JP2019024422A - Cell dissociation agent, cell dissociation method and method for producing cell sheet - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞解離剤、細胞解離方法および細胞シートの製造方法に関する。 The present invention relates to a cell dissociation agent, a cell dissociation method, and a method for producing a cell sheet.
細胞培養用の基材上で細胞を培養すると、細胞の表面上に存在するタンパク質（例えば、インテグリンなど）を介して、細胞は該基材の表面に接着し、当該接着を維持した状態で、細胞は増殖する。細胞が該基材上において高密度にまで増殖した時、継代のために、細胞を基材から解離させて、当該細胞を回収する必要がある。細胞を回収する時、従来から、公知の細胞解離剤を用いて、細胞を上記基材の表面から解離している。一般的に用いられる細胞解離剤として、タンパク質分解酵素であるトリプシンが挙げられる。トリプシンは、細胞の表面上に存在するタンパク質および細胞外マトリックスを構成するタンパク質を分解することにより、細胞を基材表面から解離させる。 When cells are cultured on a substrate for cell culture, the cells adhere to the surface of the substrate via a protein (for example, integrin) existing on the surface of the cell and maintain the adhesion. Cells proliferate. When cells grow to a high density on the substrate, it is necessary to dissociate the cells from the substrate and recover the cells for passage. When cells are collected, cells are conventionally dissociated from the surface of the substrate using a known cell dissociating agent. A commonly used cell dissociator is trypsin which is a proteolytic enzyme. Trypsin dissociates cells from the substrate surface by degrading proteins present on the surface of the cells and proteins that make up the extracellular matrix.
しかしながら、トリプシンは、タンパク質分解能力が非常に高いため、細胞の表面上に存在するタンパク質を過剰に分解してしまう。そのため、従来の細胞解離剤は、細胞へ与えるダメージが大きいという問題を有していた。 However, since trypsin has a very high proteolytic ability, it excessively degrades proteins present on the surface of cells. Therefore, the conventional cell dissociating agent has a problem that damage to cells is large.
細胞へ与えるダメージが大きいと、（ｉ）細胞の増殖能を低下させてしまう虞、（ｉｉ）細胞の分化能を低下させてしまう虞、（ｉｉｉ）細胞表面上に存在するタンパク質を研究対象としている場合、トリプシンを用いて基材の表面から細胞を解離すると、所望のタンパク質の収率が低下する虞、がある。それ故に、細胞にダメージを与えることなく、基材から細胞を解離する手段（より具体的に、細胞の表面上に存在するタンパク質を分解することなく、該タンパク質を残存させたまま基材から細胞を解離する手段）が求められている。 If the damage to the cell is large, (i) the possibility of reducing the proliferation ability of the cell, (ii) the possibility of reducing the differentiation ability of the cell, (iii) the protein present on the cell surface as a research object If the cells are dissociated from the surface of the substrate using trypsin, the yield of the desired protein may be reduced. Therefore, a means for dissociating the cell from the substrate without damaging the cell (more specifically, the cell is removed from the substrate while leaving the protein remaining without decomposing the protein present on the surface of the cell. Is required.
本発明の一態様は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞へ与えるダメージが小さい細胞解離剤、および、当該細胞解離剤の用途を提供することにある。 One embodiment of the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a cell dissociation agent with small damage to cells and use of the cell dissociation agent.
上記の課題を解決するために、本発明者は、特定のアミノ酸単体を有効成分として含有する細胞解離剤が、細胞の表面上に存在するタンパク質を分解することなく細胞を基材から解離させることを見出し、本発明を完成させるに至った。 In order to solve the above problems, the present inventor has made it possible for a cell dissociation agent containing a specific amino acid as an active ingredient to dissociate cells from a substrate without decomposing proteins present on the surface of the cells. As a result, the present invention has been completed.
本発明の細胞解離剤は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸、または、当該アミノ酸の誘導体を有効成分として含有しているものであることを特徴としている。 The cell dissociation agent of the present invention comprises arginine, lysine, histidine, asparagine, glutamic acid, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, cysteine, methionine, aspartic acid, glutamine, proline, phenylalanine, tryptophan, tyrosine It is characterized by containing one or more amino acids selected from the group or derivatives of the amino acids as active ingredients.
本発明の細胞溶解剤に含有される上記アミノ酸の誘導体は、アグマチン、カダベリン、ヒスタミン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、メタナミン、エタナミン、イソブチルアミン、イソアミルアミン、２−メチルブチルアミン、エタノールアミン、１−アミノ−２−プロパノール、シスタミン、３−メチルチオプロピルアミン、γ−アミノ酪酸、γ−アミノブチルアミド、ピロリジン、フェネチルアミン、トリプタミン、または、チラミンであることが好ましい。 Derivatives of the above amino acids contained in the cytolytic agent of the present invention include agmatine, cadaverine, histamine, β-alanine, γ-aminobutyric acid, methamamine, etanamine, isobutylamine, isoamylamine, 2-methylbutylamine, ethanolamine, 1 Amino-2-propanol, cystamine, 3-methylthiopropylamine, γ-aminobutyric acid, γ-aminobutyramide, pyrrolidine, phenethylamine, tryptamine, or tyramine is preferable.
本発明の細胞解離方法は、基材に接着している細胞と、細胞解離剤とを接触させる工程を有し、上記細胞解離剤は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸、または、当該アミノ酸の誘導体を有効成分として含有しているものであることを特徴としている。 The cell dissociation method of the present invention includes a step of bringing a cell adhering to a base material into contact with a cell dissociation agent, and the cell dissociation agent includes arginine, lysine, histidine, asparagine, glutamic acid, glycine, alanine, Contains one or more amino acids selected from the group consisting of valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, cysteine, methionine, aspartic acid, glutamine, proline, phenylalanine, tryptophan, and tyrosine, or a derivative of the amino acid as an active ingredient It is characterized by being.
本発明の細胞シートの製造方法は、基材にシート状に接着している細胞と、細胞解離剤とを接触させる工程を有し、上記細胞解離剤は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸、または、当該アミノ酸の誘導体を有効成分として含有しているものであることを特徴としている。 The method for producing a cell sheet of the present invention includes a step of bringing a cell adhering to a base material into a sheet form and a cell dissociating agent, and the cell dissociating agent includes arginine, lysine, histidine, asparagine, and glutamic acid. One or more amino acids selected from the group consisting of glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, cysteine, methionine, aspartic acid, glutamine, proline, phenylalanine, tryptophan, tyrosine, or a derivative of the amino acid It is characterized by being contained as an active ingredient.
本発明の細胞解離剤および細胞解離方法は、細胞の表面上に存在するタンパク質を分解することなく、基材の表面から細胞を解離することができる。 The cell dissociation agent and cell dissociation method of the present invention can dissociate cells from the surface of the substrate without decomposing proteins present on the surface of the cells.
本発明の細胞シート製造方法は、細胞の表面上に存在するタンパク質を分解することなく細胞シートを作製することができるのみならず、高価な機器を必要とせず、容易に細胞シートを作製することができる。 The cell sheet production method of the present invention can not only produce a cell sheet without decomposing proteins present on the cell surface, but also easily produce a cell sheet without requiring expensive equipment. Can do.
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態および実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to this, and various modifications can be made within the scope of the claims, and the embodiments can be obtained by appropriately combining technical means disclosed in different embodiments and examples. The form is also included in the technical scope of the present invention. Unless otherwise specified in this specification, “A to B” indicating a numerical range means “A or more and B or less”.
＜１．発明の概要説明＞
細胞外マトリックスを構成するタンパク質（例えば、フィブロネクチンなど）が、細胞の表面上に存在する受容体（例えば、インテグリンなど）に結合することで、細胞と細胞外マトリックスとの間で接着が生じる。このとき、上記細胞外マトリックスを構成するタンパク質の部分配列としてＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）配列が存在し、当該ＲＧＤ配列に対して上記受容体が結合することが知られている。
<1. Summary of Invention>
A protein (for example, fibronectin and the like) constituting the extracellular matrix binds to a receptor (for example, integrin and the like) present on the surface of the cell, thereby causing adhesion between the cell and the extracellular matrix. At this time, an RGD (arginine-glycine-aspartic acid) sequence exists as a partial sequence of the protein constituting the extracellular matrix, and it is known that the receptor binds to the RGD sequence.
本発明者は、まず、細胞の表面上に存在する受容体へ３アミノ酸（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）からなるオリゴペプチドを競合的に結合させることで、当該受容体と細胞外マトリックスを構成するタンパク質との間の結合を阻害し、その結果、細胞を基材の表面から解離できるのではないかと考えた。そこで、本発明者は、ＲＧＤ配列からなるオリゴペプチドを含有する溶液を細胞へ接触させたが、細胞を基材の表面から解離させることが出来なかった（後述する実施例を参照）。 The inventor first constructs an extracellular matrix by competitively binding an oligopeptide consisting of 3 amino acids (arginine-glycine-aspartic acid) to a receptor present on the surface of the cell. It was thought that binding between proteins was inhibited, and as a result, cells could be dissociated from the surface of the substrate. Therefore, the present inventor brought a solution containing an oligopeptide comprising an RGD sequence into contact with the cells, but was unable to dissociate the cells from the surface of the substrate (see Examples described later).
ＲＧＤ配列は受容体に結合する最小単位のアミノ酸配列であると考えられていることから、当業者であれば、ＲＧＤ配列自体は変化させず、当該ＲＧＤ配列の両端に更にアミノ酸を結合させてアミノ酸数を増やすことにより、細胞外マトリックスを構成するタンパク質と細胞の表面上に存在する受容体との間の結合を阻害するポリペプチドを設計しようとするのが一般的である。 Since the RGD sequence is considered to be the amino acid sequence of the smallest unit that binds to the receptor, those skilled in the art do not change the RGD sequence itself, but further bind amino acids to both ends of the RGD sequence to form amino acids. By increasing the number, it is common to design polypeptides that inhibit the binding between the proteins that make up the extracellular matrix and the receptors present on the surface of the cells.
しかし、本発明者は、このような技術常識にとらわれることなく、アミノ酸単体を含有する溶液を細胞へ接触させることによって細胞を基材から解離できるのではないかとの独自の仮説の下で、実験を行った。その結果、本発明者は、アミノ酸単体によって細胞を基材から解離することに成功し、本発明を完成させるに至った（後述する実施例を参照）。 However, the present inventor is not limited to such common technical knowledge, and under the original hypothesis that the cell can be dissociated from the substrate by contacting the cell with a solution containing a single amino acid. Went. As a result, the present inventor succeeded in dissociating cells from the base material with a single amino acid, and completed the present invention (see Examples described later).
＜２．細胞解離剤＞
本発明の一実施形態にかかる細胞解離剤は、「細胞が接着している基材から当該細胞を解離させるための薬剤」を意図する。また、「細胞を細胞培養用基材の表面（培養液と接触する面）から解離する効果」を、以下「細胞解離効果」と称する。
<2. Cell dissociator>
The cell dissociation agent according to one embodiment of the present invention intends “an agent for dissociating the cell from the substrate to which the cell is adhered”. The “effect of dissociating cells from the surface of the cell culture substrate (the surface in contact with the culture medium)” is hereinafter referred to as “cell dissociation effect”.
上記細胞は、上記基材への接着性を有する細胞であれば、特に限定されない。本発明においては、例えば、軟骨細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、表皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞、肝細胞、膵細胞、筋細胞又はこれらの前駆細胞が挙げられる。また、細胞が由来する動物種も特に限定されず、動物種は、非ヒト哺乳類またはヒトであっても良い。非ヒト哺乳動物の例としては、霊長類（サル、類人猿など）、偶蹄類（ウシ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、奇蹄類（ウマなど）、齧歯類（マウス、ラット、ハムスター、リスなど）、ウサギ目（ウサギなど）、食肉類（イヌ、ネコ、フェレットなど）などが挙げられる。上述の非ヒト哺乳動物は、家畜またはコンパニオンアニマルであってもよく、野生動物であってもよい。 The cells are not particularly limited as long as the cells have adhesion to the substrate. In the present invention, for example, chondrocytes, osteoblasts, fibroblasts, epidermal cells, epithelial cells, adipocytes, hepatocytes, pancreatic cells, muscle cells, or precursor cells thereof can be mentioned. The animal species from which the cells are derived is not particularly limited, and the animal species may be a non-human mammal or a human. Examples of non-human mammals include primates (monkeys, apes, etc.), cloven-hoofers (cattle, wild boar, pigs, sheep, goats, etc.), odd-hoofed animals (such as horses), rodents (mouse, rats, hamsters). , Squirrel, etc.), rabbit eyes (rabbit, etc.), and meat (dogs, cats, ferrets, etc.). The non-human mammal described above may be a domestic animal, a companion animal, or a wild animal.
上記細胞は、株化された細胞であってもよいし、人工的に作製された細胞（例えば、ｉＰＳ：induced pluripotent stem cells）であってもよい。ｉＰＳ細胞は、生体移植に用いられる細胞である。それ故に、後述する「細胞シートの製造方法」においてｉＰＳ細胞をもちいれば、生体移植用の細胞シートを容易に作製することができる。 The cell may be a cell line or an artificially produced cell (for example, iPS: induced pluripotent stem cells). iPS cells are cells used for living transplantation. Therefore, if iPS cells are used in the “cell sheet manufacturing method” described later, a cell sheet for living transplantation can be easily prepared.
上記細胞解離剤は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸、または、当該アミノ酸の誘導体を有効成分として含有している。 The cell dissociator is a group consisting of arginine, lysine, histidine, asparagine, glutamic acid, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, cysteine, methionine, aspartic acid, glutamine, proline, phenylalanine, tryptophan, tyrosine. It contains one or more selected amino acids or derivatives of the amino acids as active ingredients.
なお、上記細胞解離剤は、上述したアミノ酸のうち１つを含有していても良いし、複数を含有していても良い。また、上記細胞解離剤は、上記アミノ酸の誘導体のうち１つを含有していても良いし、複数を含有していても良い。さらに、上記細胞解離剤は、上記アミノ酸および当該アミノ酸の誘導体を組み合わせて含有しているものであっても良い。 In addition, the said cell dissociation agent may contain one of the amino acids mentioned above, and may contain multiple. The cell dissociator may contain one or more of the amino acid derivatives. Further, the cell dissociator may contain a combination of the amino acid and a derivative of the amino acid.
上記構成によれば、細胞表面に存在するタンパク質を分解することなく、細胞へのダメージを低減させて、細胞を基材の表面から解離することができる。また、従来から用いられてきたトリプシン等と比較して、アミノ酸、および、アミノ酸の誘導体は、安価な物質である。それ故に、上記構成によれば、安価な細胞解離剤を実現できる。また、従来から用いられてきたトリプシン等と比較して、アミノ酸、および、アミノ酸の誘導体は、安定な物質である（例えば、熱によって変性し難い）。それ故に、上記構成によれば、安定な細胞解離剤（例えば、長期保存できる細胞解離剤）を実現できる。また、上記構成によれば、特別な装置を用いることなく、容易に細胞を基材の表面から解離することができる。また、アミノ酸、および、アミノ酸の誘導体は、細胞と細胞との間に形成される接着を解離させること無く、細胞と基材との間に形成される接着を、特異的に解離させることができる。それ故に、上記構成によれば、細胞と細胞との間に接着が形成された状態の細胞シートを、当該シート状を保ったままで、基材の表面から解離することができる。 According to the said structure, the damage to a cell can be reduced and the cell can be dissociated from the surface of a base material, without decomposing | disassembling the protein which exists on the cell surface. In addition, amino acids and amino acid derivatives are inexpensive materials compared to conventionally used trypsin and the like. Therefore, according to the said structure, an inexpensive cell dissociation agent is realizable. In addition, amino acids and amino acid derivatives are stable substances (for example, hardly denatured by heat) as compared with trypsin and the like conventionally used. Therefore, according to the above configuration, a stable cell dissociator (for example, a cell dissociator that can be stored for a long time) can be realized. Moreover, according to the said structure, a cell can be easily dissociated from the surface of a base material, without using a special apparatus. In addition, amino acids and amino acid derivatives can specifically dissociate the adhesion formed between the cell and the substrate without dissociating the adhesion formed between the cells. . Therefore, according to the said structure, the cell sheet of the state in which adhesion | attachment was formed between the cells can be dissociated from the surface of a base material, maintaining the said sheet form.
上記細胞解離剤は、突出して高い細胞解離効果が得られる細胞が存在するという観点から（後述する実施例を参照）、（ｉ）アルギニン、および／または、当該アミノ酸の誘導体を含有していることが最も好ましく、（ｉｉ）リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、および／または、当該アミノ酸の誘導体を含有していることが２番目に好ましく、（ｉｉｉ）アラニン、バリン、ロイシン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、トリプトファン、チロシン、および／または、当該アミノ酸の誘導体を含有していることが３番目に好ましい。 The cell dissociation agent contains (i) arginine and / or a derivative of the amino acid from the viewpoint that there are cells that protrude and have a high cell dissociation effect (see Examples below). (Ii) It is second preferred that it contains lysine, histidine, aspartic acid, glutamic acid, glycine, isoleucine, cysteine, methionine, phenylalanine and / or a derivative of said amino acid, and (iii) alanine , Valine, leucine, serine, threonine, asparagine, glutamine, proline, tryptophan, tyrosine, and / or a derivative of the amino acid is third preferred.
上記細胞解離剤に含有させるアミノ酸を、解離させたい細胞の種類に応じて適宜選択しても良い。例えば、解離させたい細胞がヒト（より具体的に、ヒト胎児腎）由来の細胞であれば、上記細胞解離剤は、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、システインのうちいずれかを含んでいることが好ましい。上記構成によれば、ヒト（より具体的に、ヒト胎児腎）由来の細胞に上記細胞解離剤を用いた場合に、より高い細胞解離効果が得られる。 The amino acid to be contained in the cell dissociator may be appropriately selected according to the type of cells to be dissociated. For example, if the cells to be dissociated are cells derived from humans (more specifically, human fetal kidney), the cell dissociating agent contains any one of arginine, aspartic acid, glutamic acid, glycine, isoleucine, and cysteine. Preferably it is. According to the said structure, when the said cell dissociation agent is used for the cell derived from a human (more specifically, a human fetal kidney), a higher cell dissociation effect is acquired.
上記アミノ酸の構造は、特に限定されず、Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸のいずれであっても良い。また、上記アミノ酸は天然に存在するアミノ酸であっても良いし、合成されたものであっても良く、さらに生体内に存在するアミノ酸であっても良い。より効率良く細胞を基材の表面から解離するという観点からは、Ｄ−アミノ酸よりもＬ−アミノ酸の方が好ましいといえる。 The structure of the amino acid is not particularly limited, and may be either a D-amino acid or an L-amino acid. The amino acid may be a naturally occurring amino acid, a synthesized amino acid, or an amino acid that exists in a living body. From the viewpoint of dissociating cells from the surface of the substrate more efficiently, it can be said that L-amino acid is preferable to D-amino acid.
上記細胞解離剤に含有されるアミノ酸の誘導体としては、例えば、上述のアミノ酸が脱炭酸化されたアミンが挙げられる。ここで、「アミノ酸が脱炭酸化されたアミン」とは、アミノ酸における、主鎖の「−ＣＯＯＨ」、または、側鎖の「−ＣＯＯＨ」が除かれた結果生じるアミンを意図する。なお、アミノ酸は、「ＨＯＯＣ−Ｃ（−Ｒ）−ＮＨ２」との一般式にて示すことができる。主鎖の「−ＣＯＯＨ」とは、一般式における「ＨＯＯＣ−」を意図し、側鎖の「−ＣＯＯＨ」とは、一般式における「−Ｒ」に含まれている「−ＣＯＯＨ」を意図する。より効率良く細胞を基材の表面から解離するという観点からは、「アミノ酸が脱炭酸化されたアミン」は、アミノ酸における主鎖の「−ＣＯＯＨ」が除かれた結果生じるアミンが好ましく、例えば「Ｈ−Ｃ（−Ｒ）−ＮＨ２」の一般式にて示されるアミンが好ましい。 Examples of amino acid derivatives contained in the cell dissociating agent include amines obtained by decarboxylation of the above-mentioned amino acids. Here, the “amine in which an amino acid is decarboxylated” intends an amine resulting from the removal of “—COOH” in the main chain or “—COOH” in the side chain in the amino acid. Incidentally, the amino acid can be shown by the general formula of the "HOOC-C (-R) -NH 2." The main chain “—COOH” intends “HOOC—” in the general formula, and the side chain “—COOH” means “—COOH” contained in “—R” in the general formula. . From the viewpoint of more efficiently dissociating cells from the surface of the substrate, the “amine decarboxylated” is preferably an amine resulting from removal of the main chain “—COOH” in the amino acid. The amine represented by the general formula of “H—C (—R) —NH 2 ” is preferable.
上記脱炭酸化されたアミンとしては、例えば、アグマチン、カダベリン、ヒスタミン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、メタナミン、エタナミン、イソブチルアミン、イソアミルアミン、２−メチルブチルアミン、エタノールアミン、１−アミノ−２−プロパノール、シスタミン、３−メチルチオプロピルアミン、γ−アミノ酪酸、γ−アミノブチルアミド、ピロリジン、フェネチルアミン、トリプタミン、または、チラミンを挙げることができる。 Examples of the decarboxylated amine include agmatine, cadaverine, histamine, β-alanine, γ-aminobutyric acid, methanamine, etanamine, isobutylamine, isoamylamine, 2-methylbutylamine, ethanolamine, 1-amino-2. Mention may be made of -propanol, cystamine, 3-methylthiopropylamine, γ-aminobutyric acid, γ-aminobutyramide, pyrrolidine, phenethylamine, tryptamine or tyramine.
上記細胞解離剤中に含まれる上記アミノ酸および／または上記アミノ酸の誘導体の含有量としては、特に限定されないが、終濃度にて１ｍＭ〜５００ｍＭであることが好ましく、２５ｍＭ〜１００ｍＭであることがより好ましい。上記アミノ酸および／または上記アミノ酸の誘導体の含有量は、溶媒への溶解のし易さ、および／または、アミノ酸の種類に応じて、適宜変更され得る。 The content of the amino acid and / or derivative of the amino acid contained in the cell dissociator is not particularly limited, but is preferably 1 mM to 500 mM, more preferably 25 mM to 100 mM at the final concentration. . The content of the amino acid and / or derivative of the amino acid can be appropriately changed depending on the ease of dissolution in a solvent and / or the type of amino acid.
また、上記細胞解離剤中に含まれる上記アミノ酸および／または上記アミノ酸の誘導体の含有量としては、特に限定されないが、細胞解離剤を１００重量％とした場合に、０．００１重量％〜１００重量％であってもよく、０．０１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜９５重量％であってもよく、０．１重量％〜９０重量％であってもよく、０．１重量％〜８０重量％であってもよく、０．１重量％〜７０重量％であってもよく、０．１重量％〜６０重量％であってもよく、０．１重量％〜５０重量％であってもよく、０．１重量％〜４０重量％であってもよく、０．１重量％〜３０重量％であってもよく、０．１重量％〜２０重量％であってもよく、０．１重量％〜１０重量％であってもよい。 Further, the content of the amino acid and / or derivative of the amino acid contained in the cell dissociation agent is not particularly limited, but 0.001% by weight to 100% by weight when the cell dissociation agent is 100% by weight. %, 0.01 wt% to 100 wt%, 0.1 wt% to 100 wt%, or 0.1 wt% to 95 wt% It may be 0.1% to 90% by weight, 0.1% to 80% by weight, 0.1% to 70% by weight, % By weight to 60% by weight, 0.1% to 50% by weight, 0.1% to 40% by weight, 0.1% to 30% by weight %, 0.1 wt% to 20 wt%, 0.1 wt% to 10 wt% It may be a%.
上記細胞解離剤のｐＨについては、上記アミノ酸および上記細胞へ影響を及ぼすことのないｐＨであれば、特に限定されない。例えば、上記細胞解離剤は、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．０に調製されてもよいし、ｐＨ７．２〜ｐＨ７．６に調製されてもよい。 The pH of the cell dissociator is not particularly limited as long as it does not affect the amino acids and the cells. For example, the cell dissociator may be adjusted to pH 7.0 to pH 8.0, or may be adjusted to pH 7.2 to pH 7.6.
上記細胞解離剤は、上記アミノ酸または上記アミノ酸の誘導体と異なる他の成分が含有されていても良い。該成分として、例えば、ｐＨを調節するための緩衝剤が挙げられる。当該緩衝剤としては、特に限定されないが、例えば、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）が挙げられる。また、当該緩衝剤としては、リン酸またはリン酸塩、ホウ酸またはホウ酸塩、クエン酸またはクエン酸塩、酢酸または酢酸塩、炭酸または炭酸塩、酒石酸または酒石酸塩、ε−アミノカプロン酸、トロメタモール等が挙げられる。上記リン酸塩としては、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等が挙げられる。上記ホウ酸塩としては、ホウ砂、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウム等が挙げられる。上記クエン酸塩としては、クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム等が挙げられる。上記酢酸塩としては、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等が挙げられる。上記炭酸塩としては、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられる。上記酒石酸塩としては、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウム等が挙げられる。 The cell dissociator may contain other components different from the amino acid or the amino acid derivative. Examples of the component include a buffer for adjusting pH. Although it does not specifically limit as the said buffering agent, For example, HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine etheric acid) is mentioned. The buffer includes phosphoric acid or phosphate, boric acid or borate, citric acid or citrate, acetic acid or acetate, carbonic acid or carbonate, tartaric acid or tartrate, ε-aminocaproic acid, trometamol Etc. Examples of the phosphate include sodium phosphate, sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, potassium phosphate, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, and the like. Examples of the borate include borax, sodium borate, and potassium borate. Examples of the citrate include sodium citrate, disodium citrate, and trisodium citrate. Examples of the acetate include sodium acetate and potassium acetate. Examples of the carbonate include sodium carbonate and sodium hydrogen carbonate. Examples of the tartrate salt include sodium tartrate and potassium tartrate.
上記基材は、該基材の表面上に、細胞培養に適したコーティングまたは親水化等の表面への処理がなされているものであれば、特に限定されない。上記基材の形状も特に限定されず、例えばプレート、シャーレ、ディッシュ、Ｔ−フラスコ等が挙げられる。上記基材の材質としては、細胞培養に使用できるものであれば特に限定されず、例えばプラスチック、ガラス等が挙げられる。また、該材質は天然由来材料であっても良いし、無機材料であっても良い。 The base material is not particularly limited as long as the surface of the base material is subjected to a surface treatment such as coating suitable for cell culture or hydrophilization. The shape of the substrate is not particularly limited, and examples thereof include a plate, a petri dish, a dish, and a T-flask. The material of the substrate is not particularly limited as long as it can be used for cell culture, and examples thereof include plastic and glass. Further, the material may be a naturally derived material or an inorganic material.
＜３．細胞解離方法＞
本実施形態の一態様に係る細胞解離方法は、基材に接着している細胞と、細胞解離剤とを接触させる工程（以下、接触工程１と称する）を有し、上記細胞解離剤は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸、または、当該アミノ酸の誘導体を有効成分として含有しているものである。
<3. Cell dissociation method>
The cell dissociation method according to one aspect of the present embodiment includes a step of contacting a cell adhering to a substrate and a cell dissociation agent (hereinafter referred to as contact step 1), One or more selected from the group consisting of arginine, lysine, histidine, asparagine, glutamic acid, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, cysteine, methionine, aspartic acid, glutamine, proline, phenylalanine, tryptophan, tyrosine An amino acid or a derivative of the amino acid is contained as an active ingredient.
上記構成によれば、細胞表面上に存在するタンパク質を分解することなく、細胞基材から細胞を解離させることができる。なお、解離して回収した細胞は、例えば、継代、または、保存等の目的に使用することができる。 According to the said structure, a cell can be dissociated from a cell base material, without decomposing | disassembling the protein which exists on the cell surface. The cells recovered by dissociation can be used for the purpose of passage or storage, for example.
上記接触工程１は、基材（例えば、細胞培養用のシャーレ等）内に貯留されている培地を吸引して基材から除去した後、適宜リン酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）等を用いて基材および当該基材に接着している細胞を洗浄した後に、上記細胞解離剤を基材の表面上に接着している細胞へ接触させる工程であっても良い。 In the contact step 1, a medium stored in a base material (for example, a petri dish for cell culture) is aspirated and removed from the base material, and then a phosphate-buffered saline (PBS) or the like is appropriately used. After washing the base material and the cells adhering to the base material using, the cell dissociating agent may be brought into contact with the cells adhering to the surface of the base material.
上記接触工程１において、上記細胞解離剤を上記細胞へ接触させるための手段としては、例えば電動ピペッター等公知の機器が用いられる。 In the contact step 1, as means for bringing the cell dissociating agent into contact with the cells, a known device such as an electric pipettor is used.
上記接触工程の後、細胞解離剤と接触した培養細胞は、例えばＣＯ２インキュベータ等下にて３７℃環境下にて静置されても良い。 After the contact step, the cultured cells that have contacted the cell dissociating agent may be allowed to stand in a 37 ° C. environment, for example, in a CO 2 incubator or the like.
上記細胞解離剤は、上述の＜２．細胞解離剤＞中で説明したものと同様のものであるため、ここでは説明を省略する。同様に、上記細胞解離方法に用いられる基材および細胞についても、＜２．細胞解離剤＞中で説明したものと同様のものであるため、ここでは説明を省略する。 The cell dissociating agent is the above <2. Since it is the same as that described in the cell dissociation agent, description thereof is omitted here. Similarly, regarding the base material and cells used in the cell dissociation method, <2. Since it is the same as that described in the cell dissociation agent, description thereof is omitted here.
本実施形態の一態様に係る細胞解離方法は、上記接触工程１の前に、基材の表面に細胞を接着させ、細胞を培養する工程（以下、培養工程１と称する）を含んでいても良い。 The cell dissociation method according to one aspect of the present embodiment may include a step of attaching cells to the surface of the substrate and culturing the cells (hereinafter referred to as culture step 1) before the contact step 1. good.
上記培養工程１においては、目的の細胞を、培地中にて培養する。培養のために用いる培地としては、特に限定されず、例えば、公知の血清培地または無血清培地、もしくは上記培地へ増殖因子を添加した増殖用培地等が挙げられる。 In the culture step 1, the target cell is cultured in a medium. The medium used for the culture is not particularly limited, and examples thereof include a known serum medium or serum-free medium, or a growth medium in which a growth factor is added to the above medium.
細胞の培養方法に関しては特に限定されず、公知の培養方法を用いて培養することができる。 The cell culture method is not particularly limited, and can be cultured using a known culture method.
本実施形態の一態様に係る細胞解離方法は、上記接触工程１の後に、基材から解離させて回収した細胞を継代培養する工程（以下、継代培養工程と称する）を含んでいても良い。細胞の継代方法に関しては特に限定されず、公知の継代方法を用いて継代することができる。 The cell dissociation method according to one aspect of the present embodiment may include a step of subculturing the cells dissociated from the base material and recovered after the contact step 1 (hereinafter referred to as a subculture step). good. There are no particular limitations on the cell passage method, and the cells can be passaged using a known passage method.
上記接触工程１では、基材に接着している細胞の数（換言すれば、基材の表面積と、当該基材の表面積のうち、細胞によって覆われている部分の面積との比）は、特に限定されない。上記細胞解離剤は、細胞と細胞との間に形成される接着を解離させること無く、細胞と基材との間に形成される接着を、特異的に解離させることができる。それ故に、基材に接着している細胞の数が、細胞と細胞との間に接着が形成されない程度の細胞の数であれば、本細胞解離方法によって、個々に分離した細胞群を得ることができる。一方、基材に接着している細胞の数が、細胞と細胞との間に接着が形成される程度の細胞の数であれば、本細胞解離方法によって、細胞同士が接着した状態の細胞シートを得ることができる。 In the contact step 1, the number of cells adhering to the base material (in other words, the ratio of the surface area of the base material to the area of the surface area of the base material covered by the cells) is: There is no particular limitation. The cell dissociating agent can specifically dissociate the adhesion formed between the cell and the base material without dissociating the adhesion formed between the cells. Therefore, if the number of cells adhering to the base material is such that no adhesion is formed between the cells, individual cell groups can be obtained by this cell dissociation method. Can do. On the other hand, if the number of cells adhering to the substrate is such that adhesion is formed between the cells, the cell sheet in which the cells are adhered to each other by the present cell dissociation method Can be obtained.
例えば、基材の表面積をＡ［ｃｍ２］とし、当該基材の表面積のうち、細胞によって覆われている部分の面積をＢ［ｃｍ２］とした場合、「Ｂ／Ａ」の値は、例えば、０．１〜１、０．２〜１、０．３〜１、０．４〜１、０．５〜１、０．６〜１、０．７〜１、０．８〜１、または、０．９〜１であってもよい。 For example, when the surface area of the substrate is A [cm 2 ] and the area of the portion of the substrate covered with cells is B [cm 2 ], the value of “B / A” is For example, 0.1 to 1, 0.2 to 1, 0.3 to 1, 0.4 to 1, 0.5 to 1, 0.6 to 1, 0.7 to 1, 0.8 to 1, Or 0.9-1 may be sufficient.
＜４．細胞シートの製造方法＞
本発明の細胞シートの製造方法は、基材にシート状に接着している細胞（換言すれば、細胞と細胞との間の接着が形成されている細胞）と、細胞解離剤とを接触させる工程（以下、接触工程２と称する）を有し、上記細胞解離剤は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸、または、当該アミノ酸の誘導体を有効成分として含有しているものである。
<4. Cell sheet manufacturing method>
In the method for producing a cell sheet of the present invention, a cell adhering to a base material in a sheet form (in other words, a cell in which adhesion between cells is formed) and a cell dissociating agent are brought into contact. The cell dissociating agent is arginine, lysine, histidine, asparagine, glutamic acid, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, cysteine, methionine, aspartic acid , One or more amino acids selected from the group consisting of glutamine, proline, phenylalanine, tryptophan, and tyrosine, or derivatives of the amino acids as active ingredients.
上記構成によれば、高価な機器を必要せず、より容易に細胞シート（例えば、移植用の細胞シート）を得ることができる。 According to the said structure, an expensive apparatus can be obtained more easily and a cell sheet (for example, cell sheet for transplantation) can be obtained more easily.
上記細胞シートとは、平面状に細胞同士が結合して形成されるシートのことを意図する。 The above-mentioned cell sheet intends a sheet formed by bonding cells in a planar shape.
上記細胞シート製造方法において用いられる基材は、該基材の表面上に、細胞培養に適したコーティングまたは親水化等の表面への処理がなされており、かつ細胞シートを基材から解離する際に所望の面積の細胞シートが得られるほどの十分な面積を有する基材であれば、特に限定されない。 The base material used in the above cell sheet production method has a surface suitable for cell culture, such as a coating suitable for cell culture or a hydrophilic treatment, and the cell sheet is dissociated from the base material. The substrate is not particularly limited as long as the substrate has a sufficient area to obtain a cell sheet having a desired area.
上記細胞シートの製造方法において用いられる細胞については、上述の＜２．細胞解離剤＞中で説明した種類の細胞のうち、細胞シートの移植先に応じて適宜選択することができる。例えば得られた細胞シートを心筋組織へ移植する場合は骨格筋芽細胞を、角膜上皮組織へ移植する場合は口腔粘膜細胞を用いてもよい。 The cells used in the method for producing the cell sheet are described in <2. Among the types of cells described in <Cell Dissociator>, it can be appropriately selected according to the transplant destination of the cell sheet. For example, skeletal myoblasts may be used when transplanting the obtained cell sheet into myocardial tissue, and oral mucosal cells may be used when transplanting into corneal epithelial tissue.
上記細胞シートの製造方法において用いられる細胞は、例えばｉＰＳ細胞、または、ＥＳ細胞であっても良い。 The cells used in the method for producing the cell sheet may be, for example, iPS cells or ES cells.
上記接触工程２において、上記細胞解離剤を上記細胞へ接触させるための手段としては、例えば電動ピペッター等公知の機器が用いられる。 In the contact step 2, as a means for bringing the cell dissociating agent into contact with the cells, a known device such as an electric pipetter is used.
上記細胞解離剤は、上述の＜２．細胞解離剤＞中で説明したものと同様のものであるため、ここでは説明を省略する。 The cell dissociating agent is the above <2. Since it is the same as that described in the cell dissociation agent, description thereof is omitted here.
本実施形態の一態様に係る細胞シート製造方法は、上記接触工程２の前に、基材の表面に細胞をシート状に接着させ、細胞を培養する工程（以下、培養工程２と称する）を含んでいても良い。 The cell sheet manufacturing method according to an aspect of the present embodiment includes a step (hereinafter referred to as culture step 2) of culturing the cells by adhering the cells to the surface of the base material in the form of a sheet before the contact step 2. It may be included.
上記培養工程２においては、目的の細胞を、培地中にて培養する。培養する日数としては、所望の面積および厚さを有する細胞シートが得られる日数であれば特に限定されない。培養のために用いる培地としては、特に限定されず、例えば、公知の血清培地または無血清培地、もしくは上記培地へ増殖因子を添加した増殖用培地等が挙げられる。 In the culture step 2, the target cell is cultured in a medium. The number of days for culturing is not particularly limited as long as a cell sheet having a desired area and thickness can be obtained. The medium used for the culture is not particularly limited, and examples thereof include a known serum medium or serum-free medium, or a growth medium in which a growth factor is added to the above medium.
本実施形態の一態様に係る細胞シート製造方法において、上記接触工程の後に、基材から解離した細胞シートを回収する工程（以下、回収工程と称する）を含んでいても良い。 The cell sheet manufacturing method according to one aspect of the present embodiment may include a step of collecting the cell sheet dissociated from the base material (hereinafter referred to as a recovery step) after the contact step.
上記回収工程における細胞シートの回収方法としては特に限定されず、例えば、得られた細胞シートを支持膜に付着させて引き上げても良い。 The method for collecting the cell sheet in the collecting step is not particularly limited, and for example, the obtained cell sheet may be attached to the support membrane and pulled up.
上記支持膜としては、基材から解離された細胞シートを損なうことなく上記支持膜へ懸架できるものであれば、特に限定されない。上記支持膜は、たとえば、滅菌ガーゼ、滅菌和紙、滅菌濾紙、滅菌不織布などで形成されるものであっても良いし、親水性膜、高分子材料、生分解性ポリマー、寒天培地、ハイドロゲルなどをシート状にしたものであっても良い。 The support membrane is not particularly limited as long as it can be suspended from the support membrane without damaging the cell sheet dissociated from the base material. The support membrane may be formed of, for example, sterilized gauze, sterilized Japanese paper, sterilized filter paper, sterilized non-woven fabric, etc., hydrophilic membrane, polymer material, biodegradable polymer, agar medium, hydrogel, etc. May be in the form of a sheet.
上記接触工程２では、基材に接着している細胞の数（換言すれば、基材の表面積と、当該基材の表面積のうち、細胞によって覆われている部分の面積との比）は、特に限定されない。上記細胞解離剤は、細胞と細胞との間に形成される接着を解離させること無く、細胞と基材との間に形成される接着を、特異的に解離させることができる。それ故に、基材に接着している細胞の数が、細胞と細胞との間に接着が形成される程度の細胞の数であれば、本細胞解離方法によって、細胞同士が接着した状態の細胞シートを得ることができる。 In the contact step 2, the number of cells adhered to the base material (in other words, the ratio of the surface area of the base material to the area of the surface area of the base material covered by the cells) is: There is no particular limitation. The cell dissociating agent can specifically dissociate the adhesion formed between the cell and the base material without dissociating the adhesion formed between the cells. Therefore, if the number of cells adhering to the substrate is such that adhesion is formed between the cells, the cells in a state where the cells are adhered to each other by this cell dissociation method. A sheet can be obtained.
例えば、基材の表面積をＡ［ｃｍ２］とし、当該基材の表面積のうち、細胞によって覆われている部分の面積をＢ［ｃｍ２］とした場合、「Ｂ／Ａ」の値は、例えば、０．５〜１、０．６〜１、０．７〜１、０．８〜１、または、０．９〜１であってもよい。 For example, when the surface area of the substrate is A [cm 2 ] and the area of the portion of the substrate covered with cells is B [cm 2 ], the value of “B / A” is For example, it may be 0.5 to 1, 0.6 to 1, 0.7 to 1, 0.8 to 1, or 0.9 to 1.
＜１．細胞の培養方法＞
以下の実験を行うために、予め細胞を培養した。本実施例においては、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３、ラット副腎褐色細胞腫ＰＣ−１２、マウス胎児線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３を用いた。
<1. Cell culture method>
In order to perform the following experiments, cells were cultured in advance. In this example, human embryonic kidney cells HEK293, rat adrenal pheochromocytoma PC-12, and mouse embryonic fibroblasts NIH / 3T3 were used.
ＨＥＫ２９３は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｕｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；ｇｉｂｃｏ社、１１８８５−０８４）へ、１０％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）および１％抗生物質（ペニシリン-ストレプトマイシン混合溶液、ナカライテスク社 ２６２５２−９４）を添加したものを用いて培養した。 HEK293 was added to Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; gibco, 11885-084) with 10% Fetal Bovine Serum (FBS) and 1% antibiotic (penicillin-streptomycin mixed solution, Nacalai Tesque) 26252-94 Was used to culture.
ＰＣ−１２は、ＤＭＥＭへ、５％ＦＢＳ、５％ Ｈｏｒｓｅ Ｓｅｒｕｍ（ＨＳ）および１％抗生物質（ペニシリン-ストレプトマイシン混合溶液；ナカライテスク社 ２６２５２−９４）を添加したものを用いて培養した。 PC-12 was cultured using DMEM supplemented with 5% FBS, 5% Horse Serum (HS) and 1% antibiotic (penicillin-streptomycin mixed solution; Nacalai Tesque 26252-94).
ＮＩＨ／３Ｔ３用は、ＤＭＥＭ（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ）（ｇｉｂｃｏ社 １１９６５−０９２）へ、１０％ＦＢＳおよび１％抗生物質（ペニシリン-ストレプトマイシン混合溶液、ナカライテスク社 ２６２５２−９４）を添加したものを用いて培養した。 For NIH / 3T3, culture was performed using DMEM (High Glucose) (gibco 1965-092) supplemented with 10% FBS and 1% antibiotics (penicillin-streptomycin mixed solution, Nacalai Tesque 26252-94). did.
培養用基材として、３５ｍｍ径のＮｕｎｃ細胞培養ディッシュ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１５３０６６）を使用した。細胞培養は、いずれもＣＯ２ インキュベータを用いて、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下にて行った。 A 35 mm diameter Nunc cell culture dish (Thermo Fisher Scientific, 153066) was used as a culture substrate. All cell cultures were performed using a CO 2 incubator at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere.
＜２．アミノ酸またはアミノ酸の誘導体を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液の調製＞
アミノ酸またはアミノ酸の誘導体が有する細胞解離効果を検証した。
<2. Preparation of HEPES buffer containing amino acids or amino acid derivatives>
The cell dissociation effect of amino acids or amino acid derivatives was verified.
ＨＥＰＥＳ緩衝液に、アミノ酸またはアミノ酸の誘導体を、終濃度２５ｍＭ、または１００ｍＭになるように加えて、溶液を調製した。なお、チロシンは水に難溶性であるため、ＨＥＰＥＳ緩衝液にチロシンを終濃度２ｍＭになるように加えて、溶液を調製した。いずれの溶液もｐＨを７．４に調製した後、各溶液を孔径０．２μｍのフィルターを用いて濾過滅菌した。 A solution was prepared by adding amino acids or amino acid derivatives to HEPES buffer to a final concentration of 25 mM or 100 mM. Since tyrosine is hardly soluble in water, a solution was prepared by adding tyrosine to a HEPES buffer to a final concentration of 2 mM. Each solution was adjusted to pH 7.4, and then each solution was sterilized by filtration using a filter having a pore size of 0.2 μm.
＜３．細胞解離効果の検証＞
ＨＥＫ２９３、ＰＣ−１２またはＮＩＨ／３Ｔ３と、細胞解離剤とを接触させて、細胞解離効果を検証した。
<3. Verification of cell dissociation effect>
HEK293, PC-12, or NIH / 3T3 was brought into contact with a cell dissociator to verify the cell dissociation effect.
まず、細胞解離剤として０．１ＭのＬ−アルギニン溶液および０．１ＭのＤ−アルギニン溶液を用いた場合の細胞解離効果を検証した。 First, the cell dissociation effect when a 0.1 M L-arginine solution and a 0.1 M D-arginine solution were used as cell dissociators was verified.
細胞を培養しているディッシュから培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にてディッシュを二回洗浄した。洗浄後、０．１Ｍのアルギニン溶液を１ｍＬディッシュへ添加し、３７℃下にて５分間インキュベートした。その後ディッシュへ１ｍＬの培地を加え、ピペッティングを３回行った。 The medium was removed from the dish in which the cells were cultured, and the dish was washed twice with phosphate buffered saline (PBS). After washing, 0.1 M arginine solution was added to a 1 mL dish and incubated at 37 ° C. for 5 minutes. Thereafter, 1 mL of medium was added to the dish, and pipetting was performed three times.
顕微鏡を用いて、細胞の処理前および処理後における細胞の形状をそれぞれ観察し、細胞が基材から解離したかを判定した。ここで、細胞の解離における判定基準として、細胞が仮足状の形状を有している場合に、細胞がディッシュ表面に接着していると判定した。一方、細胞が丸い形状を有している場合に、細胞がディッシュ表面から解離していると判定した。 The shape of the cell before and after the treatment of the cell was observed using a microscope, and it was determined whether the cell was dissociated from the base material. Here, as a criterion for cell dissociation, it was determined that the cell was adhered to the dish surface when the cell had a provisional foot shape. On the other hand, when the cells had a round shape, it was determined that the cells were dissociated from the dish surface.
図１および図２に試験結果を示す。図１は、Ｌ−アルギニンを含有する細胞解離剤を用いた場合の、処理前後の細胞の形状を示す像である。図２は、Ｄ−アルギニンを含有する細胞解離剤を用いた場合の、処理前後の細胞の形状を示す像である。各像について、細胞解離剤を添加する前（上段）、添加した後（下段）の細胞を示す。図１および図２に示す通り、いずれの細胞においても細胞が基材の表面から解離した。 FIG. 1 and FIG. 2 show the test results. FIG. 1 is an image showing cell shapes before and after treatment when a cell dissociation agent containing L-arginine is used. FIG. 2 is an image showing the shape of cells before and after treatment when a cell dissociation agent containing D-arginine is used. For each image, cells before (upper) and after (lower) addition of a cell dissociator are shown. As shown in FIG. 1 and FIG. 2, the cells were dissociated from the surface of the substrate in any of the cells.
次に、細胞解離剤として終濃度が２５ｍＭであるアルギニン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、または終濃度が２ｍＭであるチロシンの中から１種類のみを含む溶液を用いて、細胞解離効果を調べた。 Next, arginine, lysine, histidine, asparagine, glutamic acid, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, cysteine, methionine, aspartic acid, glutamine, proline, phenylalanine, having a final concentration of 25 mM as a cell dissociator The cell dissociation effect was examined using a solution containing only one type of tryptophan or tyrosine having a final concentration of 2 mM.
結果を図３に示す。図３は、各アミノ酸の細胞解離効果を示す表である。ここで、目視観察下にて、「◎」は全細胞のうち７０％以上、「○」は１０％以上７０％未満、「△」は１％以上１０％未満、「×」は１％未満の細胞が基材から解離した状態であることを示す。 The results are shown in FIG. FIG. 3 is a table showing the cell dissociation effect of each amino acid. Here, under visual observation, “◎” is 70% or more of all cells, “◯” is 10% or more and less than 70%, “Δ” is 1% or more and less than 10%, and “X” is less than 1%. These cells are in a state dissociated from the substrate.
細胞解離剤としてアルギニンを含む場合、３種類全ての細胞において、高い細胞解離効果を示した。また、ＨＥＫ細胞においては、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシンまたはシステインを含有している細胞解離剤を用いた場合に、より高い細胞解離効果が認められた。一方、ＰＣ−１２においては、アルギニン酸を、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞においては、アルギニン酸、リシン、ヒスチジン、メチオニンまたはフェニルアラニンを含有している細胞解離剤を用いた場合に、より高い細胞解離効果が認められた。 When arginine was included as a cell dissociating agent, a high cell dissociation effect was shown in all three types of cells. In HEK cells, a higher cell dissociation effect was observed when a cell dissociator containing arginine, aspartic acid, glutamic acid, glycine, isoleucine or cysteine was used. On the other hand, when a cell dissociation agent containing arginic acid in PC-12 or arginic acid, lysine, histidine, methionine or phenylalanine in NIH / 3T3 cells was used, a higher cell dissociation effect was observed. It was.
さらに、アミノ酸誘導体であるアグマチンを含有する細胞解離剤の細胞解離効果を調べた。図４に試験結果を示す。図４に示す通り、アグマチンにおいても細胞解離効果が認められた。 Furthermore, the cell dissociation effect of the cell dissociation agent containing agmatine which is an amino acid derivative was examined. FIG. 4 shows the test results. As shown in FIG. 4, a cell dissociation effect was also observed in agmatine.
最後に、Ｌ−アルギニンを含む溶液と、Ｄ−アルギニンを含む溶液（Ｄ−Ａｒｇ）との細胞解離剤としての効果を比較検証した。各アルギニン溶液としては、アルギニンの濃度が２５ｍＭまたは１００ｍＭのものを用いた。 Finally, the effect as a cell dissociation agent between a solution containing L-arginine and a solution containing D-arginine (D-Arg) was compared and verified. As each arginine solution, an arginine concentration of 25 mM or 100 mM was used.
図５に試験結果を示す。アルギニンの濃度が１００ｍＭの場合は、Ｌ−アルギニンおよびＤ−アルギニンを含有する細胞解離剤は、いずれも同程度の細胞解離効果を示した。一方、アルギニンの濃度が２５ｍＭの場合は、Ｌ−アルギニンを含有する細胞解離剤の方が、Ｄ−アルギニンを含有する細胞解離剤に比べ、細胞を解離する効果が高かった。 FIG. 5 shows the test results. When the concentration of arginine was 100 mM, the cell dissociation agent containing L-arginine and D-arginine showed the same level of cell dissociation effect. On the other hand, when the concentration of arginine was 25 mM, the cell dissociation agent containing L-arginine was more effective in dissociating cells than the cell dissociation agent containing D-arginine.
＜４．細胞解離後の生存率の測定＞
細胞解離後の細胞の生存率を算出するべく、細胞解離剤を用いてディッシュ表面から細胞を解離させ、当該細胞を含む懸濁液を作製した。該懸濁液に対して、４１０ｇにて５分間遠心分離処理を行った。遠心分離処理の後、該懸濁液から上清を除去し、沈殿している細胞に対して培地を１ｍＬ加えて、細胞を含む懸濁液を作製した。該懸濁液のうち、２０μＬを同量のトリパンブルー染色液（ＳＩＧＭＡ社 Ｔ６１４６−５Ｇを終濃度０．５％になるようＰＢＳで希釈したもの）と混合した後、室温下で１分間静置した。血球計算版を用いて、顕微鏡下にて全細胞の数と、染色された細胞（死細胞）の数とをそれぞれ計数し、得られた値より生存率を算出した。
<4. Measurement of survival rate after cell dissociation>
In order to calculate the survival rate of the cells after cell dissociation, the cells were dissociated from the dish surface using a cell dissociating agent to prepare a suspension containing the cells. The suspension was centrifuged at 410 g for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed from the suspension, and 1 mL of medium was added to the precipitated cells to prepare a suspension containing cells. 20 μL of the suspension was mixed with the same amount of trypan blue staining solution (SIGMA T6146-5G diluted with PBS to a final concentration of 0.5%), and then allowed to stand at room temperature for 1 minute. did. Using a hemocytometer, the number of total cells and the number of stained cells (dead cells) were counted under a microscope, and the survival rate was calculated from the obtained values.
本実施例では、比較例１として、トリプシンを用いて細胞を解離させた場合の細胞の生存率も算出した。培養から生存率の測定までの工程を、以下に簡潔に述べる。まず、細胞を培養しているディッシュから培地を除去し、ＰＢＳを用いてディッシュを２回洗浄した後、該ディッシュにトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ （１Ｘ）、ｇｉｂｃｏ社 ２５２００−０５６）を０．５ｍＬ添加して、３７℃にて５２分間インキュベートした。次に、１ｍＬの培地をディッシュに添加してトリプシンの活性を失わせ、ピペッティングを３回行って、ディッシュから細胞を解離させた。こうして得られた細胞懸濁液を、上述と同様に処理し、細胞の生存率を算出した。 In this example, as Comparative Example 1, the cell viability when cells were dissociated using trypsin was also calculated. The process from culture to measurement of viability is briefly described below. First, after removing the medium from the dish in which the cells are cultured and washing the dish twice with PBS, trypsin-EDTA solution (0.25% Trypsin-EDTA (1X), gibco 25200-) is added to the dish. 056) was added and incubated at 37 ° C. for 52 minutes. Next, 1 mL of medium was added to the dish to lose trypsin activity, and pipetting was performed three times to dissociate the cells from the dish. The cell suspension thus obtained was treated in the same manner as described above, and the cell viability was calculated.
また、比較例２として、スクレーパーを用いて細胞を解離させた場合の細胞の生存率も算出した。培養から生存率の測定までの工程を、以下に簡潔に述べる。まず、細胞を培養しているディッシュから培地を除去し、ＰＢＳを用いてディッシュを２回洗浄した後、該ディッシュにＰＢＳを１ｍＬ添加した。次にディッシュの底をスクレーパーを用いて拭い、ディッシュから細胞を解離させた。その後、該ディッシュへ１ｍＬの培地を加え、ピペッティングを３回行った。こうして得られた細胞懸濁液を、上述と同様に処理し、細胞の生存率を算出した。 In addition, as Comparative Example 2, the cell survival rate when cells were dissociated using a scraper was also calculated. The process from culture to measurement of viability is briefly described below. First, the medium was removed from the dish in which the cells were cultured, and the dish was washed twice with PBS, and then 1 mL of PBS was added to the dish. Next, the bottom of the dish was wiped with a scraper to dissociate the cells from the dish. Thereafter, 1 mL of medium was added to the dish, and pipetting was performed three times. The cell suspension thus obtained was treated in the same manner as described above, and the cell viability was calculated.
なお、本実施例および比較例では、ＨＥＫ２９３、ＰＣ−１２およびＮＩＨ／３Ｔ３それぞれについて生存率を算出した。 In this example and comparative examples, survival rates were calculated for HEK293, PC-12, and NIH / 3T3.
図６に試験結果を示す。図６は、基材の表面から解離された各細胞の生存率を示すグラフである。図６に示す通り、いずれの細胞種においても、細胞をスクレーパーを用いて解離させた場合に比べ、本実施例の細胞解離剤を用いた場合に、細胞の生存率が高かった。一方、本実施例の細胞解離剤を用いた場合、ＨＥＫ２９３については、トリプシン処理後の細胞と同程度の生存率であった。一方、本実施例の細胞解離剤を用いた場合、ＰＣ−１２およびＮＩＨ／３Ｔ３については、トリプシン処理後の細胞と比べて生存率が高かった。 FIG. 6 shows the test results. FIG. 6 is a graph showing the survival rate of each cell dissociated from the surface of the substrate. As shown in FIG. 6, in any of the cell types, the cell survival rate was higher when the cell dissociating agent of this example was used than when the cells were dissociated using a scraper. On the other hand, when the cell dissociation agent of this example was used, the survival rate of HEK293 was similar to that of the cells after trypsin treatment. On the other hand, when the cell dissociating agent of this example was used, the survival rate of PC-12 and NIH / 3T3 was higher than that of the cells after trypsin treatment.
＜５．細胞解離後の細胞の接着性の比較＞
細胞解離後の細胞の接着性を確認するべく、細胞解離剤を用いてディッシュ表面から細胞を解離させ、当該細胞を含む懸濁液を作製した。該懸濁液に対して、４１０ｇにて５分間遠心分離処理を行った。遠心分離処理の後、該懸濁液から上清を除き、沈殿している細胞に対して培地４ｍＬを加えて、細胞を含む懸濁液を作製した。該懸濁液のうち、２ｍＬを新しいディッシュに添加し、３７℃にて１０分間インキュベートした。ディッシュから培地を除去し、ＰＢＳにてディッシュを一回洗浄した後、ディッシュ上に残存している細胞数を計数した。
<5. Comparison of cell adhesion after cell dissociation>
In order to confirm the adhesiveness of the cells after cell dissociation, the cells were dissociated from the dish surface using a cell dissociating agent to prepare a suspension containing the cells. The suspension was centrifuged at 410 g for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed from the suspension, and 4 mL of medium was added to the precipitated cells to prepare a suspension containing cells. Of the suspension, 2 mL was added to a new dish and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. After removing the medium from the dish and washing the dish once with PBS, the number of cells remaining on the dish was counted.
また、比較例１（トリプシンを用いた細胞の解離）および比較例２（スクレーパーを用いた細胞の解離）についても、同様に実験した。比較例１および比較例２について、上述の実施例と同様の手順を行った後、ディッシュから培地を除去し、ＰＢＳにてディッシュを一回洗浄した後、ディッシュ上に残存している細胞数を計測した。 Further, Comparative Example 1 (cell dissociation using trypsin) and Comparative Example 2 (cell dissociation using a scraper) were also tested in the same manner. For Comparative Example 1 and Comparative Example 2, the same procedure as in the above Example was performed, the medium was removed from the dish, the dish was washed once with PBS, and the number of cells remaining on the dish was then determined. Measured.
図７〜１０に試験結果を示す。図７は、洗浄前および洗浄後のＨＥＫ２９３のディッシュへの接着を示す像である。図８は、洗浄前および洗浄後のＰＣ−１２のディッシュへの接着を示す像である。図９は、洗浄前および洗浄後のＮＩＨ／３Ｔ３のディッシュへの接着を示す像である。図１０は、各細胞解離処理における細胞接着性の高さを示すグラフである。 The test results are shown in FIGS. FIG. 7 is an image showing the adhesion of HEK293 to the dish before and after cleaning. FIG. 8 is an image showing adhesion of PC-12 to the dish before and after cleaning. FIG. 9 is an image showing adhesion of NIH / 3T3 to the dish before and after cleaning. FIG. 10 is a graph showing the height of cell adhesion in each cell dissociation process.
図７〜１０に示す通り、いずれの細胞においても、トリプシン処理後はディッシュへの接着性が低かったことが確認された。この結果から、トリプシン処理によって細胞接着に関与するタンパク質が分解されたことが示唆された。一方、０．１Ｍアルギニン溶液を用いて解離された細胞は、スクレーパーを用いて物理的に細胞を解離させた細胞とほぼ同程度の接着性を示した。この結果から、本実施例における細胞解離剤により解離された細胞は、細胞接着に関与するタンパク質が残存していることが示唆された。 As shown in FIGS. 7 to 10, it was confirmed that any cell had low adhesion to the dish after trypsin treatment. This result suggested that the protein involved in cell adhesion was degraded by trypsin treatment. On the other hand, the cells dissociated using the 0.1 M arginine solution showed almost the same adhesiveness as the cells physically dissociated using the scraper. From this result, it was suggested that the protein dissociated by the cell dissociating agent in the present example remains a protein involved in cell adhesion.
＜６．細胞解離後の細胞の分化能の確認＞
本実施例において用いられた細胞解離剤により、基材の表面から解離されたＰＣ−１２が、解離後正常に分化（具体的には、神経突起の成長）するかを調べた。上述の培地へ、神経成長因子であるＮｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ （ＮＧＦ）を終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。該培地中にてＰＣ−１２を３日間培養した後、顕微鏡を用いて細胞の形状を確認した。
<6. Confirmation of cell differentiation after cell dissociation>
It was examined whether PC-12 dissociated from the surface of the base material normally differentiated after dissociation (specifically, neurite growth) by the cell dissociation agent used in this example. Nerve Growth Factor (NGF), which is a nerve growth factor, was added to the above-mentioned medium to a final concentration of 50 ng / mL. After culturing PC-12 in the medium for 3 days, the shape of the cells was confirmed using a microscope.
比較例として、前述同様に細胞を培養後、細胞解離剤としてトリプシンを用いた場合についても細胞の形状を確認した。 As a comparative example, the cell shape was also confirmed in the case where trypsin was used as the cell dissociating agent after culturing the cells in the same manner as described above.
図１１に試験結果を示す。なお、図１１中の各像中の細胞解離手段および培地成分として、（ａ）はトリプシン処理、ＮＧＦが含まれない培地、（ｂ）はトリプシン処理、ＮＧＦを含む培地、（ｃ）は２５ｍＭアルギニン溶液処理、ＮＧＦが含まれる培地、（ｄ）は０．１Ｍアルギニン溶液処理、ＮＧＦが含まれる培地を示している。図１１の（ｃ）および（ｄ）では、図１１の（ｂ）と同様に、神経突起の成長が確認できる。この結果から、本実施例における細胞解離剤により基材の表面から解離された細胞は、解離後も正常に分化（具体的には、神経突起の成長）できることが示された。 FIG. 11 shows the test results. The cell dissociation means and medium components in each image in FIG. 11 are as follows: (a) trypsin treatment, medium not containing NGF, (b) trypsin treatment, medium containing NGF, (c) 25 mM arginine Solution treatment, medium containing NGF, (d) shows 0.1 M arginine solution treatment, medium containing NGF. In (c) and (d) of FIG. 11, neurite growth can be confirmed as in (b) of FIG. From this result, it was shown that the cells dissociated from the surface of the base material by the cell dissociating agent in this example can be normally differentiated (specifically, neurite growth) even after dissociation.
＜７．細胞シートの作製＞
１００％コンフルエントの状態に培養したＮＩＨ／３Ｔ３細胞の培養ディッシュに、１００ｍＭのＤ−アルギニンまたはＬ−アルギニンを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液を添加し、３７℃下にて５分間インキュベートした。
<7. Production of cell sheet>
A HEPES buffer containing 100 mM D-arginine or L-arginine was added to a culture dish of NIH / 3T3 cells cultured in a state of 100% confluence, and incubated at 37 ° C. for 5 minutes.
図１２に試験結果を示す。図１２は、本実施例において得られた細胞シートの像である。ディッシュの中央に認められる白色の物体が、細胞シートである。図１２に示す通り、Ｌ−型アミノ酸またはＤ−型アミノ酸を含む細胞解離剤を用いた場合のいずれにおいても、ディッシュからシート状に細胞が解離された。 FIG. 12 shows the test results. FIG. 12 is an image of the cell sheet obtained in this example. The white object found in the center of the dish is the cell sheet. As shown in FIG. 12, cells were dissociated from the dish in a sheet form in any of the cases where the cell dissociation agent containing L-type amino acid or D-type amino acid was used.
本発明は、細胞培養および再生医療の分野において利用することができる。 The present invention can be used in the fields of cell culture and regenerative medicine.
Claims (4)
上記細胞解離剤は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸、または、当該アミノ酸の誘導体、を有効成分として含有しているものであることを特徴とする、細胞解離剤。 A cell dissociation agent for dissociating the cell from the substrate to which the cell is adhered,
The cell dissociating agent is from the group consisting of arginine, lysine, histidine, asparagine, glutamic acid, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, cysteine, methionine, aspartic acid, glutamine, proline, phenylalanine, tryptophan, tyrosine. A cell dissociation agent comprising one or more selected amino acids or a derivative of the amino acid as an active ingredient.
上記細胞解離剤は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸、または、当該アミノ酸の誘導体、を有効成分として含有しているものであることを特徴とする、細胞解離方法。 A step of contacting a cell adhering to a cell and a cell dissociating agent,
The cell dissociating agent is from the group consisting of arginine, lysine, histidine, asparagine, glutamic acid, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, cysteine, methionine, aspartic acid, glutamine, proline, phenylalanine, tryptophan, tyrosine. A cell dissociation method comprising one or more selected amino acids or a derivative of the amino acid as an active ingredient.
上記細胞解離剤は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンからなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸、または、当該アミノ酸の誘導体、を有効成分として含有しているものであることを特徴とする、細胞シートの製造方法。 Having a step of contacting the cell adhering to the base material in the form of a sheet and a cell dissociator,
The cell dissociating agent is from the group consisting of arginine, lysine, histidine, asparagine, glutamic acid, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, cysteine, methionine, aspartic acid, glutamine, proline, phenylalanine, tryptophan, tyrosine. A method for producing a cell sheet, comprising one or more selected amino acids or derivatives of the amino acids as active ingredients.
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