JP2018533927A

JP2018533927A - 新規のｐｃｒプライマーおよびｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するためのその方法

Info

Publication number: JP2018533927A
Application number: JP2018516540A
Authority: JP
Inventors: ムハンマドマジード; カリアナムナガブシャナム; シヴァクマールアルムガム; フルカンアリ
Original assignee: サミラブズリミテッド
Priority date: 2015-10-01
Filing date: 2016-09-27
Publication date: 2018-11-22
Anticipated expiration: 2036-09-27
Also published as: AU2016332583A1; US20170096700A1; RS61730B1; CA2999517C; CA2999517A1; PH12018500553A1; JP6938479B2; EP3356545B1; US10260112B2; PL3356545T3; HK1258685A1; WO2017058741A1; EP3356545A1; EP3356545A4

Abstract

本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、新規のオリゴヌクレオチドプライマー配列ＢＣ１、ＢＣ２およびＢＣ３について開示する。本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、前記プライマーを使用するＰＣＲベースの方法であって、プライマーセットＢＣ１、ＢＣ２による陽性増幅、およびプライマーセットＢＣ３による陰性増幅によりＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの存在が確認される、方法についても開示する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１０月１日出願の米国仮出願第６２２３５５９３号の非仮出願である。
本発明は概して、分子生物学分野およびプロバイオティック乳酸菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ(バチルスコアグランス)に関する。より詳細には、本発明は、（ｉ）Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための新規のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｉｉ）Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、前記プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの方法に関する。

先行技術の説明
プロバイオティクスは今や、腸管感染症および尿路感染症を有効に管理するための栄養補助食品として広く使用されている。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ属のプロバイオティック細菌が、多くの販売業者から経口用栄養補助食品の形態で市販されている。プロバイオティック活性は細菌種／株の型と関連しているため、プロバイオティック栄養補助食品中の細菌種／株の型を同定することが急務となっている。乳、乳製品およびその他の栄養補助食品に混入するおそれのあるその他の病原性Ｂａｃｉｌｌｕｓ種から、プロバイオティック細菌を同定および区別することも急務である。

Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓは、広く使用されるプロバイオティック栄養補助食品の１つである。アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを缶詰食品に混入する細菌の１つに挙げている（Landry et al.(2001) Bacteriological Analytical Manual Chapter 21A Examination of Canned Foods In: BAM: Examination of Canned Foods）。プロバイオティクスおよび混入物としてＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓが生物学的に重要であることから、生物を有効に同定することが必要である。ポリメラーゼ連鎖反応（Lei et al., Method for identifying Bacillus coagulans, CN104004846）、リアルタイムＰＣＲ（Liu et al., Fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) method for detecting Bacillus coagulans quickly, CN102304559）、ＰＣＲ−ＲＡＰＤ（Sudha et al., (2010) Molecular Typing and Probiotic Attributes of a New Strain of Bacillus coagulans Unique IS-2: A Potential Biotherapeutic Agent, Genetic Engineering and Biotechnology Journal, 2010:1-20）、ＰＣＲ−変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Theunissen et al., (2005), Identification of probiotic microorganisms in South African products using PCR based DGGE analysis, International Journal of Food Microbiology, 98(1):11-21）などの分子技術を使用してＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓを同定する方法が、当技術分野において周知である。研究の大部分は、１６ｓｒＲＮＡ配列のＢａｃｉｌｌｕｓ種間での差を標的とすることで、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するものである。迅速かつ信頼に足る検出様式のため、その他の機能遺伝子の種間での差を標的とすることでＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するためのオリゴヌクレオチドプライマーが必要である。本発明はこの技術的な問題を、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種の機能遺伝子の差を標的とすることによる、新規のプライマーを使用した鋭敏なＰＣＲベースの方法を開示することで解決する。

本発明の主目的は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、新規のオリゴヌクレオチドプライマーの使用について開示することである。
本発明のさらに別の目的は、前記プライマーを使用してＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するＰＣＲベースの方法について開示することである。
本発明は前記目的を実現し、さらなる関連の利点を提供する。

（ｉ）Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、新規のオリゴヌクレオチドプライマーＢＣ１（配列番号１のフォワードプライマーおよび配列番号２のリバースプライマーを含む）、ＢＣ２（配列番号３のフォワードプライマーおよび配列番号４のリバースプライマーを含む）、ＢＣ３（配列番号５のフォワードプライマーおよび配列番号６のリバースプライマーを含む）、および（ｉｉ）Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、前記プライマーを使用するＰＣＲベースの方法であって、プライマーセットＢＣ１、ＢＣ２による陽性増幅、およびプライマーセットＢＣ３による陰性増幅によりＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの存在が確認される、方法が開示される。
本発明のその他の特徴および利点は、本発明の原理を例として示す添付画像と併せて、以下のより詳細な説明から明らかとなるであろう。

プライマーセットＢＣ１を使用した増幅後のＰＣＲ産物を示す、アガロースゲル（２％）電気泳動画像を示す図である。レーンＡはＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＡＴＣＣ３１２８４を表し、レーンＭはＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＡＴＣＣ５８５６を表し、レーンＣはＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓＡＴＣＣ１４５７９を表し、レーンＳはＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＭＴＣＣ４４１を表し、レーンＲは０．１、０．２、０．３、０．６、１、１．５、２、２．５および３Ｋｂのフラグメントを有するＤＮＡラダーを表す。プライマーセットＢＣ２を使用した増幅後のＰＣＲ産物を示す、アガロースゲル（２％）電気泳動画像を示す図である。レーンＡはＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＡＴＣＣ３１２８４を表し、レーンＭはＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＡＴＣＣ５８５６を表し、レーンＣはＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓＡＴＣＣ１４５７９を表し、レーンＳはＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＭＴＣＣ４４１を表し、レーンＲは０．１、０．２、０．３、０．６、１、１．５、２、２．５および３Ｋｂのフラグメントを有するＤＮＡラダーを表す。プライマーセットＢＣ３を使用した増幅後のＰＣＲ産物を示す、アガロースゲル（２％）電気泳動画像を示す図である。レーンＡはＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＡＴＣＣ３１２８４を表し、レーンＭはＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＡＴＣＣ５８５６を表し、レーンＣはＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓＡＴＣＣ１４５７９を表し、レーンＳはＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＭＴＣＣ４４１を表し、レーンＲは０．１、０．２、０．３、０．６、１、１．５、２、２．５および３Ｋｂのフラグメントを有するＤＮＡラダーを表す。

最も好ましい実施形態において、本発明は、
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、
ａ）配列番号１のフォワードプライマーおよび配列番号２のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ１、
ｂ）配列番号３のフォワードプライマーおよび配列番号４のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ２、
ｃ）配列番号５のフォワードプライマーおよび配列番号６のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ３
を含む新規のプライマー配列について開示する。
別の好ましい実施形態において、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定する方法であって、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓからＤＮＡを単離するステップ、および単離したＤＮＡを、上記のプライマーを使用して、９４℃で３０秒間（１サイクル）インキュベートし、その後９４℃で３０秒間、アニーリング温度で３０秒間、および７２℃で１分間を３０サイクル、その後７２℃で５分間（１サイクル）最終インキュベーションを行い、４℃で維持することにより増幅するステップを含む方法について開示する。

関連実施形態において、配列番号１のフォワードプライマーおよび配列番号２のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ１のアニーリング温度は６０℃であり、それにより約９９０塩基対の増幅産物が得られる。別の関連実施形態では、配列番号３のフォワードプライマーおよび配列番号４のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ２のアニーリング温度は５８℃であり、それにより約５４３塩基対の増幅産物が得られる。本発明のさらに別の実施形態では、配列番号５のフォワードプライマーおよび配列番号６のリバースプライマーを含むプライマー配列ＢＣ３のアニーリング温度は６８℃であり、それにより約３０１０塩基対の増幅産物が得られる。
別の実施形態において、本発明は、プライマーＢＣ１、プライマーＢＣ２による陽性増幅、およびプライマーＢＣ３による陰性増幅によりＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの存在が確認される、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するためのプロセスについて開示する。
本明細書で開示するプロセスにより、その他の株の中からＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＡＴＣＣ３１２８４、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＡＴＣＣ７０５０、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ２−６、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ３６Ｄ１、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＳ−ｌａｃおよびＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＨＭ−０８を含むＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ株が全て同定され、その他の株の中のＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓを含むＢａｃｉｌｌｕｓ属のその他の種全てと区別される。

本明細書に含まれる以下の特定の例では、本発明の前記最も好ましい実施形態を示す。
（例Ｉ）
プライマー設計および合成
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ株に特有の領域を、データベースにおける入手可能な全ゲノム配列全てについて全ゲノムを広くデータマイニングすることで決定し、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６と比較した。データの初期解析に基づいて特定の領域を３つ選択し、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓと比較した。データのインシリコ解析により、これらの領域がＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ株全てには共通して存在するが、その他のＢａｃｉｌｌｕｓ種には存在しないことが示唆された。

インシリコ結果に基づく、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するためのプライマー合成用として可能性のある遺伝子標的を表１に示す。プライマー設計用の標的遺伝子を、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ間での類似性、ならびにその他のＢａｃｉｌｌｕｓ種すなわちＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓとの相違に基づいて選択した。

プライマーＢＣ１の配列は、鋳型としてｍａｒＣ膜内在性ファミリータンパク質遺伝子を使用して合成した。この遺伝子は、細胞膜を複数回貫通し、かつては複数抗生物質抵抗性タンパク質と考えられていたタンパク質ｍａｒＣを指定する。後の研究で、このタンパク質は複数抗生物質抵抗性には関与していないことが明らかとなった。この遺伝子ファミリーの正確な機能は未だ不明である（McDermott et al., (2008), The marC gene of Escherichia coli is not involved in multiple antibiotic resistance, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 52:382-383）。Ｐｒｉｍｅｒ３ｗｅｂバージョン４．０．０（Untergasser et al., (2012) Primer3 - new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research 40(15):e115）を使用して、約９９０塩基対の増幅産物（配列番号７）が得られる配列番号１および配列番号２のフォワードおよびリバースプライマーを設計した。選択したプライマー配列はＥｕｒｏｆｉｎｓＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂａｎｇａｌｏｒｅ、インドで合成され、ここから得た。

増幅された配列（配列番号７）の基本ローカルアラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）検索を行ったところ、配列番号１のフォワードプライマーおよび配列番号２のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ１により、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ株全てを明確に同定することが可能であった（表２）こと、およびＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓをその他のＢａｃｉｌｌｕｓ種と区別しうることが示された。

プライマーＢＣ２の配列は、鋳型としてＣｏｍＫファミリータンパク質遺伝子を使用して合成した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ種のＣｏｍＫは、コンピテンスシグナルトランスダクション（ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ−ｓｉｇｎａｌ−ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）ネットワークの中心的位置を占める正の自己調節タンパク質である。ＣｏｍＫは、ＤＮＡ結合および取り込み装置の構築に必要な形態形成タンパク質および構造タンパク質を指定する後期コンピテンス遺伝子の転写、ならびにｃｏｍＫ自体の転写を正に調節する（Kovacs et al., (2013), Functional Analysis of the ComK Protein of Bacillus coagulans. PLoS ONE 8(1): e53471）。Ｐｒｉｍｅｒ３ｗｅｂバージョン４．０．（Untergasser et al., (2012) Primer3 - new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research 40(15):e115）を使用して、約５４３塩基対の増幅産物（配列番号８）が得られる配列番号３および配列番号４のフォワードおよびリバースプライマーを設計した。選択したプライマー配列はＥｕｒｏｆｉｎｓＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂａｎｇａｌｏｒｅ、インドで合成され、ここから得た。

増幅された配列（配列番号８）の基本ローカルアラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）検索を行ったところ、配列番号３のフォワードプライマーおよび配列番号４のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ２により、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ株全てを明確に同定することが可能であった（表３）こと、およびＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓをその他のＢａｃｉｌｌｕｓ種と区別しうることが示された。

プライマーＢＣ３の配列は、鋳型としてメチル基受容走化性タンパク質（ＭＣＰ）遺伝子を使用して合成した。メチル基受容走化性タンパク質（ＭＣＰ）は、細菌の膜貫通型センサータンパク質である。ＭＣＰを使用することで細菌は細胞外マトリックスの分子濃度を検知することができ、それゆえに細菌は滑らかに泳ぐか急に方向転換することができる。細菌が誘引物質（栄養素）レベルの上昇または忌避物質（毒素）レベルの下降を検知すると、細菌は前方へ泳ぎ続けるか滑らかに泳ぎ続けることになる。細菌が誘引物質レベルの下降または忌避物質レベルの上昇を検知すると、細菌は急に方向転換して自身を新たな方向に再び方向づけることになる。このようにして、細菌は栄養素に向かって泳ぎ毒素から離れて泳ぐことができる（Derr et al., (2006) Changing the specificity of a bacterial chemoreceptor, Journal of Molecular Biology, 355 (5): 923-32）。Ｐｒｉｍｅｒ３ｗｅｂバージョン４．０．０（Untergasser et al., (2012) Primer3 - new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research 40(15):e115）を使用して、約３０１０塩基対の増幅産物（配列番号９）が得られる配列番号５および配列番号６のフォワードおよびリバースプライマーを設計した。選択したプライマー配列は、ＥｕｒｏｆｉｎｓＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂａｎｇａｌｏｒｅ、インドで合成され、ここから得た。

増幅された配列（配列番号９）の基本ローカルアラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）検索を行ったところ、配列番号５のフォワードプライマーおよび配列番号６のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ３により、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ株全てを明確に同定することが可能であったことが示された（表４）。

（例ＩＩ）
試料調製
ＤＮＡ単離
ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６（ＬａｃｔｏＳｐｏｒｅ（登録商標）胞子１５０億／ｇｍ）、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＡＴＣＣ３１２８４、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓＡＴＣＣ１４５７９、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ１．０ｇｍを秤量し、それぞれ滅菌生理食塩水２５０ｍｌ（ＮａＣｌ０．９ｇｍ、ｗ／ｖ）に添加し、滅菌生理食塩水を使用して段階希釈した。プレートあたり３０〜３００コロニーを得るのに推奨される希釈度は２５０×１０⁶である。希釈した試料をウォーターバスにおいて７５℃で３０分間インキュベートし、４５℃未満まで速やかに冷却した。次いで、上記試料１．０ｍＬを滅菌ペトリ皿５枚それぞれに分配し、次いで各プレートにあらかじめ冷却しておいたグルコース酵母エキス培地（約４５℃）１５〜２０ｍｌを注いだ。プレートを転動および回転させて均一なスプレッドを形成させ、凝固させる。次いでプレートを３７℃±２℃で４８〜７２時間インキュベートした。プレートで増殖した、単離した純度の高いコロニーを、次いで滅菌ループを使用して注意深く取り出した。さらに、プレートから取り出した細胞を、２．０ｍＬ微量遠心チューブ中でＰＢＳ試薬１００μＬに懸濁させた。リゾチーム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）２μｌを添加し、指ではじいて混合して、細胞が塊状になるまでチューブを３７℃で１０分間インキュベートした。次いでＤＮＡｚｏｌ（チオシアン酸グアニジン、サルコシルおよびトリス緩衝液−ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃより販売（カタログ番号１０５０３−０２７））３００μｌを添加し、１０秒〜３０秒間または細胞が試薬中で均質に懸濁されるまでチューブをボルテックスした。次いで１００℃に維持したウォーターバスで混合物を１０分間加熱し、１６，０００ｘｇで５分間遠心処理した。上清を新たな微量遠心チューブに注意深く移した。この溶液は細菌ゲノムＤＮＡを含む。解析前に、この溶液の一定分量を滅菌ＴＥ（１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）および１ｍＭＥＤＴＡ−１：５０、ｖ／ｖ）で希釈して試料を調製した。これによりＤＮＡ約１０〜１００ｎｇ／μｌが生じることになる。

プライマー調製
プライマーＢＣ１：配列番号１のフォワードプライマーおよび配列番号２のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ１を、滅菌した１０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ７．４および０．１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液で１００μｍｏｌ／ｍＬに希釈し、−２０℃または−８０℃で保存した。使用直前に、一定分量の各プライマーを、滅菌水、または０．１ｍＭＥＤＴＡ含有ＴＥ緩衝液（１：１０、ｖ／ｖ）で希釈した。プライマーセットＢＣ１用のアニーリング温度は６０℃である。プライマーセットＢＣ１による陽性試験では、約９９０塩基対の増幅産物（配列番号７）が得られることが予期される。

プライマーＢＣ２：配列番号３のフォワードプライマーおよび配列番号４のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ２を、滅菌した１０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ７．４および０．１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液で１００μｍｏｌ／ｍＬに希釈し、−２０℃または−８０℃で保存した。使用直前に、一定分量の各プライマーを、滅菌水、または０．１ｍＭＥＤＴＡ含有ＴＥ緩衝液（１：５、ｖ／ｖ）で希釈する。プライマーセットＢＣ２用のアニーリング温度は５８℃である。プライマーセットＢＣ２による陽性試験では、約５４３塩基対の増幅産物（配列番号８）が得られることが予期される。
プライマーＢＣ３：配列番号５のフォワードプライマーおよび配列番号６のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ３を、滅菌した１０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ７．４および０．１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液で１００μｍｏｌ／ｍＬに希釈し、−２０℃または−８０℃で保存した。使用直前に、一定分量の各プライマーを、滅菌水、または０．１ｍＭＥＤＴＡ含有ＴＥ緩衝液（１：１０、ｖ／ｖ）で希釈する。プライマーセットＢＣ３用のアニーリング温度は６８℃である。プライマーセットＢＣ３による陽性試験では、３Ｋｂの増幅産物（配列番号９）が得られることが予期される。

（例ＩＩＩ）
ＰＣＲ増幅
プライマーセットごとに、２ＸＰＣＲマスターミックス（１ＸＰＣＲマスターミックスは０．１ｍＭの各ｄＮＴＰ、１ＸＴａｑｐｏｌアッセイ緩衝液および１ＵＴａｑポリメラーゼを有する）２５μＬ、希釈したフォワードおよびリバースプライマー（１０〜２０ピコモル）１μＬ、鋳型ＤＮＡ（約１０ｎｇ〜１００ｎｇ）を含む希釈試料１μＬ、および滅菌水２２μＬを混合して、ＰＣＲ試料を調製した。希釈試料１μＬをヌクレアーゼ不含の水１μＬで置き換えてＰＣＲ陰性対照を調製した。
適切なサーマルサイクラーを使用して、以下のステップによりＰＣＲ増幅を実施した：
１．９４℃で３０秒間インキュベーション（１サイクル）、
２．９４℃で３０秒間変性、アニーリング温度で３０秒間、および７２℃で１分間伸長（３０サイクル）、
３．７２℃で５分間最終インキュベーション（１サイクル）、４℃で維持。
アガロースゲル電気泳動（２％アガロースゲル）を実施して、各ＰＣＲ試料調製物およびＰＣＲ陰性対照のＰＣＲ増幅産物を解析し、ＤＮＡバンドをゲルドキュメンテーションシステムで視覚化した。

判定基準
プライマーＢＣ１：プライマーセットＢＣ１で調製したＰＣＲ試料調製物により、約９９０塩基対の増幅産物が得られる（陽性）［図１］。
プライマーＢＣ２：プライマーセットＢＣ２で調製したＰＣＲ試料調製物により、予期された約５４３塩基対の増幅産物が得られる（陽性）。［図２］
プライマーＢＣ３：プライマーセットＢＣ３で調製したＰＣＲ試料調製物では、約３０１０塩基対の増幅産物が得られない（陰性）。［図３］
本発明は、プライマーＢＣ１、プライマーＢＣ２による陽性増幅、およびプライマーＢＣ３による陰性増幅により、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの存在が確認され、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓなどのその他のＢａｃｉｌｌｕｓ種と区別される、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するためのプロセスについて開示する。本発明は、栄養補助食品、乳および乳製品、飲料、菓子、缶詰食品を含むがこれらに限定されない食品中のＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ、ならびに醸造所においてＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するのに役立つであろう。

本発明は好ましい実施形態を参照して記載されるが、本発明がそこに限定されるわけではないことを当業者は明確に理解すべきである。むしろ、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲と併せてのみ解釈されるべきである。

Claims

Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、
配列番号１および配列番号２で表されるＢＣ１、
配列番号３および配列番号４で表されるＢＣ２、ならびに
配列番号５および配列番号６で表されるＢＣ３の、
新規のオリゴヌクレオチドプライマー配列。
ＢＣ１が、配列番号１のフォワードプライマー５’ＡＣＡＧＧＧＣＴＴＴＣＡＧＡＴＡＣＣＣＧ３’、および配列番号２のリバースプライマー５’ＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＣＡＴＣＡＡＡＡ３’を含む、請求項１に記載のプライマー。
ＢＣ２が、配列番号３のフォワードプライマー５’ＧＡＡＴＧＣＡＴＴＡＴＧＣＡＡＣＡＴＧＧＧ３’、および配列番号４のリバースプライマー５’ＣＣＡＧＧＣＴＴＡＡＡＴＣＣＡＡＴＡＣＡＧ３’を含む、請求項１に記載のプライマー。
ＢＣ３が、配列番号５のフォワードプライマー５’ＣＧＣＣＡＡＧＣＧＧＧＴＡＣＧＣＴＴＣＡＣＣＧ３’、および配列番号６のリバースプライマー５’ＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧ３’を含む、請求項１に記載のプライマー。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ株が、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＡＴＣＣ３１２８４、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＡＴＣＣ７０５０、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ２−６、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ３６Ｄ１、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＳ−ｌａｃおよびＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＨＭ−０８からなる群から選択される、請求項１に記載の、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するためのプライマー。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ株からＤＮＡを単離するステップ、および単離したＤＮＡを、請求項１に記載の新規のプライマーを使用して、サーモサイクラーにおいて９４℃で３０秒間（１サイクル）インキュベートし、その後９４℃で３０秒間、プライマーに特有のアニーリング温度で３０秒間、および７２℃で１分間を３０サイクル、その後７２℃で５分間（１サイクル）最終インキュベーションを行い４℃で維持することにより増幅するステップを含む、ポリメラーゼ連鎖反応を使用してＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定する方法。
配列番号１のフォワードプライマーおよび配列番号２のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ１のアニーリング温度が６０℃であり、それにより約９９０塩基対の増幅産物が得られる、請求項６に記載の方法。
配列番号３のフォワードプライマーおよび配列番号４のリバースプライマーを含むプライマーＢＣ２のアニーリング温度が５８℃であり、それにより約５４３塩基対の増幅産物が得られる、請求項６に記載の方法。
配列番号５のフォワードプライマーおよび配列番号６のリバースプライマーを含むプライマー配列ＢＣ３のアニーリング温度が６８℃であり、それにより約３０１０塩基対の増幅産物が得られる、請求項６に記載の方法。
プライマーＢＣ１、プライマーＢＣ２による陽性増幅、およびプライマーＢＣ３による陰性増幅によりＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの存在が確認される、請求項６に記載の方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ株が、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＡＴＣＣ３１２８４、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＡＴＣＣ７０５０、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ２−６、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ３６Ｄ１、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＳ−ｌａｃおよびＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＨＭ−０８からなる群から選択される、請求項６および請求項１０に記載の方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、請求項１に記載のプライマーを含む検出キット。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓを同定するための、請求項６に記載の方法を使用する検出キット。