を呈し、これは多臓器不全を引き起こす。しかしながら、点変異がなぜこのような重篤な症状を引き起こすかは完全には明らかになっていない。 Mammalian mitochondrial DNA (mtDNA) encodes 22 mitochondrial transfer RNAs (mt-tRNAs), and these mt-tRNAs translate 13 types of mitochondrial proteins. These mtDNA-derived proteins are rapidly incorporated into the respiratory complex and are involved in electron transfer. mtDNA plays an essential role in aerobic respiration, and mutations in mtDNA are associated with various metabolic diseases including mitochondrial disease. Patients with some point mutations in mtDNA encoding mt-tRNA exhibit severe mitochondrial dysfunction, which causes multiple organ failure. However, it is not completely clear why point mutations cause such severe symptoms.

細胞質ｔＲＮＡと同様に、ｍｔ−ｔＲＮＡは、種々の化学的修飾を含んでいる。ウシのｍｔ−ｔＲＮＡでは、２２のｍｔ−ｔＲＮＡにおいて１１８箇所における１５種類の修飾が同定されている。全ての修飾は、核ＤＮＡによってエンコードされるｍｔ−ｔＲＮＡ修飾酵素によって仲介されている。例えば、ｍｔ−ｔＲＮＡ修飾酵素であるＭｔｕ１、Ｐｕｓ１、およびＴｒｉｔ１は、それぞれ、ｍｔ−ｔＲＮＡの、２位におけるチオール修飾、プソイドウリジン修飾、イソペンテニル修飾を仲介している。これらの酵素を欠失したトランスジェニックマウスは、ミトコンドリア翻訳の顕著な減少を示し、ミトコンドリアの機能障害を引き起こす。さらに、これらの遺伝子の変異が、ミトコンドリア機能障害を持つ患者で同定されている。 Like cytoplasmic tRNAs, mt-tRNA contains various chemical modifications. In bovine mt-tRNA, 15 modifications at 118 sites in 22 mt-tRNAs have been identified. All modifications are mediated by the mt-tRNA modification enzyme encoded by nuclear DNA. For example, the mt-tRNA modifying enzymes Mtu1, Pus1 and Trit1 respectively mediate thiol modification, pseudouridine modification, isopentenyl modification at position 2 of mt-tRNA. Transgenic mice lacking these enzymes show a marked decrease in mitochondrial translation and cause mitochondrial dysfunction. Furthermore, mutations of these genes have been identified in patients with mitochondrial dysfunction.

哺乳動物のミトコンドリアのｔＲＮＡ（ｍｔ−ｔＲＮＡｓ）には、タウリンに由来するユニークな修飾を持つものがある。タウリン修飾はこれらｍｔ−ｔＲＮAのアンチコドンの３４番のウラシル（Ｕ）に存在する。アンチコドンの最初のヌクレオチドである３４番目のウオッブルウラシルに位置するタウリン修飾は、５−タウリノメチルウリジン（τｍ⁵U）を含むｍｔ−ｔＲＮＡ^Leu(UUR)およびｍｔ−ｔＲＮＡ^Trp、５−タウリノメチル−２−チオウリジン（τｍ⁵ｓ²U）を含むｍｔ−ｔＲＮＡ^Lys、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Gluおよびｍｔ−ｔＲＮＡ^Glnが知られている。タウリン修飾は、コドン−アンチコド相互作用の安定化を通じて、ミトコンドリアの翻訳に関わっている。 Some mammalian mitochondrial tRNAs (mt-tRNAs) have unique modifications derived from taurine. Taurine modifications are present in the anticodon # 34 uracil (U) of these mt-tRNAs. The taurine modification located at the 34th wobble uracil, which is the first nucleotide of the anticodon, includes mt-tRNA ^{Leu (UUR)} and mt-tRNA ^Trp , 5-taulinomethyl-, including ^5- taulinomethyluridine (τm ⁵ U). Mt-tRNA ^Lys , mt-tRNA ^Glu and mt-tRNA ^Gln containing ² -thiouridine (τm ⁵ s ² U) are known. Taurine modifications are involved in mitochondrial translation through stabilization of codon-anticod interactions.

これらのｍｔ−ｔＲＮＡにおけるタウリン修飾の変異は、ＭＥＬＡＳやＭＥＲＦＦなどのミトコンドリア病と関連している。ＭＥＬＡＳ患者の約８０％で、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Leu(URR)においてＡ３２３４Ｇ変異を有しており、ほとんどのＭＥＲＲＦ患者で、ｍｔ−ｔＲＮＡ^LysにおいてＡ８３４４Ｇ変異を有していることが報告されている。このようにタウリン修飾の異常は、ミトコンドリア病の発症と関連していると報告されているが、その分子メカニズムは不明のままである。 Mutations of taurine modifications in these mt-tRNAs are associated with mitochondrial diseases such as MELAS and MERFF. About 80% of MELAS patients carry the A3234G mutation in mt-tRNA ^{Leu (URR)} and most MERRF patients are reported to carry the A8344G mutation in mt-tRNA ^Lys . Thus, although abnormalities in taurine modification are reported to be associated with the onset of mitochondrial diseases, their molecular mechanisms remain unknown.

また、ミトコンドリア病の患者で、mitochondrial optimization 1 （Ｍｔｏ１）およびGTP binding protein 3（ＧＴＰＢＰ３）の遺伝的変異が同定されており、これらの遺伝子がタウリン修飾に関わっていることが示唆されている。 In addition, genetic mutations of mitochondrial optimization 1 (Mto1) and GTP binding protein 3 (GTPBP3) have been identified in patients with mitochondrial disease, suggesting that these genes are involved in taurine modification.

そこで、いくつかのグループにより、Ｍｔｏ１のイントロン領域に遺伝子トラップコンストラクトを挿入し、Ｍｔｏ１欠損マウスを作製したことが報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。そこでは、ミトコンドリア翻訳は正常であり、高齢のＭｔｏ１欠損マウスにおいて、僅かな呼吸機能の欠陥が観察された、と報告されている。さらに、それらのＭｔｏ１欠損マウスでは、Ｍｔｏ１タンパク質が観察され、また、ｍｔ−ｔＲＮＡの修飾も特に変化がなかった、と報告されている。 Therefore, several groups have reported that a gene trap construct was inserted into the Mto1 intron region to produce a Mto1 deficient mouse (Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2). There, it is reported that mitochondrial translation was normal, and slight defects in respiratory function were observed in elderly Mto1-deficient mice. Furthermore, it is reported that Mto1 protein was observed in those Mto1 deficient mice, and that there was no particular change in mt-tRNA modification.

ミトコンドリア病の治療剤の開発は進められており、現在、α−トコトリエノールキノン、タウリン、ピルビン酸ナトリウム、L-アルギニン、５−ＡＬＡ／Ｆｅなどの化合物が、ミトコンドリア病の治療薬として臨床試験が行われている。しかしながら、現在日本国内で承認されたミトコンドリア病治療の医薬品はなく、早急な医薬品の開発が望まれている。 Development of therapeutic agents for mitochondrial diseases is underway, and compounds such as α-tocotrienol quinone, taurine, sodium pyruvate, L-arginine and 5-ALA / Fe are currently in clinical trials as therapeutic agents for mitochondrial diseases. It is However, there is currently no medicine approved for treatment of mitochondrial diseases in Japan, and rapid development of medicine is desired.

タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）は、ある種のタンパク質の熱凝集を阻害する化学シャペロンとして報告され（非特許文献３）、また、マウスにおいて、凝集物の蓄積を減少し、小胞体ストレス（ＵＰＲ）を抑制すると報告されている（非特許文献３、および非特許文献４）。また、ＴＧＦ−βシグナル阻害剤を含む角膜内皮の小胞体関連ストレスに関連する疾患の処置または予防剤において、それにさらに添加されるＥＲストレス治療剤としてＴＵＤＣの使用が提案されている（特許文献１）。 Tauroulesodeoxycholic acid (TUDC) has been reported as a chemical chaperone that inhibits the thermal aggregation of certain proteins (Non-patent Document 3), and also reduces aggregate accumulation in mice, endoplasmic reticulum stress (UPR) Is reported to suppress (non-patent documents 3 and 4). In addition, in the treatment or prevention of diseases associated with endoplasmic reticulum-related stress of the corneal endothelium, including TGF-β signal inhibitors, the use of TUDC as an agent for treating ER stress further added thereto has been proposed (Patent Document 1) ).

ＷＯ２０１５／０６４７６８WO 2015/064768

Tischnerら (2015) Hum Mol Genet. 24, 2247-2266.Tischner et al. (2015) Hum Mol Genet. 24, 2247-2266. Beckerら(2014) PLoS One.9,e114918.Becker et al. (2014) PLoS One. 9, e114918. Cortezら(2014) Prion. 8, 197-202.Cortez et al. (2014) Prion. 8, 197-202. Sigurdssonら、Cell Stem Cell.18, 522-532.Sigurdsson et al., Cell Stem Cell. 18, 522-532.

本発明の課題は、新たなミトコンドリア病の治療薬を提供することである。 An object of the present invention is to provide a novel therapeutic agent for mitochondrial diseases.

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けた結果、ミトコンドリアのｔＲＮＡのタウリン修飾がＭｔｏ１によって仲介されていることをつきとめ、Ｍto１の遺伝子異常が遺伝的原因によるミトコンドリア病の原因の一つであることをつきとめた。そして、Ｍto１の遺伝子異常のよって生じるタウリン修飾の異常が、ミトコンドリアにおける翻訳と呼吸の障害を引き起こし、更には、Ｏｐａ１を含む核ＤＮＡによってエンコードされるミトコンドリアタンパク質の異常な局在化を引き起こすためにミトコンドリアの形態異常を引き起こすことをつきとめた。さらには、そのような異常な局在化を示したミトコンドリアタンパク質が細胞質内でミスフォールディングを引き起こして凝集し、細胞障害性の小胞体ストレス（ＵＰＲ）を誘導することもつきとめた。
そこで本発明者らは、引き起こされたミトコンドリアタンパク質の異常な局在化を緩和または修復することによりミトコンドリア病の治療が行えると考え、異常な局在化を緩和または修復する物質を鋭意探索した。その結果、本発明者らは、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）などの化学シャペロンが、遺伝子異常に起因して生じたミトコンドリア異常を修復できること見いだし本発明を完成した。 As a result of continuous research to solve the above-mentioned problems, the present inventors found that taurine modification of mitochondrial tRNA is mediated by Mto1, and genetic abnormality of Mto1 is a cause of mitochondrial disease caused by genetic cause. I found out that I was one. And, the abnormality of taurine modification caused by the genetic abnormality of Mto1 causes the impairment of translation and respiration in mitochondria, and furthermore, the mitochondria because it causes the abnormal localization of mitochondrial proteins encoded by nuclear DNA containing Opa1. Was found to cause morphological abnormalities. Furthermore, it was also found that mitochondrial proteins that showed such abnormal localization cause misfolding and aggregate in the cytoplasm and induce cytotoxic endoplasmic reticulum stress (UPR).
Therefore, the present inventors considered that mitochondrial diseases can be treated by alleviating or repairing the aberrant localization of mitochondrial proteins that have been caused, and have intensively searched for substances that alleviate or repair the aberrant localization. As a result, the present inventors have found that chemical chaperones such as tauroursodeoxycholic acid (TUDC) can repair mitochondrial abnormalities caused by genetic abnormalities, and completed the present invention.

本発明は以下の態様を含むものである。
［１］タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）、フェニル酪酸（ＰＢＡ）、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を有効成分として含有する遺伝性ミトコンドリア病の治療および／または予防のための医薬組成物。
［２］タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）またはそれの薬学的に許容される塩を有効成分として含有する上記［１］に記載の医薬組成物。
［３］前記遺伝性ミトコンドリア病が、ミトコンドリアｔＲＮＡ（ｍｔ−ｔＲＮＡ）のタウリン修飾の異常に起因するミトコンドリア病である上記［１］または［２］に記載の医薬組成物。
［４］前記ｍｔ−ｔＲＮＡのタウリン修飾の異常が、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Leu(UUR)、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Trp、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Lys、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Glu、およびｍｔ−ｔＲＮＡ^Glnからなる群より選ばれる少なくとも一つのｍｔ−ｔＲＮＡのタウリン修飾の異常である上記［３］に記載の医薬組成物。
［５］前記ミトコンドリア病が、Ｍto１遺伝子の変異に起因するミトコンドリア病である上記［１］または［２］に記載の医薬組成物。
［６］タウリン修飾の異常に起因するミトコンドリア病に罹患した患者に投与されることを特徴とする上記［１］または［２］に記載の医薬組成物。
［７］Ｍto１遺伝子の変異に起因するミトコンドリア病に罹患した患者に投与されることを特徴とする上記［１］または［２］に記載の医薬組成物。
［８］他のミトコンドリア病治療薬と併用して投与されることを特徴とする上記［１］〜［７］のいずれか一つに記載の医薬組成物。 The present invention includes the following aspects.
[1] Treatment of hereditary mitochondrial disease containing at least one compound selected from the group consisting of tauroursodeoxycholic acid (TUDC), phenylbutyric acid (PBA), and their pharmaceutically acceptable salts as an active ingredient And / or a pharmaceutical composition for the prevention.
[2] The pharmaceutical composition according to the above [1], which comprises tauroursodeoxycholic acid (TUDC) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
[3] The pharmaceutical composition according to the above [1] or [2], wherein the hereditary mitochondrial disease is a mitochondrial disease caused by an abnormality in taurine modification of mitochondrial tRNA (mt-tRNA).
[4] At least one selected from the group consisting of mt-tRNA ^{Leu (UUR)} , mt-tRNA ^Trp , mt-tRNA ^Lys , mt-tRNA ^Glu , and mt-tRNA ^Gln , wherein the abnormality in taurine modification of mt-tRNA is selected. Pharmaceutical composition as described in said [3] which is the abnormality of the taurine modification of four mt-tRNA.
[5] The pharmaceutical composition according to [1] or [2] above, wherein the mitochondrial disease is a mitochondrial disease caused by a mutation of the Mto1 gene.
[6] The pharmaceutical composition of the above-mentioned [1] or [2], which is administered to a patient suffering from a mitochondrial disease caused by an abnormality in taurine modification.
[7] The pharmaceutical composition of the above-mentioned [1] or [2], which is administered to a patient suffering from a mitochondrial disease caused by a mutation of the Mto1 gene.
[8] The pharmaceutical composition according to any one of the above [1] to [7], which is administered in combination with another therapeutic agent for mitochondrial disease.

［９］以下の工程からなるミトコンドリア病に罹患した患者を治療する方法、
（ａ）ミトコンドリア病に罹患した患者が、ｍｔ−ｔＲＮＡのタウリン修飾の異常を有することを検出する工程、および
（ｂ）工程（ａ）により、前記タウリン修飾の異常を有すると判定された患者に、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）、フェニル酪酸（ＰＢＡ）、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を、治療有効量の投与する工程。
［１０］前記ｍｔ−ｔＲＮＡのタウリン修飾の異常が、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Leu(UUR)、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Trp、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Lys、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Glu、およびｍｔ−ｔＲＮＡ^Glnからなる群より選ばれる少なくとも一つのｍｔ−ｔＲＮＡのタウリン修飾の異常である上記［９］に記載の方法。
［１１］前記工程（ａ）における検出が、患者から単離・精製したｍｔ−ｔＲＮＡ^Leu(UUR)、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Trp、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Lys、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Glu、またはｍｔ−ｔＲＮＡ^Glnを質量分析法により検出することを含む上記［１０］に記載の方法。
［１２］前記工程（ａ）における検出が、患者から単離・精製したＲＮＡを用いて、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Leu(UUR)、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Trp、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Lys、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Glu、またはｍｔ−ｔＲＮＡ^Glnの３４番目のウラシルのタウリン修飾を検出する方法であって、
以下の２つの工程：
A1．第１プライマーを用いて、該ＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを生成する工程、ここで、該第１プライマーは、該ＲＮＡ上のタウリン修飾を有する部位を含む領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである、
A2．第２プライマーを用いて、該ＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを生成する工程、ここで、該第２プライマーは、該ＲＮＡ上のタウリン修飾を有する部位より５’側の領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである、
をそれぞれ行い、それぞれの工程から生成されたｃＤＮＡ量の差を測定することにより該タウリン修飾を検出する方法、を含む工程である、上記［１０］に記載の方法。
［１３］以下の工程からなるミトコンドリア病に罹患した患者を治療する方法、
（ａ）ミトコンドリア病に罹患した患者が、Ｍto１遺伝子の変異を有することを検出する工程、および
（ｂ）工程（ａ）により、前記変異を有すると判定された患者に、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）、フェニル酪酸（ＰＢＡ）、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を、治療有効量の投与する工程。
［１４］前記工程（ａ）における検出が、患者から単離したＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によりＭto１変異を検出することを含む上記［１０］に記載の方法。 [9] A method of treating a patient suffering from a mitochondrial disease, comprising the following steps:
(A) detecting that a patient suffering from a mitochondrial disease has an abnormality in taurine modification of mt-tRNA, and (b) in a patient determined to have the abnormality in the taurine modification according to step (a) Administering a therapeutically effective amount of at least one compound selected from the group consisting of: tauroursodeoxycholic acid (TUDC), phenylbutyric acid (PBA), and pharmaceutically acceptable salts thereof.
[10] At least one selected from the group consisting of mt-tRNA ^{Leu (UUR)} , mt-tRNA ^Trp , mt-tRNA ^Lys , mt-tRNA ^Glu , and mt-tRNA ^Gln , wherein the abnormality in taurine modification of the mt-tRNA is selected. The method according to the above-mentioned [9], which is an abnormality in taurine modification of two mt-tRNAs.
[11] The mass spectrometry of mt-tRNA ^{Leu (UUR)} , mt-tRNA ^Trp , mt-tRNA ^Lys , mt-tRNA ^Glu or mt-tRNA ^Gln isolated and purified from the patient in the step (a). The method according to the above [10], which comprises detecting by a method.
[12] The detection in the step (a) may be carried out using mt-tRNA ^{Leu (UUR)} , mt-tRNA ^Trp , mt-tRNA ^Lys , mt-tRNA ^Glu or mt-tRNA using RNA isolated and purified from the patient. A method for detecting taurine modification of uracil at position 34 of tRNA ^Gln , comprising:
The following two steps:
A1. Generating cDNA from said RNA by reverse transcription using a first primer, wherein said first primer is designed to complementarily bind to a region including a site having a taurine modification on said RNA Are oligonucleotides,
A2. Generating a cDNA from said RNA by reverse transcription using a second primer, wherein the second primer is complementary to a region 5 'to the site having a taurine modification on the RNA Is an oligonucleotide designed to
A method of detecting the taurine modification by measuring the difference in the amount of cDNA generated from each step.
[13] A method of treating a patient suffering from a mitochondrial disease, comprising the following steps:
(A) detecting that a patient suffering from a mitochondrial disease has a mutation in the Mto1 gene, and (b) in a patient determined as having the mutation by step (a), Administering a therapeutically effective amount of at least one compound selected from the group consisting of: TUDC), phenylbutyric acid (PBA), and pharmaceutically acceptable salts thereof.
[14] The method according to [10] above, wherein the detection in the step (a) comprises detecting Mto1 mutation by RT-PCR using RNA isolated from a patient.

本発明により、新たなミトコンドリア病の治療薬が提供される。 The present invention provides a novel therapeutic agent for mitochondrial diseases.

Ｍｔｏ１ノックアウトマウス作成の概要を示す。The outline of Mto1 knockout mouse creation is shown. 野生型およびＭｔｏ１ノックアウトマウスの交配後の胚（Ｅ８〜Ｅ９）の形態を観察した結果である。Ａは、ＰＥＣＡＭ−１抗体およびエオシンで染色した結果である。矢印は、心臓の心室である。バーは、０．５ｍｍ（上図）および０．２ｍｍ（下図）を示す。Ｂは、Ｅ８．０およびＥ９．０における形態を示している。バーは、０．５ｍｍ。It is the result of observing the form of embryos (E8 to E9) after mating of wild type and Mto1 knockout mice. A is the result of staining with PECAM-1 antibody and eosin. Arrows are the ventricles of the heart. The bars show 0.5 mm (upper) and 0.2 mm (lower). B shows the morphology at E8.0 and E9.0. Bar is 0.5 mm. 野生型およびＭｔｏ１ノックアウトＥＳ細胞から抽出した全ＲＮＡにおけるタウリン修飾の有無の結果を示している。ウラシル（Ｕ）、５−タウリノメチルウリジン（τｍ⁵Ｕ）および５−タウリノメチル−２−チオウリジン（τｍ⁵ｓ²Ｕ）のマスクロマトグラムの結果を示している。The results for the presence or absence of taurine modification in total RNA extracted from wild type and Mto1 knockout ES cells are shown. The result of the mass chromatogram of uracil (U), 5-taurinomethyluridine (τm ⁵ U) and 5-taurinomethyl-2-thiouridine (τm ⁵ s ² U) is shown. 野生型およびＭｔｏ１ノックアウトＥＳ細胞から抽出した全ＲＮＡから精製したｍｔ−ｔＲＮＡ^Trpのフラグメントにおけるタウリン修飾の有無を確認したマスクロマトグラムの結果である。矢印は、τｍ⁵Ｕの有無が異なる対応するフラグメントのピークを示している。It is the result of the mass chromatogram which confirmed the presence or absence of the taurine modification in the fragment of mt-tRNA ^Trp purified from the total RNA extracted from wild type and Mto1 knockout ES cells. The arrows indicate the peaks of the corresponding fragments which differ in the presence or absence of τm ⁵ U. マウスのｍｔ−ｔＲＮＡ^Trpの２次構造および３４番目のウラシルにおけるタウリン修飾を示した図である。FIG. 2 shows the secondary structure of mouse mt-tRNA ^Trp and taurine modification at uracil 34. 野生型およびＭｔｏ１ノックアウトＥＳ細胞におけるミトコンドリアの代謝標識の結果を示した図である。FIG. 5 shows the results of mitochondrial metabolic labeling in wild type and Mto1 knockout ES cells. Ｍｔｏ１ノックアウトのＥＳ細胞および胚（Ｅ９．０）のミトコンドリアを電子顕微鏡で観察した結果である。矢印は、広がったクリステを示す。バーは、１μｍ。It is the result of observing the mitochondria of Mto1 knockout ES cells and embryos (E9.0) with an electron microscope. Arrows indicate expanded cristae. The bar is 1 μm. 野生型およびＭｔｏ１ノックアウトＥＳ細胞（Ｅ９．０）におけるＯｐａ１の発現をblue-native PAGEを用いて確認した結果を示す。The result of having confirmed the expression of Opa1 in wild type and Mto1 knockout ES cell (E9.0) using blue-native PAGE is shown. 野生型およびＭｔｏ１ノックアウトＥＳ細胞における、ミトコンドリアの外膜および内膜に局在するタンパク質のレベルを確認した結果である。外膜タンパク質としてＴｏｍｍ２０、Ｔｏｍｍ４０、Ｄｒｐ１、およびＭｆｎ２を、内膜タンパク質としてＭｉｔｏｆｉｌｉｎ、Ｏｐａ１、Ｔｉｍｍ４４、Ｔｉｍｍ５０のタンパク質レベルを確認した結果である。It is the result of having confirmed the level of the protein localized to the outer membrane and inner membrane of mitochondria in wild type and Mto1 knockout ES cells. It is the result of confirming the protein level of Tomm20, Tomm40, Drp1, and Mfn2 as outer membrane proteins and Mitofilin, Opa1, Timm44, and Timm50 as inner membrane proteins. 細胞内におけるタンパク質の凝集を確認した結果である。バーは１０μｍを示す。This is the result of confirmation of protein aggregation in cells. The bar represents 10 μm. 野生型およびＭｔｏ１ノックアウトＥＳ細胞における編集型および非編集型Ｘｂｐ１、およびＣｈｏｐの発現レベルを確認した結果である。それぞれｎ＝３。***は、ＷＴに対して、P<0.0001を示す。It is the result of confirming the expression level of edited and non-edited Xbp1 and Chop in wild type and Mto1 knockout ES cells. Each n = 3. *** indicates P <0.0001 for WT. 野生型およびＭｔｏ１ノックアウトＥＳ細胞の小胞体構造を透過電子顕微鏡で確認した結果である。矢印は、拡大した小胞体を示す。バーは１μｍを示すIt is the result of having confirmed the endoplasmic reticulum structure of wild type and Mto1 knockout ES cell by a transmission electron microscope. Arrows indicate enlarged vesicles. Bar shows 1 μm 新生のＦｌｏｘマウスおよび心臓特異的コンディショナルＭｔｏ１ノックアウトマウス（ＨｃＫＯ）の心臓の、ミトコンドリアおよび小胞体構造を透過電子顕微鏡で確認した結果である。バーは１μｍを示す。矢印はＥＲ構造を示す。矢先は、凝集様構造を示す。It is the result of having confirmed the mitochondrial and endoplasmic reticulum structure of the heart of a newborn Flox mouse and a cardiac specific conditional Mto1 knockout mouse (HcKO) with a transmission electron microscope. The bar indicates 1 μm. Arrows indicate ER structures. Arrowheads indicate aggregation-like structures. 新生マウスの心臓からのミトコンドリアにおけるＯｐａ１およびＴｉｍｍ４４の発現をウエスタンブロットにより確認した結果である。It is the result of confirming the expression of Opa1 and Timm44 in mitochondria from the heart of newborn mice by western blot. 新生のＦｌｏｘマウスおよび心臓特異的コンディショナルＭｔｏ１ノックアウトマウス（ＨｃＫＯ）の心臓における挿入および非挿入Xbp1、およびＣｈｏｐの発現レベルを確認した結果である。Ｆｌｏｘ：ｎ＝３、ＨｃＫＯ：ｎ＝６。Ｆｌｏｘに対し、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。It is the result of confirming the expression level of inserted and non-inserted Xbp1 and Chop in the hearts of newborn Flox mice and cardiac specific conditional Mto1 knockout mice (HcKO). Flox: n = 3, HcKO: n = 6. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001 for Flox. 呼吸系サブユニットに関連するミトコンドリアタンパク質（ＭＴＣＯＩおよびＮｄｕｆｂ８）および内膜タンパク質（Ｏｐａ１およびＴｉｍｍ４４）の発現をウエスタンブロットにより確認した結果である。It is the result of confirming the expression of mitochondrial proteins (MTCOI and Ndufb8) and inner membrane proteins (Opa1 and Timm44) related to respiratory system subunits by Western blot. Ｆｌｏｘマウスおよび肝臓特異的コンディショナルＭｔｏ１ノックアウトマウス（ＬｃＫＯ）の肝臓のミトコンドリアを透過電子顕微鏡で確認した結果である。バーは１μｍを示す。矢印はクリスタの凝集様構造を示す。It is the result of confirming the mitochondria of the liver of Flox mouse and liver specific conditional Mto1 knockout mouse (LcKO) with a transmission electron microscope. The bar indicates 1 μm. Arrows indicate aggregation-like structures of the crystal. ＴＵＤＣで処理した野生型およびＭｔｏ１ノックアウトＥＳ細胞におけるタンパク質ミスフォールディングによる凝集を検出した結果である。バーは１０μｍを示す。It is a result of detecting aggregation by protein misfolding in wild type and Mto1 knockout ES cells treated with TUDC. The bar represents 10 μm. 細胞の可溶性および不溶性分画中のＯｐａ１をウエスタンブロットにより解析した結果である。The results of Western blot analysis of Opa1 in the soluble and insoluble fractions of cells. ＴＵＤＣで処理した細胞のミトコンドリアを透過電子顕微鏡で確認した結果である。バーは１μｍを示す。It is the result of having confirmed the mitochondria of the cell processed by TUDC with the transmission electron microscope. The bar indicates 1 μm. ＴＵＤＣ処理した細胞の全細胞溶解物中のＣｈｏｐ遺伝子発現を解析した結果である。*P<0.05。It is the result of analyzing Chop gene expression in whole cell lysates of TUDC-treated cells. * P <0.05. ＴＵＤＣ処理した細胞の小胞体構造を透過電子顕微鏡で確認した結果である。バーは１μｍを示す。矢印はＥＲ構造を示す。ＫＯ細胞における拡大したＥＲがＴＵＤＣ処理で回復しているのが確認できる。It is the result of having confirmed the endoplasmic reticulum structure of the cell processed with TUDC by the transmission electron microscope. The bar indicates 1 μm. Arrows indicate ER structures. It can be confirmed that the expanded ER in KO cells is restored by TUDC treatment. ＥＲからのカルシウムの漏出を測定した結果である。カルシウムの漏出は、Ｆｌｕｏ−４を用い、Ｆｌｕｏ−４を含むタイロード液中で３０分処理した後、培地をカルシウム不含のタイロード液に換え、タルプシガルギンで刺激してＥＲからのカルシウム放出を共焦点顕微鏡にて確認した。It is the result of measuring the leakage of calcium from ER. Calcium leakage was treated with Fluo-4 for 30 minutes in Tyrode's solution containing Fluo-4, then medium was changed to calcium-free Tyrode's solution and stimulated with Tarpsigargin to release calcium from ER It confirmed by the confocal microscope. ＴＵＤＣ処理における細胞増殖の影響を確認した結果である。***P<0.001。It is the result of having confirmed the influence of cell proliferation in TUDC treatment. *** P <0.001. ２５Ａは、ＰＢＡで処理した野生型およびＭｔｏ１ノックアウトＥＳ細胞におけるタンパク質ミスフォールディングによる凝集を検出した結果である。バーは５０μｍを示す。２５Ｂは、ＰＢＡで処理した細胞の全細胞溶解物中のＣｈｏｐ遺伝子発現を解析した結果である。*P<0.001。２５Ｃは、ＰＢＡ処理における細胞増殖の影響を確認した結果である。***P<0.001。25A is the result of detecting aggregation due to protein misfolding in PBA-treated wild type and Mto1 knockout ES cells. The bar represents 50 μm. 25B shows the results of analysis of Chop gene expression in whole cell lysates of PBA-treated cells. * P <0.001 25 C is the result of confirming the influence of cell proliferation in PBA treatment. *** P <0.001. ＴＵＤＣを１週間投与したＦｌｏｘおよびＬｃＫＯマウスから精製したミトコンドリア分画中のＯＰａ１をウエスタンブロットにより解析した結果である。The results of Western blot analysis of OPa1 in mitochondrial fractions purified from Flox and Lc KO mice to which TUDC was administered for 1 week. ＴＵＤＣを投与したＦｌｏｘおよびＬｃＫＯマウスのミトコンドリアを透過電子顕微鏡で確認した結果である。バーは１μｍを示す。It is the result of having confirmed the mitochondria of the Flox and Lc KO mouse which administered TUDC with the transmission electron microscope. The bar indicates 1 μm. 異常なクリステ凝集をもつミトコンドリアの割合を、透過電子顕微鏡を用いて測定した結果である。***P<0.001。It is the result of measuring the ratio of mitochondria having abnormal cristae aggregation using a transmission electron microscope. *** P <0.001. ＦｌｏｘおよびＬｃＫＯマウスの肝臓から得た細胞中の集合した呼吸系複合体のblue-native PAGEの結果である。複合体ＩＩＩおよびＩＶは、それぞれ、抗ＵＱＣＲ−２およびＭＴＣＯＩ抗体を用いて免疫検出した。FIG. 7 shows the results of blue-native PAGE of assembled respiratory complexes in cells obtained from livers of Flox and Lc KO mice. Complexes III and IV were immunodetected using anti-UQCR-2 and MTCOI antibodies, respectively. ＴＵＤＣ投与したＦｌｏｘおよびＬｃＫＯマウスの肝臓中の複合体ＩＶの相対活性を示した図である。***P<0.001。FIG. 10 shows relative activity of complex IV in livers of FDC- and Lc-KO mice treated with TUDC. *** P <0.001. ＴＵＤＣ投与したＦｌｏｘおよびＬｃＫＯマウスの肝臓中のＣｈｏｐの相対的遺伝子発現レベルおよびタンパク質レベルを測定した結果である。***P<0.05。It is the result of measuring the relative gene expression level and protein level of Chop in the liver of Flox and Lc KO mice which were subjected to TUDC administration. *** P <0.05. ＴＵＤＣ投与したＦｌｏｘおよびＬｃＫＯマウスの肝臓中のＦｇｆ２１の相対的遺伝子発現レベルを測定した結果である。***P<0.0001。It is the result of measuring the relative gene expression level of Fgf21 in the liver of Flox and Lc KO mice administered with TUDC. *** P <0.0001. ＢＩＸ、ＴＭＡＮＯ、またはＴＵＤＣで処理した野生型およびＭｔｏ１ノックアウトＥＳ細胞におけるＣｈｏｐの発現レベルを確認した結果である。Ｃｈｏｐ発現量は、各細胞中の１８Ｓの発現量に対する相対値で示してある。*P<0.005、**P<0.001、N.S.=Not Significant。It is the result of confirming the expression level of Chop in wild type and Mto1 knockout ES cells treated with BIX, TMANO or TUDC. The expression level of Chop is shown as a relative value to the expression level of 18S in each cell. * P <0.005, ** P <0.001, NS = Not Significant.

以下、本発明を、例示的な実施態様を例として、本発明の実施において使用することができる好ましい方法および材料とともに説明する。
なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等または同様の任意の材料および方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。
また、本明細書に記載された発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書の一部を構成するものである。 The invention will now be described by way of illustrative embodiments and with preferred methods and materials that can be used in the practice of the invention.
Unless defined otherwise in the text, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Also, any materials and methods equivalent or similar to those described herein can be used as well in the practice of the present invention.
Also, all publications and patents cited herein in connection with the invention described herein are, for example, as indicative of methods, materials and the like that can be used in the present invention. It constitutes a part.

本明細書中で、「Ｘ〜Ｙ」という表現を用いた場合は、下限としてＸを、上限としてＹを含む意味で用いる。本明細書において「約」とは、±１０％を許容する意味で用いる。 In the present specification, when the expression “X to Y” is used, X is used as the lower limit and Y is used as the upper limit. As used herein, "about" is used in a sense that allows for ± 10%.

本発明の医薬組成物が対象とするミトコンドリア病は、遺伝性のミトコンドリア病である。本明細書において遺伝性ミトコンドリア病とは、ミトコンドリア病の原因が核DNAあるいはミトコンドリアDNA上の遺伝子の変異の結果として生じるミトコンドリア病を意味し、これに限定されないが、赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）；ミトコンドリアミオパシー・脳症・ラクトアシドーシス・脳卒中（ＭＥＬＡＳ）；レーバー遺伝性視神経障害（ＬＨＯＮ）；優性視神経萎縮（ＤＯＡ）；リー症侯群；カーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ）；フリードライヒ運動失調（ＦＲＤＡ）；慢性進行性外眼筋麻痺症（ＣＰＥＯ）などをあげあることができる。本発明の医薬組成物が対象とするミトコンドリア病は、特に好ましくは、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Leu(UUR)、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Trp、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Lys、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Glu、およびｍｔ−ｔＲＮＡ^Glnからなる群より選ばれる少なくとも一つのｍｔ−ｔＲＮＡのタウリンの修飾の異常に起因するミトコンドリア病、または、Ｍto１遺伝子の変異に起因するミトコンドリア病である。 The mitochondrial diseases targeted by the pharmaceutical composition of the present invention are hereditary mitochondrial diseases. As used herein, hereditary mitochondrial disease means mitochondrial disease caused by mitochondrial disease as a result of mutation of a gene on nuclear DNA or mitochondrial DNA, including, but not limited to, myoclonic epilepsy with red rags ( MERRF) Mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactoacidosis, stroke (MELAS); Lever hereditary optic neuropathy (LHON); dominant optic atrophy (DOA); Leigh syndrome group; FRDA); chronic progressive extraocular ophthalmoplegia (CPEO) etc. can be mentioned. The mitochondrial disease targeted by the pharmaceutical composition of the present invention is particularly preferably selected from the group consisting of mt-tRNA ^{Leu (UUR)} , mt-tRNA ^Trp , mt-tRNA ^Lys , mt-tRNA ^Glu and mt-tRNA ^Gln It is a mitochondrial disease caused by an abnormality in the modification of taurine of at least one mt-tRNA selected, or a mitochondrial disease caused by a mutation of the Mto1 gene.

本発明の医薬組成物に用いる、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）、フェニル酪酸（ＰＢＡ）は、購入することができ、また、低分子の化合物合成の技術分野において用いられている公知の方法を参照して合成することができる。また、それらの塩も、当該技術分野における公知の方法を参照して合成または調製することができる。 Tauroulesodeoxycholic acid (TUDC) and phenylbutyric acid (PBA), which are used in the pharmaceutical composition of the present invention, can be purchased, and known methods used in the art of synthesis of low molecular weight compounds can be used. It can be synthesized by reference. Also, their salts can be synthesized or prepared with reference to methods known in the art.

本発明よって提供される医薬組成物は、治療有効量の、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）、フェニル酪酸（ＰＢＡ）、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物（以下、単に「本発明に用いる化合物」という場合がある）を有効成分として含有する遺伝性ミトコンドリア病の治療または予防のための医薬組成物である。
「薬学的に許容されるその塩」とは、上記化合物から形成される非毒性の塩を示す。適切な塩としては、例えば、これに限定しないが、アンモニウム塩などの無機塩、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、メチルアミン、エチルアミン、シクロヘキシルアミンなどの低級アルキルアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンなどの置換低級アルキルアミンなどの有機塩基との塩、などをあげることができる。 The pharmaceutical composition provided by the present invention comprises at least one selected from the group consisting of a therapeutically effective amount of tauroursodeoxycholic acid (TUDC), phenylbutyric acid (PBA), and pharmaceutically acceptable salts thereof. It is a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of hereditary mitochondrial diseases, which comprises a compound (hereinafter sometimes simply referred to as "the compound used in the present invention") as an active ingredient.
"Pharmaceutically acceptable salt thereof" refers to non-toxic salts formed from the above compounds. Suitable salts include, for example and without limitation, inorganic salts such as ammonium salts, alkali metal salts such as sodium salts, potassium salts, alkaline earth metal salts such as calcium salts, magnesium salts, methylamine, ethylamine, Examples thereof include lower alkylamines such as cyclohexylamine and salts with organic bases such as diethanolamine and substituted lower alkylamines such as triethanolamine.

本発明はまた、本発明に用いる化合物から形成される溶媒和物及び水和物を含む医薬組成物を包含する。「溶媒和物」という用語は、１種以上の溶媒分子と上記の化合物（その薬学的に許容される塩を含む）の分子複合体を指す。例えば、これに限定されないが、水、エタノールなどである。「水和物」という用語は、溶媒分子が水である複合体を指す。本発明で用いる化合物は、その塩、水和物および溶媒和物を含む。例えば、タウロウルソデオキシコール酸については、その二水和物をあげることができる The present invention also encompasses pharmaceutical compositions comprising solvates and hydrates formed from the compounds used in the present invention. The term "solvate" refers to a molecular complex of one or more solvent molecules and a compound described above (including its pharmaceutically acceptable salts). For example, but not limited to, water, ethanol and the like. The term "hydrate" refers to the complex where the solvent molecule is water. The compounds used in the present invention include salts, hydrates and solvates thereof. For example, for tauroursodeoxycholic acid, its dihydrate can be mentioned

本発明の医薬組成物は、本発明に用いる化合物に加え、１以上の薬学的に許容される担体、及び、適宜、他のミトコンドリア病の治療薬を含むことができる。 The pharmaceutical composition of the present invention may contain, in addition to the compounds used in the present invention, one or more pharmaceutically acceptable carriers and, optionally, other therapeutic agents for mitochondrial diseases.

本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、当業者に知られているように、任意およびすべての、溶媒、分散媒体、コーティング剤、酸化防止剤、キレート剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、界面活性剤、緩衝剤、浸透圧調節剤、吸収遅延剤、塩、薬物安定剤、賦形剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、甘味剤、芳香剤、潤沢剤、染料など、及びそれらの組合せを含む。何れかの担体が本発明の活性成分と不適合である場合以外は、本発明の治療または医薬組成物において使用することができる。 As used herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier" refers to any and all solvents, dispersion media, coatings, antioxidants, chelating agents, as known to the person skilled in the art. Preservatives (eg, antibacterial agents, antifungal agents), surfactants, buffers, osmotic regulators, absorption delaying agents, salts, drug stabilizers, excipients, diluents, binders, disintegrants, sweeteners , Fragrances, lubricants, dyes and the like, and combinations thereof. Except when any carrier is incompatible with the active ingredient of the present invention, it can be used in the therapeutic or pharmaceutical composition of the present invention.

本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、治療を必要とするほ乳類に投与される場合、治療効果を生じさせるのに十分な量の上記化合物をいう。治療有効量は対象および治療する疾患症状、対象の体重および年齢、疾患症状の重症度、投与方法などに依存して異なり、当該技術分野における当業者により容易に決定されることができる。 The term "therapeutically effective amount" as used herein refers to a sufficient amount of the compound to produce a therapeutic effect when administered to a mammal in need of treatment. The therapeutically effective amount varies depending on the subject and the disease condition to be treated, the weight and age of the subject, the severity of the disease condition, the method of administration, etc, and can be readily determined by one skilled in the art.

本明細書で使用される「対象」という用語は、動物を指す。典型的には、動物は、哺乳動物である。対象は、例えば、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、魚類、鳥類なども指す。ある種の実施形態において、対象は霊長類、好ましくはヒトである。 The term "subject" as used herein refers to an animal. Typically, the animal is a mammal. A subject also refers to, for example, primates (eg, humans), cows, sheep, goats, horses, dogs, cats, rabbits, rats, mice, fish, birds and the like. In certain embodiments, the subject is a primate, preferably a human.

本発明に用いる化合物を含む医薬組成物は、医薬組成物の処方のための既知の方法に準じて処方することができる。代表的な医薬組成物には、上記した薬学的に許容される担体が含まれうる。これらの担体の使用は、当該技術分野においてよく知られている。また、活性成分を含む医薬組成物を調製するための方法は、当該技術分野においてよく知られている。 Pharmaceutical compositions containing the compounds used in the present invention can be formulated according to known methods for formulating pharmaceutical compositions. A representative pharmaceutical composition can include the pharmaceutically acceptable carrier described above. The use of these carriers is well known in the art. Also, methods for preparing pharmaceutical compositions containing the active ingredients are well known in the art.

本発明の医薬組成物は、使用目的に応じた特定の投与経路に適合するように製剤化されうる。投与経路は、これに限定されないが、例えば、経口、非経口、静脈内、皮内、皮下、経皮、吸入、局所、経粘膜的、又は直腸内投与がある。本発明の医薬組成物は、固体形態又は液体形態で製剤化されうる。固体形態は、これに限定されないが、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、散剤、又は坐剤を含む。液体形態は、これに限定されないが、例えば、溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含む。本発明の医薬組成物は、好ましくは経口により投与される。 The pharmaceutical composition of the present invention can be formulated to be compatible with a particular administration route depending on the purpose of use. The route of administration is not limited thereto, for example, oral, parenteral, intravenous, intradermal, subcutaneous, transdermal, inhalation, topical, transmucosal or rectal administration. The pharmaceutical compositions of the invention may be formulated in solid or liquid form. Solid forms include, but are not limited to, tablets, capsules, pills, granules, powders, or suppositories, for example. Liquid forms include, but are not limited to, solutions, suspensions, or emulsions, for example. The pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered orally.

本発明に用いる化合物の投与量は、疾患の種類、投与対象の症状、年齢、投与方法等により適宜選択される。例えば、これに限定されないが、経口剤であれば、通常、１日当たり１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは１０〜５０００ｍｇ、より好ましくは１００〜２０００ｍｇを、１回又は数回に分けて投与すればよい。 The dose of the compound used in the present invention is appropriately selected according to the type of disease, the condition to be administered, the age, the administration method and the like. For example, although it is not limited thereto, in the case of an oral preparation, usually 1 mg to 10 g, preferably 10 mg to 5000 mg, and more preferably 100 mg to 2000 mg per day may be administered once or several times.

本発明に用いる化合物の投与経路としては、経口投与、非経口投与又は直腸内投与のいずれでもよく、その一日投与量は、化合物の種類、投与方法、患者の症状・年齢等により異なる。例えば、経口投与の場合は、通常、ヒト又は哺乳動物１ｋｇ体重当たり約０．０１ｍｇ〜５０００ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇ〜２０００ｍｇ、更に好ましくは約１ｍｇ〜２００ｍｇを１〜数回に分けて投与することができる。静注等の非経口投与の場合は、通常、例えば、ヒト又は哺乳動物１ｋｇ体重当たり約０．０１ｍｇ〜３００ｍｇ、更に好ましくは約１ｍｇ〜１００ｍｇを投与することができる。 The administration route of the compound used in the present invention may be oral administration, parenteral administration or rectal administration, and the daily dosage varies depending on the type of compound, administration method, patient condition, age and the like. For example, in the case of oral administration, usually about 0.01 mg to 5000 mg, preferably about 0.1 mg to 2000 mg, and more preferably about 1 mg to 200 mg per kg body weight of human or mammal is divided into 1 to several doses and administered. be able to. In the case of parenteral administration such as intravenous injection, generally, for example, about 0.01 mg to 300 mg, and more preferably about 1 mg to 100 mg can be administered per kg body weight of human or mammal.

本発明はまた、治療有効量の本発明に用いる化合物を、患者に投与することを含む、遺伝性ミトコンドリア病の治療のための方法を含む。本発明の方法において治療対象とする患者は、遺伝性ミトコンドリア病と判定された患者であれば特に制限がないが、好ましくは、タウリン修飾の異常に起因するミトコンドリア病の患者である。
タウリン修飾の異常に起因するミトコンドリア病の患者としては、例えば、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Leu(UUR)、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Trp、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Lys、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Glu、またはｍｔ−ｔＲＮＡ^Glnにおけるタウリン修飾に異常をもつ患者をあげることができ、より具体的には、３４番目のウラシルにおけるタウリン修飾に異常をもつ患者である。これらのｍｔ−ｔＲＮＡのタウリン修飾に異常を有するか否かは、対象とする患者から単離および精製したｍｔ−ｔＲＮＡを質量分析法により分析することにより検出できる。より詳細には、質量分析法では、まず、組織や細胞からｔＲＮＡを精製したのち、ヌクレアーゼによりｔＲＮＡを数個のオリゴヌクレオチドまで消化する。その後、消化されたオリゴヌクレオチドを精製し、逆相液体クロマトグラフィおよび質量分析機にて分析することによりタウリン修飾を検出する。本発明の治療方法は、これらのｍｔ−ｔＲＮＡのタウリン修飾を検出する工程を含むこともできる。 The invention also includes a method for the treatment of hereditary mitochondrial diseases, which comprises administering to the patient a therapeutically effective amount of a compound for use in the invention. The patient to be treated in the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a patient determined to be hereditary mitochondrial disease, but is preferably a patient with mitochondrial disease caused by abnormal taurine modification.
As a patient with a mitochondrial disease caused by an abnormality in taurine modification, for example, an abnormality in taurine modification in mt-tRNA ^{Leu (UUR)} , mt-tRNA ^Trp , mt-tRNA ^Lys , mt-tRNA ^Glu , or mt-tRNA ^Gln It is a patient who has an abnormality in taurine modification in the 34th uracil which can be raised. Whether or not the taurine modification of these mt-tRNAs is abnormal can be detected by analyzing the mt-tRNA isolated and purified from the target patient by mass spectrometry. More specifically, in mass spectrometry, first, after purifying tRNA from tissues and cells, the nuclease digests the tRNA to several oligonucleotides. The digested oligonucleotides are then purified and taurine modifications detected by reverse phase liquid chromatography and analysis on a mass spectrometer. The therapeutic methods of the invention can also include the step of detecting taurine modifications of these mt-tRNAs.

上記ｍｔ−ｔＲＮＡ（ｍｔ−ｔＲＮＡ^Leu(UUR)、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Trp、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Lys、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Glu、またはｍｔ−ｔＲＮＡ^Gln）の３４番目のウラシルがタウリン修飾されているか否かの決定はまた、本発明者らによる特許出願の国際公開公報ＷＯ２０１４／１３６８７０に記載の方法を用いて行うことができ、それは本明細書の一部を構成するものである。具体的には、患者から単離したＲＮＡを用いて、以下の２つの工程：
Ａ１．第１プライマーを用いて、ＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを生成する工程、ここで、第１プライマーは、ＲＮＡ上のタウリン修飾を有する部位を含む領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである、
Ａ２．第２プライマーを用いて、ＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを生成する工程、ここで、第２プライマーは、ＲＮＡ上のタウリン修飾を有する部位より５’側の領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである、
をそれぞれ行い、それぞれの工程から生成されたｃＤＮＡ量の差を測定することによりタウリン修飾を検出することができる。
上記方法においては、これに限定されないが、ｃＤＮＡ量の差を核酸増幅反応、例えばＲＴ−ＰＣＲ法により測定することが好ましい。
また、患者からのＲＮＡの由来は特に制限がないが、好ましくは、血液由来のＲＮＡである。 Determination of whether or not the 34th uracil of the above mt-tRNA (mt-tRNA ^{Leu (UUR)} , mt-tRNA ^Trp , mt-tRNA ^Lys , mt-tRNA ^Glu or mt-tRNA ^Gln is taurine-modified is Moreover, it can carry out using the method as described in international publication WO2014 / 136870 of the patent application by the present inventors, and that constitutes a part of this specification. Specifically, using RNA isolated from the patient, the following two steps:
A1. Generating cDNA from the RNA by reverse transcription using a first primer, wherein the first primer is an oligonucleotide designed to complementarily bind to a region containing a site having a taurine modification on the RNA Is
A2. A step of generating cDNA from the RNA by reverse transcription using a second primer, wherein the second primer is designed to complementarily bind to a region 5 'to the site having a taurine modification on the RNA Are oligonucleotides,
Taurine modification can be detected by measuring the differences in the amount of cDNA generated from each step.
In the above method, although not limited thereto, it is preferable to measure the difference in the amount of cDNA by a nucleic acid amplification reaction such as RT-PCR.
Also, the source of RNA from the patient is not particularly limited, but is preferably RNA derived from blood.

本発明の方法において治療対象とする好ましい患者である、タウリン修飾の異常に起因するミトコンドリア病の患者としては、また、Ｍto１遺伝子の変異を有する患者をあげることができる。Ｍto１遺伝子に変異を有するか否かは、患者から単離したＲＮＡを用いて検出できる。より具体的には、これに限定されないが、患者から単離したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法を用いて増幅し遺伝子配列を特定することにより、変異を検出することができる。このような変異に検出は、遺伝子配列の決定における公知の方法を制限なく用いて行うことができる。 As a preferred patient to be treated in the method of the present invention, a patient with a mitochondrial disease caused by an abnormality in taurine modification can also include a patient having a mutation in the Mto1 gene. Whether or not a mutation is present in the Mto1 gene can be detected using RNA isolated from a patient. More specifically, although not limited thereto, mutations can be detected by amplifying RNA isolated from a patient using RT-PCR and identifying gene sequences. Detection of such mutations can be performed without limitation using known methods in the determination of gene sequences.

本発明はまた、他の既知のミトコンドリア病薬と組み合わせて患者に投与することを含む、ミトコンドリア病の治療のための方法（併用）及び２つ以上の医薬有効成分の組合せ（配合剤）を含む。他のミトコンドリア病の治療薬としては、これに限定されることはないが、例えば、タウリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−アルギニン、５−ＡＬＡ／Ｆｅ、イデベノン、エダラボンをあげることができる。 The invention also includes methods (combinations) for the treatment of mitochondrial diseases and combinations of two or more pharmacologically active ingredients (combinations) comprising administering to a patient in combination with other known mitochondrial diseases. . Other therapeutic agents for mitochondrial diseases include, but are not limited to, for example, taurine, sodium pyruvate, L-arginine, 5-ALA / Fe, idebenone, edaravone.

以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（動物）
全ての工程は、熊本大学の動物倫理委員会より承認を得た（承認ID：A27-037 R1）。Mto1ノックアウトマウスは、標準的な相同組み換えにより、Mto1遺伝子のエクソン１−２を、ネオマイシン抵抗遺伝子で置き換えることにより作成した。概要を図１に示す。LoxP配列で挟み込まれたMto1遺伝子のエクソン１−２をもったトランスジェニックマウスを、AlbCreマウス(B6.Cg-Tg（Alb-cre）21Mgn/J）またはMhcCreマウス（B6.FVB-Tg（Myh6-cre）2182Mds/J）を交配することにより、肝臓特異的Mto1ノックアウトマウスまたは心臓特異的Mto1ノックアウトマウスをそれぞれ得た。動物は、12時間毎の明暗サイクルにて25℃で飼育した。肝臓特異的Mto1ノックアウトマウスは、８〜９週齢の雄マウスを犠牲にして全ての実験に用いた。心臓特異的Mto1ノックアウトマウスは、０．５〜１日齢の新生マウスを犠牲にして全ての実験に用いた。Ｅ８．０およびＥ９．０の遺伝子型がMto1野生型およびノックアウトである胚は、Mto1ヘテロ型の雄および雌のマウスを２時間交配させることによって作成した。また、Ｅ８．０およびＥ９．０の胚を採取し、卵黄嚢から胚性ＤＮＡを抽出した。 Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but the present invention is not limited to the following examples.
(animal)
All processes were approved by the animal ethics committee of Kumamoto University (approval ID: A27-037 R1). Mto1 knockout mice were created by replacing exons 1-2 of the Mto1 gene with a neomycin resistance gene by standard homologous recombination. An overview is shown in FIG. A transgenic mouse having exons 1-2 of the Mto1 gene flanked by LoxP sequences was either AlbCre mice (B6.Cg-Tg (Alb-cre) 21 Mgn / J) or MhcCre mice (B6.FVB-Tg (Myh6-). By mating (cre) 2182 (Mds / J), liver-specific Mto1 knockout mice or heart-specific Mto1 knockout mice were obtained, respectively. The animals were kept at 25 ° C. with a 12 hour light and dark cycle. Liver-specific Mto1 knockout mice were used for all experiments at the expense of 8- to 9-week-old male mice. Heart specific Mto1 knockout mice were used for all experiments at the expense of 0.5-1 day old newborn mice. Embryos with E8.0 and E9.0 genotypes of Mto1 wild type and knockout were generated by mating Mto1 heterotype male and female mice for 2 hours. In addition, embryos of E8.0 and E9.0 were collected, and embryonic DNA was extracted from the yolk sac.

実施例１：Mto1ノックアウトマウスの作製
最初に、MTO1-EGFP(緑)で形質転換したHela細胞をMitotrackＥＲ(赤)で染色し、MTO1-EGFPがMitotrackＥＲと同じ場所に位置すること、即ち、Mto1蛋白がミトコンドリアに存在することを確認した。
次いで、Mto1のミトコンドリアでの機能を確認するために、Mto1遺伝子のエクソン１−２を欠失させたMto1ノックアウトマウスを作成した。しかし、新生マウスは生まれてこなかった。そこで、交配後８および９日（E8.0およびE9.0）における胚の形態を確認した。胚を細断し、24ウェルプレートに移した。卵黄嚢を注意深く除去した後、胚を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、PECAM-1抗体（BD Bioscience）で染色した。さらに、胚をパラフィンに包埋した後、ヘマトシキン・エオシンで対比染色し、顕微鏡で観察した。結果を図２に示す。その結果、ノックアウト胚（ＫＯ胚）が致死であるここが判った。野生型では、９日（E9.0）で完全な形態変化および成熟した心臓系が観察されたのに対し、ＫＯ胚では、９日（E9.0）においても８日（E8.0）と同様の大きさおよび形態を示していた。このことは、Mto1欠失胚が、初期の発達段階で致死となっていることを示している。 Example 1: Generation of Mto1 knockout mouse First, Hela cells transformed with MTO1-EGFP (green) are stained with Mitotrack ER (red), and MTO1-EGFP is co-located with Mitotrack ER, ie, Mto1 protein Was confirmed to exist in mitochondria.
Then, in order to confirm the mitochondrial function of Mto1, Mto1 knockout mice in which exons 1-2 of the Mto1 gene were deleted were created. However, newborn mice have not been born. Therefore, embryo morphology was confirmed at 8 and 9 days (E8.0 and E9.0) after mating. Embryos were shredded and transferred to 24-well plates. After careful removal of the yolk sac, embryos were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with PECAM-1 antibody (BD Bioscience). Furthermore, after embedding the embryo in paraffin, it was counterstained with hematoshikin eosin and observed with a microscope. The results are shown in FIG. As a result, it was found that the knockout embryo (KO embryo) was lethal. In wild type, complete morphological change and mature heart system were observed in 9 days (E9.0), while in KO embryo, 8 days (E8.0) in 9 days (E9.0) It showed similar size and morphology. This indicates that the Mto1 deficient embryo is lethal at an early developmental stage.

実施例２：Mto1ノックアウトＥＳ細胞の作製
実施例１で得られMto1ＫＯ胚から繊維芽細胞を作製するのは難しいため、Mto1ノックアウトEmbryonic stem cell line（ＫＯＥＳ細胞株）を用いて以下の検討を行った。Mto1がヘテロ接合型の雄および雌のマウスを用いて、インビトロで人工授精を行い、Mto1の野生型およびＫＯのＥＳ細胞クローンを作製した。ＫＯＥＳ細胞は、野生型（ＷＴ）に比べて非常に成長が遅かった。以下のようにしてタウリン修飾を確認した。ＷＴおよびＫＯマウス細胞からTrizol（Invitrogen）を用いて全ＲＮＡを抽出した。20μgのＲＮＡを、2.5Ｕのヌクレアーゼおよび0.2Ｕのアルカリホスファターゼで消化し、サンプルをWeiらの既報（Wei, FY.ら(2015)"Cdk5rap1-mediated 2-methylthio modification of mitochondrial tRNAs governs protein translation and contributes to myopathy in mice and humans. Cell Metab. 21, 428-442）を参照して質量分析にかけた。結果を図３に示す。５−タウリノメチルウリジン（τｍ⁵Ｕ）および５−タウリノメチル−２−チオウリジン（τｍ⁵ｓ²Ｕ）の何れもＫＯ細胞の全ＲＮＡからは検出されなかった。 Example 2: Preparation of Mto1 knockout ES cells Because it is difficult to generate fibroblasts from Mto1 KO embryo obtained in Example 1, the following study was performed using Mto1 knockout Embryonic stem cell line (KOES cell line) . Artificial insemination was performed in vitro using Mto1 heterozygous male and female mice to generate Mto1 wild type and KO ES cell clones. KOES cells grew much more slowly than wild type (WT). Taurine modification was confirmed as follows. Total RNA was extracted from WT and KO mouse cells using Trizol (Invitrogen). 20 μg of RNA was digested with 2.5 U of nuclease and 0.2 U of alkaline phosphatase, and the sample was published by Wei et al. (Wei, FY. Et al. (2015) Cdk5rap1-mediated 2-methylthio modification of mitochondrial tRNAs protein translation and contributes Cell metab. 21, 428-442) and the results are shown in Fig. 3. The results are shown in Fig. 5. ⁵ -taulinomethyluridine (τm ⁵ U) and 5-taurinomethyl-2-. None of the thiouridine (τm ⁵ s ² U) was detected from the total RNA of KO cells.

次いで、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Trpにおける修飾を確認するために、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Trpの配列に相同なオリゴＤＮＡプローブを用いて、全ＲＮＡからｍｔ−ｔＲＮＡ^Trpを精製し、質量分析により分析をおこなった。その結果、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Trpの３４番目のウラシルにおける修飾がＫＯＥＳ細胞では欠失していた。結果を図４に示す。また、ｍｔ−ｔＲＮＡ^Trpの３４番目のウラシルにおけるタウリン修飾を図５に示す。
これらの結果は、Mto1の欠失がｍｔ−ｔＲＮＡにおけるタウリン修飾の欠失をもたらし、それが胚性致死であることを示し得いる。 Then, in order to confirm the modification in mt-tRNA ^Trp, using homologous oligo DNA probes to the sequence of mt-tRNA ^Trp, was purified mt-tRNA ^Trp from total RNA, was subjected to analysis by mass spectrometry. As a result, the modification at uracil 34 of mt-tRNA ^Trp was deleted in KOES cells. The results are shown in FIG. Moreover, the taurine modification in uracil 34 of mt-tRNA ^Trp is shown in FIG.
These results may indicate that the deletion of Mto1 results in the deletion of taurine modifications in mt-tRNA, which is embryonic lethality.

実施例３：野生型およびMto1ＫＯにおけるミトコンドリア翻訳および代謝の検討
ミトコンドリアにおける翻訳に対するタウリン修飾の欠失の影響を、以下のようにして確認した。
（３−１）ミトコンドリアの単離
ＥＳ細胞を、４℃、680ｒｐｍにて５分間遠心して回収した。細胞を、HEPES緩衝液に懸濁し、テフロンホモジナイザーで溶解した。250mMスクロースを含有した同量のHEPES緩衝液を添加し、さらに、４℃、600ｘｇにて15分間遠心した。上清を、４℃、15,000ｘｇにて15分間遠心し、ミトコンドリアを沈殿させた。肝臓、心臓等のマウスの組織からのミトコンドリアの単離は、氷冷MOPS緩衝液中にて組織をミンチして小片にしたのち、プロテアーゼインヒビターカクテルを添加し、テフロンホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジネートを、４℃、800ｘｇにて15分間遠心し、上清をさらに、8,000ｘｇにて15分間遠心した。ミトコンドリア沈殿物をMOPOS緩衝液に懸濁し、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いて、タンパク質濃度を1mg/mLに調製した。 Example 3 Examination of Mitochondrial Translation and Metabolism in Wild Type and Mto1KO The effect of deletion of taurine modification on translation in mitochondria was confirmed as follows.
(3-1) Isolation of Mitochondria ES cells were collected by centrifugation at 680 rpm for 5 minutes at 4 ° C. The cells were suspended in HEPES buffer and lysed with a teflon homogenizer. The same amount of HEPES buffer containing 250 mM sucrose was added, and centrifuged at 600 × g for 15 minutes at 4 ° C. The supernatant was centrifuged at 15,000 × g for 15 minutes at 4 ° C. to precipitate mitochondria. Isolation of mitochondria from mouse tissue such as liver and heart was carried out by mincing the tissue into small pieces in ice-cold MOPS buffer, then adding a protease inhibitor cocktail, and homogenizing with a Teflon homogenizer. The homogenate was centrifuged at 800 × g for 15 minutes at 4 ° C., and the supernatant was further centrifuged at 8,000 × g for 15 minutes. The mitochondrial precipitate was suspended in MOPOS buffer and the protein concentration was adjusted to 1 mg / mL using a BCA protein assay kit.

（３−２）ミトコンドリアの翻訳測定
ミトコンドリアのタンパク質合成の標識は、Weiら(2015、Cell Metab. 21, 428-442)の報告を参考にして行った。要約すれば、細胞をメチオニン／システイン不含のDMEM培地で洗浄した後、細胞質翻訳の阻害剤であるエメチンを培地に添加し、次いで、放射性標識した³⁵Ｓ−メチオニン／システインを細胞に添加し１時間培養した。メチオニンおよびシステインを過剰に含んだ冷却リン酸緩衝液を添加して代謝標識を停止した。次いで、上記にようにしてミトコンドリアを単離した。10μgのミトコンドリアタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（15−20％勾配ゲル）にかけた。ゲルを乾燥して、標識されたバンドを確認した。 (3-2) Measurement of Translation of Mitochondria The labeling of mitochondrial protein synthesis was performed with reference to the report of Wei et al. (2015, Cell Metab. 21, 428-442). In summary, after washing the cells with a methionine / cysteine-free DMEM medium, the cytosolic translation inhibitor emetin is added to the medium, and then radiolabeled ³⁵ S-methionine / cysteine is added to the cells. Incubated for time. The metabolic labeling was stopped by adding cold phosphate buffer containing excess of methionine and cysteine. The mitochondria were then isolated as described above. 10 μg of mitochondrial proteins were subjected to SDS-PAGE (15-20% gradient gel). The gel was dried to confirm the labeled band.

（３−３）呼吸系複合体アッセイ
上記のようにして抽出したミトコンドリアを用い、Trounceら（(1996). Assessment of mitochondrial oxidative phosphorylation in patients muscle biopsies, lymphoblasts, and transmitochondrial cell line. Method. Enzymol. 264, 484-509.）の方法を参考に、複合体Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，ＩＶ、およびクエン酸シンターゼの活性を測定した。 (3-3) Respiratory system complex assay Using the mitochondria extracted as described above, Trounce et al. ((1996). Assessment of mitochondrial oxidative phosphorylation in patients muscle biopsies, lymphoblasts, and transmitter cell line. Method. Enzymol. 264 , 484- 509.), and the activities of complexes I, II, III, IV and citrate synthase were measured.

（３−４）測定結果
ミトコンドリアにおける翻訳は、ＫＯ細胞で顕著に減少していた。また、Blue native PAGEを用いて、ＷＴおよびＫＯ細胞から単離したミトコンドリアを確認したところ、ＫＯ細胞では、呼吸系複合体が顕著に減少していた。そして、呼吸系複合体の活性も、ＷＴに比べてＫＯでは顕著に減少していた（それぞれＷＴに比べてＫＯでは、CI：23%、CII：30%、CIII：40%、CIV：8%）。結果を図６に示す。
上記に加えて、ＫＯ細胞では、ミトコンドリア膜電位が著しく減少していた。解糖系およびアミノ酸代謝に関わる代謝は、ＫＯ細胞でアップレギュレートされていたが、クエン酸サイクルおよびピリミジンに関する代謝はＫＯ細胞で減少していた。ＫＯ細胞ではまた、乳酸およびNADHが著しく増加しており、これはミトコンドリア障害の特徴でもある。ＫＯ細胞の全ＡＴＰレベルは、ＷＴに比べて僅かしか減少しておらず、このことは、タウリン修飾の欠失がミトコンドリア翻訳を障害しているが、代謝は、ミトコンドリア依存のエネルギー供給の減少を補うために嫌気性の解糖系へシフトしていることを示している。 (3-4) Measurement results The translation in mitochondria was significantly reduced in KO cells. Moreover, when the mitochondria isolate | separated from WT and KO cells was confirmed using Blue native PAGE, in KO cells, the respiratory-system complex was reducing notably. And, the activity of the respiratory complex was also significantly reduced in KO compared to WT (CI: 23%, CII: 30%, CIII: 40%, CIV: 8% for KO compared to WT respectively) ). The results are shown in FIG.
In addition to the above, in KO cells, mitochondrial membrane potential was significantly reduced. Metabolism involved in glycolysis and amino acid metabolism was upregulated in KO cells, but the citric acid cycle and metabolism for pyrimidines were reduced in KO cells. In KO cells, lactate and NADH are also significantly increased, which is also a feature of mitochondrial dysfunction. Total ATP levels in KO cells are only slightly reduced compared to WT, which means that although taurine modification is impaired in mitochondrial translation, metabolism reduces mitochondrial dependent energy supply It indicates the shift to an anaerobic glycolysis system to compensate.

次いで、ミトコンドリア障害は、細胞のアポトーシスと関連し、障害のある胚発生を引き起こしうると報告されているので、その点を検討した。しかしながら、ＫＯ細胞において、チトクロームＣの放出は確認されず、また、カスパーゼ３／７の活性も著しくダウンレギュレートしていた。
これらのことより、アポトーシスも翻訳の変化も、Mto1ＫＯ胚の致死には直接関わっていないことが示唆された。 Mitochondrial damage was then linked to cellular apoptosis and reported to be capable of causing impaired embryonic development, so we examined that point. However, in KO cells, release of cytochrome C was not confirmed, and the activity of caspase 3/7 was also significantly downregulated.
These results suggest that neither apoptosis nor translational changes are directly related to Mto1 KO embryo lethality.

実施例４：Mto1ノックアウトにおけるミトコンドリアの形態変化
電子顕微鏡を用いて、Mto1ノックアウトのＥＳ細胞および胚のミトコンドリアを観察した。結果を図７に示す。ＷＴで観察される狭く伸びたクリスタに比べ、ＫＯ細胞では殆どのクリスタが顕著に広がっていた。ＫＯ胚では、異常なクリスタの形態が観察された。 Example 4 Morphological Change of Mitochondria in Mto1 Knockout The electron microscope was used to observe the mitochondria of Mto1 knockout ES cells and embryos. The results are shown in FIG. Compared to the narrow elongated crystal observed in WT, most of the crystal was significantly expanded in KO cells. In KO embryos, abnormal crista morphology was observed.

実施例５：Mto1ノックアウトにおけるミトコンドリアの膜タンパク質の検討
Optic atrophy 1（Opa1）は、クリスタの形態を制御する重要なタンパク質の一つであるので、Opa1の発現を検討した。ＷＴおよびＫＯ細胞のミトコンドリ分画を精製し、膜に結合したOpa1を、blue-native PAGEを用いて確認した。結果を図８に示す。ＫＯのミトコンドリアでは、クリスタの形態変化とともに、OPa1およびオリゴマーも顕著に減少していた。しかし、ＫＯ細胞においては、オートファゴソーム膜によって囲まれたミトコンドリアは滅多に観察されなかった。
Opa1および複合体IIタンパク質を含むミトコンドリア内膜の殆どのタンパク質は、細胞質で翻訳され、内膜へと移動する。それ故、次に、ＫＯ細胞におけるミトコンドリアタンパク質のホメオスタシスを検討した。具体的には、外膜および内膜に局在するミトコンドリアタンパク質の発現レベルを確認した。外膜タンパク質であるTomm40、Drp1、Mfn2の蛋白レベルは、ＷＴとＫＯ細胞で変化がなかったが、Tomm20はＫＯ細胞で僅かに減少していた。一方、内膜タンパク質であるMitofilin、OPa1、Timm44、Timm50はKO細胞で著しく減少していた。このことは、Mto1ＫＯ細胞において、ミトコンドリアの内膜タンパク質が選択的に減少していることを示している。結果を図９に示す。 Example 5 Examination of mitochondrial membrane proteins in Mto1 knockout
Since Optic atrophy 1 (Opa1) is one of the important proteins that control the form of crista, the expression of Opa1 was examined. Mitochondrial fractions of WT and KO cells were purified and membrane bound Opal was confirmed using blue-native PAGE. The results are shown in FIG. In KO mitochondria, OPa1 and oligomers were also significantly decreased along with the change in crystal shape. However, in KO cells, mitochondria surrounded by autophagosomal membranes were rarely observed.
Most proteins in the inner mitochondrial membrane, including Opal and complex II proteins, are translated in the cytoplasm and translocate to the inner membrane. Therefore, next we examined mitochondrial protein homeostasis in KO cells. Specifically, the expression levels of mitochondrial proteins localized to the outer and inner membranes were confirmed. The protein levels of the outer membrane proteins Tomm40, Drp1 and Mfn2 were unchanged in WT and KO cells, but Tomm20 was slightly reduced in KO cells. On the other hand, inner membrane proteins Mitofilin, OPa1, Timm44 and Timm50 were significantly reduced in KO cells. This indicates that in Mto1 KO cells, mitochondrial inner membrane proteins are selectively reduced. The results are shown in FIG.

内膜タンパク質の減少は、タンパク質の分解の増加、または、タンパク質選別（protein trafficking）の減少の結果であると考えられる。そこで、タンパク質選別を確認するために、GFPを用いた分割レポーター（split GFP-based reportＥＲ）を作製した。２つの分割されたGFPポリペプチド（spGFP_1-10およびspGFP₁₁）が互いに接近するとそれらは、リフォールディングされて完全なGFPタンパク質となる。外膜標的シグナルをもつspGFP_1-10（Mt_out-spGFP_1-10）およびmCherryをもつspGFP₁₁を結合させた。mCherryは、細胞質に均質に広がるので、外膜に位置するspGFP_1-10とは容易に相互作用する。外膜標的シグナルをもつｓｐＧＦＰ_1-10（Ｍｔ_out−ｓｐＧＦＰ_1-10）およびmCherryをもつｓｐＧＦＰ₁₁を、ＷＴおよびＫＯ細胞において共発現した場合は、予想通り、ＷＴおよびＫＯ細胞の何れにおいてもGFPの蛍光が明らかに検出できた。しかしながら、spGFP_1-10を内膜標的シグナルに結合させて（Mt_in-spGFP_1-10）、それをspGFP_11-10-mCherryと共発現させても、ＷＴでは、蛍光は検出できなかった。しかし、ＫＯ細胞にてそれらを共発現させた場合は、細胞質において蛍光が検出された。
これらの結果は、タンパク質選別における障害が、Opa1を含む内膜タンパク質の減少の原因であり、結果として、膜構築の障害を引き起こしていることを示している。 The decrease in inner membrane proteins is believed to be the result of increased protein degradation or decreased protein trafficking. Therefore, in order to confirm protein selection, a split reporter (split GFP-based reportER) using GFP was prepared. As the two split GFP polypeptides (spGFP _1-10 and spGFP ₁₁ ) approach one another, they are refolded into a complete GFP protein. SpGFP _1-10 (Mt _out -spGFP _1-10 ) with outer membrane targeting signal and spGFP ₁₁ with mCherry were bound. Since mCherry spreads uniformly in the cytoplasm, it readily interacts with spGFP _1-10 located in the outer membrane. When co-expressed in WT and KO cells with spGFP _1-10 (Mt _out -spGFP _1-10 ) with outer membrane targeting signal and spGFP ₁₁ with mCherry, as expected, GFP in both WT and KO cells The fluorescence of was clearly detected. However, when spGFP _1-10 was bound to the inner membrane targeting signal (M t _in -spGFP _1-10 ) and it was coexpressed with spGFP _11-10 -mCherry, no fluorescence was detectable in WT. However, when they were coexpressed in KO cells, fluorescence was detected in the cytoplasm.
These results indicate that impairments in protein sorting are responsible for loss of inner membrane proteins, including Opal, resulting in impaired membrane construction.

実施例６：Mto1ノックアウト細胞におけるミスフォールディングミトコンドリアタンパク質の蓄積
ミトコンドリアの内膜に配置されなかったミトコンドリアタンパク質がどのような影響を及ぼすかを検討した。ミトコンドリアタンパク質の多くは、膜を標的とするための疎水性ドメインを有している。これらの疎水性のため、ミトコンドリアタンパク質は、素早くミトコンドリア膜中に移送されないと、ミスフォールディングまたは凝集する傾向にある。そこで、溶液中では弱い蛍光を発するが凝集タンパク質中に入り込んだ場合に強い蛍光を発する色素を用いて、ＫＯ細胞におけるタンパク質凝集を確認した。結果を図１０に示す。ＷＴ細胞に比べ、多量の凝集がＫＯ細胞において検出された。
異なる界面活性剤を用いてＷＴおよびＫＯ細胞からタンパク質を抽出し、それらを可溶性分画と不溶性分画に分け、SDS-PAGEを行い、各種のミトコンドリアタンパク質を検出することにより、ミトコンドリアタンパク質が凝集しているかを確認した。その結果、ＷＴ細胞に比べ、ＫＯ細胞では、可溶性分画でミトコンドリア内膜タンパク質であるNdufb8、SdhaおよびOpa1が減少している一方、これらのタンパク質の全てが、ＫＯ細胞の不溶性分画に蓄積していた。これに対し、ミトコンドリアの外膜タンパク質であるTomm70、Tomm40およびTomm34は、ＫＯ細胞の不溶性分画では蓄積されていなかった。加えて、細胞質タンパク質であるエロンゲーション因子2（EF2）は、ＷＴとＫＯ細胞で差がなかった。 Example 6 Accumulation of Misfolded Mitochondrial Protein in Mto1 Knockout Cells The effect of mitochondrial protein not arranged in the inner membrane of mitochondria was examined. Many mitochondrial proteins have hydrophobic domains to target membranes. Because of their hydrophobicity, mitochondrial proteins tend to misfold or aggregate if they are not quickly transported into the mitochondrial membrane. Therefore, a dye that emits weak fluorescence in solution but emits strong fluorescence when it enters into aggregated protein was used to confirm protein aggregation in KO cells. The results are shown in FIG. Greater aggregation was detected in KO cells compared to WT cells.
Proteins are extracted from WT and KO cells using different detergents, they are separated into soluble and insoluble fractions, SDS-PAGE is performed, and mitochondrial proteins are aggregated by detecting various mitochondrial proteins. I confirmed it. As a result, KO cells have reduced soluble inner membrane proteins Ndufb8, Sdha and Opa1 in KO cells compared to WT cells, while all of these proteins accumulate in the insoluble fractions of KO cells. It was On the other hand, mitochondrial outer membrane proteins Tomm70, Tomm40 and Tomm34 were not accumulated in the insoluble fraction of KO cells. In addition, cytoplasmic protein Elongation Factor 2 (EF2) was not different between WT and KO cells.

一般に、ミスフォールディングしたタンパク質は、小胞体ストレス（unfolded protein response：ＵＰＲ）を活性化すると言われている。ＵＰＲは、細胞内ホメオスタシスに深刻なインパクトを与えるものである。よく知られＵＰＲの兆候は、EF2およびeukaryotic initiation factor（elF2）のリン酸化を通じたタンパク質合成の抑制である。
実施例２で作製したＫＯ細胞について、EF2およびelF2のリン酸化を確認したところ、著しく増加しており、このことは、タンパク質合成が抑制されていることを示している。また、ＫＯ細胞においては、不完全なタンパク質の蓄積が、Atf4、Chop、および挿入Xbl1（spliced Xbl1）を含むＵＰＲ特異的な翻訳ネットワークの活性化を誘導しており、ＵＰＲ関連タンパク質の一つであるChopタンパク質レベルは著しく増加していた。ＷＴとＫＯ細胞における挿入および非挿入Xbp1、およびChopの発現を図１１に示す。タンパク質合成の抑制、並びにAtf4およびChopの増加は、分化したＫＯ細胞においても確認された。また、小胞体（ＥＲ）の形態を電子顕微鏡で確認したところ、図１２に示すように、ＫＯ細胞では、拡大したＥＲ構造が確認された。これはＵＰＲの形態学的な指標でもある。
ＥＲにおける過剰なフォールドされていないタンパク質は、細胞障害性および細胞増殖阻害と関連する、異常なカルシウムハンドリングを引き起こす。ＫＯ細胞においては、ＷＴに比べこれらも著しく増加していた。
これらの結果は、Mto1のＫＯ細胞において、ミスフォールディングしたミトコンドリアタンパク質が、細胞障害性のあるＵＰＲを積極的に引き起こしていることを示している。 In general, misfolded proteins are said to activate unfolded protein response (UPR). UPR has a serious impact on intracellular homeostasis. A well-known manifestation of UPR is the suppression of protein synthesis through phosphorylation of EF2 and eukaryotic initiation factor (elF2).
The phosphorylation of EF2 and elF2 was confirmed for the KO cells produced in Example 2, and significantly increased, indicating that protein synthesis was suppressed. Moreover, in KO cells, defective protein accumulation induces the activation of UPR-specific translation networks including Atf4, Chop, and inserted Xbl1 (spliced Xbl1), one of the UPR-related proteins. Certain Chop protein levels were significantly increased. Expression of inserted and non-inserted Xbp1 and Chop in WT and KO cells is shown in FIG. Repression of protein synthesis, and increases in Atf4 and Chop were also confirmed in differentiated KO cells. In addition, when the morphology of the endoplasmic reticulum (ER) was confirmed by an electron microscope, as shown in FIG. 12, an expanded ER structure was confirmed in KO cells. This is also a morphological indicator of UPR.
Overfolded unfolded proteins in the ER cause abnormal calcium handling associated with cytotoxicity and cell growth inhibition. These were also significantly increased in KO cells compared to WT.
These results indicate that in Mto1 KO cells, misfolded mitochondrial proteins are actively causing cytotoxic UPR.

実施例７：コンディショナルMto1ノックアウトマウスにおけるＵＰＲの確認
Mto1を欠失したＥＳ細胞において確認されたミスフォールディングしたミトコンドリアタンパク質による進行性のＵＰＲが、出生後の組織でも観察されるか確認した。心筋ミオパチーは、MELASおよびMERRF患者における共通する不良な予後であるので、心臓特異的なMto1ノックアウトマウス（ＨｃＫＯ）を作製した。ＨｃＫＯマウスは、出生後は正常に見えたが、24時間以上は生存できなかった。心臓形態においては、ＨｃＫＯおよびＦｌｏｘマウス間で著しい差はなかったことより、心臓の発達障害が致死の原因ではないと言える。死亡前の新生マウスから全RNAを抽出し、遺伝子プロフェイリングおよび質量分析により解析したところ、ＨｃＫＯマウスではMto1発現が著しく減少しており、タウリン修飾も減少していた。心不全マーカーであるAnpおよびBnpのmRNAレベルはＨｃＫＯマウスの心臓で著しく増加しており、一方、mtDNAがエンコードする呼吸系サブユニットであるMTCOIおよび核DNAがエンコードする呼吸系サブユニットであるAtp5、Uqcrc2、SdhbおよびNdufb8は、ＨｃＫＯの心臓で著しく減少していた。透過電子顕微鏡により、ミトコンドリアおよびＥＲの形態を確認したところ、図１３に示すように、ＨｃＫＯマウスの心臓では、著しく拡張したミトコンドリアとともに崩壊したクリスタ構造が確認された。ＨｃＫＯマウス心臓のミトコンドリアは、非常に低い電子密度を示し、このことは、異常なミトコンドリアタンパク質ホメオスタシスを示している。図１４に示すように、ＨｃＫＯマウス心臓では、形態異常と一致して、内膜タンパク質Opa1およびTimm44も著しく減少していた。また、図１３に示すように、ＨｃＫＯマウス心臓の細胞質において、凝集様構造が確認され、このことは、ミトコンドリアタンパク質のミスフォールディングが心筋において引き起こされていることを示している。図１３に示すように、ＨｃＫＯマウス心臓では、ＥＲ構造がフラグメント化および拡大していた。さらに、図１５に示すように、ＨｃＫＯマウス心臓では、ＵＰＲ関連遺伝子である挿入Xbp1、Xbp1、およびChopの発現レベルが著しくアップレギュレートされており、Chopのレベルは、Ｆｌｏｘマウス心臓の１０倍であった。加えて、ＨｃＫＯの心臓では、elf2およびEF2のリン酸化も著しく増加しており、タンパク質合成が抑制されていることを示している。ＨｃＫＯの心臓から調製した心筋細胞を用いてカルシウム移動を確認したところ、カルシウム振幅の自然発生頻度が、ＨｃＫＯの心筋細胞では、Ｆｌｏｘの心筋細胞に比べて著しく低かった。このことが、ＨｃＫＯの心筋細胞におけるカルシウムハンドリングの異常を反映していた。 Example 7: Confirmation of UPR in conditional Mto1 knockout mice
It was confirmed whether progressive UPR by misfolded mitochondrial protein confirmed in ES cells deficient in Mto1 was also observed in postnatal tissues. Because cardiac myopathy is a common poor prognosis in MELAS and MERRF patients, cardiac-specific Mto1 knockout mice (HcKO) were generated. HcKO mice appeared normal after birth but could not survive more than 24 hours. From the fact that there was no significant difference between HcKO and Flox mice in cardiac morphology, it can be said that cardiac developmental disorders do not cause lethality. When total RNA was extracted from newborn mice before death and analyzed by gene profiling and mass spectrometry, HcKO mice had a marked decrease in Mto1 expression and also reduced taurine modification. MRNA levels of the heart failure markers Anp and Bnp are significantly increased in the heart of HcKO mice, while MTCOI, a respiratory subunit encoded by mtDNA, and Atp5, Uqcrc2, a respiratory subunit encoded by nuclear DNA , Sdhb and Ndufb8 were significantly reduced in HcKO hearts. When the morphology of mitochondria and ER was confirmed by transmission electron microscopy, as shown in FIG. 13, in the heart of HcKO mice, a crista structure that collapsed along with the remarkably expanded mitochondria was confirmed. The mitochondria of the HcKO mouse heart show very low electron density, indicating abnormal mitochondrial protein homeostasis. As shown in FIG. 14, in the HcKO mouse heart, the intima proteins Opa1 and Timm44 were also significantly reduced, consistent with the morphological abnormalities. Also, as shown in FIG. 13, in the cytoplasm of the HcKO mouse heart, an aggregation-like structure was confirmed, which indicates that misfolding of mitochondrial proteins is caused in the myocardium. As shown in FIG. 13, ER structures were fragmented and expanded in HcKO mouse hearts. Furthermore, as shown in FIG. 15, in the HcKO mouse heart, the expression levels of the UPR-related genes, inserted Xbp1, Xbp1, and Chop, are significantly upregulated, and the level of Chop is 10 times that of Flox mouse heart. there were. In addition, in the HcKO heart, phosphorylation of elf2 and EF2 is also significantly increased, indicating that protein synthesis is suppressed. When calcium migration was confirmed using cardiomyocytes prepared from the HcKO heart, the spontaneous occurrence frequency of calcium amplitude was significantly lower in the cardiomyocytes of HcKO compared to the cardiomyocytes of Flox. This reflected the abnormality of calcium handling in the cardiomyocytes of HcKO.

肝臓特異的なＫＯマウスは、致死性の欠損にも関わらす通常は生存可能であるので、肝臓特異的なMto1ノックアウト（ＬｃＫＯ）マウスを作製した。作製したＬｃＫＯマウスは生存可能であり、ＷＴと外見上は差がなかった。しかしながら、ＬｃＫＯマウス肝臓では、欠陥のあるミトコンドリアおよび細胞質タンパク質ホメオスタシスを示し、そして、Mto1のmRNAレベルは著しく減少しており、タウリン修飾は減少していた。また、図１６に示すように、mtDNA由来のMT-COIおよび核DNA由来のNDUFB8のタンパク質レベル、並びに、Opa1およびTimm44のタンパク質レベルは、ＬｃＫＯマウス肝臓のミトコンドリアで減少していた。ミトコンドリアタンパク質ホメオスタシスの機能障害と一致して、図１７に示すように、ＬｃＫＯマウス肝臓では、ミトコンドリア膜組織の異常な凝集を示していた。ＨｃＫＯマウス心臓と同様に、ＬｃＫＯマウス肝臓でも、ＥＲ構造は拡大していた。このことは、異常なタンパク質が過剰であることを示している。同様に、ＬｃＫＯマウスでは、ＵＰＲ関連タンパク質である、Chopおよびリン酸化elF2も増加していた。
これらの結果は、インビボでも、進行性のＵＰＲが、欠損したミトコンドリアタンパク質ホメオスタシスによって引き起こされた主要な細胞障害性であることを示している。 Liver-specific Mto1 knockout (LcKO) mice were generated because liver-specific KO mice are usually viable despite lethality defects. The generated LcKO mice were viable and did not differ in appearance from WT. However, LcKO mouse liver showed defective mitochondrial and cytoplasmic protein homeostasis, and Mto1 mRNA levels were significantly reduced and taurine modification was reduced. Also, as shown in FIG. 16, the protein levels of MT-COI derived from mtDNA and NDUFB8 derived from nuclear DNA, and the protein levels of Opa1 and Timm44 were decreased in mitochondria of LcKO mouse liver. Consistent with a dysfunction of mitochondrial protein homeostasis, LcKO mouse liver showed abnormal aggregation of mitochondrial membrane tissue, as shown in FIG. Similar to HcKO mouse heart, ER structure was expanded in LcKO mouse liver. This indicates that the abnormal protein is in excess. Similarly, in LcKO mice, UPR-related proteins, Chop and phosphorylated elF2, were also increased.
These results indicate that, even in vivo, progressive UPR is the major cytotoxicity caused by defective mitochondrial protein homeostasis.

実施例８：Opa1を介したMto1ＫＯ細胞を用いた改善化合物の検討
上記したように、ミスフォールディングしたミトコンドリアタンパク質の蓄積は、ミトコンドリア障害を増幅し、細胞障害性を誘導する。そこで、ミトコンドリアタンパク質のミスフォールディングを抑制することにより、機能性ミトコンドリアタンパク質の供給を増加させることが、Mto1ＫＯ細胞における細胞障害性を緩和することができると考えられる。
タウリンが結合した胆汁酸である、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣ）に着目し、Mto1ＫＯ細胞におけるミトコンドリアタンパク質の凝集を抑制できるか検討した。
培地に50μMのＴＵＤＣ（シグマより購入）を添加し、ＷＴおよびＫＯ細胞を48時間処理した。その後、タンパク質の凝集を、ProteoStat（登録商標）aggresome検出キット（Enzo Life Science）を用い、製造者の指示書に従って検出した。結果を、図１８に示す。ＴＵＤＣがタンパク質凝集を効果的に防ぐことが確認できた。また、図１９に示すように、ＫＯ細胞において、ＴＵＤＣは、不溶性のOpa1を減少させ、可溶性のOpa1を増加させた。その結果、ＴＵＤＣ処理されたＫＯ細胞では、他の内膜タンパク質とともに顕著な量のOpa1がミトコンドリア内に存在した。ミトコンドリアの形態を確認したところ、図２０に示すように、ＴＵＤＣ処理により著しく改善した。 Example 8 Examination of Improvement Compounds Using Mto1 KO Cells Mediated by Opal As described above, accumulation of misfolded mitochondrial proteins amplifies mitochondrial damage and induces cytotoxicity. Therefore, it is considered that, by suppressing misfolding of mitochondrial proteins, increasing supply of functional mitochondrial proteins can alleviate cytotoxicity in Mto1 KO cells.
Focusing on taurine-bound bile acid, tauroursodeoxycholic acid (TUDC), we examined whether it could suppress the aggregation of mitochondrial proteins in Mto1 KO cells.
The media was supplemented with 50 μM TUDC (purchased from Sigma) and WT and KO cells were treated for 48 hours. Protein aggregation was then detected using the ProteoStat® aggresome detection kit (Enzo Life Science) according to the manufacturer's instructions. The results are shown in FIG. It has been confirmed that TUDC effectively prevents protein aggregation. Also, as shown in FIG. 19, in KO cells, TUDC decreased insoluble Opal and increased soluble Opal. As a result, in TUDC-treated KO cells, a significant amount of Opal was present in mitochondria along with other inner membrane proteins. When the morphology of mitochondria was confirmed, as shown in FIG. 20, TUDC treatment significantly improved.

次に、ＫＯ細胞における細胞障害性のＵＰＲに対するＴＵＤＣの効果を確認した。図２１に示すように、ＴＵＤＣは、ＫＯ細胞におけるChopの遺伝子およびタンパク質レベルを有効に減少させた。ＴＵＤＣはまたEF2リン酸化を減少させＫＯ細胞における全体的なタンパク質合成を増加させた。ＥＲ構造を確認したところ、図２２に示すように、ＴＵＤＣ処理によりＫＯ細胞においてＥＲ構造の改善が確認できた。また、図２３に示すように、ＴＵＤＣ処理により細胞質のカルシウムの漏出も著しく減少した。ＴＤＵＣによる細胞質タンパク質ホメオスタシスの改善は、図２４に示すように、細胞増殖も改善した。 Next, the effect of TUDC on cytotoxic UPR in KO cells was confirmed. As shown in FIG. 21, TUDC effectively reduced Chop gene and protein levels in KO cells. TUDC also reduced EF2 phosphorylation and increased overall protein synthesis in KO cells. When the ER structure was confirmed, as shown in FIG. 22, improvement of ER structure in KO cells was confirmed by TUDC treatment. In addition, as shown in FIG. 23, TUDC treatment significantly reduced cytoplasmic calcium leakage. Improvement of cytosolic protein homeostasis by TDUC also improved cell proliferation as shown in FIG.

実施例９：他の改善化合物の検討
次いで、他のシャペロンである、フェニル酪酸（ＰＢＡ）について同様の検討を行った。ＰＢＡは、100μMの濃度にて培地に添加した。ＰＢＡも同様に、タンパク質凝集の抑制、Chop発現の減少、および細胞増殖の著しい改善を示した。それぞれの結果を、図２５Ａ〜Ｃに示す。 Example 9 Examination of Other Improved Compounds Subsequently, the same examination was conducted for another chaperone, phenylbutyric acid (PBA). PBA was added to the culture medium at a concentration of 100 μM. PBA also showed inhibition of protein aggregation, reduced Chop expression, and a marked improvement in cell proliferation. The respective results are shown in FIGS. 25A-C.

実施例１０：インビボにおけるＴＵＤＣの効果の確認
ＬｃＫＯマウスを用い、ＴＵＤＣの改善効果を以下のようにして確認した。
ＴＵＤＣを25mg/mLの濃度となるように生理食塩水に溶解した後、250mg/kg体重の投与用量となるように、８週齢のＦｌｏｚおよびＬｃＫＯマウスの腹腔内に投与した。その後１週間、１日に１回投与を行った。最終投与の24時間後に、マウスを犠牲にして実験を行った。コントロール（Vehicle）は、生理食塩水を投与した。
ミトコンドリア膜の組織構造および細胞質のＵＰＲに対するＴＵＤＣの効果を確認した。図２６に示すように、細胞モデルと同様に、ＴＵＤＣの投与により、ＬｃＫＯマウス肝臓のミトコンドリアでも、Opa1の増加が確認できた。また、図２７に示すように、ＴＵＤＣを投与したＬｃＫＯマウスでは、肝細胞中の異常なミトコンドリア膜の組織構造が著しく改善していた。クリステ凝集を示す異常なミトコンドリアの数を定量した結果を図２８に示す。ＴＵＤＣ投与したマウスの肝臓では、数の著しい減少が確認された。
ＴＵＤＣ投与したＫＯマウスの肝臓では、完全な膜の形成が改善されていることが、呼吸系のサブユニットの部分的な回復からも裏付けられた（図２９）。ＴＵＤＣ投与により、呼吸系複合体の活性は、Ｆｌｏｘマウスでは僅かに改善されていたが、ＬｃＫＯマウスでは著しい改善が見られた（図３０）。また、ＴＵＤＣ投与ＬｃＫＯマウスでは、ChopのmRNAレベルおよびタンパク質レベルの何れも著しく減少していた（図３１）。
ＬｃＫＯマウスでは、血清中のアスパラギン酸トランスフェラーゼおよびアラニンアミノトランスフェラーゼレバルは正常であったが、血清アルブミンレベルは減少し、血清アルカリホスファターゼレベルは上昇していた。血清アルブミンおよび血清アルカリホスファターゼレベルともに、ＴＵＤＣ処置により正常レベルに回復した。また、ミトコンドリア病のホールマークであるFgf21の遺伝子発現を確認したところ、図３２に示すように、ＬｃＫＯマウスではアップレギュレートされていたが、ＴＵＤＣの投与により、顕著に減少した。このことは、ＴＵＤＣがミトコンドリア病の治療に有効であることを示している。 Example 10 Confirmation of Effect of TUDC in Vivo Using a LcKO mouse, the improvement effect of TUDC was confirmed as follows.
After dissolving TUDC in physiological saline to a concentration of 25 mg / mL, it was administered intraperitoneally to 8-week-old Floz and Lc KO mice at a dose of 250 mg / kg body weight. The administration was performed once a day for one week thereafter. Twenty-four hours after the final dose, mice were sacrificed and experiments were performed. The control (Vehicle) was administered saline.
The effect of TUDC on mitochondrial membrane tissue structure and cytoplasmic UPR was confirmed. As shown in FIG. 26, as in the cell model, administration of TUDC confirmed an increase in Opa1 even in the mitochondria of LcKO mouse liver. Further, as shown in FIG. 27, in the LcKO mice to which TUDC was administered, the tissue structure of the abnormal mitochondrial membrane in the hepatocytes was significantly improved. The results of quantifying the number of abnormal mitochondria exhibiting cristal aggregation are shown in FIG. In the livers of TUDC-administered mice, a marked reduction in number was observed.
In the liver of TUDC-administered KO mice, improved formation of complete membranes was also supported by partial recovery of respiratory subunits (FIG. 29). With TUDC administration, respiratory complex activity was slightly improved in Flox mice, but significant improvement was seen in LcKO mice (FIG. 30). Also, in TUDC-administered LcKO mice, both Chop mRNA level and protein level were significantly reduced (FIG. 31).
In Lc KO mice, aspartate transferase and alanine aminotransferase Reval in serum were normal, but serum albumin levels decreased and serum alkaline phosphatase levels increased. Both serum albumin and serum alkaline phosphatase levels were restored to normal levels by TUDC treatment. In addition, when gene expression of Fgf21, which is a hallmark of mitochondrial disease, was confirmed, it was upregulated in LcKO mice as shown in FIG. 32, but it was significantly reduced by the administration of TUDC. This indicates that TUDC is effective for the treatment of mitochondrial diseases.

実施例１１：他の化学シャペロンとの比較
ＴＵＤＣの効果について、他の化学シャペロンである、ＢＩＸ（BiP Inducer X）およびＴＭＡＮＯとの比較を行った。ＢＩＸ（１−（３，４−ジヒドロキシ−フェニル）−２−チオシアナト−エタノン）は、小胞体分子シャペロンであるBiP mRNA1の発現を上昇させる化合物である（再表２００７／１２５７２０号公報）。ＴＭＡＮＯ（トリメチルアミンＮ−オキシド）は、様々なタンパク質の構造を維持するシャペロン的な効果を有すると報告されている。
実施例２で作製したＷＴ細胞およびMot1ＫＯＥＳ細胞を入れた培地に、ＢＩＸ（シグマより購入）、ＴＭＡＮＯ（シグマより購入）、およびＴＵＤＣを50μMとなるように添加し、培養を行った。48時間後に、ＵＰＲ遺伝子の一つであるChop遺伝子の発現量をqPCR法により検討した。結果図３３に示す。ＴＵＤＣ処理ではＫＯマウス細胞におけるChopの発現が抑制されたが、ＢＩＸやＴＭＡＮＯ処理では、Chop発現量を完全に抑制することはできなかった。 Example 11 Comparison with Other Chemical Chaperones The effects of TUDC were compared with other chemical chaperones, BIX (BiP Inducer X) and TMANO. BIX (1- (3,4-dihydroxy-phenyl) -2-thiocyanato-etanone) is a compound that elevates the expression of the endoplasmic reticulum molecular chaperone BiP mRNA 1 (Retable 2007/125720). TMANO (trimethylamine N-oxide) is reported to have a chaperone effect to maintain the structure of various proteins.
To the medium containing the WT cells and Mot1 KOES cells prepared in Example 2, BIX (purchased from Sigma), TMANO (purchased from Sigma), and TUDC were added to a concentration of 50 μM, and culture was performed. After 48 hours, the expression level of Chop gene, which is one of the UPR genes, was examined by qPCR. Results are shown in FIG. Although TUDC treatment suppressed the expression of Chop in KO mouse cells, BIX or TMANO treatment could not completely suppress the amount of Chop expression.

上記の詳細な記載は、本発明の目的および対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更および置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。 The above detailed description merely illustrates the objects and objects of the present invention, and does not limit the scope of the appended claims. Various modifications and substitutions to the described embodiments will be apparent to those skilled in the art from the teachings set forth herein, without departing from the scope of the appended claims.

本発明により、新たな作用機序のミトコンドリア病治療薬を提供することが可能となる。 The present invention makes it possible to provide a therapeutic agent for mitochondrial diseases with a novel mechanism of action.

Claims

Treatment and / or treatment of hereditary mitochondrial diseases comprising at least one compound selected from the group consisting of tauroursodeoxycholic acid (TUDC), phenylbutyric acid (PBA), and pharmaceutically acceptable salts thereof, as an active ingredient Pharmaceutical composition for prevention.

The pharmaceutical composition according to claim 1, comprising tauroursodeoxycholic acid (TUDC) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

The pharmaceutical composition according to claim 1 or 2, wherein the hereditary mitochondrial disease is a mitochondrial disease caused by an abnormality in taurine modification of mitochondrial tRNA (mt-tRNA).

The at least one mt- selected from the group consisting of mt-tRNA ^{Leu (UUR)} , mt-tRNA ^Trp , mt-tRNA ^Lys , mt-tRNA ^Glu , and mt-tRNA ^Gln , wherein the abnormality in taurine modification of mt-tRNA is selected. The pharmaceutical composition according to claim 3, which is an abnormality in the modification of taurine of tRNA.

The pharmaceutical composition according to claim 1 or 2, wherein the mitochondrial disease is a mitochondrial disease caused by a mutation of Mot1 gene.

The pharmaceutical composition according to claim 1 or 2, which is administered to a patient suffering from a mitochondrial disease caused by an abnormality in taurine modification.

The pharmaceutical composition according to claim 1 or 2, which is administered to a patient suffering from a mitochondrial disease caused by a mutation of the Mot1 gene.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 7, which is administered in combination with another therapeutic agent for mitochondrial disease.