JP2019013154A - Rice plant with high carotenoid accumulation and preparation methods thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、カロテノイドを高蓄積するイネ及びその作製方法に関する。詳細には、本発明は、GIC（GLK-Induced CCT domain-containing proteins）をコードする遺伝子を過剰
に発現させることによってカロテノイドを高濃度に蓄積するイネおよびその作製方法に関する。
The present invention relates to rice that highly accumulates carotenoids and a method for producing the same. Specifically, the present invention relates to rice that accumulates carotenoids at a high concentration by overexpressing a gene encoding GIC (GLK-Induced CCT domain-containing proteins) and a method for producing the same.
カロテノイドはビタミンＡ（レチノール）の前駆体として重要な脂溶性色素である。ビタミンＡの欠乏はヒトや家畜に夜盲症や失明、抗酸化力の低下、粘膜の乾燥、免疫力の低下等を引き起こす。特に米を主食とする地域で夜盲症や失明のリスクが高い。世界保健機関（WHO、2009）は、年間で約50万人の未就学児童と約100万人の妊婦が夜盲症を患ったと報告している（非特許文献１）。ビタミンA前駆体のβ-カロテン（カロテノイドの一種）高蓄積米の実用化により、上述のリスクを低減すると期待されている。また、家畜にも飼料にビタミン剤を添加して与えることがしばしばあるが、カロテノイド高蓄積米を飼料に混合すれば、ビタミン剤の投与量の軽減が可能で、経費の節減につながると期待されている。
カロテノイドを高度に蓄積するイネとして「ゴールデンライス」の実用化が進行中である。ゴールデンライスは、植物起源のphytoene synthase（PSY）の他に植物病原細菌（Erwinia uredovora）起源のcarotene desaturase（crtI）のカロテノイド生合成系の酵素をコードする遺伝子が導入された遺伝子組換えイネであり、これら2遺伝子を恒常的過剰発
現あるいは胚乳特異的に高発現させることで穀粒のカロテノイド含量を高めている（非特許文献２，３）。
実用化途上の改良型ゴールデンライス（ゴールデンライス2）にはイネ起源ではない遺
伝子、すなわちトウモロコシPSY遺伝子とErwinia crtI遺伝子が共導入されており（非特
許文献２）、目下、フィリピン、バングラデシュ、インドネシアで実用化に向けた試験栽培が進行中である。しかし、遺伝子組換え作物（Genetically Modified Organism; GMO）栽培に対する厳しい規制やGMOに対する農民や消費者のネガティブなイメージ等のため、
ゴールデンライス2の実用化への道は平坦ではない状況である。従って、社会により広く
受け入れやすい方策の一つとして、出来る限り植物起源、より望ましくはイネ起源の遺伝子をイネに導入することにより、カロテノイドを高蓄積することが求められていた。
Carotenoids are important fat-soluble pigments as precursors of vitamin A (retinol). Vitamin A deficiency causes night blindness, blindness, decreased antioxidant capacity, dry mucous membranes, decreased immunity, etc. in humans and livestock. There is a high risk of night blindness and blindness, especially in areas where rice is the staple food. The World Health Organization (WHO, 2009) reports that about 500,000 preschool children and about 1 million pregnant women suffered from night blindness (Non-patent Document 1). It is expected that the risk mentioned above will be reduced by the practical use of β-carotene (a kind of carotenoid) that accumulates vitamin A precursor. In addition, vitamins are often given to livestock by adding vitamins to the feed. However, if carotenoid-rich rice is mixed with feed, the dosage of vitamins can be reduced, which is expected to lead to cost savings. ing.
Practical application of “Golden Rice” is underway as a rice plant that accumulates high levels of carotenoids. Golden rice is a genetically-modified rice plant that has introduced a carotenoid biosynthetic enzyme gene of carrotene desaturase (crtI) derived from plant pathogenic bacteria (Erwinia uredovora) in addition to plant-derived phytoene synthase (PSY). These two genes are constantly overexpressed or highly expressed specifically in the endosperm to increase the carotenoid content of the grain (Non-patent Documents 2 and 3).
An improved Golden Rice (Golden Rice 2), which is in practical use, has been co-introduced with genes that are not of rice origin, ie, maize PSY gene and Erwinia crtI gene (Non-Patent Document 2), and currently in the Philippines, Bangladesh and Indonesia Trial cultivation for practical application is ongoing. However, due to strict regulations on genetically modified crops (GMO) cultivation and negative images of farmers and consumers against GMO,
The road to commercialization of Golden Rice 2 is not flat. Accordingly, as one of the measures that are more widely accepted by society, it has been required to accumulate carotenoids by introducing genes of plant origin, more preferably rice origin, into rice as much as possible.
本発明は、イネ起源の遺伝子を導入することにより、カロテノイドを高蓄積するイネを作製することを課題とする。 An object of the present invention is to produce rice that highly accumulates carotenoids by introducing a gene of rice origin.
本発明者らは、葉緑体分化の正の制御因子Golden2-Like（GLK：イネではOsGLK1とOsGLK2の2種）のcDNAを過剰発現するイネ（OsGLK1/2-OX）のカルスが、野生型カルスの乳白色
に対し、緑色を呈し、かつその細胞内に発達した葉緑体を有することを見出した。次に、OsGLK1-OXイネならびにOsGLK2-OXイネの緑色カルスを、農業生物資源研究所（現 農業・
食品産業技術総合研究機構）にてイネ44k発現マイクロアレイ解析に供試した。その結果
、野生型カルスに比して、上記の形質転換イネの緑色カルスで共通して3倍以上の発現上
昇を見せた遺伝子群の中に、タンパク質間相互作用やDNA結合に働くと考えられるCCTドメインをC末端側に含むCONSTANS-like（COL）ファミリー転写因子と推定されるタンパク質
をコードする遺伝子を5種類見出した（GLK-Induced CCT domain-containing proteins：GIC1、GIC2、GIC3、GIC4、GIC5）。本発明者らは、GIC1〜GIC5遺伝子の各cDNAをイネに個
別導入し、過剰発現させたところ、OsGIC4-OXおよびOsGIC5-OXイネ系統のカルスは乳白色で、濃黄色カルスは出現しなかった。一方、GIC1、GIC2、GIC3を過剰発現する形質転換イネ（OsGIC1/2/3-OX）系統は、特定の種類のカロテノイドの高蓄積に起因して、カルスや
種子が濃黄色を呈することを見出した。本発明者らはこのような知見に基づいて発明を完成させた。
The present inventors have described that the callus of rice (OsGLK1 / 2-OX) overexpressing the cDNA of the positive regulator of chloroplast differentiation Golden2-Like (GLK: OsGLK1 and OsGLK2 in rice) is wild type. It was found that the milky white color of the callus had a green color and had a chloroplast developed in the cell. Next, the green callus of OsGLK1-OX rice and OsGLK2-OX rice was transferred to the National Institute of Agrobiological Sciences (currently
The Food Industry Technology Research Organization) was used for rice 44k expression microarray analysis. As a result, it is considered that among the gene groups that showed an expression increase of 3 times or more in common in green callus of the above transformed rice compared to wild type callus, it is considered to work for protein-protein interaction and DNA binding. We found five genes encoding proteins presumed to be CONSTANS-like (COL) family transcription factors containing a CCT domain on the C-terminal side (GLK-Induced CCT domain-containing proteins: GIC1, GIC2, GIC3, GIC4, GIC5 ). When the present inventors individually introduced and overexpressed each cDNA of the GIC1 to GIC5 genes into rice, the calli of OsGIC4-OX and OsGIC5-OX rice lines were milky white, and no dark yellow callus appeared. On the other hand, transformed rice (OsGIC1 / 2 / 3-OX) lines that overexpress GIC1, GIC2, and GIC3 have found that callus and seeds have a deep yellow color due to high accumulation of certain types of carotenoids. It was. The present inventors have completed the invention based on such findings.
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）（ａ）（ｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、
配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列、
をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、および／又は挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは、
（ｉｉｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、
配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列
と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、ならびに、
（ｂ）（ａ）に記載の遺伝子をイネにおいて過剰発現させるプロモーターとして機能するＤＮＡ、
を含有する、組換えベクター。
（２）（ｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、
配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列、
を含むタンパク質、
（ｉｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、および／又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは、
（ｉｉｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、
配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列
と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質
の発現量が野生型と比較して増加するように改変され、カロテノイドの蓄積量が野生型イネと比較して増加した形質転換イネ。
（３）（１）に記載の組換えベクターで形質転換され、カロテノイドの蓄積量が野生型イネと比較して増加した前記形質転換イネ。
（４）以下（ａ）および（ｂ）の工程を含む、カロテノイドの蓄積量が野生型イネと比較して増加した形質転換イネの作製方法。
（ａ）（１）に記載の組換えベクターでイネ細胞を形質転換する工程、
（ｂ）該組換えベクターで形質転換されたイネ細胞からイネ植物体を再生する工程。
That is, the present invention is as follows.
(1) (a) (i) SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 452 of SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 4 or amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 421 of SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 6 or amino acid sequence of amino acid numbers 196 to 448 of SEQ ID NO: 6,
DNA consisting of a base sequence encoding
(Ii) SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 452 of SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 421, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 6 448 amino acid sequences, DNA consisting of a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, added, and / or inserted; or
(Iii) SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 452 of SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 4 or the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 421 of SEQ ID NO: 4, or the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or amino acid numbers 196 to 448 of SEQ ID NO: 6 DNA consisting of, and
(B) DNA that functions as a promoter that overexpresses the gene described in (a) in rice,
A recombinant vector containing
(2) (i) SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 452 of SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 4 or amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 421 of SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 6 or amino acid sequence of amino acid numbers 196 to 448 of SEQ ID NO: 6,
A protein containing,
(Ii) SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 452 of SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 421, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 6 A protein comprising an amino acid sequence wherein one or several amino acid residues are substituted, deleted, added, and / or inserted in a 448 amino acid sequence, or
(Iii) SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 452 of SEQ ID NO: 2,
Expression of a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or amino acid numbers 203 to 421 of SEQ ID NO: 4, or the amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or amino acid numbers 196 to 448 of SEQ ID NO: 6 A transgenic rice plant that has been modified so that its amount is increased compared to wild type, and the amount of accumulated carotenoids is increased compared to wild type rice.
(3) The transformed rice transformed with the recombinant vector according to (1), wherein the accumulated amount of carotenoid is increased compared to wild-type rice.
(4) A method for producing transformed rice, comprising the following steps (a) and (b), wherein the accumulated amount of carotenoid is increased compared to wild-type rice.
(A) transforming rice cells with the recombinant vector according to (1),
(B) A step of regenerating a rice plant from rice cells transformed with the recombinant vector.
本発明のイネ及びその作製法は、イネ起源の遺伝子をイネに導入する点でゴールデンライスに比べて少ない外来遺伝子数で、ゴールデンライスとは全く異なるメカニズム（すなわち、カロテノイド生合成酵素遺伝子を導入しない）により、カロテノイドを高蓄積させることができる。カロテノイド生合成酵素遺伝子ではなく、GIC遺伝子をイネに導入する
ことによりカロテノイドを高蓄積できるのは、当該分野の技術常識から予測し得なかった顕著な効果である。
本発明の組換えベクターを用いてイネを形質転換することにより、カロテノイドをイネに高蓄積できるため、本発明のイネは、稲作地帯でビタミンＡ欠乏にさいなまれている人々の救済に活用可能であり、また、家畜のビタミンＡ補給や欠乏対策にも活用可能である。
本発明の組換えベクターにおいて、例えば、胚乳特異的発現遺伝子のプロモーターを使用することにより、カロテノイドを胚乳限定的に高蓄積するイネを作製することができる。
本発明の組換えベクターにおいて、例えば、葉身に比べて葉緑体の発達が十分でない葉鞘やシュート（地上部）維管束で特異的に発現する遺伝子のプロモーターを使用することにより、カロテノイドを葉鞘や維管束に高蓄積するイネを作製することができる。
The rice of the present invention and the production method thereof have a smaller number of foreign genes than golden rice in terms of introducing rice-derived genes into rice, and do not introduce a carotenoid biosynthetic enzyme gene that is completely different from that of golden rice. ) Allows a high accumulation of carotenoids. The high accumulation of carotenoids by introducing the GIC gene into rice instead of the carotenoid biosynthetic enzyme gene is a remarkable effect that could not be predicted from the common general technical knowledge in the field.
By transforming rice using the recombinant vector of the present invention, carotenoids can be highly accumulated in rice, so that the rice of the present invention can be used for the rescue of people who are suffering from vitamin A deficiency in rice cultivation areas. Yes, it can also be used for vitamin A supplementation and deficiency countermeasures for livestock.
In the recombinant vector of the present invention, for example, by using a promoter of an endosperm-specific expression gene, rice that accumulates carotenoids in a limited amount of endosperm can be produced.
In the recombinant vector of the present invention, for example, a carotenoid can be converted into a leaf sheath by using a promoter of a gene that is specifically expressed in a shoot or a shoot (ground part) vascular bundle in which chloroplast development is not sufficient compared to a leaf blade. And rice that accumulates highly in the vascular bundle.
１．本発明の組換えベクター
本発明の組換えベクターは、GIC1、GIC2またはGIC3をコードする遺伝子の各cDNA配列、および、これらの遺伝子をイネにおいて過剰発現させるプロモーターとして機能するＤＮＡを含有する。GIC1、GIC2、GIC3は単独または２〜３の組み合わせで過剰発現されてもよい。本発明の組換えベクターにおいて、GIC1、GIC2またはGIC3をコードする遺伝子の各cDNAは、上記の過剰発現型プロモーター配列の3’下流に連結され、同プロモーターの制御
下に置かれている。
GIC1［遺伝子座 (RAP Locus): Os02g0731700］、GIC2（Os03g0711100）、及びGIC3（Os06g0264200）遺伝子の塩基配列、並びに同遺伝子産物のアミノ酸配列は当該分野で公知である。本明細書中において、GIC1の塩基配列（cDNA配列）は、配列番号１で示され、そのアミノ酸配列は、配列番号２で示されている。GIC2の塩基配列（cDNA配列）は、配列番号３で示され、そのアミノ酸配列は、配列番号４で示されている。GIC3の塩基配列（cDNA配列）は、配列番号５で示され、そのアミノ酸配列は、配列番号６で示されている。
なお、実施例で示すように、GIC1はＮ末部分を欠損させた配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列を有するＮ末欠損体でもカロテノイド高蓄積効果を発揮するのでこのＮ末欠損体を過剰発現させてもよい。また、配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列に対応するGIC2およびGIC3の部分は、図２のアラインメントから、それぞれ配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１、配列番号６のアミノ酸番号１９６〜
４４８に該当するので、これらのアミノ酸配列を有するGIC2およびGIC3のＮ末欠損体を過剰発現させてもよい。
1. Recombinant vector of the present invention The recombinant vector of the present invention contains each cDNA sequence of genes encoding GIC1, GIC2 or GIC3, and DNA functioning as a promoter for overexpressing these genes in rice. GIC1, GIC2, and GIC3 may be overexpressed singly or in combination of 2-3. In the recombinant vector of the present invention, each cDNA of a gene encoding GIC1, GIC2, or GIC3 is linked 3 ′ downstream of the overexpression promoter sequence and placed under the control of the promoter.
The base sequences of GIC1 [locus (RAP Locus): Os02g0731700], GIC2 (Os03g0711100), and GIC3 (Os06g0264200) genes, and the amino acid sequences of the gene products are known in the art. In the present specification, the base sequence (cDNA sequence) of GIC1 is represented by SEQ ID NO: 1, and its amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 2. The base sequence (cDNA sequence) of GIC2 is represented by SEQ ID NO: 3, and its amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 4. The base sequence (cDNA sequence) of GIC3 is represented by SEQ ID NO: 5, and its amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 6.
As shown in the Examples, GIC1 exhibits a carotenoid high accumulation effect even in the N-terminal deficient having the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 452 of SEQ ID NO: 2 from which the N-terminal portion has been deleted. May be overexpressed. Further, the GIC2 and GIC3 portions corresponding to the amino acid sequences of amino acid numbers 203 to 452 of SEQ ID NO: 2 are represented by amino acid numbers 203 to 421 of SEQ ID NO: 4 and amino acid numbers 196 to 196 of SEQ ID NO: 6, respectively, from the alignment of FIG.
Since it corresponds to 448, N-terminal deletions of GIC2 and GIC3 having these amino acid sequences may be overexpressed.
本発明の組換えベクターにおいて、「過剰発現」とは、GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、GIC3遺伝子などの目的の遺伝子の発現量が、野生型イネと比較して、mRNAの量が、例えば、３倍以上、好ましくは１０倍以上に上昇していることを意味する。発現量は、例えば、定量的RT-PCRで測定できる。GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、GIC3遺伝子の発現の上昇には、GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、GIC3遺伝子の転写の促進、転写物のスプライシングの促進、およびタンパク質への翻訳の促進が含まれる。 In the recombinant vector of the present invention, “overexpression” means that the expression level of a target gene such as GIC1 gene, GIC2 gene, and GIC3 gene is, for example, 3 times the amount of mRNA compared to wild-type rice. This means that it is preferably increased 10 times or more. The expression level can be measured by, for example, quantitative RT-PCR. Increased expression of the GIC1, GIC2, and GIC3 genes includes promoting transcription of the GIC1, GIC2, and GIC3 genes, promoting splicing of transcripts, and promoting translation into proteins.
GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、GIC3遺伝子は、好ましくは、それぞれ、配列番号１もしくは配列番号１の塩基番号６０７〜１３５６、配列番号３もしくは配列番号３の塩基番号６０７〜１２６３、配列番号５もしくは配列番号５の塩基番号５８６〜１３４４で示される配列を有するＤＮＡであり、イネで過剰発現させることにより野生型イネと比較してカロテノイドの蓄積量が増加する限り、配列番号１もしくは配列番号１の塩基番号６０７〜１３５６、配列番号３もしくは配列番号３の塩基番号６０７〜１２６３、配列番号５もしくは配列番号５の塩基番号５８６〜１３４４の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有するＤＮＡであってもよい。本発明でＤＮＡに関し「ストリンジェントな条件下」というときは、高程度にストリンジェントな条件をいう。基本的な条件は、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、第6〜7章、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示されている。本発明において、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、5XSSC、7%(W/V)SDS、100マイクログラム/ml変性サケ精子DNA、5Xデンハルト液を含む溶液にて60℃でハイブリダイゼーションを行い、その後0.1XSSC溶液にて65℃でしんとうしながら２時間洗浄する条件が挙げられ
る。GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、GIC3遺伝子は、さらに、イネで過剰発現させることにより野生型イネと比較してカロテノイドの蓄積量が増加する限り、配列番号１もしくは配列番号１の塩基番号６０７〜１３５６、配列番号３もしくは配列番号３の塩基番号６０７〜１２６３、配列番号５もしくは配列番号５の塩基番号５８６〜１３４４の塩基配列において１または数個の塩基が置換、欠失、付加、および／又は挿入された塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。ここで、「１または数個の塩基」とは、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜９個の塩基である。
The GIC1 gene, GIC2 gene, and GIC3 gene are preferably SEQ ID NO: 1 or base numbers 607 to 1356 of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or base numbers 607 to 1263 of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 5, respectively. As long as the amount of accumulated carotenoids increases as compared with wild-type rice by overexpression in rice, the DNA having the sequence represented by nucleotide numbers 586 to 1344 of SEQ ID NO: 1 or nucleotide number 607 of SEQ ID NO: 1 1356, DNA having a sequence that hybridizes under stringent conditions with the complementary sequence of nucleotide numbers 607 to 1263 of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 3, and nucleotide numbers 586 to 1344 of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 5. Also good. In the present invention, “stringent conditions” with respect to DNA refers to highly stringent conditions. Basic conditions are shown in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, chapters 6-7, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. In the present invention, stringent hybridization conditions include, for example, hybridization at 60 ° C. in a solution containing 5XSSC, 7% (W / V) SDS, 100 microgram / ml denatured salmon sperm DNA, and 5X Denhardt's solution. And then washing with 0.1XSSC solution at 65 ° C. for 2 hours. As long as GIC1 gene, GIC2 gene, and GIC3 gene are further overexpressed in rice and the amount of accumulated carotenoid is increased compared to wild type rice, SEQ ID NO: 1 or nucleotide numbers 607 to 1356 of SEQ ID NO: 1, One or several bases are substituted, deleted, added, and / or inserted in the base sequence of nucleotide numbers 607 to 1263 of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 3, or nucleotide numbers 586 to 1344 of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 5. It may be DNA consisting of a base sequence. Here, “1 or several bases” is preferably 1 to 30, more preferably 1 to 15, and particularly preferably 1 to 9 bases.
GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、GIC3遺伝子は、好ましくは、配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列をコードする。また、GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、GIC3遺伝子は、これらの遺伝子の機能に実質的に影響しない保存的変異を有していてもよい。すなわち、配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。前記「１又は数個のアミノ酸残基」とは、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個のアミノ酸残基である。なお、GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、GIC3遺伝子は、イネで過剰発現させることにより野生型イネと比較してカロテノイドの蓄積量が増加する限り、配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列に対して、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。 The GIC1 gene, GIC2 gene, and GIC3 gene are preferably the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 452 of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 421 of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 6 or the amino acid sequence of amino acid numbers 196 to 448 of SEQ ID NO: 6. Further, the GIC1 gene, GIC2 gene, and GIC3 gene may have conservative mutations that do not substantially affect the functions of these genes. That is, the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 452 of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 421 of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 4, or the amino acid numbers of 196 to 448 of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 6 In this amino acid sequence, a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted, or added may be used. The “one or several amino acid residues” is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 3 amino acid residues. The GIC1 gene, GIC2 gene, and GIC3 gene are amino acids of amino acid numbers 203 to 452 of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 2 as long as the amount of accumulated carotenoid is increased by overexpression in rice compared to wild type rice. 90% or more, preferably 95% or more with respect to the sequence, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or amino acid numbers 203 to 421 of SEQ ID NO: 4, or the amino acid sequence of amino acid numbers 196 to 448 of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 6. More preferably, it may encode a protein having amino acid identity of 98% or more.
GIC（GLK-Induced CCT domain-containing proteins：GIC1-5）との名称は、GIC遺伝子が、葉緑体分化の正の制御因子Golden2-Like（GLK）のcDNAを過剰発現するイネにおいて
見出され、タンパク質間相互作用やDNA結合に働くと考えられるCCTドメインをC末端側に
含むCONSTANS-like（COL）ファミリー転写因子をコードしており、5種類存在していたこ
とに由来する（図1、2）。GIC1-5のうちGIC1-3の3種は互いにアミノ酸配列同一性が高く
、GIC1とGIC2の同一性は３７％であり、GIC1とGIC3の同一性は５９％であり、GIC2とGIC3の同一性は４１％であり、タンパク質間相互作用への関与が推測されるB-box zinc finger（ZF）ドメインをN末端側に、タンパク質間相互作用やDNA結合に働くと考えられるCCTドメインをC末端側にそれぞれ1つずつ有するのが特徴である（図1、2）。B-boxドメインの
同一性は、GIC1とGIC2間で８１％、GIC1とGIC3間で９８％、GIC2とGIC3間で８４％を示した。また、CCTドメインの同一性は、GIC1とGIC2間で９５％、GIC1とGIC3間で９８％、GIC2とGIC3間で９８％を示した（表１）。以上より、両ドメインはGIC1-3で高度に保存され
ていることが判明した。この知見は、これら３種類のGICタンパク質の機能に類似性（重
複性）があることを示唆するものである。
The name GIC (GLK-Induced CCT domain-containing proteins: GIC1-5) is found in rice plants where the GIC gene overexpresses the cDNA of the positive regulator of chloroplast differentiation, Golden2-Like (GLK). It encodes a CONSTANS-like (COL) family transcription factor containing a CCT domain that is thought to act on protein-protein interactions and DNA binding on the C-terminal side, and is derived from the presence of five types (Fig. 1, 2). Three of GIC1-5, GIC1-3, have high amino acid sequence identity, GIC1 and GIC2 have 37% identity, GIC1 and GIC3 have 59% identity, and GIC2 and GIC3 identity Is 41%, and the B-box zinc finger (ZF) domain, which is presumed to be involved in protein-protein interactions, is located on the N-terminal side, and the CCT domain, which is thought to act on protein-protein interactions and DNA binding, is located on the C-terminal side. One of them is characterized by having one each (Figs. 1 and 2). The identity of the B-box domain was 81% between GIC1 and GIC2, 98% between GIC1 and GIC3, and 84% between GIC2 and GIC3. The identity of the CCT domain was 95% between GIC1 and GIC2, 98% between GIC1 and GIC3, and 98% between GIC2 and GIC3 (Table 1). From the above, it was found that both domains are highly conserved in GIC1-3. This finding suggests that these three types of GIC proteins have similarities (redundancy) in function.
GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、またはGIC3遺伝子が挿入されるベクターは、イネ植物細胞内で遺伝子を過剰発現させるためのプロモーターを含み、イネ植物細胞内で挿入物の機能を発揮させることが可能なものであれば特に制限はない。イネ植物細胞内で遺伝子を過剰発現させるためのプロモーターとしてはGIC1遺伝子、GIC2遺伝子、またはGIC3遺伝子が本来有するプロモーターより強力なプロモーターであることが好ましく、恒常的プロモーターでも誘導型プロモーターでもよいが、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロ
モーター、イネ由来アクチンプロモーター（例えば、Actin-1遺伝子のプロモーター）、
トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター（例えば、Ubiquitin-1（ZmUbi-1）遺伝子のプロモーター）、イネ由来翻訳伸長因子プロモーター（例えば、Elongation factor 1 beta（EF-1β）遺伝子のプロモーター）などを用いることができる。ここでいう「イネ植物細胞」には、種々の形態のイネ植物細胞、例えば、種子、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
The vector into which the GIC1 gene, GIC2 gene, or GIC3 gene is inserted contains a promoter for overexpressing the gene in rice plant cells, and can exert the function of the insert in rice plant cells. If there is no particular limitation. The promoter for overexpressing a gene in rice plant cells is preferably a promoter stronger than the promoter originally possessed by the GIC1 gene, GIC2 gene, or GIC3 gene, and may be a constitutive promoter or an inducible promoter. , Cauliflower mosaic virus 35S promoter, rice-derived actin promoter (for example, Actin-1 gene promoter),
A corn-derived ubiquitin promoter (for example, Ubiquitin-1 (ZmUbi-1) gene promoter), a rice-derived translation elongation factor promoter (for example, Elongation factor 1 beta (EF-1β) gene promoter) and the like can be used. As used herein, “rice plant cells” include various types of rice plant cells, such as seeds, suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, and callus.
また、本発明の組換えベクターにおいて、例えば、Plant Mol. Biol. 30: 1207-1221 (1996)およびPlant J. 4: 357-366 (1993)に記載されるような胚乳特異的発現遺伝子のプ
ロモーター（GluB-1、GluA-2）を使用することにより、カロテノイドを胚乳限定的に高蓄積するイネを作製することができるし、例えば、葉鞘特異的発現遺伝子のプロモーターや、特許第4474540号公報に記載されるようなシュート（地上部）維管束特異的発現遺伝子
のプロモーターを使用することにより、カロテノイドを葉鞘や維管束に高蓄積するイネを作製することができる。
Further, in the recombinant vector of the present invention, for example, a promoter of an endosperm-specific expression gene as described in Plant Mol. Biol. 30: 1207-1221 (1996) and Plant J. 4: 357-366 (1993), for example. (GluB-1, GluA-2) can be used to produce rice that accumulates carotenoids in a limited amount of endosperm. For example, a promoter of a leaf sheath-specific expression gene or Japanese Patent No. 4474540 By using a promoter of a shoot (ground part) vascular bundle-specific expression gene as described, rice that highly accumulates carotenoids in leaf sheaths and vascular bundles can be produced.
本発明の組換えベクターを用いることにより、イネにおいてカロテノイドを高濃度で蓄積させることができる。カロテノイドのうち、植物性の食品由来の主要なカロテノイドとしては、β−カロテン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、α−カロテン、β−クリプトキサンチンの６種が知られている。この６種のカロテノイドについては、食品や植物により含まれるカロテノイドの組成に特徴がある。例えば、β−カロテンは、ニンジン、カボチャなどの緑黄色野菜に多く含まれ、マンゴーなどの果実にも含まれている。また、リコペンはトマトに特異的に多く含まれている。また、ルテインは、卵黄や緑黄色野菜に含まれ、抽出原料としてはマリーゴールドの花が用いられる。また、ゼアキサンチンは、トウモロコシ種子や卵黄に含まれている。また、α−カロテンは、緑黄色野菜に含まれている。
本発明においては、ビタミンＡの前駆体であるβ−カロテン等のカロテノイド色素をイネに高蓄積させることにより、東南アジアなどの米を主食とする地域で多いビタミンＡの不足を補うことができる。本発明のイネにおいては、野生型と比較して、例えば、２倍以上、３倍以上、４倍以上の量のカロテノイドを蓄積させることができる。カロテノイドの蓄積量はそれぞれ公知の方法で測定することができる。
本発明においては、β−カロテン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、α−カロテン、β−クリプトキサンチンなどを総称してカロテノイドというが、β−カロテン、α−カロテン、β−クリプトキサンチンなど分解されてビタミンＡに変換されるものが、カロテノイドとして好ましい。ただし、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン等のカロテノイドも生体構成物質に障害を与えると言われる活性酸素やラジカルの消去能力が高いこと、またルテインやゼアキサンチンは視物質としての機能も重要であることから、これら色素の高蓄積も健康機能上有用と期待される。
本発明においては、GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、またはGIC3遺伝子の過剰発現により、通常、ゼアキサンチンおよびβ−カロテンを多く含むカロテノイドが、野生型と比較して高度に蓄積され、これらの種類のカロテノイドは濃黄色を呈するため、濃黄色の着色によってもカロテノイドの蓄積が確認できる。
By using the recombinant vector of the present invention, carotenoids can be accumulated at a high concentration in rice. Among the carotenoids, six kinds of β-carotene, lycopene, lutein, zeaxanthin, α-carotene, and β-cryptoxanthin are known as main carotenoids derived from vegetable foods. These six types of carotenoids are characterized by the composition of carotenoids contained in foods and plants. For example, β-carotene is abundant in green and yellow vegetables such as carrots and pumpkins, and is also contained in fruits such as mango. Also, lycopene is abundantly contained in tomatoes. In addition, lutein is contained in egg yolk and green-yellow vegetables, and marigold flowers are used as an extraction raw material. Zeaxanthin is contained in corn seed and egg yolk. Further, α-carotene is contained in greenish yellow vegetables.
In the present invention, vitamin C deficiency, which is common in regions such as Southeast Asia where rice is a staple food, can be compensated for by highly accumulating rice with carotenoid pigments such as β-carotene, which is a precursor of vitamin A. In the rice of the present invention, the amount of carotenoid can be accumulated, for example, 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more compared to the wild type. The amount of accumulated carotenoid can be measured by a known method.
In the present invention, β-carotene, lycopene, lutein, zeaxanthin, α-carotene, β-cryptoxanthin and the like are generically called carotenoids, but β-carotene, α-carotene, β-cryptoxanthin and the like are decomposed to give vitamin A. Those that are converted to are preferred as carotenoids. However, carotenoids such as lycopene, lutein, and zeaxanthin also have a high scavenging ability for active oxygen and radicals, which are said to damage biological components, and lutein and zeaxanthin also have important visual functions. High accumulation of pigment is also expected to be useful for health functions.
In the present invention, due to overexpression of the GIC1 gene, GIC2 gene, or GIC3 gene, normally, carotenoids rich in zeaxanthin and β-carotene are highly accumulated compared to the wild type, and these types of carotenoids are concentrated. Since it exhibits a yellow color, the accumulation of carotenoids can be confirmed even by a deep yellow coloration.
２．本発明の形質転換イネの作製
本発明のイネは、形質転換によって、上記GIC1、GIC2、またはGIC3タンパク質の発現量が野生型と比較して増加するように改変され、カロテノイドの蓄積量が野生型イネと比較して増加したイネであればよい。本発明のイネの製造方法は、GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、またはGIC3遺伝子の発現が野生型と比較して上昇したイネを作製できれば特に制限されず、これらの遺伝子のプロモーター置換によって得られるものでもよいが、好ましくは、本発明の組換えベクターをイネに導入することによって、本発明の形質転換イネを得ることができる。
2. Production of the transgenic rice of the present invention The rice of the present invention is modified so that the expression level of the GIC1, GIC2, or GIC3 protein is increased as compared to the wild type by transformation, and the accumulated amount of carotenoid is the wild type. Any rice that has increased compared to rice may be used. The method for producing rice of the present invention is not particularly limited as long as it can produce rice in which expression of the GIC1 gene, GIC2 gene, or GIC3 gene is increased compared to the wild type, and may be obtained by promoter replacement of these genes. However, preferably, the transformed rice of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into rice.
植物細胞へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。アグロバクテリウム（例えば、EHA101株やEHA105株）を介する方法においては、例えば、超迅速単子葉形質転換法（特許第3141084
号公報、Toki S, et al. Plant J. 47: 969-976, 2006）を用いることが可能である。ま
た、パーティクルガン法においては、例えば、パーティクルデリバリーシステム（PDS-10
00/Heシステム等、バイオラッド社）を用いることが可能である。
For introduction of a vector into a plant cell, various methods known to those skilled in the art such as polyethylene glycol method, electroporation method (electroporation method), Agrobacterium-mediated method, particle gun method and the like can be used. In the method using Agrobacterium (for example, EHA101 strain or EHA105 strain), for example, an ultra-rapid monocotyl transformation method (Patent No. 314084)
No., Toki S, et al. Plant J. 47: 969-976, 2006). In the particle gun method, for example, a particle delivery system (PDS-10
00 / He system, etc., Bio-Rad) can be used.
形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、イネにおいて形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型やインド型のイネ品種に適用可能）を再生させる方法（Hayashimoto A, et al. Plant Physiol. 93: 857-863, 1990; Datta SK: In Gene Transfer To Plants（Potrykus I and Spangenberg G, Eds）pp.66-74, 1995）、電気パルス（エレクトロポレーション）によりプ
ロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型やインド型のイネ品種に適用可能）を再生させる方法（Shimamoto K, et al. Nature 338: 274-276, 1989; Datta SK, et al. Bio/Technology 8: 736-740, 1990; Toki S, et al. Plant Physiol. 100: 1503-1507, 1992
）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou P, et al. Bio/Technology. 9: 957-962, 1991）、およびアグロバクテリウムを
介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei Y, et al. Plant J. 6: 271-282, 1994; Toki S, et al. Plant J. 47: 969-976, 2006）など、いくつかの技術が既に確
立し、本発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
適当な抗生物質による選抜を経由して得られた各種GIC形質転換植物体を、カロテノイ
ド色素の分析に供試し、カロテノイドの蓄積量が野生型イネと比較して増加した形質転換イネ植物体を本発明の形質転換イネとして得ることができる。
Regeneration of plant bodies from transformed plant cells can be performed by methods known to those skilled in the art depending on the type of plant cells. For example, as a method for producing transformed plants in rice, a method of regenerating plants (applicable to Japanese and Indian rice varieties) by introducing genes into protoplasts using polyethylene glycol (Hayashimoto A, et al. Plant Physiol. 93: 857-863, 1990; Datta SK: In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg G, Eds) pp. 66-74, 1995), gene to protoplast by electric pulse (electroporation) Introduction and regeneration of plants (applicable to Japanese and Indian rice varieties) (Shimamoto K, et al. Nature 338: 274-276, 1989; Datta SK, et al. Bio / Technology 8: 736 -740, 1990; Toki S, et al. Plant Physiol. 100: 1503-1507, 1992
), A method of introducing a gene directly into a cell by the particle gun method and regenerating a plant (Christou P, et al. Bio / Technology. 9: 957-962, 1991), and introducing a gene through Agrobacterium However, there are several techniques such as a method for regenerating plant bodies (Hiei Y, et al. Plant J. 6: 271-282, 1994; Toki S, et al. Plant J. 47: 969-976, 2006). It has already been established and widely used in the technical field of the present invention. In the present invention, these methods can be suitably used.
Various GIC-transformed plants obtained through selection with appropriate antibiotics were used for the analysis of carotenoid pigment, and transformed rice plants with increased carotenoid accumulation compared to wild-type rice were tested. It can be obtained as the transformed rice of the invention.
本発明のイネは、上述の形質転換イネを、該形質転換イネ系統内で交配させること又は他のイネ系統、例えば、コシヒカリなどの優良イネ品種と交配させることによって得られた後代であって、野生型イネと比較してカロテノイドの蓄積量が増加した形質転換イネであってもよい。
本発明において使用されるイネとしては、GIC1遺伝子、GIC2遺伝子、またはGIC3遺伝子を有するものであれば限定されないが、例えば、コシヒカリ、あきたこまち、ひとめぼれ、ヒノヒカリ、ななつぼし、にこまる等が挙げられる。
The rice of the present invention is a progeny obtained by crossing the above-described transformed rice within the transformed rice line or by mating with other rice lines, for example, excellent rice varieties such as Koshihikari, It may be transformed rice that has an increased amount of accumulated carotenoids compared to wild-type rice.
The rice used in the present invention is not limited as long as it has the GIC1 gene, GIC2 gene, or GIC3 gene, and examples thereof include Koshihikari, Akitakomachi, Hitomebore, Hinohikari, Natsutsubo, and Nikomaru. .
以下に実施例を挙げて本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がこれら実施例にのみ限定を受けないことは言うまでもない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but it is needless to say that the present invention is not limited to these examples.
実施例１（GIC遺伝子の過剰発現の発見）
葉緑体分化の正の制御因子Golden2-Like（GLK：イネではOsGLK1とOsGLK2の2種）のcDNAを過剰発現するイネ（OsGLK1/2-OX）は緑色を呈する。OsGLK1-OXイネならびにOsGLK2-OX
イネの緑色カルスをイネ44k発現マイクロアレイ解析に供試した（Nakamura et al. Plant
Cell Physiol. 50(11): 1933-1949, 2009）。これら形質転換イネカルスで共通して発現が3倍以上の上昇を見せた遺伝子群の中に、タンパク質間相互作用やDNA結合に働くと考えられるCCTドメインをC末端側に含むCONSTANS-like（COL）ファミリー転写因子をコードする遺伝子を5種類見出し、GLK-Induced CCT domain-containing proteins（GIC1-5）と名
付けた（表２）。
Example 1 (Discovery of GIC gene overexpression)
Rice (OsGLK1 / 2-OX) that overexpresses the cDNA of the positive regulator of chloroplast differentiation Golden2-Like (GLK: OsGLK1 and OsGLK2 in rice) is green. OsGLK1-OX rice and OsGLK2-OX
Rice green callus was subjected to rice 44k expression microarray analysis (Nakamura et al. Plant
Cell Physiol. 50 (11): 1933-1949, 2009). CONSTANS-like (COL) that contains a CCT domain on the C-terminal side, which is thought to work for protein-protein interaction and DNA binding, among the genes that showed a three-fold increase in expression in common in these transformed rice calli Five genes encoding family transcription factors were found and named GLK-Induced CCT domain-containing proteins (GIC1-5) (Table 2).
GIC1-5のうちGIC1-3の3種は互いに相同性が高く、タンパク質間相互作用への関与が推
測されるB-Box zinc finger（ZF）ドメインをN末端側に、タンパク質間相互作用やDNA結
合に働くと考えられるCCTドメインをC末端側にそれぞれ1つずつ有する（図1、2）。
野生型イネ（日本晴）におけるGIC1-5遺伝子の組織別発現をRT-PCRにて調べたところ、いずれも葉や茎で発現が高く、根、カルスではほとんど発現が見られなかった。GIC1-5遺伝子のうち、GIC1転写産物は選択的スプライシングを受け、2種類のmRNAを生成すること
が判明した。 ここでは、より長い転写産物をGIC1L（完全長cDNA（fl-cDNA）のアクセッ
ション番号: AK120314）、短いものをGIC1S（AK072346）と呼称する。ただし、単にGIC1
と記載する場合はGIC1Lを指すものとする。GIC1L mRNAはGIC1 mRNA前駆体からイントロン1が切り出されることで生成する(配列番号1)。GIC1S mRNAはN末端側のB-box zinc fingerドメインを欠くタンパク質をコードする。GIC1S mRNAはGIC1L mRNAの推定開始コドンから5’上流に12塩基の位置、および130番目のATGコドンから5’上流に14塩基の位置から始まる8塩基の重複配列5’-TCGTCGTG-3’にて分子内相同組換えを介したスプライシングによ
ってB-boxを含む配列がイントロンとして切り出された後に生じる産物と推定された（図3）。
なお、GIC1L fl-cDNAクローン（AK120314）の塩基配列には1塩基の欠失（配列番号1の509番目の塩基C）が見つかり、それ以降の配列にフレームシフトが生じ、中途から本来のGIC1Lとは全く別物のアミノ酸配列を持つタンパク質が作られることになる。そこで、GIC1L塩基配列の509番目にCを挿入することで、GIC1L cDNAのコドンの読み枠を正常なものに
戻した後、イネ形質転換用ベクターの構築に供した。
Three of GIC1-5, GIC1-3, are highly homologous to each other, and the B-Box zinc finger (ZF) domain, which is presumed to be involved in protein-protein interactions, is located on the N-terminal side. It has one CCT domain, which is thought to work for binding, on the C-terminal side (Figs. 1 and 2).
When the tissue-specific expression of GIC1-5 gene in wild-type rice (Nipponbare) was examined by RT-PCR, all were highly expressed in leaves and stems, and almost no expression was observed in roots and callus. Of the GIC1-5 genes, GIC1 transcripts were found to undergo alternative splicing to produce two types of mRNA. Here, the longer transcript is referred to as GIC1L (full-length cDNA (fl-cDNA) accession number: AK120314), and the shorter transcript is referred to as GIC1S (AK072346). However, just GIC1
"GIC1L" shall be indicated. GIC1L mRNA is generated by excising intron 1 from the GIC1 mRNA precursor (SEQ ID NO: 1). GIC1S mRNA encodes a protein lacking the N-terminal B-box zinc finger domain. GIC1S mRNA is an 8-base overlapping sequence 5'-TCGTCGTG-3 'starting from 12 base positions 5' upstream from the estimated start codon of GIC1L mRNA and 14 base positions 5 'upstream from the 130th ATG codon. It was presumed to be a product produced after the sequence containing B-box was excised as an intron by splicing via intramolecular homologous recombination (FIG. 3).
In addition, a single base deletion (509th base C of SEQ ID NO: 1) was found in the base sequence of the GIC1L fl-cDNA clone (AK120314), a frame shift occurred in the subsequent sequence, and the original GIC1L Will produce a protein with a completely different amino acid sequence. Thus, by inserting C at the 509th position of the GIC1L nucleotide sequence, the codon reading frame of the GIC1L cDNA was returned to the normal one, and then used for the construction of a rice transformation vector.
実施例２（GIC遺伝子の過剰発現ベクターの構築）
GIC1-5のコード領域（Coding sequence: CDS）を含むfl-cDNAクローンの配列情報は、
農業生物資源研究所（現 農業・食品産業技術総合研究機構 遺伝資源センター）の菊池
尚志博士らから、またGIC 1-5のfl-cDNA試料（プラスミドDNA）は同研究所（現 農業・食品産業技術総合研究機構 次世代作物開発研究センター）のイネゲノムリソースセンター（RGRC、http://www.rgrc.dna.affrc.go.jp/jp/）の長村吉晃博士らから提供された。
GIC1-5のストップコドンを除去したCDSの5’上流に、各20塩基のGIC1-5非コード配列とGateway attB1配列を付加し、3’下流にはattB2配列を付加した各cDNAのPCR産物を、att
配列を介したGateway BP部位特異的組換え反応により、エントリーベクターpDONR207（Invitrogen/サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）に組込んだ。
得られた各cDNAのGatewayエントリークローンを、Gateway LR反応を介して、農業生物
資源研究所（現 農業・食品産業技術総合研究機構 生物機能研究部門）が構築したGIC過
剰発現（GIC-OX）用Gatewayデスティネーション・バイナリーベクターpSMAHdN638GW（図4）に部位特異的に組み込み、各GIC-OX発現ベクターを取得した。
バイナリーベクターpSMAHdN638GWには、T-DNA上に植物用選抜マーカー遺伝子として、
アグロバクテリウムTiプラスミド由来nos（ノパリン合成酵素）遺伝子のプロモーター::
大腸菌由来hpt〔ハイグロマイシン耐性〕遺伝子のコード領域::Tiプラスミド由来TiaaM（トリプトファンモノオキシゲナーゼ）遺伝子のターミネーターを配置し、形質転換された植物細胞が抗生物質ハイグロマイシンB（Hyg）に耐性を示すようにした。また、その隣接部位にイネ由来Actin-1遺伝子のプロモーター::部位特異的組換え用Gatewayカセット配列::Tiプラスミド由来nosターミネーターから構成されるキメラ遺伝子を配置し、対象遺伝
子（GIC1-5）断片をGateway LR反応によってActin-1プロモーターとnosターミネーターの間に挿入した。また、T-DNAのleft border（LB）配列とright border（RB）の配列の外側のベクター骨格には、微生物で機能し得るスペクチノマイシン耐性（SpR）遺伝子、大腸
菌で機能するpBR322由来（ColE1型）複製開始領域、またPseudomonas pVS1プラスミド起
源の遺伝子（断片）として3種類、すなわちアグロバクテリウムでプラスミドが安定に保
持されるために必要なstaAをコードする遺伝子、プラスミドDNAの複製タンパク質repAを
コードする遺伝子、さらに高宿主域（大腸菌では機能しないが、アグロバクテリウムで機能）複製開始点oriV（origin of vegetative replication）を設けた。各GIC-OX発現ベクターは、エレクトロポレーション法により、アグロバクテリウムEHA105株に導入した。
上記バイナリーベクターpSMAHdN638GWは、特許第4505627号公報に記載されるバイナリー
ベクターpSMAHdN627-M2GUSに由来する発現ベクターである。pSMAHdN638GWとpSMAHdN627-M2GUS とのT-DNA領域の差異は、マルチクローニング部位のHidIII認識配列からnosターミ
ネーター（Tnos）の開始部位にあるSacI認識部位までの一連の塩基配列で、これ以外は共通の配列である。
Example 2 (Construction of GIC gene overexpression vector)
The sequence information of the fl-cDNA clone containing the GIC1-5 coding region (Coding sequence: CDS)
Dr. Naoshi Kikuchi of the National Institute of Agrobiological Resources (currently the National Institute of Genetics, National Institute of Agricultural and Food Research) and the fl-cDNA sample (plasmid DNA) of GIC 1-5 were Provided by Dr. Yoshiaki Nagamura of the Rice Genome Resource Center (RGRC, http://www.rgrc.dna.affrc.go.jp/jp/) of the Next Generation Crop Development Research Center.
A 20-base GIC1-5 non-coding sequence and a Gateway attB1 sequence were added 5 ′ upstream of the CDS from which the GIC1-5 stop codon was removed, and an attB2 sequence was added 3 ′ downstream. , Att
It was integrated into the entry vector pDONR207 (Invitrogen / Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) by Gateway BP site-specific recombination reaction via the sequence.
Gateway entry clone of each cDNA obtained for GIC overexpression (GIC-OX) constructed by National Institute of Agrobiological Sciences (currently Biofunctional Research Division, National Agriculture and Food Research Organization) via Gateway LR reaction Each GIC-OX expression vector was obtained by site-specific integration into the Gateway destination binary vector pSMAHdN638GW (FIG. 4).
In binary vector pSMAHdN638GW, as a plant selection marker gene on T-DNA,
Agrobacterium Ti plasmid-derived nos (nopaline synthase) promoter ::
Coding region of E. coli-derived hpt [hygromycin resistance] gene :: TiaM-derived TiaaM (tryptophan monooxygenase) gene terminator is placed so that transformed plant cells are resistant to the antibiotic hygromycin B (Hyg) I made it. In addition, a chimeric gene composed of rice-derived Actin-1 gene promoter :: site-specific recombination Gateway cassette sequence :: Ti plasmid-derived nos terminator is placed in the adjacent site, and the target gene (GIC1-5) fragment Was inserted between the Actin-1 promoter and the nos terminator by Gateway LR reaction. In addition, the vector backbone outside the T-DNA left border (LB) and right border (RB) sequences has a spectinomycin resistance (Sp R ) gene that can function in microorganisms and pBR322 that functions in E. coli ( ColE1 type) replication origin region, and Pseudomonas pVS1 plasmid origin gene (fragment) 3 types, ie, the gene encoding staA necessary for stable plasmid maintenance in Agrobacterium, the replication protein repA of plasmid DNA The gene to be encoded, and a higher host range (not functioning in E. coli but functioning in Agrobacterium) oriV (origin of vegetative replication) was provided. Each GIC-OX expression vector was introduced into Agrobacterium EHA105 strain by electroporation.
The binary vector pSMAHdN638GW is an expression vector derived from the binary vector pSMAHdN627-M2GUS described in Japanese Patent No. 4505627. The difference in the T-DNA region between pSMAHdN638GW and pSMAHdN627-M2GUS is a series of base sequences from the HidIII recognition sequence of the multiple cloning site to the SacI recognition site at the start of the nos terminator (Tnos). It is.
実施例３（GIC-OX形質転換イネの作出）
イネへの遺伝子導入は迅速形質転換法（WO 2005/092082、Toki, S., Hara, N., Ono, K., Onodera, H., Tagiri, A., Oka, S. and Tanaka, H. (2006) Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation of rice. The Plant Journal 47: 969-976）に準じて実施した。イネ（品種：日本晴）種子は、籾殻を除去して玄米とした後、70%エタノールで30秒間、続いて界面活性剤（10% (v/v) Tween 20
またはTriton X-100を約10 μl /10 mL）を添加した次亜塩素酸ナトリウム溶液（最終有
効塩素濃度：2.5%）で30分間殺菌し、滅菌蒸留水で数回すすいで水を切った後、胚が上向きになるようN6D寒天培地〔N6塩類及びビタミン〔Chu, C.C., Wang, C.S., Sun, C.C., Hsu, C, Yin, K.C., and Chu, C.Y. (1975) Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources. Scientia Sinica 18: 659-668〕、30 g/L ショ糖、0.3 g/L カザミノ酸、2.8 g/L プロリン、2 mg/L 2,4-D、2 g/L ゲルライト、pH 5.7〕に置床後、30〜32℃かつ明条件下で約7
日間培養することで胚盤周辺部の細胞を脱分化させ、カルス（不定形の細胞塊）を誘導した。
実施例２で調製した5種類のGIC-OX発現ベクターをそれぞれ保持するEHA105アグロバク
テリウム系統を、25 mg/Lクロラムフェニコール、12.5 mg/Lリファンピシン、及び100 mg/Lスペクチノマイシンを含むLB液体培地にて28℃、180 rpmで約24時間培養した。
約1週間経過したイネの培養初期カルス（各処理区あたり約5 g）を20 mg/Lのアセトシ
リンゴンを含むN6D液体培地（40 mL）に入れ、さらに上述の各5種類（合計10種類）のGIC-OXアグロバクテリウムの各培養菌液を最終菌密度がO.D. 600 nm = 0.001になるよう添加した。イネ培養細胞が入った各菌懸濁液は数分間、軽く転倒混和した後、ステンレス製の茶こしにあけた。茶こしに残ったカルスの水分を滅菌ろ紙上で除去後、N6D寒天培地に再
度置床し、25℃の暗条件下で3日間の共存培養を行った。その後、共存培養後のイネカル
スを滅菌水で7〜8回、続いて12.5 mg/Lメロペネム（アグロバクテリウム除菌用抗生物質
、商品名：メロペン、大日本住友製薬）を含む滅菌水で１〜数回洗浄し、滅菌ろ紙上で余分な水分を切った後、12.5 mg/L メロペネム及び30 mg/L Hygを含むN6D（N6D + Hyg）寒
天培地に置床し、30〜32℃の明条件下で約2週間培養した。その後、増殖中のカルスを新
たなN6D + Hyg寒天培地に移し、Hyg耐性カルスを得た。
各処理区で出現したHyg耐性カルスは、12.5 mg/Lメロペネムと30 mg/L Hygを添加した
植物体再分化培地〔MS塩類及びビタミン（Murashige, T. and Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15: 473-497）、30 g/L ショ糖、30 g/L ソルビトール、2 g/L カザミノ酸、0.02 mg/L ナフタレン酢酸、2 mg/L カイネチン、2 g/L ゲルライト（pH 5.8）〕に移
し、30℃かつ明条件下で14日間培養し、カルスの緑化とシュート（地上部）形成を促した。さらにこの操作をもう一度繰り返すことで、Hyg耐性を有する緑色シュート（地上部）
を再分化させた。これらの独立した複数の再分化個体（イネ科では通常、再分化当代をT0世代と称する）を植物ホルモン無添加のMS寒天培地［MS塩類及びビタミン〔MurashigeとSkoog (1962)：前掲〕、30 g/L ショ糖、4 g/L ゲルライト（pH 5.8）］に移植し、30℃かつ明条件下で1〜2週間生育させ、シュート（地上部）の伸長、及び発根とその伸長を促した。
Example 3 (Production of GIC-OX transformed rice)
Gene transfer into rice is performed by a rapid transformation method (WO 2005/092082, Toki, S., Hara, N., Ono, K., Onodera, H., Tagiri, A., Oka, S. and Tanaka, H. (2006) Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation of rice. The Plant Journal 47: 969-976). Rice (variety: Nipponbare) seeds are made from brown rice by removing rice husks, then 70% ethanol for 30 seconds, followed by surfactant (10% (v / v) Tween 20
Or sterilize with sodium hypochlorite solution (final effective chlorine concentration: 2.5%) to which Triton X-100 is added (approx. 10 μl / 10 mL) for 30 minutes, rinse with sterile distilled water several times, and drain the water. N6D agar medium (N6 salts and vitamins [Chu, CC, Wang, CS, Sun, CC, Hsu, C, Yin, KC, and Chu, CY (1975) Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen sources.Scientia Sinica 18: 659-668], 30 g / L sucrose, 0.3 g / L casamino acid, 2.8 g / L proline, 2 mg / L 2,4-D, 2 g / L Gellite, pH 5.7), about 7 under 30-32 ° C and bright conditions
By culturing for days, the cells around the scutellum were dedifferentiated to induce callus (amorphous cell mass).
EHA105 Agrobacterium strains, each carrying the five GIC-OX expression vectors prepared in Example 2, contain 25 mg / L chloramphenicol, 12.5 mg / L rifampicin, and 100 mg / L spectinomycin The cells were cultured in LB liquid medium at 28 ° C. and 180 rpm for about 24 hours.
About 1 week of rice initial culture callus (about 5 g per treatment group) is placed in N6D liquid medium (40 mL) containing 20 mg / L acetosyringone, and each of the above 5 types (10 types in total) ) GIC-OX Agrobacterium culture solution was added so that the final cell density was OD 600 nm = 0.001. Each bacterial suspension containing cultured rice cells was gently mixed by inversion for several minutes, and then opened in a stainless steel tea strainer. The water of callus remaining in the tea strainer was removed on sterile filter paper, and then placed again on N6D agar, and co-cultured for 3 days in the dark at 25 ° C. Thereafter, the rice callus after co-cultivation was sterilized with water 7 to 8 times, followed by sterilized water containing 12.5 mg / L meropenem (antibiotic for Agrobacterium eradication, brand name: Meropen, Sumitomo Dainippon Pharma). Wash several times, drain excess water on sterile filter paper, place on N6D (N6D + Hyg) agar medium containing 12.5 mg / L meropenem and 30 mg / L Hyg, light conditions at 30-32 ° C For about 2 weeks. Thereafter, the growing callus was transferred to a new N6D + Hyg agar medium to obtain a Hyg resistant callus.
Hyg-tolerant callus that appeared in each treatment group was plant regeneration medium supplemented with 12.5 mg / L meropenem and 30 mg / L Hyg [MS salts and vitamins (Murashige, T. and Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15: 473-497), 30 g / L sucrose, 30 g / L sorbitol, 2 g / L casamino acid, 0.02 mg / L naphthalene acetic acid, 2 mg / L-Kinetin, 2 g / L Gellite (pH 5.8)], and cultured for 14 days at 30 ° C. under light conditions to promote callus greening and shoot (above ground) formation. Furthermore, by repeating this operation once more, a green chute with resistance to Hyg (ground part)
Were redifferentiated. A plurality of these independent redifferentiated individuals (usually referred to as the T0 generation in the Gramineae family) MS agar medium without addition of plant hormones [MS salts and vitamins (Murashige and Skoog (1962): supra), 30 g / L sucrose, 4 g / L gellite (pH 5.8)], and grown for 1 to 2 weeks at 30 ° C under light conditions to promote shoot (above ground) elongation, rooting and elongation did.
実施例４（GIC-OX形質転換イネの栽培、表現型観察）
N6D + Hyg寒天培地上で形成された各種GIC-OX形質転換カルスの形状や色を、野生型（
コントロール）のカルスと比較した。GIC1-5-OX形質転換カルスと野生型カルスの間で、
カルスの形状や増殖速度に顕著な差異は見られなかった。カルスの色調を比較したところ、野生型カルスの乳白色（クリーム色）に対し、GIC1/2/3-OXを導入したHyg耐性カルスの多くは濃黄色を呈した（図５：上段と下段の写真）。なお、GIC1には実施例１及び図３に記載の通り、2種類の転写産物GIC1LとGIC1Sが存在し、両者のcDNAを過剰発現するイネの
カルスは共に濃黄色を示した。実施例１（GIC遺伝子の過剰発現の発見）で述べた通り、GIC1Sタンパク質にはB-box ZFドメインが欠落しているが、上述の結果はB-boxがカルスの
黄化に必須ではないことを示すものである。
一方、GIC4/5-OXを導入したHyg耐性カルスは野生型と同じく乳白色を呈した。以上の結果から、GIC1/2/3は各cDNAの過剰発現により、黄色の色素をイネの培養細胞に蓄積する性質があることが判明した。
シャーレ（直径9 cm）内で再分化した各種GIC形質転換イネのシュート及び根の長さが
約10 cm、あるいはそれ以上の長さに到達した時点で、同一起源のカルス集団から得られ
た再分化個体の中から1本の分げつのみを選んで合成粒状培土（ボンソル2号、住友化学工業）に移植し、形質転換イネ育成用グロースチャンバーにて明期14時間（28〜30℃）および暗期10時間（24〜25℃）のサイクルでさらに生育させた。各系統（T0世代）の生育特性を観察しながら栽培を継続し、最終的に自殖後代（T1世代）種子を収穫した。
各種GIC形質転換イネ系統のT1種子及び野生型（日本晴）種子を、実施例３の記載に準
じて滅菌し、それぞれ12.5 mg/L メロペネムを含むMS + Hyg及びMS（Hyg無し）寒天培地
に置床し、28〜30℃の明条件下で発芽を誘導した。MS + Hyg寒天培地にて発芽・生育したT1形質転換植物（Hyg耐性幼苗）は、上述のT0植物の栽培時と同様、形質転換イネ育成用
グロースチャンバー、あるいは形質転換イネ育成用閉鎖系ガラス温室にて栽培し、T2種子を得た。各種GIC形質転換イネ系統種子（T1、T2世代等）及び野生型種子をカルス化する
際は、上述の通り玄米を滅菌処理した後、それぞれ12.5 mg/L メロペネムを含むN6D + Hyg及びN6D（Hyg無し）寒天培地に置床し、30〜32℃の明条件下で培養し、2〜3週間毎に継
代培養した。
MS寒天培地に置床した直後の野生型（日本晴）の種子は、種子胚が乳白色を示した。一方、MS + Hyg寒天培地に置床した直後の各種GIC形質転換イネ系統（T1世代）の形質転換
種子は、通常、種子胚が黄色を呈した（図６）。これはGIC cDNAの過剰発現に用いたOsAct-1プロモーターの活性が胚で比較的高く、胚乳ではその形成の中・後期に低下すること
から、種子における黄色の色素蓄積は同プロモーター活性に応じて起こっている考えられる。各種GIC形質転換イネ系統（T1及びT2世代）の種子をカルス化したところ、多くの系
統のカルスが濃黄色を呈し、その色合いは少なくとも4か月以上に渡り、安定に保持され
た（図７A、７B）。以上の結果から、各種GIC形質転換イネ系統に見られる濃黄色の色素
の蓄積という表現型は、長期間かつ世代を超えて安定した形質であることが明らかになった。
Example 4 (Cultivation of GIC-OX transformed rice, observation of phenotype)
The shape and color of various GIC-OX transformed calli formed on N6D + Hyg agar medium,
Control) and callus. Between GIC1-5-OX transformed callus and wild type callus,
There was no significant difference in callus shape or growth rate. When comparing the color of the callus, many of the Hyg-resistant calli with GIC1 / 2 / 3-OX were dark yellow compared to the milky white (cream color) of the wild type callus (Figure 5: Upper and lower photographs). ). As shown in Example 1 and FIG. 3, GIC1 contains two types of transcripts, GIC1L and GIC1S, and both calli overexpressing both cDNAs showed a deep yellow color. As described in Example 1 (discovery of overexpression of GIC gene), the GIC1S protein lacks the B-box ZF domain, but the above results indicate that B-box is not essential for callus yellowing. Is shown.
On the other hand, Hyg-resistant callus with GIC4 / 5-OX introduced was milky white like the wild type. From the above results, it was found that GIC1 / 2/3 has a property of accumulating yellow pigments in cultured rice cells by overexpression of each cDNA.
When the shoots and roots of various GIC transformed rice regenerated in a petri dish (diameter 9 cm) reach a length of about 10 cm or more, regenerated from callus populations of the same origin Only one tiller is selected from the differentiated individuals and transplanted to a synthetic granular soil (Bonsol No. 2, Sumitomo Chemical Co., Ltd.) and grown for 14 hours (28-30 ° C) in the growth chamber for growing transformed rice Further growth was carried out with a cycle of 10 hours (24-25 ° C.) in the dark period. Cultivation was continued while observing the growth characteristics of each line (T0 generation), and seeds of self-propagating progeny (T1 generation) were finally harvested.
T1 seeds and wild type (Nipponbare) seeds of various GIC-transformed rice lines were sterilized according to the description in Example 3, and placed on MS + Hyg and MS (without Hyg) agar medium containing 12.5 mg / L meropenem, respectively. Then, germination was induced under light conditions of 28-30 ° C. T1 transformed plants (Hyg-resistant seedlings) germinated and grown on MS + Hyg agar medium are the same as during the cultivation of T0 plants described above. To obtain T2 seeds. When calling various GIC-transformed rice seeds (T1, T2 generation, etc.) and wild-type seeds, after sterilizing brown rice as described above, N6D + Hyg and N6D (Hyg) containing 12.5 mg / L meropenem, respectively. None) Placed on agar medium, cultured under light conditions of 30-32 ° C., and subcultured every 2-3 weeks.
The wild-type (Nipponbare) seeds immediately after placing on the MS agar medium showed milky white seed embryos. On the other hand, the seeds of various GIC-transformed rice lines (T1 generation) immediately after being placed on the MS + Hyg agar medium usually had yellow seed embryos (FIG. 6). This is because the activity of the OsAct-1 promoter used for overexpression of GIC cDNA is relatively high in embryos, and in endosperm it decreases in the middle and late stages of formation, so yellow pigment accumulation in seeds depends on the promoter activity. Conceived happening. When the seeds of various GIC-transformed rice lines (T1 and T2 generations) were converted to callus, many lines of callus had a deep yellow color, and the color was stable for at least 4 months (FIG. 7A). 7B). From the above results, it was revealed that the dark yellow pigment accumulation phenotype found in various GIC transformed rice lines is a stable trait for a long period of time and beyond generations.
実施例５（GIC-OX形質転換イネのカロテノイド色素の分析）
1）分光学的定量
GIC1/2/3-OXイネ系統のカルス（培養細胞塊）が（濃）黄色を示したことから、この色
素はフラボノイド（カルコンやオーロン）、あるいはカロテノイド（β−カロテン、ゼアキサンチン他）に由来すると推察した。他にベタキサンチンと称されるベタレインに属する黄色の色素があるが、ベタレインは、ビート（アカザ科）、オシロイバナとブーゲンビレア（共にオシロイバナ科）、ケイトウ（ヒユ科）、マツバボタン（スベリヒユ科）等のナデシコ目植物に限定して含まれ、イネ（科）には見られないため、候補から除外した。
上記の形質転換イネ系統の黄色カルスの小塊をアルカリ性溶液（0.1N KOH等）に浸漬しても呈色に変化が見られなかったことから、この色素はフラボノイド系のカルコンやオーロン）に由来するものではないと推察した。次に、カロテノイドとクロロフィルの分光学的定量を、「光合成の森 光合成関連実験プロトコール クロロフィル定量法」（http://www.photosynthesis.jp/proto/chlorophyll.html）に記載の手法を参考に、両色素含量
を同時に導き出すことが可能なLichtenthalerとWelburn（1983）の計算式に従って実施した（Lichtenthaler HK and Wellburn AR, Biochem. Soc. Trans. 11: 591-592, 1983）。すなわち、約100 mgのカルスを1.5 mL ミクロチューブに入れてすりつぶした後、800 μLのアセトンを加え、4℃にて一晩、色素を抽出した。これに200 μLの水を加えて終濃度80%（v/v）のアセトン溶液とし、遠心分離（15,000 rpm、5分間）により上清を得た。各上
清は小型ろ過フィルター（0.45 μm、非水系）を通して精製後、470 nm、663 nm、646 nmの吸光度を、分光光度計を用いて測定し、以下に示すLichtenthaler and Welburn（1983
）の計算式に従って各カルスのカロテノイド含量を算出した。
[Chl a] = 12.21×A663 - 2.81×A646
[Chl b] = 20.13×A646 - 5.03×A663
[Carotenoids] = (1000×A470 - 3.27×[Chl a] - 104×[Chl b]) ÷ 229
カロテノイド色素の測定結果を図８に示す。各3検体のGIC1S-OX及びGIC2-OX黄色カルスは野生型（日本晴）カルスに比べ、グラム新鮮重あたり6〜7倍のカロテノイドを含むことがわかった。
2）高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いたカロテノイドの分析
本分析は、農業・食品産業技術総合研究機構 花き研究所（現：野菜花き研究部門）の
山溝 千尋博士と大宮 あけみ博士に実施して頂いた。
各0.5 gのカルス標品を細胞破砕装置（シェイクマスター、株式会社バイオメディカル
サイエンス）で粉砕した後、0.5 mLのアセトンを加えて色素を抽出した。さらに1.5 mLのジエチルエーテルを加えてよく撹拌し、エーテル層（上層）を回収した。アセトン、ジエチルエーテルによる抽出をカルスの黄色の着色が視認出来なくなるまで繰り返した。これによって得られたアセトン／エーテル抽出液に等量の水を加え、3回の洗浄を行った。カ
ロテノイドを含むエーテル層（上層）を採取し、その液量の半量のアルカリ溶液（5% KOH-NaOH）を加えて暗所で2時間静置することでけん化処理をした。カロテノイドの中でも、キサントフィル類はしばしば脂肪酸が結合した状態、すなわち脂肪酸エステルの状態で存在する。けん化（saponification）による加水分解の結果、脂肪酸エステル型キサントフィルから脂肪酸が遊離され、フリーのキサントフィル類が得られる。けん化処理無しの試料をHPLC分析に供試すると、脂肪酸の種類、位置、数によって複数のピークに別れてしまうので、各キサントフィル分子種の正確な同定や定量が困難になる。けん化後の溶液に蒸留水を加え、よく攪拌した後、上層のエーテル層を回収し、中性になるまで水で洗浄した後、濃縮乾固した（ケン化サンプル）。これをメタノールで溶解し、フォトダイオードアレイ検出器（PDA） 付きHPLC分析に供した。
・高速液体クロマトグラフ X-LC（日本分光株式会社、東京）
・PDA検出器 X-LC 3110MD（同上）
・カラム YMC Carotenoid シリカ系逆相カラム
（内径 4.6 mm, 長さ 100 mm, 粒子径 3 μm；株式会社ワイエムシィ、京都）
・展開溶媒A Methanol:t-butyl methyl ether:H20 = 95:1:4
・展開溶媒B Methanol:t-butyl methyl ether:H20 = 25:71:4
溶出
以下の条件にて行い、200〜750 nmの範囲の吸収スペクトルを検出した。
1） 0〜 5分：溶媒Aを5分間流す（溶媒A 100% / 溶媒B 0%）
2） 5〜38分：溶媒Aに対し、溶媒Bが0〜100%になるよう直線的に濃度勾配をかける
3）38〜40分：溶媒Bを2分間流す（溶媒A 0% / 溶媒B 100%）
・流速 1.0 mL/min
・カラム温度 35℃
各カロテノイド成分は、検出されたピークの保持時間と吸収スペクトルを、標準物質と比較することで同定した。また、各標品のカロテノイド含有量は、ケン化処理後の抽出液を450nmの光波長で検出したHPLCクロマトグラムにおけるピーク面積の合計から、1 g新鮮重のカルスあたりのルテイン当量として算出した。
HPLC分析の結果、供試系統の総カロテノイド含有量（ルテイン当量）は、野生型に比べて6〜14倍も増加していた（図９）。この結果は、前述の1）分光学的定量の結果（図８）を裏付けるもので、GIC cDNAの過剰発現はイネにカロテノイドの蓄積を亢進することが明らかになった。また、HPLCクロマトグラムを比較した結果、GIC1S-OXおよびGIC2-OXイネ
系統の黄色カルスは、野生型に比して、ゼアキサンチンやβ-カロテンを含むカロテノイ
ド含有量が顕著に増大していていることが判明した（図１０）。
Example 5 (Analysis of carotenoid pigment in GIC-OX transformed rice)
1) Spectroscopic determination
Since the callus (cultured cell mass) of the GIC1 / 2 / 3-OX rice line showed a (dark) yellow color, this pigment is derived from flavonoids (chalcones and aurones) or carotenoids (β-carotene, zeaxanthin, etc.) I guessed. There is also a yellow pigment belonging to betalain called betaxanthin. It was excluded from the candidates because it was limited to Nadesicos plants and was not found in rice (family).
This pigment was derived from flavonoid chalcone and auron) because the color change was not observed even when the nodule of yellow callus from the above transformed rice line was immersed in an alkaline solution (0.1N KOH, etc.) I guessed it wasn't. Next, spectrophotometric quantification of carotenoids and chlorophylls, with reference to the method described in “Photosynthesis Forest Photosynthesis-Related Experiment Protocol Chlorophyll Determination Method” (http://www.photosynthesis.jp/proto/chlorophyll.html) It was carried out according to the calculation formula of Lichtenthaler and Welburn (1983) capable of deriving both pigment contents simultaneously (Lichtenthaler HK and Wellburn AR, Biochem. Soc. Trans. 11: 591-592, 1983). That is, after about 100 mg of callus was put in a 1.5 mL microtube and ground, 800 μL of acetone was added, and the dye was extracted overnight at 4 ° C. 200 μL of water was added thereto to make an acetone solution with a final concentration of 80% (v / v), and a supernatant was obtained by centrifugation (15,000 rpm, 5 minutes). Each supernatant was purified through a small filtration filter (0.45 μm, non-aqueous), and the absorbance at 470 nm, 663 nm, and 646 nm was measured using a spectrophotometer. The following Lichtenthaler and Welburn (1983
), The carotenoid content of each callus was calculated.
[Chl a] = 12.21 × A 663 - 2.81 × A 646
[Chl b] = 20.13 × A 646 - 5.03 × A 663
[Carotenoids] = (1000 × A 470 - 3.27 × [Chl a] - 104 × [Chl b]) ÷ 229
The measurement result of the carotenoid pigment is shown in FIG. The GIC1S-OX and GIC2-OX yellow callus from each of the three samples were found to contain 6-7 times more carotenoids per gram fresh weight than wild-type (Nipponbare) callus.
2) Analysis of carotenoids using high-performance liquid chromatography (HPLC) This analysis was conducted by Dr. Chihiro Yamamizo and Dr. Akemi Omiya of the National Institute for Agricultural and Food Sciences, Flower Research Institute (currently, Vegetable Flower Research Division). got.
Each 0.5 g of callus preparation was pulverized with a cell disruption apparatus (Shake Master, Biomedical Science Co., Ltd.), and 0.5 mL of acetone was added to extract the pigment. An additional 1.5 mL of diethyl ether was added and stirred well to recover the ether layer (upper layer). Extraction with acetone and diethyl ether was repeated until no yellow coloration of the callus was visible. An equivalent amount of water was added to the acetone / ether extract thus obtained, and washing was performed three times. A carotenoid-containing ether layer (upper layer) was collected, and an alkali solution (5% KOH-NaOH) of half of the liquid amount was added and allowed to stand in the dark for 2 hours for saponification treatment. Among carotenoids, xanthophylls are often present in a fatty acid bound state, that is, in the form of fatty acid esters. As a result of hydrolysis by saponification, fatty acids are liberated from the fatty acid ester type xanthophyll and free xanthophylls are obtained. When a sample without saponification treatment is subjected to HPLC analysis, it is separated into a plurality of peaks depending on the type, position, and number of fatty acids, making it difficult to accurately identify and quantify each xanthophyll molecular species. Distilled water was added to the saponified solution and stirred well, and then the upper ether layer was collected, washed with water until neutral, and concentrated to dryness (saponified sample). This was dissolved in methanol and subjected to HPLC analysis with a photodiode array detector (PDA).
・ High-performance liquid chromatograph X-LC (JASCO Corporation, Tokyo)
・ PDA detector X-LC 3110MD (same as above)
・ Column YMC Carotenoid Silica-based reverse phase column (Inner diameter 4.6 mm, Length 100 mm, Particle diameter 3 μm; YMC, Kyoto)
・ Developing solvent A Methanol: t-butyl methyl ether: H 2 0 = 95: 1: 4
・ Developing solvent B Methanol: t-butyl methyl ether: H 2 0 = 25: 71: 4
Elution was performed under the following conditions, and an absorption spectrum in the range of 200 to 750 nm was detected.
1) 0 to 5 minutes: Flow solvent A for 5 minutes (solvent A 100% / solvent B 0%)
2) 5 to 38 minutes: A linear gradient of solvent B is applied to solvent A so that solvent B is 0 to 100%.
3) 38-40 minutes: Flow solvent B for 2 minutes (solvent A 0% / solvent B 100%)
・ Flow rate 1.0 mL / min
・ Column temperature 35 ℃
Each carotenoid component was identified by comparing the retention time and absorption spectrum of the detected peak with a standard substance. The carotenoid content of each sample was calculated as the lutein equivalent per 1 g fresh weight of callus from the total peak area in the HPLC chromatogram obtained by detecting the saponified extract at a light wavelength of 450 nm.
As a result of HPLC analysis, the total carotenoid content (lutein equivalent) of the test line was increased by 6 to 14 times compared to the wild type (FIG. 9). This result confirms the results of 1) spectroscopic quantification described above (FIG. 8), and it was revealed that overexpression of GIC cDNA enhances the accumulation of carotenoids in rice. In addition, as a result of comparison of HPLC chromatograms, the yellow callus of GIC1S-OX and GIC2-OX rice lines have significantly increased carotenoid content including zeaxanthin and β-carotene compared to the wild type. Was found (FIG. 10).
実施例６（カルスの黄化に必要なGIC1タンパク質の領域の同定）
カルスの黄化に必要なGIC1タンパク質の領域を明らかにすべく、様々な領域を欠失させたGIC1誘導体（図１１）のcDNAコンストラクト（内部欠失型または変異型GIC1過剰発現ベクター）を作製し、それらを個別に導入した形質転換イネ系統のカルスのカロテノイド含量を調べた。
＊材料と方法
1）ドメイン欠失やアミノ酸置換を施したGIC1のcDNA過剰発現コンストラクトの構築
GIC1の各領域の欠失型または変異型のコンストラクト作製のため、まず適当なプライマーペアを用いて各断片をPCR増幅し、pENTR/D-TOPOベクター（Invitrogen／サーモフィッ
シャーサイエンティフィック株式会社）にクローン化することで、Gatewayエントリーク
ローンを得た。
コンストラクト#4の欠失型GIC1 cDNA断片は、同#2のGIC1 cDNA断片を鋳型として外向きのプライマーペア、すなわち280番目のアミノ酸を指定するトリプレット（3個のヌクレオチド配列）から5’側方向、及び371番目のアミノ酸を指定するトリプレットから3’側方
向にPCRを行うための2つのプライマーを用いて増幅し、得られたPCR産物をセルフライゲ
ーションした。ライゲーション反応後の試料を大腸菌に導入することで、コンストラクト#4のGatewayエントリークローンを得た。
GIC1の334番目のアミノ酸であるロイシン残基（L）をアラニン残基（A）に置換したGIC1(L334A)をコードするcDNAを有するコンストラクト#9は、334番目のロイシンを指定する
トリプレットCTCに変異を導入してアラニンを指定するGCCに置換することにより作製した。この変異導入では、始めに上記の2塩基の変異を中央付近に持つプライマーを両向きに
デザインした。このプライマーペアでGIC1 cDNAクローン（プラスミドDNA）を鋳型にしたPCRを実施した。変異導入を行う前のプラスミドDNAはメチル化されているため、5’-gatc-3’（ただし、a（アデニン）はメチル化）を認識する制限酵素DpnIで消化される。一方
、変異導入したPCR産物はメチル化されていないため、DpnIによる消化を受けない。次に
、このDNA断片をセルフライゲーションさせた後に大腸菌に導入し、コンストラクト#9のGatewayエントリークローンを得た。複数のクローンからプラスミドDNAを単離し、DNA塩基配列解析により標的とするか所への変異導入を確認した。
以上の各GatewayエントリーベクターにcDNA過剰発現用ベクターpSMAHdN638GW（図４）
を加えてGateway LR反応を行うことで、イネActin-1プロモーター（OsAct-1）制御下で各種GIC1誘導体を過剰発現するコンストラクト（バイナリーベクター）を作製した。
2）形質転換イネの作出とカルス化
実施例３（GIC-OX形質転換イネの作出）に記載の方法に準じて、上記の各種過剰発現ベクターをアグロバクテリウム経由でイネに導入した。得られた過剰発現イネ再分化植物体（T0世代）を栽培し、T1種子を収穫した。イネ種子（玄米、T1世代）をN6D寒天培地に無
菌播種した後、約32℃にて培養することでカルスを誘導した。1週間後、胚乳やシュート
部分を除去した初期カルスを新しいN6D培地に移し、培養を2〜3週間ごとに継代した。
3）カロテノイド色素の分光学的定量
実施例５（GIC-OX形質転換イネのカロテノイド色素の分析）の1）分光学的定量に準じ
て実施した。
＊結果
各種欠失型または変異型GIC1過剰発現カルスの写真及びカロテノイド定量の結果を図１１にまとめて示した。GIC1は選択的スプライシングにより2種類のmRNA（GIC1LとGIC1S）
が生じ、それらが翻訳されることで2種のタンパク質GIC1LとGIC1Sが生合成されると考え
られる。B-box ZFドメインを含むN末端202番目までのアミノ酸配列（領域I）を欠くGIC1
をコードするコンストラクト#2の過剰発現は、GIC1Lをコードするコンストラクト#1過剰
発現と同様、イネカルスを黄色に変え、カロテノイドの高蓄積を誘発した。この結果は、実施例４（GIC-OX形質転換イネの栽培、表現型観察）に記載のGIC1L及びB-box ZFドメイ
ンのコード領域を欠いたGIC1S cDNAの過剰発現が共にイネのカルスを黄化したことと一致する。従って、B-box ZFドメインを含む領域Iは、イネカルスのカロテノイド蓄積に必須
でないことが明らかになった。一方、N末端から280アミノ酸（領域IとII）を欠くコンス
トラクト#3の過剰発現イネカルスは黄色に呈色することはなかった。これらの結果から、GIC1の202〜279番目のアミノ酸配列（領域II）がカルスの黄化に必須であると判断した。次に、コンストラクト#2から280〜370番目のアミノ酸配列（領域III）、あるいは371番目〜C末端までの配列（領域IV）をそれぞれ欠失させたペプチドのcDNAコンストラクト#4及
び#5の過剰発現カルスは黄色く変化しなかった。
同様に、コンストラクト#2から領域IIIとIVを欠いた配列をコードするコンストラクト#6、領域IIとIVを欠いた配列をコードするコンストラクト#7、及び領域IIIとIVを欠いた配列をコードするコンストラクト#8を過剰発現するイネ系統のカルスも、黄変することはなかった。これらの結果から、GIC1の過剰発現によるイネ細胞のカロテノイドの高蓄積には、N末端配列（領域I）を除く領域II、IIIおよびIVが必須であることが導き出された。ま
た、EAR-likeモチーフ（*注）内のロイシン残基（L）をアラニン残基（A）に置換したGIC1(L334A)をコードするcDNAコンストラクト#9の過剰発現カルスも黄化しなかったことから（図１１、１２）、この334番目のロイシン残基も細胞の黄化に重要であることが明らか
になった。以上の結果を総合し、GIC1の領域II、III、IVに存在する酸性領域、PEST配列
、EAR-likeモチーフ、およびCCTドメインが、カルスの黄化に必要であると推論した。
Example 6 (Identification of GIC1 Protein Region Required for Callus Yellowing)
In order to clarify the region of GIC1 protein required for callus yellowing, a cDNA construct (internal deletion type or mutant GIC1 overexpression vector) of GIC1 derivative (Fig. 11) from which various regions were deleted was prepared. Then, the carotenoid content of callus of the transgenic rice lines into which they were individually introduced was examined.
* Materials and methods
1) Construction of GIC1 cDNA overexpression construct with domain deletion and amino acid substitution
In order to construct a deletion-type or mutant-type construct for each region of GIC1, each fragment was first PCR-amplified using an appropriate primer pair, and the pENTR / D-TOPO vector (Invitrogen / Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) By cloning, the Gateway entry clone was obtained.
The deleted GIC1 cDNA fragment of construct # 4 is an outward primer pair using the # 2 GIC1 cDNA fragment as a template, that is, the 5 'side from the triplet (3 nucleotide sequence) specifying the 280th amino acid, Amplification was performed using two primers for PCR in the 3 ′ direction from the triplet specifying the 371st amino acid, and the resulting PCR product was self-ligated. The gateway entry clone of construct # 4 was obtained by introducing the sample after the ligation reaction into E. coli.
Construct # 9, which has a cDNA encoding GIC1 (L334A) in which the leucine residue (L), the 334th amino acid of GIC1, is replaced with an alanine residue (A), is mutated to a triplet CTC specifying the 334th leucine. Was introduced to replace alanine with the GCC specified. In this mutagenesis, first, a primer having the above two-base mutation near the center was designed in both directions. PCR was performed with this primer pair using the GIC1 cDNA clone (plasmid DNA) as a template. Since the plasmid DNA before mutagenesis is methylated, it is digested with a restriction enzyme DpnI that recognizes 5′-gatc-3 ′ (where a (adenine) is methylated). On the other hand, the mutated PCR product is not methylated and therefore does not undergo digestion with DpnI. Next, this DNA fragment was self-ligated and then introduced into E. coli to obtain a Gateway entry clone of construct # 9. Plasmid DNA was isolated from multiple clones, and mutation introduction into the target site was confirmed by DNA nucleotide sequence analysis.
Each of the above Gateway entry vectors contains the cDNA overexpression vector pSMAHdN638GW (Fig. 4).
In addition, a construct (binary vector) overexpressing various GIC1 derivatives under the control of rice Actin-1 promoter (OsAct-1) was prepared by performing Gateway LR reaction.
2) Production of transformed rice and callusization According to the method described in Example 3 (production of GIC-OX transformed rice), the above-described various overexpression vectors were introduced into rice via Agrobacterium. The obtained overexpressed rice redifferentiated plant (T0 generation) was cultivated, and T1 seeds were harvested. Rice seeds (brown rice, T1 generation) were aseptically inoculated on N6D agar medium, and then cultured at about 32 ° C. to induce callus. One week later, the initial callus from which endosperm and shoots had been removed was transferred to a new N6D medium, and the culture was passaged every 2-3 weeks.
3) Spectroscopic quantification of carotenoid pigments Carried out according to 1) spectroscopic quantification of Example 5 (analysis of carotenoid pigments of GIC-OX transformed rice).
* Results Pictures of various deletion-type or mutant-type GIC1 overexpressing calli and the results of carotenoid quantification are summarized in FIG. GIC1 has two types of mRNA (GIC1L and GIC1S) by alternative splicing
It is thought that two proteins, GIC1L and GIC1S, are biosynthesized when they are translated. GIC1 lacking the amino acid sequence (region I) up to the 202nd N-terminal containing B-box ZF domain
Over-expression of construct # 2 encoding, as in construct # 1 over-expression of GIC1L, turned the rice callus to yellow and induced a high accumulation of carotenoids. This result indicates that both overexpression of GIC1L and GIC1S cDNA lacking the coding region of B-box ZF domain described in Example 4 (cultivation of GIC-OX transformed rice, phenotype observation) yellowed rice callus. Is consistent with Therefore, it became clear that region I containing the B-box ZF domain is not essential for carotenoid accumulation in rice callus. On the other hand, overexpressed rice callus of construct # 3 lacking 280 amino acids (regions I and II) from the N-terminus did not turn yellow. From these results, it was judged that the 202nd to 279th amino acid sequences of GIC1 (region II) are essential for callus yellowing. Next, overexpression of the cDNA constructs # 4 and # 5 of the peptide from which the amino acid sequence from the 280th to 370th position (region III) or the sequence from the 371st position to the C terminus (region IV) has been deleted, respectively The callus did not turn yellow.
Similarly, construct # 6 encodes a sequence lacking regions III and IV from construct # 2, construct # 7 encodes a sequence lacking regions II and IV, and construct encodes a sequence lacking regions III and IV. Rice lines overexpressing # 8 also did not turn yellow. From these results, it was derived that regions II, III and IV excluding the N-terminal sequence (region I) are essential for the high accumulation of carotenoids in rice cells due to overexpression of GIC1. In addition, the overexpressed callus of cDNA construct # 9 encoding GIC1 (L334A) in which the leucine residue (L) in the EAR-like motif (*) was replaced with an alanine residue (A) was not yellowed. (FIGS. 11 and 12), it was revealed that this 334th leucine residue is also important for cell yellowing. Based on the above results, we inferred that the acidic region, PEST sequence, EAR-like motif, and CCT domain present in regions II, III, and IV of GIC1 are necessary for callus yellowing.
*注：EAR-likeモチーフ
当初、植物特有のAP2/ERFファミリーに属す転写因子の配列中に、転写抑制に関わる比
較的短い機能ドメインとして見出された。その後、SUPERMANをはじめとするZFファミリーや、IAAファミリーの転写因子等にもこのモチーフが見つかり、その一部が実際に転写抑
制活性を持つことが実験的に示されている。その一つであるリプレッションドメインSRDX（Superman Repression Domain modified ver. X）は、シロイヌナズナの強力な転写抑制化因子SUPERMANのC末端配列を部分改変した12個のアミノ酸配列（Leu Asp Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly Phe Ala）（配列番号７）で、このSRDX配列をC末端あるいはN末端に付加した転写活性化因子（キメラリプレッサー、あるいはドミナントネガティブ体）は転写抑制化因子に変換される。一方、転写抑制化因子にSRDXを付加したキメラリプレッサーは通常、活性化因子に変換されること無く、抑制化因子のままである。このキメラリプレッサーを用いる転写因子機能のサイレンシング法は、Chimeric REpressor gene-Silencing Technology（CRES-T）法と命名され、従来のアンチセンス法やRNAi法とは全く異なる機構で転写因子の機能解明を可能にする。また、CRES-T法はアンチセンス法やRNAi法でノックダウンできなかった転写因子に対してもしばしば有効に機能するだけでなく、機能の重複する一群の転写因子に対しても優性に働くことが示されており、高次倍数体などでは難しいとされてきた遺伝子のノックダウンを可能にする技法として注目されている（Hiratsuら、Plant J. 34: 733-739 (2003) および 光田と高木、化学と生物 52: 438-446 (2014)）。
* Note: EAR-like motif Initially found in the sequence of transcription factors belonging to the plant-specific AP2 / ERF family as a relatively short functional domain involved in transcriptional repression. Later, this motif was also found in ZER family such as SUPERMAN and transcription factors of IAA family, and it has been experimentally shown that some of these motifs actually have transcriptional repression activity. Its is one repression domain SRDX (S uperman R epression D omain modified ver. X) , the 12 amino acid sequence of the C-terminal sequence of the potent transcriptional repressor factor SUPERMAN moiety modified Arabidopsis (Leu Asp Leu Asp In Leu Glu Leu Arg Leu Gly Phe Ala (SEQ ID NO: 7), the transcriptional activator (chimeric repressor or dominant negative form) with this SRDX sequence added to the C-terminal or N-terminal is converted into a transcriptional repressor. The On the other hand, a chimeric repressor in which SRDX is added to a transcriptional repressor usually remains a repressor without being converted into an activator. This method of silencing transcription factor function using a chimeric repressor is called the Chimeric REpressor gene-Silencing Technology (CRES-T) method, and the function of transcription factors is elucidated by a mechanism completely different from the conventional antisense and RNAi methods. Enable. In addition, the CRES-T method not only works effectively for transcription factors that could not be knocked down by antisense or RNAi methods, but it also works dominantly for a group of transcription factors with overlapping functions. Has been attracting attention as a technique that enables knockdown of genes that have been considered difficult in higher polyploids (Hiratsu et al., Plant J. 34: 733-739 (2003) and Mitsuda and Takagi) Chemistry and Biology 52: 438-446 (2014)).
本発明は、イネを含むイネ科穀類の分子育種の分野で有用である。 The present invention is useful in the field of molecular breeding of gramineous cereals including rice.
Claims (4)
配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列、
をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、および／又は挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは、
（ｉｉｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、
配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列
と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、ならびに、
（ｂ）（ａ）に記載の遺伝子をイネにおいて過剰発現させるプロモーターとして機能するＤＮＡ、
を含有する、組換えベクター。 (A) (i) SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 452 of SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 4 or amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 421 of SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 6 or amino acid sequence of amino acid numbers 196 to 448 of SEQ ID NO: 6,
DNA consisting of a base sequence encoding
(Ii) SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 452 of SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 421, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 6 448 amino acid sequences, DNA consisting of a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, added, and / or inserted; or
(Iii) SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 452 of SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 4 or the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 421 of SEQ ID NO: 4, or the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or amino acid numbers 196 to 448 of SEQ ID NO: 6 DNA consisting of, and
(B) DNA that functions as a promoter that overexpresses the gene described in (a) in rice,
A recombinant vector containing
配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列、
を含むタンパク質、
（ｉｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、および／又は挿入されたアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは、
（ｉｉｉ）配列番号２もしくは配列番号２のアミノ酸番号２０３〜４５２のアミノ酸配列、
配列番号４もしくは配列番号４のアミノ酸番号２０３〜４２１のアミノ酸配列、又は
配列番号６もしくは配列番号６のアミノ酸番号１９６〜４４８のアミノ酸配列
と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質
の発現量が野生型と比較して増加するように改変され、カロテノイドの蓄積量が野生型イネと比較して増加した形質転換イネ。 (I) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or amino acid numbers 203 to 452 of SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 4 or amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 421 of SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 6 or amino acid sequence of amino acid numbers 196 to 448 of SEQ ID NO: 6,
A protein containing,
(Ii) SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 452 of SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 421, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 6 A protein comprising an amino acid sequence wherein one or several amino acid residues are substituted, deleted, added, and / or inserted in a 448 amino acid sequence, or
(Iii) SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of amino acid numbers 203 to 452 of SEQ ID NO: 2,
Expression of a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or amino acid numbers 203 to 421 of SEQ ID NO: 4, or the amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or amino acid numbers 196 to 448 of SEQ ID NO: 6 A transgenic rice plant that has been modified so that its amount is increased compared to wild type, and the amount of accumulated carotenoids is increased compared to wild type rice.
（ａ）請求項１に記載の組換えベクターでイネ細胞を形質転換する工程、
（ｂ）該組換えベクターで形質転換されたイネ細胞からイネ植物体を再生する工程。 A method for producing transformed rice in which the accumulated amount of carotenoid is increased compared to wild-type rice, including the steps of (a) and (b) below.
(A) transforming rice cells with the recombinant vector according to claim 1,
(B) A step of regenerating a rice plant from rice cells transformed with the recombinant vector.
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