JP6616559B2 - Method for producing sheet cell culture - Google Patents
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Description
本発明は、シート状細胞培養物の製造方法、および該製造方法によって製造されたシート状細胞培養物に関する。 The present invention relates to a method for producing a sheet-like cell culture, and a sheet-like cell culture produced by the production method.
近年、事故や病気によって失われた身体の細胞、組織、器官の再生や機能の回復を目的して、種々の細胞（iPS細胞、多能性幹細胞、成体幹細胞、体細胞など）を用いた再生医療が注目を集めている。
障害を受けた組織及び器官に所望の細胞を適応する方法として、細胞を細胞懸濁液の状態にして直接注入する方法が挙げられる。しかし、当該方法では、移植細胞の組織からの流出、レシピエント組織への穿刺による障害、広範囲な組織修復が困難であるといった問題のため、期待する治療効果を実現することができていない。
これらの欠点を解決する方法として、所望の細胞をシート状に培養したシート状細胞培養物（細胞シートとも称される）の開発が進められている。シート状細胞培養物は、所望の細胞を大量に損傷部位に定着させることができることに加え、レシピエント組織の特性に合わせて、適度に組織化させた細胞集団を移植することのできる、大変有用な治療手段である。
Regeneration using various cells (iPS cells, pluripotent stem cells, adult stem cells, somatic cells, etc.) for the purpose of regenerating and restoring the cells, tissues, and organs of the body lost due to accidents and diseases in recent years Medical care is attracting attention.
As a method for adapting desired cells to damaged tissues and organs, there is a method in which cells are directly injected into a cell suspension. However, in this method, the expected therapeutic effect cannot be realized due to problems such as outflow of transplanted cells from the tissue, obstacle due to puncture of the recipient tissue, and difficulty in extensive tissue repair.
As a method for solving these drawbacks, development of a sheet-shaped cell culture (also referred to as a cell sheet) in which desired cells are cultured in a sheet shape has been underway. Sheet-like cell cultures are very useful because they can transplant large numbers of desired cells to the site of injury and transplant a moderately organized cell population according to the characteristics of the recipient tissue. It is a simple treatment means.
シート状細胞培養物は、所望の細胞を培養基材の表面上で培養を行い、細胞による層構造を形成させて得られるシート状の培養物を、その構造を壊さないように培養基材から剥離することによって製造される。一般に、細胞培養物によるシート状構造を形成させるために、細胞を基材に接着させる機能を有する成分を被覆した培養基材の表面上で細胞培養が行われる。このような成分としては、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、カドヘリン、ゼラチン、フィブリノゲン、フィブリン、インテグリン、ポリＬリジン、ヒアルロン酸、多血小板血漿、ポリビニルアルコール、特定の抗原を認識する抗体等が報告されている（特許文献１〜特許文献６）。また、細胞接着性を有する成分を複数含むものとして、血清（異種血清、同種血清若しくは自己血清など）も使用されている（特許文献７）。 A sheet-shaped cell culture is obtained by culturing desired cells on the surface of a culture substrate and forming a layered structure of cells from the culture substrate so as not to break the structure. Manufactured by peeling. In general, in order to form a sheet-like structure by cell culture, cell culture is performed on the surface of a culture substrate coated with a component having a function of adhering cells to the substrate. Examples of such components include collagen, fibronectin, laminin, heparan sulfate proteoglycan, cadherin, gelatin, fibrinogen, fibrin, integrin, poly L lysine, hyaluronic acid, platelet-rich plasma, polyvinyl alcohol, and an antibody that recognizes a specific antigen. Etc. have been reported (Patent Documents 1 to 6). Moreover, serum (heterologous serum, allogeneic serum, autologous serum, etc.) is also used as a thing containing multiple components which have cell adhesiveness (patent document 7).
従来、培養基材の培養表面に対する細胞の接着性を向上させるために血清を使用する場合、該表面上に万編無く血清を添加し、被覆する方法が行われていた。このような方法を行うと、使用する培養基材の全ての培養表面を血清で被覆することが必要となる。また、通常、シート状細胞培養物を患者の損傷部位に移植する際には、拒絶反応などを回避するため、その患者由来の血清（自己血清）を使用することから、患者に対する負担も大きい。
以上のように、自己血清を使用したシート状細胞培養物を調製する方法は、拒絶反応等の回避には非常に有効である一方で、大量の自己血清を必要である点に問題が存在していた。
Conventionally, when serum is used to improve the adhesion of cells to the culture surface of a culture substrate, a method has been used in which serum is added and coated on the surface without any problem. When such a method is performed, it is necessary to coat all culture surfaces of the culture substrate to be used with serum. In addition, when a sheet-like cell culture is transplanted to a damaged site of a patient, the patient-derived serum (autologous serum) is used to avoid rejection and the burden on the patient is large.
As described above, the method of preparing a sheet-shaped cell culture using autoserum is very effective for avoiding rejection and the like, but has a problem in that a large amount of autoserum is required. It was.
本発明は、シート状細胞培養物を安定的に製造する方法を提供する。特に、培養基材の培養表面を被覆する血清の量を可能な限り少なくし、かつ、安定的にシート状細胞培養物を製造することを目的とする。 The present invention provides a method for stably producing a sheet-shaped cell culture. In particular, an object of the present invention is to produce a sheet-shaped cell culture stably while minimizing the amount of serum that covers the culture surface of the culture substrate.
発明者らは、シート状細胞培養物の製造方法につき鋭意研究を行った結果、血清など、細胞を培養基材に接着させる成分（細胞接着成分と記載する）を１又は２以上含む物質と細胞を混合し、懸濁した後に、細胞を播種すると、従来使用されていた量よりも少ない量の細胞接着性成分を含む物質（血清など）の使用であっても、シート状細胞培養物を製造することができることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of diligent research on a method for producing a sheet-shaped cell culture, the inventors have obtained a substance and a cell containing one or more components such as serum that cause cells to adhere to a culture substrate (referred to as cell adhesion components). After mixing and suspending the cells, seeding the cells produces a sheet-like cell culture, even with the use of substances (such as serum) that contain a smaller amount of cell-adhesive components than previously used The present invention has been completed.
従って、本発明は以下の（１）〜（５）である。
（１）細胞接着成分を含む物質と細胞を混合して懸濁し、該懸濁した細胞を播種する工程を含む、該細胞のシート状細胞培養物を製造する方法。
（２）前記細胞接着成分を含む物質が血清であることを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（３）細胞接着成分を含む物質と細胞を混合し懸濁した後、該懸濁物を静置することを含む上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）懸濁した細胞を播種する前に該細胞を洗浄することを含む上記（１）又は（２）に記載の方法。
（５）細胞が骨格筋芽細胞であることを特徴とする上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の方法。
（６）上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法により製造されたシート状細胞培養物。
Accordingly, the present invention includes the following (1) to (5).
(1) A method for producing a sheet-shaped cell culture of cells, comprising a step of mixing and suspending a substance containing a cell adhesion component and cells, and seeding the suspended cells.
(2) The method according to (1) above, wherein the substance containing the cell adhesion component is serum.
(3) The method according to (1) or (2) above, comprising mixing and suspending a substance containing a cell adhesion component and cells, and then allowing the suspension to stand.
(4) The method according to (1) or (2) above, which comprises washing the cells before seeding the suspended cells.
(5) The method according to any one of (1) to (4) above, wherein the cell is a skeletal myoblast.
(6) A sheet-shaped cell culture produced by the method according to any one of (1) to (5) above.
本発明によれば、少量の細胞接着成分を含む物質、例えば、少量の血清を使用することで、シート状細胞培養物を製造することができる。
従って、シート状細胞培養物を製造するにあたりコストを削減することができ、また、細胞由来以外の成分（血清成分など）の残留量の極めて少ない、安全性の高いシート状細胞培養物を提供することが可能となる。更に、シート状細胞培養物の培養に自己血清を使用する場合には、血清採取にかかる患者への負担を軽減することができる。
According to the present invention, a sheet-shaped cell culture can be produced by using a substance containing a small amount of a cell adhesion component, for example, a small amount of serum.
Accordingly, it is possible to reduce the cost in producing a sheet-shaped cell culture, and to provide a highly safe sheet-shaped cell culture in which the amount of residual components other than cells (such as serum components) is extremely small. It becomes possible. Furthermore, when autologous serum is used for culturing a sheet-shaped cell culture, it is possible to reduce the burden on patients related to serum collection.
本発明は、細胞接着成分を含む物質と細胞を混合して懸濁した後、該細胞を播種する工程を含む点に特徴を有する。
細胞は、適当な培養基材上に播種し、シート状の細胞培養物を形成するまで培養を行う。
ここで、「培養基材」とは細胞がその表面上でシート状細胞培養物を形成し得るものであればいかなるものであってもよく、少なくとも、細胞が接着し得るような平坦な部分を具備し、典型的には、細胞培養皿、細胞培養ボトル（又はフラスコ）であり、市販される培養用ディッシュなどが使用可能であり、材質も特に限定されない。培養基材の材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレートなどが挙げられる。
また、「培養基材」の培養表面は、温度変化等によってその物性が変化する材料（温度応答性材料）で作製されているか、あるいは、該温度応答性材料によって培養基材の培養表面が層状に被覆されていてもよい。ここで、「温度応答性材料」は、温度変化に依存して、細胞の基材表面への接着性を変化させる材料のことで、例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどのアクリルアミド誘導体などを挙げることができる（特開２０００−２１２１４４などを参照のこと）。
The present invention is characterized in that it includes a step of mixing and suspending a substance containing a cell adhesion component and cells and then seeding the cells.
Cells are seeded on a suitable culture substrate and cultured until a sheet-like cell culture is formed.
Here, the “culture substrate” may be any material as long as the cells can form a sheet-shaped cell culture on the surface, and at least a flat portion where the cells can adhere is used. It is typically a cell culture dish or cell culture bottle (or flask), and a commercially available culture dish or the like can be used, and the material is not particularly limited. Examples of the culture substrate material include polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate, and the like.
The culture surface of the “culture substrate” is made of a material whose physical properties change due to a temperature change or the like (temperature responsive material), or the culture surface of the culture substrate is layered by the temperature responsive material. It may be coated. Here, the “temperature-responsive material” refers to a material that changes the adhesion of cells to the surface of a substrate depending on a change in temperature. Examples thereof include acrylamide derivatives such as poly-N-isopropylacrylamide. (See JP 2000-212144, for example).
本発明で使用できる「細胞接着成分を含む物質」とは、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリノゲン、フィブリン、ビトロネクチンなど細胞の培養基材へ接着させる成分を１以上含む物質のことで、典型的には、血清を挙げることができる。血清は、当業者が通常行う方法によって生体から取得したもの、あるいは、市販品などを使用することができ、血清の調製方法などは特に限定されない。また、シート状細胞培養物の使用目的に応じて、異種血清又は同種血清（自己血清を含む）のいずれであっても使用することができる。「異種血清」は、シート状細胞培養物の移植を受ける者とは異なる種の生物に由来する血清を意味し、例えば、移植を受ける者がヒトの場合、ウシ胎仔血清、ウシ血清、ウマ血清などが挙げられる。 The “substance containing a cell adhesion component” that can be used in the present invention is a substance that contains one or more components that adhere to a cell culture substrate such as fibronectin, laminin, fibrinogen, fibrin, vitronectin, and the like. And serum. As the serum, one obtained from a living body by a method commonly used by those skilled in the art or a commercially available product can be used, and the method for preparing serum is not particularly limited. Further, depending on the purpose of use of the sheet-like cell culture, either heterogeneous serum or allogeneic serum (including autoserum) can be used. “Heterologous serum” means serum derived from an organism of a species different from that of the recipient of the sheet-shaped cell culture transplant. For example, when the recipient of the transplant is a human, fetal bovine serum, bovine serum, horse serum Etc.
本発明において、細胞接着成分を含む物質と細胞を混合する場合、例えば、細胞接着成分を含む物質が血清であれば、血清１ｍＬに対して、混合する細胞の数は、細胞の種類にも依存するが、１．０×１０９個以下が好ましい。そして、細胞接着成分を含む物質に細胞を懸濁した後、そのまま培養基材上に播種してもよいが、播種前に該懸濁物を一定時間静置してもよい。静置の条件は、特に限定されるものではなく、血清等に含まれる細胞接着成分が細胞表面に接着するために必要な条件であればよく、例えば、０℃〜４０℃、好ましくは、３７℃程度で、１〜２４時間程度、好ましくは、１．５時間程度である。静置している間、適当な時間（例えば、２０〜３０分）毎に細胞懸濁液をタッピング等して、混合することが望ましい。また、播種する前に適当な溶液で洗浄してもよい。洗浄するための溶液は、例えば、培養液、PBS、生理食塩水などを挙げることができる。 In the present invention, when a substance containing a cell adhesion component is mixed with cells, for example, if the substance containing a cell adhesion component is serum, the number of cells to be mixed with 1 mL of serum also depends on the type of cell. However, 1.0 × 10 9 or less is preferable. And after suspending a cell in the substance containing a cell adhesion component, you may seed | inoculate on a culture | cultivation base material as it is, but you may leave this suspension for a fixed time before seed | inoculation. The conditions for standing are not particularly limited, and may be any conditions necessary for the cell adhesion component contained in serum or the like to adhere to the cell surface. For example, 0 to 40 ° C., preferably 37 The temperature is about 1 to 24 hours, preferably about 1.5 hours at about ° C. During the standing, it is desirable to mix the cell suspension by tapping or the like every appropriate time (for example, 20 to 30 minutes). Moreover, you may wash | clean with a suitable solution before sowing. Examples of the solution for washing can include a culture solution, PBS, and physiological saline.
本発明のシート状細胞培養物を製造する方法は、いかなる動物種、組織由来の細胞であっても使用することができる。かかる細胞の例としては、限定されずに、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞）、心筋細胞、線維芽細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、上皮細胞（例えば、角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞）、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、歯根膜細胞、皮膚細胞などが挙げられる。シート状細胞培養物の形成に用いる細胞は１種類のみであってもよいが、２種類以上の細胞を用いることもできる。
シート状細胞培養物を製造するために細胞を培養する過程は、各細胞に適した通常の培養方法によって行うことができる。本発明の好ましい態様において、細胞培養物を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の比率（純度）は、細胞培養物製造終了時において、６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上である。
細胞が骨格筋芽細胞の場合、例えば、特開２０１１−１１０３６８に記載された方法を用いることができる。播種密度は、細胞が分化状態へ移行しない程度の密度が好ましく、３．０×１０５細胞／ｃｍ２〜３．５×１０６細胞／ｃｍ２程度の範囲である。また、シート状細胞培養物形成後の細胞数は、播種時の細胞数の、例えば、３００％以下、好ましくは２００％以下、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは、１００％程度である。
The method for producing the sheet-shaped cell culture of the present invention can be used for cells derived from any animal species and tissue. Examples of such cells include, but are not limited to, myoblasts (eg, skeletal myoblasts), cardiomyocytes, fibroblasts, mesenchymal stem cells, embryonic stem cells, iPS cells, synovial cells, epithelial cells ( Examples thereof include corneal epithelial cells, oral mucosal epithelial cells), endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, periodontal ligament cells, skin cells, and the like. Only one type of cell may be used for forming the sheet-shaped cell culture, but two or more types of cells may be used.
The process of culturing cells to produce a sheet-shaped cell culture can be performed by a normal culture method suitable for each cell. In a preferred embodiment of the present invention, when there are two or more types of cells forming a cell culture, the ratio (purity) of the most cells is 65% or more, preferably 70% or more at the end of cell culture production. Preferably it is 75% or more.
When the cells are skeletal myoblasts, for example, the method described in JP2011-110368 can be used. The seeding density is preferably such that the cells do not shift to a differentiated state, and is in the range of about 3.0 × 10 5 cells / cm 2 to 3.5 × 10 6 cells / cm 2 . The number of cells after forming the sheet-shaped cell culture is, for example, 300% or less, preferably 200% or less, more preferably 50% or less, and still more preferably about 100% of the number of cells at the time of seeding.
本発明のシート状細胞培養物の製造方法において使用される培地は、培養する細胞に適した培地を適宜選択して使用することができる。例えば、一般的に使用可能な培地として、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０などを挙げることができる。これらの培地は市販のものを購入して使用してもよい。また、これらの培地は単独で用いても、また、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
さらに、培地に対し、必要に応じて適当な添加物を加えて使用してもよい。添加物としては、例えば、アミノ酸類（例えば、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トリオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンなど）、ビタミン類（例えば、葉酸、リボフラビン、チアミンなど）、その他、Ｄ−グルコース、ピルビン酸ナトリウムなどを含んでもよい。また、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＡＮＫ’Ｓなどの緩衝剤（液）を適宜培地に加えてもよい。さらに、培養する細胞の特性に応じて、適宜、細胞成長因子などを添加してもよい。
As the medium used in the method for producing a sheet-shaped cell culture of the present invention, a medium suitable for the cells to be cultured can be appropriately selected and used. For example, MEM, DMEM, F12, IMEM, RPMI-1640 etc. can be mentioned as a culture medium which can be generally used. You may purchase and use these culture media. Moreover, these culture media may be used independently or may be used in combination of 2 or more types.
Furthermore, you may use for a culture medium, adding an appropriate additive as needed. Examples of the additive include amino acids (for example, L-arginine, L-cystine, L-glutamine, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-serine, L-trionine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-alanyl-L-glutamine, etc.), vitamins (for example, folic acid, riboflavin, thiamine, etc.), other, D-glucose, pyrubin It may contain sodium acid. Moreover, you may add buffer (liquid), such as PBS, HEPES, and HANK'S suitably to a culture medium. Furthermore, a cell growth factor or the like may be added as appropriate according to the characteristics of the cells to be cultured.
細胞の培養は、当該技術分野において通常実施される条件等で行うことができる。培養温度は３０〜４０℃、好ましくは３６〜３８℃、ＣＯ２濃度は０〜１０％、好ましくは４〜６％の条件を挙げることができるが、この条件は限定されるものではなく、培養する細胞の特性に応じて、適宜、培養温度、ＣＯ２濃度を選択することができる。培養時間は、所望のシート状細胞培養物が形成されるために必要な時間であれば、特に限定されるものではなく、例えば、１０時間〜３０時間、１２時間〜２６時間程度の培養時間を例示することができる。 Cell culture can be performed under conditions ordinarily performed in the art. The culture temperature can be 30 to 40 ° C., preferably 36 to 38 ° C., and the CO 2 concentration can be 0 to 10%, preferably 4 to 6%. Depending on the characteristics of the cells to be cultured, the culture temperature and CO 2 concentration can be appropriately selected. The culture time is not particularly limited as long as it is a time necessary for forming a desired sheet-shaped cell culture. For example, the culture time is about 10 hours to 30 hours, about 12 hours to 26 hours. It can be illustrated.
細胞の培養後、所望の形状、構造等を備えたシート状細胞培養物が形成されたのち、該シート状細胞培養物を細胞培養基材の培養表面から剥離し、シート状細胞培養物の回収を行う。シート状細胞培養物の培養表面からの剥離は、シート状の構造が破損されないような方法で実施することができる。具体的には、例えば、シート状細胞培養物を直接ピンセットなどによって摘み培養表面から剥離する、あるいはピペッティングにより細胞を培養表面との間を機械的に剥離する、あるいは、シート状の構造が破損されない限り、トリプシン、コラゲナーゼなどの酵素処理等を行ってもよく、細胞の性質に応じて適切な方法を選択することができる。あるいは、シート状細胞培養物の上面に細胞に親和性を有する基材（例えば、PVDF膜、ニトロセルロース膜、フィブリンゲル、コラーゲンゲルなど）を被せて、細胞を膜に写し取ることによって細胞を剥離、回収することもできる。
温度応答性材料（例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどのアクリルアミド誘導体など）で表面を被覆した細胞培養基材を使用した場合には、容器の温度を、例えば、０〜３０℃程度に下げたのちに、上記、細胞の剥離、回収を実施してもよい。
After the cell culture, a sheet-like cell culture having a desired shape, structure, etc. is formed, and then the sheet-like cell culture is peeled off from the culture surface of the cell culture substrate, and the sheet-like cell culture is recovered. I do. The peeling of the sheet-shaped cell culture from the culture surface can be performed by a method that does not damage the sheet-shaped structure. Specifically, for example, the sheet-shaped cell culture is directly picked with forceps and peeled off from the culture surface, or the cells are mechanically separated from the culture surface by pipetting, or the sheet-like structure is damaged. Unless otherwise specified, enzyme treatment such as trypsin and collagenase may be performed, and an appropriate method can be selected according to the properties of the cells. Alternatively, a substrate having affinity for cells (eg, PVDF membrane, nitrocellulose membrane, fibrin gel, collagen gel, etc.) is placed on the upper surface of the sheet-shaped cell culture, and the cells are detached by copying the cells to the membrane. It can also be recovered.
When a cell culture substrate whose surface is coated with a temperature-responsive material (for example, an acrylamide derivative such as poly-N-isopropylacrylamide) is used, the temperature of the container is lowered to, for example, about 0 to 30 ° C. Later, the cells may be detached and collected.
本発明には、本発明の方法によって製造されるシート状細胞培養物も含まれる。本発明で製造されたシート状細胞培養物は、細胞由来の物質以外の物質（例えば、血清成分など）の残留量が従来技術による培養物と比べて極めて少ない。このため、レシピエントの組織内で感染、アレルギー反応が起こる可能性が低く、安全性の高いシート状細胞培養物を提供することが可能である。 The present invention also includes a sheet-shaped cell culture produced by the method of the present invention. The sheet-like cell culture produced by the present invention has a very small residual amount of substances other than cell-derived substances (for example, serum components) as compared with cultures according to the prior art. For this reason, it is possible to provide a highly safe sheet-like cell culture that is less likely to cause infection or allergic reaction in the recipient tissue.
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
ヒト骨格筋芽細胞を２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有のＭＣＤＢ１３１培地（ライフテクノロジージャパン社製）で増殖させた後、回収し、１０％DMSO（純正化学製）を含む凍結保存液を用いて凍結保存した。凍結保存した細胞を約３７℃に設定したウォーターバス内で解凍し、０．５％のヒト血清アルブミンを含む緩衝液で洗浄したものを以下の実施例に用いた。 Human skeletal myoblasts were grown in MCDB131 medium (Life Technology Japan) containing 20% (v / v) FBS, recovered, and then frozen using a cryopreservation solution containing 10% DMSO (Pure Chemical). Cryopreserved. The cryopreserved cells were thawed in a water bath set at about 37 ° C. and washed with a buffer containing 0.5% human serum albumin and used in the following examples.
実施例
50%v/vのヒト血清を含むDMEM/F12培地（ライフテクノロジージャパン社）1000μLに、1.76×106個の骨格筋芽細胞を懸濁し、CO2インキュベーター（設定値：37℃、5%CO2）内で90分間インキュベートした。
インキュベートの間、細胞懸濁液は30分置きにタッピングにより攪拌した。インキュベート後、DMEM/F12基礎培地（血清を含まない）を12mLずつ加えて遠心し（240×g、4℃、7分）、上清を取り除き、500μLのDMEM/F12基礎培地（血清を含まない）を加え懸濁した後、全量を温度応答性培養皿（24well）に播種し、CO2インキュベーター（設定値：37℃、5%CO2）内で24時間培養した。培養後、培養上清を取り除き、シート形成の可否を顕微鏡及び目視下で観察した。
その結果、培養基材表面に敷石状の細胞層が形成され（図1）、細胞シートを調製することができた。
Example
1.76 × 10 6 skeletal myoblasts are suspended in 1000 μL of DMEM / F12 medium (Life Technology Japan) containing 50% v / v human serum, and a CO 2 incubator (setting value: 37 ° C., 5% CO 2) 2 ) Incubated for 90 minutes in.
During the incubation, the cell suspension was agitated by tapping every 30 minutes. After incubation, add 12 mL each of DMEM / F12 basal medium (without serum), centrifuge (240 × g, 4 ° C, 7 minutes), remove the supernatant, and 500 μL of DMEM / F12 basal medium (without serum) ) Was added and suspended, and the whole amount was seeded in a temperature-responsive culture dish (24 well) and cultured in a CO 2 incubator (setting values: 37 ° C., 5% CO 2 ) for 24 hours. After the culture, the culture supernatant was removed, and the possibility of sheet formation was observed under a microscope and visually.
As a result, a paving stone cell layer was formed on the surface of the culture substrate (FIG. 1), and a cell sheet could be prepared.
上記結果より、細胞のシート構造を形成するために必要な細胞接着性を有する成分を予め細胞表面に付着させておくことによって、培養工程で細胞接着性を有する成分を含む物質（血清等）を使うことなく、シート状細胞培養物の調製が可能であることが明らかとなった。すなわち、血清の使用量を減らすことができることが確認された。従来の一般的な製造方法を用いた場合、血清は細胞シート1枚(10cmディッシュを使用した場合)あたり3mLの血清が必要であるが、本発明の場合は500μL以下まで減らすことが可能である。 From the above results, a substance (serum or the like) containing a cell-adhesive component in the culturing process is prepared by previously attaching a cell-adhesive component necessary for forming a cell sheet structure to the cell surface. It became clear that preparation of a sheet-like cell culture was possible without using. That is, it was confirmed that the amount of serum used can be reduced. When using a conventional general production method, serum requires 3 mL of serum per cell sheet (when using a 10 cm dish), but in the case of the present invention, it can be reduced to 500 μL or less. .
本発明は、細胞のシート構造を形成させるために必要な細胞接着成分（血清など）の使用量減らすことを可能ならしめ、また、自己血清を使用する場合の患者負担を軽減することができる。従って、再生医療の分野における利用性が高く、当該分野の発展にも貢献するものである。 The present invention makes it possible to reduce the amount of cell adhesion components (such as serum) used to form a cell sheet structure, and to reduce the burden on the patient when using autologous serum. Therefore, it is highly applicable in the field of regenerative medicine and contributes to the development of this field.
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