JP2019074427A - Peak identification method using peak width inclusion method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、クロマトグラフィでの成分同定を、ピークの特定の時間範囲を示す指標(時間)を基に行い、同定精度を向上させる方法に関するものである。 The present invention relates to a method of performing component identification in chromatography based on an index (time) indicating a specific time range of a peak to improve identification accuracy.
クロマトグラフィでは、溶離液をカラムに送液する送液ポンプが不安定になる等の装置上の問題、室温の変動などによる測定環境上の問題、成分の濃度が変化することによりピーク形状が変化するという試料濃度の問題等により、同じ成分であっても必ずしも同じ溶出時間にならないことがある。このような溶出時間の変動があっても、確実に同定を行うために、基準となる溶出時間の許容幅を広げることも考えられるが、一定程度正確に同定できる確率が高くなる一方、不純物由来のピークを目的の成分として誤同定してしまうリスクも同時に高まることになる。 In chromatography, equipment problems such as instability of the liquid feed pump that sends the eluent to the column, measurement environmental problems due to fluctuations in room temperature, etc. Peak shape changes due to changes in the concentration of components Due to the problem of sample concentration, etc., the same components may not necessarily have the same elution time. Even if there is such a variation in elution time, it is conceivable to widen the tolerance of the standard elution time in order to perform identification reliably, but the probability of being able to accurately identify to a certain extent is high, while the origin of impurities At the same time, the risk of misidentifying the peak of the target as a target component is also increased.
そこで、一般的な溶出時間による同定法にピーク幅による同定を併用する方法が考案されている(例えば、特許文献1参照)。しかしながら、この方法では溶出条件の変動などによる誤同定は防止できるが、試料濃度が変化することによりピーク形状が変化し、それにより溶出時間が変動することで、本来同定するべきピークが同定できなくなる現象への対応はできなかった。 Therefore, a method has been devised in which identification by peak width is used in combination with identification by general elution time (see, for example, Patent Document 1). However, although this method can prevent misidentification due to fluctuations in elution conditions, etc., the peak shape changes when the sample concentration changes, and the elution time fluctuates, which makes it impossible to identify the peak that should be identified. I could not cope with the phenomenon.
本発明の課題は、試料を分析した際の溶出ピークに、リーディングやテーリングなどが発生し非対称になるなどの、ピーク形状変化が発生した際にも対応できるピーク同定方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a peak identification method which can cope with occurrence of peak shape change, such as leading or tailing occurring in an elution peak when a sample is analyzed, resulting in asymmetry.
本発明者は、ピーク同定の基準を従来の溶出時間ではなく、クロマトグラム中の任意の点を基準点とし、ピークがその基準点から任意の高さ以上にある時間範囲をピーク幅とし、当該ピーク幅をピーク同定に用いることで、同定精度を向上させることができることを見出した。なお、本発明で言う「高さ」とは出力値=0の直線からの距離を指すものであり、マイナスの出力値に対しても適用される概念である。 The inventors set the peak identification standard not to the conventional elution time, but to an arbitrary point in the chromatogram as a reference point, and a time range in which the peak is an arbitrary height or more from the reference point is a peak width. By using peak width for peak identification, it discovered that identification accuracy could be improved. In the present invention, "height" refers to the distance from a straight line of output value = 0, and is a concept applied to negative output values.
すなわち本発明は、
クロマトグラフィによる試料の分析方法であって、
クロマトグラム中の任意の点を基準点、
前記基準点から任意の高さを指定高さ、
ピークが前記指定高さ以上にある時間範囲をピーク幅とし、
濃度が既知である特定成分の前記ピーク幅を基準ピーク幅として、
前記特定成分と同じ条件の基準点及び指定高さを選択した未知成分の前記ピーク幅が、前記基準ピーク幅に包含される又は前記基準ピーク幅を包含するときは、前記未知成分を前記特定成分と同定することを特徴とする分析方法に関するものである。
That is, the present invention
A method of analyzing a sample by chromatography
Reference point at any point in the chromatogram,
Designate any height from the reference point Height,
Let the time range where the peak is above the specified height be the peak width,
The peak width of a specific component whose concentration is known is taken as a reference peak width.
When the peak width of the unknown component for which the reference point under the same condition as the specific component and the designated height are selected is included in the reference peak width or includes the reference peak width, the unknown component is selected as the specific component The invention relates to an analysis method characterized by identifying
以下、本発明について詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
まず、本発明のピーク同定法の特徴である「ピーク幅」について説明する。「ピーク幅」とは、クロマトグラム中の任意の点を基準点、前記基準点から任意の高さを指定高さとするときに、ピークが前記指定高さ以上にある時間範囲を指すものである。具体的な算出方法としては、クロマトグラムに含まれるピークを時間微分などの手法を用いて検出し、同定すべきピーク曲線の立ち上がりが、基準点からの高さで指定された出力値を超えた点をピーク幅開始A点、同ピークの立下りが同基準点からの高さで指定された出力値を下回った点をピーク幅終了B点とした場合のA点とB点間の絶対時間の範囲を示す(図1)。一般的にはピークを発生させる成分の濃度が変化すると、ピークの形状が変化することにより、ピーク幅も変動する。 First, “peak width”, which is a feature of the peak identification method of the present invention, will be described. "Peak width" refers to a time range in which a peak is at or above the designated height, where any point in the chromatogram is a reference point, and an arbitrary height from the reference point is a designated height. . As a specific calculation method, the peak included in the chromatogram is detected using a method such as time differentiation, and the rising of the peak curve to be identified exceeds the output value specified by the height from the reference point Absolute time between point A and point B, where peak width start A point and peak fall lower than output value specified by height from same reference point as peak width end B point Range (Figure 1). Generally, when the concentration of the component that generates the peak changes, the peak width also changes due to the change in the shape of the peak.
本発明における基準点は、クロマトグラム中のピーク開始点又はピーク終了点、クロマトグラムの開始点又は終了点、クロマトグラム中でピークが存在しない安定点から選択することが好ましいが、固定点、クロマトグラム中でユーザーが任意に指定した点などでも問題はない。ベースラインがドリフトしている場合の基準点は、ピーク開始点又はピーク終了点を選択し、ピーク幅を取得することが望ましい(図2)。試料の濃度が高いなどの理由により2つ以上のピークが不分離となった場合、前半のピークのピーク幅終了B点と後半のピークのピーク幅開始A点が2ピーク間の谷となる時間で同一としてもよく(図3)、各ピークの指定高さを2ピーク間の谷となっている出力値よりも大きい値を設定してもよい(図4)。一方で不分離ピークとなっている場合でも、波形分離等のデータ処理にて各ピークが取得できている場合は、不分離点の高さに依らずピーク毎に単一のピークとしてピーク幅を取得することができる(図5)。 The reference point in the present invention is preferably selected from the peak start point or peak end point in the chromatogram, the start point or end point of the chromatogram, and the stable point where no peak is present in the chromatogram. There is no problem even if the user arbitrarily specified in the program. When the baseline is drifting, it is desirable to select the peak start point or peak end point and obtain the peak width (FIG. 2). When two or more peaks are not separated because the sample concentration is high, etc., the time when the peak width end point B of the first half peak and the peak width start A point of the second half peak become a valley between two peaks The designated height of each peak may be set to a value larger than the output value of the valley between the two peaks (FIG. 4). On the other hand, when each peak can be acquired by data processing such as waveform separation, even if the peak is not separated, the peak width is set as a single peak for each peak regardless of the height of the unseparated point. It can be acquired (Figure 5).
本発明における指定高さは、クロマトグラムに含まれる測定対象とする各ピーク幅が取得できる値となるように任意に設定すればよい。つまり、指定高さの設定は、ピーク幅を取得するピークの出力値が、クロマトグラムのノイズレベルよりは高い値であり、測定対象とする成分の下限濃度の出力値よりは低い値となるように設定することが望ましい。指定高さは、すべての成分で同じ値を用いても良いが、検量範囲等の違いなどにより、成分毎に異なる値を設定してもよい。例えば、巨大ピークの後方に出現する微小な目的ピークがショルダーピークとなった場合でも、異なる指定高さを用いることにより、巨大ピークと微小ピークのピーク幅を取得することができる(図6)。 The designated height in the present invention may be arbitrarily set such that each peak width to be measured included in the chromatogram can be obtained. That is, in the setting of the designated height, the output value of the peak for acquiring the peak width is higher than the noise level of the chromatogram and lower than the output value of the lower limit concentration of the component to be measured. It is desirable to set to. The designated height may use the same value for all the components, but different values may be set for each component depending on the difference in calibration range and the like. For example, even when a minute target peak appearing behind a huge peak becomes a shoulder peak, peak widths of the huge peak and the minute peak can be obtained by using different designated heights (FIG. 6).
次に、「ピーク幅」を用いたピーク同定の方法について説明する。最初に、含有成分が既知である標準試料のクロマトグラムを取得し、各ピークのピーク幅と、指定高さと、該当する成分の関連を同定条件として作成し、特定成分の基準ピーク幅と定める。次に、未知試料から得られたクロマトグラムのピークについて、標準試料と同じ条件の基準点及び指定高さを選択して得られるピーク幅が、基準ピーク幅に包含されるか、基準ピーク幅を包含する場合はピーク成分を特定成分と同定し、その他の場合は成分不明のピークとして取り扱う(図7)。指定高さをピーク毎に変える場合は、同定条件の指定高さを成分毎に異なる値に設定すればよい。 Next, a method of peak identification using “peak width” will be described. First, a chromatogram of a standard sample whose content is known is acquired, and the relationship between the peak width of each peak, the designated height, and the corresponding component is created as an identification condition, and defined as the reference peak width of the specific component. Next, for the peak of the chromatogram obtained from the unknown sample, whether the peak width obtained by selecting the reference point under the same conditions as the standard sample and the designated height is included in the reference peak width or the reference peak width When included, the peak component is identified as a specific component, otherwise treated as a peak of unknown component (FIG. 7). When the designated height is changed for each peak, the designated height of the identification condition may be set to a different value for each component.
図8には表1に記載した4条件での同定基準を示した。条件Aのピーク幅は基準ピーク幅に包含されるために同定される。条件B、Cのピーク幅は基準ピーク幅に包含されることも、基準ピーク幅を包含することもないために同定されない。条件Dのピーク幅は基準ピーク幅を包含するために同定される。 The identification criteria under the four conditions described in Table 1 are shown in FIG. The peak width of condition A is identified to be included in the reference peak width. The peak widths of the conditions B and C are not identified because they are neither included in the reference peak width nor included in the reference peak width. The peak width of condition D is identified to include the reference peak width.
しかしながら、同一の分析条件で同一の試料を測定したにもかかわらず、溶離液の性状変化や外部環境変化などによってピーク溶出時間に変動が生じた場合は、同一成分であってもピーク幅が変わる可能性がある。そのため、ピーク幅の誤差を考慮して、任意の比率で基準ピーク幅を伸長及び短縮し、伸長された基準ピーク幅に包含される又は短縮された基準ピーク幅を包含するかどうかでピークの同定を行うことが好ましい。図9a、bには基準ピーク幅を任意の比率で伸長及び短縮した場合の同定条件を示した。条件Eは通常の基準ピーク幅の場合は基準ピーク幅を包含することも、基準ピーク幅に包含されることもないが、短縮された基準ピーク幅を包含するために同定される。条件Fは通常の基準ピーク幅の場合は基準ピーク幅を包含することも、基準ピーク幅に包含されることもないが、伸長された基準ピーク幅に包含されるために同定される。 However, although the same sample was measured under the same analysis conditions, if the peak elution time fluctuates due to changes in the properties of the eluent or changes in the external environment, the peak width changes even if the same component is used. there is a possibility. Therefore, in consideration of the error of the peak width, the reference peak width is extended and shortened at an arbitrary ratio, and the identification of the peak whether or not the extended reference peak width includes or is included in the shortened reference peak width It is preferable to FIGS. 9a and 9b show identification conditions when the reference peak width is extended and shortened at an arbitrary ratio. Condition E does not include the reference peak width in the case of the normal reference peak width, nor is it included in the reference peak width, but is identified to include the shortened reference peak width. The condition F does not include the reference peak width in the case of the normal reference peak width, nor is it included in the reference peak width, but is identified to be included in the extended reference peak width.
前述した比率は同定条件に含めることができ、絶対時間による指定や、ピークの開始時間や終了時間の割合、ピーク幅開始A点や終了B点の割合などで指定しても良く、ピーク幅開始A点と終了B点で別の指定方法を用いても良い。また、ピーク毎に別々の設定基準を用いて指定しても良い。 The ratio described above can be included in the identification condition, and may be specified by an absolute time, a ratio of peak start time or end time, or a ratio of peak width start A point or end B point, peak width start Another designation method may be used at the point A and the point B at the end. Also, each peak may be designated using different setting criteria.
また、ピーク幅を用いて同定を行う本発明は、従来の溶出時間を用いた同定方法と併用することが可能である。つまり、巨大ピークの後方に出現する微小な目的ピークがショルダーピークとなり、かつ微小ピークが正規分布様のピークである場合などで、指定高さの設定が困難である場合などで併用を行うことが望ましい。 Further, the present invention of performing identification using peak width can be used in combination with a conventional identification method using elution time. That is, when the minute target peak appearing behind the huge peak is a shoulder peak and the minute peak is a normal distribution-like peak, the combination may be performed when the setting of the designated height is difficult. desirable.
上述した方法で、ピーク形状の変化に伴う「ピーク幅」の変動を、擬似クロマトグラムを基に説明する。なお、擬似クロマトグラムは、非対称の分布関数である、下記のジョンソンSU関数を用いて作成したものである。 In the method described above, the variation of the “peak width” accompanying the change of the peak shape will be described based on the pseudo chromatogram. In addition, a pseudo-chromatogram is created using the following Johnson SU function which is an asymmetric distribution function.
図10は正規分布様の基準ピーク、基準ピークよりもピーク面積値が小さい正規分布様のPeak A、基準ピークよりも面積値の大きい正規分布様のPeak B、Peak Aの立ち上がりがなだらかで立下りが急なリーディング状態のPeak C及びPeak Bの立ち上がりが急で立下りがなだらかなテーリング状態のPeak Dを示す。 Fig. 10 shows a standard peak like normal distribution, Peak A with normal area size smaller than the reference peak, Peak A with normal area size larger than the reference peak, Peak B with normal area like Area value larger than the reference peak, and Peak A with a gentle fall. Shows Peak D in the leading state Peak C and Peak B in the leading state, and Peak D in the tailing state where the falling is gentle.
表2に図10に示した6つのピークの溶出時間と、ピーク幅を示す。なお、基準点は出力値が0.0の点、指定高さは出力値が15.0となった点とした。 Table 2 shows the elution times and peak widths of the six peaks shown in FIG. The reference point is a point at which the output value is 0.0, and the designated height is a point at which the output value is 15.0.
表3に、溶出時間を用いて同定を行う従来法にて、±1.0%の同定許容幅を設定してピーク同定を行った結果を示す。正規分布様のPeak A及びPeak Bは、基準ピークと溶出時間に差が生じないために同定されるが、リーディング及びテーリングが発生しているPeak C及びPeak Dの溶出時間は同定許容幅を超えているため、同定されない。また、不純物ピークは正規分布様のピークであるが、溶出時間が同定許容幅を超えているため同定されない。このように溶出時間を用いた同定手法の場合、試料濃度の違いによりリーディング及びテーリングが生じた場合、同定許容幅の設定によっては同定されない場合がある。 Table 3 shows the results of peak identification performed by setting the identification tolerance of ± 1.0% in the conventional method of identification using elution time. Normal distribution-like Peak A and Peak B are identified because the elution time does not differ from the reference peak, but the elution time of Peak C and Peak D where reading and tailing are occurring exceeds the identification tolerance. Not identified. In addition, although the impurity peak is a normal distribution-like peak, it is not identified because the elution time exceeds the identification tolerance. Thus, in the case of the identification method using elution time, when reading and tailing occur due to the difference in sample concentration, the identification may not be made depending on the setting of the identification tolerance.
表4に、溶出時間を用いて同定を行う従来法にて、試料濃度の違いによりリーディング及びテーリングが生じた場合でも同定できるように、同定許容幅を±5.0%に設定した場合のピーク同定を行った結果を示す。Peak A〜Dのいずれも同定されているが、本来は同定されるべきではない不純物由来ピークも基準ピークと誤同定されていることがわかる。 Table 4 shows the peaks when the identification tolerance is set to ± 5.0% so that identification can be performed even if reading and tailing occur due to differences in sample concentration in the conventional method of identification using elution time It shows the results of identification. Although all of Peaks A to D have been identified, it can be seen that an impurity-derived peak that should not be originally identified is also incorrectly identified as a reference peak.
表5に、本発明におけるピーク幅を用いた方法にて、ピーク同定を行った結果を示す。Peak A、Cはピーク幅が基準ピーク幅に包含されるため同定され、Peak B、Dはピーク幅が基準ピーク幅を包含するため同定される。一方で同定されるべきではない不純物由来ピークは、基準ピーク幅を包含することも、基準ピーク幅に包含されることもないため同定されない。 Table 5 shows the results of peak identification in the method using the peak width in the present invention. Peaks A and C are identified because the peak width is included in the reference peak width, and Peaks B and D are identified because the peak width includes the reference peak width. On the other hand, an impurity-derived peak that should not be identified is not identified because it does not include the reference peak width or be included in the reference peak width.
表6に、基準ピーク幅を+1.0%の比率で伸長及び短縮した場合のピーク同定を行った結果を示す。許容ピーク幅を用いていない表5の結果と同じとなったことから、溶離液の性状変化や外部環境変化などによってピーク溶出時間に変動への対応として許容ピーク幅を設定した場合であっても、正しくピーク同定されることがわかる。 Table 6 shows the results of peak identification when the reference peak width was extended and shortened at a rate of + 1.0%. Since the result is the same as the results in Table 5 in which the allowable peak width is not used, even when the allowable peak width is set as the response to fluctuations in the peak elution time due to changes in the properties of the eluent or changes in the external environment. It can be seen that the peak is correctly identified.
以下、実施例によって本発明を具体的に示すが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but the present invention is not limited to these examples.
本発明の効果を、実際のクロマトグラムを用いて検証を行った。
図11に示す、液体クロマトグラムシステムを使用し、実際の測定を行った。システムは、溶媒脱気装置2、送液ポンプ3、試料注入部4、カラムオーブン6、サプレッサー7、電気伝導度検出器8、廃液ボトル9、及びデータ処理プログラム(IC−2010 Workstation)10で構成した(いずれも、東ソー(株)製)。分析カラム5としては、東ソー(株)製 TSKgel SuperIC−Anion HS(4.6 mmI.D.×10 cm)を使用し、標準物質の分離を行った。その他の条件は下記の通りである。
注入量:30 μL、カラム温度:40 ℃、流速:1.0 mL/min
溶離液:9.0 mmol/L NaHCO3 + 1.0 mmol/L Na2CO3
サンプル:陰イオン混合標準液(和光純薬工業(株) 製)
臭化物イオン 100 mg/L
塩化物イオン20 mg/L
フッ化物イオン 20 mg/L
亜硝酸イオン100 mg/L
硝酸イオン 100 mg/L
リン酸イオン200 mg/L
硫酸イオン 100 mg/L
希釈試料各種:
試料1 混合液 1/2希釈 希釈率:0.5
試料2 混合液 1/20希釈 希釈率:0.05
試料3 混合液 1/320希釈 希釈率:0.003125
The effect of the present invention was verified using an actual chromatogram.
The actual measurement was performed using a liquid chromatogram system as shown in FIG. The system comprises a
Injection volume: 30 μL, column temperature: 40 ° C, flow rate: 1.0 mL / min
Eluent: 9.0 mmol / L NaHCO 3 + 1.0 mmol / L Na 2 CO 3
Sample: anion mixed standard solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
Bromide ion 100 mg / L
Nitrite ion 100 mg / L
Nitrate ion 100 mg / L
Phosphate ion 200 mg / L
Sulfate ion 100 mg / L
Diluted samples:
図12は上記、試料1から3のクロマトグラムを重ねて表示した図である。
図13は上記クロマトグラムを重ねて表示した図のうち、8.5分〜10.0分前後に出現するリン酸イオンのピークをベースライン付近で拡大表示した図である。基準点を0.0μSとし、指定高さを0.1μSとした場合における試料3のリン酸イオンピーク幅を表す。
FIG. 12 is a diagram in which the chromatograms of
FIG. 13 is an enlarged view of the peak of phosphate ion appearing around 8.5 minutes to 10.0 minutes in the vicinity of the baseline among the drawings in which the chromatograms are superimposed and displayed. When the reference point is 0.0 μS and the designated height is 0.1 μS, the phosphate ion peak width of
次に、本発明の同定法の効果について検証を行った。
試料1を基準ピークとした場合の、溶出時間による同定条件を表7に、本発明を用いた同定条件を表8に示す。基準ピークの基準点を0.0μS、指定高さを0.1μSとした。
Next, the effects of the identification method of the present invention were verified.
Table 7 shows identification conditions by elution time when
これらの同定条件を試料2および試料3に適用し検証した結果を表9に示す。
The results obtained by applying and verifying these identification conditions to sample 2 and
これらの結果から、従来法である溶出時間を用いたピーク同定法では、濃度が異なる他の試料に対して同定できないピークが発生するが、本発明であれば100倍以上濃度が異なる試料に対しても正しくピーク同定できていることがわかる。 From these results, according to the conventional peak identification method using elution time, a peak which can not be identified occurs to other samples having different concentrations, but in the present invention, to a sample having a concentration different by 100 times or more However, it can be seen that the peak identification can be correctly made.
1.溶離液
2.脱気装置
3.送液ポンプ
4.試料注入バルブ
5.分析カラム
6.カラム恒温槽
7.サプレッサー
8.電気伝導度検出器
9.廃液ボトル
10.システム制御及びデータ処理装置
1.
Claims (3)
クロマトグラム中の任意の点を基準点、
前記基準点から任意の高さを指定高さ、
ピークが前記指定高さ以上にある時間範囲をピーク幅とし、
濃度が既知である特定成分の前記ピーク幅を基準ピーク幅として、
前記特定成分と同じ条件の基準点及び指定高さを選択した未知成分の前記ピーク幅が、前記基準ピーク幅に包含される又は前記基準ピーク幅を包含するときは、前記未知成分を前記特定成分と同定することを特徴とする分析方法。 A method of analyzing a sample by chromatography
Reference point at any point in the chromatogram,
Designate any height from the reference point Height,
Let the time range where the peak is above the specified height be the peak width,
The peak width of a specific component whose concentration is known is taken as a reference peak width.
When the peak width of the unknown component for which the reference point under the same condition as the specific component and the designated height are selected is included in the reference peak width or includes the reference peak width, the unknown component is selected as the specific component And an analytical method characterized by identifying.
前記特定成分と同じ条件の基準点及び指定高さを選択した未知成分の前記ピーク幅が、伸長された基準ピーク幅に包含される又は短縮された基準ピーク幅を包含するときは、前記未知成分を前記特定成分と同定することを特徴とする請求項1に記載の分析方法。 Stretch and shorten the reference peak width at an arbitrary ratio,
When the peak width of the unknown component for which the reference point under the same conditions as the specific component and the designated height have been selected includes the shortened reference peak width included in the extended reference peak width, the unknown component The analysis method according to claim 1, wherein the specific component is identified.
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