JP2019037180A - 細胞活性測定用デバイス、細胞活性測定方法、及び細胞活性測定用デバイスの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】低侵襲の細胞活性測定用デバイスを提供する。【解決手段】一面側に凹部状のマイクロチャンバを有し、測定対象である環境因子の透過を阻害する材料で構成された第1層と、前記第1層の、前記マイクロチャンバを有する面の他面側に積層された第2層と、前記マイクロチャンバの内面に配置され、前記環境因子の量に応じて光学的変化を生じる環境因子検出プローブと、前記第2層の、前記第1層と接する面の他面側において、前記マイクロチャンバに対応する位置に配置され、前記第2層と一体成形されたマイクロレンズと、を備える細胞活性測定用デバイス。【選択図】図2
Description
本発明は、細胞活性測定用デバイス、細胞活性測定方法、及び細胞活性測定用デバイスの製造方法に関する。
細胞の生物学的活性を測定する技術は、再生医療などの先端医療分野や医薬品のスクリーニングをはじめとする幅広い分野における基盤技術となっている。
従来から公知の細胞の活性計測方法のうち、個々の細胞を解析した上で分離する手法の一例としてフローセルソーターによる計測が挙げられる。フローセルソーターでは、電荷を持たせた液滴中に蛍光染色処理後の細胞を単離して滴下する。そして、この液滴中の細胞の蛍光の有無、光散乱量の大小に基づいて液滴の落下方向を電界の印加で制御し、複数の容器に細胞を分画して回収することができる(例えば、非特許文献1参照)。
従来から公知の細胞の活性計測方法のうち、個々の細胞を解析した上で分離する手法の一例としてフローセルソーターによる計測が挙げられる。フローセルソーターでは、電荷を持たせた液滴中に蛍光染色処理後の細胞を単離して滴下する。そして、この液滴中の細胞の蛍光の有無、光散乱量の大小に基づいて液滴の落下方向を電界の印加で制御し、複数の容器に細胞を分画して回収することができる(例えば、非特許文献1参照)。
Kamarck,M.E. Methods Enzymol. 第151巻第150頁から第165頁(1987年)
本発明の1実施形態は、一面側にマイクロチャンバを有し、測定対象である環境因子の透過を阻害する材料で構成された第1層と、前記第1層の、前記マイクロチャンバを有する面の他面側に積層された第2層と、前記マイクロチャンバの内面に配置され、前記環境因子の量に応じて光学的変化を生じる環境因子検出プローブと、前記第2層の、前記第1層と接する面の他面側において、前記マイクロチャンバに対応する位置に配置され、前記第2層と一体成形されたマイクロレンズと、を備える細胞活性測定用デバイスである。
また、本発明の1実施形態は、前記実施形態の細胞活性測定用デバイスを細胞に被せて、前記細胞活性測定用デバイスのマイクロチャンバに、前記細胞を収容する工程と、前記マイクロレンズが一体成形された一面側から、前記細胞活性測定用デバイスに光を照射する工程と、前記環境因子検出プローブに生じる光学的変化を検出する工程と、を含む、細胞活性測定方法である。
また、本発明の1実施形態は、(a)測定対象である環境因子の量に応じて光学的変化を生じる材料で形成され、凸部を一面側に有する、環境因子検出プローブ層を用意する工程と、(b)前記環境因子検出プローブ層の前記凸部を有する面上に、前記凸部が覆われるように前記環境因子の透過を阻害する材料を塗布して第1層を形成する工程と、(c)前記第1層上に、前記環境因子検出プローブ層の凸部に対応する位置にマイクロレンズが一体成形された第2層を形成する工程と、(d)前記環境因子検出プローブ層が、前記環境因子検出プローブ層の凸部に対応する位置に形成された前記第1層の凹部の内面のみに残るように、前記環境因子検出プローブ層を除去し、前記凹部の内面に環境因子検出プローブを形成する工程と、を含む、細胞活性測定用デバイスの製造方法である。
≪細胞活性測定用デバイス≫
1実施形態において、本発明は、細胞活性測定用デバイスを提供する。本実施形態の細胞活性測定用デバイスは、一面側にマイクロチャンバを有し、測定対象である環境因子の透過を阻害する材料で構成された第1層と、前記第1層の、前記マイクロチャンバを有する面の他面側に積層された第2層と、前記マイクロチャンバの内面に配置され、前記環境因子の量に応じて光学的変化を生じる環境因子検出プローブと、前記第2層の、前記第1層と接する面の他面側において、前記マイクロチャンバに対応する位置に配置され、前記第2層と一体成形されたマイクロレンズと、を備える。
1実施形態において、本発明は、細胞活性測定用デバイスを提供する。本実施形態の細胞活性測定用デバイスは、一面側にマイクロチャンバを有し、測定対象である環境因子の透過を阻害する材料で構成された第1層と、前記第1層の、前記マイクロチャンバを有する面の他面側に積層された第2層と、前記マイクロチャンバの内面に配置され、前記環境因子の量に応じて光学的変化を生じる環境因子検出プローブと、前記第2層の、前記第1層と接する面の他面側において、前記マイクロチャンバに対応する位置に配置され、前記第2層と一体成形されたマイクロレンズと、を備える。
図1は、本実施形態の細胞活性測定用デバイスの構成例を示す斜視図である。図2は、本実施形態の細胞活性測定用デバイスの構成例を示す断面図である。細胞活性測定用デバイス1は、第1層10と、第2層20とから構成されている。第1層10の一面側には、凹部状のマイクロチャンバ11が形成されている。マイクロチャンバ11の内面には、環境因子検出プローブ30が配置されている。第2層20には、マイクロレンズ21が一体成形されている。細胞活性を測定する際には、マイクロチャンバ11内に細胞を収容し、細胞の代謝で産生又は消費される環境因子を、環境因子検出プローブ30で検出して、細胞活性を測定する。細胞は、培地(細胞培養液など)とともに、マイクロチャンバ11内に収容されてもよい。
(第1層)
第1層10は、測定対象である環境因子の透過を阻害する材料で構成されている。本明細書において、「環境因子」とは、細胞の代謝で産生又は消費される物質を意味する。環境因子としては、例えば、グルコース、カルシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、水素イオン、酸素、活性酸素種、過酸化水素、二酸化炭素、タンパク質、ペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。測定対象の環境因子は、1種であってもよく、2種以上であってもよい。測定対象の環境因子が2種以上である場合、第1層10は、当該2種以上の環境因子のいずれの透過も阻害する材料で構成される。第1層10が、測定対象である環境因子の透過を阻害する材料で構成されることにより、環境因子がマイクロチャンバ11の外部に拡散することを防ぐことができる。また、マイクロチャンバ11内の環境因子が隣接するマイクロチャンバ11に移動することを防ぎ、各マイクロチャンバ11に収容された細胞毎に、正確に細胞活性を測定することができる。
第1層10は、測定対象である環境因子の透過を阻害する材料で構成されている。本明細書において、「環境因子」とは、細胞の代謝で産生又は消費される物質を意味する。環境因子としては、例えば、グルコース、カルシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、水素イオン、酸素、活性酸素種、過酸化水素、二酸化炭素、タンパク質、ペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。測定対象の環境因子は、1種であってもよく、2種以上であってもよい。測定対象の環境因子が2種以上である場合、第1層10は、当該2種以上の環境因子のいずれの透過も阻害する材料で構成される。第1層10が、測定対象である環境因子の透過を阻害する材料で構成されることにより、環境因子がマイクロチャンバ11の外部に拡散することを防ぐことができる。また、マイクロチャンバ11内の環境因子が隣接するマイクロチャンバ11に移動することを防ぎ、各マイクロチャンバ11に収容された細胞毎に、正確に細胞活性を測定することができる。
例えば、環境因子が、酸素、二酸化炭素等の気体である場合、第1層10は、ガスバリア性の高い材料で構成される。一例として、環境因子が酸素である場合、第1層10は、酸素の透過を阻害する材料で構成される。
また、一例として、第1層10は、透光性を有する材料で構成される。第1層10が、透光性を有する材料で構成されることにより、環境因子検出プローブ30に対して効率よく光が照射される。また、環境因子検出プローブ30の光学的変化を効率よく検出することができる。
また、第1層10は細胞培養液自体の流出入も阻害することで、マイクロチャンバ11ごとに独立した空間としている。
また、一例として、第1層10は、透光性を有する材料で構成される。第1層10が、透光性を有する材料で構成されることにより、環境因子検出プローブ30に対して効率よく光が照射される。また、環境因子検出プローブ30の光学的変化を効率よく検出することができる。
また、第1層10は細胞培養液自体の流出入も阻害することで、マイクロチャンバ11ごとに独立した空間としている。
環境因子が酸素である場合、第1層10は、例えば、エチレンビニルアルコール(EVOH)で構成されていてもよい。EVOHは、生体適合性が高いため、細胞に対する侵襲性が低い。また、ガスバリア性が高く、酸素の透過を阻害する。さらに、EVOHは、透光性を有する。なお、EVOHは、酸素以外の多くの環境因子の透過も阻害するため、環境因子が酸素以外の物質である場合も、第1層10の材料として用いることができる。
第1層10の厚さt10は、特に限定されないが、例えば、10μm〜1mmが例示される。第1層10の厚さt10が前記範囲内であると、マイクロチャンバ11の容積を環境因子の検出に適度なものとし得るとともに、細胞活性測定用デバイス1の重量が適度なものとなる。厚さt10は、20〜500μmとしてもよく、30〜300μmとしてもよい。一例として、厚さt10は、40〜200μmである。
第1層10の一面側には、凹部状のマイクロチャンバ11が形成されている。マイクロチャンバ11の数は特に限定されず、1個であってもよく、2個以上であってもよい。マイクロチャンバ11の数は、細胞活性測定用デバイス1のサイズに合わせて、適宜適当な数を形成することができる。第1層10に複数のマイクロチャンバ11が形成されている場合、マイクロチャンバ11の配列方式は、特に限定されず、細胞活性測定用デバイス1の形状に合わせて、適宜適切な配列方式を選択することができる。一例として、マイクロチャンバ11は、格子状に配列することができる。
マイクロチャンバ11が複数ある場合、隣接するマイクロチャンバ間の距離d11は、特に限定されず、細胞活性測定用デバイス1のサイズ及びマイクロチャンバ11の数に応じて、適宜設定すればよい。第1層10の材料についての測定対象である環境因子の拡散係数を考慮し、マイクロチャンバ11内の当該環境因子が拡散して、隣接するマイクロチャンバ11に至る時間が、当該環境因子を測定するための時間よりも長くなるように、距離d11を設定してもよい。また、距離d11は、全て同じである必要はなく、マイクロチャンバ11の位置によって距離d11を変更してもよい。距離d11としては、例えば、10〜500μmが例示される。
マイクロチャンバ11は、第1層の一面側に形成された孔である。孔は貫通孔であってもよく、貫通しない孔であってもよい。図2の例では、マイクロチャンバ11は第1層10を貫通しない孔として形成されているが、マイクロチャンバ11は、第1層10に貫通孔を形成していてもよい。マイクロチャンバ11が、第1層を貫通する貫通孔である場合、マイクロチャンバ11に対応する位置に貫通孔を有する第1層10に、第2層20を積層することによって、マイクロチャンバ11が形成されていてもよい。かかる構成も「第1層の一面側にマイクロチャンバを有する」構成に含まれる。マイクロチャンバ11の形状は、特に限定されず、任意の形状とすることができる。マイクロチャンバ11の形状としては、例えば、円柱形状、楕円柱形状、多角柱形状、半球形状、円錐台形状、多角錐台形状等が挙げられるが、これらに限定されない。図2の例では、マイクロチャンバ11は円柱形状である。
マイクロチャンバ11のサイズは、特に限定されず、細胞の種類、測定対象とする環境因子の種類等に応じて、任意のサイズとすることができる。例えば、ヒト細胞を対象とする場合、マイクロチャンバ11の容積としては、103〜107μm3を例示できる。
また、例えば、マイクロチャンバ11が円柱形状である場合、マイクロチャンバ11の横断面の円の直径φ11は、30〜200μmとすることができる。直径φ11は、50〜150μmであってもよく、70〜120μmであってもよい。一例として、直径φ11は90〜100μmである。また、例えば、マイクロチャンバ11が円柱形状である場合、マイクロチャンバ11の高さh11は、5〜90μmとすることができる。高さh11は、10〜80μmとしてもよく、20〜70μmとしてもよい。一例として、高さh11は、30〜50μmである。
また、例えば、マイクロチャンバ11が円柱形状である場合、マイクロチャンバ11の横断面の円の直径φ11は、30〜200μmとすることができる。直径φ11は、50〜150μmであってもよく、70〜120μmであってもよい。一例として、直径φ11は90〜100μmである。また、例えば、マイクロチャンバ11が円柱形状である場合、マイクロチャンバ11の高さh11は、5〜90μmとすることができる。高さh11は、10〜80μmとしてもよく、20〜70μmとしてもよい。一例として、高さh11は、30〜50μmである。
一例として、マイクロチャンバ11は、図3の例のように、マイクロチャンバ11の底部及び開口部の中心を結ぶ中心軸Cに直行する断面積aが、前記マイクロチャンバの底部からの距離がl1である断面積a1と、前記凹部の底部からの距離がl2である断面積a2とを有する場合、l2>l1のときa2>a1であるような形状を有するものであってもよい。そのようなマイクロチャンバ11の形状としては、例えば、半球形状、円錐台形状、多角錐台形状等が挙げられる。図3の例では、マイクロチャンバ11は円錐台形状である。
マイクロチャンバ11の内面には、測定対象である環境因子の量に応じて光学的変化を生じる環境因子検出プローブ30が配置されている。環境因子検出プローブ30は、測定対象である環境因子と反応し、光学的変化を生じる。「光学的変化」とは、少なくとも1つの光学的性質に変化が生じることを意味する。光学的性質の例としては、例えば、蛍光強度、蛍光寿命、リン光強度、リン光寿命、吸光度、吸収波長等が挙げられるが、これらに限定されない。
マイクロチャンバ11に細胞を収容してインキュベートすると、細胞の代謝により、マイクロチャンバ11内の環境因子の量が変化する。当該環境因子の量的変化に依存して、環境因子検出プローブ30に光学的変化が生じる。そのため、環境因子検出プローブ30の光学的変化を検出することにより、マイクロチャンバ11に収容された細胞の代謝活性を測定することができる。
マイクロチャンバ11に細胞を収容してインキュベートすると、細胞の代謝により、マイクロチャンバ11内の環境因子の量が変化する。当該環境因子の量的変化に依存して、環境因子検出プローブ30に光学的変化が生じる。そのため、環境因子検出プローブ30の光学的変化を検出することにより、マイクロチャンバ11に収容された細胞の代謝活性を測定することができる。
例えば、検出対象の環境因子が酸素である場合、環境因子検出プローブ30は、酸素濃度に依存してリン光寿命が変化する材料を含んでいてもよい。例えば、環境因子検出プローブ30は、公知のリン光試薬を含むことができる。リン光試薬としては、例えば、金属ポルフィリン、金属フタロシアニン、ルテニウム錯体、イリジウム錯体等が挙げられるが、これらに限定されない。なお、金属ポルフィリン又は金属フタロシアニンにおいて、中心金属の具体例としては、白金、亜鉛、パラジウム等が挙げられる。一例として、環境因子検出プローブ30は、白金ポルフィリンを含んでいてもよい。白金ポルフィリンの例としては、オクタエチルポルフィリン(PtOEP)が挙げられる。PtOEPは、常温下で安定なリン光を発生し、酸素濃度が上昇するとリン光寿命が低下する性質を有する。そのため、PtOEPは、酸素濃度を測定するためのリン光試薬として適している。環境因子検出プローブ30がPtOEPを含む場合、酸素透過性の高いポリスチレン(PS)を用いたPtOEP−PSの薄膜を含んでいてもよい。
環境因子検出プローブ30は、マイクロチャンバ11の内面において、細胞活性測定用デバイス1に照射される光を受光可能な位置に配置される。細胞活性測定用デバイス1に照射される光は、環境因子検出プローブ30に生じる光学的変化を検出するために照射されるものである。例えば、環境因子検出プローブ30に生じる光学的変化が蛍光強度やリン光寿命の変化である場合、環境因子検出プローブ30に蛍光又はリン光を発生させるための励起光が、細胞活性測定用デバイス1に照射される。
環境因子検出プローブ30は、照射光を受光可能な位置であれば、特に制限なくマイクロチャンバ11の内面に配置することができる。例えば、環境因子検出プローブ30は、マイクロチャンバ11の底部内面に配置されてもよく、内側面に配置されてもよい。また、底部内面及び内側面の両方に、環境因子検出プローブ30を配置してもよい。なお、環境因子検出プローブ30は、底部内面及び内側面のいずれに配置される場合であっても、底部内面又は内側面の全面に配置されている必要はなく、底部内面又は内側面の少なくとも一部に配置されていればよい。
環境因子検出プローブ30は、照射光を受光可能な位置であれば、特に制限なくマイクロチャンバ11の内面に配置することができる。例えば、環境因子検出プローブ30は、マイクロチャンバ11の底部内面に配置されてもよく、内側面に配置されてもよい。また、底部内面及び内側面の両方に、環境因子検出プローブ30を配置してもよい。なお、環境因子検出プローブ30は、底部内面及び内側面のいずれに配置される場合であっても、底部内面又は内側面の全面に配置されている必要はなく、底部内面又は内側面の少なくとも一部に配置されていればよい。
例えば、図2の例のように、マイクロチャンバ11が円柱形状である場合、環境因子検出プローブ30は、マイクロチャンバ11の底部内面に配置することができる。
また、例えば、図3の例のように、マイクロチャンバ11が、l2>l1のときa2>a1であるような形状を有する場合、環境因子検出プローブ30は、マイクロチャンバ11の内側面に配置してもよい。この場合、環境因子と接触する環境因子検出プローブ30の表面積が大きくなるため、環境因子の検出感度を高めることができる。なお、図3の例では、環境因子検出プローブ30は、マイクロチャンバ11の内側面にしか配置されていないが、内側面とともに底部内面にも配置されていてもよい。
また、例えば、図3の例のように、マイクロチャンバ11が、l2>l1のときa2>a1であるような形状を有する場合、環境因子検出プローブ30は、マイクロチャンバ11の内側面に配置してもよい。この場合、環境因子と接触する環境因子検出プローブ30の表面積が大きくなるため、環境因子の検出感度を高めることができる。なお、図3の例では、環境因子検出プローブ30は、マイクロチャンバ11の内側面にしか配置されていないが、内側面とともに底部内面にも配置されていてもよい。
また、環境因子検出プローブ30は、多孔質であってもよい。環境因子検出プローブ30を多孔質とした場合、環境因子検出プローブ30が環境因子と接触する表面積が大きくなる。そのため、環境因子によって生じる光学的変化を検出しやすくなり、環境因子の検出感度を高めることができる。
なお、測定対象の環境因子が2種以上である場合、2種以上の環境因子検出プローブ30を用いて、それぞれ環境因子を検出してもよい。この場合、マイクロチャンバ11の内面を区画分けし、各区画に異なる種類の環境因子検出プローブ30を配置してもよい。あるいは、2種以上の環境因子検出プローブ30を、互いに重なるように、マイクロチャンバ11の内面に配置してもよい。
例えば、第1の環境因子を第1の環境因子検出プローブで検出し、第2の環境因子を第2の環境因子検出プローブで検出する場合、第1の環境因子検出プローブをマイクロチャンバ11の内面の第1区画に配置し、第2の環境因子検出プローブをマイクロチャンバ11の内面の第2区画に配置してもよい。
また、例えば、第1の環境因子検出プローブを、マイクロチャンバ11の内面のいずれかに配置された第2の環境因子検出プローブに、重ねて配置してもよい。この場合、第1の環境因子検出プローブは、マイクロチャンバ11内の細胞培養液と直接接触して、細胞培養液中の第1の環境因子を検出する。一方、第2の環境因子検出プローブは、第1の環境因子検出プローブ内を拡散して第2の環境因子検出プローブまで到達した、第2の環境因子を検出する。
例えば、第1の環境因子を第1の環境因子検出プローブで検出し、第2の環境因子を第2の環境因子検出プローブで検出する場合、第1の環境因子検出プローブをマイクロチャンバ11の内面の第1区画に配置し、第2の環境因子検出プローブをマイクロチャンバ11の内面の第2区画に配置してもよい。
また、例えば、第1の環境因子検出プローブを、マイクロチャンバ11の内面のいずれかに配置された第2の環境因子検出プローブに、重ねて配置してもよい。この場合、第1の環境因子検出プローブは、マイクロチャンバ11内の細胞培養液と直接接触して、細胞培養液中の第1の環境因子を検出する。一方、第2の環境因子検出プローブは、第1の環境因子検出プローブ内を拡散して第2の環境因子検出プローブまで到達した、第2の環境因子を検出する。
環境因子検出プローブ30の厚さt30は、特に限定されない。環境因子と接触するのは表層のみであるため、厚さt30を厚くしても、環境因子検出プローブ30の性能が大きく向上することはない。環境因子検出プローブ30の厚さt30は、例えば、0μm超5μm以下とすることができる。厚さt30は、0μm超3μm以下であってもよく、0μm超2μm以下であってもよく、0μm超1μm以下であってもよい。一例として、厚さt30は1μmである。環境因子検出プローブ30の厚さt30が薄すぎると、環境因子の測定に十分な光学的変化が得られない場合があり、また、厚さt30が厚すぎると、環境因子に感度のない部分に光学的変化が生じ、感度が鈍る場合がある。そのため、環境因子の種類、及び環境因子検出プローブ30を構成する材料に応じて、適正な厚さt30を求めてもよい。
環境因子検出プローブ30が多孔質である場合、環境因子は多孔質構造中を拡散し、環境因子検出プローブ30が第1層10と接する面付近まで移動し得る。そのため、環境因子検出プローブ30が多孔質である場合、環境因子検出プローブ30の厚さt30を厚くすることにより、環境因子の感度を高め得る。環境因子検出プローブ30が多孔質である場合には、厚さt30は、例えば、0μm超100μm以下とすることができる。また、多孔質の孔径は、例えば、0.5μm〜100μmである。
(第2層)
第2層20は、第1層10の、マイクロチャンバ11を有する面の他面側に、積層されている。第2層20は、第1層10の材料と異なる材料で構成されてもよく、同じ材料で構成されてもよい。また、第2層20において、第1層10と接する面の他面側には、マイクロレンズ21が一体成形されている。すなわち、第2層20の他面側とマイクロレンズ21との間には継ぎ目がない。第2層20とマイクロレンズ21とは、同一の材料であることが好ましい。マイクロレンズ21は、細胞活性測定用デバイス1に照射される光を、環境因子検出プローブ30に集光する機能を有する(図4参照)。
第2層20は、第1層10の、マイクロチャンバ11を有する面の他面側に、積層されている。第2層20は、第1層10の材料と異なる材料で構成されてもよく、同じ材料で構成されてもよい。また、第2層20において、第1層10と接する面の他面側には、マイクロレンズ21が一体成形されている。すなわち、第2層20の他面側とマイクロレンズ21との間には継ぎ目がない。第2層20とマイクロレンズ21とは、同一の材料であることが好ましい。マイクロレンズ21は、細胞活性測定用デバイス1に照射される光を、環境因子検出プローブ30に集光する機能を有する(図4参照)。
第2層20を構成する材料は、特に限定されない。第2層20は、例えば、透光性を有する材料で構成することができる。また、第2層20に一体成形されるマイクロレンズ21の集光効率を高めるために、屈折率の高い材料で第2層20を構成してもよい。例えば、細胞活性測定用デバイス1に対する照射光の波長に関して、1.3〜2.0程度の屈折率を有する材料で第2層20を構成することができる。また、第2層20にマイクロレンズ21を一体成形するために、熱硬化性材料又は光硬化性材料を用いて、第2層20を構成してもよい。
第2層20を構成する材料としては、例えば、シリコーン樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂等から、上記のような性質を有する樹脂を適宜選択して用いてもよい。具体例としては、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、NTTアドバンストテクノロジー社製の高屈折率樹脂(#18165、#18166、#6205、E3754、#7200)、三菱ガス化学社製のルミプラス(登録商標)シリーズ等が挙げられる。これらの樹脂は、透光性を有し、屈折率が高く、熱硬化性又は光硬化性である。例えば、測定対象の環境因子が酸素であり、環境因子検出プローブ30がPtOEPを含む場合、励起光として383nmの光を用いることができる。前記具体例として挙げた樹脂における383nmの光の屈折率は1.4〜1.9程度である。
第2層20の厚さt20は、特に限定されないが、例えば、10〜1mmが例示される。第2層20の厚さt20が前記範囲内であると、細胞活性測定用デバイスの重量が適度なものとなる。厚さt20は、30〜500μmとしてもよく、50〜200μmとしてもよい。一例として、厚さt20は、100〜200μmである。
マイクロレンズ21は、第2層20の一面側に一体成形されている。マイクロレンズ21は、第1層10が有するマイクロチャンバ11に対応する位置に配置されている。1つのマイクロチャンバ11に対しては、1つのマイクロレンズ21が配置されている。一例として、マイクロレンズ21は、マイクロレンズ21の中心点と、マイクロチャンバ11の底面の中心点と、マイクロチャンバ11の開口部の中心点とが、一直線上に並ぶように配置される。細胞活性測定用デバイス1に照射された光は、マイクロレンズ21を通過する際に屈折し、環境因子検出プローブ30に集光される(図4参照)。マイクロレンズ21は、第2層20と一体成形されているため、マイクロレンズ21と第2層20とがシームレスに繋がっている。そのため、マイクロレンズ21と第2層20との境界付近でひずみ等を生じることがなく、マイクロレンズ21を透過した光が第2層20との間で散乱や屈折などの影響を受けることを抑えられる。
マイクロレンズ21のサイズは、特に限定されないが、例えば、環境因子検出プローブ30を覆い得るサイズとすることができる。マイクロレンズ21の曲率半径R及び厚みdは、マイクロチャンバ11のサイズ、環境因子検出プローブの配置位置、第2層20を構成する材料の屈折率等により、適宜選択することができる。例えば、マイクロレンズ21の曲率半径Rは、50〜300μmとすることができる。曲率半径Rは、100〜200μmであってもよく、120〜180μmであってもよい。また、マイクロレンズ21の厚みdは、例えば、10〜120μmとすることができる。厚みdは、20〜100μmであってもよく、30〜80μmであってもよい。一例として、マイクロレンズ21の曲率半径Rは150μmであり、厚みdは50μmである。
上記のような構成を備える細胞活性測定用デバイス1は、一例として、シート状である。細胞活性測定用デバイス1がシート状である場合、軽量で嵩張らず、扱いやすい。また、マイクロチャンバ11の配置の自由度が高く、多数のマイクロチャンバ11を形成して、一度に多くの細胞の細胞活性を別々に測定することもできる。また、軽量であり柔軟性があることから、細胞へのダメージを抑えられる。
細胞活性測定用デバイス1がシート状である場合、細胞活性測定用デバイス1の平面形状は、測定対象の細胞を培養する培養容器等に応じて、適当な平面形状を選択すればよい。例えば、シャーレ中の培養細胞の細胞活性を測定する場合には、細胞活性測定用デバイス1の平面形状は円形とすることができる。
細胞活性測定用デバイス1がシート状である場合、細胞活性測定用デバイス1の平面形状は、測定対象の細胞を培養する培養容器等に応じて、適当な平面形状を選択すればよい。例えば、シャーレ中の培養細胞の細胞活性を測定する場合には、細胞活性測定用デバイス1の平面形状は円形とすることができる。
(他の構成)
上記構成のほか、細胞活性測定用デバイス1は、他の構成を含んでいてもよい。
例えば、マイクロチャンバ11内には、環境因子検出プローブ30に加えて、環境因子の量を電気化学的手段によって電気信号に変換するセンサが配置されていてもよい(図示せず)。そのようなセンサとしては、例えば、酸素センサ、各種バイオセンサ(例、グルコースセンサ)等が挙げられる。
あるいは、マイクロチャンバ11内には、特定の生体分子に特異的に結合する生体分子検出プローブが配置されていてもよい(図示せず)。生体分子検出プローブとしては、例えば、抗体、レセプタータンパク質、酵素、アプタマー、核酸等が挙げられる。
上記構成のほか、細胞活性測定用デバイス1は、他の構成を含んでいてもよい。
例えば、マイクロチャンバ11内には、環境因子検出プローブ30に加えて、環境因子の量を電気化学的手段によって電気信号に変換するセンサが配置されていてもよい(図示せず)。そのようなセンサとしては、例えば、酸素センサ、各種バイオセンサ(例、グルコースセンサ)等が挙げられる。
あるいは、マイクロチャンバ11内には、特定の生体分子に特異的に結合する生体分子検出プローブが配置されていてもよい(図示せず)。生体分子検出プローブとしては、例えば、抗体、レセプタータンパク質、酵素、アプタマー、核酸等が挙げられる。
また、マイクロチャンバ11の内面は、親水性被膜等でコーティングされていてもよい。あるいは、マイクロチャンバ11の内面を、タンパク質の吸着を阻害する物質(ポリエチレングリコール(PEG)、2−メタクリロイオキシエチルホスホリルコリン(MPC))等でコーティングしてもよい。
≪細胞活性測定方法≫
1実施形態において、本発明は、上記実施形態の細胞活性測定用デバイスを用いた細胞活性測定方法を提供する。本実施形態の細胞活性方法は、上記実施形態の細胞活性測定用デバイスを細胞に被せて、マイクロチャンバに細胞を収容する工程(以下、「工程I」という。)と、前記マイクロレンズが一体成形された一面側から、前記細胞活性測定用デバイスに光を照射する工程(以下、「工程II」という。)と、前記環境因子検出プローブに生じる光学的変化を検出する工程(以下、「工程III」という。)と、を含む。
1実施形態において、本発明は、上記実施形態の細胞活性測定用デバイスを用いた細胞活性測定方法を提供する。本実施形態の細胞活性方法は、上記実施形態の細胞活性測定用デバイスを細胞に被せて、マイクロチャンバに細胞を収容する工程(以下、「工程I」という。)と、前記マイクロレンズが一体成形された一面側から、前記細胞活性測定用デバイスに光を照射する工程(以下、「工程II」という。)と、前記環境因子検出プローブに生じる光学的変化を検出する工程(以下、「工程III」という。)と、を含む。
図5は、細胞活性測定用デバイス1の使用方法の一例を示す図である。図6は、細胞活性測定用デバイス1を用いて細胞活性を測定している状態の一例を示す断面図である。図5、6では、培養容器50で培養される細胞60の細胞活性を、細胞活性測定用デバイス1で測定している。なお、培養容器50中には、図示しない培地(細胞培養液)が存在しており、細胞60は当該培地中で培養されている。
本実施形態の細胞活性測定方法において、活性測定の対象となる細胞は、特に限定されない。ヒト細胞であってもよく、ヒト以外の動物の細胞であってもよく、植物細胞であってもよい。また、原生動物、菌類、細菌類等であってもよい。ヒト細胞又はヒト以外の動物の細胞である場合、細胞の例としては、体細胞、生殖細胞、受精卵、幹細胞(例、iPS細胞、ES細胞など)、幹細胞から誘導された分化細胞(例、心筋細胞など)、免疫細胞、がん細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。また、細胞は、図5、6の例のような培養細胞であってもよく、組織検体中の細胞であってもよい。細胞は浮遊細胞であっても接着細胞であってもよい。
また、活性測定の対象となる細胞が培養細胞である場合、図5、6の例のように、培養容器50において培養中の細胞60に対して、細胞活性測定用デバイス1を適用してもよい。培養容器50の形状は、特に限定されず、細胞の種類に応じて適宜選択することができる。一例として、図5の例のようなシャーレ状の培養容器が挙げられる。
以下、シャーレ状培養容器50で培養される細胞60を細胞活性測定対象の例として、本実施形態の細胞活性測定方法の各工程について説明する。
以下、シャーレ状培養容器50で培養される細胞60を細胞活性測定対象の例として、本実施形態の細胞活性測定方法の各工程について説明する。
(工程I)
工程Iは、細胞活性測定用デバイスを細胞に被せて、マイクロチャンバに細胞を収容する工程である。
本工程では、培養容器50で培養される細胞60に対して、細胞活性測定用デバイス1を被せればよい。これにより、図6の例のように、各マイクロチャンバ11a、11bに細胞が収容される。なお、本明細書において、「マイクロチャンバに細胞が収容される」とは、細胞の一部又は全部がマイクロチャンバ内に位置する場合に加えて、図6の例のように、細胞の一部又は全部がマイクロチャンバ内の空間に接している場合も含まれる。また、細胞活性測定用デバイス1をかぶせた時に、マイクロチャンバ11と培養容器50とによって、測定対象となる細胞の周囲に閉鎖的な空間を形成する場合も含まれる。
工程Iは、細胞活性測定用デバイスを細胞に被せて、マイクロチャンバに細胞を収容する工程である。
本工程では、培養容器50で培養される細胞60に対して、細胞活性測定用デバイス1を被せればよい。これにより、図6の例のように、各マイクロチャンバ11a、11bに細胞が収容される。なお、本明細書において、「マイクロチャンバに細胞が収容される」とは、細胞の一部又は全部がマイクロチャンバ内に位置する場合に加えて、図6の例のように、細胞の一部又は全部がマイクロチャンバ内の空間に接している場合も含まれる。また、細胞活性測定用デバイス1をかぶせた時に、マイクロチャンバ11と培養容器50とによって、測定対象となる細胞の周囲に閉鎖的な空間を形成する場合も含まれる。
各マイクロチャンバ11a、11bに収容された細胞60は、それぞれマイクロチャンバ11a、11b内に代謝によって生じる環境因子を放出する。あるいは、代謝によって、各マイクロチャンバ11a、11bに存在する環境因子を消費する。
なお、本工程では、熱の移動による培養環境への悪影響を抑制するために、細胞活性測定用デバイス1を、予め培養容器50内の培地と同じ温度に保温しておいてもよい。
また、マイクロチャンバ11内の空間と接する細胞60の数は、単数であってもよく、複数であってもよい。
また、マイクロチャンバ11内の空間と接する細胞60の数は、単数であってもよく、複数であってもよい。
(工程II)
工程IIは、マイクロレンズが一体成形された一面側から、細胞活性測定用デバイスに光を照射する工程である。
本工程では、図6の例のように、細胞活性測定用デバイス1のマイクロレンズ21a、21b側に配置される光源40から、細胞活性測定用デバイス1に対して光を照射する。当該照射光を、環境因子検出プローブ30a、30bが受光することにより、マイクロチャンバ11a、11b内の環境因子の量に依存して、環境因子検出プローブ30a、30bにそれぞれ光学的変化が生じる。
工程IIは、マイクロレンズが一体成形された一面側から、細胞活性測定用デバイスに光を照射する工程である。
本工程では、図6の例のように、細胞活性測定用デバイス1のマイクロレンズ21a、21b側に配置される光源40から、細胞活性測定用デバイス1に対して光を照射する。当該照射光を、環境因子検出プローブ30a、30bが受光することにより、マイクロチャンバ11a、11b内の環境因子の量に依存して、環境因子検出プローブ30a、30bにそれぞれ光学的変化が生じる。
照射する光の波長は、測定対象の環境因子の種類、環境因子検出プローブ30a、30bに生じる光学的変化の種類に応じて、適宜選択すればよい。例えば、測定対象の環境因子が酸素であり、環境因子検出プローブ30a、30bがPtOEPを含み、環境因子検出プローブ30a、30bに生じる光学的変化がリン光寿命の変化である場合、波長383nmの紫外線を光源40から照射することができる。
光源40から細胞活性測定用デバイス1に照射された光は、マイクロレンズ21a、21bを通過する際に屈折し、環境因子検出プローブ30a、30bにそれぞれ集光される。そのため、照射光の照射量が少ない、例えば照射光の光強度が小さい場合であっても、環境因子検出プローブ30a、30bは、光学的変化が生じるのに十分な量の光を受光し得る。
光源40から細胞活性測定用デバイス1に照射された光は、マイクロレンズ21a、21bのない部分においては、第2層20及び第1層10を透過して、細胞60に照射される。そのため、照射光によって細胞60への影響が起こり得るため、照射光の照射量はなるべく少なくすることが望ましい。
本実施形態では、マイクロレンズを細胞活性測定用デバイスに一体的に設けることにより、マイクロレンズを備えない細胞活性測定用デバイスにより測定する場合に比べ、照射光の照射量を少なくすることができる。そのため、、例えば、照射光として紫外線を用いる場合にも、細胞60に対するダメージを低減することができる。
光源40から細胞活性測定用デバイス1に照射された光は、マイクロレンズ21a、21bのない部分においては、第2層20及び第1層10を透過して、細胞60に照射される。そのため、照射光によって細胞60への影響が起こり得るため、照射光の照射量はなるべく少なくすることが望ましい。
本実施形態では、マイクロレンズを細胞活性測定用デバイスに一体的に設けることにより、マイクロレンズを備えない細胞活性測定用デバイスにより測定する場合に比べ、照射光の照射量を少なくすることができる。そのため、、例えば、照射光として紫外線を用いる場合にも、細胞60に対するダメージを低減することができる。
(工程III)
工程IIIは、環境因子検出プローブに生じる光学的変化を検出する工程である。
本工程においては、マイクロチャンバ11a、11bにそれぞれ配置される環境因子検出プローブ30a、30bに生じる光学的変化をそれぞれ検出する。光学的変化の検出手段は、当該光学的変化の種類に応じて、適宜選択すればよい。一例として、測定対象の環境因子が酸素であり、環境因子検出プローブ30a、30bに生じる光学的変化がリン光寿命である場合、リン光寿命の検出には、蛍光顕微鏡、分光蛍光光度計、蛍光撮像装置等を用いることができる。
工程IIIは、環境因子検出プローブに生じる光学的変化を検出する工程である。
本工程においては、マイクロチャンバ11a、11bにそれぞれ配置される環境因子検出プローブ30a、30bに生じる光学的変化をそれぞれ検出する。光学的変化の検出手段は、当該光学的変化の種類に応じて、適宜選択すればよい。一例として、測定対象の環境因子が酸素であり、環境因子検出プローブ30a、30bに生じる光学的変化がリン光寿命である場合、リン光寿命の検出には、蛍光顕微鏡、分光蛍光光度計、蛍光撮像装置等を用いることができる。
環境因子検出プローブ30a、30bに生じる光学的変化の検出は、マイクロレンズ21a、21bが配置される側、及び培養容器50が配置される側のいずれで行ってもよい。マイクロレンズ21a、21bが配置される側で検出光の検出を行う場合、マイクロレンズ21a、21bにより検出光が集光されるため、光学的変化の検出感度が高く成り得る。また、いずれの側で検出光の検出を行う場合においても、検出光を検出器に導くための光学系を別途設計して用いてもよい。
環境因子検出プローブ30a、30bに生じる光学的変化は、マイクロチャンバ11a、11bにおける環境因子の量にそれぞれ依存する。そのため、環境因子検出プローブ30a、30bの光学的変化は、マイクロチャンバ11a、11b内の環境因子の量を反映しており、当該環境因子の量は、マイクロチャンバ11a、11b内の細胞の細胞活性を反映している。例えば、測定対象の環境因子が酸素である場合を例にすると、細胞60の代謝によって、マイクロチャンバ11a、11b内の酸素が消費される。細胞60の活性が高いほど、マイクロチャンバ11a、11b内で消費される酸素の量が多くなり、マイクロチャンバ11a、11b内の酸素濃度が低下する。
環境因子検出プローブ30a、30bが、酸素濃度が低いほどリン光寿命が長くなる材料を含んでいる場合、酸素濃度の低下に伴い環境因子検出プローブ30a、30bのリン光寿命が長くなる。したがって、例えば、環境因子検出プローブ30aのリン光寿命が、環境因子検出プローブ30bのリン光寿命よりも長い場合には、マイクロチャンバ11a内の空間に接触する細胞60の活性が、マイクロチャンバ11b内の空間に接触する細胞60の活性よりも高いことを意味する。
このように、環境因子検出プローブ30a、30bに生じる光学的変化を検出することにより、マイクロチャンバ11a、11bに収容された細胞の活性をそれぞれ測定することができる。
環境因子検出プローブ30a、30bが、酸素濃度が低いほどリン光寿命が長くなる材料を含んでいる場合、酸素濃度の低下に伴い環境因子検出プローブ30a、30bのリン光寿命が長くなる。したがって、例えば、環境因子検出プローブ30aのリン光寿命が、環境因子検出プローブ30bのリン光寿命よりも長い場合には、マイクロチャンバ11a内の空間に接触する細胞60の活性が、マイクロチャンバ11b内の空間に接触する細胞60の活性よりも高いことを意味する。
このように、環境因子検出プローブ30a、30bに生じる光学的変化を検出することにより、マイクロチャンバ11a、11bに収容された細胞の活性をそれぞれ測定することができる。
本実施形態の細胞活性測定方法においては、培養容器内で培養される細胞の活性をそのまま測定できるため、細胞活性の測定による細胞への影響を小さくすることができる。また、照射光をマイクロレンズにより環境因子検出プローブに集光するため、照射光を少なくすることができ、細胞への影響をより低減できる。
さらに、マイクロチャンバの容積は、培養容器50の容積に対して微小であるため、マイクロチャンバ内は外側の環境と比べて環境因子の濃度変化がより大きくなる。そのため、高い感度で環境因子を検出できる。また、マイクロチャンバ内では環境因子の濃度変化が大きくなるため、比較的短時間で測定を行うことができる。
本実施形態の細胞活性測定方法は、例えば以下の用途に利用することができる。
(用途例1:幹細胞の培養管理プロセスでの利用)
再生医療分野では、幹細胞(iPS細胞、ES細胞)をインビトロで増殖、分化させて、所望の細胞組織を生成する培養管理プロセスが存在する。上記の培養管理プロセスでは、細胞の分化の成否、細胞の癌化や感染の有無を管理するために、培養細胞の生物学的活性を測定することが不可欠となる。
上記の培養管理プロセスでは、幹細胞から生成される細胞組織を人体に戻すことが前提となる。そのため、上記の培養管理プロセスでは、染色や遺伝子導入を必要とせず、かつ培養細胞に非侵襲である活性評価方法が必要とされている。本実施形態の細胞活性測定方法は、かかる幹細胞の培養管理プロセスにおいて有用である。
再生医療分野では、幹細胞(iPS細胞、ES細胞)をインビトロで増殖、分化させて、所望の細胞組織を生成する培養管理プロセスが存在する。上記の培養管理プロセスでは、細胞の分化の成否、細胞の癌化や感染の有無を管理するために、培養細胞の生物学的活性を測定することが不可欠となる。
上記の培養管理プロセスでは、幹細胞から生成される細胞組織を人体に戻すことが前提となる。そのため、上記の培養管理プロセスでは、染色や遺伝子導入を必要とせず、かつ培養細胞に非侵襲である活性評価方法が必要とされている。本実施形態の細胞活性測定方法は、かかる幹細胞の培養管理プロセスにおいて有用である。
(用途例2:卵細胞の選別での利用)
体外受精では、成功率を高めるために、より活性の高い受精卵を選別して子宮内に戻すことが行われている。上記の体外受精においても、染色や遺伝子導入を必要とせず、かつ卵細胞に非侵襲である活性評価方法が必要とされている。
かかる受精卵の活性測定の一例として、酸素センサを受精卵近傍に近づけて酸素濃度を求める手法が検討されている。しかし、細胞の代謝物は培地全体に拡散されることから、精度のよい活性測定は困難であった。
本実施形態の細胞活性測定方法は、かかる卵細胞の選別の工程において有用である。
体外受精では、成功率を高めるために、より活性の高い受精卵を選別して子宮内に戻すことが行われている。上記の体外受精においても、染色や遺伝子導入を必要とせず、かつ卵細胞に非侵襲である活性評価方法が必要とされている。
かかる受精卵の活性測定の一例として、酸素センサを受精卵近傍に近づけて酸素濃度を求める手法が検討されている。しかし、細胞の代謝物は培地全体に拡散されることから、精度のよい活性測定は困難であった。
本実施形態の細胞活性測定方法は、かかる卵細胞の選別の工程において有用である。
(用途例3:医薬品のスクリーニングでの利用)
医薬品のスクリーニングでは、医薬品が人体に及ぼす影響を確認するために、薬剤に感作された細胞の活性測定が行われる。一例として、新薬投与による心筋梗塞の有無を評価する場合、幹細胞から分化誘導した心筋細胞に薬剤を感作させて、その細胞の活性測定によって医薬品の安全性を評価することが想定される。
本実施形態の細胞活性測定方法は、かかる医薬品のスクリーニングの工程において有用である。
医薬品のスクリーニングでは、医薬品が人体に及ぼす影響を確認するために、薬剤に感作された細胞の活性測定が行われる。一例として、新薬投与による心筋梗塞の有無を評価する場合、幹細胞から分化誘導した心筋細胞に薬剤を感作させて、その細胞の活性測定によって医薬品の安全性を評価することが想定される。
本実施形態の細胞活性測定方法は、かかる医薬品のスクリーニングの工程において有用である。
≪細胞活性測定用デバイスの製造方法≫
1実施形態において、本発明は、上記実施形態の細胞活性測定用デバイスの製造方法を提供する。本実施形態の製造方法は、(a)測定対象である環境因子の量に応じて光学的変化を生じる材料で形成され、凸部を一面側に有する、環境因子検出プローブ層を用意する工程と、(b)前記環境因子検出プローブ層の前記凸部を有する面上に、前記凸部が覆われるように前記環境因子の透過を阻害する材料を塗布して第1層を形成する工程と、(c)前記第1層上に、前記環境因子検出プローブ層の前記凸部に対応する位置にマイクロレンズが一体成形された、第2層を形成する工程と、(d)前記環境因子検出プローブ層が、前記環境因子検出プローブ層の前記凸部に対応する位置に形成された前記第1層の凹部の内面のみに残るように、前記環境因子検出プローブ層を除去し、前記凹部の内面に環境因子検出プローブを形成する工程と、を含む。
1実施形態において、本発明は、上記実施形態の細胞活性測定用デバイスの製造方法を提供する。本実施形態の製造方法は、(a)測定対象である環境因子の量に応じて光学的変化を生じる材料で形成され、凸部を一面側に有する、環境因子検出プローブ層を用意する工程と、(b)前記環境因子検出プローブ層の前記凸部を有する面上に、前記凸部が覆われるように前記環境因子の透過を阻害する材料を塗布して第1層を形成する工程と、(c)前記第1層上に、前記環境因子検出プローブ層の前記凸部に対応する位置にマイクロレンズが一体成形された、第2層を形成する工程と、(d)前記環境因子検出プローブ層が、前記環境因子検出プローブ層の前記凸部に対応する位置に形成された前記第1層の凹部の内面のみに残るように、前記環境因子検出プローブ層を除去し、前記凹部の内面に環境因子検出プローブを形成する工程と、を含む。
図7は、本実施形態の製造方法の一例を示す概略図である。
まず、測定対象である環境因子の量に応じて光学的変化を生じる材料で構成される環境因子検出プローブ層31を用意する。環境因子検出プローブ層31は、凸部(以下、「プローブ層凸部」という。)33を一面側に有している(図7(1);工程(a))。なお、環境因子検出プローブ層31の一面側は、プローブ層凸部33を有する結果として、プローブ層凹部32を有している。プローブ層凹部32とプローブ層凸部33とは、互いに環境因子検出プローブ層31の一面側における高さが異なる。プローブ層凹部32は、環境因子検出プローブ層31の一面側において、2以上の凸部を形成した結果として、形成されてもよい。また、プローブ層凸部33は、環境因子検出プローブ層31の一面側において、2以上の凹部を形成した結果として形成されてもよい。
次に、環境因子検出プローブ層31のプローブ層凸部33を有する面上に、測定対象の環境因子の透過を阻害する材料を塗布して第1層10を形成する。第1層10は、第1層10によりプローブ層凸部33が覆われるように形成される(図7(2);工程(b))。環境因子検出プローブ層31の、プローブ層凹部32に対応する位置には第1層凸部16が形成され、プローブ層凸部33に対応する位置には第1層凹部15が形成される。
次に、第1層10上に、第2層20を形成する。第2層20の、プローブ層凸部33に対応する位置には、マイクロレンズ21が一体成形されている(図7(3)〜(5);工程(c))。すなわち、第2層20の第1層凹部15に対応する位置に、マイクロレンズ21が一体形成される。なお、図7の例では、マイクロレンズ形状の凹部71を有するモールド70を用いて、第2層20にマイクロレンズ21を一体成形している。
次に、環境因子検出プローブ層31を除去する。この際、環境因子検出プローブ層31が、プローブ層凸部33に対応する位置に形成された第1層凹部15の内面のみに残るように、環境因子検出プローブ層31の除去を行う。これにより、第1層凹部15の内面に環境因子検出プローブ30が形成される(図7(6);工程(d))。
なお、図7の例では、最後にモールド70を離型して、細胞活性測定用デバイス1を製造している(図7(7))。
以下、本実施形態の製造方法における各工程について説明する。
まず、測定対象である環境因子の量に応じて光学的変化を生じる材料で構成される環境因子検出プローブ層31を用意する。環境因子検出プローブ層31は、凸部(以下、「プローブ層凸部」という。)33を一面側に有している(図7(1);工程(a))。なお、環境因子検出プローブ層31の一面側は、プローブ層凸部33を有する結果として、プローブ層凹部32を有している。プローブ層凹部32とプローブ層凸部33とは、互いに環境因子検出プローブ層31の一面側における高さが異なる。プローブ層凹部32は、環境因子検出プローブ層31の一面側において、2以上の凸部を形成した結果として、形成されてもよい。また、プローブ層凸部33は、環境因子検出プローブ層31の一面側において、2以上の凹部を形成した結果として形成されてもよい。
次に、環境因子検出プローブ層31のプローブ層凸部33を有する面上に、測定対象の環境因子の透過を阻害する材料を塗布して第1層10を形成する。第1層10は、第1層10によりプローブ層凸部33が覆われるように形成される(図7(2);工程(b))。環境因子検出プローブ層31の、プローブ層凹部32に対応する位置には第1層凸部16が形成され、プローブ層凸部33に対応する位置には第1層凹部15が形成される。
次に、第1層10上に、第2層20を形成する。第2層20の、プローブ層凸部33に対応する位置には、マイクロレンズ21が一体成形されている(図7(3)〜(5);工程(c))。すなわち、第2層20の第1層凹部15に対応する位置に、マイクロレンズ21が一体形成される。なお、図7の例では、マイクロレンズ形状の凹部71を有するモールド70を用いて、第2層20にマイクロレンズ21を一体成形している。
次に、環境因子検出プローブ層31を除去する。この際、環境因子検出プローブ層31が、プローブ層凸部33に対応する位置に形成された第1層凹部15の内面のみに残るように、環境因子検出プローブ層31の除去を行う。これにより、第1層凹部15の内面に環境因子検出プローブ30が形成される(図7(6);工程(d))。
なお、図7の例では、最後にモールド70を離型して、細胞活性測定用デバイス1を製造している(図7(7))。
以下、本実施形態の製造方法における各工程について説明する。
(工程(a))
工程(a)は、測定対象である環境因子の量に応じて光学的変化を生じる材料で形成され、凸部(プローブ層凸部)を一面側に有する、環境因子検出プローブ層を用意する工程である。
工程(a)は、測定対象である環境因子の量に応じて光学的変化を生じる材料で形成され、凸部(プローブ層凸部)を一面側に有する、環境因子検出プローブ層を用意する工程である。
環境因子検出プローブ層31は、測定対象である環境因子の量に応じて光学的変化を生じる材料(以下、「環境因子検出材料」という。)で形成される。例えば、環境因子が酸素である場合、酸素の量に依存してリン光寿命が変化するリン光試薬を含む材料で、環境因子検出プローブ層が形成されてもよい。リン光試薬の例としては、上記「≪細胞活性測定用デバイス≫」で挙げたものと同様のものが挙げられる。
環境因子検出プローブ層31は、公知の方法を特に制限なく用いて、形成することができる。例えば、平板基板上に、環境因子検出材料を塗布して、環境因子検出材料からなる層を形成し、当該層の一面側にプローブ層凹部32及びプローブ層凸部33を形成することにより、環境因子検出プローブ層31を形成してもよい。環境因子検出材料からなる層の形成には、例えば、スピンコート法、ディップコート法、スリットダイコート法、スプレーコート法等を用いることができる。また、プローブ層凹部32及びプローブ層凸部33の形成には、例えば、マイクロブラスト法、ドライエッチング法等を用いることができる。
あるいは、平板基板上に、環境因子検出材料を塗布し、凹凸形状を有するモールドをプレスすることにより、プローブ層凹部32及びプローブ層凸部33を一面側に有する環境因子検出プローブ層31を形成してもよい。
あるいは、環境因子検出材料で形成された既存の樹脂シートに、上記のような方法でプローブ層凹部32及びプローブ層凸部33を形成して、環境因子検出プローブ層31として用いてもよい。例えば、環境因子が酸素である場合には、PtOEPを含むスチレン樹脂シート等を用いることができる。
環境因子検出プローブ層31の厚さは、製造予定の細胞活性測定用デバイス1におけるマイクロチャンバ11の高さh11以上であれば、特に限定されない。環境因子検出プローブ層31の厚さとしては、例えば、10〜300μmが挙げられる。環境因子検出プローブ層31の厚さは、50〜200μmであってもよく、100〜200μmであってもよい。
また、プローブ層凹部32及びプローブ層凸部33のサイズは、製造予定の細胞活性測定用デバイス1におけるマイクロチャンバ11のサイズに応じて、適宜選択すればよい。本実施形態の製造方法により製造される細胞活性測定用デバイス1において、マイクロチャンバ11のサイズは、本工程におけるプローブ層凸部33のサイズに規定される。そのため、プローブ層凸部33のサイズとしては、上記「≪細胞活性測定用デバイス≫」において、マイクロチャンバ11のサイズとして挙げたものと同様のものが挙げられる。また、プローブ層凹部32の幅は、細胞活性測定用デバイス1におけるマイクロチャンバ11間の距離を規定する。
(工程(b))
工程(b)は、環境因子検出プローブ層のプローブ層凸部を有する面上に、プローブ層凸部が覆われるように、測定対象である環境因子の透過を阻害する材料を塗布して第1層を形成する工程である。
工程(b)は、環境因子検出プローブ層のプローブ層凸部を有する面上に、プローブ層凸部が覆われるように、測定対象である環境因子の透過を阻害する材料を塗布して第1層を形成する工程である。
本工程において、第1層10は、測定対象である環境因子の透過を阻害する材料(以下、「環境因子透過阻害材料」という。)で形成される。第1層10を形成する材料は、測定対象である環境因子の種類に応じて、適宜選択すればよく、上記「≪細胞活性測定用デバイス≫」で挙げたものと同様のものが挙げられる。
環境因子検出プローブ層31のプローブ層凸部33を有する面に、環境因子透過阻害材料を塗布する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いればよい。たとえば、スピンコート法、ディップコート法、スリットダイコート法、スプレーコート法等を用いることができる。なお、環境因子透過阻害材料は、プローブ層凸部33が覆われるように塗布され、第1層10は、プローブ層凸部33を覆うように形成される。
環境因子検出プローブ層31のプローブ層凸部33を有する面に、環境因子透過阻害材料を塗布する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いればよい。たとえば、スピンコート法、ディップコート法、スリットダイコート法、スプレーコート法等を用いることができる。なお、環境因子透過阻害材料は、プローブ層凸部33が覆われるように塗布され、第1層10は、プローブ層凸部33を覆うように形成される。
上記のように、環境因子検出プローブ層31上に第1層10を形成すると、第1層10の環境因子検出プローブ層31に接する面には、プローブ層凸部33及びプローブ層凹部32のそれぞれ対応する位置に、第1層凹部15及び第1層凸部16が形成される。
本工程において形成される第1層10の厚さ(第1層凸部16の先端から他面側まで)は、特に限定されないが、上記「≪細胞活性測定用デバイス≫」において第1層の厚さt10として例示したものと、同様のものが例示される。
(工程(c))
工程(c)は、第1層上に、前記環境因子検出プローブ層の凸部に対応する位置にマイクロレンズが一体成形された、第2層を形成する工程である。
工程(c)は、第1層上に、前記環境因子検出プローブ層の凸部に対応する位置にマイクロレンズが一体成形された、第2層を形成する工程である。
本工程において、第2層20は、第1層10と異なる材料で形成されてもよく、同じ材料で形成されてもよい。第2層20を形成する材料としては、上記「≪細胞活性測定用デバイス≫」で挙げたものと同様のものが挙げられる。また、塗布方法としては、第1層10の形成において例示した方法と同様の方法が例示される。
本工程において形成される第2層20の厚さは、特に限定されず、製造予定の細胞活性測定用デバイス1における第2層20の厚さt20及びマイクロレンズ21の厚みdに応じて、適宜選択すればよい。
第2層20は、環境因子検出プローブ層31のプローブ層凸部に対応する位置に(すなわち第1層凹部15の対応する位置に)、マイクロレンズ21が一体成形されている。
第2層20にマイクロレンズ21を一体成形する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、図7の例では、第1層上に、第2層を形成する材料を塗布して第2層20(マイクロレンズ21を有さない第2層20)を形成し、マイクロレンズ形状の凹部71を有するモールド70を、第2層20に押し当て、第2層20を硬化することにより、マイクロレンズ21の一体成形を行っている。モールド70を用いてマイクロレンズ21の一体成形を行うことにより、環境因子検出プローブ層31のプローブ層凸部33に対応する位置(すなわち、第1層凹部15に対応する位置)へのマイクロレンズ21の配置を容易に行うことができる。
第2層20にマイクロレンズ21を一体成形する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、図7の例では、第1層上に、第2層を形成する材料を塗布して第2層20(マイクロレンズ21を有さない第2層20)を形成し、マイクロレンズ形状の凹部71を有するモールド70を、第2層20に押し当て、第2層20を硬化することにより、マイクロレンズ21の一体成形を行っている。モールド70を用いてマイクロレンズ21の一体成形を行うことにより、環境因子検出プローブ層31のプローブ層凸部33に対応する位置(すなわち、第1層凹部15に対応する位置)へのマイクロレンズ21の配置を容易に行うことができる。
モールド70を第2層20に押し当てた後、第2層20を硬化させる方法は、第2層20を形成する材料に応じて、適宜選択すればよい。例えば、第2層20が紫外線硬化樹脂で形成される場合には、紫外線照射により第2層20を硬化させることができる。また、第2層20が熱硬化樹脂で形成される場合には、熱を加えることにより第2層20を硬化させることができる。
(工程(d))
工程(d)は、環境因子検出プローブ層が、プローブ層凸部に対応する位置に形成された第1層の凹部の内面のみに残るように、環境因子検出プローブ層を除去し、第1層凹部の内面に環境因子検出プローブを形成する工程である。
工程(d)は、環境因子検出プローブ層が、プローブ層凸部に対応する位置に形成された第1層の凹部の内面のみに残るように、環境因子検出プローブ層を除去し、第1層凹部の内面に環境因子検出プローブを形成する工程である。
本工程では、環境因子検出プローブ層31が、第1層凹部15の内面のみに残るように、、環境因子検出プローブ層31を除去する。なお、「第1層凹部15の内面のみに残る」とは、第1層凹部15の内面の少なくとも一部が、環境因子検出プローブ層31で被覆されている状態を指し、且つ第1層凹部15全体が環境因子検出プローブ層31で満たされた状態は除かれる。第1層凹部15の内面に残された環境因子検出プローブ層31は、第1層凹部15の内面全体を被覆してもよく、内面の一部のみを被覆していてもよい。一例として、環境因子検出プローブ層31は、第1層凹部15の内面の一部のみに残るようにする。第1層凹部15の内面に残された環境因子検出プローブ層31は、第1層凹部15の底部内面及び内側面の少なくとも一部を被覆し、環境因子検出プローブ30を形成する。
第1層凹部15の内面に残す環境因子検出プローブ層31の位置及び厚さは、特に限定されず、形成する環境因子検出プローブ30の配置及び厚さt30に応じて、適宜選択すればよい。環境因子検出プローブ30の位置及び厚さt30としては、「≪細胞活性測定用デバイス≫」で挙げた例と同様の例が挙げられる。
第1層凹部15の内面に残す環境因子検出プローブ層31の位置及び厚さは、特に限定されず、形成する環境因子検出プローブ30の配置及び厚さt30に応じて、適宜選択すればよい。環境因子検出プローブ30の位置及び厚さt30としては、「≪細胞活性測定用デバイス≫」で挙げた例と同様の例が挙げられる。
環境因子検出プローブ層31の除去方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、ドライエッチング法、マイクロブラスト法等を用いることができる。
(他の工程)
本実施形態の製造方法は、上記工程(a)〜(d)に加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、モールドを離型する工程(離型工程)、環境因子検出プローブ層を発泡させる工程(発泡工程)等が挙げられる。
本実施形態の製造方法は、上記工程(a)〜(d)に加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、モールドを離型する工程(離型工程)、環境因子検出プローブ層を発泡させる工程(発泡工程)等が挙げられる。
<離型工程>
工程(c)において、モールド70を用いてマイクロレンズ21の一体成形を行った場合、本実施形態の製造方法は、モールド70を離型する工程を含んでいてもよい。モールド70の離型は、工程(d)の後に行ってもよく、工程(c)と工程(d)との間に行ってもよい。
工程(c)において、モールド70を用いてマイクロレンズ21の一体成形を行った場合、本実施形態の製造方法は、モールド70を離型する工程を含んでいてもよい。モールド70の離型は、工程(d)の後に行ってもよく、工程(c)と工程(d)との間に行ってもよい。
<発泡工程>
環境因子検出プローブ層31が、発泡剤を含む環境因子検出材料で形成されている場合、本実施形態の製造方法は、当該発泡剤を反応させて、環境因子検出プローブ層31を発泡させる工程を含んでいてもよい。この場合、環境因子検出プローブ30が多孔質である、細胞活性測定用デバイス1を製造することができる。図8は、発泡工程を含む場合の本実施形態の製造方法の一例を示す概略図である。
環境因子検出プローブ層31が、発泡剤を含む環境因子検出材料で形成されている場合、本実施形態の製造方法は、当該発泡剤を反応させて、環境因子検出プローブ層31を発泡させる工程を含んでいてもよい。この場合、環境因子検出プローブ30が多孔質である、細胞活性測定用デバイス1を製造することができる。図8は、発泡工程を含む場合の本実施形態の製造方法の一例を示す概略図である。
発泡工程を含む場合、工程(a)では、発泡剤を含む環境因子検出材料で形成された環境因子検出プローブ層を用意する。図8の例では、発泡剤を含む環境因子検出材料を用いて形成された環境因子検出プローブ層を31’で示している。
発泡工程は、一例として、工程(c)と工程(d)との間に行う。本実施形態の製造方法が、離型工程を含み、離型工程を工程(c)と工程(d)との間に行う場合には、発泡工程は離型工程の前に行ってもよく、離型工程の後に行ってもよい。
図8の例では、図8(6)が発泡工程を示しており、発泡後の環境因子検出プローブ層を31”で示している。
発泡工程は、一例として、工程(c)と工程(d)との間に行う。本実施形態の製造方法が、離型工程を含み、離型工程を工程(c)と工程(d)との間に行う場合には、発泡工程は離型工程の前に行ってもよく、離型工程の後に行ってもよい。
図8の例では、図8(6)が発泡工程を示しており、発泡後の環境因子検出プローブ層を31”で示している。
環境因子検出プローブ層31’を発泡させる工程では、環境因子検出プローブ層31’に含まれる発泡剤を反応させて、環境因子検出プローブ層31’を発泡させる。発泡剤を反応させる方法は、発泡剤の種類に応じて、適宜選択すればよい。発泡剤としては、例えば、炭酸カルシウムを用いることができ、この場合、ベーク処理を行うことにより反応させることができる。
本実施形態の製造方法によれば、個々のマイクロチャンバに対応する位置に、マイクロレンズを効率よく配置することができる。そのため、上記実施形態の細胞活性測定用デバイスの製造を効率よく行うことができる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
第1層をEVOH、第2層をPDMS、第2層の厚さt20=100μm、マイクロチャンバの直径φ11=100μmの細胞活性測定用デバイスを仮定し、マイクロレンズの厚みd及び曲率半径Rの一方を固定し、一方を変動させた場合に、環境因子検出プローブが受光する光強度を計算した。
照射光としては、383nmの紫外線を仮定した。PDMSにおける383nmの紫外線の屈折率はn=1.44とした。計算の簡略化のために、EVOHはPDMSと光学的に等価とした。
マイクロレンズありの場合の光強度をI、マイクロレンズ無しの場合の光強度をI0とすると受光強度比は下記式で与えられる。
照射光としては、383nmの紫外線を仮定した。PDMSにおける383nmの紫外線の屈折率はn=1.44とした。計算の簡略化のために、EVOHはPDMSと光学的に等価とした。
マイクロレンズありの場合の光強度をI、マイクロレンズ無しの場合の光強度をI0とすると受光強度比は下記式で与えられる。
図9は、マイクロレンズの曲率半径R=150μmに固定し、厚みdを変動させた場合の環境因子検出プローブが受光する光強度を示すグラフである。図10は、マイクロレンズの厚みd=50μmに固定し、曲率半径Rを変動させた場合の環境因子検出プローブが受光する光強度を示すグラフである。図9及び図10のグラフ中、「受光強度比」は、マイクロレンズがない場合の受光強度を1とした場合の比率を示す。
図9及び図10において受光強度を算出した範囲では、いずれの場合も、マイクロレンズがない場合と比較して、受光強度が1.5倍以上となった。マイクロレンズの厚みd=50μm、曲率半径R=150μmとしたとき、マイクロレンズがない場合と比較して受光強度は約2倍となった。
図9及び図10において受光強度を算出した範囲では、いずれの場合も、マイクロレンズがない場合と比較して、受光強度が1.5倍以上となった。マイクロレンズの厚みd=50μm、曲率半径R=150μmとしたとき、マイクロレンズがない場合と比較して受光強度は約2倍となった。
1…細胞活性測定用デバイス、10…第1層、11、11a、11b…マイクロチャンバ、15…第1層凹部、16…第1層凸部、20…第2層、21、21a、21b…マイクロレンズ、30…環境因子検出プローブ、31…環境因子検出プローブ層、31’…発泡剤を含む環境因子検出プローブ層、31”…発泡させた環境因子検出プローブ層、32…プローブ層凹部、33…プローブ層凸部、40…光源、50…培養容器、60…細胞、70…モールド、71…モールドの凹部
Claims (12)
- 一面側にマイクロチャンバを有し、測定対象である環境因子の透過を阻害する材料で構成された第1層と、
前記第1層の、前記マイクロチャンバを有する面の他面側に積層された第2層と、
前記マイクロチャンバの内面に配置され、前記環境因子の量に応じて光学的変化を生じる環境因子検出プローブと、
前記第2層の、前記第1層と接する面の他面側において、前記マイクロチャンバに対応する位置に配置され、前記第2層と一体成形されたマイクロレンズと、
を備える細胞活性測定用デバイス。 - 前記環境因子検出プローブが多孔質である、請求項1に記載の細胞活性測定用デバイス。
- 前記マイクロチャンバは、前記マイクロチャンバの底部及び開口部の中心を結ぶ中心軸に直行する断面積aが、前記マイクロチャンバの底部からの距離がl1である断面積a1と、前記マイクロチャンバの底部からの距離がl2である断面積a2と、を有し、l2>l1のときa2>a1であり、
前記マイクロチャンバの内側面の少なくとも一部に、前記環境因子検出プローブが配置されている、
請求項1又は2に記載の細胞活性測定用デバイス。 - 前記第1層及び前記第2層が、透光性を有する材料で形成されている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞活性測定用デバイス。
- 前記環境因子検出プローブを2種以上備え、前記2種以上の環境因子検出プローブが、それぞれ異なる種類の環境因子の量に応じて光学的変化を生じる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細胞活性測定用デバイス。
- 前記環境因子の少なくとも1種が酸素であり、前記第1層が酸素の透過を阻害する材料で形成されている、請求項1〜5のいずれか一項に記載の細胞活性測定用デバイス。
- 前記環境因子検出プローブの少なくとも1種が、酸素濃度に依存してリン光寿命が変化する材料を含む、請求項6に記載の細胞活性測定用デバイス。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の細胞活性測定用デバイスを細胞に被せて、前記マイクロチャンバに、前記細胞を収容する工程と、
前記マイクロレンズが一体成形された一面側から、前記細胞活性測定用デバイスに光を照射する工程と、
前記環境因子検出プローブに生じる光学的変化を検出する工程と、
を含む、細胞活性測定方法。 - (a)測定対象である環境因子の量に応じて光学的変化を生じる材料で形成され、凸部を一面側に有する、環境因子検出プローブ層を用意する工程と、
(b)前記環境因子検出プローブ層の前記凸部を有する面上に、前記凸部が覆われるように前記環境因子の透過を阻害する材料を塗布して第1層を形成する工程と、
(c)前記第1層上に、前記環境因子検出プローブ層の凸部に対応する位置にマイクロレンズが一体成形された第2層を形成する工程と、
(d)前記環境因子検出プローブ層が、前記環境因子検出プローブ層の凸部に対応する位置に形成された前記第1層の凹部の内面のみに残るように、前記環境因子検出プローブ層を除去し、前記凹部の内面に環境因子検出プローブを形成する工程と、
を含む、細胞活性測定用デバイスの製造方法。 - 前記環境因子検出プローブ層が発泡剤を含み、
前記発泡剤を反応させて、前記環境因子検出プローブ層を発泡させる工程を、さらに含む、
請求項9に記載の細胞活性測定用デバイスの製造方法。 - 前記工程(c)が、前記第1層上に、第2層を形成する材料を塗布して第2層を形成し、マイクロレンズ形状の凹部を有するモールドを、前記第2層に押し当てて硬化させること、を含む、
請求項9又は10に記載の細胞活性測定用デバイスの製造方法。 - 前記工程(d)において、前記環境因子検出プローブ層が、前記第1層の凹部の内面の一部のみに残るように前記環境因子検出プローブ層を除去する、
請求項9〜11のいずれか一項に記載の細胞活性測定用デバイスの製造方法。
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JP2017162331A JP2019037180A (ja) | 2017-08-25 | 2017-08-25 | 細胞活性測定用デバイス、細胞活性測定方法、及び細胞活性測定用デバイスの製造方法 |
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JP2017162331A Pending JP2019037180A (ja) | 2017-08-25 | 2017-08-25 | 細胞活性測定用デバイス、細胞活性測定方法、及び細胞活性測定用デバイスの製造方法 |
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