JP2019080578A - Cell colony detection device, cell colony detection method, and program - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、撮像画像内に含まれる細胞コロニーを検出する細胞コロニー検出装置および方法並びにプログラムに関するものである。 The present invention relates to a cell colony detection apparatus, method, and program for detecting cell colonies contained in a captured image.
近年、再生医療の分野において、造血幹細胞、ＥＳ(embryonic stem)細胞、ｉＰＳ（Induced Pluripotent Stem）細胞などの多能性幹細胞、および分化誘導された細胞などを培養して顕微鏡で撮像し、その画像の特徴を捉えることで細胞の状態を評価する方法が提案されている。 In recent years, in the field of regenerative medicine, hematopoietic stem cells, ES (embryonic stem) cells, pluripotent stem cells such as iPS (induced pluripotent stem) cells, and differentiation-induced cells are cultured and imaged with a microscope and the image A method has been proposed to evaluate the state of cells by capturing the features of
具体的には、たとえば培養された細胞コロニーに対して薬剤を添加し、その細胞コロニーの状態や細胞コロニーの数の増減を観察することによって薬効試験または毒性試験を行ったり、もしくは細胞コロニーの大きさの変化を観察することによって細胞群の成長度を評価したりすることが行われている。 Specifically, for example, a drug is added to cultured cell colonies, and drug efficacy test or toxicity test is carried out by observing the state of the cell colonies and the increase or decrease of the number of cell colonies, or the size of cell colonies It has been practiced to evaluate the degree of growth of cell groups by observing changes in size.
ここで、上述したような細胞コロニーの状態や数を観察して評価を行う際には、細胞コロニーを正確に把握することが重要である。 Here, when performing evaluation by observing the state and number of cell colonies as described above, it is important to accurately grasp cell colonies.
ここで、癌細胞やｉＰＳ細胞など細胞は主に平面培養され、仮足により培養容器や足場材に接着した状態で増殖して細胞コロニーを形成するため、細胞コロニーが分割されることは稀である。しかしながら，血球前駆細胞などの一部細胞では浮遊培養を行うため、細胞が仮足によって固定されない。そのため、同一の細胞由来である細胞コロニーが形成途中で分割され、サブコロニーを形成してしまうことがある。 Here, cells such as cancer cells and iPS cells are mainly cultured in a plane, and proliferate in a state of being adhered to a culture vessel or a scaffold by temporary foot to form cell colonies, so cell colonies are rarely divided. is there. However, some cells such as blood cell precursor cells are subjected to suspension culture, so the cells are not fixed by pseudopods. Therefore, cell colonies derived from the same cell may be divided during formation to form sub-colonies.
このようにサブコロニーが形成されると、たとえば細胞コロニーの数を計測して評価を行う際、サブコロニーを１つの細胞コロニーとして計測する場合があり、正確な評価を行うことができない。 When the sub-colony is formed in this way, for example, when the number of cell colonies is counted and evaluated, the sub-colony may be counted as one cell colony, and accurate evaluation can not be performed.
そこで、たとえば特許文献１には、複数のサブコロニー間の距離および複数のサブコロニーの色成分に基づいて、それらのサブコロニーが同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定する方法が提案されている。 Therefore, for example, in Patent Document 1, there is a method of determining whether or not the subcolonies belong to the same cell colony based on the distance between the plurality of subcolonies and the color components of the plurality of subcolonies. Proposed.
しかしながら、特許文献１に記載の方法のように、サブコロニーの色成分によって判定を行ったのでは、たとえば細胞の種類が特定の色を示さないような細胞である場合には、正確に判定することができない。 However, as in the method described in Patent Document 1, if the determination is made based on the color component of the sub-colony, for example, if the cell type does not show a specific color, the determination is accurately made. I can not do it.
なお、特許文献２には、細胞コロニーの領域を検出する際、一部の領域が途切れて検出された場合には、その一部の領域との距離が閾値以下である領域を同一の領域とすることが開示されているが、複数のサブコロニーが同一の細胞コロニーに属するものか否かの判定方法については何も提案されていない。また、特許文献３には、細胞コロニーの色成分に基づいて細胞コロニーの種類を決定することが開示されているが、特許文献３にも、複数のサブコロニーが同一の細胞コロニーに属するものか否かの判定方法については何も提案されていない。 In Patent Document 2, when a region of a cell colony is detected, if a partial region is interrupted and detected, a region having a distance of a threshold or less to the partial region is regarded as the same region. However, nothing has been proposed as a method for determining whether or not multiple sub-colonies belong to the same cell colony. Although Patent Document 3 discloses that the type of cell colony is determined based on the color component of the cell colony, Patent Document 3 also allows a plurality of sub-colonies to belong to the same cell colony. No proposal has been made as to a method of judging whether or not it is not.
本発明は、上記の事情に鑑み、撮像画像内に含まれる複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するか否かを高精度に判定することができ、細胞コロニーの検出精度を向上することができる細胞群検出装置および方法並びにプログラムを提供することを目的とする。 The present invention can highly accurately determine whether or not a plurality of cell groups included in a captured image belong to the same cell colony in view of the above circumstances, and improves the detection accuracy of the cell colony. It is an object of the present invention to provide an apparatus, method and program for cell group detection that can
本発明の細胞コロニー検出装置は、複数の細胞を撮像した撮像画像を取得する細胞画像取得部と、撮像画像内に含まれる複数の細胞からなる細胞群を検出する細胞群検出部と、複数の細胞群の間の距離と複数の細胞群のそれぞれの成熟度に基づいて、複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定し、同一の細胞コロニーに属するものであると判定した場合に、複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出する細胞群統合部とを備えたことを特徴とする。 The cell colony detection apparatus of the present invention comprises a cell image acquisition unit for acquiring a captured image obtained by imaging a plurality of cells, a cell group detection unit for detecting a cell group consisting of a plurality of cells contained in the captured image, and a plurality of cells. Based on the distance between cell groups and the maturity of each of a plurality of cell groups, it is determined whether or not a plurality of cell groups belong to the same cell colony, and they belong to the same cell colony And a cell group integration unit that integrates a plurality of cell groups and detects as one cell colony.
また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞群統合部は、複数の細胞群の間の距離が予め設定された距離閾値以下であり、かつ複数の細胞群の成熟度の差が予め設定された成熟度閾値以下である場合に、複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであると判定することができる。 Further, in the cell colony detection device of the present invention, the cell group integration unit is configured such that the distance between the plurality of cell groups is equal to or less than a preset distance threshold, and the difference in maturity of the plurality of cell groups is previously set. If the degree of maturation threshold or less, it can be determined that a plurality of cell groups belong to the same cell colony.
また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞群統合部は、細胞の培養期間に応じて距離閾値および成熟度閾値の少なくとも１つを変更することができる。 In the cell colony detection device of the present invention, the cell group integration unit can change at least one of the distance threshold and the maturity threshold in accordance with the culture period of the cells.
また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞群統合部は、細胞の成長因子の種類または量に応じて距離閾値および成熟度閾値の少なくとも１つを変更することができる。 In the cell colony detection device of the present invention, the cell group integration unit can change at least one of the distance threshold and the maturity threshold according to the type or amount of the growth factor of the cell.
また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞群統合部は、複数の細胞群の間の距離と複数の細胞群の成熟度の差の線形和もしくは非線形和が閾値以下である場合に、同一の細胞コロニーに属するものであると判定することができる。 Further, in the cell colony detection device of the present invention, the cell group integration unit is configured to set the linear sum or the non-linear sum of the difference between the distance between the plurality of cell groups and the maturity of the plurality of cell groups below a threshold. It can be determined that they belong to the same cell colony.
また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞群統合部は、細胞の培養期間に応じて上記閾値を変更することができる。 In the cell colony detection device of the present invention, the cell group integration unit can change the threshold according to the culture period of the cells.
また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞群統合部は、細胞の成長因子の種類または量に応じて上記閾値を変更することができる。 In the cell colony detection device of the present invention, the cell group integration unit can change the threshold according to the type or amount of the growth factor of the cell.
また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞が、造血幹細胞由来の細胞である場合、細胞群統合部は、細胞群の画像の赤色と青色の比率を成熟度として取得することができる。 In the cell colony detection device of the present invention, when the cells are cells derived from hematopoietic stem cells, the cell group integration unit can acquire the ratio of red to blue in the image of the cell group as the degree of maturation.
また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞が、ｉＰＳ（Induced Pluripotent Stem）細胞またはＥＳ(embryonic stem)細胞である場合、細胞群統合部は、細胞群の分化度または未分化度を成熟度として取得することができる。 In the cell colony detection apparatus of the present invention, when the cells are iPS (Induced Pluripotent Stem) cells or ES (embryonic stem) cells, the cell group integration part matures the differentiation degree or undifferentiation degree of the cell group. It can be obtained as a degree.
また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞群統合部は、分化度または未分化度を示す特徴量として細胞群の細胞密度または平均核細胞質比を取得することができる。 Further, in the cell colony detection apparatus of the present invention, the cell group integration unit can obtain the cell density or average nucleocytoplasmic ratio of the cell group as the feature amount indicating the differentiation degree or the undifferentiation degree.
また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞群統合部は、複数の細胞の中に複数種類の細胞が含まれる場合、複数の細胞群が同じ種類の細胞の細胞群であるか否かを判定し、その判定結果と複数の細胞群の間の距離と複数の細胞群のそれぞれの成熟度に応じて、複数の細胞群が同一細胞コロニーに属するものであるか否かを判定することができる。 Further, in the cell colony detection device of the present invention, when the plurality of types of cells are included in the plurality of cells, the cell group integration unit determines whether the plurality of types of cells are cells of the same type of cells or not. To determine whether or not the plurality of cell groups belong to the same cell colony according to the determination result, the distance between the plurality of cell groups, and the respective degrees of maturation of the plurality of cell groups Can.
また、上記本発明の細胞コロニー検出装置において、細胞群統合部は、細胞群の画像の赤色と青色の比率に基づいて、細胞群の種類を判定することができる。 In the cell colony detection device of the present invention, the cell group integration unit can determine the type of cell group based on the ratio of red to blue in the image of the cell group.
また、細胞群統合部による細胞コロニーの検出結果を出力する出力部を備えることができる。 Moreover, the output part which outputs the detection result of the cell colony by a cell group integrated part can be provided.
本発明の細胞コロニー検出方法は、複数の細胞を撮像した撮像画像を取得し、撮像画像内に含まれる複数の細胞からなる細胞群を検出し、複数の細胞群の間の距離と複数の細胞群のそれぞれの成熟度に基づいて、複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定し、同一の細胞コロニーに属するものであると判定した場合に、複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出することを特徴とする。 The cell colony detection method of the present invention acquires a captured image obtained by imaging a plurality of cells, detects a cell group consisting of a plurality of cells contained in the imaged image, and detects the distance between the plurality of cell groups and the plurality of cells If it is determined based on the degree of maturity of each group whether or not multiple cell groups belong to the same cell colony, and if it is determined that they belong to the same cell colony, multiple cell groups Are integrated and detected as one cell colony.
本発明の細胞コロニー検出プログラムは、複数の細胞を撮像した撮像画像を取得する細胞画像取得部と、撮像画像内に含まれる複数の細胞からなる細胞群を検出する細胞群検出部と、複数の細胞群の間の距離と複数の細胞群のそれぞれの成熟度に基づいて、複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定し、同一の細胞コロニーに属するものであると判定した場合に、複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出する統合部としてコンピュータを機能させることを特徴とする。 The cell colony detection program of the present invention comprises a cell image acquisition unit for acquiring a captured image obtained by imaging a plurality of cells, a cell group detection unit for detecting a cell group consisting of a plurality of cells contained in the captured image, Based on the distance between cell groups and the maturity of each of a plurality of cell groups, it is determined whether or not a plurality of cell groups belong to the same cell colony, and they belong to the same cell colony When it is determined, the computer functions as an integrated unit that integrates a plurality of cell groups and detects as one cell colony.
本発明の細胞コロニー検出装置および方法並びにプログラムによれば、撮像画像内に含まれる複数の細胞からなる細胞群を検出し、その複数の細胞群の間の距離と複数の細胞群のそれぞれの成熟度に基づいて、複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定し、同一の細胞コロニーに属するものであると判定した場合に、その複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出するようにしたので、複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するか否かを高精度に判定することができ、細胞コロニーの検出精度を向上することができる。 According to the cell colony detection apparatus, method and program of the present invention, a cell group consisting of a plurality of cells contained in a captured image is detected, and the distance between the plurality of cell groups and the maturation of each of the plurality of cell groups Based on the degree, it is determined whether or not multiple cell groups belong to the same cell colony, and when it is determined that they belong to the same cell colony, the multiple cell groups are integrated and Since detection is performed as one cell colony, it can be determined with high accuracy whether or not a plurality of cell groups belong to the same cell colony, and the detection accuracy of cell colonies can be improved.
以下、本発明の細胞コロニー検出装置および方法並びにプログラムの一実施形態を用いた細胞コロニー観察システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本実施形態の細胞コロニー観察システムの概略構成を示すブロック図である。 Hereinafter, a cell colony observation system using one embodiment of the cell colony detection apparatus, method and program of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. FIG. 1 is a block diagram showing a schematic configuration of a cell colony observation system of the present embodiment.
本実施形態の細胞コロニー観察システムは、図１に示すように、顕微鏡装置１と、細胞コロニー検出装置２と、表示装置３と、入力装置４とを備えている。 As shown in FIG. 1, the cell colony observation system of the present embodiment includes a microscope device 1, a cell colony detection device 2, a display device 3, and an input device 4.
顕微鏡装置１は、培養容器内で培養された複数の細胞からなる細胞群の画像を撮像するものである。顕微鏡装置１としては、位相差顕微鏡装置、明視野顕微鏡装置、微分干渉顕微鏡装置および蛍光観察顕微鏡装置などを用いることができる。顕微鏡装置１は、ＣＣＤ（charge-coupled device）イメージセンサやＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサなどの撮像素子を備えており、撮像素子によって撮像された撮像画像は細胞コロニー検出装置２に入力される。 The microscope apparatus 1 captures an image of a cell group consisting of a plurality of cells cultured in a culture vessel. As the microscope apparatus 1, a phase contrast microscope apparatus, a bright field microscope apparatus, a differential interference microscope apparatus, a fluorescence observation microscope apparatus, and the like can be used. The microscope apparatus 1 includes an imaging device such as a charge-coupled device (CCD) image sensor or a complementary metal-oxide semiconductor (CMOS) image sensor, and the captured image captured by the imaging device is input to the cell colony detection device 2 Be done.
撮像対象の細胞としては、たとえば骨髄および臍帯血に含まれ、浮遊培養される造血幹細胞および血球前駆細胞などがある。ただし、これらに限らず、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞といった多能性幹細胞、幹細胞から分化誘導された神経、皮膚、心筋および肝臓の細胞、並びに人体から取り出された皮膚、網膜、心筋、血球、神経および臓器の細胞などでもよい。 The cells to be imaged include, for example, hematopoietic stem cells and blood cell precursors which are contained in bone marrow and cord blood and suspended and cultured. However, not limited thereto, pluripotent stem cells such as iPS cells and ES cells, nerves derived from stem cells, skin, cells of myocardium and liver, skins taken from human body, retina, myocardium, blood cells, nerves and It may be a cell of an organ.
細胞コロニー検出装置２は、入力された撮像画像に含まれる細胞コロニーを検出するものであり、コンピュータに対して本発明の細胞コロニー検出プログラムの一実施形態がインストールされたものである。 The cell colony detection device 2 detects cell colonies contained in the input captured image, and one embodiment of the cell colony detection program of the present invention is installed in a computer.
細胞コロニー検出装置２は、中央処理装置、半導体メモリおよびハードディスクなどを備えており、ハードディスクに本発明の細胞コロニー検出プログラムの一実施形態がインストールされている。そして、このプログラムが中央処理装置によって実行されることによって、図１に示すような細胞画像取得部２０、細胞群検出部２１、細胞群統合部２２および表示制御部２３が動作する。細胞コロニー検出プログラムは、ＣＤ−ＲＯＭ（Compact Disc Read Only Memory）等の記録媒体に記憶されたものでもよいし、インターネット等のネットワークを介して配布されたものでもよい。 The cell colony detection device 2 includes a central processing unit, a semiconductor memory, a hard disk and the like, and one embodiment of a cell colony detection program of the present invention is installed on the hard disk. Then, the program is executed by the central processing unit, whereby the cell image acquisition unit 20, the cell group detection unit 21, the cell group integration unit 22, and the display control unit 23 as shown in FIG. 1 operate. The cell colony detection program may be stored in a recording medium such as a compact disc read only memory (CD-ROM), or may be distributed via a network such as the Internet.
細胞画像取得部２０は、顕微鏡装置１によって撮像された細胞群の撮像画像を取得して記憶するものである。本実施形態においては、細胞群の外形および色の特徴などが判別できれば良いので、顕微鏡装置１の光学倍率を等倍〜４倍程度として撮像された細胞画像を取得する。 The cell image acquisition unit 20 acquires and stores a captured image of the cell group captured by the microscope device 1. In the present embodiment, as long as it is possible to distinguish the outer shape of the cell group and the characteristics of the color, etc., a cell image taken with the optical magnification of the microscope device 1 approximately equal to four times is acquired.
細胞群検出部２１は、撮像画像内に含まれる個々の細胞群を検出するものである。本実施形態において検出される細胞群には、本来、１つの細胞コロニーとして成長すべき細胞群であるが、細胞コロニーの形成途中で分割されてしまった複数の細胞群が含まれる。細胞群は、細胞コロニーよりも小さい単位の細胞群であって、サブコロニーともいう。 The cell group detection unit 21 detects individual cell groups included in a captured image. The cell group detected in the present embodiment is originally a cell group to be grown as one cell colony, but includes a plurality of cell groups divided during formation of the cell colony. A cell group is a unit cell group smaller than a cell colony, and is also called a sub-colony.
細胞群検出部２１は、たとえば、撮像画像を２値化画像に変換した後、テンプレートマッチングなどによって細胞群を自動的に検出するものである。また、細胞群の検出方法については、上述した方法に限らず、その他の公知な方法を用いるようにしてもよい。また、たとえば細胞群を形成する細胞が１つにまとまらずに散在しているような場合には、カーネル密度推定を用いた方法で細胞群を検出することが有効である。なお、カーネル密度推定を用いた方法については、後で詳述する。 The cell group detection unit 21 automatically detects a cell group by, for example, template matching after converting a captured image into a binarized image. Further, the method of detecting the cell group is not limited to the method described above, and other known methods may be used. In addition, for example, when cells forming a cell group are scattered without being collected into one, it is effective to detect the cell group by a method using kernel density estimation. The method using kernel density estimation will be described in detail later.
また、細胞群検出部２１は、上述したように細胞群を撮像画像から自動的に検出するのではなく、たとえば表示装置３に表示された撮像画像上において、ユーザがマウスなどの入力装置４を用いて細胞群を指定した信号を取得することによって細胞群を検出するようにしてもよい。 Further, the cell group detection unit 21 does not automatically detect the cell group from the captured image as described above, and for example, the user can input the input device 4 such as a mouse on the captured image displayed on the display device 3. The cell group may be detected by acquiring a signal specifying the cell group.
細胞群統合部２２は、細胞群検出部２１によって検出された複数の細胞群の間の距離と複数の細胞群のそれぞれの成熟度に基づいて、その複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定し、同一の細胞コロニーに属するものであると判定した場合に、その複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出するものである。 The plurality of cell groups belong to the same cell colony based on the distance between the plurality of cell groups detected by the cell group detection unit 21 and the respective degrees of maturity of the plurality of cell groups. If it is determined that the cells belong to the same cell colony, the plurality of cell groups are integrated and detected as one cell colony.
具体的には、たとえば図２に示すように撮像画像Ｐ内に、細胞群ＳＣ１〜ＳＣ５が存在する場合、細胞群統合部２２は、細胞群ＳＣ１〜ＳＣ５のそれぞれについて、他の細胞群との距離を計測する。図２では、細胞群ＳＣ１と細胞群ＳＣ２との距離Ｄ１、細胞群ＳＣ２と細胞群ＳＣ４との距離Ｄ２、細胞群ＳＣ４と細胞群ＳＣ３との距離Ｄ３、および細胞群ＳＣ３と細胞群ＳＣ５との距離Ｄ４を示している。 Specifically, for example, as shown in FIG. 2, when cell groups SC1 to SC5 exist in the captured image P, the cell group integration unit 22 performs the cell groups SC1 to SC5 with other cell groups. Measure the distance. In FIG. 2, the distance D1 between the cell group SC1 and the cell group SC2, the distance D2 between the cell group SC2 and the cell group SC4, the distance D3 between the cell group SC4 and the cell group SC3, and the cell group SC3 and the cell group SC5 The distance D4 is shown.
ただし、実際は、たとえば細胞群ＳＣ１については、他の全ての細胞群ＳＣ２〜ＳＣ５との距離が計測され、細胞群ＳＣ２については、他の全ての細胞群ＳＣ１，ＳＣ３〜ＳＣ５との距離が計測され、細胞群ＳＣ３については、他の全ての細胞群ＳＣ１〜ＳＣ２，ＳＣ４〜ＳＣ５との距離が計測され、細胞群ＳＣ４については、他の全ての細胞群ＳＣ１〜ＳＣ３，ＳＣ５との距離が計測され、細胞群ＳＣ５については、他の全ての細胞群ＳＣ１〜ＳＣ４との距離が計測される。細胞群間の距離は、たとえば２つの細胞群の重心位置間の距離を計測するようにすればよい。ただし、重心位置間の距離に限らず、たとえば２つの細胞群間の最短距離を計測するようにしてもよい。 However, in practice, for example, for cell group SC1, the distances to all other cell groups SC2 to SC5 are measured, and for cell group SC2, the distances to all other cell groups SC1 and SC3 to SC5 are measured. For cell group SC3, the distances to all other cell groups SC1 to SC2 and SC4 to SC5 are measured, and for cell group SC4, the distances to all other cell groups SC1 to SC3 and SC5 are measured. For cell group SC5, the distances to all other cell groups SC1 to SC4 are measured. The distance between the cell groups may be determined, for example, by measuring the distance between the barycentric positions of the two cell groups. However, for example, the shortest distance between two cell groups may be measured without being limited to the distance between the barycentric positions.
また、細胞群統合部２２は、撮像画像Ｐ内に存在する細胞群ＳＣ１〜ＳＣ５のそれぞれについて成熟度を算出する。成熟度とは、細胞群の成熟度合いを表す指標である。成熟度としては、たとえば培養対象の細胞群が造血幹細胞由来の細胞であり、赤芽球系の細胞である場合には、各細胞群の画像の平均Ｒ／Ｂ比率を用いることができる。Ｒ／Ｂ比率とは、画像の赤色成分と青色成分の比率である。赤芽球系の細胞は、成熟が進むにつれてヘモグロビンが増加して赤色成分が増加する。したがって、平均Ｒ／Ｂ比率を成熟度として用いることができる。 In addition, the cell group integration unit 22 calculates the degree of maturity of each of the cell groups SC1 to SC5 present in the captured image P. The degree of maturity is an index indicating the degree of maturation of the cell group. As the degree of maturation, for example, when the cell group to be cultured is a cell derived from hematopoietic stem cells and is a erythroid cell, an average R / B ratio of images of each cell group can be used. The R / B ratio is the ratio of the red and blue components of the image. In erythroid cells, hemoglobin increases and the red component increases as maturation progresses. Thus, the average R / B ratio can be used as the maturity.
また、培養対象の細胞群が造血幹細胞由来の細胞であり、最終的に白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球およびマクロファージなど）に成長する骨髄芽球系の細胞である場合には、各細胞群の画像の輝度値を成熟度として用いることができる。骨髄芽球系の細胞は、成熟が進むにつれて積層して暗い画像となる。したがって、輝度値を成熟度として用いることができる。 In addition, a cell group to be cultured is a cell derived from hematopoietic stem cells, and a myeloblastoid line that eventually grows into white blood cells (neutrophils, eosinophils, basophils, lymphocytes, monocytes and macrophages, etc.) When the cells are cells, the luminance value of the image of each cell group can be used as the degree of maturation. Cells of the myeloblast lineage stack as the maturation progresses, resulting in a dark image. Therefore, the luminance value can be used as the maturity level.
また、培養対象の細胞群がｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞および分化誘導された細胞など透明な細胞である場合には、各細胞群の分化度または未分化度を成熟度として用いることができる。分化度または未分化度を示す特徴量としては、細胞群の細胞密度または平均核細胞質比を用いることができる。分化度が進むほど細胞が遊走するので細胞密度は小さくなり、平均核細胞質比も小さくなる。逆に、未分化度が高いほど細胞密度は大きくなり、平均核細胞質比も大きくなる。 When the cells to be cultured are transparent cells such as iPS cells, ES cells and cells induced to differentiate, the degree of differentiation or undifferentiation of each cell group can be used as the degree of maturation. The cell density or average nucleocytoplasmic ratio of the cell group can be used as the feature amount indicating the differentiation degree or the undifferentiation degree. As the degree of differentiation progresses, cells migrate and the cell density decreases, and the average nucleocytoplasmic ratio also decreases. Conversely, the higher the undifferentiated degree, the greater the cell density and the greater the average nucleocytoplasmic ratio.
なお、分化度または未分化度を示す特徴量としては、細胞密度および平均核細胞質比に限らず、たとえば各細胞群に含まれる細胞の数、細胞の移動速度および細胞の移動距離などを用いるようにしてもよい。また、ｉＰＳ細胞などの幹細胞は、成熟度が進行すると密集度が高くなり、さらに幹細胞が積層されて、画像の輝度が次第に高くなる。各細胞群の画像の輝度を成熟度として用いるようにしてもよい。また、成熟度として、各細胞群の形状の特徴量を取得するようにしてもよい。幹細胞の成熟度が進行すると細胞群の形状は次第に円形に近づいた後、周辺部分の分化が進行してエッジの複雑度が大きくなる。したがって、細胞群の形状の変化の特徴量を成熟度として用いることができる。なお、成熟度としては、上記に挙げたものに限らず、その他の公知なものを用いることができる。 In addition, as the feature amount indicating the differentiation degree or the undifferentiation degree, not only the cell density and the average nucleocytoplasmic ratio but, for example, the number of cells included in each cell group, the cell migration speed, the cell migration distance, etc. You may In addition, stem cells such as iPS cells become denser as the degree of maturation progresses, and the stem cells are further stacked, and the brightness of the image gradually increases. The brightness of the image of each cell group may be used as the degree of maturation. Further, as the degree of maturity, feature quantities of the shape of each cell group may be acquired. As the degree of maturation of stem cells progresses, the shape of the cell group gradually approaches a circle, and then differentiation of the peripheral portion proceeds to increase the complexity of the edge. Therefore, the feature quantity of the change in shape of the cell group can be used as the degree of maturation. The degree of maturity is not limited to those described above, and other known ones can be used.
そして、細胞群統合部２２は、上記のようにして取得した細胞群間の距離と、細胞群間の成熟度の差に基づいて、複数の細胞群が１つの細胞コロニーに属するものであるか否かを判定する。 Then, whether the plurality of cell groups belong to one cell colony based on the distance between the cell groups acquired as described above and the difference in the degree of maturity between the cell groups It is determined whether or not.
具体的には、細胞群統合部２２は、細胞群間の距離が予め設定された距離閾値以下であって、かつ細胞群間の成熟度の差が予め設定された成熟度閾値以下である場合に、それらの細胞群は同一の細胞コロニーに属するものであると判定し、これらの細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出する。すなわち、細胞群間の距離と成熟度の差が、図３に示す斜線の範囲内にある場合に、それらの細胞群は同一の細胞コロニーに属するものであると判定する。 Specifically, when the cell group integration unit 22 determines that the distance between the cell groups is equal to or less than the preset distance threshold and the difference in the degree of maturation between the cell groups is equal to or less than the preset maturity threshold Then, it is determined that those cell groups belong to the same cell colony, and these cell groups are integrated and detected as one cell colony. That is, when the distance between the cell groups and the difference in the degree of maturity are within the hatched range shown in FIG. 3, it is determined that those cell groups belong to the same cell colony.
なお、上記距離閾値および成熟度閾値は、細胞群統合部２２に予め記憶されるものであるが、これらの閾値を培養期間に応じて変更するようにしてもよい。すなわち、培養期間が経過すると細胞群の成熟が進み、また細胞群間の距離も大きくなっていくことが考えられるため、培養期間毎に異なる距離閾値および成熟度閾値を記憶しておき、培養期間に応じた距離閾値および成熟度閾値を用いるようにしてもよい。なお、培養期間の情報については、ユーザが入力装置４を用いて設定入力するようにしてもよいし、細胞群統合部２２に培養期間を計測するタイマを設けておき、細胞コロニーの検出処理を行う際に、そのタイマによって計測された培養期間を取得するようにしてもよい。また、距離閾値および成熟度閾値の両方を変更するのではなく、いずれか一方のみを変更するようにしてもよい。 Although the above-mentioned distance threshold and maturity threshold are stored in advance in the cell group integration unit 22, these thresholds may be changed according to the culture period. That is, it is conceivable that as the culture period elapses, maturation of the cell group proceeds and the distance between the cell groups also increases, so different distance threshold and maturity threshold are stored for each culture period, and the culture period is kept. A distance threshold and a maturity threshold may be used in accordance with. Note that the information on the culture period may be set and input by the user using the input device 4, or the cell group integration unit 22 may be provided with a timer for measuring the culture period, and the cell colony detection process may be performed. When performing, the culture period measured by the timer may be acquired. Also, instead of changing both the distance threshold and the maturity threshold, only one of them may be changed.
また、細胞群の成熟の進行度は、培養期間だけでなく、成長因子の種類または量に応じて異なる。したがって、細胞群を培養する際に添加する成長因子の種類毎に距離閾値および成熟度閾値を記憶しておき、成長因子の種類に応じた距離閾値および成熟度閾値を用いるようにしてもよい。また、細胞を培養する際に添加する成長因子の量毎に異なる距離閾値および成熟度閾値を記憶しておき、成長因子の量に応じた距離閾値および成熟度閾値を用いるようにしてもよい。なお、成長因子の種類または量の情報については、ユーザが入力装置４を用いて設定入力するようにすればよい。また、距離閾値および成熟度閾値の両方を変更するのではなく、いずれか一方のみを変更するようにしてもよい。 In addition, the progress of maturation of the cell population depends not only on the culture period but also on the type or amount of growth factor. Therefore, the distance threshold and the maturity threshold may be stored for each type of growth factor added when culturing a cell group, and the distance threshold and the maturity threshold may be used according to the type of growth factor. In addition, different distance threshold and maturity threshold may be stored for each amount of growth factor added when culturing cells, and the distance threshold and maturity threshold may be used according to the amount of growth factor. The user may set and input information on the type or amount of growth factor using the input device 4. Also, instead of changing both the distance threshold and the maturity threshold, only one of them may be changed.
なお、距離閾値および成熟度閾値については、目視による細胞コロニーの検出結果と、細胞群統合部２２による細胞コロニーの検出結果との差が最小となるように事前に取得するようにすればよい。 The distance threshold and the maturity threshold may be obtained in advance so that the difference between the detection result of the cell colony by visual observation and the detection result of the cell colony by the cell group integration unit 22 is minimized.
また、複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するか否かの判定方法としては、上記の方法に限らず、たとえば細胞群間の距離と成熟度の差との線形和を算出し、その線形和が予め設定された閾値以下である場合に、それらの細胞群は同一の細胞コロニーに属するものであると判定するようにしてもよい。具体的には、細胞群間の距離と成熟度の差とが、図４に示す線形関数で規定される斜線の範囲に含まれる場合に、それらの細胞群は同一の細胞コロニーに属するものであると判定するようにしてもよい。 Further, the method of determining whether or not a plurality of cell groups belong to the same cell colony is not limited to the above method, and for example, a linear sum of the distance between cell groups and the difference in the degree of maturation is calculated If the sum is less than or equal to a preset threshold value, those cell groups may be determined to belong to the same cell colony. Specifically, when the distance between the cell groups and the difference in the degree of maturation are included in the hatched range defined by the linear function shown in FIG. 4, those cell groups belong to the same cell colony. It may be determined that there is.
また、線形和に限らず、細胞群間の距離と成熟度の差との非線形和を算出し、その非線形和が予め設定された閾値以下である場合に、それらの細胞群は同一の細胞コロニーに属するものであると判定するようにしてもよい。具体的には、細胞群間の距離と成熟度の差とが、図５に示す非線形関数で規定される斜線の範囲に含まれる場合に、それらの細胞群は同一の細胞コロニーに属するものであると判定するようにしてもよい。 Moreover, not only the linear sum but also the non-linear sum of the distance between the cell groups and the difference in the degree of maturation is calculated, and when the non-linear sum is less than a preset threshold, those cell groups are identical cell colonies It may be determined that it belongs to Specifically, when the distance between the cell groups and the difference in the degree of maturation are included in the hatched range defined by the non-linear function shown in FIG. 5, those cell groups belong to the same cell colony. It may be determined that there is.
また、上述したように細胞群間の距離と成熟度の差の線形和または非線形和に基づいて判定する場合にも、培養期間、成長因子の種類または量に応じて閾値を変更するようにしてもよい。 Also, as described above, when determining based on the linear sum or nonlinear sum of the difference between the distance between the cell groups and the degree of maturation, the threshold value is changed according to the type or amount of growth factor during the culture period. It is also good.
また、上述した線形関数または非線形関数を、培養期間、成長因子の種類または量に応じて変更するようにしてもよい。さらに、培養する細胞群の細胞の種類に応じて線形関数または非線形関数を変更するようにしてもよい。なお、この場合も、線形関数および非線形関数については、目視による細胞コロニーの検出結果と、細胞群統合部２２による細胞コロニーの検出結果との差が最小となるように事前に取得するようにすればよい。 In addition, the linear function or the non-linear function described above may be changed depending on the culture period and the type or amount of growth factor. Furthermore, the linear function or non-linear function may be changed according to the type of cells in the cell group to be cultured. Also in this case, linear and non-linear functions are obtained in advance so that the difference between the detection result of the cell colony by visual observation and the detection result of the cell colony by the cell group integration unit 22 is minimized. Just do it.
そして、細胞群統合部２２は、たとえば同一の細胞コロニーに属するものであると判定された複数の細胞群に対して同じ識別情報などを付加することによって統合して１つの細胞コロニーとして検出する。細胞群統合部２２における細胞コロニーの検出結果は、表示制御部２３に出力される。 Then, the cell group integration unit 22 integrates and detects, for example, one cell colony by adding the same identification information or the like to a plurality of cell groups determined to belong to the same cell colony. The detection result of the cell colony in the cell group integration unit 22 is output to the display control unit 23.
表示制御部２３は、細胞群統合部２２における細胞コロニーの検出結果を表示装置３に表示させるものである。具体的には、たとえば図６に示すように、１つの細胞コロニーに属する細胞群を点線で囲んだ範囲Ｃ１０，Ｃ２０を撮像画像上に重ねて表示させるものである。なお、本実施形態では、表示制御部２３が、出力部に相当するものである。 The display control unit 23 causes the display device 3 to display the detection result of the cell colony in the cell group integration unit 22. Specifically, for example, as shown in FIG. 6, areas C10 and C20 in which a cell group belonging to one cell colony is surrounded by a dotted line are superimposed and displayed on the captured image. In the present embodiment, the display control unit 23 corresponds to an output unit.
また、本実施形態では、上述したように細胞コロニーの検出結果を点線の範囲で表示装置３に表示させるようにしたが、これに限らず、たとえば細胞群統合部２２において、検出された細胞コロニーの数を計測し、表示制御部２３が、その細胞コロニーの数を表示装置３に表示させるようにしてもよい。 Further, in the present embodiment, as described above, the detection result of the cell colony is displayed on the display 3 in the range of the dotted line, but the present invention is not limited thereto. For example, the cell colony detected in the cell group integration unit 22 The number of cell colonies may be displayed on the display device 3 by counting the number of cell colonies.
入力装置４は、マウスやキーボードなどを備えたものであり、ユーザによる種々の設定入力を受け付けるものである。 The input device 4 includes a mouse, a keyboard, and the like, and receives various setting inputs from the user.
次に、本実施形態の細胞群観察システムの作用について、図７に示すフローチャートを参照しながら説明する。 Next, the operation of the cell group observation system of the present embodiment will be described with reference to the flowchart shown in FIG.
まず、顕微鏡装置１によって複数の細胞群の画像が撮像され、その撮像画像が、細胞コロニー検出装置２の細胞画像取得部２０によって取得される。（Ｓ１０）。 First, images of a plurality of cell groups are imaged by the microscope device 1, and the imaged images are acquired by the cell image acquisition unit 20 of the cell colony detection device 2. (S10).
細胞画像取得部２０によって取得された撮像画像は細胞群検出部２１に入力され、細胞群検出部２１は、撮像画像内に含まれる複数の細胞群を検出する（Ｓ１２）。 The captured image acquired by the cell image acquisition unit 20 is input to the cell group detection unit 21, and the cell group detection unit 21 detects a plurality of cell groups included in the captured image (S12).
細胞群検出部２１による複数の細胞群の検出結果は細胞群統合部２２に入力され、細胞群統合部２２は、細胞群間の距離を計測し、かつ各細胞群の成熟度を取得する（Ｓ１４，Ｓ１６）。そして、細胞群統合部２２は、細胞群間の距離および成熟度の差に基づいて、それらの細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定し、同一の細胞コロニーに属するものであると判定した場合には、それらの細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出する（Ｓ１８）。 The detection results of a plurality of cell groups by the cell group detection unit 21 are input to the cell group integration unit 22, and the cell group integration unit 22 measures the distance between the cell groups and obtains the degree of maturation of each cell group ( S14, S16). Then, the cell group integration unit 22 determines whether or not those cell groups belong to the same cell colony based on the difference in distance and maturity between the cell groups, and belongs to the same cell colony. When it is determined that the cells are ones, those cell groups are integrated and detected as one cell colony (S18).
細胞群統合部２２における細胞コロニーの検出結果は表示制御部２３に出力され、表示制御部２３は、細胞コロニーの検出結果を表示装置３に表示させる（Ｓ２０）。 The detection result of the cell colony in the cell group integration unit 22 is output to the display control unit 23, and the display control unit 23 causes the display device 3 to display the detection result of the cell colony (S20).
上記実施形態の細胞コロニー観察システムによれば、撮像画像内に含まれる複数の細胞からなる細胞群を検出し、その複数の細胞群の間の距離と複数の細胞群のそれぞれの成熟度に基づいて、複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定し、同一の細胞コロニーに属するものであると判定した場合に、その複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出するようにしたので、複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属するか否かを高精度に判定することができ、細胞コロニーの検出精度を向上することができる。 According to the cell colony observation system of the above embodiment, a cell group consisting of a plurality of cells contained in a captured image is detected, and the distance between the plurality of cell groups and the maturity of each of the plurality of cell groups are detected. If it is determined that a plurality of cell groups belong to the same cell colony and it is determined that they belong to the same cell colony, the plurality of cell groups are integrated to form one cell. Since detection is performed as a colony, it can be determined with high accuracy whether or not a plurality of cell groups belong to the same cell colony, and the detection accuracy of the cell colony can be improved.
なお、上記実施形態においては、培養対象の細胞が単一の種類であることを想定して説明したが、複数種類の細胞群が共培養される状態も考えられる。たとえば、造血幹細胞を培養した場合、赤芽球系の細胞と骨髄芽球系の細胞とが共培養される状態が考えられる。このような場合、たとえば、上述したように細胞群の成熟度として平均Ｒ／Ｂ比率を用いた場合、赤芽球系の細胞群と骨髄芽球系の細胞群とで、平均Ｒ／Ｂ比率の差が小さい場合が起こり得る。 In addition, in the said embodiment, although the cell of culture object was demonstrated supposing that it is single type, the state where several types of cell groups are cocultured is also considered. For example, when hematopoietic stem cells are cultured, it may be considered that erythroid cells and myeloblast cells are co-cultured. In such a case, for example, when the average R / B ratio is used as the degree of maturation of the cell group as described above, the average R / B ratio between the erythroblast cell group and the myeloblast cell group There may be a small difference in
具体的には、たとえば骨髄芽球系の細胞群Ｒ１〜Ｒ３の平均Ｒ／Ｂ比率が図８に示す大きさであり、赤芽球系の細胞群Ｒ４〜Ｒ６の平均Ｒ／Ｂ比率が図８に示す大きさである場合、骨髄芽球系の細胞群Ｒ３と赤芽球系の細胞群Ｒ４とは、それぞれ異なる種類の細胞群であるにも関わらず、平均Ｒ／Ｂ比率の差が小さい。したがって、骨髄芽球系の細胞群Ｒ３と赤芽球系の細胞群Ｒ４の平均Ｒ／Ｂ比率の差とこれらの細胞群間の距離とに基づいて同一の細胞コロニーに属する細胞群であるか否かを判定した場合、これらの細胞群間の距離が閾値以下である場合には、これらの細胞群は同一の細胞コロニーに属するものであると判定され、誤判定を発生してしまう。 Specifically, for example, the average R / B ratio of cell groups R1 to R3 of bone marrow blast line is the size shown in FIG. 8, and the average R / B ratio of cell groups R4 to R6 of erythroblast line is a figure. In the case of the size shown in FIG. 8, although the cell group R3 of the myeloblast line and the cell group R4 of the erythroblast line are different cell groups, the difference in average R / B ratio is small. Therefore, is it a cell group belonging to the same cell colony based on the difference between the average R / B ratio of cell group R3 of myeloblast lineage and cell group R4 of erythroblast lineage and the distance between these cell groups? When it is determined whether or not the distance between these cell groups is equal to or less than the threshold value, it is determined that these cell groups belong to the same cell colony and an erroneous determination occurs.
そこで、このような誤判定を防止するため、細胞群統合部２２が、細胞群間の距離および成熟度の差に基づく判定の前に、複数の細胞群が同じ種類の細胞群であるか否かの判定を行うようにしてもよい。具体的には、各細胞群の平均Ｒ／Ｂ比率と予め設定された平均Ｒ／Ｂ比率の閾値とを比較し、平均Ｒ／Ｂ比率が閾値以上である細胞群は、赤芽球系の細胞群であると判定し、平均Ｒ／Ｂ比率が閾値未満である細胞群は、骨髄芽球系の細胞群であると判定する。 Therefore, in order to prevent such an erroneous determination, before the determination based on the distance between the cell groups and the difference in the degree of maturation, the cell group integration unit 22 determines whether the plurality of cell groups are the same type of cell group or not. It is also possible to make a decision on Specifically, the average R / B ratio of each cell group is compared with a preset average R / B ratio threshold value, and a cell group whose average R / B ratio is equal to or greater than the threshold value is a erythroid cell type A cell group determined to be a cell group and having an average R / B ratio less than the threshold value is determined to be a myeloblast cell group.
そして、その後、上記実施形態と同様にして、細胞群間の距離および成熟度の差に基づく判定を行うが、この際、細胞群間の距離が距離閾値以下であり、かつ細胞群間の成熟度の差が成熟度閾値以下であったとしても、異なる種類の細胞群であると既に判定されている細胞群同士は、同一の細胞コロニーに属するものではないと判定するようにすればよい。このような判定を行うことによって、上述したような骨髄芽球系の細胞群Ｒ３と赤芽球系の細胞群Ｒ４の誤判定を防止することができる。なお、上記のようにして各細胞群の種類が判定された後は、赤芽球系の細胞群については成熟度として平均Ｒ／Ｂ比率を用い、骨髄芽球系の細胞群については成熟度として輝度を用いて、同一の細胞コロニーに属するものであるか否かを判定するようにすればよい。 After that, determination is performed based on the difference between the distance between the cell groups and the degree of maturation in the same manner as in the above embodiment, wherein the distance between the cell groups is equal to or less than the distance threshold and the maturation between the cell groups is performed. Even if the difference in degree is less than or equal to the maturity threshold, it may be determined that the cell groups which have already been determined to be different types of cell groups do not belong to the same cell colony. By performing such determination, it is possible to prevent erroneous determination of the cell group R3 of the myeloblast type and the cell group R4 of the erythroblast type as described above. In addition, after the type of each cell group is determined as described above, the average R / B ratio is used as the degree of maturation for erythroblast cells, and the degree of maturation for myeloblast cells The luminance may be used to determine whether the cell belongs to the same cell colony.
次に、上記実施形態の細胞コロニー検出装置２の細胞群検出部２１において、カーネル密度推定を用いた方法によって細胞群を検出する場合について説明する。 Next, a case where a cell group is detected by a method using kernel density estimation in the cell group detection unit 21 of the cell colony detection device 2 of the above embodiment will be described.
まず、撮像画像内における細胞群を検出する際、通常、細胞群は円形にまとまって形成される傾向にあるが、上述した赤芽球系の細胞群などの一部の細胞群は、細胞が散在して分布するため細胞群の輪郭が不明瞭である。具体的には、図９の上図に示すように、細胞が円形にひとまとまりに分布していない場合には、複数の細胞群の集まりなのか、１つの細胞群を形成するものであるのか不明瞭である。また、図９の下図に示すように、細胞群と推定される分布の周辺にまばらにしか細胞が分布していない場合にも、細胞群の輪郭が不明瞭である。特に、浮遊培養によって細胞を培養する場合に、細胞群の輪郭が不明瞭になることが多い。 First, when detecting a cell group in a captured image, the cell group usually tends to be formed in a circle, but some cell groups such as the erythroid cell group described above have cells Due to the sparse distribution, the outline of the cell group is unclear. Specifically, as shown in the upper drawing of FIG. 9, in the case where the cells are not distributed in a circle, it is a collection of a plurality of cell groups or one cell group is formed? It is unclear. Further, as shown in the lower part of FIG. 9, the outline of the cell group is unclear even when the cells are distributed sparsely around the distribution assumed to be the cell group. In particular, when culturing cells by suspension culture, the contours of cell groups often become unclear.
細胞群の輪郭が明瞭である場合、上述したようなパターンマッチングによる検出方法では、適切に細胞群を検出することが難しい場合がある。そこで、カーネル密度推定を用いた方法によって細胞群を検出すれば、上述したような輪郭が不明瞭な細胞群についても、高精度に検出することができる。以下、カーネル密度推定を用いた細胞群の検出方法について、具体的に説明する。 When the outline of the cell group is clear, it may be difficult to detect the cell group appropriately by the detection method by pattern matching as described above. Therefore, if a cell group is detected by a method using kernel density estimation, it is possible to detect with high accuracy even a cell group whose outline is unclear as described above. Hereinafter, a method of detecting a cell group using kernel density estimation will be specifically described.
まず、細胞群検出部２１は、撮像画像内に含まれる各細胞を表す画素をそれぞれ検出する。細胞を表す画素（以下、細胞画素という。）は、細胞群とともに培養容器に収容されている培養液を表す画素とは輝度値が異なるため、たとえば大津の２値化法を用いることによって検出する。図１０の上図は、検出された細胞画素の一例を示す図である。図１０の上図における黒い点のそれぞれが細胞画素である。 First, the cell group detection unit 21 detects pixels representing each cell included in a captured image. Pixels representing cells (hereinafter referred to as cell pixels) are detected by using, for example, the Otsu binarization method because the luminance value is different from the pixels representing the culture solution contained in the culture vessel together with the cell group. . The upper diagram of FIG. 10 shows an example of the detected cell pixel. Each of the black dots in the upper part of FIG. 10 is a cell pixel.
そして、細胞群検出部２１は、上述したようにして検出した各細胞画素について、その細胞画素を含む予め設定された範囲内の細胞画素数に基づいて、カーネル密度推定に用いられるバンド幅を細胞画素毎にそれぞれ設定し、その細胞画素毎に設定されたバンド幅および細胞画素毎に設定されたカーネル関数に基づいて確率密度関数を計算し、その計算した確率密度関数に基づいて、細胞画素を区分することによって、複数の細胞を複数の細胞群に区分する。以下、より具体的に説明する。 Then, for each cell pixel detected as described above, the cell group detection unit 21 determines the bandwidth used for kernel density estimation based on the number of cell pixels within a preset range including the cell pixel. The probability density function is calculated based on the bandwidth set for each cell pixel and the kernel function set for each cell pixel, and the cell pixel is calculated based on the calculated probability density function. By dividing, a plurality of cells are divided into a plurality of cell groups. The following more specifically describes.
まず、細胞群検出部２１は、各細胞画素について、その細胞画素を含む予め設定された範囲内の細胞画素数をそれぞれ算出する。具体的には、たとえば、図１１に示すように、細胞画素ＣＰの位置を中心として所定の半径の円内に存在する近傍細胞画素ＮＰの数を算出する。図１１に示す例の場合、円内に存在する近傍細胞画素ＮＰは３個である。なお、予め設定された範囲内（図１１の例では円内）に存在する近傍細胞画素ＮＰの数のことを、以下、細胞画素密度という。細胞画素密度を算出する際に用いられる円の大きさは、ユーザが入力装置４を用いて任意に設定可能であるが、たとえば半径約０．６５ｍｍとすればよい。 First, the cell group detection unit 21 calculates, for each cell pixel, the number of cell pixels within a preset range including the cell pixel. Specifically, for example, as shown in FIG. 11, the number of neighboring cell pixels NP present in a circle of a predetermined radius centered on the position of the cell pixel CP is calculated. In the case of the example shown in FIG. 11, the number of neighboring cell pixels NP present in the circle is three. Hereinafter, the number of neighboring cell pixels NP existing in a preset range (in the circle in the example of FIG. 11) will be referred to as cell pixel density. The size of the circle used when calculating the cell pixel density can be arbitrarily set by the user using the input device 4, but may be, for example, about 0.65 mm in radius.
細胞画素密度が大きいほど中心の細胞画素ＣＰの近傍に同じ細胞群に属する細胞画素が集中して分布していると推定される。また、逆に、細胞画素密度が小さいほど中心の細胞画素ＣＰから広い範囲に亘って同じ細胞群に属する細胞画素が分布していると推定される。 It is estimated that cell pixels belonging to the same cell group are concentrated and distributed in the vicinity of the central cell pixel CP as the cell pixel density is higher. Also, conversely, it is estimated that as the cell pixel density is smaller, cell pixels belonging to the same cell group are distributed over a wide range from the central cell pixel CP.
そこで、細胞群検出部２１は、各細胞画素に算出された細胞画素密度に基づいて、各細胞画素に対して、カーネル密度推定に用いられるバンド幅を設定する。具体的には、細胞画素密度が大きいほど、つまり円内に存在する近傍細胞画素ＮＰが多いほどバンド幅を小さくし、細胞画素密度が小さいほど、つまり円内に存在する近傍細胞画素ＮＰが少ないほどバンド幅を大きくする。細胞群検出部２１には、上述したような細胞画素密度とバンド幅との対応関係が設定されたテーブルが予め記憶されており、細胞群検出部２１は、このテーブルを参照して各細胞画素のバンド幅を設定する。なお、細胞画素密度とバンド幅と対応関係については、目視による細胞群の区分結果と、細胞群検出部２１による細胞群の区分結果との差が最小となるように事前に算出するようにすればよい。 Therefore, the cell group detection unit 21 sets the bandwidth used for kernel density estimation for each cell pixel based on the cell pixel density calculated for each cell pixel. Specifically, as the cell pixel density is larger, that is, as the number of neighboring cell pixels NP existing in the circle is smaller, the bandwidth is decreased, and as the cell pixel density is smaller, ie, the number of neighboring cell pixels NP existing in the circle is smaller Increase the bandwidth as much. The cell group detection unit 21 stores in advance a table in which the correspondence between the cell pixel density and the bandwidth as described above is set, and the cell group detection unit 21 refers to this table to refer to each cell pixel. Set the bandwidth of The correspondence between the cell pixel density and the band width is calculated in advance so that the difference between the classification result of the cell group by visual observation and the classification result of the cell group by the cell group detection unit 21 is minimized. Just do it.
次に、細胞群検出部２１は、上述したようにして細胞画素毎に設定されたバンド幅と、細胞画素毎に設定されたカーネル関数に基づいて確率密度関数を計算する。カーネル関数の形状としては、たとえば計算が容易なガウシアンカーネルを用いることが望ましい。ただし、その他のカーネルを用いるようにしてもよい。 Next, the cell group detection unit 21 calculates the probability density function based on the bandwidth set for each cell pixel and the kernel function set for each cell pixel as described above. As the shape of the kernel function, for example, it is desirable to use a Gaussian kernel which is easy to calculate. However, other kernels may be used.
図１２は、細胞画素毎に設定されたバンド幅およびカーネル関数を模式的に示す図である。図１２に示す白丸Ｐ１〜Ｐ７が細胞画素を示しており、各細胞画素Ｐ１〜Ｐ７に対応して示されているＦ１〜Ｆ８が、各細胞画素Ｐ１〜Ｐ７に設定されたカーネル関数である。なお、上述したバンド幅とは、カーネル関数の広がりの幅であり、図１２に示す例では、各細胞画素Ｐ１〜Ｐ７に設定されるバンド幅は全て同じにしてあるが、実際には、上述したようにバンド幅は、各細胞画素のそれぞれの細胞画素密度に応じて異なる。また、図１２では、１次元に配列された複数の細胞画素に対してバンド幅およびカーネル関数を設定した図を示しているが、実際には、図１０の上図に示すような２次元状に配列された複数の細胞画素に対してバンド幅およびカーネル関数が設定される。 FIG. 12 schematically shows the bandwidth and kernel function set for each cell pixel. White circles P1 to P7 illustrated in FIG. 12 indicate cell pixels, and F1 to F8 illustrated corresponding to the cell pixels P1 to P7 are kernel functions set for the cell pixels P1 to P7. Note that the above-mentioned bandwidth is the width of the spread of the kernel function, and in the example shown in FIG. 12, the bandwidths set for each of the cell pixels P1 to P7 are all the same. As done, the bandwidth varies depending on the respective cell pixel density of each cell pixel. Further, FIG. 12 shows a diagram in which the bandwidth and the kernel function are set for a plurality of cell pixels arranged in one dimension, but actually, a two-dimensional shape as shown in the upper diagram of FIG. The bandwidth and kernel function are set for a plurality of cell pixels arranged in.
次いで、細胞群検出部２１は、上述したようにして各細胞画素に設定されたカーネル関数に基づいて、カーネル密度推定法を用いて確率密度関数を計算する。具体的には、下式に基づいて、確率密度関数ｆ（ｘ）を計算する。式中のｎは細胞画素の数であり、ｈはカーネル幅であり、ｘｉは各細胞画素の座標であり、Ｋ（ｘ）はカーネル関数である。図４に示すＦ８は、各細胞画素Ｐ１〜Ｐ７に対して設定されたカーネル関数Ｆ１〜Ｆ７に基づいて算出された確率密度関数を模式的に示したものである。また、図１０に示すＦ１０は、図１０の上図に示す撮像画像に対して算出された確率密度関数を模式的に示したものである。 Next, the cell group detection unit 21 calculates a probability density function using a kernel density estimation method based on the kernel function set for each cell pixel as described above. Specifically, the probability density function f (x) is calculated based on the following equation. In the formula, n is the number of cell pixels, h is the kernel width, x i is the coordinates of each cell pixel, and K (x) is the kernel function. F8 shown in FIG. 4 schematically shows the probability density function calculated based on the kernel functions F1 to F7 set for the respective cell pixels P1 to P7. Further, F10 shown in FIG. 10 schematically shows the probability density function calculated for the captured image shown in the upper part of FIG.
次に、細胞群検出部２１は、上式に基づいて計算した確率密度関数に基づいて、複数の細胞画素を区分することによって、撮像画像内に含まれる複数の細胞を複数の細胞群に区分する。具体的には、細胞群検出部２１は、図１０や図１２に示す確率密度関数上において、同じ山に属する細胞画素が同じ細胞群に属するようにクラスタリングすることによって、複数の細胞群に区分する。クラスタリングの方法としては、たとえばミーンシフト法を用いることができる。具体的には、下式を用いて行うことができる。 Next, the cell group detection unit 21 divides the plurality of cells contained in the captured image into a plurality of cell groups by dividing the plurality of cell pixels based on the probability density function calculated based on the above equation. Do. Specifically, the cell group detection unit 21 classifies cells into a plurality of cell groups by clustering so that cell pixels belonging to the same mountain belong to the same cell group on the probability density function shown in FIGS. 10 and 12. Do. As a method of clustering, for example, a mean shift method can be used. Specifically, it can be performed using the following formula.
上式のＳＧ（ｘ）を算出することによって、各細胞画素は、カーネル密度推定結果の確率密度関数上の山を登る。そして、収束するまでＳＧ（ｘ）を計算することによって、各細胞画素は、確率密度関数上の極値に達する。同じ極値に達した細胞画素同士は、確率密度関数上で同じ山に属するため、これらの細胞画素が同じ細胞群に属するものとしてクラスタリングする。なお、ミーンシフト法によるクラスタリングは、既に公知であるため、詳細な説明は省略する。 By calculating S G (x) in the above equation, each cell pixel climbs a mountain on the probability density function of the kernel density estimation result. Then, by computing S G (x) until convergence, each cell pixel reaches an extremum on the probability density function. Since the cell pixels that have reached the same extreme value belong to the same mountain on the probability density function, these cell pixels are clustered as belonging to the same cell group. In addition, since the clustering by a mean shift method is already known, detailed description is abbreviate | omitted.
図１３は、図１０に示した撮像画像内における複数の細胞画素を上述したミーンシフト法によってクラスタリングした結果を模式的に示す図である。図１３に示すＦ１０は、図２に示した確率密度関数Ｆ１０であり、図１３に示すＤ１〜Ｄ５は、確率密度関数上でクラスタリングされた各山を示したものである。そして、図１３の上図におけるＣ１〜Ｃ５は、複数の細胞画素をクラスタリングした結果を示しており、Ｃ１〜Ｃ５のそれぞれの範囲に含まれる細胞画素が、同じ細胞群に属する細胞画素である。具体的には、確率密度関数の山Ｄ１に属する細胞画素が範囲Ｃ１で示されており、山Ｄ２に属する細胞画素が範囲Ｃ２で示されており、山Ｄ３に属する細胞画素が範囲Ｃ３で示されており、山Ｄ４に属する細胞画素が範囲Ｃ４で示されており、山Ｄ５に属する細胞画素が範囲Ｃ５で示されている。すなわち、点線で示される範囲Ｃ１〜Ｃ５の各範囲が、１つの細胞群に属する細胞が分布する範囲を示している。 FIG. 13 is a view schematically showing the result of clustering a plurality of cell pixels in the captured image shown in FIG. 10 by the mean shift method described above. F10 shown in FIG. 13 is the probability density function F10 shown in FIG. 2, and D1 to D5 shown in FIG. 13 show the peaks clustered on the probability density function. And C1-C5 in the upper figure of FIG. 13 have shown the result of having clustered several cell pixels, and the cell pixel contained in each range of C1-C5 is a cell pixel which belongs to the same cell group. Specifically, the cell pixels belonging to the mountain D1 of the probability density function are indicated by the range C1, the cell pixels belonging to the mountain D2 are indicated by the range C2, and the cell pixels belonging to the mountain D3 are indicated by the range C3. The cell pixels belonging to the mountain D4 are indicated by the range C4, and the cell pixels belonging to the mountain D5 are indicated by the range C5. That is, each of the ranges C1 to C5 indicated by dotted lines indicates the range in which the cells belonging to one cell group are distributed.
上記のようにカーネル密度推定を用いた方法によって細胞群を検出することによって、細胞群を高精度に検出することができる。 The cell group can be detected with high accuracy by detecting the cell group by the method using kernel density estimation as described above.
１ 顕微鏡装置
２ 細胞コロニー検出装置
３ 表示装置
４ 入力装置
２０ 細胞画像取得部
２１ 細胞群検出部
２２ 細胞群統合部
２３ 表示制御部
Reference Signs List 1 microscope device 2 cell colony detection device 3 display device 4 input device 20 cell image acquisition unit 21 cell group detection unit 22 cell group integration unit 23 display control unit
Claims (13)
前記撮像画像内に含まれる複数の細胞からなる細胞群を、前記撮像画像に基づいて複数検出する細胞群検出部と、
前記細胞群検出部により検出された複数の細胞群の間の距離と前記複数の細胞群のそれぞれの成熟度合いを示す成熟度に基づいて、前記複数の細胞群の間の距離が予め設定された距離閾値以下で、かつ前記複数の細胞群の間の前記成熟度の差が予め設定された成熟度閾値以下である場合に、前記複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属すると判定して、前記複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出する細胞群統合部と、
を備え、
前記成熟度は、前記細胞が幹細胞の場合には、前記複数の細胞群各々の形状の変化の特徴量であることを特徴とする細胞コロニー検出装置。 A cell image acquisition unit that acquires a captured image obtained by imaging a plurality of cells;
A cell group detection unit that detects a plurality of cell groups composed of a plurality of cells included in the captured image based on the captured image;
The distance between the plurality of cell groups is previously set based on the distance between the plurality of cell groups detected by the cell group detection unit and the degree of maturity indicating the degree of maturation of each of the plurality of cell groups If the difference between the plurality of cell groups is less than or equal to the distance threshold and the difference in the degree of maturation between the plurality of cell groups is less than or equal to a preset maturity threshold, it is determined that the plurality of cell groups belong to the same cell colony; A cell group integration unit which integrates the plurality of cell groups and detects them as one cell colony;
Equipped with
The cell colony detection apparatus, wherein the degree of maturity is a feature of change in shape of each of the plurality of cell groups when the cells are stem cells.
前記撮像画像内に含まれる複数の細胞からなる細胞群を、前記撮像画像に基づいて複数検出する細胞群検出部と、
前記細胞群検出部により検出された複数の細胞群の間の距離と前記複数の細胞群のそれぞれの成熟度合いを示す成熟度に基づいて、前記複数の細胞群の間の距離と前記複数の細胞群の成熟度の差の線形和もしくは非線形和が閾値以下である場合に、前記複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属すると判定して、前記複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出する細胞群統合部と、
を備え、
前記成熟度は、前記細胞が幹細胞の場合には、前記複数の細胞群各々の形状の変化の特徴量であることを特徴とする細胞コロニー検出装置。 A cell image acquisition unit that acquires a captured image obtained by imaging a plurality of cells;
A cell group detection unit that detects a plurality of cell groups composed of a plurality of cells included in the captured image based on the captured image;
The distance between the plurality of cell groups and the plurality of cells based on the distance between the plurality of cell groups detected by the cell group detection unit and the degree of maturity indicating the degree of maturation of the plurality of cell groups When the linear sum or non-linear sum of the difference in the degree of maturation of the groups is less than the threshold value, it is determined that the plurality of cell groups belong to the same cell colony, and the plurality of cell groups are integrated to form one cell colony Cell group integration unit to be detected as
Equipped with
The cell colony detection apparatus, wherein the degree of maturity is a feature of change in shape of each of the plurality of cell groups when the cells are stem cells.
前記撮像画像内に含まれる複数の細胞からなる細胞群を、前記撮像画像に基づいて複数検出し、
複数の細胞群の間の距離と前記複数の細胞群のそれぞれの成熟度合いを示す成熟度であって、前記細胞が幹細胞の場合には、前記複数の細胞群各々の形状の変化の特徴量である成熟度に基づいて、前記複数の細胞群の間の距離が予め設定された距離閾値以下で、かつ前記複数の細胞群の間の前記成熟度の差が予め設定された成熟度閾値以下である場合に、前記複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属すると判定して、前記複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出することを特徴とする細胞コロニー検出方法。 Acquire a captured image obtained by imaging a plurality of cells,
A plurality of cell groups composed of a plurality of cells contained in the captured image are detected based on the captured image;
The degree of maturity indicating the distance between a plurality of cell groups and the degree of maturation of each of the plurality of cell groups, and in the case where the cells are stem cells, the feature value of the change in shape of each of the plurality of cell groups Based on a certain degree of maturity, the distance between the plurality of cell groups is less than or equal to a predetermined distance threshold, and the difference in the degree of maturity among the plurality of cell groups is less than or equal to a predetermined maturity threshold A method for detecting a cell colony, characterized in that, in some cases, the plurality of cell groups are determined to belong to the same cell colony, and the plurality of cell groups are integrated and detected as one cell colony.
前記撮像画像内に含まれる複数の細胞からなる細胞群を、前記撮像画像に基づいて複数検出し、
複数の細胞群の間の距離と前記複数の細胞群のそれぞれの成熟度合いを示す成熟度であって、前記細胞が幹細胞の場合には、前記複数の細胞群各々の形状の変化の特徴量である成熟度に基づいて、前記複数の細胞群の間の距離と前記複数の細胞群の成熟度の差の線形和もしくは非線形和が閾値以下である場合に、前記複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属すると判定して、前記複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出することを特徴とする細胞コロニー検出方法。 Acquire a captured image obtained by imaging a plurality of cells,
A plurality of cell groups composed of a plurality of cells contained in the captured image are detected based on the captured image;
The degree of maturity indicating the distance between a plurality of cell groups and the degree of maturation of each of the plurality of cell groups, and in the case where the cells are stem cells, the feature value of the change in shape of each of the plurality of cell groups The plurality of cell groups are identical if the linear sum or nonlinear sum of the difference between the plurality of cell groups and the maturity degree of the plurality of cell groups is less than or equal to a threshold value based on a certain degree of maturity. A cell colony detection method comprising determining that the cells belong to a colony and integrating the plurality of cell groups to detect as one cell colony.
前記撮像画像内に含まれる複数の細胞からなる細胞群を、前記撮像画像に基づいて複数検出する細胞群検出部と、
前記細胞群検出部により検出された複数の細胞群の間の距離と前記複数の細胞群のそれぞれの成熟度合いを示す成熟度であって、前記細胞が幹細胞の場合には、前記複数の細胞群各々の形状の変化の特徴量である成熟度に基づいて、前記複数の細胞群の間の距離が予め設定された距離閾値以下で、かつ前記複数の細胞群の間の前記成熟度の差が予め設定された成熟度閾値以下である場合に、前記複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属すると判定して、前記複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出する細胞群統合部としてコンピュータを機能させることを特徴とする細胞コロニー検出プログラム。 A cell image acquisition unit that acquires a captured image obtained by imaging a plurality of cells;
A cell group detection unit that detects a plurality of cell groups composed of a plurality of cells included in the captured image based on the captured image;
The degree of maturity indicating the distance between the plurality of cell groups detected by the cell group detection unit and the degree of maturity of each of the plurality of cell groups, and when the cells are stem cells, the plurality of cell groups The difference in the degree of maturation between the plurality of cell groups is less than or equal to a predetermined distance threshold based on the degree of maturity which is a feature of the change in each shape. A cell group integration unit that determines that the plurality of cell groups belong to the same cell colony when they are less than or equal to a preset maturity threshold, and integrates the plurality of cell groups to detect as one cell colony A cell colony detection program characterized by causing a computer to function.
前記撮像画像内に含まれる複数の細胞からなる細胞群を、前記撮像画像に基づいて複数検出する細胞群検出部と、
前記細胞群検出部により検出された複数の細胞群の間の距離と前記複数の細胞群のそれぞれの成熟度合いを示す成熟度であって、前記細胞が幹細胞の場合には、前記複数の細胞群各々の形状の変化の特徴量である成熟度に基づいて、前記複数の細胞群の間の距離と前記複数の細胞群の成熟度の差の線形和もしくは非線形和が閾値以下である場合に、前記複数の細胞群が同一の細胞コロニーに属すると判定して、前記複数の細胞群を統合して１つの細胞コロニーとして検出する細胞群統合部としてコンピュータを機能させることを特徴とする細胞コロニー検出プログラム。 A cell image acquisition unit that acquires a captured image obtained by imaging a plurality of cells;
A cell group detection unit that detects a plurality of cell groups composed of a plurality of cells included in the captured image based on the captured image;
The degree of maturity indicating the distance between the plurality of cell groups detected by the cell group detection unit and the degree of maturity of each of the plurality of cell groups, and when the cells are stem cells, the plurality of cell groups When the linear sum or non-linear sum of the difference between the distance between the plurality of cell groups and the degree of maturity of the plurality of cell groups is less than or equal to a threshold based on the degree of maturity that is a feature of the change in each shape. A cell colony detection characterized by causing a computer to function as a cell group integration unit that determines that the plurality of cell groups belong to the same cell colony, and integrates the plurality of cell groups to detect as one cell colony. program.
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