JP2018537093A - 異所性石灰化障害を治療するための組成物およびそれを使用する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、病的石灰化または病的骨化に関連する疾患および障害を治療するための組成物および方法を含む。

Description

関連出願の相互参照
本願は、35U.S.C.119条(e)に基づいて、2015年11月20日に出願された米国特許仮出願第62/257,883号に係る優先権を主張する。当該仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

発明の背景
石灰化とは、カルシウム塩が体組織に蓄積することである。石灰化は、通常、骨が形成されている間に起こるが、カルシウムは、動脈、軟骨、および心臓弁などの軟部組織に異常に沈着することもある。アテローム性動脈硬化症、脳卒中、弁膜症、および静脈瘤の患者では血管石灰化がよく発症する。高齢および糖尿病を含む代謝障害が寄与因子である。

骨化とは、骨芽細胞によって取りまとめられる骨組織形成または骨リモデリングのプロセスをいう。骨化が起きると、胎児がまだ子宮内にいる間に骨形成が可能となり、また、様々なタイプの結合組織が骨に変換される。2つの主な骨化プロセスは膜内骨化および軟骨内骨化であり、これらは軟骨がある体内の部位に基づいて異なる。

石灰化および骨化のレベルに異常があると、ある範囲の疾患が生じる。このような疾患のいくつかの例は、乳児全身性動脈石灰化症(general arterial calcification of infancy)(GACI)、特発性乳児動脈石灰化症(IIAC)、弾力線維性仮性黄色腫(PXE)、後縦靱帯骨化(OPLL)、血管内壁石灰化(medial wall vascular calcification)(MWVC)、常染色体劣性低リン血症性くる病2型(ARHR2)、末期腎臓病(ESRD)、慢性腎臓病に伴う骨ミネラル代謝異常(chronic kidney disease-bone/mineral disorder)(CKD-MBD)、X連鎖性低リン酸血症(XLH)、加齢性骨減少症、尿毒症性細小動脈石灰化症(calcific uremic arteriolopathy)(CUA)、および低リン血症性くる病である。

GACIは、大型血管および中型血管における広範囲の動脈石灰化が乳児期に発症し、その結果として、新生児期に心血管虚脱および死亡が起こることを特徴とする極めてまれな新生児疾患である。この疾患は、臨床面では、心不全、呼吸困難、高血圧、チアノーゼ、および心臓肥大が現れる。予後は重篤であり、6ヶ月での死亡率が85％という古い報告があるのに対して、最近では、ビスホスホネート（例えば、エチドロネート）による集中治療によって6ヶ月での死亡率が55％まで低下している。この明らかな進歩を抑えているのは、GACI患者におけるエチドロネートの長期使用に関連する重篤な骨格毒性であり、初期に開始した場合でも一部の患者では死亡を阻止するのにビスホスホネートの効果が無かった。さらに、利用可能なデータが限られているために、ビスホスホネート処置が本当に保護をするのか、またはあまり効かなかった患者では疾患の自然史を反映しているのかどうか確かめることが難しいという意見がある。興味深いことに、GACI患者では血清中PPiレベルが有意に激減しているようである。

腎臓は、リン酸排出を含む正常な骨と無機質の代謝の維持に不可欠である。National Kidney Foundation Kidney Disease Outcomes Quality Initiative(NKFK/DOQI)が明らかにしたように、2003年には1950万人の米国成人が慢性腎臓病(CKD)にかかり、1360万人がステージ2〜5のCKDにかかった。ESRDの羅患率は驚くべき速度で増加している。2000年には米国において90,000人超が末期腎臓病を発症した。透析療法を受けているか、または移植を必要としている患者集団は2003年には380,000人で、2010年には651,000人の患者になった。米国では、ESRD患者の治療に、毎年、180億ドル超がすでに費やされており、これは医療制度にとって大きな負担である。重要なことに、腎不全患者は血清中無機質のバランスを適切に調節することができず、様々な食物成分から吸収したリン酸を保持する傾向がある。高い血清中リン酸レベルは、副甲状腺ホルモンが過剰に分泌されることと、血管を含む軟部組織が石灰化する傾向に関連する。

腎不全患者では、血液透析中または腹膜透析中にリン酸イオンとピロリン酸イオンが過剰に除去されることがある。これらの陰イオンが組織および血漿から枯渇すると、骨軟化症および軟部組織石灰化および骨疾患を含む、骨と無機質の代謝の障害が起こる。皮膚の小さな血管へのカルシウムの沈着は、皮膚と、基礎をなす組織の壊疽をまねいて重篤な慢性疼痛の原因となり得るカルシフィラキシーと呼ばれる炎症性血管炎を引き起こす。カルシフィラキシーは、冒された手足の切断を必要とする場合があり、この状態には有効な治療法が無く、一般的に致死性である。したがって、系においてピロリン酸量を調節し、患者においてカルシフィラキシーの発生を抑えることが重要である。

CUAは、透析を受けているCKD患者において見られる致死性の疾患である。小さな動脈が石灰化すると組織/皮膚虚血、梗塞、ならびに血栓症が起こり、患者の死亡率は80％に近い。現在、米国には、CUAにかかるリスクのある透析患者が450,000人おり、FDAにより承認された、この疾患の治療法は無い。CUAには、GACIおよび他の石灰化障害に似た顕著な特徴があり、低レベルのPPiと高レベルの線維芽細胞増殖因子23(すなわちFGF23)を示す。透析を必要とするESRD患者では、この石灰化プロセスはもっと速まり、平均余命は5〜6年である。

PXEは、弛緩と弾力性喪失が付随する皮膚病変、動脈不全、心血管疾患、および黄斑変性につながる網膜出血をもたらす、皮膚、動脈、および網膜における弾性線維石灰化を特徴とする遺伝性障害である。PXEに関連する変異もabcc6遺伝子に位置している。一般的に、特徴的な皮膚病変部(典型的には顔、首、腋窩、前肘窩、膝窩、鼡径部、および臍周囲領域に見られる、黄色がかった丘疹およびプラーク、ならびに弛緩と弾力性喪失)がPXEの初期徴候であり、真皮中央における異常な石灰化弾性線維の蓄積に起因する。皮膚病変部は、通常、小児期または青年期に検出され、ゆっくりと、多くの場合は予測不可能に進行する。PXE診断は、真皮の中央および下部に、断片化した弾性線維の石灰化を示す皮膚生検によって確定することができる。PXEの最もよくある特徴の中に皮膚症状があるが、眼症状および心血管症状が、この疾患の病的状態を担っている。

PXEの一般的な心血管合併症は、異常な石灰化弾性線維が中型動脈の内部弾性板に存在することによるものである。広範囲の表現型には、時期尚早なアテローム動脈硬化性変化、アンギナもしくは間欠性跛行またはその両方を引き起こす内膜性線維増殖、早期の心筋梗塞、および高血圧が含まれる。心内膜および房室弁の線維性肥厚によって拘束型心筋症も引き起こされることがある。PXE患者の約10％は全身動脈壁石灰化の結果として胃腸出血ならびに中枢神経系合併症(例えば、脳卒中および認知症)も発症する。さらに、PXE患者では腎血管性高血圧および心房中隔動脈瘤を認めることができる。

血清中リン酸レベルが低い状態は低リン酸血症と呼ばれ、血清中リン酸レベルが高い状態は高リン酸血症と呼ばれる。低リン酸血症は、腎臓リン酸消耗に起因することが多く、X染色体低リン血症性くる病(XLH)、高カルシウム尿症を伴う遺伝性低リン血症性くる病(HHRH)、低リン血症性骨疾患(HBD)、および常染色体優性低リン血症性くる病(ADHR)を含む多数の遺伝障害によって引き起こされる。適切な血清中リン酸濃度が維持される正確な分子機構は十分に理解されていない。

病的石灰化および/または病的骨化に関連する疾患および障害を治療するための新規の組成物および方法が当技術分野において必要とされている。このような組成物および方法は他の生理学的プロセスを不必要に乱してはならない。このような組成物および方法は、正常血漿中PPiレベルより少ない血漿中PPiレベルを示す個体において石灰化レベルを低減し、PPi血漿レベルを高めるはずである。本発明は、この必要性を満たす。

本発明の例示的な態様の以下の詳細な説明は、添付の図面と組み合わせて読めばさらに深く理解されるだろう。本発明を例示するために、例示的な態様を図面に示した。しかしながら、本発明は、図面に示した態様の正確な配置および手段に限定されないことが理解されるはずである。

図1A〜1Cは、ヒトENPP3定常状態ATP加水分解活性の研究を図示したグラフを含む。図1Aは、50nM hNPP3に、(下から上に)0.98μM、1.95μM、3.9μM、7.8μM、15.6μM、31.3μM、62.5μM、125μM、250μM、および500μM ATPを添加した後のAMP生成物形成の時間経過を図示する。酵素反応を様々な時間で等量の3Mギ酸によって止め、反応生成物AMPをAMP検量線を用いてHPLC分析によって定量した。データ点を通る平坦な線は、生成物阻害および基質枯渇のある非直線酵素キネティックモデルとのベストフィット(best fit)である。 図1Bは、定常状態ATPアーゼ回転速度の比較を図示する。初期定常状態酵素回転速度のENPP3基質濃度依存性を、ヒトENPP1について以前に測定した値と比較した。50nM hNPP3およびhNPP1のATPアーゼサイクリング反応は、0.98μM、1.95μM、および3.9μM ATPでは1分でATP基質を完全に枯渇させた。従って、これらの3つの速度は正確に求めることができなかったのでプロットから除外した。hNPP3定常状態ATPアーゼ反応は、7.8μM、15.6μM、31.3μM、62.5μM、125μM基質濃度での速度測定値の加重平均から、2.59(±0.04)s^-1酵素^-1の最大値(k_cat)に達した。これは、hNPP1の3.46(±0.44)s^-1酵素^-1よりも遅いようである。K_Mは<8μMと見積もることができる。>125μMの基質[ATP]では、hNPP3 ATPアーゼ回転速度は徐々に減少した。 図1Cは基質濃度依存性ηを図示する。両酵素とも基質濃度と共にη値が減少することから、酵素反応時間経過における非直線性には、低い初期基質濃度での生成物阻害よりもはるかに基質枯渇が寄与することが分かる。ヒトENPP3対ヒトENPP1のηには著しい類似性があることから、2つの酵素の反応速度と生成物阻害は類似することが分かる。hNPP1の速度の方がわずかに速く、従って、hNPP1は低い基質濃度ではhNPP3よりもわずかに速く基質ATPを枯渇させる。 クマシー染色ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲルによるNPP3融合タンパク質の非限定的な精製プロファイルを図示する。この図では、精製されたNPP3タンパク質は、ある特定のサイズマーカーと比べて示されている。 示された制限エンドヌクレアーゼ部位を用いてクローニングされた、プラスミド中のヒトNPP121-NPP3-Fcの非限定的なプラスミド構築物マップを図示する。 IN-FUSION(登録商標)技術を用いてクローニングされた、プラスミドpcDNA3中のヒトNPP121-NPP3-Fcの非限定的なプラスミド構築物マップを図示する。 プラスミドpcDNA3中のヒトNPP121-NPP3-アルブミンの非限定的なプラスミド構築物マップを図示する。

本発明は、単離されたポリペプチドまたはその薬学的な塩もしくは溶媒和物を提供する。さらに、本発明は、病的石灰化または病的骨化に関連する疾患または障害の治療または予防を必要とする対象において、病的石灰化または病的骨化に関連する疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。さらに、本発明は、血漿中ピロリン酸(PPi)が少ないかまたは血清中リン酸(Pi)が多い対象において血管石灰化を低減または予防する方法を提供する。さらに、本発明は、NPP1欠損症またはNPP1関連疾患を有する対象を治療する方法を提供する。さらに、本発明は、少なくとも1種類の単離された本発明のポリペプチドと、病的石灰化または病的骨化に関連する疾患または障害の治療を必要とする対象において、病的石灰化または病的骨化に関連する疾患または障害を治療するための少なくとも1種類のポリペプチドの使用について述べた説明書を備え、任意で、塗布具をさらに備える、キットを提供する。

ある特定の態様では、本発明のポリペプチドは、式(I):エクスポート(EXPORT)-タンパク質(PROTEIN)-Z-ドメイン(DOMAIN)-X-Y(I)を有し、(I)において、エクスポート(EXPORT)は存在しないか、または輸送シグナル配列またはその生物学的に活性な断片であり、タンパク質(PROTEIN)は、ENPP3の細胞外ドメイン(SEQ ID NO:1)またはその生物学的に活性な断片であり、ドメイン(DOMAIN)は、ヒトIgG Fcドメインおよびヒトアルブミンドメインからなる群より選択され、XおよびZは独立して存在しないか、または1〜20個のアミノ酸を含むポリペプチドであり、
Yは存在しないか、または

からなる群より選択される配列であり、配列中、nはそれぞれの場合に独立して1〜20の整数である。

ある特定の態様では、タンパク質(PROTEIN)またはその変異体のヌクレアーゼドメインは存在しない。他の態様では、エクスポート(EXPORT)は存在しないか、またはSEQ ID NO:2〜5からなる群より選択される。さらに他の態様では、Xは、存在しない、20アミノ酸からなるポリペプチド、19アミノ酸からなるポリペプチド、18アミノ酸からなるポリペプチド、17アミノ酸からなるポリペプチド、16アミノ酸からなるポリペプチド、15アミノ酸からなるポリペプチド、14アミノ酸からなるポリペプチド、13アミノ酸からなるポリペプチド、12アミノ酸からなるポリペプチド、11アミノ酸からなるポリペプチド、10アミノ酸からなるポリペプチド、9アミノ酸からなるポリペプチド、8アミノ酸からなるポリペプチド、7アミノ酸からなるポリペプチド、6アミノ酸からなるポリペプチド、5アミノ酸からなるポリペプチド、4アミノ酸からなるポリペプチド、3アミノ酸からなるポリペプチド、2アミノ酸からなるポリペプチド、および1アミノ酸からなるポリペプチドからなる群より選択される。さらに他の態様では、Zは、存在しない、20アミノ酸からなるポリペプチド、19アミノ酸からなるポリペプチド、18アミノ酸からなるポリペプチド、17アミノ酸からなるポリペプチド、16アミノ酸からなるポリペプチド、15アミノ酸からなるポリペプチド、14アミノ酸からなるポリペプチド、13アミノ酸からなるポリペプチド、12アミノ酸からなるポリペプチド、11アミノ酸からなるポリペプチド、10アミノ酸からなるポリペプチド、9アミノ酸からなるポリペプチド、8アミノ酸からなるポリペプチド、7アミノ酸からなるポリペプチド、6アミノ酸からなるポリペプチド、5アミノ酸からなるポリペプチド、4アミノ酸からなるポリペプチド、3アミノ酸からなるポリペプチド、2アミノ酸からなるポリペプチド、および1アミノ酸からなるポリペプチドからなる群より選択される。

ある特定の態様では、ドメイン(DOMAIN)は、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4からなる群より選択されるヒトIgG Fcドメインである。他の態様では、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:19、21、および22からなる群より選択される。さらに他の態様では、ドメイン(DOMAIN)はヒトアルブミンドメインである。さらに他の態様では、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:24、25、および26からなる群より選択される。

ある特定の態様では、前記ポリペプチドはNPP3の可溶性領域またはその融合タンパク質を含み、膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドを欠き、前記ポリペプチドは、石灰化および骨化の疾患に罹患している対象に投与されたときに細胞石灰化を低減する。他の態様では、前記ポリペプチドはNPP3の可溶性領域を含み、膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドを欠き、前記ポリペプチドは、石灰化および骨化の疾患に罹患している対象に投与されたときに細胞石灰化を低減する。

ある特定の態様では、前記ポリペプチドは、ENPP3の細胞外ドメイン(SEQ ID NO:1)またはその生物学的に活性な断片を含む。他の態様では、前記ポリペプチドはSEQ ID NO:1またはその生物学的に活性な断片から本質的になる。さらに他の態様では、前記ポリペプチドはSEQ ID NO:1またはその生物学的に活性な断片からなる。

ある特定の態様では、可溶性ENPP3断片またはその融合タンパク質は、ENPP3の細胞外ドメイン(SEQ ID NO:1)またはその生物学的に活性な断片を含む。他の態様では、可溶性ENPP3断片はSEQ ID NO:1またはその生物学的に活性な断片から本質的になる。さらに他の態様では、可溶性ENPP3断片はSEQ ID NO:1またはその生物学的に活性な断片からなる。さらに他の態様では、可溶性ENPP3断片またはその融合タンパク質には膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドが無い。

ある特定の態様では、前記方法は、治療的有効量の少なくとも1種類の本発明のポリペプチドまたはその薬学的な塩もしくは溶媒和物を対象に投与する工程を含む。他の態様では、前記方法は、治療的有効量の単離された組換えヒト可溶性ENPP3断片またはその融合タンパク質を対象に投与する工程を含む。

ある特定の態様では、疾患または障害は、GACI、IIAC、PXE、OPLL、低リン血症性くる病、変形性関節症、アテローム性動脈硬化巣の石灰化(calcification of atherosclerotic plaques)、遺伝性および非遺伝性の変形性関節症、強直性脊椎炎、加齢に伴う動脈硬化、ならびに末期腎臓病に起因するカルシフィラキシー(または慢性腎臓病に伴う骨ミネラル代謝異常)からなる群より選択される少なくとも1つを含む。

ある特定の態様では、疾患または障害は、GACI、IIAC、PXE、OPLL、MWVC、ARHR2、ESRD、CKD-MBD、XLH、加齢性骨減少症、CUA、および低リン血症性くる病からなる群より選択される少なくとも1つを含む。

ある特定の態様では、疾患または障害はGACIである。他の態様では、疾患または障害はIIACである。さらに他の態様では、疾患または障害はPXEである。さらに他の態様では、疾患または障害はOPLLである。さらに他の態様では、疾患または障害は低リン血症性くる病である。さらに他の態様では、疾患または障害は変形性関節症である。さらに他の態様では、疾患または障害はアテローム性動脈硬化巣の石灰化である。さらに他の態様では、疾患または障害は遺伝性および非遺伝性の変形性関節症である。さらに他の態様では、疾患または障害は強直性脊椎炎である。さらに他の態様では、疾患または障害は、加齢に伴う動脈硬化である。さらに他の態様では、疾患または障害は、末期腎臓病に起因するカルシフィラキシー(または慢性腎臓病に伴う骨ミネラル代謝異常)である。さらに他の態様では、疾患または障害は加齢性骨減少症である。さらに他の態様では、疾患または障害はCUAである。さらに他の態様では、疾患または障害はMWVCである。さらに他の態様では、疾患または障害はARHR2である。さらに他の態様では、疾患または障害はESRDである。

ある特定の態様では、前記投与される量（前記量の投与）は、対象における血漿中PPiレベルを少なくとも約800nMまで上昇させる。他の態様では、前記投与される量（前記量の投与）は、対象における血漿中PPiレベルを少なくとも約1μMまで上昇させる。さらに他の態様では、前記投与される量（前記量の投与）は、対象における血漿中PPiレベルを少なくとも約1.5μMまで上昇させる。

ある特定の態様では、少なくとも1種類のポリペプチドは対象に短期または長期にわたって投与される。他の態様では、少なくとも1種類のポリペプチドは対象に局所投与、局部投与、または全身投与される。さらに他の態様では、対象は哺乳動物である。さらに他の態様では、哺乳動物はヒトである。

発明の詳細な説明
本発明は、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼ(ENPPまたはNPP)酵素ファミリーの一員であるENPP3(NPP3とも知られる)には強力なATP加水分解酵素活性があるという発見に関する。本明細書において証明されるように、ENPP3はATPをAMPおよびPPiに加水分解する。

ある特定の局面では、本発明は、(例えば、医療従事者によって、または医学文書もしくはマニュアルを調べることによって確かめられたときに)個体を低PPi状態に関連する病的状態の危険にさらす低血漿中PPiの生理状態において血漿中PPiを上昇させる、融合タンパク質などあるが、これに限定されない組成物を提供する。ある特定の態様では、これらの生理状態は、GACI、PXE、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群(Hutchinson Gilford Progeria Syndrome)、慢性腎臓病(CKD)、X連鎖性低リン酸血症、鎌状赤血球性貧血、および末期腎臓病などの認められている疾患状態である。他の態様では、これらの生理状態は、非疾患状態で、例えば、「動脈の硬化」および骨減少などの全高齢者において起こることが知られている慢性疾患にかかっている高齢者において起こる。

ある特定の態様では、低血漿中PPiは、約1.5μM未満の血漿中PPi濃度と定義される。これらの疾患状態は、動脈および/または軟部組織の病的石灰化、血管内壁石灰化、脳卒中もしくは脳血管障害、脈波伝播速度の低下、軟部組織、例えば、皮膚の石灰化、眼の中にあるブルッフ膜の石灰化、腱付着部とも知られる腱の周囲にある軟部組織の石灰化、脊椎の中にある靱帯、例えば、後縦靱帯の石灰化、ならびに骨化疾患、例えば、くる病が伴ってもよく、伴わなくてもよい。他の態様では、本発明は、本明細書に記載の融合タンパク質の投与を介した低PPi生理状態の治療を含む。

他の局面において、本発明の組成物および方法は、酵素ENPP1の発現または活性が低減している状態において生じることが知られている疾患状態を治療するのに使用することができる。これらの認められている疾患状態には、非限定的に、変形性関節症、GACI、およびARHR2が含まれる。これらの状態は、ENPP1タンパク質レベルが低減している他の生理状態でも、例えば、ENPP1コード領域に共通多型(polymporphism)があり、分泌タンパク質の位置121(または完全長タンパク質の位置173)にあるK残基がQ残基で置換されている個体でも起こる場合がある(Eller, et al., 2008, Nephrol. Dial. Transplant. 23(1):321-7; Flanagan, et al., 2013, Blood 121(16):3237-45)。

本明細書において証明されるように、ENPP3の酵素活性を試験するために、この酵素によるATP加水分解の生成物と、対応する酵素反応定数(enzymatic constant)を分析した。ENPP3は、ATPからPPiおよびAMPを生成することができる強力なATP加水分解酵素であることが見出された。ある特定の態様では、ENPP3には、ENPP1のATP加水分解酵素活性に匹敵するATP加水分解酵素活性がある。本明細書において証明されるように、ENPP3は、ENPP酵素ファミリーの別の一員であるENPP1とほぼ同じミカエリス・メンテン速度式でATPからPPiへの加水分解を触媒する。ある特定の態様では、ENPP3の可溶性融合構築物は、そのアルブミン融合構築物および/またはそのIgG Fcドメイン構築物を含めて、異所性石灰化の疾患を治療するのに有効である。さらに他の態様では、本明細書に記載の構築物は異所性血管石灰化の障害を治療および/または予防するのに有効である。

一局面では、NPP3は細胞表面に十分に輸送されない。ある特定の態様では、可溶性ENPP3タンパク質は、NPP3のシグナル配列を他のENPPの天然シグナル配列と交換することによって構築される。他の態様では、可溶性ENPP3構築物は、ENPP7および/またはENPP5などあるがこれらに限定されない他のENPP酵素の輸送シグナル配列を用いることによって調製される。さらに他の態様では、可溶性ENPP3構築物は、ENPP1およびENPP2のシグナル配列の組み合わせで構成されるシグナル配列を用いることによって調製される(以下、「ENPP1-2-1」)。さらに他の態様では、分泌のためにENPP3細胞外ドメインを標的化するために、免疫グロブリンκ軽鎖タンパク質およびλ軽鎖タンパク質のシグナル配列などあるがこれらに限定されない他の任意の公知のタンパク質のシグナル配列も使用することができる。さらに、本発明は、本明細書に記載の構築物に限定されると解釈してはならないが、酵素活性のある任意のENPP3細胞外ドメイン切断を含む構築物も含む。

本発明の組成物および方法によって治療可能な病的石灰化および/または病的骨化を伴う疾患および障害には、特発性乳児動脈石灰化症(IIAC)、後縦靭帯骨化症(OPLL)、低リン血症性くる病、変形性関節症、アテローム性動脈硬化プラークの石灰化、弾力線維性仮性黄色腫(PXE)、遺伝性および非遺伝性の変形性関節症、強直性脊椎炎、加齢に伴う動脈硬化、および末期腎臓病に起因するカルシフィラキシーが含まれるが、これに限定されない。

定義
特に定義のない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様のまたは等価な任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を説明する。

本明細書で使用する、以下の用語はそれぞれ、このセクションにおいて、それぞれの用語に関連する意味を有する。

冠詞「1つの(a)」および「1つの(an)」は、冠詞の文法上の目的語の1つまたは複数(すなわち、少なくとも1つ)を指すために本明細書において用いられる。例として、「要素」とは1つの要素または複数の要素を意味する。

「異常な」という用語は、生物、組織、細胞、またはその成分の文脈において用いられた場合は、少なくとも1つの観察可能または検出可能な特徴(例えば、年齢、処置、時刻など)の点で、「正常な」(期待された)それぞれの特徴を示す生物、組織、細胞、またはその成分とは異なる、生物、組織、細胞、またはその成分を指す。ある細胞または組織タイプにとって正常な、または期待される特徴は、異なる細胞または組織タイプにとっては異常であるかもしれない。

本明細書で使用する「約」とは、測定可能な値、例えば、量、期間などを指している場合には、指定値からの±20％または±10％、より好ましくは±5％、さらにより好ましくは±1％、なおさらにより好ましくは±0.1％のばらつきが、開示された方法を実施するのに適している場合に、このようなばらつきを包含することを意味する。

本明細書で使用する、「ADHR」という用語は常染色体優性低リン血症性くる病を指す。

本明細書で使用する、「アルブミン」という用語は、肝臓で産生され、全血漿タンパク質の大きな割合を形成する血漿タンパク質を指す。ある特定の態様では、アルブミンはヒト血清アルブミンを指す。ウシ血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、およびブタ血清アルブミンなどの他のアルブミンの使用も本発明の中で意図される。

疾患もしくは障害の症状の重篤度、このような症状を患者が経験する頻度、またはその両方が低下すれば、疾患または障害は「軽減」されている。

本明細書で使用する「変化」、「欠損」、「バリエーション」、または「変異」という用語は、遺伝子がコードするポリペプチドの機能、活性、発現(転写もしくは翻訳)、またはコンホメーションに影響を及ぼす、細胞にある遺伝子の変異を指す。本発明に含まれる変異は、コードされるタンパク質の発現の完全な非存在を含む、コードされるポリペプチドの機能、活性、発現、またはコンホメーションの強化または破壊をもたらす、細胞にある遺伝子の任意の変異でよく、例えば、ミスセンス変異およびナンセンス変異、挿入、欠失、フレームシフト、ならびに早すぎる終結を含んでもよい。本発明に含まれる変異は、次に言うように限定されることはないが、mRNAのスプライシングを変えてもよく(スプライス部位変異)、読み枠のシフトを引き起こしてもよい(フレームシフト)。

「アミノ酸配列バリアント」という用語は、天然配列ポリペプチドとある程度まで異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。通常、アミノ酸配列バリアントは、天然ポリペプチドに対して少なくとも約70％の相同性、少なくとも約80％の相同性、少なくとも約90％の相同性、または少なくとも約95％の相同性を有する。アミノ酸配列バリアントは、天然アミノ酸配列のアミノ酸配列内にある、ある特定の位置に置換、欠失、および/または挿入を有する。

本明細書で使用する「Ap3P」という用語は、アデノシン-(5')-トリホスホ-(5')-アデノシンまたはその塩を指す。

本明細書で使用する「ARHR2」という用語は常染色体劣性低リン血症性くる病2型を指す。

本明細書で使用する「CKD」という用語は慢性腎臓病を指す。

本明細書で使用する「CKD-MBD」という用語は慢性腎臓病に伴う骨ミネラル代謝異常を指す。

本明細書で使用する「コード配列」という用語は、mRNAおよび/もしくはポリペプチドまたはその断片を産生するように転写および/または翻訳することができる、核酸もしくはその相補鎖の配列またはその一部を意味する。コード配列には、ゲノムDNAまたは未熟な一次RNA転写物にあるエキソンが含まれ、エキソンは、成熟mRNAを生じるように細胞の生化学的機構によってつなぎ合わされる。アンチセンス鎖は、このような核酸の相補鎖であり、アンチセンス鎖からコード配列を推定することができる。対照的に、本明細書で使用する「ノンコード配列」という用語は、インビボでアミノ酸に翻訳されないか、またはアミノ酸を配置するようにtRNAが相互作用しないか、もしくはアミノ酸を配置しようとしない核酸もしくはその相補鎖またはその一部の配列を意味する。ノンコード配列には、ゲノムDNAまたは未熟な一次RNA転写物にあるイントロン配列と、遺伝子に関連する配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどが含まれる。

本明細書で使用する「相補的な」または「相補性」という用語は、塩基対合の規則によって関係付けられるポリヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチド配列)に関して用いられる。例えば、配列「A-G-T」は配列「T-C-A」に相補的である。相補性は「部分的」であってもよく、この場合、塩基対合の規則に従って核酸塩基の一部しか一致しない。または、核酸間には「完全な」または「全体の」相補性があってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に大きな影響を及ぼす。このことは、核酸間の結合に左右される増幅反応ならびに検出方法において特に重要である。

本明細書で使用する「組成物」または「薬学的組成物」という用語は、薬学的に許容される担体との、本発明において有用な少なくとも1種類の化合物の混合物を指す。薬学的組成物は、患者への化合物の投与を容易にする。静脈内投与、経口投与、エアロゾル投与、吸入投与、直腸投与、腟投与、経皮投与、鼻腔内投与、頬投与、舌下投与、非経口投与、くも膜下腔内投与、胃内投与、眼投与、肺投与、および局所投与を含むが、これに限定されない、化合物を投与する複数の技法が当技術分野において存在する。

本明細書で使用する「保存的バリエーション」または「保存的置換」という用語は、アミノ酸残基と別の生物学的に類似する残基との交換を指す。保存的バリエーションまたは保存的置換はペプチド鎖の形状を変える可能性が低い。保存的バリエーションまたは保存的置換の例には、ある疎水性残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニンと別の疎水性残基との交換、またはある極性残基と別の極性残基との交換、例えば、リジンからアルギニンへの置換、アスパラギン酸からグルタミン酸への置換、またはアスパラギンからグルタミンへの置換が含まれる。

本明細書で使用する「CUA」という用語は、尿毒症性細小動脈石灰化症を指す。

「疾患」とは、動物がホメオスタシス維持することができない、動物の健康状態であり、疾患が良くならなければ、動物の健康は悪化し続ける。

動物における「障害」とは、動物がホメオスタシス維持することができる健康状態であるが、障害が存在しない場合より動物の健康状態は好ましくない。無処置のままにしておいたら、障害は、必ず、動物の健康状態をさらに低下させるとは限らない。

本明細書で使用する「ドメイン」という用語は、疎水性、極性、球状、およびヘリックスのドメインまたは特性などがあるが、これに限定されない、共通の物理化学的特徴を有する、分子または構造の一部を指す。結合ドメインの具体的な例には、DNA結合ドメインおよびATP結合ドメインが含まれるが、これに限定されない。

本明細書で使用する「有効量」、「薬学的有効量」、および「治療的有効量」という用語は、望ましい生物学的結果をもたらすのに無毒であるが十分な薬剤の量を指す。この結果は、疾患の徴候、症状、もしくは原因の低減および/もしくは軽減でもよく、生物系の他の任意の望ましい変化でもよい。任意の個々の症例における適切な治療上の量は日常的な実験方法を用いて当業者によって決定することができる。

「コードする」とは、生物学的プロセスにおいて、規定されたヌクレオチド配列(すなわち、rRNA、tRNA、およびmRNA)または規定されたアミノ酸配列を有し、結果として生じる生物学的特性を有する他のポリマーおよび高分子を合成するためのテンプレートとして働くようなポリヌクレオチド、例えば、遺伝子、cDNA、またはmRNAにおける特定のヌクレオチド配列の固有の性質を指す。従って、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳によって細胞または他の生物系においてタンパク質が産生されるのであればタンパク質をコードする。mRNA配列と同一であり、通常、配列表に示されているヌクレオチド配列であるコード鎖と、遺伝子またはcDNAの転写用のテンプレートとして用いられる非コード鎖はいずれも、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードすると言うことができる。

本明細書で使用する「ESRD」という用語は末期腎臓病を指す。

本明細書で使用する「Fc」という用語はヒトIgG Fcドメインを指す。IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4などのIgGサブタイプは全て、Fcドメインとして用いられることが意図される。

本明細書で使用する「断片」という用語は、核酸に適用される場合には、さらに大きな核酸の部分配列を指す。核酸の「断片」は、長さが少なくとも約15ヌクレオチド、例えば、少なくとも約50ヌクレオチド〜約100ヌクレオチド;少なくとも約100〜約500ヌクレオチド、少なくとも約500〜約1000ヌクレオチド;少なくとも約1000ヌクレオチド〜約1500ヌクレオチド;約1500ヌクレオチド〜約2500ヌクレオチド;または約2500ヌクレオチド(およびその間の任意の整数値)でもよい。本明細書で使用する「断片」という用語は、タンパク質またはペプチドに適用される場合には、さらに大きなタンパク質またはペプチドの部分配列を指す。タンパク質またはペプチドの「断片」は、長さが少なくとも約20アミノ酸、例えば、長さが少なくとも約50アミノ酸;長さが少なくとも約100アミノ酸;長さが少なくとも約200アミノ酸;長さが少なくとも約300アミノ酸;または長さが少なくとも約400アミノ酸(およびその間の任意の整数値)でもよい。

本明細書で使用する「HBD」という用語は低リン血症性骨疾患を指す。

本明細書で使用する「HHRH」という用語は、高カルシウム尿症(hypercakiuria)を伴う遺伝性低リン血症性くる病を指す。

「相同」とは、2つのポリペプチド間または2つの核酸分子間の配列類似性または配列同一性を指す。2つの比較分子の両方にある位置が同じ塩基またはアミノ酸単量体サブ単位によって占められている場合、例えば、2つのDNA分子のそれぞれにある位置がアデニンによって占められているのであれば、当該分子はその位置において相同である。2つの配列間の相同性の割合（％）は、2つの配列が共有する一致する位置または相同な位置の数/比較した位置の数X100の関数である。例えば、2つの配列中にある位置の10個のうち6個が一致しているか、または相同であれば、2つの配列は60％相同である。例として、DNA配列ATTGCCおよびTATGGCは50％相同である。一般的に、相同性が最大になるように2つの配列がアラインメントされた場合に比較が行われる。

本明細書で使用する「IIAC」という用語は、特発性乳児動脈石灰化症を指す。

本明細書で使用する「イムノアッセイ」とは、標的分子を検出および定量するために、標的分子に特異的に結合することができる抗体を使用する任意の結合アッセイを指す。

本明細書で使用する「免疫グロブリン」または「Ig」という用語は、抗体として機能するタンパク質のクラスと定義される。B細胞が発現する抗体は、BCR(B細胞受容体)または抗原受容体と呼ばれることもある。このクラスのタンパク質に含まれる5つのメンバーは、IgA、IgG、IgM、IgD、およびIgEである。IgAは、身体分泌物、例えば、唾液、涙、母乳、胃腸分泌物、ならびに気道および尿生殖器管の粘液分泌物に存在する一次抗体である。IgGは最も一般的な循環抗体である。IgMは、ほとんどの対象において一次免疫応答で産生される主要な免疫グロブリンである。IgMは、凝集、補体結合、および他の抗体15応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌およびウイルスに対する防御において重要である。IgDは、抗体機能が分かっていないが、抗原受容体として役立つ可能性がある免疫グロブリンである。IgEは、アレルゲンに曝露されたときマスト細胞および好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こすことによって即時型過敏症を媒介する免疫グロブリンである。

「教材」とは、この用語が本明細書において用いられる場合には、本明細書において列挙された様々な疾患または障害を特定または軽減または治療するためのキットの中にある、本発明の核酸、ペプチド、および/または化合物の有用性を伝えるのに使用することができる刊行物、記録、図、または他の任意の表現媒体を含む。任意で、または代わりに、教材は、対象の細胞または組織における疾患または障害を特定または軽減する1つまたは複数の方法を説明してもよい。キットの教材は、例えば、本発明の核酸、ポリペプチド、および/または化合物を収める容器に貼り付けられてもよく、核酸、ポリペプチド、および/または組成物を収める容器と一緒に発送されてもよい。または、教材は、教材および化合物がレシピエントによって協同して用いられる意図をもって、容器とは別々に発送されてもよい。または、キットは、本発明の核酸、ペプチド、および/または化合物を対象に投与するのに使用することができる塗布具を備える。この応用例は、例えば、ドロップディスペンサー(drop dispenser)、瓶、ピルディスペンサー(pill dispenser)、注射器などでもよい。

「単離された」とは、自然状態から変えられている、または取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に天然で存在する核酸またはポリペプチドは「単離されて」いないが、自然状態の同時に存在する材料から部分的または完全に分離されている同じ核酸またはポリペプチドは「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は実質的に精製された形で存在してもよく、例えば、宿主細胞などの自然ではない環境に存在してもよい。

「単離された核酸」とは、天然状態で隣接する配列から分離されている、核酸セグメントまたは断片、例えば、DNA断片に通常隣接する配列、例えば、DNA断片が天然で生じるゲノム内でDNA断片に隣接する配列から除去されているDNA断片を指す。この用語はまた、天然で付随する他の成分、例えば、細胞内で天然で付随するRNAもしくはDNAまたはタンパク質から実質的に精製されている核酸にも適用される。従って、この用語は、例えば、ベクター、自己複製プラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれたか、あるいは他の配列とは独立した別々の分子として(例えば、PCRまたは制限酵素消化によって生じたcDNAまたはゲノム断片もしくはcDNA断片として)存在する組換えDNAを含む。この用語はまた、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAも含む。

本明細書で使用する「MWVC」という用語は、血管内壁石灰化を指す。

本明細書で使用する「NPP」という用語は、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼを指す。

「核酸」とはポリヌクレオチドを指し、ポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明による核酸は、ピリミジン塩基、好ましくは、シトシン、チミン、およびウラシルと、プリン塩基、好ましくは、グアニンの任意のポリマーまたはオリゴマーを含んでもよい（全ての目的のために、その全体が本明細書に組み入れられる、Albert L. Lehninger, Principles of Biochemistry, 793-800 (Worth Pub. 1982)）。実際に、本発明は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはペプチド核酸成分、およびその任意の化学的バリアント、例えば、これらの塩基のメチル化型、ヒドロキシメチル型、またはグルコシル化型などを意図する。これらのポリマーまたはオリゴマーは組成が不均一でも均一でもよく、天然供給源から単離されてもよく、人工的にまたは合成により生成されてもよい。さらに、核酸はDNAもしくはRNA、またはその混合物でもよく、ホモ二重鎖、ヘテロ二重鎖、およびハイブリッド状態を含めて一本鎖または二本鎖の形で永久に、または一過的に(transitionally)存在してもよい。

「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、長さが少なくとも2ヌクレオチド、好ましくは少なくとも8ヌクレオチド、15ヌクレオチド、または25ヌクレオチドの核酸であるが、50ヌクレオチド長、100ヌクレオチド長、1000ヌクレオチド長、または5000ヌクレオチド長まででもよく、ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする化合物でもよい。ポリヌクレオチドには、天然供給源から単離されてもよく、組換えにより生成されてもよく、人工的に合成されてもよい、デオキシリボ核酸(DNA)もしくはリボ核酸(RNA)またはそのミメティックの配列が含まれる。本発明のポリヌクレオチドのさらなる例はペプチド核酸(PNA)でもよい(その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,156,501号を参照されたい)。本発明はまた、ある特定のtRNA分子において特定されており、三重らせんに存在すると想定されている、フーグスティーン塩基対合などの普通ではない塩基対合がある状況も包含する。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は本明細書において同義に用いられる。ヌクレオチド配列が本明細書においてDNA配列(例えば、A、T、G、およびC)で表される場合には、これは、「U」が「T」の代わりに用いられる、対応するRNA配列(例えば、A、U、G、C)も含む。

本明細書で使用する「OPLL」という用語は、後縦靭帯骨化症を指す。

本明細書で使用する「患者」、「個体」、または「対象」という用語は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を指す。非ヒト哺乳動物には、例えば、家畜およびペット、例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、およびマウスの哺乳動物が含まれる。例えば、患者、個体、または対象はヒトである。

本明細書で使用する「薬学的に許容される」という用語は、化合物の生物学的活性または生物学的特性を無くさない、比較的無毒の材料、例えば、担体または希釈剤を指す。すなわち、この材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはこの材料が含まれる組成物のどの成分とも有害に相互作用することなく個体に投与することができる。

本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」という用語は、本発明において有用な化合物が、意図された機能を果たすことができるように、本発明において有用な化合物を患者の中に、または患者に運搬もしくは輸送することに関与する、薬学的に許容される材料、組成物、または担体、例えば、液体または固体の増量剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒、またはカプセル化材料を意味する。典型的には、このような構築物は、ある臓器または身体の一部から別の臓器または身体の一部に運搬または輸送される。それぞれの担体は、本発明において有用な化合物を含む、製剤の他の成分と適合し、患者に害を及ぼさないという意味で「許容」されなければならない。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例には、糖、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース;デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプン;セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース;粉末トラガカントゴム;麦芽;ゼラチン;タルク;賦形剤、例えば、カカオ脂および坐剤ろう;油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油;グリコール、例えば、プロピレングリコール;ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール;エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル;寒天;緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム;界面活性剤;アルギン酸;発熱物質を含まない水;等張性食塩水;リンガー液、エチルアルコール;リン酸緩衝液;ならびに薬学的製剤において用いられる他の無毒の適合性物質が含まれる。「薬学的に許容される担体」はまた、本発明において有用な化合物の活性と適合し、患者に生理学的に許容される、任意のおよび全てのコーティング、抗菌剤および抗真菌剤、および吸収遅延剤なども含む。補助的な活性化合物も組成物に組み込まれてもよい。「薬学的に許容される担体」は、本発明において有用な化合物の薬学的に許容される塩をさらに含んでもよい。本発明の実施において用いられる薬学的組成物に含まれ得る他のさらなる成分は当技術分野において公知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA)に記載されている。

本明細書で使用する「薬学的に許容される塩」という言葉は、無機酸、無機塩基、有機酸、無機塩基、その溶媒和物、水和物、および包接化合物を含む、薬学的に許容される無毒の酸および塩基から調製された、投与される化合物の塩を指す。適切な薬学的に許容される酸添加塩は無機酸から調製されてもよく、有機酸から調製されてもよい。無機酸の例には、硫酸塩、硫酸水素塩、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸、ならびにリン酸(リン酸一水素塩およびリン酸二水素塩を含む)が含まれる。適切な有機酸は、有機酸の脂肪族クラス、脂環式クラス、芳香族クラス、アリール芳香族(araliphatic)クラス、複素環式クラス、カルボキシル基を含むクラス、およびスルホン基を含むクラスより選択されてもよい。この例には、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、4-ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸(embonic acid)(パモ酸)、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルギン酸、β-ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクタル酸、およびガラクツロン酸が含まれる。本発明の化合物の適切な薬学的に許容される塩基添加塩には、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、および遷移金属塩、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、および亜鉛塩を含む金属塩が含まれる。薬学的に許容される塩基添加塩にはまた、例えば、N,N'-ジベンジルエチレン-ジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン(N-メチルグルカミン)、およびプロカインなどの塩基性アミンから作られた有機塩も含まれる。これらの塩は全て、対応する化合物から、例えば、適切な酸または塩基と化合物を反応させることによって調製することができる。

本明細書で使用する「血漿中ピロリン酸レベル」または「血漿中PPi」という用語は、動物の血漿中に存在するピロリン酸(PPi)の量を指す。ある特定の態様では、動物には、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ヒト、ウシ、およびウマなどあるが、これに限定されない哺乳動物が含まれる。ある特定の態様では、血小板からPPiが放出されるために、PPiは血清ではなく血漿中で測定される。いくつかの非限定的なPPi測定法があり、このうちの1つは、LustおよびSeegmiller(Lust, et al., 1976, Clin. Chim. Acta 66:241-249; Cheung & Suhadolnik, 1977, Anal. Biochem. 83:61-63)により述べられたようなウリジン-ジホスホグルコース(uridine-diphosphoglucose)(UDPG)ピロホスホリラーゼを用いた酵素アッセイに変更を加えたものによる測定法である。典型的には、健常な個体は約3.0μMの平均血漿レベルを示す。高齢の、および/または石灰化もしくは骨化の疾患のある対象における血漿中PPiレベルは正常レベルよりかなり少ない。ある特定の態様では、対象は約1.5μmという低い血漿中PPiレベルを示す。他の態様では、石灰化の疾患をもつ対象の場合、血漿中PPiレベルは、約500nM、約600nM、約700nM、約800nM、約900nM、約1μM、約1.1μM、約1.2μM、約1.3μM、約1.4μM、約1.5μM、約1.6μM、約1.7μM、約1.8μM、約1.9μM、約2μM、約2.2μM、約2.4μM、および/または約2.6μMである。さらに他の態様では、石灰化の疾患をもつ対象の場合、血漿中PPiレベルは、約500nM〜約2.8μM、約600nM〜約2.8μM、約700nM〜約2.8μM、約800nM〜約2.8μM、約900nM〜約2.8μM、約1μM〜約2.8μM、約1.1μM〜約2.8μM、約1.2μM〜約2.8μM、約1.3μM〜約2.8μM、約1.4μM〜約2.8μM、約1.5μM〜約2.8μM、約1.6μM〜約2.8μM、約1.7μM〜約2.8μM、約1.8μM〜約2.8μM、約1.9μM〜約2.8μM、約2μM〜約2.8μM、約2.2μM〜約2.8μM、約2.4μM〜約2.8μM、および/または約2.6μM〜約2.8μMである。

本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」とは、cDNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、アンチセンスRNA、リボザイム、ゲノムDNA、合成型、および混合ポリマー、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含み、非天然の、または誘導体化された、合成の、もしくは半合成のヌクレオチド塩基を含有するように化学的または生化学的に改変されてもよい。1つもしくは複数のヌクレオチドの欠失、挿入、置換、または他のポリヌクレオチド配列との融合を含むが、これに限定されない野生型遺伝子または合成遺伝子の変化も意図される。

本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して連結したアミノ酸残基、その関連する天然構造バリアント、および合成の非天然類似体で構成されるポリマー化合物を指す。合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成機を用いて合成することができる。本明細書で使用する「タンパク質」という用語は、典型的には、大きなポリペプチドを指す。本明細書で使用する「ペプチド」という用語は、典型的には、短いポリペプチドを指す。ポリペプチド配列を表すために本明細書では従来の表記法が用いられる。すなわち、ポリペプチド配列の左側の末端がアミノ末端であり、ポリペプチド配列の右側の末端がカルボキシル末端である。

本明細書で使用するアミノ酸は、以下:アスパラギン酸, Asp, D;グルタミン酸, Glu, E;リジン, Lys, K;アルギニン, Arg, R;ヒスチジン, His, H;チロシン, Tyr, Y;システイン, Cys, C;アスパラギン, Asn, N;グルタミン, Gln, Q;セリン, Ser, S;スレオニン, Thr, T;グリシン, Gly, G;アラニン, Ala, A;バリン, Val, V;ロイシン, Leu, L;イソロイシン, Ile, I;メチオニン, Met, M;プロリン, Pro, P;フェニルアラニン, Phe, F;トリプトファン, Trp, Wに示したように、そのフルネームで表されるか、それに対応する三文字表記で表されるか、それに対応する一文字表記で表される。

本明細書で使用する「予防する」または「予防」という用語は、何も起こっていなければ、障害の発症も疾患の発症も無いこと、または障害もしくは疾患が既に発症していれば、これ以上の障害の発症も疾患の発症も無いことを意味する。障害または疾患に関連する症状の一部または全てを予防できることも考慮される。

本明細書で使用する「PXE」という用語は、弾力線維性仮性黄色腫を指す。

本明細書で使用する「試料」または「生物学的試料」とは、対象から単離された生物学的材料を意味する。生物学的試料は、対象においてmRNA、ポリペプチド、または生理学的プロセスもしくは病的プロセスの他のマーカーを検出するのに適した任意の生物学的材料を含有してよく、個体から得られた流体、組織、細胞材料、および/または非細胞材料を含んでもよい。

本明細書で使用する「実質的に精製された」とは、他の成分を本質的に含まないことを指す。例えば、実質的に精製されたポリペプチドは、天然状態で通常関連する他の成分から分離されているポリペプチドである。

本明細書で使用する「治療/処置」または「治療/処置する」という用語は、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害を発症する可能性を治すか、治癒するか、軽減するか、緩和するか、変えるか、いやすか、寛解させるか、改善するか、またはこれに影響を及ぼす目的で、疾患もしくは障害を有するか、疾患もしくは障害の症状を有するか、または疾患もしくは障害を発症する可能性を有する患者への、治療剤、すなわち、本発明において有用な化合物の（単独で、もしくは別の薬学的な薬剤と組み合わせた）適用もしくは投与、または患者に由来する単離された組織もしくは細胞株への治療剤の適用もしくは投与(例えば、診断もしくはエクスビボ適用の場合)と定義される。このような治療/処置は、ファーマコゲノミクスの分野から得られた知識に基づいて個別に合わせられてもよく、変更されてもよい。

本明細書で使用する「XLH」という用語は、X連鎖性低リン酸血症、X染色体優性低リン血症性くる病、X連鎖性ビタミンD抵抗性くる病、および/またはX連鎖性低リン血症性くる病を指す。

本明細書で使用する「野生型」という用語は、天然供給源から単離された遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団内で最も頻繁に観察され、従って、任意で、遺伝子の「正常」型または「野生」型だと指定された遺伝子である。対照的に、「改変された」または「変異体」という用語は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に配列および/または機能的特性の改変(すなわち、特徴の変化)を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。天然変異体は単離することができる。これらは、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に特徴の変化(核酸配列の変化を含む)を有するという事実によって特定される。

範囲： 本願全体を通じて、本発明の様々な局面を範囲の形で提示することができる。範囲の形での説明は単なる便宜および簡略のためのものであり、本発明の範囲に対する融通の利かない限定として解釈してはならないことが理解されるはずである。従って、範囲の説明は、可能性のある全ての部分範囲(subrange)ならびにその範囲内にある個々の数値を具体的に開示したとみなされるはずである。例えば、1〜6などの範囲の説明は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの部分範囲、ならびにその範囲内にある個々の数値、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6を具体的に開示したとみなされるはずである。これは範囲の幅に関係なく適用される。

組成物
ある特定の態様では、本発明のポリペプチドは、式(I):エクスポート(EXPORT)-タンパク質(PROTEIN)-Z-ドメイン(DOMAIN)-X-Y(I)を有し、(I)において、エクスポート(EXPORT)は存在しないか、または輸送シグナル配列またはその生物学的に活性な断片であり、タンパク質(PROTEIN)はENPP3の細胞外ドメイン(SEQ ID NO:1)またはその生物学的に活性な断片であり、ドメイン(DOMAIN)はヒトIgG Fcドメインおよびヒトアルブミンドメインからなる群より選択され、XおよびZは独立して存在しないか、または1〜20個のアミノ酸を含むポリペプチドであり、Yは存在しないか、または

からなる群より選択される配列であり、配列中、nはそれぞれの場合に独立して1〜20の整数である。

ある特定の態様では、前記ポリペプチドはENPP3の細胞外ドメイン(SEQ ID NO:1)またはその生物学的に活性な断片(もしくは領域)を含む。

ある特定の態様では、前記ポリペプチドは可溶性である。他の態様では、タンパク質(PROTEIN)またはその変異体のヌクレアーゼドメインは存在しない。さらに他の態様では、エクスポート(EXPORT)は存在しないか、またはSEQ ID NO:2〜5からなる群より選択される。さらに他の態様では、Xは、存在しない、20アミノ酸からなるポリペプチド、19アミノ酸からなるポリペプチド、18アミノ酸からなるポリペプチド、17アミノ酸からなるポリペプチド、16アミノ酸からなるポリペプチド、15アミノ酸からなるポリペプチド、14アミノ酸からなるポリペプチド、13アミノ酸からなるポリペプチド、12アミノ酸からなるポリペプチド、11アミノ酸からなるポリペプチド、10アミノ酸からなるポリペプチド、9アミノ酸からなるポリペプチド、8アミノ酸からなるポリペプチド、7アミノ酸からなるポリペプチド、6アミノ酸からなるポリペプチド、5アミノ酸からなるポリペプチド、4アミノ酸からなるポリペプチド、3アミノ酸からなるポリペプチド、2アミノ酸からなるポリペプチド、および1アミノ酸からなるポリペプチドからなる群より選択される。さらに他の態様では、Zは、存在しない、20アミノ酸からなるポリペプチド、19アミノ酸からなるポリペプチド、18アミノ酸からなるポリペプチド、17アミノ酸からなるポリペプチド、16アミノ酸からなるポリペプチド、15アミノ酸からなるポリペプチド、14アミノ酸からなるポリペプチド、13アミノ酸からなるポリペプチド、12アミノ酸からなるポリペプチド、11アミノ酸からなるポリペプチド、10アミノ酸からなるポリペプチド、9アミノ酸からなるポリペプチド、8アミノ酸からなるポリペプチド、7アミノ酸からなるポリペプチド、6アミノ酸からなるポリペプチド、5アミノ酸からなるポリペプチド、4アミノ酸からなるポリペプチド、3アミノ酸からなるポリペプチド、2アミノ酸からなるポリペプチド、および1アミノ酸からなるポリペプチドからなる群より選択される。

ある特定の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜18個のアミノ酸を含むポリペプチドである。他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜16個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜14個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜12個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜10個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜8個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜6個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜5個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜4個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜3個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜2個のアミノ酸を含むポリペプチドである。さらに他の態様では、XおよびZは、独立して、存在しないか、または1個のアミノ酸である。

ある特定の態様では、ドメイン(DOMAIN)は、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4からなる群より選択されるヒトIgG Fcドメインである。他の態様では、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:19、21、および22からなる群より選択される。さらに他の態様では、ドメイン(DOMAIN)はヒトアルブミンドメインである。さらに他の態様では、前記ポリペプチドはSEQ ID NO:24、25、および26からなる群より選択される。

ある特定の態様では、可溶性ポリペプチドには膜貫通ドメインおよび/またはシグナルペプチドが無い。他の態様では、可溶性ポリペプチドには膜貫通ドメインが無い。さらに他の態様では、可溶性ポリペプチドにはシグナルペプチドが無い。さらに他の態様では、可溶性ポリペプチドには膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドが無い。

ある特定の態様では、前記ポリペプチドはNPP3の可溶性領域(または断片)またはその融合タンパク質を含み、膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドを欠く。他の態様では、前記ポリペプチドはNPP3の可溶性領域を含み、膜貫通ドメインおよび/またはシグナルペプチドを欠く。さらに他の態様では、前記ポリペプチドはNPP3の可溶性領域を含み、膜貫通ドメインを欠く。さらに他の態様では、前記ポリペプチドはNPP3の可溶性領域を含み、シグナルペプチドを欠く。さらに他の態様では、前記ポリペプチドは石灰化および骨化の疾患に罹患している対象に投与されたときに細胞石灰化を低減する。

ある特定の態様では、前記ポリペプチドはSEQ ID NO:1またはその生物学的に活性な断片から本質的になる。他の態様では、前記ポリペプチドはSEQ ID NO:1またはその生物学的に活性な断片からなる。

ある特定の態様では、可溶性ENPP3断片またはその融合タンパク質はENPP3の細胞外ドメイン(SEQ ID NO:1)またはその生物学的に活性な断片を含む。他の態様では、可溶性ENPP3断片はSEQ ID NO:1またはその生物学的に活性な断片から本質的になる。さらに他の態様では、可溶性ENPP3断片はSEQ ID NO:1またはその生物学的に活性な断片からなる。さらに他の態様では、可溶性ENPP3断片またはその融合タンパク質には膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドが無い。

ある特定の態様では、本発明のポリペプチドは可溶性である。他の態様では、本発明のポリペプチドは組換えポリペプチドである。さらに他の態様では、さらに、本発明のポリペプチドはペグ化されている。

方法
本発明は、病的石灰化または病的骨化に関連する疾患または障害の治療または予防を必要とする対象において、病的石灰化または病的骨化に関連する疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。さらに、本発明は、血漿中ピロリン酸(PPi)が少ないかまたは血清中リン酸(Pi)が多い対象において血管石灰化を低減または予防する方法を提供する。さらに、本発明は、NPP1欠損症またはNPP1関連疾患を有する対象を治療する方法を提供する。さらに、本発明は、ENPP3ポリペプチド、その断片、誘導体、変異体、または変異体断片の活性またはレベルの増加が望ましい対象において障害および疾患を治療または予防する方法を提供する。

ある特定の態様では、対象には、治療的有効量の少なくとも1種類の本発明のポリペプチドが投与される。他の態様では、前記方法は、治療的有効量の単離された組換えヒト可溶性ENPP3断片またはその融合タンパク質を対象に投与する工程を含む。

ある特定の態様では、疾患または障害は、GACI、IIAC、PXE、OPLL、低リン血症性くる病、変形性関節症、アテローム性動脈硬化巣の石灰化、遺伝性および非遺伝性の変形性関節症、強直性脊椎炎、加齢に伴う動脈硬化、ならびに末期腎臓病に起因するカルシフィラキシー(または慢性腎臓病に伴う骨ミネラル代謝異常)からなる群より選択される少なくとも1つを含む。

ある特定の態様では、疾患または障害は、GACI、IIAC、PXE、OPLL、MWVC、ARHR2、ESRD、CKD-MBD、XLH、加齢性骨減少症、CUA、および低リン血症性くる病からなる群より選択される少なくとも1つを含む。

ある特定の態様では、疾患または障害はGACIである。他の態様では、疾患または障害はIIACである。さらに他の態様では、疾患または障害はPXEである。さらに他の態様では、疾患または障害はOPLLである。さらに他の態様では、疾患または障害は低リン血症性くる病である。さらに他の態様では、疾患または障害は変形性関節症である。さらに他の態様では、疾患または障害はアテローム性動脈硬化巣の石灰化である。さらに他の態様では、疾患または障害は遺伝性および非遺伝性の変形性関節症である。さらに他の態様では、疾患または障害は強直性脊椎炎である。さらに他の態様では、疾患または障害は、加齢に伴う動脈硬化である。さらに他の態様では、疾患または障害は、末期腎臓病に起因するカルシフィラキシー(または慢性腎臓病に伴う骨ミネラル代謝異常)である。さらに他の態様では、疾患または障害は加齢性骨減少症である。さらに他の態様では、疾患または障害はCUAである。さらに他の態様では、疾患または障害はMWVCである。さらに他の態様では、疾患または障害はARHR2である。さらに他の態様では、疾患または障害はESRDである。

ある特定の態様では、少なくとも1種類のポリペプチドは対象に短期または長期にわたって投与される。他の態様では、少なくとも1種類のポリペプチドは対象に局所投与、局部投与、または全身投与される。さらに他の態様では、対象は哺乳動物である。さらに他の態様では、哺乳動物はヒトである。

ある特定の態様では、前記投与される量（前記量の投与）は、対象における血漿中PPiレベルを少なくとも約250nMまで上昇させる。他の態様では、前記投与される量（前記量の投与）は、対象における血漿中PPiレベルを少なくとも約500nMまで上昇させる。さらに他の態様では、前記投与される量（前記量の投与）は、対象における血漿中PPiレベルを少なくとも約800nMまで上昇させる。さらに他の態様では、前記投与される量（前記量の投与）は、対象における血漿中PPiレベルを少なくとも約900nMまで上昇させる。さらに他の態様では、前記投与される量（前記量の投与）は、対象における血漿中PPiレベルを少なくとも約1μMまで上昇させる。さらに他の態様では、前記投与される量（前記量の投与）は、対象における血漿中PPiレベルを少なくとも約1.2μMまで上昇させる。さらに他の態様では、前記投与される量（前記量の投与）は、対象における血漿中PPiレベルを少なくとも約1.4μMまで上昇させる。さらに他の態様では、前記投与される量（前記量の投与）は、対象における血漿中PPiレベルを少なくとも約1.5μMまで上昇させる。ある特定の態様では、前記投与される量（前記量の投与）は、対象における血漿中PPiレベルを少なくとも約2μMまで上昇させる。ある特定の態様では、前記投与される量（前記量の投与）は、対象における血漿中PPiレベルを少なくとも約4μMまで上昇させる。

当業者は、本明細書において提供される開示に基づいて、本発明が、病的石灰化または病的骨化に対して全部(例えば、全身)または一部(例えば、局所、組織、臓器)が治療されているか、または治療されることになっている対象において有用なことを理解するだろう。ある特定の態様では、本発明は、病的石灰化または病的骨化の治療または予防において有用である。当業者は、本明細書において提供される教示に基づいて、本明細書に記載の組成物および方法によって治療可能な疾患および障害が、石灰化または骨化の減少が正の治療アウトカムを促進する任意の疾患または障害を包含することを認める。

本明細書において詳述される方法を含む本開示を得た場合に、本発明は、確立されたら疾患の治療にも障害の治療にも限定されないことが当業者によって認められる。特に、疾患または障害の症状は対象を害する程度まで現れている必要はない。実際に、治療剤が投与される前に、疾患または障害は対象において検出される必要はない。すなわち、本発明が利益を与える可能性がある前に、疾患または障害による目立った病状が生じる必要はない。従って、本明細書の他の場所で議論されるように、本発明のポリペプチドまたはその変異体は、疾患または障害が発症する前に対象に投与することができ、それによって、疾患または障害が発症しないようにすることができるので、本発明は、本明細書においてさらに完全に説明されるように、対象において疾患および障害を予防するための方法を含む。

本明細書における開示を得た場合に、当業者は、対象における疾患または障害の予防が、疾患または障害に対する予防的措置として本発明のポリペプチドまたはその変異体を対象に投与する工程を包含することを認めるだろう。

本発明は、本発明の方法を実施するための本発明のポリペプチドまたはその変異体の投与を包含する。当業者は、本明細書において提供される開示に基づいて、本発明のポリペプチドまたはその変異体を処方し、対象に投与するやり方を理解するだろう。しかしながら、本発明は、任意の特定の投与方法にも治療レジメンにも限定されない。このことは、当技術分野において認められている病的石灰化または病的骨化のモデルを用いた具体化(reduction to practice)を含む本明細書において提供される開示が授けられた場合に、本発明の化合物を投与する方法が薬理学分野の当業者によって決定できることが当業者によって認められる場合に特に当てはまる。

薬学的組成物および製剤
本発明は、本発明のポリペプチドを含む薬学的組成物を本発明の方法において使用することを企図する。

このような薬学的組成物は対象への投与に適した形をとる。または、薬学的組成物は、1種類もしくは複数種の薬学的に許容される担体、1種類もしくは複数種のさらなる成分、またはこれらの何らかの組み合わせをさらに含んでもよい。薬学的組成物の様々な成分は、当技術分野において周知のように、生理学的に許容される塩の形で、例えば、生理学的に許容されるカチオンまたはアニオンと組み合わせて存在してもよい。

特定の態様において、本発明の方法を実施するのに有用な薬学的組成物は、1ng/kg/day〜100mg/kg/dayの用量を送達するために投与されてもよい。他の態様では、本発明を実施するのに有用な薬学的組成物は1ng/kg/day〜500mg/kg/dayの用量を送達するために投与されてもよい。

本発明の薬学的組成物中にある活性成分、薬学的に許容される担体、および任意のさらなる成分の相対量は、処置される対象の身元(identity)、大きさ、および状態に応じて、さらには、組成物が投与される経路に応じて変化する。例として、前記組成物は約0.1％〜約100％(w/w)の活性成分を含んでもよい。

本発明の方法において有用な薬学的組成物は、投与の吸入経路用、経口経路用、直腸経路用、腟経路用、非経口経路用、局所経路用、経皮経路用、肺経路用、鼻腔内経路用、頬経路用、眼経路用、くも膜下腔内経路用、静脈内経路用、または別の経路用に適宜、開発されてもよい。他の意図される製剤は、射出されるナノ粒子、リポソーム調製物、活性成分を含有する再封入された赤血球、および免疫に基づく製剤を含む。投与経路は当業者に容易に明らかであり、治療される疾患のタイプおよび重篤度、治療される獣医学患畜またはヒト患者のタイプおよび年齢などを含む任意の数の要因に左右される。

本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、薬理学の分野において公知の任意の方法によって調製されてもよく、薬理学の分野において将来開発される任意の方法によって調製されてもよい。一般的に、このような準備方法は、活性成分を担体または1種類もしくは複数種の他のアクセサリー成分と結合させる工程、次いで、必要であれば、または所望であれば、生成物を望ましい単回投与単位または多回（複数回）投与単位に成型または包装する工程を含む。

本明細書で使用する「単位用量」とは、活性成分の予め決められた量を含む、薬学的組成物の別々の量である。活性成分の量は、一般的に、対象に投与される活性成分の投与量に等しいか、またはこのような投与量の便利な一部分、例えば、このような投与量の1/2もしくは1/3である。単位剤形は単回一日量用の単位剤形でもよく、複数回一日量(例えば、1日につき約1〜4回またはそれより多い回数)のうちの1つの単位剤形でもよい。複数回一日量が用いられる場合、単位剤形は各用量について同じでもよく異なってもよい。

本明細書において提供される薬学的組成物の説明は、主に、ヒトへの倫理的投与に適した薬学的組成物に向けられるが、このような組成物は、一般的に、全種類の動物に投与するのに適していることが当業者に理解される。組成物を様々な動物に投与するのに適するようにするために、ヒトに投与するのに適した薬学的組成物を改良することは良く理解されており、通常の知識を有する獣医薬理学者(veterinary pharmacologist)が、もしあれば普通の実験だけで、このような改良を設計および実施することができる。本発明の薬学的組成物の投与が意図される対象には、ヒトおよび他の霊長類、商業的に関連する哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、およびイヌを含む哺乳動物が含まれるが、これに限定されない。

ある特定の態様では、前記組成物は、1種類または複数種の薬学的に許容される賦形剤または担体を用いて処方される。ある特定の態様では、薬学的組成物は、活性薬剤の治療的有効量と、薬学的に許容される担体を含む。有用な薬学的に許容される担体には、グリセロール、水、食塩水、エタノール、ならびに他の薬学的に許容される塩溶液、例えば、リン酸塩および有機酸の塩が含まれるが、これに限定されない。これらの、および他の薬学的に許容される担体の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 1991, Mack Publication Co., New Jerseyに記載されている。

担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、その適切な混合物、ならびに植物油を含有する溶媒または分散媒でもよい。例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合では必要とされる粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって適切な流動性を維持することができる。微生物の活動は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって阻止することができる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム、または多価アルコール、例えば、マンニトールおよびソルビトールが含まれることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによって可能になる。

製剤は、従来の賦形剤、すなわち、当業者に公知の経口投与、非経口投与、鼻投与、静脈内投与、皮下投与、経腸投与、または他の任意の適切な投与方法に適した、薬学的に許容される有機担体物質または無機担体物質と混合して用いられてもよい。薬学的調製物は滅菌されてもよく、所望であれば、補助剤、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝液、着色物質、着香物質、および/または芳香物質などと混合されてもよい。これらは、所望の場合、他の活性薬剤、例えば、他の鎮痛剤と組み合わされてもよい。

本明細書で使用する「さらなる成分」には、以下:賦形剤;界面活性剤;分散剤;不活性希釈剤;造粒剤および崩壊剤;結合剤;潤滑剤;甘味剤;着香剤;着色剤;防腐剤;生理学的に分解性の組成物、例えば、ゼラチン;水性のビヒクルおよび溶媒;油性のビヒクルおよび溶媒;懸濁剤;分散剤または湿潤剤;乳化剤、粘滑薬;緩衝液;塩;増粘剤;増量剤;乳化剤;酸化防止剤;抗生物質;抗真菌剤;安定剤;ならびに薬学的に許容されるポリマー材料または疎水性材料の1つまたは複数が含まれるが、これに限定されない。本発明の薬学的組成物において含まれ得る他の「さらなる成分」は当技術分野において公知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Genaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PAに記載されている。

本発明の組成物は、組成物の総重量に対して約0.005％〜2.0％の防腐剤を含んでもよい。防腐剤は、環境にある汚染物質に曝露された場合に劣化するのを防ぐために用いられる。本発明に従って有用な防腐剤の例には、ベンジルアルコール、ソルビン酸、パラベン、イミドウレア(imidurea)、およびその組み合わせからなる群より選択される防腐剤が含まれるが、これに限定されない。特に好ましい防腐剤は、約0.5％〜2.0％のベンジルアルコールと0.05％〜0.5％のソルビン酸の組み合わせである。

前記組成物は好ましくは、化合物の分解を阻害する抗酸化物質およびキレート剤を含む。一部の化合物のための好ましい抗酸化物質は、組成物の総重量に対して約0.01重量％〜0.3重量％の好ましい範囲にあるBHT、BHA、α-トコフェロール、およびアスコルビン酸、より好ましくは0.03重量％〜0.1重量％の範囲にあるBHTである。好ましくは、キレート剤は、組成物の総重量に対して0.01重量％〜0.5重量％の量で存在する。特に好ましいキレート剤には、組成物の総重量に対して約0.01重量％〜0.20重量％の重量範囲にある、より好ましくは0.02重量％〜0.10重量％の範囲にある、エデト酸塩(例えば、エデト酸二ナトリウム)およびクエン酸が含まれる。キレート剤は、製剤の貯蔵寿命に有害な場合がある、組成物中にある金属イオンをキレート化するのに有用である。BHTおよびエデト酸二ナトリウムが、それぞれ、一部の化合物のための特に好ましい抗酸化物質およびキレート剤であるが、他の適切で等価な抗酸化物質およびキレート剤が、当業者に公知のように代用されてもよい。

液体懸濁液は、活性成分を水性または油性のビヒクルに懸濁する従来の方法を用いて調製することができる。水性ビヒクルには、例えば、水および等張性食塩水が含まれる。油性ビヒクルには、例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、植物油、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、またはヤシ油、分留した植物油、および鉱油、例えば、流動パラフィンが含まれる。液体懸濁液は、懸濁剤、分散剤または湿潤剤、乳化剤、粘滑薬、防腐剤、緩衝液、塩、香料、着色剤、および甘味剤を含むが、これに限定されない1種類または複数種のさらなる成分をさらに含んでもよい。油性懸濁液は増粘剤をさらに含んでもよい。公知の懸濁剤には、ソルビトールシロップ、水素添加された食用脂、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アラビアゴム、およびセルロース誘導体(例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース)が含まれるが、これに限定されない。公知の分散剤または湿潤剤には、天然のホスファチド、例えば、レシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物、アルキレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、アルキレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、またはアルキレンオキシドと、脂肪酸とヘキシトール無水物に由来する部分エステルとの縮合生成物(例えば、それぞれ、ポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール(heptadecaethyleneoxycetanol)、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート)が含まれるが、これに限定されない。公知の乳化剤にはレシチンおよびアラビアゴムが含まれるが、これに限定されない。公知の防腐剤には、パラヒドロキシ安息香酸メチル、パラヒドロキシ安息香酸エチル、またはパラヒドロキシ安息香酸n-プロピル、アスコルビン酸、およびソルビン酸が含まれるが、これに限定されない。公知の甘味剤には、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロース、およびサッカリンが含まれる。油性懸濁液用の公知の増粘剤には、例えば、蜜ろう、固形パラフィン、およびセチルアルコールが含まれる。

水性溶媒または油性溶媒に溶解した活性成分の液体溶液は、液体懸濁液と実質的に同じやり方で調製することができ、主な違いは、活性成分が溶媒に懸濁されるのではなく溶解されることである。本明細書で使用する「油性」液体とは、炭素を含有する液体分子を含み、水より極性の低い特徴を示す液体である。本発明の薬学的組成物の液体溶液は、液体懸濁液について述べられた各成分を含んでもよく、懸濁剤は、必ずしも、活性成分を溶媒に溶解するのを助けるというわけではないと理解される。水性溶媒には、例えば、水および等張性食塩水が含まれる。油性溶媒には、例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、植物油、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、またはヤシ油、分留した植物油、および鉱油、例えば、流動パラフィンが含まれる。

本発明の薬学的組成物の粉末状および顆粒状の製剤は公知の方法を用いて調製することができる。このような製剤は、直接、対象に投与されてもよく、例えば、錠剤を形成するのに、カプセルを充填するのに、または水性もしくは油性のビヒクルを添加することによって水性もしくは油性の懸濁液もしくは溶液を調製するのに使用されてもよい。これらの製剤はそれぞれ、分散剤または湿潤剤、懸濁剤、および防腐剤の1つまたは複数をさらに含んでもよい。これらの製剤には、増量剤および甘味剤、香料、または着色剤などの、さらなる賦形剤も含まれてもよい。

本発明の薬学的組成物はまた、水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョンの形で調製、包装、または販売されてもよい。油相は、植物油、例えば、オリーブ油もしくは落花生油、鉱油、例えば、流動パラフィン、またはこれらの組み合わせでもよい。このような組成物は、1種類または複数種の乳化剤、例えば、天然ゴム、例えば、アラビアゴムまたはトラガカントゴム、天然ホスファチド、例えば、ダイズホスファチドまたはレシチンホスファチド、脂肪酸とヘキシトール無水物の組み合わせに由来するエステルまたは部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレエート、およびこのような部分エステルと酸化エチレンの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートをさらに含んでもよい。これらのエマルジョンはまた、例えば、甘味剤または着香剤を含む、さらなる成分を含有してもよい。

材料を化学的組成物で含浸する、またはコーティングさせるための方法は当技術分野において公知であり、化学的組成物を表面に付着または結合する方法、材料の合成中に(すなわち、例えば、生理学的に分解性の材料と共に)化学的組成物を材料の構造に組み入れる方法、および後で乾燥させて、または後で乾燥させることなく、水性または油性の溶液または懸濁液を吸収材料に吸収させる方法を含むが、これに限定されない。

投与/投薬
投与計画は、有効量を構成するものに影響を及ぼす可能性がある。例えば、いくつかの分割投与量ならびに時間をずらした(staggered)投与量が毎日または連続して投与されてもよい。または、用量は連続注入されてもよく、ボーラス注射でもよい。さらに、治療状況または予防状況の切迫した要件により示されるように、治療用製剤の投与量は比例して増やしてもよく減らしてもよい。

本発明の組成物は、公知の手順を用いて、患者にある疾患または障害を治療するのに有効な投与量および期間で、患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトに投与することができる。治療効果を実現するのに必要な治療用化合物の有効量は、使用される特定の化合物の活性、投与時間、化合物の排出速度、処置期間、化合物と併用される他の薬物、化合物、または材料、疾患または障害の状態、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、身体全体の健康、および前病歴などの要因、ならびに医学分野において周知の同様の要因に従って変化することがある。最適な治療応答を提供するように投与計画が調整されてもよい。例えば、いくつかの分割量が毎日投与されてもよい。または、治療状況の切迫した要件により示されるように用量が比例して減らされてもよい。本発明の治療用化合物の有効な用量範囲の非限定的な例は約0.01〜50mg/体重kg/日である。当業者であれば、関連する要因を研究し、過度の実験なく治療用化合物の有効量に関する決定を下すことができるだろう。

前記化合物は、1日に数回もの頻度で動物に投与されてもよく、1日に1回、1週間に1回、2週間に1回、1ヶ月に1回などのもっと少ない頻度で、あるいは数ヶ月に1回もしくは1年に1回、またはそれ未満などのさらにもっと少ない頻度で投与されてもよい。1日あたりに投薬される量の化合物は、非限定的な例では、毎日、1日おきに、2日ごとに、3日ごとに、4日ごとに、または5日ごとに投与されてもよいことが理解される。例えば、1日おきに投与する場合、月曜日に1日あたり5mgの用量が開始し、水曜日に、その後の1日あたり5mgの第1の用量が投与され、金曜日に、その後の1日あたり5mgの第2の用量が投与されてもよい。投薬の頻度は当業者に容易に明らかであり、治療される疾患のタイプおよび重篤度ならびに動物のタイプおよび年齢などがあるが、これに限定されない任意の数の要因に左右される。

本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者への毒性が無く、特定の患者、組成物、および投与方法について望ましい治療応答を実現するのに有効な活性成分の量を得るように変えられてもよい。

当技術分野において通常の知識を有する医師(medical doctor)、例えば、医師(physician)または獣医師は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に決定し、薬学的組成物の有効量を処方することができる。例えば、医師または獣医師は、望ましい治療効果を実現するために必要なレベルより少ないレベルで、薬学的組成物において用いられる本発明の化合物の投薬を開始し、望ましい効果が実現するまで投与量を除去に増やすことができるだろう。

特定の態様では、投与を容易にするために、および投与量を均一にするために化合物を単位剤形で処方することが特に有利である。本明細書で使用する単位剤形とは、処置しようとする患者への単位投与として適した物理的に別個の単位を指す。それぞれの単位は、必要とされる薬学的ビヒクルに結合して望ましい治療効果を生じるように計算された所定量の治療用化合物を含有する。本発明の単位剤形は、(a)治療用化合物の独特の特徴と、実現しようとする特定の治療効果と、(b)患者にある疾患または障害を治療するために、このような治療用化合物を配合/処方する分野に固有にある制約によって決められ、かつこれらに直接左右される。

ある特定の態様では、本発明の組成物は、1日に1〜5回またはそれより多い投薬で患者に投与される。他の態様では、本発明の組成物は、1日1回、2日に1回、3日に1回から1週間に1回、および2週間に1回を含むが、これに限定されない投薬の範囲で患者に投与される。年齢、治療される疾患または障害、性別、健康全般、および他の要因を含むが、これに限定されない多くの要因に応じて、本発明の様々な組み合わせ組成物の投与の頻度が対象ごとに異なることは当業者に容易に明らかである。従って、本発明は、任意の特定の投与計画に限定されると解釈してはならず、任意の患者に投与される正確な投与量および組成物は、患者についての他の全ての要因を考慮に入れて、主治医によって決定される。

投与用の本発明の化合物は、約1μg〜約7,500mg、約20μg〜約7,000mg、約40μg〜約6,500mg、約80μg〜約6,000mg、約100μg〜約5,500mg、約200μg〜約5,000mg、約400μg〜約4,000mg、約800μg〜約3,000mg、約1mg〜約2,500mg、約2mg〜約2,000mg、約5mg〜約1,000mg、約10mg〜約750mg、約20mg〜約600mg、約30mg〜約500mg、約40mg〜約400mg、約50mg〜約300mg、約60mg〜約250mg、約70mg〜約200mg、約80mg〜約150mg、ならびにその間の任意の、および全ての全増加分または部分的な増加分の範囲でもよい。

一部の態様では、本発明の化合物の用量は約0.5μg〜約5,000mgである。一部の態様では、本明細書に記載の組成物において用いられる本発明の化合物の用量は、約5,000mg未満、または約4,000mg未満、または約3,000mg未満、または約2,000mg未満、または約1,000mg未満、または約800mg未満、または約600mg未満、または約500mg未満、または約200mg未満、または約50mg未満である。同様に、一部の態様では、本明細書に記載の第2の化合物の用量は、約1,000mg未満、または約800mg未満、または約600mg未満、または約500mg未満、または約400mg未満、または約300mg未満、または約200mg未満、または約100mg未満、または約50mg未満、または約40mg未満、または約30mg未満、または約25mg未満、または約20mg未満、または約15mg未満、または約10mg未満、または約5mg未満、または約2mg未満、または約1mg未満、または約0.5mg未満、ならびにその任意の、および全ての全増加分または部分的な増加分である。

ある特定の態様では、本発明は、単独で、または第2の薬学的薬剤と組み合わせて、本発明の化合物の治療的有効量を収容するための容器と、患者において疾患または障害の1つまたは複数の症状を治療、予防、または低減するために前記化合物を使用するための説明書を備える、包装された薬学的組成物に関する。

「容器」という用語は、薬学的組成物を収容するための任意の入れ物を含む。例えば、ある特定の態様では、容器は、薬学的組成物を収める包装容器である。他の態様では、容器は、薬学的組成物を収める包装容器でない。すなわち、容器は、包装された薬学的組成物または包装されていない薬学的組成物と、薬学的組成物を使用するための説明書を収める入れ物、例えば、箱またはバイアルである。さらに、包装する技法は当技術分野において周知である。薬学的組成物を使用するための説明書は、薬学的組成物を収める包装容器の表面に収められてもよいことが理解されるはずである。従って、説明書は、包装された製品と増大した機能的関係を築く。しかしながら、説明書は、化合物が、意図された機能、例えば、患者における疾患または障害の治療、予防、または低減を果たす能力に関する情報を収めてもよいことが理解されるはずである。

投与経路
本発明の任意の組成物の投与経路には、吸入投与、経口投与、鼻投与、直腸投与、非経口投与、舌下投与、経皮投与、経粘膜投与(例えば、舌下投与、舌投与、(経)頬投与、(経)尿道投与、腟投与(例えば、経腟投与および膣周囲投与)、鼻(鼻腔内)投与、ならびに(経)直腸投与)、膀胱内投与、肺内投与、十二指腸内投与、胃内投与、くも膜下腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、動脈内投与、静脈内投与、気管支内投与、吸入投与、ならびに局所投与が含まれる。

適切な組成物および剤形には、例えば、錠剤、カプセル、カプレット、丸剤、ゲルキャップ(gel cap)、トローチ、分散液、懸濁液、溶液、シロップ、顆粒、ビーズ、経皮パッチ、ゲル、散剤、ペレット、マグマ剤、ロゼンジ、クリーム、パスタ剤、硬膏剤、ローション剤、ディスク(disc)、坐剤、鼻投与用または経口投与用の液体スプレー、吸入用の乾燥粉末またはエアロゾル化製剤、膀胱内投与用の組成物および製剤などが含まれる。本発明において有用な製剤および組成物は、本明細書に記載の特定の製剤および組成物に限定されないことが理解されるはずである。

経口投与
経口適用の場合、錠剤、糖衣錠、液体、ドロップ、坐剤、またはカプセル、カプレットおよびゲルキャップが特に適している。経口投与に適した他の製剤には、粉末状もしくは顆粒状の製剤、水性もしくは油性の懸濁液、水性もしくは油性の溶液、パスタ剤、ゲル、練り歯磨き、口腔洗浄薬、コーティング、オーラルリンス(oral rinse)、またはエマルジョンが含まれるが、これに限定されない。経口使用を目的とした組成物は、当技術分野において公知の任意の方法に従って調製することができ、このような組成物は、錠剤の製造に適した不活性な無毒の薬学的賦形剤からなる群より選択される1種類または複数種の薬剤を含有してもよい。このような賦形剤には、例えば、不活性希釈剤、例えば、ラクトース;造粒剤および崩壊剤、例えば、コーンスターチ;結合剤、例えば、デンプン;ならびに潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムが含まれる。

錠剤はコーティングされなくてもよく、対象の胃腸管内での崩壊を遅らせ、それによって、活性成分を持続的に放出および吸収するように公知の方法を用いてコーティングされてもよい。例として、錠剤をコーティングするために、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどの材料が用いられてもよい。さらに、例として、錠剤は、浸透圧により制御される放出錠剤を形成するために、米国特許第4,256,108号;同第4,160,452号;および同第4,265,874号に記載の方法を用いてコーティングされてもよい。錠剤は、薬学的にすばらしく、かつ味のよい調製物を提供するために、甘味剤、着香剤、着色剤、防腐剤、またはこれらの何らかの組み合わせをさらに含んでもよい。

活性成分を含む硬カプセルは、ゼラチンなどの生理学的に分解性の組成物を用いて作られてもよい。このような硬カプセルは活性成分を含み、例えば、不活性な固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリンを含む、さらなる成分をさらに含んでもよい。

活性成分を含む軟ゼラチンカプセルは、ゼラチンなどの生理学的に分解性の組成物を用いて作られてもよい。このような軟カプセルは活性成分を含み、活性成分は、水または油媒体、例えば、ピーナッツ油、流動パラフィン、またはオリーブ油と混合されてもよい。

経口投与の場合、本発明の化合物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、結合剤;増量剤;潤滑剤;崩壊剤;または湿潤剤を用いて従来の手段によって調製された錠剤またはカプセルの形をとってもよい。所望であれば、錠剤は、適切な方法およびコーティング材料、例えば、Colorcon, West Point,Paから入手可能なOPADRY(商標)フィルムコーティングシステム(例えば、OPADRY(商標) OY Type, OYC Type, Organic Enteric OY-P Type, Aqueous Enteric OY-A Type, OY-PM TypeおよびOPADRY(商標) White, 32K18400)を用いてコーティングされてもよい。

経口投与用の液体調製物は溶液、シロップ、または懸濁液の形をとってもよい。液体調製物は、薬学的に許容される添加物、例えば、懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、または水素添加された食用脂);乳化剤(例えば、レシチンまたはアラビアゴム);非水性ビヒクル(例えば、扁桃油、油性エステル、またはエチルアルコール);および防腐剤(例えば、パラヒドロキシ安息香酸メチルもしくはパラヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸)を用いて従来の手段によって調製されてもよい。経口投与に適した本発明の薬学的組成物の液体製剤は、液体の形で、または使用前に水もしくは別の適切なビヒクルで再構成することを目的とした乾燥製品の形で調製、包装、または販売されてもよい。

活性成分を含む錠剤は、例えば、任意で、1種類または複数種のさらなる成分と共に、活性成分を圧縮または成型することによって作られてもよい。散剤または顆粒状調製物などの自由に流動することができる形をした活性成分を、任意で、結合剤、潤滑剤、賦形剤、界面活性剤、および分散剤の1つまたは複数と混合して適切な機械の中で圧縮することによって圧縮錠が調製されてもよい。活性成分と、薬学的に許容される担体と、少なくとも、混合物を湿らせるのに十分な液体の混合物を適切な機械の中で成型することによって湿製錠が作られてもよい。錠剤の製造において用いられる薬学的に許容される賦形剤には、不活性な希釈剤、造粒剤および崩壊剤、結合剤、ならびに潤滑剤が含まれるが、これに限定されない。公知の分散剤には、バレイショデンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウムが含まれるが、これに限定されない。公知の界面活性剤にはラウリル硫酸ナトリウムが含まれるが、これに限定されない。公知の希釈剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、結晶セルロース、リン酸カルシウム、リン酸一水素カルシウム、およびリン酸ナトリウムが含まれるが、これに限定されない。公知の造粒剤および崩壊剤にはトウモロコシデンプンおよびアルギン酸が含まれるが、これに限定されない。公知の結合剤には、ゼラチン、アラビアゴム、予め糊化した(pre-gelatinized)トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースが含まれるが、これに限定されない。公知の潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカ、およびタルクが含まれるが、これに限定されない。

活性成分の出発粉末または他の粒子状物質を改変するために造粒法が薬学分野において周知である。この粉末は典型的には結合剤材料と混合されて、「造粒」と呼ばれる、さらに大きな、長持ちのする、自由に流動することができる集塊物または顆粒になる。例えば、溶媒を用いた「湿式」造粒プロセスは、一般的に、粉末を結合剤材料と混合し、湿った粒状塊を形成する条件下で水または有機溶媒で湿らし、次いで、湿った粒状塊から溶媒を蒸発させなければならない点を特徴とする。

一般的に、溶融造粒は、本質的に、添加される水または他の液体溶媒の非存在下で、粉末状材料または他の材料の造粒を促進するために、室温で固体または半固体の(すなわち、比較的低い軟化点または融点範囲を有する)材料を使用することにある。低融点固体は融点範囲の温度まで加熱されると液化して結合剤または造粒媒体として働く。液化した固体は、そのままで、接触している粉末状材料の表面に広がり、冷却されると、初期材料が結び付けられた固体の粒状塊を形成する。次いで、結果として生じた溶融造粒は打錠機に供給されてもよく、経口剤形を調製するためにカプセルに入れられてもよい。溶融造粒は、固体分散体(solid dispersion)または固溶体(solid solution)を形成することによって活性成分(すなわち、薬物)の溶出速度およびバイオアベイラビリティを改善する。

米国特許第5,169,645号は、改善された流動特性を有する、直接圧縮可能な、ろう含有顆粒を開示する。ろうが溶解状態で、ある特定の流動改善添加物と混合され、その後に、混合物の冷却と造粒が行われた場合に、顆粒が得られる。ある特定の態様では、ろうそれ自体は、ろうと添加物を溶融して組み合わせた場合にしか溶融せず、他の場合では、ろうと添加物は両方とも溶融する。

本発明はまた、本発明の方法において有用な1種類または複数種の化合物を遅延放出する層と、本発明の方法において有用な1種類または複数種の化合物を即時放出するさらなる層を含む多層錠剤を含む。ろう/pH感受性ポリマー混合物を用いて、活性成分を閉じ込めて、活性成分の遅延放出を確かなものにする、胃の中で不溶性の組成物を得ることができる。

非経口投与
本明細書で使用する、薬学的組成物の「非経口投与」は、対象の組織に物理的に穴を作り、組織にある穴を通して薬学的組成物を投与することを特徴とする任意の投与経路を含む。従って、非経口投与には、薬学的組成物の注射、外科的切開部を通した薬学的組成物の適用、組織を貫通する非外科的創傷を通した薬学的組成物の適用などによる薬学的組成物の投与が含まれるが、これに限定されない。特に、非経口投与は、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、胸骨内注射、および腎臓透析注入法を含むが、これに限定されないことが意図される。

非経口投与に適した薬学的組成物の製剤は、薬学的に許容される担体、例えば、滅菌水または滅菌した等張性食塩水と組み合わされた活性成分を含む。このような製剤は、大量瞬時投与または連続投与に適した形で調製、包装、または販売されてもよい。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、アンプルに入れられて、または防腐剤を含有する多回投与容器に入れられて調製、包装、または販売されてもよい。非経口投与用の製剤には、懸濁液、溶液、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルに溶解したエマルジョン、パスタ剤、および移植可能な持続放出製剤または生分解性製剤が含まれるが、これに限定されない。このような製剤は、懸濁剤、安定剤、または分散剤を含むが、これに限定されない1種類または複数種のさらなる成分をさらに含んでもよい。非経口投与用の製剤の一態様において、再構成された組成物を非経口投与する前に適切なビヒクル(例えば、滅菌した、発熱物質を含まない水)を用いて再構成するために、活性成分は乾燥した形(すなわち、粉末状または顆粒状)で提供される。

薬学的組成物は、滅菌した注射用の水性または油性の懸濁液または溶液の形で調製、包装、または販売されてもよい。この懸濁液または溶液は公知の技術に従って処方されてもよく、活性成分に加えて、本明細書に記載の分散剤、湿潤剤、または懸濁剤などの、さらなる成分を含んでもよい。このような滅菌した注射用製剤は、無毒の非経口的に許容される希釈剤または溶媒、例えば、水または1,3-ブタンジオールを用いて調製されてもよい。他の許容される希釈剤および溶媒には、リンガー液、等張性塩化ナトリウム溶液、および不揮発性油、例えば、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドが含まれるが、これに限定されない。有用な他の非経口(parentally)投与可能な製剤には、微結晶の形をとるか、リポソーム調製物に入れられているか、または生分解性ポリマー系の成分として活性成分を含む製剤が含まれる。持続放出または移植のための組成物は、薬学的に許容されるポリマー材料または疎水性材料、例えば、エマルジョン、イオン交換樹脂、やや溶けにくいポリマー、またはやや溶けにくい塩を含んでもよい。

さらなる投与形態
本発明のさらなる剤形には、米国特許第6,340,475号、同第6,488,962号、同第6,451,808号、同第5,972,389号、同第5,582,837号、および同第5,007,790号に記載の剤形が含まれる。本発明のさらなる剤形はまた、米国特許出願第20030147952号、同第20030104062号、同第20030104053号、同第20030044466号、同第20030039688号、および同第20020051820号に記載の剤形も含む。本発明のさらなる剤形はまた、PCT出願番号WO03/35041、WO03/35040、WO03/35029、WO03/35177、WO03/35039、WO02/96404、WO02/32416、WO01/97783、WO01/56544、WO01/32217、WO98/55107、WO98/11879、WO97/47285、WO93/18755、およびWO90/11757に記載の剤形も含む。

徐放製剤および薬物送達系
本発明の薬学的組成物の徐放製剤または持続放出製剤は従来の技術を用いて作製することができる。場合によっては、使用される剤形は、例えば、望ましい放出プロファイルを提供するために、比率の異なる、ヒドロプロピルメチル(hydropropylmethyl)セルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透析膜、浸透圧系、多層コーティング、微粒子、リポソーム、もしくはマイクロスフェア、またはその組み合わせを用いて、その中にある1種類または複数種の活性成分をゆっくりと放出するか、または徐放するものとして提供することができる。本明細書に記載の徐放製剤を含む、当業者に公知の適切な徐放製剤は、本発明の薬学的組成物と共に使用するために容易に選択することができる。従って、徐放用に合わせられた、経口投与に適した単一単位剤形、例えば、錠剤、カプセル、ゲルキャップ、およびカプレットが本発明に含まれる。

ほとんどの徐放薬学的製品には、制御されていない対応物よって成し遂げられるものよりも薬物療法を改善するという共通の目標がある。理想的には、医学的処置における、最適に設計された徐放調製物の使用は、最短時間で状態を治すか、または管理するために最小量の原薬が用いられることを特徴とする。徐放製剤の利点には、薬物活性が長期間にわたること、投与頻度が少ないこと、および患者コンプライアンスが高いことが含まれる。さらに、徐放製剤は、作用の開始時間または他の特徴、例えば、薬物の血中濃度に影響を及ぼすのに使用することができ、従って、副作用の発生に影響を及ぼすことができる。

ほとんどの徐放製剤は、最初に、望ましい治療効果を迅速に生じる量の薬物を放出し、このレベルの治療効果を長期間にわたって維持する他の量の薬物を徐々に、かつ継続して放出するように設計される。体内で、この一定の薬物レベルを維持するためには、身体から代謝および排泄される薬物の量の代わりを補う速度で、剤形から薬物を放出しなければならない。

活性成分の徐放は、様々な誘導因子、例えば、pH、温度、酵素、水、または他の生理状態もしくは化合物によって刺激することができる。「徐放成分」という用語は、本発明の文脈では、活性成分の徐放を容易にする、ポリマー、ポリマーマトリックス、ゲル、透析膜、リポソーム、もしくはマイクロスフェア、またはその組み合わせを含むが、これに限定されない化合物と本明細書において定義される。

ある特定の態様では、本発明の製剤は、短期製剤、急速作用消失(rapid-offset)製剤、ならびに徐放製剤、例えば、持続放出製剤、遅延放出製剤、および拍動放出(pulsatile release)製剤でもよいが、これに限定されない。

持続放出という用語は、長期間にわたって薬物を徐々に放出し、必ずしもそうであるとは限らないが、長期間にわたって実質的に一定の薬物血中濃度をもたらし得る薬物製剤を指すために従来の意味で用いられる。期間は1ヶ月以上と長くてもよく、ボーラスの形で投与される等量の薬剤より長い放出になるはずである。持続放出の場合、化合物は、化合物に持続放出特性を付与する適切なポリマー材料または疎水性材料を用いて処方されてもよい。従って、本発明の方法を使用するための化合物は、微粒子の形で、例えば、注射によって投与されてもよく、カシェ剤またはディスクの形で移植によって投与されてもよい。本発明の好ましい態様では、本発明の化合物は、持続放出製剤を用いて、単独で、または別の薬学的薬剤と組み合わせて患者に投与される。

遅延放出という用語は、本明細書では、薬物が投与された後に、いくらかの遅延の後に薬物を初めて放出し、必ずしもそうであるとは限らないが、約10分から約12時間までの遅延を含んでもよい薬物製剤を指すために従来の意味で用いられる。拍動放出という用語は、本明細書では、薬物が投与された後に、薬物パルス血漿プロファイルを生じるように薬物を放出する薬物製剤を指すために従来の意味で用いられる。即時放出という用語は、薬物が投与された直後に薬物を放出する薬物製剤を指すために従来の意味で用いられる。

本明細書で使用する短期とは、薬物が投与された後の、約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分、約20分、または約10分、ならびにその任意の、および全ての全増加分または部分的な増加分までの、またはこれらを含む任意の期間を指す。

本明細書で使用する急速作用消失とは、薬物が投与された後の、約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分、約20分、または約10分、ならびにその任意の、および全ての全増加分および部分的な増加分までの、またはこれらを含む任意の期間を指す。

当業者は、本明細書に記載の特定の手順、態様、クレーム、および実施例に対する非常に多くの等価物を認識しているか、または日常的な実験法だけを用いて認めることができる。このような等価物は本発明の範囲内だとみなされ、添付の特許請求の範囲によってカバーされた。例えば、当技術分野において認められている代案による、および日常的な実験法だけを用いた、反応時間、反応サイズ/容積、および実験試薬、例えば、溶媒、触媒、圧力、雰囲気条件、例えば、窒素雰囲気、および還元剤/酸化剤を含むが、これに限定されない反応条件の変更は本願の範囲内であると理解されるはずである。

値および範囲が本明細書において提供される場合は必ず、これらの値および範囲に含まれる全ての値および範囲は本発明の範囲内に含まれることが意図されると理解されなければならない。さらに、これらの範囲内にある値は全て、ならびに値の範囲の上限または下限も本願に含まれる。

以下の実施例は本発明の局面をさらに例示する。しかしながら、以下の実施例は、本明細書において示された本発明の教示も開示も限定するものではない。

これより、以下の実施例に関連して本発明を説明する。これらの実施例は例示目的のためだけに提供される。本発明は、これらの実施例に限定されず、本明細書において提供される教示の結果として明らかな全てのバリエーションを包含する。

方法および材料:配列:
ENPP3の細胞外ドメイン(SEQ ID NO:1)

シグナル配列ENPP7(SEQ ID NO:2)

シグナル配列ENPP7(SEQ ID NO:3)

シグナル配列ENPP5(SEQ ID NO:4)

シグナル配列ENPP1-2-1(SEQ ID NO:5)

(一重下線)-(二重下線):一重下線から二重下線に移る位置で切断されるようにNPP2の1〜27番目の残基と交換した残基。
SEQ ID NO:6 (DSS)_n、配列中、nは1〜20の整数である。
SEQ ID NO:7 (ESS)_n、配列中、nは1〜20の整数である。
SEQ ID NO:8 (RQQ)_n、配列中、nは1〜20の整数である。
SEQ ID NO:9 (KR)_n、配列中、nは1〜20の整数である。
SEQ ID NO:10 R_n、配列中、nは1〜20の整数である。
SEQ ID NO:11 (KR)_n、配列中、nは1〜20の整数である。

SEQ ID NO:17 E_n、配列中、nは1〜20の整数である。
SEQ ID NO:18 D_n、配列中、nは1〜20の整数である。

ENPP121-NPP3-Fc配列(SEQ ID NO:19)

太字の残基＝NPP1に由来するアミノ酸配列;一重下線を引いた残基＝NPP2に由来するシグナルペプチド配列;二重下線を引いた残基＝IgG Fcドメインのアミノ酸配列。ある特定の態様では、IgG Fcドメインは、サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4のいずれかより選択される。他の態様では、Fcドメインの代わりにアルブミンドメインが用いられる。

ある特定の態様では、NPP3 C末端およびFc/アルブミンドメインはリンカーによって接続される。他の態様では、リンカーは少なくとも2個のアミノ酸を含む。さらに他の態様では、リンカーは、2〜40個のアミノ酸、2〜30個のアミノ酸、2〜20個のアミノ酸、2〜18個のアミノ酸、2〜16個のアミノ酸、2〜14個のアミノ酸、2〜12個のアミノ酸、2〜10個のアミノ酸、2〜8個のアミノ酸、2〜6個のアミノ酸、2〜4個のアミノ酸、または2個のアミノ酸を含む。さらに他の態様では、可動性リンカーはポリエチレングリコール鎖および/または炭化水素鎖(例えば、アルキレン鎖)を含む。

IgG Fc配列(SEQ ID NO:20)

ENPP7-NPP3-Fc配列(SEQ ID NO:21)

一重下線を引いた残基＝NPP7に由来するシグナルペプチド配列;二重下線を引いた残基＝IgG Fcドメインのアミノ酸配列。ある特定の態様では、IgG FcドメインはサブクラスIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4のいずれかより選択される。他の態様では、Fcドメインの代わりにアルブミンドメインが用いられる。

ある特定の態様では、NPP3 C末端およびFc/アルブミンドメインはリンカーによって接続される。他の態様では、リンカーは少なくとも2個のアミノ酸を含む。さらに他の態様では、リンカーは、2〜40個のアミノ酸、2〜30個のアミノ酸、2〜20個のアミノ酸、2〜18個のアミノ酸、2〜16個のアミノ酸、2〜14個のアミノ酸、2〜12個のアミノ酸、2〜10個のアミノ酸、2〜8個のアミノ酸、2〜6個のアミノ酸、2〜4個のアミノ酸、または2個のアミノ酸を含む。さらに他の態様では、可動性リンカーはポリエチレングリコール鎖および/または炭化水素鎖(例えば、アルキレン鎖)を含む。

ENPP5-NPP3-Fc配列(SEQ ID NO:22)

一重下線を引いた残基＝NPP5に由来するシグナルペプチド配列;二重下線を引いた残基＝IgG Fcドメインのアミノ酸配列。ある特定の態様では、IgG FcドメインはサブクラスIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4のいずれかより選択される。他の態様では、Fcドメインの代わりにアルブミンドメインが用いられる。

ある特定の態様では、NPP3 C末端およびFc/アルブミンドメインはリンカーによって接続される。他の態様では、リンカーは少なくとも2個のアミノ酸を含む。さらに他の態様では、リンカーは、2〜40個のアミノ酸、2〜30個のアミノ酸、2〜20個のアミノ酸、2〜18個のアミノ酸、2〜16個のアミノ酸、2〜14個のアミノ酸、2〜12個のアミノ酸、2〜10個のアミノ酸、2〜8個のアミノ酸、2〜6個のアミノ酸、2〜4個のアミノ酸、または2個のアミノ酸を含む。さらに他の態様では、可動性リンカーはポリエチレングリコール鎖および/または炭化水素鎖(例えば、アルキレン鎖)を含む。

アルブミン配列(SEQ ID NO:23)

ENPP121-NPP3-アルブミン配列(SEQ ID NO:24)

太字の残基＝NPP1に由来するアミノ酸配列;一重下線を引いた残基＝NPP2に由来するシグナルペプチド配列;二重下線を引いた残基＝スペーサー配列およびアルブミンドメインのアミノ酸配列。

ある特定の態様では、NPP3 C末端およびアルブミンドメインはリンカーによって接続される。他の態様では、リンカーは少なくとも2個のアミノ酸を含む。さらに他の態様では、リンカーは、2〜40個のアミノ酸、2〜30個のアミノ酸、2〜20個のアミノ酸、2〜18個のアミノ酸、2〜16個のアミノ酸、2〜14個のアミノ酸、2〜12個のアミノ酸、2〜10個のアミノ酸、2〜8個のアミノ酸、2〜6個のアミノ酸、2〜4個のアミノ酸、または2個のアミノ酸を含む。さらに他の態様では、可動性リンカーはポリエチレングリコール鎖および/または炭化水素鎖(例えば、アルキレン鎖)を含む。

ENPP7-NPP3-アルブミン配列(SEQ ID NO:25)

一重下線を引いた残基＝NPP7に由来するシグナルペプチド配列;二重下線を引いた残基＝スペーサー配列およびアルブミンドメインのアミノ酸配列。

ある特定の態様では、NPP3 C末端およびアルブミンドメインはリンカーによって接続される。他の態様では、リンカーは少なくとも2個のアミノ酸を含む。さらに他の態様では、リンカーは、2〜40個のアミノ酸、2〜30個のアミノ酸、2〜20個のアミノ酸、2〜18個のアミノ酸、2〜16個のアミノ酸、2〜14個のアミノ酸、2〜12個のアミノ酸、2〜10個のアミノ酸、2〜8個のアミノ酸、2〜6個のアミノ酸、2〜4個のアミノ酸、または2個のアミノ酸を含む。さらに他の態様では、可動性リンカーはポリエチレングリコール鎖および/または炭化水素鎖(例えば、アルキレン鎖)を含む。

ENPP5-NPP3-アルブミン配列(SEQ ID NO:26)

一重下線を引いた残基＝NPP5に由来するシグナルペプチド配列;二重下線を引いた残基＝スペーサー配列およびアルブミンドメインのアミノ酸配列。

ある特定の態様では、NPP3 C末端およびアルブミンドメインはリンカーによって接続される。他の態様では、リンカーは少なくとも2個のアミノ酸を含む。さらに他の態様では、リンカーは、2〜40個のアミノ酸、2〜30個のアミノ酸、2〜20個のアミノ酸、2〜18個のアミノ酸、2〜16個のアミノ酸、2〜14個のアミノ酸、2〜12個のアミノ酸、2〜10個のアミノ酸、2〜8個のアミノ酸、2〜6個のアミノ酸、2〜4個のアミノ酸、または2個のアミノ酸を含む。さらに他の態様では、可動性リンカーはポリエチレングリコール鎖および/または炭化水素鎖(例えば、アルキレン鎖)を含む。

NPP121-NPP3-Fcのヌクレオチド配列(SEQ ID NO:27)

NPP121-NPP3-Fcのヌクレオチド配列(SEQ ID NO:28)

hNPP3-hFc-pcDNA3のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:29)

実施例1:
図1A〜1Cは、hNPP3定常状態ATP加水分解活性の研究を図示したグラフを含む。

図1Aに図示したように、50nM hNPP3に、(下から上に)0.98μM、1.95μM、3.9μM、7.8μM、15.6μM、31.3μM、62.5μM、125μM、250μM、および500μM ATPを添加した後のAMP生成物形成の時間経過を分析した。酵素反応を様々な時間で等量の3Mギ酸によって止め、反応生成物AMPをAMP検量線を用いてHPLC分析によって定量した。データ点を通る平坦な線は、生成物阻害および基質枯渇のある非直線酵素キネティックモデルとのベストフィットであった。

図1Bは、定常状態ATPアーゼ回転速度の比較を図示する。初期定常状態酵素回転速度のhNPP3基質濃度依存性を、hNPP1について測定したものと比較した。50nM hNPP3およびhNPP1のATPアーゼサイクリング反応は両方とも、0.98μM、1.95μM、および3.9μM ATPでは1分以内にATP基質を枯渇させた。これらの低いATP濃度での不確かさはかなり大きく、従って、フィッティング中に、これらの3つの速度をデータセットから除外した。hNPP3定常状態ATPアーゼ反応は、7.8μM、15.6μM、31.3μM、62.5μM、125μM基質での速度測定値の加重平均から、2.59(±0.04)s^-1酵素^-1の最大値(k_cat)に達した。hNPP1の代謝回転速度は3.46(±0.44)s^-1酵素^-1であった。ATP基質のK_Mは<8μMと見積もられた。

図1Cはη値の基質濃度依存性を図示する。両酵素の基質濃度と共にη値が減少することから、酵素反応時間経過における非直線性には、低い初期基質濃度での生成物阻害よりもはるかに基質枯渇が寄与することが分かる。hNPP3およびhNPP1のη値の類似性は首尾一貫しており、2つの酵素の反応速度および生成物阻害は似ている。

実施例2:動物モデル
以下の非限定的な動物モデルを用いて、低ピロリン酸(PPi)に起因するヒト疾患に対する、現在、請求されている組成物の効力を試験することができる。

1.乳児全身性動脈石灰化症(GACI)のenpp1asj/asjモデル; Li, et al., 2013, Disease Models & Mech. 6(5):1227-35.
2.乳児全身性動脈石灰化症(GACI)のenpp12asj/2asjモデル; Li, et al., 2014, PloS one 9(12):e113542.
3.弾力線維性仮性黄色腫(PXE)のABCC6-/-マウスモデル; Jiang, et al., 2007, J. Invest. Derm. 127(6):1392-402.
4.X連鎖性低リン酸血症(XLH)のHYPマウスモデル; Liang, et al., 2009, Calcif. Tissue Int. 85(3):235-46.
5.ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群(Hutchison-Gilford Progeria Syndrome)のLmnaG609G/+マウスモデル; Villa-Bellosta, et al., 2013, Circulation 127(24):2442-51.
6.後縦靱帯骨化(OPLL)(Okawa, et al., 1998, Nature Genetics 19(3):271-3; Nakamura, et al., 1999, Human Genetics 104(6):492-7)および変形性関節症(Bertrand, et al., 2012, Annals Rheum. Diseases 71(7):1249-53)のTip toe walking (ttw) マウスモデル
7.アデニン飼料を与えた慢性腎臓病(CKD)のラットモデル; Schibler, et al., 1968, Clin. Sci. 35(2):363-72; O’Neill, et al., 2011, Kidney Int. 79(5):512-7.
8. アデニン飼料を与えた慢性腎臓病(CKD)のマウスモデル; Jia, et al., 2013, BMC Nephrol. 14:116.
9.CKDの5/6th腎摘出ラットモデル; Morrison, 1962, Lab Invest. 11:321-32; Shimamura & Morrison, 1975, Am. J. Pathol. 79(1):95-106.
10.GACIおよび骨減少のENPP1ノックアウトマウスモデル; Mackenzie, et al., 2012, PloS one 7(2):e32177.

ある特定の態様では、文献において常染色体劣性低リン血症性くる病2型(ARHR2)とも呼ばれる、成人型のヒト疾患GACIを再現する、げっ歯類モデルはない(Levy-Litan, et al., 2010, Am. J. Human Gen. 86(2):273-8)。

酵素活性、血漿中PPiの定量、マイクロ-CTスキャン、血漿中ピロリン酸取り込みの定量、およびマウス石灰化モデルについての実験上の詳細は、特許出願および/または公報であるPCT/US2016/33236、WO2014126965(PCT特許出願番号PCT/US2014/015945に関連する)、およびUS20150359858に記載されている。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

実施例3:ENPP3融合タンパク質の作製および精製
ENPP3は、CHOまたはHEK293哺乳動物細胞のいずれかにおいて安定したトランスフェクションを確立することによって産生される。このタンパク質は付着細胞または懸濁細胞のいずれかにおいて産生することができる。安定細胞株を樹立するために、NPP3融合タンパク質をコードする核酸配列(図3〜5およびSEQ ID NO:1〜29)を、大規模タンパク質産生に適切したベクターに導入した。商業的供給業者から入手可能な、これらの様々なベクターがあり、これらのベクターのうちどれでも使用することができる。

例えば、図3は、適切なエンドヌクレアーゼ制限部位を用いてpcDNA3プラスミドにクローニングしたENPP1-2-1-exENPP3-Fcのプラスミドマップを図示する。融合タンパク質のシグナル配列、ENPP3の細胞外ドメイン、およびFcドメインを図示するためにタンパク質サブドメインを色分けした。クローニングしたタンパク質のアミノ酸配列もプラスミドマップの下に示し、これも融合タンパク質のドメインを図示するために色分けした。望ましいタンパク質構築物を含むpcDNA3プラスミドを、エレクトロポレーションまたはリポフェクタミンなどの確立した技法を用いて安定したトランスフェクションによって発現プラスミドに導入することができ、安定にトランスフェクトされた細胞を増やすために細胞を抗生物質選択下で増殖することができる。

次いで、安定にトランスフェクトされたシングル細胞のクローンを樹立し、望ましい融合タンパク質の高発現クローンがあるかどうかスクリーニングする。ENPP1について以前に述べられたように(Saunders, et al., 2008, Mol. Cancer Therap. 7(10):3352-62; Albright, et al., 2015, Nat Commun. 6:10006)、ENPP3タンパク質発現があるかどうかシングル細胞クローンを、96ウェルプレートに入れてハイスループット方式で合成酵素基質pNP-TMPを用いてスクリーニングすることができる。スクリーニングによって高発現クローンが特定されたら、ENPP1について以前に述べられたように(Albright, et al., 2015, Nat Commun. 6:10006)、タンパク質を振盪フラスコまたはバイオリアクタの中で産生することができる。

ENPP3は、当技術分野において公知の標準的な精製法の組み合わせを用いて精製することができる。これらの技法は当技術分野において周知であり、カラムクロマトグラフ、超遠心、濾過、および沈殿などの技法より選択される。カラムクロマトグラフィー精製は、アフィニティクロマトグラフィー、例えば、プロテインA樹脂およびプロテインG樹脂、金属アフィニティ樹脂、例えば、ニッケルまたは銅、疎水性交換クロマトグラフィー、ならびにC8-C14樹脂を用いた逆相高圧クロマトグラフィー(HPLC)を用いて成し遂げられる。市販の樹脂、例えば、Q-sepharose(陰イオン交換)およびSP-sepharose(陽イオン交換)、blue sepharose樹脂およびblue-sephadex樹脂、ならびにヒドロキシアパタイト樹脂を用いた、イオン交換、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーも用いられてもよい。当技術分野において公知のように、市販のS-75およびS200 Superdex樹脂を用いたサイズ排除クロマトグラフィーも使用することができる。タンパク質を可溶化し、上記のクロマトグラフィー工程のための選択培地を供給するのに用いられる緩衝液は、タンパク質化学の分野(art)および分野(science)の当業者に公知の標準的な生物学的緩衝液である。

調製において用いられる緩衝液のいくつかの例には、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、tris(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液、食塩緩衝液(saline buffer)、グリシン-HCL緩衝液、カコジル酸緩衝液、およびバルビタールナトリウム緩衝液が含まれ、これらは当技術分野において周知である。1種類の技法または組み合わせられた一連の技法と、適切なpHに調整した適切な緩衝系を用いて、粗材料から、説明された融合タンパク質を99％超の純度まで精製することができる(例えば、図2を参照されたい)。この図では、1回の精製工程後のクマシー染色ポリアクリルアミドゲル上で、部分的に精製されたENPP3と粗出発物質を横に並べて比較している。図2に証明したように、1回の精製工程後の右レーンに示した粗出発物質から、ENPP3の適切な分子量に対応する105kDをわずかに超える分子量のタンパク質が濃縮された。次いで、約99％純度などのかなり大きな純度に達するように、前記のように、さらなる技法および/またはクロマトグラフィー工程を用いて、この材料をさらに精製することができる。ある特定の態様では、精製されたタンパク質には、図1A〜1Cに記載および証明された酵素活性と同等の酵素活性がある。

実施例4:バイオマーカーとしての血漿中PPiの使用
本発明のある特定の態様は、どの個体が、軟部組織の異所性石灰化、血管内壁石灰化、少ない骨密度、骨減少、脳卒中、関節炎、および/または遺伝性のくる病の疾患になる危険があるか確かめるためのバイオマーカーとしての血漿中ピロリン酸の使用を意図する。有力な臨床研究所、例えば、Mayo Medical Laboratory(www dot mayomedicallaboratories dot com/test-catalog/alphabetical/P)もしくはイェール大学または有力な民間リファレンスラボラトリー(reference laboratory)、例えば、ARUP(ltd dot aruplab dot com/Search/Browse/P)もしくはThe Quest Diagnostics Nichols Institute(www dot specialtylabs dot com/about_us/)によって提供される臨床検査カタログに血漿中PPi検査がないことで証明されるように、血漿中PPiは、上記の障害の危険がある個体を予測するのに臨床において用いられたことがない。

ある特定の態様では、血漿中PPiには、石灰化、骨化の上記の障害、脳卒中、骨減少、少ない骨密度、および/または関節炎の危険がある個体を特定するための予測剤および診断剤としての臨床的有用性がある。

血漿中PPiの測定は、ラジオアイソトープ法(Cheung, et al., 1977, Anal. Biochem. 83(1):61-3)および蛍光法(Jansen, et al., 2013, PNAS U S A 110(50):20206-11; Jansen, et al., 2014, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 34(9):1985-9)を含む、いくつかの公表された方法を用いて成し遂げることができる。血漿中PPiの正しい測定には、血漿から血小板が除去され、全血が収集されたときに溶血されないことが必要である。血小板は高速遠心分離または限外濾過によって血液から除去することができる。血小板が活性化時および脱顆粒時にPPiおよびATPを血漿に放出し、これにより血漿中PPiレベルが人為的に上昇しないように、血小板の除去が必要とされる。全血が溶血されることでもATPが血漿に放出され、血漿中PPiの測定値が誤って上昇する。溶血されていない血液から収集され、血小板が除去された血漿は信頼性をもってPPi濃度を測定するのに使用することができ、上述した障害の危険がある患者を特定する予測診断剤としての臨床的有用性を提供することができる。

本明細書において引用された全ての特許、特許出願、および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本発明は特定の態様に関連して開示されたが、本発明の他の態様およびバリエーションが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのこのような態様および等価なバリエーションを含むと解釈されることが意図される。

Claims (38)

1. 式(I)の単離されたポリペプチドまたはその薬学的な塩もしくは溶媒和物：
   エクスポート(EXPORT)-タンパク質(PROTEIN)-Z-ドメイン(DOMAIN)-X-Y(I)
   式中、
   エクスポート(EXPORT)は、存在しないか、または輸送シグナル配列もしくはその生物学的に活性な断片であり、
   タンパク質(PROTEIN)は、ENPP3の細胞外ドメイン(SEQ ID NO:1)またはその生物学的に活性な断片であり、
   ドメイン(DOMAIN)は、ヒトIgG Fcドメインおよびヒトアルブミンドメインからなる群より選択され、
   XおよびZは、独立して、存在しないか、または1〜20個のアミノ酸を含むポリペプチドであり、
   Yは、存在しないか、または
   

   

   からなる群より選択される配列であり、nはそれぞれの場合に独立して1〜20の整数である。
2. タンパク質(PROTEIN)またはその変異体のヌクレアーゼドメインが存在しない、請求項1記載のポリペプチド。
3. エクスポート(EXPORT)が、存在しないか、またはSEQ ID NO:2〜5からなる群より選択される、請求項1記載のポリペプチド。
4. XおよびZが、独立して、存在しない、20アミノ酸からなるポリペプチド、19アミノ酸からなるポリペプチド、18アミノ酸からなるポリペプチド、17アミノ酸からなるポリペプチド、16アミノ酸からなるポリペプチド、15アミノ酸からなるポリペプチド、14アミノ酸からなるポリペプチド、13アミノ酸からなるポリペプチド、12アミノ酸からなるポリペプチド、11アミノ酸からなるポリペプチド、10アミノ酸からなるポリペプチド、9アミノ酸からなるポリペプチド、8アミノ酸からなるポリペプチド、7アミノ酸からなるポリペプチド、6アミノ酸からなるポリペプチド、5アミノ酸からなるポリペプチド、4アミノ酸からなるポリペプチド、3アミノ酸からなるポリペプチド、2アミノ酸からなるポリペプチド、および1アミノ酸からなるポリペプチドからなる群より選択される、請求項1記載のポリペプチド。
5. ドメイン(DOMAIN)が、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4からなる群より選択されるヒトIgG Fcドメインである、請求項1記載のポリペプチド。
6. SEQ ID NO:19、21、および22からなる群より選択される、請求項5記載のポリペプチド。
7. ドメイン(DOMAIN)が、ヒトアルブミンドメインである、請求項1記載のポリペプチド。
8. SEQ ID NO:24、25、および26からなる群より選択される、請求項7記載のポリペプチド。
9. NPP3の可溶性領域を含みかつ膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドを欠く単離されたポリペプチドまたはその融合タンパク質であって、該ポリペプチドが、石灰化および骨化の疾患に罹患している対象に投与されたときに細胞石灰化を低減する、前記単離されたポリペプチドまたはその融合タンパク質。
10. ENPP3の細胞外ドメイン(SEQ ID NO:1)またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項9記載のポリペプチド。
11. SEQ ID NO:1またはその生物学的に活性な断片から本質的になる、請求項10記載のポリペプチド。
12. 病的石灰化または病的骨化に関連する疾患または障害の治療または予防を必要とする対象において、病的石灰化または病的骨化に関連する疾患または障害を治療または予防する方法であって、治療的有効量の少なくとも1種類の請求項1記載の単離されたポリペプチドを該対象に投与する工程を含む、前記方法。
13. 前記疾患または障害が、乳児全身性動脈石灰化症(GACI)、特発性乳児動脈石灰化症(IIAC)、弾力線維性仮性黄色腫(PXE)、OPLL、低リン血症性くる病、変形性関節症、アテローム性動脈硬化巣の石灰化、弾力線維性仮性黄色腫、遺伝性および非遺伝性の変形性関節症、強直性脊椎炎、加齢に伴う動脈硬化、ならびに末期腎臓病に起因するカルシフィラキシー(または慢性腎臓病に伴う骨ミネラル代謝異常)からなる群より選択される少なくとも1つを含む、請求項12記載の方法。
14. タンパク質(PROTEIN)またはその変異体のヌクレアーゼドメインが存在しない、請求項12記載の方法。
15. エクスポート(EXPORT)が存在しないか、またはSEQ ID NO:2〜5からなる群より選択される、請求項12記載の方法。
16. XおよびZが独立して、存在しない、20アミノ酸からなるポリペプチド、19アミノ酸からなるポリペプチド、18アミノ酸からなるポリペプチド、17アミノ酸からなるポリペプチド、16アミノ酸からなるポリペプチド、15アミノ酸からなるポリペプチド、14アミノ酸からなるポリペプチド、13アミノ酸からなるポリペプチド、12アミノ酸からなるポリペプチド、11アミノ酸からなるポリペプチド、10アミノ酸からなるポリペプチド、9アミノ酸からなるポリペプチド、8アミノ酸からなるポリペプチド、7アミノ酸からなるポリペプチド、6アミノ酸からなるポリペプチド、5アミノ酸からなるポリペプチド、4アミノ酸からなるポリペプチド、3アミノ酸からなるポリペプチド、2アミノ酸からなるポリペプチド、および1アミノ酸からなるポリペプチドからなる群より選択される、請求項12記載の方法。
17. 前記少なくとも1種類のポリペプチドが、前記対象に短期または長期にわたって投与される、請求項12記載の方法。
18. 前記少なくとも1種類のポリペプチドが、前記対象に局所投与、局部投与、または全身投与される、請求項12記載の方法。
19. ドメイン(DOMAIN)が、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4からなる群より選択されるヒトIgG Fcドメインである、請求項12記載の方法。
20. 前記少なくとも1種類のポリペプチドが、SEQ ID NO:19、21、および22からなる群より選択される、請求項19記載の方法。
21. ドメイン(DOMAIN)が、ヒトアルブミンドメインである、請求項12記載の方法。
22. 前記少なくとも1種類のポリペプチドが、SEQ ID NO:24、25、および26からなる群より選択される、請求項21記載の方法。
23. 前記対象が哺乳動物である、請求項12記載の方法。
24. 前記哺乳動物がヒトである、請求項23記載の方法。
25. 血漿中ピロリン酸(PPi)が少ないかまたは血清中リン酸(Pi)が多い対象において血管石灰化を低減または予防する方法であって、治療的有効量の単離された組換えヒト可溶性ENPP3断片またはその融合タンパク質を該対象に投与する工程を含み、該投与される量が、該対象における血漿中PPiレベルを少なくとも約800nMまで上昇させる、前記方法。
26. 前記投与される量が、前記対象における血漿中PPiレベルを少なくとも約1μMまで上昇させる、請求項25記載の方法。
27. 前記投与される量が、前記対象における血漿中PPiレベルを少なくとも約1.5μMまで上昇させる、請求項26記載の方法。
28. 前記対象が、GACI、IIAC、PXE、OPLL、MWVC、ARHR2、ESRD、CKD-MBD、XLH、加齢性骨減少症、CUA、および低リン血症性くる病からなる群より選択される少なくとも1つの疾患を有する、請求項25記載の方法。
29. 前記可溶性ENPP3断片またはその融合タンパク質が、ENPP3の細胞外ドメイン(SEQ ID NO:1)またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項25記載の方法。
30. 前記可溶性ENPP3断片が、SEQ ID NO:1またはその生物学的に活性な断片から本質的になる、請求項25記載の方法。
31. 前記可溶性ENPP3断片またはその融合タンパク質が、膜貫通ドメインおよびシグナルを欠く、請求項25記載の方法。
32. NPP1欠損症またはNPP1関連疾患を有する対象を治療する方法であって、治療的有効量の単離された組換えヒト可溶性ENPP3断片またはその融合タンパク質を該対象に投与する工程を含む、前記方法。
33. 前記対象が、GACI、IIAC、PXE、OPLL、MWVC、ARHR2、ESRD、CKD-MBD、XLH、加齢性骨減少症、CUA、および低リン血症性くる病からなる群より選択される少なくとも1つの疾患を有する、請求項32記載の方法。
34. 前記可溶性ENPP3断片またはその融合タンパク質が、ENPP3の細胞外ドメイン(SEQ ID NO:1)またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項32記載の方法。
35. 前記可溶性ENPP3断片が、SEQ ID NO:1またはその生物学的に活性な断片から本質的になる、請求項32記載の方法。
36. 前記可溶性ENPP3断片またはその融合タンパク質が、膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドを欠く、請求項32記載の方法。
37. 少なくとも1種類の請求項1〜11のいずれか一項記載の単離されたポリペプチドと、病的石灰化または病的骨化に関連する疾患または障害の治療を必要とする対象において、病的石灰化または病的骨化に関連する疾患または障害を治療するための該少なくとも1種類のポリペプチドの使用について述べた説明書とを備える、キット。
38. 前記疾患または障害が、GACI、IIAC、OPLL、XLH、変形性関節症、アテローム性動脈硬化巣の石灰化、弾力線維性仮性黄色腫、遺伝性および非遺伝性の変形性関節症、強直性脊椎炎、加齢に伴う動脈硬化、末期腎臓病に起因するカルシフィラキシー(またはCKD-MBD)、MWVC、ARHR2、ESRD、加齢性骨減少症、およびCUAからなる群より選択される少なくとも1つを含む、請求項37記載のキット。

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