JP2018535973A - 心停止の処置のためのペプチドおよび方法 - Google Patents

心停止の処置のためのペプチドおよび方法 Download PDF

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Abstract

ＰＴＥＮおよびＰＨＬＰＰのＣ末端ＰＤＺ結合ドメイン、またはＰＫＮ２のＰＤＫ１干渉フラグメントに基づく修飾されたペプチドが、ＰＴＥＮ、ＰＨＬＰＰおよびＰＫＮ２の活性を遮断して、突然心停止を処置するために、修飾されたペプチドを用いる方法として記載される。ソルビトールまたはタウリンのレベルに基づく心停止の処置を指導するための方法もまた、提供される。

Description

導入
本願は、２０１５年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／２５２，２０１号の優先権の利益を主張し、その内容は、本明細書により参考としてその全体において援用される。
背景
心停止、または突然死は、一般的な心臓性の病因を伴う生理学的異常の多様な集合についての記述語であって、ここで、患者は、典型的には、無脈、無呼吸および意識不明の症状を呈する。心停止は、広範に広がっており、米国単独において毎年３００，０００人の犠牲者が概算され、全世界においてさらなる犠牲者が同様に概算される。突然心停止は、米国における死亡の主要な原因であり、その公衆衛生に対する影響は、死亡率の程度において、がん、ＨＩＶ、脳卒中および感染性疾患よりも大きい。心停止の犠牲者のうちの約４０〜５０％は、現場において医療補助員および救急医療技師（emergency medical technician：ＥＭＴ）により蘇生させられ、さらなる処置のために病院へと運ばれる；しかし、犠牲者の生命維持器官に対する心停止からの傷害により、典型的には、それらの病院へと生き延びた犠牲者のうちのわずか約２５％（または全世界における６００，０００人の心停止犠牲者のうちの約４０，０００）しか、退院するまで生き延びない。
除細動、心肺蘇生術、および強心剤（例えばエピネフリン）による薬物処置の現在の処置による心停止のための処置機会は、非常に狭い。犠牲者の虚脱の時点からの長期生存率は、おおよそ２分間の時定数により、おおよそ指数関数的な割合で減少する。したがって、現在推奨される処置プロトコルを用いる処置において、ほんの２分間の遅延が、３０〜３５％の長期生存率をもたらす。１５分後には、長期生存率は、５％未満である。
心停止の間に、脳血流は停止し、数分以内に全脳低酸素・虚血性傷害が始まる。心筋および神経組織は、長期間の虚血の間、生存可能であり続けることができる（２０分間まで）が、逆説的に、循環および酸素添加の回復の間に、即時的傷害を受け続ける。心拍再開（ＲＯＳＣ）による蘇生の成功が、再灌流傷害に関する傷害の二次カスケードをもたらすことは、組織レベルおよび動物モデルにおいて、多様な研究において示されている。この再灌流傷害は、神経組織において特に急性である。
心臓の蘇生およびＲＯＳＣの成功の後で、脳血流は、数時間にわたり異常に低くあり続ける場合がある。高い循環レベルのカテコールアミンからもたらされる初期の充血の後で、脳血流は、酸素についての脳の代謝速度が増大するにつれて、低下する。この脳の代謝速度と血流との間の長期間の不一致と、遅発型の神経細胞のアポトーシス性および壊死性の細胞死に関連する進行中の生化学的および分子プロセスとが、心停止の後の神経保護の形態として誘導される低体温についての科学的な理論的根拠を提供する。開発された一方法は、昏睡状態の心停止生存者を、停止の開始から４時間以内に約３４℃まで冷却することであり、これは、初期に蘇生させられた患者の生存率を増強することが生存率の研究において示されている（病院に間に合った犠牲者のうちの約４０〜５０％）。低体温は、心臓の集中治療、バイパス手術におけるもののような病院の環境などにおいては一般的であるが、低体温には、そのプレホスピタル環境における広範な使用を妨げてきた２種の関連する欠点が存在する。
これらの欠点のうちの第１のものは、低体温の主要な医用生体工学的課題：犠牲者の大きなサーマルマス、および犠牲者を迅速かつ安全に冷却することの困難性である。低体温は、心停止後４時間以内に適用される限りは有益であることが示されているが、一方でまた、研究により、蘇生の前に冷却することにより、さらなる治療的利益が提供されることも示されている。このことについての原因は、推論でしかないが、一方で、要因のうちの１つは、蘇生の再灌流期の間の低体温の正の効果である可能性が高い。実際問題として、適切な処置の前に患者を冷却するために除細動および蘇生を遅延させることは、非常に望ましくない。非侵襲的な冷却の方法は、最低でも１０分間から１時間かかり、一方、血液の抽出および冷却などの侵襲的方法は、３〜５分間しかかからない場合があるが、プレホスピタル環境においては特に、患者にとって危険である。除細動の場合において、３分間の遅延すら、生存率の３０％の低下をもたらし得る。低体温は、より長期間の虚血および再灌流の有害効果を中和することにおいて有効であり得るが、一方で、いかなる現在の蘇生処置を遅延することなく、同時に、再灌流傷害に対する即時的な保護効果を提供し得る処置を有することが望ましい。
ホスホチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢまたはＡｋｔ）経路は、細胞の恒常性、神経の発達、代謝および他のプロセスのために重要である。それは、アポトーシス、細胞周期の進行、および細胞の分化などの細胞の発達の多様な側面を制御する。ＰＩＰ３をＰＩＰ２へと脱リン酸化するＰＴＥＮ（phosphatase and tensin homolog）は、ＰＩＰ３を減少させることによりＡｋｔの活性化を限定することが示されている。ＰＴＥＮの欠失または変異は、多くの型の腫瘍において観察され、高いＡｋｔ活性を伴う。さらに、タンパク質キナーゼＮ２（ＰＫＮ２）、別名タンパク質キナーゼＣ関連キナーゼ−２（ＰＲＫ２）は、Ａｋｔのホスホイノシチド依存性キナーゼ１（ＰＤＫ１）の活性化を阻害することにより、Ａｋｔを負に制御し得る。ＰＤＫ１のキナーゼドメインは、ＰＲＫ２のＰＤＫ１相互作用フラグメント（PDK1-interacting fragment：PIF）を包含する領域と相互作用し、これは、疎水性モチーフＦＸＸＦＤＹ（配列番号２０７）を含む（Balendran, et al. (1999) Curr. Biol. 9:393-404）。さらに、タンパク質ホスファターゼ（ＰＰ）２Ａは、非心臓性の細胞において、ＡｋｔをＴｈｒ３０８および／またはＳｅｒ４７３において脱リン酸化することが知られる。薬理学的研究はまた、網膜において、ＰＰ２Ｂ（カルシニューリン）が、Ａｋｔを両方の部位において脱リン酸化し得ることを示唆する。より特異的なＡｋｔを標的とするＰＰ２Ｃファミリーのメンバーであるタンパク質ホスファターゼ、ＰＨＬＰＰ（プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインロイシンリッチリピートタンパク質ホスファターゼ）が同定されている。ＰＨＬＰＰの２つのアイソフォームであるＰＨＬＰＰ−１およびＰＨＬＰＰ−２は、Ａｋｔの疎水性モチーフ（Ｓｅｒ４７３）をＰＤＺ結合モチーフを介して選択的に脱リン酸化し（Gao, et al. (2005) Mol. Cell 18:13-24）、それによりＡｋｔシグナル伝達を終了させることが示されている。ＰＨＬＰＰのレベルは、いくつかの癌細胞株において著しく低下しており、これは、Ａｋｔの活性化の上昇をもたらす。逆に、癌細胞におけるＰＨＬＰＰの異種性発現は、Ａｋｔの活性化を妨げて、アポトーシス死を促進することができる。この側面において、癌の処置における使用のために、ＰＨＬＰＰの投与が示唆されている（US 2008/0108569）。
心筋細胞においては、ＰＴＥＮの過剰発現がアポトーシス促進性であることが示されており、一方、ＰＴＥＮの遺伝子の欠失は、虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）傷害から心臓をレスキューする（Schwartzbauer & Robbins (2001) J. Biol. Chem. 276:35786-93；Ruan, et al. (2009) J. Mol. Cell Cardiol. 46:193-200）。同様に、心筋細胞におけるｓｉＲＮＡまたはノックアウトを介するＰＨＬＰＰ−１のノックダウンは、アゴニストにより誘導されるＳ４７３におけるＡｋｔのリン酸化を増強する（Miyamoto, et al. (2010) Circ. Res. 107:476-84）。
Ｉ／Ｒ傷害および保護におけるＰＴＥＮについての役割を支持して、ＰＴＥＮの強力な阻害を示すバナジル低分子化合物であるVO-OHpic（ＶＯ）が、冷却様心保護を誘導し、細胞死をほぼ４倍減少させ、リン酸化Ａｋｔを著しく増大させ（Zhu, et al. (2014) PLoS One 9:e95622）、確立されたＳＣＡのマウスモデルにおいて回復および生存率を改善する（Li, et al. (2015) Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 308:H1414-22）ことが示されている。同様に、インスリンの使用は、PHLPP-1のタンパク質レベルを減少させ、Ａｋｔのリン酸化を活性化し、心筋細胞の生存を促進し、虚血状態の心臓の保護を提供すると示唆されている（CN 201210382244）。
それぞれラットおよびヒトのＰＴＥＮタンパク質に基づくペプチドＤＱＨＳＱＩＴＫＶ（配列番号４）およびＤＱＨＴＱＩＴＫＶ（配列番号５）は、網膜変性障害または脳卒中を処置することにおける使用について記載されている（US 2014/0371161）。ヒトＰＨＬＰＰ−１のＰＤＺドメイン配列に基づくペプチドＬＰＤＹＹＤＴＰＬ（配列番号９）は、抗ＰＨＬＰＰ１抗体の生成において有用であることが示されている（Jackson, et al. (April 2015) Sci. Rep. 5:9377）。さらに、配列ＲＥＰＲＩＬＳＥＥＥＱＥＭＦＲＤＦＤＹＩＡＤＷＣ（配列番号２０８）を有するペプチドは、がん、脳卒中および心筋梗塞を処置することにおいて有用であることが示唆されている（US 2007/0196883）。
本発明は、配列番号１からなるＰＤＺ結合ドメイン、および（ａ）１〜３個のさらなる非天然のＮ末端アミノ酸残基、（ｂ）１〜３個のさらなる非天然のＣ末端アミノ酸残基、（ｃ）翻訳後修飾、（ｄ）１つ以上の非加水分解性結合の導入、または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のうちの１つ以上の組み合わせからなる修飾されたペプチドを提供する。本発明はまた、配列番号２からなるＰＤＺ結合ドメインまたは配列番号３からなるＰＤＫ１干渉フラグメント、および（ａ）１〜５０個のさらなる非天然のアミノ酸残基、（ｂ）１つ以上の翻訳後修飾、（ｃ）１つ以上の非加水分解性結合の導入、または（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうちの１つ以上の組み合わせからなる修飾されたペプチドを提供する。修飾されたペプチドのいくつかの態様において、さらなる非天然のアミノ酸残基が、細胞浸透ペプチドを構成する。修飾されたペプチド、薬学的に受入可能なキャリア、および任意にニコチンアミドを含む医薬組成物もまた提供される。さらに、配列番号６３〜１１０、１１８〜１３４、または１４２〜２０６のアミノ酸配列を含む修飾されたペプチドが、さらに提供される。
本発明はまた、配列番号１または配列番号２からなるＰＤＺ結合ドメイン、または配列番号３からなるＰＤＫ１干渉フラグメント、および（ａ）１〜５０個のさらなる非天然のアミノ酸残基、（ｂ）１つ以上の翻訳後修飾、（ｃ）１つ以上の非加水分解性結合の導入、（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうちの１つ以上の組み合わせからなる修飾されたペプチドを心停止している対象に投与し、それにより対象の心停止を処置することにより、突然心停止を処置するための方法を提供する。一態様において、さらなる非天然のアミノ酸残基が、細胞浸透ペプチドを構成する。別の態様において、修飾されたペプチドは、薬学的に受入可能なキャリアと共に投与される。さらなる態様において、方法はさらに、ニコチンアミドの投与を含む。さらに別の態様において、修飾されたペプチドは、心臓の機能が回復した後で投与される。さらなる態様において、ニコチンアミドは、心肺蘇生術の間に投与され、修飾されたペプチドは、心臓の機能が回復した後で投与される；ニコチンアミドおよび修飾されたペプチドは、心臓の機能が回復した後で投与される；またはニコチンアミドおよび修飾されたペプチドは、心肺蘇生術の間に投与される。なお他の態様において、方法は、対象からの血液試料中のソルビトールまたはタウリンのレベルを決定するプレステップを含み、ここで、対照試料と比較して上昇した対象からの血液試料ソルビトールまたはタウリンのレベルは、対象に投与するべき修飾されたペプチドの量を示す。
心停止を処置するためのキットもまた提供される。本発明のキットは、（ａ）配列番号１または配列番号２からなるＰＤＺ結合ドメイン、または配列番号３からなるＰＤＫ１干渉フラグメント、および（ｉ）１〜５０個のさらなる非天然のアミノ酸残基、（ｉｉ）１つ以上の翻訳後修飾、（ｉｉｉ）１つ以上の非加水分解性結合の導入、（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちの１つ以上の組み合わせを含む、修飾されたペプチド；ならびに、（ｂ）ニコチンアミド、ソルビトールを検出するための１つ以上の試薬、タウリンを検出するための１つ以上の試薬、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、さらなる非天然のアミノ酸残基は、細胞浸透ペプチドを含む。
本発明はさらに、心停止の処置を指導するための方法を提供する。本発明の方法は、心停止していることが疑われる対象から血液試料を得るステップ；血液試料をソルビトールまたはタウリンを検出するための試薬と接触させるステップ；および、血液試料中のソルビトールまたはタウリンのレベルを対照試料と比較したものとして検出するステップを含み、ここで、対照試料と比較して高い対象の試料中のソルビトールまたはタウリンのレベルは、対象が、低体温療法、ニコチンアミド、修飾されたＰＤＺ結合ドメインペプチドまたはそれらの組み合わせによる処置を必要としていることを示す。
図１Ａ〜１Ｃは、ＴＡＴ−ＰＴＥＮ９ｃペプチドが、Ｈ２Ｏ２（図１Ａ）またはＩＧＦ−１（図１Ｂ）に応答してのＡｋｔの活性化を濃度依存的な様式において増強し、ここで、活性化は、投与の後１０分間以内に起こる（図１Ｃ）ことを示す。
図２は、心臓および脳におけるＴＡＴ−ＧＦＰ伝達は、拡散的であり、ＩＶ投与の後５分間以内に起こり、一方、ＴＡＴ−ＧＦＰ伝達は、脳および心臓において、ＩＰ投与の後１５〜３０分以内に明らかとなったことを示す。
図３は、ＴＡＴ−ＰＴＥＮ９ｃペプチドで処置されたマウスからの脳組織が、ＲＯＳＣの１５（Ｒ１５）および３０（Ｒ３０）分後に、食塩水対照（ＮＳ）と比較して著しく減少したソルビトール含有量を示したことを示す。
図４は、ＲＯＳＣの直後のＴＡＴ−ＰＴＥＮ９ｃの投与が、心停止後のマウスの生存率を、食塩水対照（ＮＳ）と比較して著しく改善することを示す。
図５は、心臓が、タウリンの主なソースであり、血中タウリン濃度が心臓のソルビトール濃度と正に相関することを示す。
発明の詳細な説明
マウスにおける能動的な冷却保護のゲノムスクリーニング、ならびに冷却に対して応答しないノックアウトマウスのさらなる研究に基づいて、ＰＴＥＮの阻害およびＡｋｔの活性化が、心停止を生き延びるための重要な標的として同定されている。したがって、Ａｋｔ経路を制御するタンパク質を一過性かつ特異的に阻害する一連のペプチドが、突然心停止を処置し、生存率を増大させるために開発されてきた。特に、ＰＴＥＮのＣ末端に局在するＰＤＺ結合ドメイン、ＰＨＬＰＰおよびＰＫＮ２のＰＤＫ１干渉フラグメントに基づく修飾されたペプチドが、内在ＰＴＥＮ、ＰＨＬＰＰおよびＰＫＮ２のそれらのアダプターへの結合に干渉し、Ａｋｔの活性化の増大をもたらし、Ａｋｔにより増強されるグルコース利用（ソルビトールへの代替的なポリオール経路を介したグルコースの転換の減少を伴う）を引き起こし、突然心停止後の生存率を改善することにおける使用のために、本明細書において記載される。
本発明のペプチドは、ＰＴＥＮまたはＰＨＬＰＰ１のＰＤＺ結合ドメインの修飾されたバージョンであって、それぞれ、配列Ａｓｐ／Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ（Ｂ−Ｑ−Ｈ−Ｓ／Ｔ−Ｑ−Ｉ−Ｔ−Ｋ−Ｖ；配列番号１）またはＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ／Ａｓｎ−Ｃｙｓ／Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ／Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（Ｌ−Ｐ−Ｂ−Ｃ／Ｙ−Ｙ−Ｂ−Ｔ−Ｐ−Ｌ；配列番号２）を有するか；またはＰＫＮ２のＰＤＫ１干渉フラグメントであって、配列Ｐｈｅ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ−Ａｓｐ／Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ／Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ／Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ／Ａｓｎ（Ｆ−Ｒ／Ｈ−Ｂ−Ｆ−Ｂ−Ｙ−Ｉ／Ｖ−Ａ−Ｂ）、配列番号３）を有する。用語「修飾された」とは、ＰＴＥＮ、ＰＨＬＰＰまたはＰＫＮ２阻害活性を有するペプチドであって、配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を有し、さらに、Ｃおよび／またはＮ末端における１つ以上のさらなる非天然のアミノ酸残基、１つ以上の非加水分解性結合および／または１つ以上の翻訳後修飾の存在を含むものを意味する。
Ａｓｐ／Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ（Ｂ−Ｑ−Ｈ−Ｓ／Ｔ−Ｑ−Ｉ−Ｔ−Ｋ−Ｖ；配列番号１）のアミノ酸配列を有するＰＴＥＮのＰＤＺ結合ドメインは、ＤＱＨＳＱＩＴＫＶ（配列番号４）、ＤＱＨＴＱＩＴＫＶ（配列番号５）、ＮＱＨＳＱＩＴＫＶ（配列番号６）およびＮＱＨＴＱＩＴＫＶ（配列番号７）を含む。
Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ／Ａｓｎ−Ｃｙｓ／Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ／Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（Ｌ−Ｐ−Ｂ−Ｃ／Ｙ−Ｙ−Ｂ−Ｔ−Ｐ−Ｌ；配列番号２）のアミノ酸配列を有するＰＨＬＰＰ１のＰＤＺ結合ドメインは、ＬＰＤＣＹＤＴＰＬ（配列番号８）、ＬＰＤＹＹＤＴＰＬ（配列番号９）、ＬＰＮＣＹＤＴＰＬ（配列番号１０）、ＬＰＮＹＹＤＴＰＬ（配列番号１１）、ＬＰＤＣＹＮＴＰＬ（配列番号１２）、ＬＰＤＹＹＮＴＰＬ（配列番号１３）、ＬＰＮＣＹＮＴＰＬ（配列番号１４）およびＬＰＮＹＹＮＴＰＬ（配列番号１５）を含む。
Ｐｈｅ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ−Ａｓｐ／Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ／Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ／Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ／Ａｓｎ（Ｆ−Ｒ／Ｈ−Ｂ−Ｆ−Ｂ−Ｙ−Ｉ／Ｖ−Ａ−Ｂ）、配列番号３）のアミノ酸配列を有するＰＫＮ２のＰＤＫ１干渉フラグメントは、ＦＨＤＦＤＹＶＡＤ（配列番号１６）、ＦＲＤＦＤＹＩＡＤ（配列番号１７）、ＦＨＮＦＤＹＶＡＤ（配列番号１８）、ＦＲＮＦＤＹＩＡＤ（配列番号１９）、ＦＨＤＦＮＹＶＡＤ（配列番号２０）、ＦＲＤＦＮＹＩＡＤ（配列番号２１）、ＦＨＤＦＤＹＶＡＮ（配列番号２２）、ＦＲＤＦＤＹＩＡＮ（配列番号２３）、ＦＨＮＦＮＹＶＡＤ（配列番号２４）、ＦＲＮＦＮＹＩＡＤ（配列番号２５）、ＦＨＮＦＤＹＶＡＮ（配列番号２６）、ＦＲＮＦＤＹＩＡＮ（配列番号２７）、ＦＨＤＦＮＹＶＡＮ（配列番号２８）、およびＦＲＤＦＮＹＩＡＮ（配列番号２９）を含む。
本明細書において開示されるＰＤＺ結合ドメインおよびＰＤＫ１干渉フラグメントは、ＰＤＺ結合ドメインのヒトおよびげっ歯類の配列（すなわち、マウスおよび／またはラット）、オルトログまたは対立遺伝子のバリアントから誘導されるが、一方で、本明細書において開示されるＰＫＮ２のＰＤＫ１干渉フラグメントもまた用いることができる。用語「オルトログ」とは、別の種における同じタンパク質であって、同じ活性を示すものを指す。対照的に、「対立遺伝子のバリアント」とは、同じ種における同じタンパク質であって、集団内の多型から生じるアミノ酸配列の改変を有し得るものを指す。ある態様において、ＰＤＺ結合ドメインまたはＰＤＫ１干渉フラグメントのオルトログまたは対立遺伝子のバリアントは、本明細書において開示されるＰＤＺ結合ドメインに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の、しかし１００％未満の、配列同一性を有する。
本発明の一特徴は、本明細書において開示されるＰＤＺ結合ドメインまたはＰＤＫ１干渉フラグメントのＮ末端および／またはＣ末端に対する、１つ以上の非天然のアミノ酸残基の付加を含む。「非天然のアミノ酸残基」とは、ＰＤＺ結合ドメインまたはＰＤＫ１干渉フラグメントのＮ末端またはＣ末端に天然では結合しない残基を指す。例えば、ヒトＰＴＥＮのＰＤＺ結合ドメインは、以下のＰＴＥＮのアミノ酸配列について見出される：ＮＥＰＦＤＥＤＱＨＴＱＩＴＫＶ（配列番号３０）。したがって、ＰＤＺ結合ドメインＤＱＨＴＱＩＴＫＶ（配列番号５）のＮ末端に対するグリシンの付加は、非天然のアミノ酸残基の付加とみなされる。いくつかの態様において、１〜５０個のさらなる非天然のアミノ酸残基が、ＰＤＺ結合ドメインまたはＰＤＫ１干渉フラグメントに付加される。他の態様において、１〜４０個、１〜３５個、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、または１〜１０個のさらなる非天然のアミノ酸残基が、ＰＤＺ結合ドメインまたはＰＤＫ１干渉フラグメントに付加される。特定の態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のさらなる非天然のアミノ酸残基が、ＰＤＺ結合ドメインまたはＰＤＫ１干渉フラグメントに付加される。いくつかの態様において、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、またはトリプトファンのうちの１つ以上が、ＰＤＺ結合ドメインまたはＰＤＫ１干渉フラグメントのＮ末端に付加される。他の態様において、メチオニン、アラニン、アルギニン、バリン、リジンまたはグルタミンのうちの１つ以上が、Ｃ末端に付加される。
ある態様において、ＰＤＺ結合ドメインまたはＰＤＫ１干渉フラグメントに付加される１つ以上の非天然のアミノ酸残基は、塩基性残基が非常に豊富なタンパク質伝達ドメイン（protein transduction domain：ＰＴＤ）または細胞浸透ペプチド（cell-penetrating peptide：ＣＰＰ）を構成する。ＣＰＰは、３つのクラス：タンパク質由来ペプチド、モデルペプチドおよびデザインされたペプチド（designed peptide）に分類することができる。タンパク質由来ペプチドは、タンパク質ドメインの短い伸長部であって、移行能力を主に担っており、ＰＴＤとも呼ばれる。例として、８６マーのＴＡＴタンパク質に由来するＴＡＴペプチド、Drosophila Antennapediaのホメオドメインに由来するペネトラチン、マウスの血管内皮カドヘリンに由来するｐＶＥＣ、およびシグナル配列に基づくペプチドまたは細胞膜移行配列（ＭＴＳ）が挙げられる。ＭＡＰ（ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ；配列番号３１）などのモデルペプチドは、既知のＣＰＰの移行特性を模倣するＣＰＰである。デザインされたＣＰＰは、異なるソースからの親水性ドメインと疎水性ドメインとの融合により生成されるキメラペプチドを包含する。デザインされたＣＰＰの例として、トランスポータン（ガラニンとマストパランとの融合）、ＭＰＧ（HIV-1 gp41タンパク質とSV40 T抗原の核移行配列との融合配列からなるキメラペプチド）が挙げられる。加えて、ポリアルギニンなどの合成ペプチドもまた、移行を示す。いくつかの態様において、ＣＰＰは、好ましくは４０アミノ酸残基長未満の短いペプチドである。他の態様において、ＣＰＰは、ＰＤＺ結合ドメインのＮ末端に付加される。
特定の態様において、ＰＤＺ結合ドメインまたはＰＤＫ１干渉フラグメントは、以下：
（ａ）Ｘ１−Ｋ−Ｋ−Ｋ−Ｉ−Ｋ−ψ−Ｅ−Ｉ−Ｘ２−Ｘ３（配列番号３２）、ここで、Ｘ１は、Ｋ、Ｖ−Ｋであるかまたは不在であり；Ｘ２は、Ｋ、Ｋ−Ｉであるかまたは不在であり；Ｘ３は、１〜４アミノ酸残基の配列であるかまたは不在であり；ψは任意のアミノ酸残基であり、ここで、（ａ）の具体例としては、これらに限定されないが、ＶＫＫＫＫＩＫＲＥＩＫＩ（配列番号３３）、ＶＫＫＫＫＩＫＮＥＩＫＩ（配列番号３４）、ＶＫＫＫＫＩＫＡＥＩＫＩ（配列番号３５）またはＶＫＫＫＫＩＫＫＥＩＫＩ（配列番号３６）が挙げられる；
（ｂ）（ＲＱＫＲＬＩ）３（配列番号３７）、（ＲＨＳＲＩＧ）３（配列番号３８）、ＲＨＳＲＩＧＩＩＱＱＲＲＴＲＮＧ（配列番号３９）、ＲＨＳＲＩＧＶＴＲＱＲＲＡＲＮＧ（配列番号４０）、またはＲＲＲＲＲＲＲＳＲＧＲＲＲＴＹ（配列番号４１）；あるいは
（ｃ）表１に列記されるＣＰＰ
を含むか、これらからなる配列を有するＣＰＰとコンジュゲート形成するか、またはこれと連結される。
細胞浸透ペプチドはさらに、US 2013/0129726；WO 03/011898；WO 2004/011595；WO 2010/112471；WO 2012/042038；WO 2013/098337；Guergnon, et al. (2006) Mol. Pharmacol. 69:1115-1124；Fonseca, et al. (2009) Adv. Drug Deliv. Rev. 61:953-964；Nakase, et al. (2012) J. Contr. Rel. 159:181-188；Bolhassani (2011) Biochim. Biophys. Acta 1816:232-246；Milleti (2012) Drug Disc. Today 17:850-860；またはAroui et al. (2009) Cancer Lett. 285:28-38において記載されるものであってもよい。加えて、ｓＣ１８などのＣＰＰの二量体化が、ＣＰＰの薬物送達能力を増大することが示されている（Hoyer, et al. (2012) Beilstein J. Org. Chem. 8:1788-97）。
ある態様において、ＰＤＺ結合ドメインまたはＰＤＫ１干渉フラグメントは、Ｔａｔペプチド、ポリアルギニンペプチド、またはポリリジンペプチドとコンジュゲート形成するか、またはこれと連結される。一態様において、ＰＤＺ結合ドメインまたはＰＤＫ１干渉フラグメントは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４３）を有するＴａｔペプチドとコンジュゲート形成するか、またはこれと連結される。別の態様において、ＰＤＺ結合ドメインまたはＰＤＫ１干渉フラグメントは、アミノ酸配列ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号４４）を有するポリアルギニンペプチドとコンジュゲート形成するか、またはこれと連結される。さらなる態様において、ＰＤＺ結合ドメインまたはＰＤＫ１干渉フラグメントは、アミノ酸配列ＫＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号５１）を有するポリリジンペプチドとコンジュゲート形成するか、またはこれと連結される。
１つ以上のさらなる非天然のアミノ酸残基の代わりに、またはこれに加えて、本発明の修飾されたペプチドは、１つ以上の翻訳後修飾を含む。かかる修飾は、修飾されたペプチドの安定性、半減期、取り込み、活性または効力を増大するために用いることができる。既知の修飾として、これらに限定されないが、アセチル化、アシル化、アミド化、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、共有結合による架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、メチル化、ミリストイル化、酸化、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（selenoylation）、硫酸化およびユビキチン化が挙げられる。
修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、および／またはＮまたはＣ末端を含む修飾されたペプチド中のいずれで起きてもよい。本発明の範囲内の多様な翻訳後修飾の簡単な説明を、表２に記載する。
ある態様において、ＰＤＺ結合ドメインまたはＰＤＫ１干渉フラグメントのＣ末端は、アミド化（−ＮＨ２と表される）、ペプチドアルコールおよびアルデヒドの付加、エステルの付加、ｐ−ニトロアニリンまたはチオエステルの付加により修飾され得る。他の態様において、ＰＤＺ結合ドメイン／ＰＤＫ１干渉フラグメントのＮ末端および／または側鎖は、ＰＥＧ化、アセチル化、ホルミル化、脂肪酸の付加、ベンゾイルの付加、ブロモアセチルの付加、ピログルタミルの付加、サクシニル化、テトラブトキシカルボニル（tetrabutyoxycarbonyl）の付加、および３−メルカプトプロピルの付加、アシル化（例えば、リポペプチド）、ビオチン化、リン酸化、硫酸化、グリコシル化、マレイミド基、キレート部分、発色団およびフルオロフォアの導入により修飾され得る。一態様において、ペプチドは、脂肪酸とコンジュゲートを形成し、例えば、ペプチドは、ミリストイル化される（「ｍｙｒ」と表される）。例えば、脂肪酸は、ＰＤＺ結合ドメインまたはＰＤＫ１干渉フラグメントのＮ末端とコンジュゲート形成してもよく、かかる脂肪酸として、カプリル酸、カプリン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸などが挙げられる。さらに、ペプチド中のシステインは、パルミトイル化され得る。一態様において、ＰＤＺ結合ドメインは、Ｎ末端アミノ酸残基において、ミリスチル化、ステアリル化またはパルミトイル化される。一態様において、ＰＤＺ結合ドメインは、Ｎ末端アミノ酸残基においてミリスチ化される。
１つ以上のさらなる非天然のアミノ酸残基および翻訳後修飾の代わりに、またはこれに加えて、本発明の修飾されたペプチドは、ペプチドをタンパク質分解から保護するための、１つ以上の非加水分解性結合の導入を含む。かかる修飾として、（ＣＨ２ＮＨ）還元型結合、（ＮＨＣＯ）レトロ−インベルソ（retro-inverso）結合、（ＣＨ２−Ｏ）メチレン-オキシ結合、（ＣＨ２−Ｓ）チオメチレン結合、（ＣＨ２ＣＨ２）カルバ結合（carba bond）、（ＣＯ−ＣＨ）セトメチレン（cetomethylene）結合、（ＣＨＯＨ−ＣＨ２）ヒドロキシエチレン結合、（Ｎ−Ｎ）結合、Ｅ−アルケン（alcene）結合、または−ＣＨ＝ＣＨ−結合による、少なくとも１つの−ＣＯＮＨ−ペプチド結合の置き換えなどの、内部修飾が挙げられる。
本発明の修飾されたペプチドは、１つ以上のさらなる非天然のアミノ酸残基、１つ以上の翻訳後修飾、および／または１つ以上の非加水分解性結合を含んでもよい。ＰＴＥＮおよびＰＨＬＰＰのＰＤＺ結合ドメインおよびＰＫＮのＰＤＫ１干渉フラグメントを含む代表的な修飾されたペプチドとして、これらに限定されないが、表３において列記されるペプチドが挙げられる。
いくつかの態様において、修飾されたペプチドは、配列番号６３〜２０６のアミノ酸配列を有する。他の態様において、本発明の修飾されたペプチドは、配列番号６３〜１１０、１１８〜１３４、または１４２〜２０６のアミノ酸配列を有する。一態様において、本発明の修飾されたペプチドは、以下から選択される：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＤＱＨＳＱＩＴＫＶ（配列番号１１１）、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＤＱＨＳＱＩＴＫＶ（配列番号１１２）、ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＤＱＨＳＱＩＴＫＶ（配列番号１１３）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＤＱＨＳＱＩＴＫＶ−ＮＨ２（配列番号１１４）、ＤＱＨＳＱＩＴＫＶ−ＮＨ２（配列番号１１７）、ｍｙｒ−ＤＱＨＳＱＩＴＫＶ−ＮＨ２（配列番号１１８）、ｍｙｒ−ＤＱＨＳＱＩＴＫＶ（配列番号１１９）、ＧＤＱＨＳＱＩＴＫＶ−ＮＨ２（配列番号１２０）、ｍｙｒ−ＧＤＱＨＳＱＩＴＫＶ−ＮＨ２（配列番号１２１）、ｍｙｒ−ＧＤＱＨＳＱＩＴＫＶ（配列番号１２２）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＤＱＨＴＱＩＴＫＶ（配列番号１３５）、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＤＱＨＴＱＩＴＫＶ（配列番号１３６）、ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＤＱＨＴＱＩＴＫＶ（配列番号１３７）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＤＱＨＴＱＩＴＫＶ−ＮＨ２（配列番号１３８）、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＤＱＨＴＱＩＴＫＶ−ＮＨ２（配列番号１３９）、ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＤＱＨＴＱＩＴＫＶ−ＮＨ２（配列番号１４０）、ＤＱＨＴＱＩＴＫＶ−ＮＨ２（配列番号１４１）、ｍｙｒ−ＤＱＨＴＱＩＴＫＶＶ−ＮＨ２（配列番号１４２）、ｍｙｒ−ＤＱＨＴＱＩＴＫＶ（配列番号１４３）、ＧＤＱＨＴＱＩＴＫＶ−ＮＨ２（配列番号１４４）、ｍｙｒ−ＧＤＱＨＴＱＩＴＫＶ−ＮＨ２（配列番号１４５）、およびｍｙｒ−ＧＤＱＨＴＱＩＴＫＶ（配列番号１４６）。
本発明の修飾されたペプチドは、組み換えＤＮＡ技術を用いて組み換えにより合成してもよい。したがって、本発明は、本発明の修飾されたペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。関連する側面において、本発明は、本発明の修飾されたペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター、特に発現ベクターを提供する。ある態様において、ベクターは、真核細胞または原核細胞における所望されるペプチドの組み換え合成を容易にする、複製、転写および／または翻訳調節配列を提供する。したがって、本発明はまた、ペプチドの組み換え発現のための宿主細胞、および宿主細胞により産生されたペプチドを収集および精製する方法を提供する。組み換えペプチドの産生および精製は、当業者にとって慣用的な業務であり、任意の好適な方法を用いることができる。
あるいは、本発明の修飾されたペプチドは、当該分野において公知の化学合成技術のうちのいずれか、特に固相合成技術により、例えば市販の自動ペプチド合成機を用いて合成することができる。例えば、Stewart & Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chemical Co.；Tarn, et al. (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:6442-55；Merrifield (1986) Science 232:341-347；およびBarany et al. (1987) Int. J. Peptide Protein Res. 30:705-739を参照。
修飾されたペプチドは、当該分野において公知の任意の好適な方法により単離および／または精製することができ、これは、限定することなくゲル濾過およびアフィニティー精製を含む。いくつかの態様において、修飾されたペプチドは、融合部分（またはエピトープタグ）を用いて修飾されたペプチドを単離し、これを任意にプロテアーゼを用いて切断することができるような、融合タンパク質の形態において生成される。一側面において、修飾されたペプチドは、少なくとも１％純粋、例えば、少なくとも５％純粋、少なくとも１０％純粋、少なくとも２０％純粋、少なくとも４０％純粋、少なくとも６０％、少なくとも８０％純粋、および少なくとも９０％純粋であることが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される。単離および／または精製された後、修飾されたペプチドの特性は、本願の例において記載されるもののような当業者に公知の技術により、容易に検証することができる。
本発明の修飾されたペプチドは、突然心停止を処置することおよび心停止の生存率を増大させることにおいて用途を見出す。したがって、本発明はまた、配列番号１、配列番号２または配列番号３からなるＰＤＺ結合ドメインを含み、（ａ）１〜５０（例えば、１〜３）個のさらなる非天然のアミノ酸残基、（ｂ）１つ以上の翻訳後修飾、（ｃ）１つ以上の非加水分解性結合の導入、または（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうちの１つ以上の組み合わせを有する１つ以上の修飾されたペプチドを心停止している対象に投与し、それにより対象の心停止を処置することにより、突然心停止を処置するための方法を提供する。
本発明の目的のために、疾患または障害を有する対象を「処置する」とは、以下の１つ以上を達成することを意味する：（ａ）疾患の重篤度を減少させること；（ｂ）疾患または障害の発症を停止させること；（ｃ）疾患または障害の悪化を阻害すること；（ｄ）疾患または障害を先に有していた患者において当該疾患または障害の再発を制限または予防すること；（ｅ）疾患または障害の退行を引き起こすこと；（ｆ）疾患または障害の症状を改善または除去すること；および（ｇ）生存率を改善すること。本発明のある態様によれば、「処置する」とは、好ましくは、Ａｋｔの活性化の測定可能な増大、ポリオール経路へのグルコースの分路（glucose shunting）の減少、および心停止している対象の生存率の増大または改善を指す。
本明細書において用いられる場合、用語「有効な量」、「有効量」または「治療有効量」とは、記述される所望される結果を達成するために十分な、本発明の修飾されたペプチドまたは本発明のペプチドを含む医薬組成物の量を指す。「有効量」または「治療有効量」を構成する修飾されたペプチドの量は、疾患の重篤度、処置されるべき患者の状態、体重もしくは年齢、投与の頻度、または投与の経路に依存して変化し得るが、当業者により慣用的に決定され得る。医師は、最適な治療効果を得るために投与量または投与の経路を滴定することができる。典型的な投与量は、上述の要因に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲またはそれより多くである。ある態様において、投与量は０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または５μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってよい。
いくつかの態様において、心停止している対象は、１つ以上の本発明の修飾されたペプチドを、心臓の機能が回復した後で投与される。他の態様において、心停止している対象は、１つ以上の本発明の修飾されたペプチドを、心肺蘇生術または除細動と組み合わせて投与される。さらなる態様において、心停止している対象は、１つ以上の本発明の修飾されたペプチドを、ニコチンアミドと組み合わせて投与され、ここで、ニコチンアミドは、１つ以上の修飾されたペプチドの投与の前に、これと同時に、またはこれの後に、投与される。特定の態様において、ニコチンアミドは、１つ以上の修飾されたペプチドの投与の前に（例えばＣＰＲの間に）投与される。他の態様において、ニコチンアミドは、心肺蘇生術の間に投与され、修飾されたペプチドは、心臓の機能が回復した後で投与される；ニコチンアミドおよび修飾されたペプチドは、心臓の機能が回復した後で投与される；またはニコチンアミドおよび修飾されたペプチドは、心肺蘇生術の間に投与される。
本発明の修飾されたペプチドは、単独で、またはニコチンアミドと組み合わせて、薬学的に受入可能なキャリアまたは賦形剤を含む医薬組成物中に組み込むことができる。最適な医薬組成物は、例えば意図される投与の経路、送達形式および所望される投与量に依存して、当業者により決定され得る。
投与形態はまた、必要な生理学的に受入可能なキャリア材料、賦形剤、潤滑剤、緩衝化剤、界面活性剤、抗菌剤、嵩高剤（マンニトールなど）、抗酸化剤（アスコルビン酸または亜硫酸ナトリウム）などを含んでもよい。
受入可能な処方材料は、好ましくは、使用される投与量および濃度においてレシピエントにとって非毒性である。医薬組成物は、例えばｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、組成物の溶解または放出、吸着または浸透の速度を改変、維持または保存するための処方材料を含んでもよい。好適な処方材料として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝化剤（ホウ酸、重炭酸、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸、リン酸または他の有機酸など）；嵩高剤（マンニトールまたはグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）；着色剤、香味剤、および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成性対イオン（ナトリウムなど）；保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック（Pluronic）、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０などのポリソルベート、TRITON、トリメタミン、レシチン、コレステロールまたはチロキサポール（tyloxapal）など）；安定性増強剤（スクロースまたはソルビトールなど）；浸透圧増強剤（アルカリ金属ハライド、好ましくは塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム、マンニトール、またはソルビトールなど）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または医薬用アジュバント。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（第１９版、１９９５年）を参照。
医薬組成物における主要なビヒクルまたはキャリアは、水性または非水性の性質のいずれであってもよい。例えば、好適なビヒクルまたはキャリアは、注射用水、生理食塩水溶液、または人工脳脊髄液であってよく、非経口投与のための組成物において一般的な他の材料を補充されていてもよい。中性に緩衝化された食塩水または血清アルブミンと混合された食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓバッファー、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸バッファーを含んでもよく、これはさらに、ソルビトールまたはその好適な基質を含んでもよい。本発明の医薬組成物は、所望される程度の純度を有する選択された組成物を、任意の処方剤と混合することにより、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態において、貯蔵のために調製してもよい。さらに、本発明の修飾されたペプチドは、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として処方してもよい。
本発明の医薬組成物のための投与経路として、静脈内、腹腔内、実質内（intra-parenchymal）、脳室内、筋肉内、眼内、関節内、門脈内、または病巣内経路による注射；持続放出系によるもの：または移植デバイスによるものが挙げられる。鼻内、経口および経皮経路もまた企図される。好ましくは、医薬組成物は、ボーラス注射により、または注入により持続的に、または移植デバイスにより投与される。医薬組成物はまた、メンブレン、スポンジ、または所望される分子が吸収もしくは封入された別の適切な材料の移植を介して、局所的に投与することができる。移植デバイスが用いられる場合、デバイスは、任意の好適な組織または器官中に移植することができ、所望される分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス、または持続投与を介するものであってよい。
本発明の医薬組成物は、非経口で送達してもよい。非経口投与が企図される場合、本発明における使用のための治療用組成物は、パイロジェンフリーの、本発明のスクリーニング方法において同定される所望される化合物を薬学的に受入可能なビヒクル中に含む、非経口で受入可能な水溶液の形態におけるものであってよい。非経口注射のために特に好適なビヒクルは、無菌蒸留水であって、その中で化合物が適切に保存された無菌の等張水溶液として処方されるものである。調製は、注射可能なマイクロスフェア、生体内分解性（bio-erodible）粒子、ポリマー化合物、ビーズまたはリポソームなどの剤を用いた、所望される分子の処方を含んでもよく、これらは、生成物の制御放出または持続放出を提供することができ、これらはしたがってデポー注射を介して送達することができる。ヒアルロン酸を用いた処方は、循環中での持続期間を促進する効果を有する。移植可能な薬物送達デバイスは、所望される分子を導入するために用いてもよい。
本発明の方法に従う処置を容易にするために、本発明はまた、代謝的傷害を逆転させるために必要とされる、修飾されたペプチドの投与量を指導するためのコンパニオン診断を提供する。特に、今や、ソルビトールおよびタウリン（２−アミノエタンスルホン酸）の血中濃度の上昇が、ＳＣＡマウスおよびＳＣＡ患者の低い生存率と関連することが観察されている。ＳＣＡのマウスモデルにおいて、血中のソルビトールおよびタウリンの濃度は、ＣＰＲの間の能動的冷却、ならびにVO-OHpicの投与の両方により低下した。したがって、ソルビトールおよび／またはタウリンの血中濃度の上昇は、ＳＣＡの間の心臓の代謝的回復状態を反映し、ＳＣＡの後の処置を指導し、予後を予測する診断マーカーとして役立つ。
したがって、本発明はまた、例えば、本明細書において開示される修飾されたペプチド、低体温および／またはニコチンアミドにより、心停止の処置を指導するための方法を提供する。方法は、心停止を有することが疑われる対象から血液試料を得るステップ；血液試料をソルビトールまたはタウリンを検出するための試薬と接触させるステップ；および、血液試料中のソルビトールまたはタウリンのレベルを対照試料と比較したものとして検出するステップを含み、ここで、対照試料と比較して上昇した、対象におけるソルビトールまたはタウリンの血中濃度は、対象が、これらに限定されないが、低体温療法、修飾されたＰＤＺ結合ドメインペプチドおよび／またはニコチンアミドを含む、１つ以上の治療による処置のための候補であることを示す。提供される方法において、対照試料は、健康な対象からの血液試料（例えば、全血、血清または血漿試料）、ＳＣＡの前の同じ対象からの血液試料、または、入院時に回収された同じ対象からの血液試料であってよい。対照試料と比較して上昇した、対象におけるソルビトールまたはタウリンの血中濃度は、対象において、対照試料と比較して２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、またはそれより高い、ソルビトールまたはタウリン濃度を含んでもよい。
タウリンのレベルは、酵素アッセイ法またはＵＶ分光光度法を含む任意の好適な試薬および方法を用いて決定することができる。タウリンの酵素検出によれば、血液試料を、タウリンジオキシゲナーゼ（EC 1.14.11.17）、二価の鉄およびα−ケトグルタル酸と接触させ、生じる生成物のうちの１つ以上を定量する（Matsuda & Asano (2012) Anal. Biochem. 427:121-3）。いくつかの態様において、生成物は、亜硫酸塩であり、これは、例えばエルマン試薬またはフルオレセインベースのプローブを用いて測定することができる（Ma, et al. (2013) Sensor Actuat. B: Chem. 188:1196-1200）。他の態様において、生成物は、２−アミノアセトアルデヒドであり、これは、アルコールデヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＨを用いて検出される（例えば、WO 2011/108670を参照）。例えば、BioVision Inc.（Milpitas, CA）から入手可能なタウリンアッセイキットを参照。タウリンのＵＶ分光光度的検出は、ニンヒドリンを用いて行うことができる（Draganov, et al. (2014) Internat. J. Nutr. Food Sci. 3:123-126）。
タウリンのレベルを評価する代わりに、またはそれに加えて、血球細胞のソルビトール濃度を用いて心臓のソルビトール蓄積を評価してもよい。ソルビトール濃度は、比色アッセイまたはＨＰＬＣ分析を用いて測定することができる。比色アッセイにおいて、ソルビトールデヒドロゲナーゼが、ソルビトールのフルクトースへの変換を触媒し、これは、最大５６０ｎｍの吸光度により、強い色の比例的な発色を伴う。ソルビトールを検出するための試薬は、当該分野において公知である。例えば、BioVision Inc.（Milpitas, CA）から入手可能なＤ−ソルビトール比色アッセイキットを参照。ＨＰＬＣによる決定は、公知の方法を用いて行うことができる（Simonzadeh & Ronsen (2012) J. Chromatog. Sci. 50:644-7）。
本発明はまた、修飾されたペプチド、またはこれを含む医薬組成物のうちの１つ以上、ならびに（ａ）補助治療としてのニコチンアミド、および／または（ｂ）処置を指導するための１つ以上のソルビトールまたはタウリンを検出するための試薬を含むキットを提供する。キットは、典型的には、好適な容器（例えば、例えば、ホイル、プラスチック、または厚紙のパッケージ）中で提供される。ある態様において、キットは、本明細書において記載されるような、１つ以上の医薬用賦形剤、医薬用添加物などを含んでもよい。他の態様において、キットは、適切な投与のための手段、例えば目盛りのついたカップ、シリンジ、針、洗浄補助剤、その他などを含んでもよい。ある態様において、キットは、適切な投与のための指示、および／または適切な投与のための調製物を含んでもよい。特定の態様において、キットは、修飾されたペプチドの１つ以上の予め決定された量を含む、予め充填されたシリンジを含んでもよい。別の態様において、キットは、ニコチンアミドの予め決定された量を含む、予め充填されたシリンジを含む。
示されるとおり、キットはさらに、ソルビトールおよび／またはタウリンを検出するための試薬を含んでもよい。これらの試薬は、対象が、修飾されたペプチド、ニコチンアミドおよび／または低体温により処置されるべきか否かについて；ならびに／または投与する修飾されたペプチドおよび／もしくはニコチンアミドの量を選択することの指導を提供することにおいて有用である。タウリンを検出するための試薬として、これらに限定されないが、タウリンジオキシゲナーゼ、二価の鉄、α−ケトグルタル酸、エルマン試薬、フルオレセインベースのプローブ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨおよびニンヒドリンが挙げられる。ソルビトールを検出するための試薬として、これらに限定されないが、ソルビトールデヒドロゲナーゼが挙げられる。いくつかの態様において、タウリンを検出するための１つ以上の試薬は、タウリンジオキシゲナーゼ、二価の鉄、α−ケトグルタル酸、およびエルマン試薬を含む。別の態様において、タウリンを検出するための１つ以上の試薬は、タウリンジオキシゲナーゼ、二価の鉄、α−ケトグルタル酸、およびフルオレセインベースのプローブを含む。さらなる態様において、タウリンを検出するための１つ以上の試薬は、タウリンジオキシゲナーゼ、二価の鉄、α−ケトグルタル酸、アルコールデヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＨを含む。さらにさらなる態様において、タウリンを検出するための１つ以上の試薬は、ニンヒドリンを含む。
以下の非限定的な例は、本発明をさらに説明するために提供される。
例１：ＴＡＴ−ＰＴＥＮ９ｃは、心停止後の生存率を改善する
２つのＴＡＴベースの細胞浸透性ペプチド、ＴＡＴ−ＰＴＥＮ９ｃおよびＴＡＴ−ＰＨＬＰＰ９ｃを、心停止の処置のために設計した。ＴＡＴ−ＰＴＥＮ９ｃおよびＴＡＴ−ＰＨＬＰＰ９ｃは、それぞれ、ＰＴＥＮおよびＰＨＬＰＰＰホスファターゼのカルボキシ末端ＰＤＺ結合モチーフを標的とする。ＴＡＴ−ＰＨＬＰＰ９ｃ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＬＰＤＣＹＤＴＰＬ；配列番号６３）およびＴＡＴ−ＰＴＥＮ９ｃ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＤＱＨＳＱＩＴＫＶ；配列番号１１１）は、２０アミノ酸残基のペプチドであり、ここで、１１個のアミノ酸残基は、Ｔａｔタンパク質の細胞膜伝達ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号４３）から誘導され、残りの９個のアミノ酸残基は、それぞれ、マウスＰＨＬＰＰ１のＣ末端残基（ＬＰＤＣＹＤＴＰＬ；配列番号８）またはＰＴＥＮのＣ末端残基（ＤＱＨＳＱＩＴＫＶ；配列番号４）から誘導される。２つの対照ペプチド、ＴＡＴ−ＰＴＥＮａａａおよびＴＡＴ−ＰＨＬＰＰａａａもまた調製した。これらの対照ペプチドにおいて、最後の３個のアミノ酸残基を、アラニンに変異させた。
マウスの心筋細胞を、公知の方法に従って、１〜３日齢の仔マウスから単離した（Zhu, et al. (2014) PLoS One 9:e95622）。ウェスタンブロット分析を用いて、酸化剤（Ｈ２Ｏ２）またはＩＧＦ−１に暴露されたマウス心筋細胞においてＡｋｔのリン酸化を増強することについての、本発明の代表的なペプチド（ＴＡＴ−ＰＴＥＮ９ｃ）の効力を決定した。Ｃ５７ＢＬ６マウスを、確立されたカリウム誘導型の８分間のＳＣＡプロトコルに供した（Li, et al. (2015) Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 308:H1414-22）。平均動脈血圧（ＭＡＰ）、呼気終末ＣＯ２（ＥｔＣＯ２）、体温および心電図（ＥＣＧ）を、心肺蘇生術（ＣＰＲ）の成功の４時間後まで記録した。ＴＡＴ−ＰＴＥＮ９ｃ（７．５ｍｇ／ｋｇ）または食塩水を、ＲＯＳＣの直後に静脈内（ＩＶ）で投与した。カプラン−マイヤー分析により、マウスの生存曲線を作成した。ＴＡＴ−ＧＦＰのＩＶ投与を用いて、心臓および脳組織のＴＡＴタンパク質送達の動態を測定した。
前述の実験は、ＴＡＴ−ＰＴＥＮ９ｃが、マウス心筋細胞においてＡｋｔの活性化を濃度依存的な様式において迅速に増強したことを示した（図１Ａ〜１Ｃ）。ウェスタンブロットおよび免疫組織化学は、心臓および脳におけるＴＡＴタンパク質の伝達は拡散的であり、ＩＶ投与の後５分間以内に起こったことを示した（図２）。処置されたマウスは、ソルビトール含有量が著しく減少した脳組織を有し、このことは、代謝的回復およびグルコース利用の改善を示唆している（図３）。加えて、ＲＯＳＣの直後のＴＡＴ−ＰＴＥＮ９ｃの投与は、ＭＡＰおよびＥｔＣＯ２を改善し（表４）、心停止後のマウスの生存率を著しく改善した（図４）。
例２：ＲＯＳＣ後に投与されるＴＡＴ−ＰＴＥＮ９ｃは利益をもたらす
修飾されたペプチド投与のタイミングを決定するために、ＣＰＲの間またはＲＯＳＣの後にＴＡＴ−ＰＴＥＮ９ｃを投与した。Ｃ５７ＢＬ６マウスを、確立されたカリウム誘導型８分間ＳＣＡプロトコルに供した（Li, et al. (2015) Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 308:H1414-22）。平均動脈血圧（ＭＡＰ）を、ＣＰＲが成功してから４時間後まで記録した。ＴＡＴ−ＰＴＥＮ９ｃ（７．５ｍｇ／ｋｇ）または食塩水（ＮＳ）を、ＣＰＲの間、およびＲＯＳＣの直後に、静脈内（ＩＶ）で投与した。
この分析は、ＣＰＲの間に投与されたＴＡＴ−ＰＴＥＮ９ｃは、蘇生率に対して何らの改善も有しなかったが、ＲＯＳＣの後に投与されたＴＡＴ−ＰＴＥＮ９ｃは、ＲＯＳＣの３０分後（６５．２±１．１ｍｍＨｇ、対、ＮＳにおける５７．５±１．０ｍｍＨｇ）および４時間後（４９．９±０．７ｍｍＨｇ、対、ＮＳにおける４３．７±３．５ｍｍＨｇ、ｐ＜０．０５）において、ＭＡＰを著しく改善したことを示す。
例３：ニコチンアミドとＴＡＴ−ＰＴＥＮ９ｃとの組み合わせ処置
ニコチンアミド（ＮＡＭ）とＴＡＴ−ＰＴＥＮ９ｃとの共投与の利益を評価した。Ｃ５７ＢＬ６マウスを、確立されたカリウム誘導型８分間ＳＣＡプロトコルに供した。ニコチンアミド（ビタミンＢ３）をＣＰＲの間に投与し、ＴＡＴ−ＰＴＥＮ９ｃをＲＯＳＣの後に投与し、各群について約１２分の中断時間を設けた。
対照群（生理食塩水；ｎ＝３ ＲＯＳＣ）について、全てのマウスは、１０分間未満生存した。ニコチンアミド単独群（ＮＡＭ、ｎ＝５ ＲＯＳＣ）について、全てのマウスは、１時間未満生存した。ＮＡＭおよびＴＡＴ−ＰＴＥＮ９ｃの群（ｎ＝７）について、全てのマウスは、１〜４時間生存した。
例４：代謝マーカーは心臓の機能および突然心停止の後の生存率を予測する
代謝の改変およびエネルギー産生は、ＳＣＡの後の重要な予後である。ＳＣＡのマウスモデル（Li, et al. (2015) Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 308:H1414-22）を用いて、いくつかの代謝化合物を、処置プロトコル（例えば、能動的冷却、低体温療法、または修飾されたＰＤＺ結合ドメインペプチド治療薬）の選択を指導することにおける使用のための診断マーカーとして同定した。
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）は、グルコース利用のための重要なコファクターであり、虚血後数分間以内に急速に低下する。ＮＡＤの喪失は、グルコース代謝を妨害し、結果としてソルビトールへのポリオール経路を介したグルコースの変換をもたらす。ソルビトールの蓄積の増加は、組織のモル浸透圧濃度を変化させ、ソルビトール蓄積により作られた浸透圧ストレスに対する代償応答として、血中へのタウリンの放出を促進する。心臓は、タウリンの主なソースであり、血中タウリン濃度は、心臓のソルビトール濃度と正に相関する。図６を参照。今や、ソルビトールまたはタウリンの高い血中濃度が、ＳＣＡマウスおよびＳＣＡ患者の低い生存率と関連することが、観察されている。血中タウリン濃度は、ＣＰＲの間の能動的冷却、ならびにVO-OHpicの投与の両方により低下する。したがって、ソルビトールまたはタウリンの高い血中濃度はＳＣＡの間の心臓の代謝回復状態を反映し、ＳＣＡの後の処置を指導し予後を予測する、診断マーカーとして役立つ。

Claims (18)

  1. 配列番号１からなるＰＤＺ結合ドメイン、および
    （ａ）１〜３個のさらなる非天然のＮ末端アミノ酸残基、
    （ｂ）１〜３個のさらなる非天然のＣ末端アミノ酸残基、
    （ｃ）翻訳後修飾、
    （ｄ）１つ以上の非加水分解性結合の導入、または
    （ｅ）（ａ）〜（ｄ）のうちの１つ以上の組み合わせ
    を含む、修飾されたペプチド。
  2. 請求項１に記載の修飾されたペプチドおよび薬学的に受入可能なキャリアを含む、医薬組成物。
  3. ニコチンアミドをさらに含む、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 配列番号２からなるＰＤＺ結合ドメイン、または配列番号３のＰＤＫ１干渉フラグメント、および
    （ａ）１〜５０個のさらなる非天然のアミノ酸残基、
    （ｂ）１つ以上の翻訳後修飾、
    （ｃ）１つ以上の非加水分解性結合の導入、または
    （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうちの１つ以上の組み合わせ
    を含む、修飾されたペプチド。
  5. さらなる非天然のアミノ酸残基が、細胞浸透ペプチドを含む、請求項４に記載の修飾されたペプチド。
  6. 請求項４に記載の修飾されたペプチドおよび薬学的に受入可能なキャリアを含む、医薬組成物。
  7. ニコチンアミドをさらに含む、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 配列番号６３〜１１０、１１８〜１３４、または１４２〜２０６のアミノ酸配列を含む、修飾されたペプチド。
  9. 配列番号１、配列番号２からなるＰＤＺ結合ドメイン、または配列番号３のＰＤＫ１干渉フラグメント、および
    （ａ）１〜５０個のさらなる非天然のアミノ酸残基、
    （ｂ）１つ以上の翻訳後修飾、
    （ｃ）１つ以上の非加水分解性結合の導入、
    （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のうちの１つ以上の組み合わせ、
    を含む修飾されたペプチドを、心停止している対象に投与し、それにより対象の心停止を処置することを含む、突然心停止を処置するための方法。
  10. さらなる非天然のアミノ酸残基が、細胞浸透ペプチドを含む、請求項９に記載の方法。
  11. 修飾されたペプチドを、薬学的に受入可能なキャリアと共に投与する、請求項９に記載の方法。
  12. 修飾されたペプチドが、心臓の機能が回復した後で投与される、請求項９に記載の方法。
  13. ニコチンアミドを投与することをさらに含む、請求項９に記載の方法。

  14. （ａ）ニコチンアミドが、心肺蘇生術の間に投与され、修飾されたペプチドが、心臓の機能が回復した後で投与される；
    （ｂ）ニコチンアミドおよび修飾されたペプチドが、心臓の機能が回復した後で投与される；または
    （ｃ）ニコチンアミドおよび修飾されたペプチドが、心肺蘇生術の間に投与される、
    請求項１３に記載の方法。
  15. 対象からの血液試料中のソルビトールまたはタウリンのレベルを決定するプレステップをさらに含む、請求項９に記載の方法であって、ここで、対照試料と比較して上昇した対象からの血液試料ソルビトールまたはタウリンのレベルが、対象に投与するべき修飾されたペプチドの量を示す、前記方法。
  16. （ａ）配列番号１、配列番号２からなるＰＤＺ結合ドメイン、または配列番号３のＰＤＫ１干渉フラグメント、および
    （ｉ）１〜５０個のさらなる非天然のアミノ酸残基、
    （ｉｉ）１つ以上の翻訳後修飾、
    （ｉｉｉ）１つ以上の非加水分解性結合の導入、
    （ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のうちの１つ以上の組み合わせ
    を含む修飾されたペプチド、ならびに
    （ｂ）ニコチンアミド、ソルビトールを検出するための１つ以上の試薬、タウリンを検出するための１つ以上の試薬、またはそれらの組み合わせ
    を含む、キット。
  17. さらなる非天然のアミノ酸残基が、細胞浸透ペプチドを含む、請求項１６に記載のキット。
  18. 心停止の処置を指導するための方法であって、心停止していることが疑われる対象から血液試料を入手すること；血液試料をソルビトールまたはタウリンを検出するための試薬と接触させること；および、血液試料中のソルビトールまたはタウリンのレベルを対照試料と比較したものとして検出することを含み、ここで、対照試料と比較して高い対象の試料中のソルビトールまたはタウリンのレベルは、対象が、低体温療法、ニコチンアミド、修飾されたＰＤＺ結合ドメインペプチドまたはそれらの組み合わせによる処置を必要としていることを示す、前記方法。
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