JP2018526362A - 円形脱毛症の処置のためのバイオマーカー - Google Patents

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Abstract

本開示の主題は、円形脱毛症の改善された診断及び予後判定、並びに、この疾患に対する効果的な処置を可能にするバイオマーカーに関し、そのような処置に応答する患者亜集団を同定する能力を持つバイオマーカーを組み込む方法、及び、そのような処置の進展を追跡する能力を持つバイオマーカーを組み込む方法を含む。

Description

関連出願との相互参照
本願は、２０１５年８月１４日に出願した米国仮特許出願第６２／２０５，４７６号に基づく優先権を主張するものであり、その全内容を参照により本願において援用する。
助成金に関する情報
本発明は、国立衛生研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）により与えられたＮＩＨ Ｇｒａｎｔ Ｎｕｍｂｅｒｓ Ｒ０１ＡＲ０５６０１６、Ｒ２１ＡＲ０６１８８１及び５Ｕ０１ＡＲ０６７１７３の下で政府の支援により行われた。政府は本発明について一定の権利を有している。
はじめに
本明細書において開示される主題は、円形脱毛症の改善された診断及び予後判定、並びに、この疾患に対する効果的な処置を可能にするバイオマーカーに関し、そのような処置に応答する患者亜集団を同定する能力を持つバイオマーカーを組み込む方法、及び、そのような処置の進展を追跡する能力を持つバイオマーカーを組み込む方法を含む。
円形脱毛症（ＡＡ）は、毛包が免疫攻撃の標的である自己免疫性の皮膚疾患である。患者は、通常は頭皮に丸い又は卵形の脱毛の部分を特徴的に呈し、この脱毛の部分は、自然に消散する、存続する又は進行して、頭皮又は体全体を巻き込み得る。この疾患の３つの主要な表現型変異体は、頭皮の又は顎鬚領域内の小さい卵形の領域に局在することが多い斑状のＡＡ（ＡＡＰ）、頭皮全体を巻き込む全頭脱毛症（ＡＴ）、及び、体表面全体を巻き込む全身脱毛症（ＡＵ）である。
現在、ＡＡに対してＦＤＡが承認した薬剤はなく、処置は経験的であることが多いが、典型的には、観察、病巣内ステロイド、外用免疫療法又は証明されていない有効性の広範な免疫抑制処置を伴う。より重症な形態の疾患であるＡＵ及びＡＴは、処置に対して不応性であることが多い。さらに、皮膚科医及び治療医の間での一般的な仮定は、長期にわたるＡＵ及びＡＴが回復不能になること又は頭皮を「燃え尽きた」状態に変えることであり、これは、罹患期間と処置に対する応答性の逆相関によって裏付けられている。その高い罹患率にもかかわらず、疾患の重症度、並びに、疾患に対する効果的な処置を同定するバイオマーカーが依然として必要とされており、そのような処置に応答する患者亜集団を同定する能力を持つバイオマーカーを組み込む方法、及び、そのような処置の進展を追跡する能力を持つバイオマーカーを組み込む方法が依然として必要とされている。
本開示は、円形脱毛症の改善された診断及び予後判定、並びに、疾患に対する効果的な処置を可能にするバイオマーカーに関する。特定の実施形態では、対象者の円形脱毛症（ＡＡ）を処置する方法は、上記の対象者のＡＡ疾患重症度を、該疾患重症度を示すバイオマーカーを検出することによって同定するステップ、及び、同定された疾患重症度に適切な治療的介入を上記の対象者に施すステップを含む。本開示の主題は、さらに、対象者のＡＡを処置する方法を提供し、当該方法は、ＡＡを有する対象者のＪＡＫインヒビター処置に応答する傾向を、該傾向を示すバイオマーカーを検出することによって同定するステップ、及び、対象者がインヒビターに応答する傾向を、同定されたバイオマーカーが示す場合に、ＪＡＫインヒビターを上記の対象者に投与するステップを含む。本開示の主題は、さらに、対象者の円形脱毛症（ＡＡ）を処置する方法を提供し、当該方法は、ＡＡを有する対象者にＪＡＫインヒビターを投与するステップ；及び、ＪＡＫインヒビター処置に対する応答性を示すバイオマーカーを検出するステップ；を含む。
特定の実施形態では、上記の本開示のバイオマーカーの検出は、対象者から得られたサンプルに対して実行され、サンプルは、皮膚、血液、血清、血漿、尿、唾液、痰、粘液、精液、羊水、口腔洗浄液及び気管支洗浄液からなる群から選択される。特定の実施形態では、対象者はヒトである。特定の実施形態では、サンプルは皮膚サンプルである。特定の実施形態では、サンプルは血清サンプルである。特定の実施形態では、バイオマーカーは遺伝子発現シグニチャである。特定の実施形態では、遺伝子発現シグニチャは、以下の遺伝子の群：ＫＲＴ関連遺伝子；ＣＴＬ関連遺伝子；及びＩＦＮ関連遺伝子；のうちの一つ又はそれ以上の遺伝子発現情報を含む。特定の実施形態では、ＫＲＴ関連遺伝子は、ＤＳＧ４、ＨＯＸＣ３１、ＫＲＴ３１、ＫＲＴ３２、ＫＲＴ３３Ｂ、ＫＲＴ８２、ＰＫＰ１及びＰＫＰ２を含む。特定の実施形態では、ＣＴＬ関連遺伝子は、ＣＤ８Ａ、ＧＺＭＢ、ＩＣＯＳ及びＰＲＦ１を含む。特定の実施形態では、ＩＦＮ関連遺伝子は、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＳＴＡＴ１及びＭＸ１を含む。特定の実施形態では、遺伝子発現シグニチャは、円形脱毛症疾患活性指数（ＡＬＡＤＩＮ）である。特定の実施形態では、遺伝子発現シグニチャは、表Ａに定められる一つ又はそれ以上の遺伝子を含む円形脱毛症遺伝子シグニチャ（ＡＡＧＳ）である。特定の実施形態では、遺伝子発現シグニチャは、ＩＫＺＦ１、ＤＬＸ４又はそれらの組み合わせである。
特定の実施形態では、本開示のバイオマーカーの検出は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイによって実行される。特定の実施形態では、検出は、マイクロアレイ解析によって実行される。特定の実施形態では、検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は核酸シークエンシングによって実行される。特定の実施形態では、バイオマーカーはタンパク質である。特定の実施形態では、タンパク質の存在は、タンパク質と特異的に結合する試薬を使用して検出される。特定の実施形態では、試薬は、モノクローナル抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又は、ポリクローナル抗体若しくはその抗原結合フラグメントである。特定の実施形態では、検出は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光測定又はウェスタンブロットアッセイによって実行される。
別の態様では、本開示の主題は、対象者の円形脱毛症（ＡＡ）を処置するためのキットを提供し、当該キットは、対象者の疾患重症度を示すバイオマーカーを検出するために有用な一つ又はそれ以上の検出試薬、及び、ＡＡを処置するために有用な一つ又はそれ以上の処置試薬を含む。本開示の主題は、さらに、対象者の円形脱毛症（ＡＡ）を処置するためのキットを提供してもよく、当該キットは、対象者の、ＡＡを処置するために有用な一つ又はそれ以上の処置試薬に応答する傾向を示すバイオマーカーを検出するために有用な、一つ又はそれ以上の検出試薬、及び、ＡＡを処置するために有用な一つ又はそれ以上の処置試薬を含む。特定の実施形態では、キットは、さらに、一つ又はそれ以上のプローブセット、アレイ／マイクロアレイ、バイオマーカー特異的抗体及び／又はビーズを含む。特定の実施形態では、キットは、さらに、説明書を含む。特定の実施形態では、処置試薬は、ＪＡＫインヒビターから選択されてもよい。
特定の実施形態では、ＪＡＫインヒビターは、Ｊａｋ１／Ｊａｋ２／Ｊａｋ３／Ｔｙｋ２／ＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ２／ＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ４／ＳＴＡＴ５ａ／ＳＴＡＴ５ｂ／ＳＴＡＴ６／ＯＳＭ／ｇｐ １３０／ＬＩＦＲ／ＯＳＭ−Ｒβ遺伝子、又は、Ｊａｋ１／Ｊａｋ２／Ｊａｋ３／Ｔｙｋ２／ＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ２／ＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ４／ＳＴＡＴ５ａ／ＳＴＡＴ５ｂ／ＳＴＡＴ６／ＯＳＭ／ｇｐ１３０／ＬＩＦＲ／ＯＳＭ−Ｒβタンパク質と相互作用する化合物である。特定の実施形態では、ＪＡＫインヒビターは、ルキソリチニブ（ＩＮＣＢ ０１８４２４）、トファシチニブ（ＣＰ６９０５５０）、チロホスチンＡＧ４９０（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１３３５５０−３０−８）、モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）、バリシチニブ（ＬＹ３００９１０４）、フェドラチニブ（ＴＧ１０１３４８）、ＢＭＳ−９１１５４３（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１２７１０２２−９０−２）、レスタウルチニブ（ＣＥＰ−７０１）、フルダラビン、エピガロカテキン−３−ガラート（ＥＧＣＧ）、ペフィシチニブ、ＡＢＴ４９４（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１３１０７２６−６０−３）、ＡＴ９２８３（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：８９６４６６−０４−９）、デセルノチニブ、フィルゴチニブ、ガンドチニブ、ＩＮＣＢ３９１１０（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１３３４２９８−９０−６）、ＰＦ ０４９６５８４２（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１６２２９０２−６８−４）、Ｒ３４８（Ｒ−９３２３４８、ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：９１６７４２−１１−５；１６２０１４２−６５−５）、ＡＺＤ１４８０（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：９３５６６６−８８−９）、セルジュラチニブ、ＩＮＣＢ０５２７９３、ＮＳ０１８（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１２３９３５８−８６−１（遊離塩基）；１２３９３５８−８５−０（ＨＣｌ））、ＡＣ ４１０（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１３６１４１５−８４−０（遊離塩基）、１３６１４１５−８６−２（ＨＣｌ））、ＣＴ１５７８（ＳＢ１５７８、ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：９３７２７３−０４−６）、ＪＴＥ０５２、ＰＦ６２６３２７６、Ｒ５４８、ＴＧ０２（ＳＢ１３１７、ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：９３７２７０−４７−８）、ランブリカス・レベラス抽出物、ＡＲＮ４０７９、ＡＲ１３１５４、ＵＲ６７７６７、ＣＳ５１０、ＶＲ５８８、ＤＮＸ０４０４２、ハイパーフォリン、その誘導体、その重水素化された異形、その塩又はその組み合わせから選択されてもよい。特定の実施形態では、検出試薬は、蛍光試薬、発光試薬、色素、放射性同位体、その誘導体又はその組み合わせから選択されてもよい。
例として与えられているが、本発明を記載される特定の実施形態に限定することを意図していない詳細な説明は、添付の図面と組み合わせて理解することができる。
円形脱毛症疾患に特異的なシグニチャを示した図であり、トレーニングセットにおけるＡＴ／ＡＵ、ＡＡＰ及びＮＣサンプル間のＡＡ特異的疾患シグニチャ内の発現が増加した５０の最も発現差異がある遺伝子、及び、発現が減少した５０の最も発現差異がある遺伝子のヒートマップである。 円形脱毛症疾患に特異的なシグニチャを示した図であり、差次的遺伝子発現の主成分に沿って整列させられたサンプルの発現地形図である。ドットは、発現空間における各サンプルの位置を表しており（白色＝ＮＣ、青色＝ＡＡＰ、赤色＝ＡＴ／ＡＵ）、ピークのサイズは、領域内のサンプルの数に基づいて生成されている（より並置されたサンプルが生成するピークはより高く広い）。主成分空間は、地形空間内のその位置に基づき、サンプルがコントロール、ＡＡＰ又はＡＴ／ＡＵであるリスクを反映する単一の数値スコアに凝縮することができる。このコンセンサススコアは、統計的に有意な分別コントロール、ＡＡＰ及びＡＴ／ＡＵのサンプルコホートを提供する（箱ひげ図）。箱は四分位範囲及び中央値を示し、ひげは５及び９５のパーセンタイルを示し、＊はＮＣに対する統計的有意性を示し、†はＡＡＰに対する統計的有意性を示す。 全頭脱毛症及び全身脱毛症における増加した遺伝子発現の複雑さ及び持続性炎症の図であり、正常と比較したＡＴ／ＡＵ（「ＡＴ／ＡＵ」）、及び、正常と比較したＡＡＰ（「ＡＡＰ」）における発現差異がある遺伝子のベン図である。ベン図の各セクション内の発現差異がある遺伝子の数が示されている。 全頭脱毛症及び全身脱毛症における増加した遺伝子発現の複雑さ及び持続性炎症の図であり、ＡＴ／ＡＵ、ＡＡＰ又はＮＣを有する患者由来の皮膚切片間のＣＤ３浸潤物の毛包周囲／球範囲の病理組織学的スコアである。＊ｐ＜０．０１；＊＊ｐ＜０．０００５ 全頭脱毛症及び全身脱毛症における増加した遺伝子発現の複雑さ及び持続性炎症の図であり、ＨＰＳスコア０（浸潤なし）から３（重度の浸潤）を反映する代表的な組織学的画像である。 全頭脱毛症及び全身脱毛症における増加した遺伝子発現の複雑さ及び持続性炎症の図であり、ＡＴ／ＡＵ対正常コントロール及びＡＡＰ対正常コントロール間で共有されるＫＥＧＧ経路のリストである。 全頭脱毛症及び全身脱毛症における増加した遺伝子発現の複雑さ及び持続性炎症の図であり、ＡＴ／ＡＵ対正常コントロール（赤）、ＡＡＰ対正常コントロール（青）においてアップレギュレートされたＫＥＧＧ経路、又は、ＡＴ／ＡＵ対正常コントロール及びＡＡＰ対正常コントロール両方における共有された経路のネットワークマップである。 ＡＡにおける個々の間で生じる遺伝子発現解析であり、患者を一致させた病変サンプルと非病変サンプルとを比較して、それらを互いに、及び、健常コントロールを描写する遺伝子を同定するヒートマップである。 ＡＡにおける個々の間で生じる遺伝子発現解析であり、患者を一致させた病変サンプルと非病変サンプルとを比較して、それらを互いに、及び、健常コントロールを描写する遺伝子を同定するヒートマップである。 ＡＡにおける個々の間で生じる遺伝子発現解析であり、患者を一致させた病変サンプルと非病変サンプルとを比較して、それらを互いに、及び、健常コントロールを描写する遺伝子を同定するヒートマップである。 ＡＡにおける個々の間で生じる遺伝子発現解析であり、発現差異の第一主成分からの正規化された偏差によって整列させられた患者を一致させた病変（赤色）及び非病変（青色）のサンプルである。対のサンプル間の線の長さは、全てのシグニチャ遺伝子のコンセンサスに基づき、全体的な類似性（より短い線）又は相違性（より長い線）を示している。 ＡＡにおける個々の間で生じる遺伝子発現解析であり、正常コントロールサンプル、病変ＡＡＰ及び非病変ＡＡＰのサンプルの第一の２つの主成分分析を使用したディスプレイは、いずれかのコホートではなく、病変サンプルが病変サンプルとコントロールとの間でクラスタ形成することを明らかにしている。 ＡＡにおける個々の間で生じる遺伝子発現解析であり、病変ＡＡＰと非病変ＡＡＰのサンプル間の過剰発現した遺伝子及び過少発現した遺伝子の経路及び機能的注釈の分析が、非病変においてアップし且つ病変においてダウンする（赤色のノード）、及び、非病変においてダウンし且つ病変においてアップする（青色のノード）別々の遺伝子のセットを明らかにしている。これらの遺伝子は、示されたエンリッチメント（濃縮）の注釈に関連づけられ（黄色のノード）、その発現プロファイルにおいて反映される病変サンプルと非病変サンプルとの機能的な分子の差を表している。 ＡＡ表現型と相関する免疫細胞浸潤遺伝子発現シグニチャを示した図であり、対応する免疫マーカーのコンセンサス発現に基づく、患者毎の示された浸潤免疫細胞の相対的推定値である（ヒートマップ、右）。増加している赤色は、増加している浸潤物の量を示す。患者はＣＤ８浸潤によってランク付けされている。最高から最低のＣＤ８浸潤による患者のランク付けが、母集団のバイアスを明らかにしている。箱ひげ図は、ＣＤ８浸潤ランクに従った、示された臨床提示の分布を反映している（ランクが低いほど、示す浸潤のレベルは高い）。箱は四分位範囲及び中央値を示し、ひげは５及び９５のパーセンタイルを示し、＊は統計的有意性ｐ＝０．００５を示し、＊＊はｐ＜１ｘ１０−５を示す。 ＡＡ表現型と相関する免疫細胞浸潤遺伝子発現シグニチャを示した図であり、コンセンサス発現を使用して、生検サンプルの浸潤汚染が各提示コホート（ＡＡＰ＝斑状、（左のパイ）、ＡＴ／ＡＵ＝全頭脱毛症／全身脱毛症（右のパイ））、及び、未罹患コントロールと比較した全浸潤汚染物質における各免疫組織タイプの相対的なシェア（線グラフ）に対して推定されている。 ＡＡ表現型と相関する免疫細胞浸潤遺伝子発現シグニチャを示した図であり、ＮＣ、ＡＡＰ及びＡＴ／ＡＵにわたる全サンプルのシグナルの割合として表される、各示された免疫タイプの推定された浸潤における変化である。 疾患表現型に対応するＡＬＡＤＩＮスコアを示した図であり、ＡＡ及び健常コントロール間の発現差異がある遺伝子の同時発現解析が、２０のモジュールの遺伝子を明らかにしている。 疾患表現型に対応するＡＬＡＤＩＮスコアを示した図であり、ＡＡ及びコントロール間の有意な発現差異における濃縮のための全２０の遺伝子モジュールのＧＳＥＡが、緑色及び茶色のモジュールは比較において最も高度に濃縮されていることを明らかにしている。 疾患表現型に対応するＡＬＡＤＩＮスコアを示した図であり、これら２つのモジュール（円）の経路解析が、いくつかの免疫及び免疫応答の経路（オレンジ色の菱形）の有意な濃縮を明らかにし、ＧＷＡＳ（黄色）、ＡＬＡＤＩＮ ＣＴＬ遺伝子（マゼンタ色）、ＧＷＡＳヒットでもあるＣＴＬ遺伝子（ピンク色）、及び、ＡＬＡＤＩＮ ＩＦＮ遺伝子（ターコイズ色）において以前に関係づけられた遺伝子を含む。 疾患表現型に対応するＡＬＡＤＩＮスコアを示した図であり、ＡＬＡＤＩＮスコアは、患者のＡＡ重症度の相対的リスクを同定するために、免疫浸潤及び遺伝子発現によって反映される構造変化を統合した３次元において患者サンプルを分類する（黒色：ＮＣ、緑色：ＡＡＰ、赤色：ＡＴ／ＡＵ）。 疾患表現型に対応するＡＬＡＤＩＮスコアを示した図であり、疾患期間に関するＡＵ／ＡＴを有する患者由来のＣＴＬ（上のパネル）、ＩＦＮ（中央のパネル）及びＫＲＴ（下のパネル）のシグニチャスコアを示している。 ＡＡ検証セットを示した図であり、検証データセットにおける３３のサンプルの樹状図及びヒートマップを示している。ユークリッド距離及び平均連結を使用した階層的クラスタリングを、サンプルをクラスタ形成するために使用されたＤｉｓｃｏｖｅｒｙデータセットにおけるＡＡ患者及び正常コントロールの間で差次的に発現されたとして同定された２００２ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＰＳＩＤを使用して行った。 ＡＡサンプル間のＴ細胞免疫遺伝子シグニチャを示した図であり、各浸潤性免疫組織に特有のシグニチャ遺伝子を使用したＡＡ患者及び未罹患コントロールの教師なしのコンセンサスクラスタリングが、各サンプルにおける浸潤物の相対的な定量化を可能にしている。このヒートマップでは、赤色はより高い発現を示し、白色はより低い発現を示している。３つの主要なスーパークラスタの境界が、マーカー発現に基づき、低、中（Ｍｅｄ）及び高の浸潤の相対的レベルとして画定されている。 ＡＡサンプル間のＴ細胞免疫遺伝子シグニチャを示した図であり、３つの浸潤スーパークラスタが、予後と統計的に有意に相関している。３ｘ３カイ二乗検定が、浸潤の重症度はこれらの患者にわたるＡＡ表現型の重症度を予測するということを明らかにしている。各セルに表示された数は、付随するスーパークラスタで見出される各臨床提示の割合を表し、例えば、ＮＣサンプルの７２％が低クラスタで見出された。カイ二乗統計及び付随するｐ値が提供されている。 ＡＡ疾患特異的シグニチャにおけるモジュールがＡＬＡＤＩＮ成分を定めることを示した図であり、樹状図が、遺伝子同時発現クラスタリング結果を反映している。底部に沿って、色付きのバーコードが、この研究で使用した２０の同時発現されたモジュールを同定した区画を示している。 ＡＡ疾患特異的シグニチャにおけるモジュールがＡＬＡＤＩＮ成分を定めることを示した図であり、２０のモジュールとの関連性についていくつかの臨床的形質を試験した場合の結果の表を示している。各セルには、対応するモジュールと形質との関連性に対するｐ値が表示されている。セルは、関連性の有意性に対応するように増える赤色に色付けされている。 ＡＡ疾患特異的シグニチャにおけるモジュールがＡＬＡＤＩＮ成分を定めることを示した図であり、ＡＡコホートにおける元のＡＬＡＤＩＮ経路のそれぞれの統計的濃縮を試験するＧｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｅｓを示している。未罹患コントロールに対する全ての比較において、予想される方向でのＩＦＮ、ＣＴＬ及びＫＲＴの経路における遺伝子の統計的濃縮があった（ＩＦＮ及びＣＴＬが正に濃縮され、ＫＲＴが負に濃縮されている）。 ＡＡ疾患特異的シグニチャにおけるモジュールがＡＬＡＤＩＮ成分を定めることを示した図であり、ＡＡコホートにおける元のＡＬＡＤＩＮ経路のそれぞれの統計的濃縮を試験するＧｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｅｓを示している。未罹患コントロールに対する全ての比較において、予想される方向でのＩＦＮ、ＣＴＬ及びＫＲＴの経路における遺伝子の統計的濃縮があった（ＩＦＮ及びＣＴＬが正に濃縮され、ＫＲＴが負に濃縮されている）。 ＡＡ疾患特異的シグニチャにおけるモジュールがＡＬＡＤＩＮ成分を定めることを示した図であり、ＡＡコホートにおける元のＡＬＡＤＩＮ経路のそれぞれの統計的濃縮を試験するＧｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｅｓを示している。未罹患コントロールに対する全ての比較において、予想される方向でのＩＦＮ、ＣＴＬ及びＫＲＴの経路における遺伝子の統計的濃縮があった（ＩＦＮ及びＣＴＬが正に濃縮され、ＫＲＴが負に濃縮されている）。 ＡＬＡＤＩＮ成分が、ＡＡ表現型及び正常コントロールを区別することを示した図であり、ＡＬＡＤＩＮのＣＴＬ（上のパネル）、ＩＦＮ（中央のパネル）及びＫＲＴ（下のパネル）の成分を、正常コントロール、ＡＡＰ及びＡＵ／ＡＴのサンプル間で比較した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０００１。 期間は、ＡＡＰ患者間のＡＬＡＤＩＮ成分スコアに有意に影響しないことを示した図であり、ＡＬＡＤＩＮのＣＴＬ（上のパネル）、ＩＦＮ（中央のパネル）及びＫＲＴ（下のパネル）の成分を、５年未満又は少なくとも５年の持続期間のＡＡＰ患者間で比較した。有意な差は見つからなかった。 ＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋細胞傷害性Ｔリンパ球が皮膚において蓄積し、ＡＡマウスにおいて疾患を誘導するのに必要であり且つ十分であることを示した図であり、（Ｋ７１によってマークされている）毛包の内毛根鞘におけるＮＫＧ２Ｄリガンド（Ｈ６０）の免疫蛍光染色を示している。スケールバー、１００μｍ。 ＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋細胞傷害性Ｔリンパ球が皮膚において蓄積し、ＡＡマウスにおいて疾患を誘導するのに必要であり且つ十分であることを示した図であり、Ｃ５７ＢＬ／６、健常Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ及びＣ３Ｈ／ＨｅＪＡＡマウスの毛包におけるＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋細胞を示している。上のスケールバー、１００μｍ；下のスケールバー、５０μｍ。 ＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋細胞傷害性Ｔリンパ球が皮膚において蓄積し、ＡＡマウスにおいて疾患を誘導するのに必要であり且つ十分であることを示した図であり、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪＡＡマウスにおける皮膚リンパ節腫脹及び細胞過形成を示している。 ＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋細胞傷害性Ｔリンパ球が皮膚において蓄積し、ＡＡマウスにおいて疾患を誘導するのに必要であり且つ十分であることを示した図であり、脱毛症マウス対未移植マウスの皮膚及び皮膚排出リンパ節におけるＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋Ｔ細胞の頻度（ボックスの領域の上に示されている数）を示している。 ＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋細胞傷害性Ｔリンパ球が皮膚において蓄積し、ＡＡマウスにおいて疾患を誘導するのに必要であり且つ十分であることを示した図であり、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ脱毛症マウスの皮膚リンパ節におけるＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋Ｔ細胞の免疫表現型を示している。 ＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋細胞傷害性Ｔリンパ球が皮膚において蓄積し、ＡＡマウスにおいて疾患を誘導するのに必要であり且つ十分であることを示した図であり、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪの毛包から増殖したＲａｅ−ｌｔ発現真皮鞘細胞（左）、遮断抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はアイソタイプのコントロールの存在下での、ＡＡマウスの皮膚リンパ節から単離されたＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋Ｔ細胞によって誘導される用量依存的特異的細胞溶解（右）を示している。エフェクターターゲット比が、示されているように与えられている。データは平均±ｓ．ｄ．として表されている。 ＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋細胞傷害性Ｔリンパ球が皮膚において蓄積し、ＡＡマウスにおいて疾患を誘導するのに必要であり且つ十分であることを示した図であり、全リンパ節（ＬＮ）細胞、ＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋Ｔ細胞のみ、ＣＤ＋ＮＫＧ２Ｄ−Ｔ細胞又はＮＫＧ２Ｄ＋を枯渇したリンパ節細胞を皮下注射したＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（１つの群あたり５匹のマウス）における脱毛を示している。マウスは２つの実験の代表である。＊＊＊Ｐ＜０．００１（フィッシャーの正確確率検定）。 ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２又はＩＬ−１５Ｒβに対する遮断抗体によるＡＡの予防を示し、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ移植マウスを、移植の時点から全身的に処置したことを示した図であり、ＩＦＮ−γに対する抗体を用いて移植の時点から全身的に処置したＣ３Ｈ／ＨｅＪ移植マウスにおけるＡＡの発生を示している。 ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２又はＩＬ−１５Ｒβに対する遮断抗体によるＡＡの予防を示し、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ移植マウスを、移植の時点から全身的に処置したことを示した図であり、ＩＦＮ−γに対する抗体を用いて移植の時点から全身的に処置したＣ３Ｈ／ＨｅＪ移植マウスにおけるＡＡの発生を示している。ＰＢＳ−処置マウスと比較した、ＩＦＮ−γに対する抗体を用いて処置したマウスの皮膚におけるＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋Ｔ細胞の頻度（ボックスの領域の上に示されている数）を示している。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１） ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２又はＩＬ−１５Ｒβに対する遮断抗体によるＡＡの予防を示し、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ移植マウスを、移植の時点から全身的に処置したことを示した図であり、アイソタイプコントロール抗体を用いて、又は、ＩＦＮ−γに対する抗体を用いて処置したマウスの皮膚におけるＣＤ８及びＭＨＣのクラスＩ及びＩＩの発現を示す皮膚生検の免疫組織化学染色を示している。スケールバー、１００μｍ。 ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２又はＩＬ−１５Ｒβに対する遮断抗体によるＡＡの予防を示し、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ移植マウスを、移植の時点から全身的に処置したことを示した図であり、ＩＬ−２に対する抗体を用いて移植の時点から全身的に処置したＣ３Ｈ／ＨｅＪ移植マウスにおけるＡＡの発生を示している。 ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２又はＩＬ−１５Ｒβに対する遮断抗体によるＡＡの予防を示し、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ移植マウスを、移植の時点から全身的に処置したことを示した図であり、ＩＬ−２に対する抗体を用いて移植の時点から全身的に処置したＣ３Ｈ／ＨｅＪ移植マウスにおけるＡＡの発生を示している。ＰＢＳ−処置マウスと比較した、ＩＬ−２に対する抗体を用いて処置したマウスの皮膚におけるＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋Ｔ細胞の頻度（ボックスの領域の上に示されている数）を示している。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１） ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２又はＩＬ−１５Ｒβに対する遮断抗体によるＡＡの予防を示し、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ移植マウスを、移植の時点から全身的に処置したことを示した図であり、アイソタイプコントロール抗体を用いて、又は、ＩＬ−２に対する抗体を用いて処置したマウスの皮膚におけるＣＤ８及びＭＨＣのクラスＩ及びＩＩの発現を示す皮膚生検の免疫組織化学染色を示している。スケールバー、１００μｍ。 ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２又はＩＬ−１５Ｒβに対する遮断抗体によるＡＡの予防を示し、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ移植マウスを、移植の時点から全身的に処置したことを示した図であり、ＩＬ−１５Ｒβに対する抗体を用いて移植の時点から全身的に処置したＣ３Ｈ／ＨｅＪ移植マウスにおけるＡＡの発生を示している。 ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２又はＩＬ−１５Ｒβに対する遮断抗体によるＡＡの予防を示し、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ移植マウスを、移植の時点から全身的に処置したことを示した図であり、ＩＬ−１５Ｒβに対する抗体を用いて移植の時点から全身的に処置したＣ３Ｈ／ＨｅＪ移植マウスにおけるＡＡの発生を示している。ＰＢＳ−処置マウスと比較した、ＩＬ−１５Ｒβに対する抗体を用いて処置したマウスの皮膚におけるＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋Ｔ細胞の頻度（ボックスの領域の上に示されている数）を示している。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１） ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２又はＩＬ−１５Ｒβに対する遮断抗体によるＡＡの予防を示し、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ移植マウスを、移植の時点から全身的に処置したことを示した図であり、アイソタイプコントロール抗体を用いて、又は、ＩＬ−１５Ｒβに対する抗体を用いて処置したマウスの皮膚におけるＣＤ８及びＭＨＣのクラスＩ及びＩＩの発現を示す皮膚生検の免疫組織化学染色を示している。スケールバー、１００μｍ。 全身性ＪＡＫ１／２又はＪＡＫ３の抑制は、移植Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおいてＡＡの発症を防ぐことを示した図であり、ルキソリチニブ（ＪＡＫ１／２ｉ）を用いて移植の時点から全身的に処置したＣ３Ｈ／ＨｅＪ移植マウスにおけるＡＡの発生を示している。（＊＊Ｐ＜０．０１）。処置中止から更なる１２週間後の毛の再生も示されている。スケールバー、１００μｍ。 全身性ＪＡＫ１／２又はＪＡＫ３の抑制は、移植Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおいてＡＡの発症を防ぐことを示した図であり、ルキソリチニブ（ＪＡＫ１／２ｉ）を用いて移植の時点から全身的に処置したＣ３Ｈ／ＨｅＪ移植マウスにおけるＡＡの発生を示している。（＊＊Ｐ＜０．０１） 全身性ＪＡＫ１／２又はＪＡＫ３の抑制は、移植Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおいてＡＡの発症を防ぐことを示した図であり、ＰＢＳを用いて、又は、ＪＡＫ１／２ｉを用いて処置したマウスの皮膚及び皮膚リンパ節におけるＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋Ｔ細胞の頻度（ボックスの領域の上に示されている数）を示している。（＊＊＊ｐ＜０．００１） 全身性ＪＡＫ１／２又はＪＡＫ３の抑制は、移植Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおいてＡＡの発症を防ぐことを示した図であり、ＰＢＳを用いて、又は、ＪＡＫ１／２ｉを用いて処置したマウスの皮膚におけるＣＤ８及びＭＨＣのクラスＩ及びＩＩの発現を示す皮膚生検の免疫組織化学染色を示している。 全身性ＪＡＫ１／２又はＪＡＫ３の抑制は、移植Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおいてＡＡの発症を防ぐことを示した図であり、ｌｏｇ２平均発現Ｚ−スコアとして与えられた、ＰＢＳを用いて、又は、ＪＡＫ１／２ｉを用いて処置したマウス由来の転写解析のＡＬＡＤＩＮスコアを示している。 全身性ＪＡＫ１／２又はＪＡＫ３の抑制は、移植Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおいてＡＡの発症を防ぐことを示した図であり、トファシチニブ（ＪＡＫ３ｉ）を用いて移植の時点から全身的に処置したＣ３Ｈ／ＨｅＪ移植マウスにおけるＡＡの発生を示している。（＊＊Ｐ＜０．０１）。処置中止から更なる１２週間後の毛の再生も示されている。スケールバー、１００μｍ。 全身性ＪＡＫ１／２又はＪＡＫ３の抑制は、移植Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおいてＡＡの発症を防ぐことを示した図であり、トファシチニブ（ＪＡＫ３ｉ）を用いて移植の時点から全身的に処置したＣ３Ｈ／ＨｅＪ移植マウスにおけるＡＡの発生を示している。（＊＊Ｐ＜０．０１） 全身性ＪＡＫ１／２又はＪＡＫ３の抑制は、移植Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおいてＡＡの発症を防ぐことを示した図であり、ＰＢＳを用いて、又は、ＪＡＫ３ｉを用いて処置したマウスの皮膚及び皮膚リンパ節におけるＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋Ｔ細胞の頻度（ボックスの領域の上に示されている数）を示している。（＊＊＊ｐ＜０．００１） 全身性ＪＡＫ１／２又はＪＡＫ３の抑制は、移植Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおいてＡＡの発症を防ぐことを示した図であり、ＰＢＳを用いて、又は、ＪＡＫ３ｉを用いて処置したマウスの皮膚におけるＣＤ８及びＭＨＣのクラスＩ及びＩＩの発現を示す皮膚生検の免疫組織化学染色を示している。 全身性ＪＡＫ１／２又はＪＡＫ３の抑制は、移植Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおいてＡＡの発症を防ぐことを示した図であり、ｌｏｇ２平均発現Ｚ−スコアとして与えられた、ＰＢＳを用いて、又は、ＪＡＫ３ｉを用いて処置したマウス由来の転写解析のＡＬＡＤＩＮスコアを示している。 下流のエフェクターキナーゼＪＡＫ１／２又はＪＡＫ３の局所的な小分子インヒビターを用いた確立されたＡＡの回復、及び、ＡＡを有する患者の臨床結果を示した図であり、１２週間にわたる連日の投与によって０．５％ＪＡＫ１／２ｉ（中央）、０．５％ＪＡＫ３ｉ（下）又は溶媒のみ（Ａｑｕａｐｈｏｒ、上）で背部を局所的に処置した、長期にわたり（移植後少なくとも１２週）ＡＡを有する１つの群あたり３匹のマウスを示している。この実験を３回繰り返した。処置中止後更なる８週間の毛の再生も示されている。 下流のエフェクターキナーゼＪＡＫ１／２又はＪＡＫ３の局所的な小分子インヒビターを用いた確立されたＡＡの回復、及び、ＡＡを有する患者の臨床結果を示した図であり、処置後の週として示されている育毛指数の時間経過を示している。 下流のエフェクターキナーゼＪＡＫ１／２又はＪＡＫ３の局所的な小分子インヒビターを用いた確立されたＡＡの回復、及び、ＡＡを有する患者の臨床結果を示した図であり、溶媒コントロールマウスと比較した、ＪＡＫ１／２ｉ又はＪＡＫ３ｉを用いて処置したマウスの皮膚におけるＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋Ｔ細胞の頻度（ボックスの領域の上に示されている数）を示している（平均±ｓ．ｅ．ｍ．、１つの群あたりｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。ＮＳ、有意ではない。 下流のエフェクターキナーゼＪＡＫ１／２又はＪＡＫ３の局所的な小分子インヒビターを用いた確立されたＡＡの回復、及び、ＡＡを有する患者の臨床結果を示した図であり、ＡＬＡＤＩＮスコアは、ｌｏｇ２平均発現Ｚ−スコアとして与えられるＣＴＬ及びＩＦＮシグニチャの処置関連の減少を示している。 下流のエフェクターキナーゼＪＡＫ１／２又はＪＡＫ３の局所的な小分子インヒビターを用いた確立されたＡＡの回復、及び、ＡＡを有する患者の臨床結果を示した図であり、マウスの皮膚生検の免疫組織化学染色が、ＣＤ８及びＭＨＣのクラスＩ及びＩＩのマーカーの発現の処置関連の減少を示している。スケールバー、１００μｍ。 下流のエフェクターキナーゼＪＡＫ１／２又はＪＡＫ３の局所的な小分子インヒビターを用いた確立されたＡＡの回復、及び、ＡＡを有する患者の臨床結果を示した図であり、ルキソリチニブを用いた、ベースラインにて頭皮のうち＞８０％の脱毛を有したＡＡを有する患者３の処置、及び、経口処置の１２週間後の毛の再生を示している。 下流のエフェクターキナーゼＪＡＫ１／２又はＪＡＫ３の局所的な小分子インヒビターを用いた確立されたＡＡの回復、及び、ＡＡを有する患者の臨床結果を示した図であり、患者２の処置前（ベースライン）、及び、処置の１２週間後に得られた生検の臨床的相関性研究を示しており、ＣＤ４、ＣＤ８及びヒト白血球抗原（ＨＬＡ）のクラスＩ（Ａ、Ｂ、Ｃ）及びクラスＩＩ（ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ）に対する免疫染色を含んでいる。スケールバー、２００μｍ。 下流のエフェクターキナーゼＪＡＫ１／２又はＪＡＫ３の局所的な小分子インヒビターを用いた確立されたＡＡの回復、及び、ＡＡを有する患者の臨床結果を示した図であり、ヒートマップとして提示されたＡＡを有する処置した患者１及び２由来のＲＮＡマイクロアレイ解析（処置前対処置後対３の正常な対象）を示している。ＫＲＴ、毛包ケラチン。 下流のエフェクターキナーゼＪＡＫ１／２又はＪＡＫ３の局所的な小分子インヒビターを用いた確立されたＡＡの回復、及び、ＡＡを有する患者の臨床結果を示した図であり、累積ＡＬＡＤＩＮ指数として提示されたＡＡを有する処置した患者１及び２由来のＲＮＡマイクロアレイ解析（処置前対処置後対３の正常な対象）を示している。ＫＲＴ、毛包ケラチン。 トファシチニブで処置したＡＡ患者由来の頭皮皮膚生検サンプルの血清ＣＸＣＬ１０の臨床写真及びＡＬＡＤＩＮプロファイルを示した図である。上のパネルでは、１６週間の１日２回のトファシチニブ５ｍｇを用いた処置にわたって、後側の頭皮の写真を得た。左下のパネルでは、血液及び頭皮の皮膚サンプルを、ベースライン及びトファシチニブを用いた処置の４週間後に採取した。ＣＸＣＬ１０ ＥＬＩＳＡを行った。中央下のパネルでは、健常コントロール患者（正常）から、及び、ベースライン（Ｔ０）及び処置の４週間後（Ｔ４）にてＡＡ患者から採取した頭皮の皮膚サンプルからのＡＬＡＤＩＮ遺伝子のヒートマップが示されている。右下のパネルでは、健常コントロール患者（黒）から、及び、ベースライン（赤色）及び処置の４週間後（黄色）にてＡＡ患者から採取した頭皮の皮膚サンプルのＡＬＡＤＩＮプロットが示されている。 経口トファシチニブ処置の中断後の脱毛の再発を示した図である。左のパネルでは、処置の中断後８週間の状態が示されており、最小限の脱毛が認められ得る。右のパネルでは、処置の中断後１６週間の状態が示されており、患者は、頭皮のほぼ完全な脱毛を示した。 経口トファシチニブを用いて処置した円形脱毛症患者由来の頭皮の生検標本を示した図であり、ベースライン（左のパネル）及びトファシチニブを用いた処置の４週間後（右のパネル）でのＨ＆Ｅ染色された頭皮の生検切片が示されている。 ルキソリチニブ処置中及び中止後の毛髪の再生を示した図である。上のパネルでは、ルキソリチニブ処置中及び中断後の個人の患者に対するＳＡＬＴスコアが示されている。中央のパネルでは、ルキソリチニブ処置中及び中断後の個人の患者に対するパーセント再生が示されている。下のパネルでは、回帰モデルからの予測された患者再生軌道（黒色の線）及び実際の患者再生軌道（青色の線）が示されている。 ルキソリチニブ処置中及び中止後の毛髪の再生を示した図である。上のパネルでは、ルキソリチニブ処置中及び中断後の個人の患者に対するＳＡＬＴスコアが示されている。中央のパネルでは、ルキソリチニブ処置中及び中断後の個人の患者に対するパーセント再生が示されている。下のパネルでは、回帰モデルからの予測された患者再生軌道（黒色の線）及び実際の患者再生軌道（青色の線）が示されている。 ルキソリチニブに対するレスポンダーＡＡ患者の臨床写真を示した図であり、各対の左のパネルはベースラインにて得られた写真であり、右のパネルはルキソリチニブを用いた処置の終わりにて得られた写真である。 皮膚遺伝子発現に基づくバイオマーカーが臨床応答と相関することを示した図であり、ベースラインレスポンダーのサンプル及び健常コントロールサンプル間の発現差異がある遺伝子を使用した、ベースライン、処置の１２週での患者由来のサンプル、及び、健常コントロール由来のサンプルのヒートマップ及びクラスタリング樹状図を示している。 皮膚遺伝子発現に基づくバイオマーカーが臨床応答と相関することを示した図であり、処置後１２週及びベースラインにて対象者から採取したサンプルの主成分プロットを示している。 皮膚遺伝子発現に基づくバイオマーカーが臨床応答と相関することを示した図であり、ＡＬＡＤＩＮ遺伝子のヒートマップを示している。 皮膚遺伝子発現に基づくバイオマーカーが臨床応答と相関することを示した図であり、ＡＬＡＤＩＮシグニチャの３次元プロットを示している。黒色、正常な対象者；赤色、ベースラインでのＡＡレスポンダー患者；紫色、１２週間の処置後のＡＡ患者；黄色、ベースラインでのＡＡノンレスポンダー患者；青色、１２週間の処置後のＡＡノンレスポンダー患者。 皮膚遺伝子発現に基づくバイオマーカーが臨床応答と相関することを示した図であり、ＡＬＡＤＩＮ成分シグニチャスコアを示している。左のパネルでは、ＣＴＬシグニチャスコア；中央のパネルでは、ＩＦＮシグニチャスコア；右のパネルでは、ＫＲＴシグニチャスコア；が示されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 ベースライン、処置の終わり、及び、処置終了後の観察の終わりでの選択された患者の臨床写真を示した図である。Ａ、Ｄ、Ｇ、ベースラインの写真。Ｂ、Ｅ、Ｈ、処置の終わり。Ｃ、Ｆ、Ｉ、観測の終わり。 レスポンダーにおける処置で正規化されたＡＬＡＤＩＮシグニチャを示した図である。ＡＡ患者の皮膚サンプル由来のＡＬＡＤＩＮ成分スコアを、ベースライン、１２週目、及び、特定の症例においては、中間又は処置後の時点にて決定した。青色、レスポンダー患者；赤色、ノンレスポンダー患者；黒色、正常コントロール（ＮＣ）の患者。 ノンレスポンダー患者を示した図である。Ａ、Ｃ、Ｅ、ベースラインの写真。Ｂ、Ｄ、Ｆ、処置の終わりの写真。 遺伝子発現解析が混合性の組織遺伝子シグニチャを同定することを示した図であり、ＡＡＧＳを使用した、ＡＡＰ、ＡＴ／ＡＵ及び未罹患コントロール（正常）のコホートの教師なしの階層的クラスタリングを示している（青色、過小発現、及び、赤色、過剰発現）。 遺伝子発現解析が混合性の組織遺伝子シグニチャを同定することを示した図であり、遺伝子クラスタを示す遺伝子共通類似性マトリックスを示している。オレンジ色が強いほど、遺伝子発現における相違度が低いことを示している。ＡＡにおいて過剰及び過少発現したクラスタが示されている。 遺伝子発現解析が混合性の組織遺伝子シグニチャを同定することを示した図であり、シグニチャにおける遺伝子及びそれに関連する統計的に濃縮された機能的カテゴリーのグラフ表示が示されている。青色はシグナル伝達経路を示し；黄色は免疫／炎症経路を示し；オレンジ色はＨＬＡを示し；さらに、赤色は細胞死経路を示している。ＦＤＲ補正されたｐ＜０．０５での経路を、この解析のために維持した。 ＭＲとしてのＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の同定を示した図であり、浸潤組織（免疫細胞）において発現した遺伝子から、終末器官（ｅｎｄ ｏｒｇａｎ）（皮膚）において発現した遺伝子の制御因子の畳み込みを解く（デコンヴォルーションする）ために使用されるパイプラインの全体的な流れを示している。複雑な一次組織サンプルから測定された遺伝子（Ａ〜Ｆでラベルされた藍緑色のノード）が、皮膚ネットワークにおける制御因子（Ｒ）にマップされ得るかどうかに基づき終末器官（赤色、ＡＡＧＳ）又は浸潤物（青色）に割り当てられている。赤色のノードにマップされた遺伝子のみが、ＭＲ分析のために考慮される。青色のノードにマップされた遺伝子は剪定される。 ＭＲとしてのＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の同定を示した図であり、浸潤組織（免疫細胞）において発現した遺伝子から、終末器官（ｅｎｄ ｏｒｇａｎ）（皮膚）において発現した遺伝子の制御因子の畳み込みを解くために使用されるパイプラインの全体的な流れを示している。結果として生じるＡＡＧＳの剪定は、ＡＡにおいて過剰発現される（クラスタ１、倍率変化に比例するノードサイズ）、及び、抑制される（クラスタ２）、ＩＧＳと相互に排他的である終末器官に富む遺伝子発現シグニチャ（藍緑色のノード）を提供している、ｐ＝１．７７×１０−４。 ＭＲとしてのＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の同定を示した図であり、浸潤組織（免疫細胞）において発現した遺伝子から、終末器官（ｅｎｄ ｏｒｇａｎ）（皮膚）において発現した遺伝子の制御因子の畳み込みを解くために使用されるパイプラインの全体的な流れを示している。頭皮の皮膚制御因子の畳み込みを解くために、ＡＡＧＳ及びＩＧＳに対してＭＲ分析を行い、各シグニチャの候補制御因子を得た。皮膚における真のＭＲ（Ｒ２）は、ＡＡＧＳを使用した場合にのみ現れ、ＩＧＳにおいては現れない。浸潤制御因子（Ｒ１）は、ＡＡＧＳを使用して検出されることはない。ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４は、ＡＡＧＳを使用した場合にのみ有意なＦＤＲ値を有し、ＩＧＳを使用した場合には有意ではない（ＦＤＲ＝１）（左）。この分析は、皮膚においてＡＡＧＳ（藍緑色の四角）及びＭＲ（黄色の四角）としてＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４を確立している（右）。 ＭＲとしてのＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の同定を示した図であり、浸潤組織（免疫細胞）において発現した遺伝子から、終末器官（ｅｎｄ ｏｒｇａｎ）（皮膚）において発現した遺伝子の制御因子の畳み込みを解くために使用されるパイプラインの全体的な流れを示している。頭皮の皮膚制御因子の畳み込みを解くために、ＡＡＧＳ及びＩＧＳに対してＭＲ分析を行い、各シグニチャの候補制御因子を得た。皮膚における真のＭＲ（Ｒ２）は、ＡＡＧＳを使用した場合にのみ現れ、ＩＧＳにおいては現れない。浸潤制御因子（Ｒ１）は、ＡＡＧＳを使用して検出されることはない。ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４は、ＡＡＧＳを使用した場合にのみ有意なＦＤＲ値を有し、ＩＧＳを使用した場合には有意ではない（ＦＤＲ＝１）（左）。この分析は、皮膚においてＡＡＧＳ（藍緑色の四角）及びＭＲ（黄色の四角）としてＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４を確立している（右）。 ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の外因性発現が、コンテクストに依存しないＡＡ様遺伝子発現シグニチャを誘導することを示した図であり、ＩＫＺＦ１、ＤＬＸ４を発現するプラスミドベクター、又は、ＤＮＡ結合ドメインを欠くアイソフォームであるＩＫＺＦδ及びＲＦＰを発現するコントロールで遺伝子導入したｈｕＤＰ及びＨＫにおいて測定された遺伝子発現の２Ｄ階層的クラスタリングを示している。各実験に対する処置タイプ及び細胞タイプは、ヒートマップの上部に示されている。青色は減少した発現を示し、赤色は過剰発現を示している。 ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の外因性発現が、コンテクストに依存しないＡＡ様遺伝子発現シグニチャを誘導することを示した図であり、平均±ＳＥＭとして表され、Ｂ−アクチンに対して正規化された、四通りの遺伝子導入された細胞におけるＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４ ｍＲＮＡの発現の分析を示している。 ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の外因性発現が、コンテクストに依存しないＡＡ様遺伝子発現シグニチャを誘導することを示した図であり、ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４タンパク質を確認するウェスタンブロットを示している。 ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の外因性発現が、コンテクストに依存しないＡＡ様遺伝子発現シグニチャを誘導することを示した図であり、ＩＫＺＦ１過剰発現後のＡＡＧＳの発現差異によって評価されるＡＡ様応答の特異性を測定するＧＳＥＡプロットが示されている。遺伝子が、ｘ軸上で、最も発現差異のあるものから最も発現差異のないものまで、左から右にランク付けされており、バーコードが、ＩＫＺＦ１シグニチャ遺伝子の位置を表している。エンリッチメントスコア（ＥＳ）がプロット内に示されており、正規化されたエンリッチメントスコア（ｎＥＳ）が上部に表示されている。ｎＥＳは、プロットの「最先端」でのＥＳ、すなわち、得られた最初の最大ＥＳピークから得られる。ｐ値が、無作為の帰無分布に対して比較されたｎＥＳに対して計算されている。 ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の外因性発現が、コンテクストに依存しないＡＡ様遺伝子発現シグニチャを誘導することを示した図であり、ＤＬＸ４過剰発現後のＡＡＧＳの発現差異によって評価されるＡＡ様応答の特異性を測定するＧＳＥＡプロットが示されている。遺伝子が、ｘ軸上で、最も発現差異のあるものから最も発現差異のないものまで、左から右にランク付けされており、バーコードが、ＤＬＸ４シグニチャ遺伝子の位置を表している。エンリッチメントスコア（ＥＳ）がプロット内に示されており、正規化されたエンリッチメントスコア（ｎＥＳ）が上部に表示されている。ｎＥＳは、プロットの「最先端」でのＥＳ、すなわち、得られた最初の最大ＥＳピークから得られる。ｐ値が、無作為の帰無分布に対して比較されたｎＥＳに対して計算されている。 ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の外因性発現が、３つの培養細胞タイプにおけるＮＫＧ２Ｄ依存性ＰＢＭＣ関連細胞傷害の増加を誘導することを示した図である。各列の左側の概略図は、（三通りの）細胞傷害性アッセイのためにＰＢＭＣに導入される組織を記載している。色は宿主源を示している（一致する色は、宿主が一致する組織を示している）。中央の棒グラフは、６時間のインキュベーション後に得られた細胞傷害値（全てのバーの高さ）、又は、ヒト抗ＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体を添加して６時間後に観察された細胞傷害値（灰色のバー）を表している。ＮＫＧ２Ｄ依存性細胞傷害性は、それら２つの差（白いバー）である。右側の棒グラフは、ＲＦＰコントロールに対して正規化されたＮＫＧ２Ｄ依存性細胞傷害性における変化を報告している。ＩＫＺＦ１．２ＢはＩＫＺＦ１δベクターで遺伝子導入した細胞を示し、ＩＫＺＦ１．３Ｂは完全長の転写物を示している。ｙ軸は、最大細胞傷害性（全細胞数）の割合として測定された細胞傷害性を報告している。全てのエラーバーは±ＳＥＭを報告している。＊＊は、ＦＤＲ＜０．０５でのＲＦＰコントロールとの統計的有意差を示している。（Ａ）ＷＢ２１５Ｊ ＰＢＭＣ及びＷＢ２１５Ｊ線維芽細胞に対応するデータ系列を示した図である。（Ｂ）培養されるｈｕＤＰに対するＷＢ２１５Ｊ ＰＢＭＣを示した図である。（Ｃ）培養されるＨＫに対するＷＢ２１５Ｊ ＰＢＭＣを示した図である。 完全に再構築された主要制御因子モジュールが、免疫浸潤も重症度も予測することを示した図であり、外因性発現データを使用して、直接転写型ＭＲ Ｔ（ＭＲ→Ｔ）も、ＭＲのＴであるＴＦによって制御されるＴ（ＭＲ→ＴＦ→Ｔ）も推測することが可能である。ＭＲｓ ＩＫＺＦ１又はＤＬＸ４（ＴＦＡ）と対になり、ＴＦＡの過剰発現の際に発現における変化を示すいかなるＴＦ（ＴＦＢ）も、ＴＦＡによって制御される。その後、ＴＦＢに連結されるＡＡＧＳにおけるいかなる遺伝子（Ｔ）も、（ＴＦＢが応答する）ＴＦＡの二次Ｔである。ＴＦＡの遺伝子導入に応答しないいかなるＴＦＢも、ＴＦＡによって制御されないため、ＴＦＢがＴＦＡを制御する（ＴＦＢ安定、左）又はその両方が第３のＴＦＣによって同時制御される（ＴＦＢ安定、右）。 完全に再構築された主要制御因子モジュールが、免疫浸潤も重症度も予測することを示した図であり、上記の手法を使用して、ＡＡＧＳの７８％を１つの間接的なＴＦＢ内のＩＫＺＦ１又はＤＬＸ４にマップすることができる。青色のノードは、ＩＫＺＦ１又はＤＬＸ４の発現に応答するＡＡＧＳ遺伝子を表し、ノードのサイズは、実験的に観察された倍率変化にスケール調整されている（少なくとも２５％の変化を有するノードのみが示されている）。 完全に再構築された主要制御因子モジュールが、免疫浸潤も重症度も予測することを示した図であり、上記のＴを使用して、ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４転写活性の単一の数値スコアを生成し、ＡＡ重症度に対する分類子を作成するために使用した。次いで、ＡＡサンプルは、検索空間に課せられ、精度が評価される（上の図）。表には、検索空間内の領域にわたる提示を分離するための定量化及び統計が提供されている（未罹患：ＮＣ；斑状のＡＡ：ＡＡＰ；及び、全頭脱毛症／全身脱毛症：ＡＴ／ＡＵ）。重心表示は、訓練された境界を横切って移動することによって、どのようにして母集団が疾患状態に移行するかを示すために使用することができる（下の図；非病変：ＡＡＰ−Ｎ、及び、病変：ＡＡＰ−Ｌ）。 畳み込みを解かれた制御モジュールを、同じナイーブフレームワークを使用してＡＡ、Ｐｓ及びＡＤに対して生成することができることを示した図であり、Ｐｓ及びＡＤに対する疾患関連遺伝子発現シグニチャは、発現差異によって明確に定めることができる。これらのシグニチャとＡＡ遺伝子シグニチャとの比較は、ＡＡシグニチャがＰｓシグニチャとＡＤシグニチャの両方とは統計的に異なることを明らかにしており（フィッシャーの正確確率検定）、ＰｓシグニチャとＡＤシグニチャとのいくつかの共有に関する統計的証拠がある。 畳み込みを解かれた制御モジュールを、同じナイーブフレームワークを使用してＡＡ、Ｐｓ及びＡＤに対して生成することができることを示した図であり、上記のシグニチャを制御モジュールに変換することは、ＡＡと比較して、ＡＤ及びＰｓを支配する全く異なるＭＲを明らかにしている。黄色のノード＝ＡＡ遺伝子シグニチャ；青色のノード＝ＡＤ遺伝子シグニチャ；藍緑色のノード＝Ｐｓ遺伝子シグニチャ；オレンジ色のノード＝ＡＡ ＭＲ；濃青色のノード＝ＡＤ ＭＲ；及び、シアン色のノード＝Ｐｓ ＭＲである。上位５つのＡＤ及びＰｓ ＭＲのリストが提供され、対応するシグニチャのカバー度によってランク付けされている。また、畳み込みが解かれていない各ＭＲのｐ値（ＩＧＳ ｐ値）も提供されている（＊は公開された制御因子を示し、†はＡＤ及びＰｓに共通のＭＲを示している）。 図２４のＡＡＧＳにおける濃縮された経路を示した図である。追加のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓが、ＡＡＧＳ内の浸潤集団及び終末器官のプロセスの両方に対する免疫及び細胞傷害シグナル伝達カスケードの濃縮を示している。ＭＲによって制御される発現差異がある遺伝子には、多くの膜結合タンパク質、細胞死タンパク質及び免疫関連タンパク質が含まれる。 図２４のＡＡＧＳにおける濃縮された経路を示した図である。追加のＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓが、ＡＡＧＳ内の浸潤集団及び終末器官のプロセスの両方に対する免疫及び細胞傷害シグナル伝達カスケードの濃縮を示している。ＭＲによって制御される発現差異がある遺伝子には、多くの膜結合タンパク質、細胞死タンパク質及び免疫関連タンパク質が含まれる。 図２９のＡＤ及びＰｓの疾患遺伝子シグニチャを示した図であり、遺伝子発現を使用した、病変及び未罹患の患者のサンプルの教師なしの階層的クラスタリングを示している。患者は、関連遺伝子発現シグニチャを使用して、乾癬において臨床提示によって見事に分離している。サンプルの樹状図が、図２９において提供されているヒートマップに対する参照のためにここで提供されている。乾癬及びアトピー性皮膚炎のコホートは、未罹患コントロールから患者を明確に描写する遺伝子発現シグニチャを有している。 図２９のＡＤ及びＰｓの疾患遺伝子シグニチャを示した図であり、遺伝子発現を使用した、病変及び未罹患の患者のサンプルの教師なしの階層的クラスタリングを示している。患者は、関連遺伝子発現シグニチャを使用して、アトピー性皮膚炎において臨床提示によって見事に分離している。サンプルの樹状図が、図２９において提供されているヒートマップに対する参照のためにここで提供されている。乾癬及びアトピー性皮膚炎のコホートは、未罹患コントロールから患者を明確に描写する遺伝子発現シグニチャを有している。 図２７の細胞傷害性アッセイを示した図であり、細胞傷害性アッセイに対するＰＢＭＣ濃度の最適化が、最適な分離を達成するための１００：１のＰＢＭＣ：標的の比を同定している。 、図２７の細胞傷害性アッセイを示した図であり、細胞傷害性アッセイに対する時間窓の最適化が、最適な分離を達成するための少なくとも６時間という時間を同定している。 本開示と関連させてバイオマーカーとして使用するためのＳＮＰのリストを描いた図である。 本開示と関連させてバイオマーカーとして使用するためのＳＮＰのリストを描いた図である。 本開示と関連させてバイオマーカーとして使用するためのＳＮＰのリストを描いた図である。 ルキソリチニブによるＡＡの処置の臨床研究の設計の概要を述べた図である。 図３５に記載されている研究の状態の概要を述べた図である。 図３５に記載されている研究の結果の概要を述べた図である。 図３５に記載されている研究と関連させて得られた結果を描いた図である。 図３５に記載されている研究と関連させて得られた結果を描いた図である。 図３５に記載されている研究と関連させて得られた結果を描いた図である。 図３５に記載されている研究と関連させて得られた結果を描いた図である。 図３５に記載されている研究と関連させて得られた結果を描いた図である。 図３５に記載されている研究と関連させて得られた結果を描いた図である。 図３５に記載されている研究と関連させて得られた結果を描いた図である。 図３５に記載されている研究と関連させて得られた結果を描いた図である。 図３５に記載されている研究と関連させて得られた結果を描いた図である。 図３５に記載されている研究と関連させて得られた結果を描いた図である。 トファシチニブによるＡＡの処置の臨床研究の設計の概要を述べた図である。 図４５に記載されている研究と関連させて得られた結果を描いた図である。
本開示の主題は、ＡＡの改善された診断及び予後判定、並びに、上記の疾患に対する効果的な処置を可能にするバイオマーカーに関し、そのような処置に応答する患者亜集団を同定する能力を持つバイオマーカーを組み込む方法、及び、そのような処置の進展を追跡する能力を持つバイオマーカーを組み込む方法を含む。
Ａ．定義
本開示によると、「対象者」（「被検者」）又は「患者」は、ヒト又は非ヒト動物である。動物の対象者は好ましくはヒトであるけれども、本発明の化合物及び組成物は獣医学においても適用され、例えば、イヌ、ネコ、マウス及び様々な他のペット等の飼いならされた種；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の家畜種；及び、非ヒト霊長類等の例えば野生又は動物園における野生動物；の処置に対して適用される。
本明細書において使用される場合、「処置」、「処置する」等の用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的な効果を得ることを意味する。この効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に防ぐという点から予防的であってもよく、及び／又は、疾患に対する部分的又は完全な治癒及び／又は疾患に起因し得る有害作用という点から治療的であってもよい。「処置」は、本明細書において使用される場合、対象者又は患者における疾患のいかなる処置もカバーし、さらに：（ａ）疾患にかかりやすいかもしれないがまだそれを有すると診断されていない対象者において疾患が発生するのを防ぐこと；（ｂ）疾患を抑制すること、すなわち、その発達を抑止すること；及び、（ｃ）その疾患を軽減すること、すなわち、疾患を後退させること；を含む。
「治療的に有効な量」又は「効果的な量」は、疾患を処置するために哺乳動物又は他の対象者に投与されたときに、そのような疾患に対する処置を行うのに十分な化合物又は組成物の量を意味する。「治療的に有効な量」は、使用される化合物又は組成物、疾患及びその重症度、並びに、処置されることになる対象者の年齢、体重等に応じて変わり得る。
「医薬組成物」及び「医薬製剤」という用語は、本明細書において使用される場合、その中に含有される有効成分の生物活性が効果的であるのを許容するような形態であり、且つ、製剤が投与されるであろう患者に対して容認しがたいほどに有毒な更なる成分を含有しない組成物を意味する。
「薬学的に許容される」という用語は、例えば「薬学的に許容されるキャリア」に関して本明細書において使用される場合、対象者に対して無毒であるという性質を意味する。医薬製剤中の薬学的に許容される成分は、無毒である有効成分以外の成分であり得る。薬学的に許容されるキャリアは、緩衝液、賦形剤、安定剤及び／又は保存剤を含み得る。
本明細書において使用される場合、「ＪＡＫインヒビター」は、Ｊａｋ１／Ｊａｋ２／Ｊａｋ３／Ｔｙｋ２／ＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ２／ＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ４／ＳＴＡＴ５ａ／ＳＴＡＴ５ｂ／ＳＴＡＴ６／ＯＳＭ／ｇｐ １３０／ＬＩＦＲ／ＯＳＭ−Ｒβ遺伝子、又は、Ｊａｋ１／Ｊａｋ２／Ｊａｋ３／Ｔｙｋ２／ＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ２／ＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ４／ＳＴＡＴ５ａ／ＳＴＡＴ５ｂ／ＳＴＡＴ６／ＯＳＭ／ｇｐ１３０／ＬＩＦＲ／ＯＳＭ−Ｒβタンパク質若しくはポリペプチドと相互作用し、且つ、その活性及び／又はその発現を抑制する化合物を意味する。この化合物は、Ｊａｋ１／Ｊａｋ２／Ｊａｋ３／Ｔｙｋ２／ＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ２／ＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ４／ＳＴＡＴ５ａ／ＳＴＡＴ５ｂ／ＳＴＡＴ６／ＯＳＭ／ｇｐ １３０／ＬＩＦＲ／ＯＳＭ−Ｒβによってコードされるタンパク質の活性又は発現を減少させることができる。特定の実施形態では、ＪＡＫインヒビターは、重水素化化合物であり得る。特定の実施形態では、重水素化化合物は、化合物上の１つ又は複数の部位での重水素化によって改変されてもよい。
本開示のＪＡＫインヒビターは、本明細書において開示される対応する配列によってコードされるポリペプチドに対して作られる（モノクローナル、ポリクローナル、ヒト化、キメラ又は完全ヒト型）抗体又はその結合性フラグメント等のタンパク質であり得る。抗体断片は、完全長の形態以外の抗体の形態であってもよく、操作された抗体断片に加えて、完全長の抗体内に存在する部分又は成分を含む。抗体断片は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、Ｆｖ及び（Ｆａｂ´）２、三重特異性抗体、Ｆｃ、Ｆａｂ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲの組み合わせ、可変領域、四重特異性抗体、二機能性ハイブリッド抗体、フレームワーク領域、定常領域等を含み得るが、それらに限定されない。抗体は、当技術分野において確立された方法に従って、関心のある抗原に対して、商業的に得る、カスタム生成する又は合成することができる。
本開示のＪＡＫインヒビターは、タンパク質に結合し且つその機能を破壊する小分子であり得る。小分子は、一般的に低分子量を有する合成物質及び天然物質の多様な群である。小分子は、天然源（例えば、植物、菌類、微生物等）から単離することができ、商業的に得られ、及び／又は、ライブラリー又はコレクションとして入手可能であるか又は合成される。タンパク質を調節する候補小分子は、コンビナトリアルライブラリーのｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのスクリーニング又はハイスループット（ＨＴＰ）スクリーニングを介して同定することができる。アスピリン、ペニシリン及び多くの化学療法薬等のほとんどの従来の医薬品は、小分子であり、商業的に得ることができ、化学的に合成することができ、又は、ランダム又はコンビナトリアルライブラリーから得ることができる。特定の実施形態では、作用物質は、標的タンパク質又はＲＮＡと結合する、相互作用する又は付随する小分子である。そのような小分子は、標的が細胞内標的である場合、細胞の脂質二重層に浸透して標的と相互作用する能力を持つ有機分子であり得る。小分子には、毒素、キレート剤、金属及びメタロイド化合物が含まれるが、それらに限定されない。小分子は、小分子を特定の細胞に特異的に誘導するように、ターゲティング剤に結合させるか又は接合させることができる。
特定の実施形態では、ＪＡＫインヒビターは、ルキソリチニブ（ＩＮＣＢ ０１８４２４）、トファシチニブ（ＣＰ６９０５５０）、チロホスチンＡＧ４９０（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１３３５５０−３０−８）、モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）、バリシチニブ（ＬＹ３００９１０４）、フェドラチニブ（ＴＧ１０１３４８）、ＢＭＳ−９１１５４３（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１２７１０２２−９０−２）、レスタウルチニブ（ＣＥＰ−７０１）、フルダラビン、エピガロカテキン−３−ガラート（ＥＧＣＧ）、ペフィシチニブ、ＡＢＴ４９４（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１３１０７２６−６０−３）、ＡＴ９２８３（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：８９６４６６−０４−９）、デセルノチニブ、フィルゴチニブ、ガンドチニブ、ＩＮＣＢ３９１１０（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１３３４２９８−９０−６）、ＰＦ ０４９６５８４２（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１６２２９０２−６８−４）、Ｒ３４８（Ｒ−９３２３４８、ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：９１６７４２−１１−５；１６２０１４２−６５−５）、ＡＺＤ１４８０（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：９３５６６６−８８−９）、セルジュラチニブ、ＩＮＣＢ０５２７９３（Ｉｎｃｙｔｅ、臨床試験ＩＤ：ＮＣＴ０２２６５５１０）、ＮＳ０１８（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１２３９３５８−８６−１（遊離塩基）；１２３９３５８−８５−０（ＨＣｌ））、ＡＣ ４１０（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：１３６１４１５−８４−０（遊離塩基）、１３６１４１５−８６−２（ＨＣｌ））、ＣＴ１５７８（ＳＢ１５７８、ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：９３７２７３−０４−６）、ＪＴＥ０５２（Ｊａｐａｎ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｉｎｃ．）、ＰＦ６２６３２７６（Ｐｆｉｚｅｒ）、Ｒ５４８（Ｒｉｇｅｌ）、ＴＧ０２（ＳＢ１３１７、ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ：９３７２７０−４７−８）、ランブリカス・レベラス抽出物、ＡＲＮ４０７９（Ａｒｒｉｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣ．）、ＡＲ１３１５４（Ａｅｒｉｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、ＵＲ６７７６７（Ｐａｌａｕ Ｐｈａｒｍａ Ｓ．Ａ．）、ＣＳ５１０（Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｃｈｉｐｓｃｒｅｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．）、ＶＲ５８８（Ｖｅｃｔｕｒａ Ｇｒｏｕｐ ｐｌｃ）、ＤＮＸ０４０４２（Ｄｙｎａｍｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｃｌｅｖｅｘｅｌ）、ハイパーフォリン又はその組み合わせである。
特定の実施形態では、ＪＡＫインヒビターは、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、Ｊａｋ３、Ｔｙｋ２、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ５ｂ、ＳＴＡＴ６、ＯＳＭ、ｇｐ１３０、ＬＩＦＲ又はＯＳＭ−Ｒβをコードする遺伝子の発現を特異的に抑制するアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ又はその変異体若しくは変態である。
Ｂ．円形脱毛症のバイオマーカー
本開示の実施形態は、対象者における円形脱毛症（ＡＡ）を処置する方法に関する。特定の実施形態では、対象者におけるＡＡを処置する方法であって：疾患重症度、及び／又は、上記の対象者に治療的介入を施す前、施している間及び／又は施した後の対象者の処置に応答する傾向を示すバイオマーカーを検出するステップを含む方法が開示されている。特定の実施形態では、バイオマーカーは遺伝子発現シグニチャである。特定の実施形態では、遺伝子発現シグニチャは、以下の群の遺伝子：ヘアケラチン（ＫＲＴ）関連遺伝子、細胞傷害性Ｔリンパ球浸潤（ＣＴＬ）関連遺伝子及びインターフェロン（ＩＦＮ）関連遺伝子のうち１つ又は複数の群の遺伝子発現情報を含む。特定の実施形態では、ＫＲＴ関連遺伝子は、ＤＳＧ４、ＨＯＸＣ３１、ＫＲＴ３１、ＫＲＴ３２、ＫＲＴ３３Ｂ、ＫＲＴ８２、ＰＫＰ１及びＰＫＰ２を含む。特定の実施形態では、ＣＴＬ関連遺伝子は、ＣＤ８Ａ、ＧＺＭＢ、ＩＣＯＳ及びＰＲＦ１を含む。特定の実施形態では、ＩＦＮ関連遺伝子は、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＳＴＡＴ１及びＭＸ１を含む。
特定の実施形態では、遺伝子発現シグニチャは、円形脱毛症疾患活性指数（ＡＬＡＤＩＮ）である。円形脱毛症疾患活性指数（ＡＬＡＤＩＮ）は、疾患重症度及び処置に対する応答を追跡するためのバイオマーカーとしての潜在的使用のための３次元定量的複合遺伝子発現スコアである。特定の実施形態では、ＡＬＡＤＩＮは、ＣＴＬ、ＩＦＮ及びＫＲＴ関連遺伝子の遺伝子発現に基づき、ＣＴＬ、ＩＦＮ及びＫＲＴのＡＬＡＤＩＮスコアが、対象者の各サンプルに対して計算される。特定の実施形態では、ｚ−スコアが、正常コントロールの平均及び標準偏差に対して、各プローブセットに対して計算される。各遺伝子に対するｚ−スコアは、その遺伝子にマップされたプローブセットのｚ−スコアを平均することによって得られてもよい。特定の実施形態では、次いで、シグニチャスコアが、対応するシグニチャに属する遺伝子に対するｚ−スコアの平均で計算される。
特定の実施形態では、バイオマーカーは、表Ａにおいて記載された１つ又は複数の遺伝子を含む円形脱毛症遺伝子シグニチャ（ＡＡＧＳ）である。特定の実施形態では、バイオマーカーは、ＩＫＺＦ１、ＤＬＸ４又はその組み合わせである。
表Ａ
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Ｃ．バイオマーカー検出
本開示の方法において使用されるバイオマーカーは、当該技術で公知のいずれの方法を用いて生物学的サンプル中で同定され得る。バイオマーカー、タンパク質もしくはその分解生成物の存在、ｍＲＮＡもしくはプレｍＲＮＡの存在、又はバイオマーカーの発現を示すいずれの生体分子もしくは生成物の存在、又はその分解生成物を決定することは、本明細書に記載されるか、又は当該技術で公知のいずれの方法における使用のために実施することができる。
核酸検出技術
核酸バイオマーカーを定性的又は定量的に検出するためのいずれの方法を使用することができる。例えば、ＲＮＡ転写物の検出は、例えばノーザンブロッティングによって行うことができる。ここで、ＲＮＡの調製物を変性アガロースゲル上で泳動させ、そして活性化セルロース、ニトロセルロース又はガラス又はナイロン膜などの適切な支持体に転写する。次いで、放射標識したｃＤＮＡ又はＲＮＡを前記調製物にハイブリダイズさせ、洗浄し、オートラジオグラフィーによって分析する。
ＲＮＡ転写物の検出は、増幅方法を用いてさらに達成することができる。例えば、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した後にポリメラーゼ連鎖反応を行うこと（ＲＴ−ＰＣＲ）、又は米国特許第５,３２２,７７０号に記載されるように両方の工程のために単一の酵素を使用すること、又はＲ． Ｌ． Ｍａｒｓｈａｌｌ， ｅｔ ａｌ．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４： ８０−８４ （１９９４）に記載されるようにｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した後に対称ギャップリガーゼ連鎖反応を行うこと（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）は、本開示の範囲内である。
特定の実施形態において、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、バイオマーカーのｍＲＮＡレベルを評価する。バイオマーカー及びコントロールｍＲＮＡのレベルは、患部組織もしくは細胞及び隣接する罹患していない組織において定量することができる。１つの特定の実施形態において、生体サンプル中の１つ以上のバイオマーカーのレベルを定量することができる。
本明細書で利用することができる他の既知の増幅方法は、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７： １８７４−１８７８ （１９９０）に記載され、且つＮａｔｕｒｅ ３５０ （Ｎｏ． ６３１３）： ９１−９２ （１９９１）にも記載される、いわゆる「ＮＡＳＢＡ」又は「３ＳＲ」技術；欧州特許出願公開（ＥＰＡ）第４５４４６１０号に記載されているＱ−ベータ増幅；Ｇ． Ｔ． Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４２： ９−１３ （１９９６）及び欧州特許出願第６８４３１５号に記載されている鎖置換増幅；及びＰＣＴ公開ＷＯ９３２２４６１に記載されているような標的媒介増幅；を包含するが、これらに限定されない。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの視覚化も利用することができる。ここで、放射性標識されたアンチセンスＲＮＡプローブは、生検サンプルの薄切片とハイブリダイズされ、洗浄され、ＲＮアーゼで切断され、オートラジオグラフィーのための感光乳剤(sensitive emulsion)に曝露される。サンプルは、当該サンプルの組織学的組成を証明するためにヘマトキシリンで染色することができ、好適な光フィルターによる暗視野イメージングは、現像された感光乳剤(emulsion)を示す。ジゴキシゲニンなどの非放射性標識も使用することができる。
バイオマーカー発現の評価のための別の方法は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（fluorescent in situ hybridization,ＦＩＳＨ）によってバイオマーカーのｍＲＮＡレベルを検出することである。ＦＩＳＨは、細胞中のＤＮＡ又はＲＮＡの特定の領域を直接的に同定することができる技術であり、及び従って、組織サンプル中のバイオマーカー発現の視覚的決定を可能にする。ＦＩＳＨ法は、より客観的なスコアリングシステムと、同じサンプル中の全ての非新生物細胞に存在するバイオマーカー遺伝子シグナルからなる組み込み(built-in)インターナルコントロールの存在と、の利点を有する。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、比較的迅速かつ敏感である直接ｉｎ ｓｉｔｕ技術である。ＦＩＳＨテストも自動化できる。免疫組織化学単独でバイオマーカーの発現レベルを決定することが困難な場合、免疫組織化学をＦＩＳＨ法と組み合わせることができる。
あるいは、ｍＲＮＡ発現は、ＤＮＡアレイ、チップ又はマイクロアレイ上で検出することができる。バイオマーカー（複数可）に対応するオリゴヌクレオチドはチップ上に固定化され、次いで、対象者(a subject)から得られたテストサンプルの標識核酸とハイブリダイズされる。ポジティブハイブリダイゼーションシグナルは、バイオマーカー転写物を含有するサンプルで得られる。ＤＮＡアレイを調製する方法及びその使用は、当技術で周知である（例えば、米国特許第６，６１８，６７９６号、第６，３７９，８９７号、第６，６６４，３７７号、第６，４５１，５３６号、第５４８，２５７号、米国特許第２００３０１５７４８５号及びＳｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ． １９９５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０：４６７−４７０； Ｇｅｒｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ． １９９９ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２４， １６８−１７３； ａｎｄ Ｌｅｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ． ２０００ Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ５： ５９−６５を参照。これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。遺伝子発現の逐次連続分析（Serial Analysis of Gene Expression,ＳＡＧＥ）も行うことができる（例えば、ＵＳ米国特許出願第２００３０２１５８５８号を参照）。
ｍＲＮＡレベルをモニターするために、例えば、試験すべき生体サンプルからｍＲＮＡを抽出することができ、逆転写され、及び蛍光標識したｃＤＮＡプローブが生成される。マイクロアレイは、バイオマーカーにハイブリダイズすることができる。次いでｃＤＮＡを標識されたｃＤＮＡプローブでプローブすることができ、スライドをスキャンし、及び蛍光強度を測定する。この強度は、ハイブリダイゼーション強度及び発現レベルと相関する。
ＲＮＡの検出のためのプローブのタイプは、ｃＤＮＡ、リボプローブ、合成オリゴヌクレオチド及びゲノムプローブを包含する。使用されるプローブのタイプは、一般に、特定の状況、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためのリボプローブ及びノーザンブロッティングのためのｃＤＮＡ、によって決定づけられよう(dictated)。特定の実施形態において、プローブは、特定のバイオマーカーＲＮＡにユニークなヌクレオチド領域に向けられる。プローブは、特定のバイオマーカーｍＲＮＡ転写物を示差的に認識するために必要とされるように短くてもよく、且つ、例えば、１５塩基ほど短くてもよい。しかし、少なくとも１７塩基、少なくとも１８塩基及び少なくとも２０塩基のプローブを使用することができる。特定の実施形態において、プライマー及びプローブは、標的遺伝子に対応するヌクレオチド配列を有する核酸フラグメントにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする。本明細書で使用されるように、「ストリンジェントな条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％又は少なくとも９７％の同一性(identity)がある場合にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
プローブの標識の形態は、放射性同位体の使用のような適切であるいずれか、例えば３２Ｐ及び３５Ｓなど、であり得る。放射性同位元素による標識は、プローブが化学的に又は生物学的に合成されようと、好適に標識された塩基の使用により達成することができる。
タンパク質検出技術
タンパク質バイオマーカーの検出のための方法は、当業者に周知であり、且つ、質量分析技術、１−Ｄもしくは２−Ｄゲルベースの分析システム、クロマトグラフィー、酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme linked immunosorbent assays,ＥＬＩＳＡｓ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ウェスタンブロッティング、免疫沈降及び免疫組織化学を包含するが、これらに限定されない。これらの方法は、タンパク質を検出するために抗体もしくは抗体等価物を使用するか、又は生物物理学的技術を使用する。抗体アレイ又はタンパク質チップも使用することができる（例えば、米国特許出願番号２００３／００１３２０８Ａ１；２００２／０１５５４９３Ａ１号、２００３／００１７５１５号及び米国特許第６，３２９，２０９号及び第６，３６５，４１８号を参照。その全体が参照により本明細書に組み入れられる。）。
ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡ手順は、バイオマーカー標準を標識するように行うことができる（１２５Ｉもしくは３５Ｓなどの放射性同位元素、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼなどのアッセイ可能な酵素を用いて）、且つ、標識されていないサンプルと共に、対応する抗体と接触させることができ、その際、第２の抗体を用いて第１の抗体に結合させ、及び放射能もしくは固定化酵素をアッセイする（競合アッセイ）。あるいは、サンプル中のバイオマーカーを対応する固定化抗体と反応させ、放射性同位体又は酵素標識抗バイオマーカー抗体を系と反応させ、及び放射能又は酵素をアッセイする（ＥＬＩＳＡ−サンドイッチアッセイ）。他の従来の方法も好適に使用することができる。
上記の技術は、本質的に「１ステップ」又は「２ステップ」アッセイとして実施することができる。「１ステップ」アッセイは、抗原を固定化抗体と接触させ、洗浄することなく、混合物を標識抗体と接触させることを含む。「２ステップアッセイは、混合物を標識抗体と接触させる前に洗浄することを含む。他の従来の方法も好適に使用することができる。
特定の実施形態において、バイオマーカー発現を測定する方法は、以下のステップ：
生体サンプル、例えば血液及び／又は血漿を、前記バイオマーカーに選択的に結合する抗体又はその変異体（例えば、フラグメント）と接触させるステップと、
前記抗体又はその変異体が前記サンプルに結合しているかどうかを検出するステップと、
を包含する。方法は、前記サンプルを第２の抗体、例えば標識された抗体と接触させることをさらに含むことができる。当該方法は、例えば１以上の試薬を除去するため、１以上の洗浄ステップをさらに包含することができる。
分析システムの１成分を支持体上に固定化し、それにより、前記システムの他の成分を当該成分と接触させ、且つ、面倒な時間を費やす労力なしに容易に除去することができることが望ましい。第２の相を第１の相から離して(away from)固定化することは可能であるが、通常は１相で十分である。
酵素自体を支持体上に固定化することは可能であるが、固相酵素が必要な場合には、これは一般に、抗体に結合させ、及び当該技術において周知である支持体、モデル及びシステムに前記抗体を固定させることによって最も良好に達成される。単純なポリエチレンは好適な支持体を提供することができる。
標識に用いることができる酵素は、特に限定されないが、例えば、オキシダーゼ群のメンバーから選択することができる。これらは、その基質との反応による過酸化水素の産生を触媒し、そしてグルコースオキシダーゼは、その良好な安定性、入手容易性及び安価性、ならびにその基質（グルコース）の容易な利用可能性のためにしばしば使用される。オキシダーゼの活性は、当該技術で周知の制御条件下で、酵素標識された抗体と基質との反応後に形成された過酸化水素の濃度を測定することによって、アッセイすることができる。
本開示に基づく専門家(practitioner)の選択に従ってバイオマーカーを検出するために、他の技術を使用することができる。バイオマーカータンパク質レベルを検出及び定量するために使用できる１つのこのような技術は、ウェスタンブロッティングである（Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７６：４３５０ （１９７９））。細胞を凍結し、溶解緩衝液中でホモジナイズし、溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びニトロセルロースフィルターなどの膜へのブロッティングに供することができる。次いで、抗体（標識されていない）を前記膜と接触させ、そして、二次免疫試薬、例えば標識されたプロテインＡ又は抗免疫グロブリン（１２５Ｉ、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼを包含する好適なラベル）、によりアッセイする。クロマトグラフィーによる検出も用いることができる。特定の実施形態において、免疫検出は、増強化学発光系（例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡから）を使用するバイオマーカーに対する抗体を用いて行うことができる。その後、前記膜をストリップし、そしてコントロール(control)抗体、例えばSigma（St.Louis,Mo.）からの抗アクチン（Ａ−２０６６）ポリクローナル抗体で再ブロットすることができる。
例えば生検サンプル中のバイオマーカーの発現及び／又は存在を検出するために免疫組織化学を用いることができる。好適な抗体を、例えば、細胞の薄層と接触させ、続いて未結合の抗体を除去するため洗浄して、及び次いで第２の標識された抗体と接触させる。標識することは、蛍光マーカー、酵素、例えばペルオキシダーゼ、アビジン又は放射標識によって行うことができる。前記アッセイは、顕微鏡を用いて視覚的に評価され、そしてその結果を定量することができる。
他の機械又は自動イメージングシステムも、バイオマーカーの免疫染色結果を測定するために使用することができる。本明細書で使用されるように、「定量的」免疫組織化学は、抗原又は他のタンパク質などの特定のバイオマーカーの存在を同定及び定量するために、免疫組織化学を受けさせたサンプルをスキャン及び評価する自動化された方法を指す。サンプルに与えられたスコアは、サンプルの免疫組織化学的染色の強度の数値表示であり、及びサンプル中に存在する標的バイオマーカーの量を表す。本明細書で使用されるように、光学濃度（Optical Density,ＯＤ）は、染色の強度を表す数値スコアである。本明細書で使用されるように、半定量的免疫組織化学は、ヒトの眼による免疫組織化学結果の評価を指し、その場合、訓練されたオペレーターは、結果を数値的にランク付けする（例えば、１、２又は３として）。
免疫組織化学での使用に好適な様々な自動サンプル処理、スキャニング及び分析システムが当該技術で利用可能である。このようなシステムには、自動染色（例えば、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋシステム、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．参照）及び顕微鏡走査、コンピュータ化画像解析、連続切片比較（サンプルの向き及びサイズの変動を制御するため）、デジタル報告生成、並びにサンプルのアーカイビング及びトラッキング（例えば、組織切片が置かれたスライドなど）を包含することができる。免疫染色されたサンプルを包含する細胞及び組織について定量分析を行うため、従来の光学顕微鏡とデジタル画像処理システムとを組み合わせた細胞イメージングシステムは、市販されている。例えば、ＣＡＳ−２００システム（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．）を参照されたい。
バイオマーカーに対する抗体は、画像化目的で、例えば対象者の細胞内のバイオマーカーの存在を検出するためにも使用することができる。好適な標識は、放射性同位体、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）及びテクネチウム（９９ｍＴｃ）が、蛍光標識、例えばフルオレセイン及びローダミンなど、及びビオチンを包含する。免疫酵素相互作用は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの異なる酵素、又はＤＡＢ、ＡＥＣもしくはファストレッド（Fast Red）などの異なる色素原を使用して視覚化することができる。
使用することができる抗体及びその誘導体には、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、キメラ、ヒト、ヒト化、霊長類化（ＣＤＲ移植）、ベニヤ化(veneered)もしくは一本鎖抗体、相生成抗体（例えば、ファージディスプレイライブラリー由来）、ならびに抗体の機能的結合フラグメントを包含する。例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２フラグメントを包含するが、これに限定されない、バイオマーカーに結合することができる抗体フラグメント、又はその一部を使用することができる。そのようなフラグメントは、酵素的切断又は組換え技術によって産生され得る。例えば、パパイン又はペプシン切断は、それぞれＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成し得る。Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成するため、必要な基質特異性を有する他のプロテアーゼを使用することもできる。抗体はまた、１以上の終止コドンが天然の終止部位の上流に導入された抗体遺伝子を使用して、様々な切断(truncated)形態で産生され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、重鎖のＣＨ、ドメイン及びヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計することができる。
合成及び操作された抗体は、例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０，１２５，０２３ Ｂ１号；Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０，１２０，６９４ Ｂ１号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．，ＷＯ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０，１９４，２７６号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００ Ｂ１号；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０４５１２１６号Ｂ１；及びＰａｄｌａｎ、Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０５１９５９６Ａ１号；に記載されている。また、霊長類化抗体に関するＮｅｗｍａｎ、Ｒ． ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１４５５−１４６０（１９９２）及びＬａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，９４６，７７８号及び短鎖抗体に関するＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９８８））を参照。
特定の実施形態において、抗体以外のポリペプチドに特異的に結合する薬剤(agents)、例えばペプチド、が使用される。特異的に結合するペプチドは、当該技術で公知のいずれの手段、例えば、ペプチドファージディスプレイライブラリーによって同定することができる。一般に、バイオマーカーの存在が検出及び／又は定量されるように、バイオマーカーポリペプチドを検出することができる薬剤(an agent)を使用することができる。本明細書で定義されるように、「薬剤」は、生体サンプル中のバイオマーカーを同定又は検出することができる物質を指す（例えば、バイオマーカーのｍＲＮＡ、バイオマーカーのＤＮＡ、バイオマーカーのタンパク質を同定又は検出する）。特定の実施形態において、薬剤は、バイオマーカーポリペプチドに特異的に結合する標識された抗体である。
加えて、バイオマーカーは、質量分析、例えばＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ（time-of-flight,飛行時間）、ＳＥＬＤＩ／ＴＯＦ、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー−質量分析（HPLC-MS）、キャピラリー電気泳動質量分析、核磁気共鳴分光法、又はタンデム質量分析法（例えば、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳなど）を使用して、検出することができる。例えば、米国特許出願第２００３０１９９００１号、第２００３０１３４３０４号、第２００３００７７６１６号を参照されたい。これらは参照により本明細書に組み込まれる。
質量分析法は、当技術で周知であり、且つ、タンパク質などの生体分子を定量及び／又は同定するために使用されている（例えば、Ｌｉ ｅｔ． ａｌ．（２０００） Ｔｉｂｔｅｃｈ １８：１５１−１６０；Ｒｏｗｌｅｙ ｅｔ． ａｌ．（２０００） Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０：３８３−３９７；及びＫｕｓｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｎｎ（１９９８） Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌ． ８：３９３−４００；を参照）。さらに、単離されたタンパク質の少なくとも部分的なde novo配列決定を可能にする質量分析技術が開発されている。Ｃｈａｉｔ ｅｔ． ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：８９−９２（１９９３）；Ｍ．Ｋｅｏｕｇｈ ｅｔ． ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ. ９６：７１３１−６（１９９９）；Ｂｅｒｇｍａｎ、ＥＸＳ ８８：１３３−４４（２０００）にレビューされている。
特定の実施形態において、気相イオン分光光度計が使用される。他の実施形態において、サンプルを分析するため、レーザー脱離／イオン化質量分析法を使用する。モデム(Modem)レーザー脱離／イオン化質量分析法（「ＬＤＩ−ＭＳ」）は、２つの主なバリエーションで実施することができる：マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）質量分析及び表面増強レーザー脱離／イオン化（「ＳＥＬＤＩ」）。ＭＡＬＤＩにおいて、検体を、マトリックスを含有する溶液と混合し、そして液滴を基質(a substrate)の表面上に置く。次いで、マトリックス溶液は、生体分子と共結晶化する。基質を質量分析計に挿入する。レーザーエネルギーは、基質表面に向けられる。その場合、基質表面(it)は、生体分子(them)を著しく断片化することなく生体分子を脱着及びイオン化する。しかしながら、ＭＡＬＤＩには分析ツールとしての限界がある。これは、サンプルを分画する(fractionating)ための手段を提供せず、且つ、マトリックス材料は、特に低分子量分析物の場合、検出を妨げる可能性がある。例えば、米国特許第５，１１８，９３７号（Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．）、及び米国特許第５，０４５，６９４号（Ｂｅａｖｉｓ＆Ｃｈａｉｔ）を参照。
質量分析計に関する追加情報については、例えば、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｓｋｏｏｇ， Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９８５；及びＫｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ ｅｄ． Ｖｏｌ． １５ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９５）， ｐｐ． １０７１−１０９４；を参照。
マーカー又は他の物質の存在の検出は、典型的には、シグナル強度の検出を含む。これは、次に、基質に結合したポリペプチドの量及び特徴を反映することができる。例えば、特定の実施形態において、特定のバイオマーカーの相対量を決定するために、第１のサンプル及び第２のサンプルのスペクトルからのピーク値のシグナル強度を比較することができる（例えば、視覚的に、コンピュータ分析などによって）。質量スペクトル分析を助けるため、Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｗｉｚａｒｄプログラム（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，Calif．）などのソフトウェアプログラムを使用することができる。質量分析計及びその技術は、当業者に周知である。
いずれの当業者は、質量分析計の構成要素のいずれか（例えば、脱着源、質量分析器、検出器など）及び様々なサンプル調製物を、他の句的な構成要素もしくは本明細書に記載の調製物と、又は当該技術で知られているものと、組み合わせることが可能である。例えば、特定の実施形態において、コントロールサンプルは重い原子（例えば、１３Ｃ）を含有することが可能であり、それによりテストサンプルを同じ質量分析法操作(run)で既知のコントロールサンプルと混合することができる。
特定の実施形態において、レーザー脱着飛行時間型（time-of-flight,ＴＯＦ）質量分析計が使用される。レーザー脱着質量分析法では、結合マーカーを有する基質を入口系に導入される。マーカーは脱離し、そしてイオン化源からのレーザーによって気相にイオン化される。生成されたイオンは、イオン光学アセンブリによって収集され、及び次いで飛行時間型質量分析器において、短い高電圧場を介してイオンが加速され、そして高真空チャンバ内にドリフトされる。高真空チャンバの遠端では、加速されたイオンは、異なる時間において敏感な検出器表面に当たる。飛行時間はイオンの質量の関数であるので、特定の質量電荷比の分子の有無を識別するため、イオン生成とイオン検出器の衝突(impact)との間の経過時間を使用することができる。
特定の実施形態において、第１又は第２のサンプル中に存在する１以上のバイオマーカーの相対量は、部分的に、プログラム可能なデジタルコンピュータでアルゴリズムを実行することによって決定される。前記アルゴリズムは、第１の質量スペクトル及び第２の質量スペクトルにおける少なくとも１つのピーク値を特定する。次に前記アルゴリズムは、第１の質量スペクトルのピーク値の信号強度を、質量スペクトルの第２の質量スペクトルのピーク値の信号強度と比較する。相対的な信号強度は、第１及び第２のサンプル中に存在するバイオマーカーの量の指標である。第１のサンプル中に存在するバイオマーカーの量をより正確に定量するため、バイオマーカーの既知量を含有する標準物質(a standard)を第２のサンプルとして分析することができる。特定の実施形態において、第１及び第２のサンプル中のバイオマーカーの同一性を決定することもできる。
Ｄ．キット
特定の非限定的な実施形態において、本開示は、患者のＡＡの重症度を同定するための、ならびにＪＡＫインヒビター治療に応答する患者亜集団を同定及び追跡するための、キットを提供する。このようなキットは、特定の実施形態において、本明細書に記載のバイオマーカーから選択される１以上のバイオマーカー、又はそれらの組み合わせを検出するための手段を包含する。本開示は、対象者におけるＡＡを治療するための療法の有効性を決定するためのキットをさらに提供する。
特定の実施形態において、対象者における円形脱毛症（Alopecia Areata,ＡＡ）を治療するためのキットは、対象者の疾患の重症度を示すバイオマーカーを検出するために有用な１つ以上の検出試薬、及びＡＡの治療に有用な１つ以上の治療試薬を含む。本開示の主題は、対象者における、脱毛症（ＡＡ）を治療するのに有用な１つ以上の治療試薬に応答する傾向を示すバイオマーカーを検出するのに有用な１つ以上の検出試薬、及びＡＡの治療に有用な１以上の治療試薬を含む、対象者における円形脱毛症（ＡＡ）を治療するためのキットをさらに提供することができる。特定の実施形態において、キットは、１つ以上のプローブセット、アレイ／マイクロアレイ、バイオマーカー特異的抗体及び／又はビーズをさらに含む。特定の実施形態において、キットは指示書をさらに含む。特定の実施形態において、前記治療試薬はＪＡＫインヒビターから選択されてよい。
キットのタイプは、パッケージされたプローブ及びプライマーセット（例えばＴａｑＭａｎプローブ／プライマーセット）、アレイ／マイクロアレイ、バイオマーカー特異的抗体及びビーズを包含するが、これらに限定されない。これらは、本開示の１つ以上のバイオマーカーを検出するため、１つ以上のプローブ、プライマー又は他の検出試薬をさらに含有する。方法を提供する。
特定の非限定的な実施形態において、キットは、同定される１つ以上のバイオマーカー（複数可）を検出するための、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は核酸配列決定に好適な一対のオリゴヌクレオチドプライマーを包含することができる。一対のプライマーは、本明細書に記載のバイオマーカーに相補的なヌクレオチド配列を包含することができ、且つ、前記バイオマーカーと選択的にハイブリダイズするのに十分な長さであり得る。あるいは、相補的ヌクレオチドは、ＰＣＲ及び／又は配列決定を行うために、バイオマーカー位置に十分に近接した特定の領域５’及び／又は３’に選択的にハイブリダイズすることができる。多数のバイオマーカーを同時にアッセイするため、多数の(multiple)バイオマーカー特異的プライマーをキット内に含めることができる。前記キットはまた、１つ以上のポリメラーゼ、逆転写酵素及びヌクレオチド塩基を包含することができ、前記ヌクレオチド塩基は、さらに検出可能に標識することができる。
特定の実施形態において、プライマーは、少なくとも約１０個のヌクレオチド又は少なくとも約１５個のヌクレオチド又は少なくとも約２０個のヌクレオチドの長さであり得、及び／又は約２００個までのヌクレオチド、又は約１５０個までのヌクレオチド、又は約１００個までのヌクレオチド、又は約７５個までのヌクレオチド又は約５０個までのヌクレオチドの長さであり得る。
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、固体表面又は支持体上に、例えば核酸マイクロアレイ上に固定化することができる。その場合、固体表面又は支持体に結合した各オリゴヌクレオチドプライマーの位置は既知であり、且つ、同定可能である。
特定の非限定的な実施形態において、キットは、同定されるべきバイオマーカー（複数可）を検出するために、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション又は蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに好適な少なくとも１つの核酸プローブを含むことができる。そのようなキットは、一般に、様々なバイオマーカーに対する特異性を有する１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを包含する。
特定の非限定的な実施形態において、キットは、プライマー伸長によるバイオマーカーの検出のためのプライマーを包含することができる。
特定の非限定的な実施形態において、キットは、同定されるべきバイオマーカー（複数可）の免疫検出のための少なくとも１つの抗体を包含することができる。バイオマーカーに特異的なポリクローナル及びモノクローナルの両方の抗体は、当業者に一般的に知られているように、従来の免疫化技術を用いて調製することができる。キットの免疫検出試薬は、所与の抗体又は抗原それ自体に付随するか又はそれに連結された検出可能な標識を包含することができる。このような検出可能な標識は、例えば、化学発光もしくは蛍光分子（ローダミン、フルオレセイン、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、Ｃｙ３、Ｃｙ５又はＲＯＸ）、放射性標識（３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、１４Ｃ、１３１Ｉ）又は酵素（アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）包含する。
特定の非限定的な実施形態において、バイオマーカー特異的抗体は、個体支持体、例えばカラムマトリックス、アレイ、又はマイクロタイタープレートのウェルなど、に結合して提供され得る。あるいは、支持体をキットの別個の要素として提供することができる。
特定の非限定的な実施形態において、キットは、本明細書に記載の１つ以上のバイオマーカー又はその組み合わせを検出するのに好適な１つ以上のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、又は抗体を包含することができる。
特定の非限定的な実施形態において、キットは、本明細書に記載のバイオマーカーの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４以上を検出するのに好適な１つ以上のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、又は抗体を包含することができる。
特定の非限定的な実施形態において、キット中の測定手段がアレイを使用する場合、上記のバイオマーカーのセットは、前記マイクロアレイ上に現れるマーカーの化学種(species)について少なくとも１０％又は少なくとも２０％又は少なくとも３０％又は少なくとも４０％又は少なくとも５０％又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％を構成することができる。
特定の非限定的な実施形態において、バイオマーカー検出キットは、バイオマーカーを検出するためのアッセイもしくは反応を実施するのに必要な、１つ以上の検出試薬及び他の成分（例えば、緩衝液、酵素、例えばＤＮＡポリメラーゼもしくはリガーゼなど、鎖伸長ヌクレオチド、例えばデオキシヌクレオチドトリホスフェートなど、及びサンガー型ＤＮＡ配列決定反応の場合、鎖終結ヌクレオチド、陽性制御配列、陰性制御配列など）を包含することができる。キットはまた、バイオマーカーの検出に必要な追加の成分又は試薬、例えばウェスタンブロッティング免疫組織化学で使用するための二次抗体など、を包含することができる。キットは、他の予後予測因子、例えば腫瘍段階を評価するための１つ以上の他のバイオマーカー又は試薬をさらに包含することができる。
キットは、バイオマーカーを標準物質と比較するための手段をさらに包含することができ、且つ、興味対象のバイオマーカーを検出するために当該キットを使用するための説明書を包含することができる。例えば、説明書は、本明細書に記載のバイオマーカーの存在が、患者のＡＡの重症度を示すこと、又はＪＡＫインヒビター治療に応答する患者亜集団を同定及び追跡するためのものであることを説明することができる。
特定の実施形態において、キットは、治療試薬をさらに包含し得る。特定の実施形態において、前記治療試薬は、本明細書の実施形態のＪＡＫインヒビターであり得る。
Ｅ．レポート、プログラムされたコンピュータ及びシステム
本明細書に記載の１つ以上のバイオマーカーのアッセイに基づいた試験（例えば、個体(an individual)のＡＡの重症度）又は個体の予測される薬物応答性（例えば、ＪＡＫインヒビター療法に対する応答）、及び/又は試験に関する他の情報は、本明細書では「レポート」と呼ぶことができる。場合によっては、テストプロセスの一部として具体的な(tangible)レポートを生成することができる（本明細書ではこれを、相互互換的に「レポートすること」、又はレポートを「提供すること」、レポートを「作成すること」又はレポートを「生成すること」と呼ぶことができる）。
具体的なレポートの例は、紙（コンピュータで生成されたテスト結果の印刷など）もしくは同等のフォーマットでのレポート、及びコンピュータ可読媒体（例えばＣＤ、ＵＳＢフラッシュドライブもしくは他のリムーバブルストレージデバイス、コンピュータハードドライブ、又はコンピュータネットワークサーバなど）に格納されたレポート、を包含することができるが、これらに限定されない。レポート、特にコンピュータ可読媒体に格納されたレポートはデータベースの一部であり得る。前記データベースは、任意にインターネットを介してアクセス可能であり得る（例えば、患者及びその患者の医療従事者だけがレポートを閲覧できるように、レポートへのアクセスを制限するセキュリティ機能を有し、他の無許可の個人がレポートを閲覧することを防止する、「安全なデータベース」であり得る、コンピュータネットワークサーバ上に格納された患者記録もしくは遺伝情報のデータベースなど）。具体的なレポートの生成に加えて、あるいはそれに代えて、レポートをコンピュータ画面（又は別の電子デバイスもしくは機器のディスプレイ）に表示することもできる。
レポートは、例えば、個人のＡＡの重症度を包含することができ、又は本明細書に記載の１つ以上のバイオマーカーの有無、レベルを包含するだけとすることができる（例えば、ネットワークサーバのようなコンピュータ可読媒体上のレポートには、特定のバイオマーカー又は特定のバイオマーカーのレベルを有する個体について、増加もしくは減少した疾患リスクなどの医学的／生物学的影響(implications)を記述する１以上のジャーナル出版物又はウェブサイトへのハイパーリンク（複数可）を含めることができる）。従って、例えば、レポートは、疾患リスクもしくは他の医学／生物学的意義（例えば、薬物反応性、示唆された予防的処置など）を包含することができ、ならびに場合によってはバイオマーカー情報も含むことができ、又は疾患リスクもしくは他の医学的／生物学的意義を含めることなく、バイオマーカー情報だけを包含することができる（それにより、当該レポート自体の外部のソースから、例えば医療従事者、出版物、ウェブサイトなどから、関連する疾患リスク又は他の医学的／生物学的意義を決定するため、レポートを閲覧している個人がバイオマーカー情報を使用することができる。これらは任意にハイパーリンクなどで当該レポートにリンクすることができる。）。
レポートを、例えば、試験された個人、医療従事者（例えば、医者、看護師、臨床検査技師、遺伝カウンセラーなど）、健康管理機構、及び/又は当該レポートを閲覧又は所持することを意図したいずれの他の当事者もしくは依頼者に、さらに「送信」(transmitted)又は「伝達」(communicated)することができる（これらの用語は、本明細書では交換可能に使用することができる）。レポートを「送信する」又は「伝達する」行為は、当該レポートのフォーマットに基づいて、当該技術で公知のいずれの手段によって行うことができる。さらに、レポートを「送信する」又は「伝達する」ことは、レポートを送達すること（「プッシュすること」(pushing)）及び／又はレポートを取り出すこと（「プルすること」(pulling)）を包含することができる。例えば、レポートは、（例えば紙フォーマットのレポートについて）当事者間に物理的に転送されることを含めて、様々な手段によって、例えばある当事者から別の当事者に物理的に配達されることにより、又は電子的又は信号形式で送信されることにより（例えば、電子メール又はインターネット経由で、ファクシミリにより、及び／又は当技術で知られているいずれの有線又は無線通信方法により）、例えばコンピュータネットワークサーバなどに格納されたデータベースから検索されることなどにより、送信／伝達することができる。
特定の例示的な実施形態において、開示される主題は、本明細書に記載の方法を実施するようにプログラムされたコンピュータ（又は生物医学デバイス又は実験装置などの他の装置／デバイス）を提供する。例えば、特定の実施形態において、開示される主題は、単独で、又は他のバイオマーカーと組み合わせて、本明細書に開示される１つ以上のバイオマーカーの同一性を受信（すなわち、入力(input)として）するように、且つ、バイオマーカー（複数可）のレベル又は同一性に基づいて、疾患重症度又は他の結果（例えば、薬物応答性など）を提供する（すなわち、出力(output)として）ように、プログラムされたコンピュータを提供する。そのような出力（例えば、疾患重症度、薬物反応性などの伝達）は、例えば、コンピュータ可読媒体上のレポートの形で、紙形式で印刷されるか、及び／又はコンピュータスクリーン又は他のディスプレイ上に表示され得る。
開示される主題の特定の更なる実施形態は、個人のＡＡの重症度を、又は個体がＪＡＫインヒビター治療から恩恵を受けるかどうかを決定するためのシステムを提供する。特定の例示的なシステムは、個人（又はそれらの医療従事者）がそのような個人のＡＡ重症度（又は薬物応答）の決定を要求する統合された「ループ」を包含し、この決定は前記個人からのサンプルを試験することによって行われ、そしてこの決定の結果は依頼者に返される。例えば、特定のシステムでは、試験のために個人からサンプル（例えば、皮膚、血液など）が得られ（サンプルは当該個人によって、又は例えば医療従事者によって入手することができる）、前記サンプルは試験のために（例えば、単独で、又は１つ以上の他のバイオマーカーと組み合わせた、本明細書に開示されたバイオマーカー（複数可）を決定する）実験室（又は他の施設）に提出され、及び次いで、前記試験の結果を患者に送信しこれは場合によっては、その結果を前記個人に提供するか又は他の方法で伝える仲介者、例えば医療従事者、に最初に結果を送信することにより行われる）、それによって個人のＡＡの重症度（又は薬物応答など）を決定するための統合ループシステムを形成する。（例えば、検査施設、医療従事者、及び／又は個人のいずれかの間で）結果が送信されるシステムの部分は、電子又は信号送信により（例えば、電子メールもしくはインターネットを介するなどのコンピュータによって、場合によって安全なデータベースであり得るウェブサイト又はコンピュータネットワークサーバ上に結果を提供することによって、電話もしくはファックスによって、当該技術において知られたいずれの他の有線もしくは無線伝送方法によって）実施することができる。
特定の実施形態において、システムは、個人及び／又はそれらの医療従事者によって制御される、その場合、個人及び／又はそれらの医療従事者が試験を要求し、試験結果を受け取り、及び、疾病管理システムを導入することなどにより、疾病リスクを軽減するため、（場合によって）試験結果に作用する。
本明細書に記載される様々な方法、例えばバイオマーカーの有無又はレベルをＡＡの変化した（例えば、増加又は減少した）重症度と相関させることなどは、自動化された方法、例えば、本明細書に記載の方法のいずれかを実施するようにプログラムされたコンピュータ（又は他の装置／デバイス、例えば生物医学デバイス、実験器具、又はコンピュータプロセッサを有する他の装置／デバイス）を使用することによって、実施することができる。例えば、コンピュータソフトウェア（本明細書ではコンピュータプログラムと互換的に言及することができる）は、個人におけるバイオマーカーの有無を、当該個人についてＡＡの変化した（例えば、増加又は減少した）重症度と相関させることができる。従って、開示される主題の特定の実施形態は、本明細書に記載の方法のいずれかを実行するようにプログラムされたコンピュータ（又は他の装置/デバイス）を提供する。
Ｆ．治療方法
特定の実施形態において、対象者における円形脱毛症（ＡＡ）を治療する方法は、前記疾患の重症度を示すバイオマーカーを検出することによって、前記対象者のＡＡ疾病重症度を同定すること、及び前記同定された疾患の重症度に適切な治療的介入を前記対象者に投与すること、を含む。
特定の実施形態において、対象者におけるＡＡを治療する方法は、上記傾向を示すバイオマーカーを検出することによってＪＡＫインヒビター処置に応答するＡＡを有する対象者の傾向を同定すること、及び同定されたバイオマーカーが、前記対象者が前記インヒビターに応答するという傾向を示すならば、JAKインヒビターを前記対象者に投与すること、を含む。
特定の実施形態において、それを必要とする対象者における円形脱毛症を治療する方法は、ＪＡＫインヒビターを前記対象者に投与するステップ、ＪＡＫインヒビター処置への応答性を示すバイオマーカーを検出するステップ、及び、（１）前記ＪＡＫインヒビターの投与を続けること（continuing）、（２）前記ＪＡＫインヒビターの投与を変更すること（altering）、又は（３）前記ＪＡＫインヒビターの投与をやめること（discontinuing）のいずれかによって、前記応答性に基づいて前記ＪＡＫインヒビターの投与を適合させるステップ（tailoring）、を含む。
特定の実施形態において、バイオマーカーは遺伝子発現シグニチャであってもよい。特定の実施形態において、前記遺伝子発現シグニチャは、以下の遺伝子群：ＫＲＴ関連遺伝子；ＣＴＬ関連遺伝子；及びＩＦＮ関連遺伝子；のうちの一つ又はそれ以上の遺伝子発現情報を含む。特定の実施形態において、前記ＫＲＴ関連遺伝子は、ＤＳＧ４、ＨＯＸＣ３１、ＫＲＴ３１、ＫＲＴ３２、ＫＲＴ３３Ｂ、ＫＲＴ８２、ＰＫＰ１及びＰＫＰ２を含む。特定の実施形態において、前記ＣＴＬ関連遺伝子は、ＣＤ８Ａ、ＧＺＭＢ、ＩＣＯＳ及びＰＲＦ１を含む。特定の実施形態において、前記ＩＦＮ関連遺伝子は、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＳＴＡＴ１及びＭＸ１を含む。
特定の実施形態において、１つ以上のＣＴＬ関連遺伝子又は１つ以上のＩＦＮ関連遺伝子が所定の遺伝子発現レベルのセットにダウンレギュレーションされる場合、及び／又は１つ以上のＫＲＴ関連遺伝子が所定の遺伝子発現レベルのセットにアップレギュレーションされる場合、前記治療は有効であると考えられ、且つ、継続することができる。特定の実施形態において、大多数のＣＴＬ関連遺伝子又は大多数のＩＦＮ関連遺伝子が所定の遺伝子発現レベルのセットにダウンレギュレーションされない場合、及び／又は大多数のＫＲＴ関連遺伝子が所定の遺伝子発現レベルのセットにアップレギュレーションされない場合、前記治療は無効であると考えられ、且つ、例えば、１つ以上の異なるＪＡＫインヒビターを投与することによって、中止もしくは変更されてもよい。
特定の実施形態において、遺伝子発現シグニチャは、円形脱毛疾患病活性係数（Ａｒｅａｔａ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ, ＡＬＡＤＩＮ）である。特定の実施形態において、ＪＡＫインヒビターの投与を適合させることは、（１）ＣＴＬスコア、ＩＦＮスコア及びＫＲＴスコアのそれぞれが処置前のスコアと比較して減少している場合、前記ＪＡＫインヒビターの投与を続けること、（２）ＣＴＬスコア、ＩＦＮスコア及びＫＲＴスコアのいずれも処置前のスコアと比較して低下しない場合、前記ＪＡＫインヒビターの投与を変更すること、又は（３）ＣＴＬスコア、ＩＦＮスコア及びＫＲＴスコアのそれぞれが治療前のスコアと比較して増加した場合、前記ＪＡＫインヒビターの投与をやめること、を含む。
特定の実施形態において、ＪＡＫインヒビター処置に対する応答性を示すバイオマーカーの検出は、前記ＪＡＫインヒビターによる処置に対する応答性の生理的サイン(signs)が存在する前に、行われる。特定の実施形態において、前記検出は、ＪＡＫインヒビターでの処置の２週間後〜６週間後に行われる。特定の実施形態において、前記検出は、ＪＡＫインヒビターでの処置の１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、４ヶ月後、５ヶ月後、６ヶ月後、それらの組み合わせ、又はこれらの値のいずれか２つの間の範囲で、行われる。
特定の実施形態において、前記ＪＡＫインヒビターの投与を変更することは、投与間隔、投与量、配合(formulation)又はそれらの組み合わせを変更することを含む。特定の実施形態において、前記特定のＪＡＫインヒビターが投与されることは中止されてもよく、且つ、異なるＪＡＫインヒビター（ＪＡＫインヒビターの異なるクラス又は同一クラスにおける異なるＪＡＫインヒビターのいずれか）を投与してもよい。
特定の実施形態において、当該方法は、ＪＡＫインヒビターの投与前にＪＡＫインヒビター処置に対する応答性を示すバイオマーカーのベースラインレベルを確立することをさらに含む。特定の実施形態において、当該方法は、ＪＡＫインヒビターの投与を調整する前に、ＪＡＫインヒビター処置に対する応答性を決定するために、ベースラインレベルと、投与後のレベルとを比較することをさらに含む。
特定の実施形態において、本開示のバイオマーカーの前記検出は、対象者から得られたサンプルに対して実施され、且つ、前記サンプルは、皮膚、血液、血清、血漿、尿、唾液、痰、粘液、精液、羊水、口腔洗浄液及び気管支肺胞洗浄液からなる群から選択される。特定の実施形態において、対象者はヒトである。特定の実施形態において、サンプルは皮膚サンプルである。特定の実施形態において、サンプルは血清試料である。
特定の実施形態において、本明細書で開示されるバイオマーカーの前記検出は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイを介して行われる。特定の実施形態において、前記検出は、マイクロアレイ解析を介して行われる。特定の実施形態において、前記検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は核酸配列決定を介して行われる。特定の実施形態において、前記バイオマーカーはタンパク質である。特定の実施形態において、前記タンパク質の存在は、前記タンパク質と特異的に結合する試薬を用いて検出される。特定の実施形態において、前記試薬は、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、又はポリクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。特定の実施形態において、前記検出は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ又はウェスタンブロットアッセイを介して行われる。
特定の実施形態において、ＪＡＫインヒビターは、Ｊａｋ１／Ｊａｋ２／Ｊａｋ３／Ｔｙｋ２／ＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ２／ＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ４／ＳＴＡＴ５ａ／ＳＴＡＴ５ｂ／ＳＴＡＴ６／ＯＳＭ／ｇｐ１３０／ＬＩＦＲ／ＯＳＭ−Ｒβ遺伝子又はＪａｋ１／Ｊａｋ２／Ｊａｋ３／Ｔｙｋ２／ＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ２／ＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ４／ＳＴＡＴ５ａ／ＳＴＡＴ５ｂ／ＳＴＡＴ６／ＯＳＭ／ｇｐ１３０／ＬＩＦＲ／ＯＳＭ−Ｒβタンパク質と相互作用する化合物である。特定の実施形態において、前記ＪＡＫインヒビターは、以下から選択されてよい：
ルキソリチニブ（ＩＮＣＢ０１８４２４）：
Figure 2018526362
トファシチニブ（ＣＰ６９０５５０）：
Figure 2018526362
パクリチニブ（ＳＢ１５１８）：
Figure 2018526362
バリシチニブ（ＬＹ３００９１０４）：
Figure 2018526362
フェドラチニブ（ＴＧ１０１３４８）：
Figure 2018526362
デセルノチニブ(decernmotinib)：
Figure 2018526362
レスタウルチニブ（ＣＥＰ−７０１）：
Figure 2018526362
ＢＭＳ−９１１５４３（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ： １２７１０２２−９０−２）、フルダラビン、３−没食子酸エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−ｇａｌｌａｔｅ，ＥＧＣＧ）、ペフィシチニブ、ＡＢＴ ４９４（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ： １３１０７２６−６０−３）、ＡＴ ９２８３（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ： ８９６４６６−０４−９）、フィルゴチニブ、ガンドチニブ、ＩＮＣＢ ３９１１０（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ： １３３４２９８−９０−６）、 ＰＦ ０４９６５８４２（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ： １６２２９０２−６８−４）、Ｒ３４８ （Ｒ−９３２３４８， ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ： ９１６７４２−１１−５； １６２０１４２−６５−５）、ＡＺＤ １４８０（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ： ９３５６６６−８８−９）、セルジュラチニブ（cerdulatinib）、ＩＮＣＢ ０５２７９３（Ｉｎｃｙｔｅ，臨床試験ＩＤ： ＮＣＴ０２２６５５１０）、ＮＳ ０１８（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ： １２３９３５８−８６−１ （遊離塩基）；１２３９３５８−８５−０ （ＨＣｌ））、ＡＣ ４１０（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ： １３６１４１５−８４−０ （遊離塩基）；１３６１４１５−８６−２（ＨＣｌ））、ＣＴ １５７８ （ＳＢ １５７８， ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ： ９３７２７３−０４−６）、ＪＴＥ ０５２ （Ｊａｐａｎ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｉｎｃ．）、ＰＦ ６２６３２７６ （Ｐｆｉｚｅｒ）、Ｒ ５４８ （Ｒｉｇｅｌ）、ＴＧ ０２ （ＳＢ １３１７， ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ： ９３７２７０−４７−８）、ｌｕｍｂｒｉｃｕｓ ｒｅｂｅｌｌｕｓ抽出物、ＡＲＮ ４０７９ （Ａｒｒｉｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， ＬＬＣ．）、ＡＲ １３１５４ （Ａｅｒｉｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、ＵＲ ６７７６７ （Ｐａｌａｕ Ｐｈａｒｍａ Ｓ．Ａ．）、ＣＳ５１０（Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｃｈｉｐｓｃｒｅｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．）、ＶＲ５８８（Ｖｅｃｔｕｒａ Ｇｒｏｕｐ ｐｉｃ）、ＤＮＸ ０４０４２（Ｄｙｎａｍｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｃｌｅｖｅｘｅｌ）、ハイパーフォリン、その誘導体、それらの重水素化変種、それらの塩、又はそれらの組み合わせ。特定の実施形態において、検出試薬は、蛍光試薬、発光試薬、色素、放射性同位体、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせから選択され得る。
６．実施例
当業者に、本出願の主題をどのように作成し、使用するかについての開示及び説明を提供するように、以下の実施例が提示される。以下の実施例は、本発明者らが現在開示されている主題とみなす範囲を限定するものではない。上述の一般的な説明を考慮すると、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。
６．１ 実施例１
Ａ．はじめに
円形脱毛症（Alopecia areata,ＡＡ）は、毛包が免疫攻撃の標的である自己免疫皮膚疾患である。患者は、通常、頭皮上の脱毛の丸い又は卵形のパッチを特徴的に呈し、これは頭皮又は全身に関与するように、自発的に解消し、持続し、又は進行させることができる。この病気の３つの主要な表現型変異体は、パッチ型(patchy-type)ＡＡ（ＡＡＰ）（これは、しばしば頭皮上又は髭領域内の小さな卵形領域に局在化する）、全頭脱毛症（alopecia totalis,ＡＴ）（これは頭皮全体を伴う）、及び全身性脱毛症（alopecia universalis,ＡＵ）（これは全身の表面積を含む）である。現在、ＦＤＡがＡＡに対して承認した薬剤はなく、そして治療は経験的であることが多いが、典型的には、観察、病巣内ステロイド、局所免疫療法又は未証明効能の広範な免疫抑制治療を伴う。当該疾病のより深刻な形態、ＡＵ及びＡＴは、しばしば治療に対して反抗的である。さらに、皮膚科医及び治療医の間で優勢な仮説は、長期にわたるＡＵ及びＡＴが回復不能になること、又は治療期間に対する応答時間及び治療に対する反応性の逆相関によりサポートされる、頭皮を「燃え尽き」状態に変えることである。その高い罹患率及び効果的な治療の必要性にもかかわらず、この疾患の分子エフェクター及び細胞エフェクターの正体(identities)は十分に研究されていなかった。
当該分野における最近の進歩は、病気の病因、薬剤標的、及び潜在的治療解決策(solutions)の理解を変えてきた。ＡＡに関連する一塩基多型(single nucleotide polymorphisms)が特に注目され、これは、ＵＬＢＰ３及びＵＬＢＰ６の多型がこの疾患を発症するリスクを高めることを示唆する。遺伝子のＵＬＢＰファミリーは、ＮＫＧ２Ｄのリガンドとして機能するタンパク質をコードし、及び発現される場合、ナチュラルキラー細胞又はＮＫＧ２Ｄ発現ＣＤ８ Ｔ細胞による免疫標的化のための細胞をマークする。これらのデータは、ＡＡ患者の病変頭皮生検標本の皮膚切片における球周囲(peribulbar)浸潤物における、並びに自発性ＡＡのＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスモデル由来の罹患皮膚及び皮膚排出リンパ節における、ＮＫＧ２Ｄ担持ＣＤ８ Ｔ細胞の認識を導いた。脱毛症を伴うＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスからの未罹患(unaffected)Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスへのこの細胞集団の養子移入は、脱毛症の誘発をもたらし、マウスＡＡモデルにおけるこれらのエフェクター細胞の中心的役割を実証した。
本発明者らは、以前に、顕著なインターフェロン（ＩＦＮ）シグニチャ及び共通ガンマ鎖サイトカイン（γｃ）シグニチャを同定した。これらの両方は、ＡＡ発病に寄与すると仮定された。これらの知見に基づいて、シグナル伝達分子、ヤヌスキナーゼ（Janus kinase,ＪＡＫ）、のファミリーの重要なメンバーの阻害に基づく治療戦略が、疾患のマウスモデル及び小さな一連のヒト患者におけるＡＡの治療に有効であることが見出された。遺伝子発現プロファイリングは、ＡＡに対する小分子ＪＡＫインヒビターの選択において重要な役割を果たした。そして、異なるＡＡ表現型を包含する、この点についての拡大された努力が、新規治療解決策並びに病原性メカニズムに対する更なる洞察を提供する可能性を有する。
この研究において、一連のＡＡ表現型を有する患者合計９６人及び正常なコントロール患者から採取した１２０を超えるサンプルがプロファイリングされた。患者のサンプルは、毛髪の疾患に特化した皮膚科医による表現型の分類の後、米国全土の円形脱毛症全米登録サイトから収集した。次いで、ＡＡ特異的遺伝子発現シグニチャを同定するために、マイクロアレイに基づく遺伝子発現解析を用いて、皮膚生検サンプルを調べた。ＡＴ／ＡＵが病気の「燃え尽きた」形態であるか、又は回復不可能であるという一般的な概念にもかかわらず、遺伝子発現解析によりＡＴ／ＡＵサンプルにおける顕著な量の免疫活性が見出されて、この免疫活性を破壊する治療が治療目的に有用であり得る可能性を示している。さらに、当該データに基づいて、円形脱毛症疾患重症度指数（ＡＬＡＤＩＮ）が作成された。これは、ＡＴ／ＡＵサンプル、ＡＡＰサンプル、及びＮＣサンプルを互いに効果的に区別し、且つ、従来の又は実験的な治療を受けている患者において、疾患活動を追跡するために使用されてよい、遺伝子発現測定基準であった。
Ｂ．結果
ＡＡ遺伝子シグニチャ
遺伝子発現プロファイリングは、６３人の患者の発見データセット及び３３人の患者の外部検証データセットからなる９６人の患者からの１２２個のサンプルについて実行された（より完全な説明については、方法の項を参照）。２０ ＡＡＰ、２０ ＡＴ／ＡＵ、及び２３正常コントロール頭皮皮膚生検標本からなる発見データセットについて、マイクロアレイベースの遺伝子発現解析を行った。発現差異がある(differentially expressed)遺伝子は、ＡＡサンプルversus正常コントロールの比較に基づいて同定された。この最初のサンプルセットからのデータの堅牢性を保証するために、追加の８ ＡＡＰ、１２ ＡＴ／ＡＵ、及び１３正常コントロール頭皮皮膚生検標本を検証セットとして用いて外部検証を行った。この分析セットから、絶対倍率変化（fold change,ＦＣ）＞１．５及び偽発見率（ＦＤＲ）＜０．０５で選択された発現差異がある遺伝子に基づいて、疾患特異的遺伝子発現プロファイルが生成された。ＡＡ特異的疾患シグニチャは、発現の増加を示す１０８３個のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブ及びＡＡにおける減少した発現を示す９１９個のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブから構成された。
注目すべきは、ＰＲＦ１及びいくつかのグランザイムを包含する細胞媒介性細胞傷害性に関連する遺伝子、並びに免疫細胞輸送ケモカイン遺伝子が、発現増加を示すものとして列挙された最上位の遺伝子の中にあった一方、ＤＳＭＧ４、ＦＧＦ１８及びＧＰＲＣ５Ｄなどの毛髪ケラチン関連遺伝子及び発生遺伝子は減少した発現を示すそれらの遺伝子の中にあった。遺伝子発現のパターンは、表現型グループを互いに区別した。ここで、正常なコントロール及びＡＴ／ＡＵサンプルが最大の不一致を示す（図１Ａ）。地形発現マップに前記サンプルをプロットすると、健常コントロール、ＡＡＰ患者、及びＡＴ／ＡＵ患者に対応する３つのクラスタが明らかになった。これらの患者群は、地形マップを貫いてほぼ直線的な経路に沿って降下した（図１Ｂ）。
この地形内のその位置に基づいて、ＡＡＰ又はＡＴ／ＡＵであるいずれの所与のサンプルの相対リスクを評価する単一のスコアが生成された。このスコアは、転じて、ＡＡと健常コントロールとの間で発現差異がある遺伝子のコンセンサスに基づいている（方法を参照）。得られたスコアは０〜１０の間に含まれ、１０は最大重症度のリスクを表し（ＡＴ／ＡＵ）、０は最小限のリスクを表す（健常コントロール）。ＡＡＰサンプルは、これら２つの極値の中間範囲にあった（スコア範囲２〜６）。ＡＡＰとＡＴ／ＡＵの両方のコホート(cohorts)は健常コントロールと比較して統計的に分離可能な平均スコアを有していた（図１Ｂの箱ひげ図(box-and-whisker plot)）。発見データセットから示差的に発現された遺伝子は、バリデーションセット（図６）における階層的クラスタリングによってＡＡサンプルを正常サンプルから区別することができた。これらのデータは、ＡＡの病状が分子遺伝子発現レベルで発現可能であること、及びＡＡＰサンプルがＡＴ／ＡＵと正常コントロールの中間であるＡＡ特異的シグニチャを示すことを示唆している。
ＡＴ／ＡＵ皮膚サンプルは免疫学的に活性である
疾患シグニチャにおける免疫関連遺伝子の存在と組み合わせた、全般的遺伝子発現解析における、コントロール、ＡＡＰ及びＡＴ／ＡＵ間の分子分類の線形表示により、ＡＴ／ＡＵサンプルが免疫学的に活性であるか否かが疑われた。ＡＴ／ＡＵサンプルは、発現差異レベル及び発現差異のある遺伝子の数の両方に基づいてＡＡＰのものよりもより重度のＡＡ特異的シグニチャを示すようであったため、ＡＴ／ＡＵの遺伝子発現プロファイル、並びに健常コントロールと比較したＡＡＰについての遺伝子発現プロファイル(that)は別々に検討した。ＦＣ＞１．５及びＦＤＲ＜０．０５に基づくＡＴ／ＡＵ特異的疾患シグニチャは、発現が増加した２２３９個の遺伝子及び発現が減少した１６４３個の遺伝子から構成された。類似の閾値に基づくＡＡＰ特異的疾患シグニチャは、より少ない数の発現差異がある遺伝子を示し、ここで、わずか３７６個のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブが増加した発現を有し、５３７個のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブが減少した発現を有していた。ＡＴ／ＡＵ特異的遺伝子リスト及びＡＡＰ特異的遺伝子リストの比較は、２つのリストの中でＡＡＰ特異的遺伝子の重複を示した。ここで、ＡＡＰ特異的遺伝子は、ＡＴ／ＡＵ特異的遺伝子リスト内にほとんど(few)含まれていなかった（図２Ａ）。以前のデータに加えてこれらのデータは、ＡＴ／ＡＵは「燃え尽きている」という仮説とは対照的に、ＡＴ／ＡＵは、疾患のより局所化されたＡＡＰ形態よりもより複雑であり、より重症であることを示している。
免疫関連遺伝子のより強固な発現に着目し、本発明者らは、別の方法を用いてＡＴ／ＡＵサンプルに見られるより重篤な遺伝子発現プロファイルを裏付けようと試みた。ＡＡＰサンプルと比較して、ＡＡ中の最も豊富で最も機能的に関連する浸潤性免疫細胞である、Ｔ細胞による浸潤がＡＴ／ＡＵサンプルで観察された程度を決定するために、ｐａｎ−Ｔ細胞マーカーＣＤ３の免疫組織化学染色を、ＡＴ／ＡＵ、ＡＡＰ、及びＮＣサンプル上で行った。ＡＴ／ＡＵサンプルは、ＮＣサンプルの免疫浸潤量と比較して相対的な免疫浸潤量の有意な増加を示した（図２Ｂ）。そして、球周囲／毛包周囲の浸潤の病理組織学的なスコアリングシステム（ＨＰＳ）を使用すると、ＡＩＰサンプルと比較して浸潤の増加傾向がさらに観察された（図２Ｃ）。これらのデータは、ＡＴ／ＡＵサンプルが高い、且つ、持続した量の免疫活性及び炎症を示すことを示している。
パスウェイ解析は、ＡＡＰ又はＡＴ／ＡＵサンプルのいずれかでアップレギュレートされたシグニチャについて実施した。興味深いことに、「移植片対宿主病」、「I型真性糖尿病」、「同種移植片拒絶」、「細胞接着分子」及び「抗原プロセシング及び提示」を包含する、ＡＡＰ及びＡＵ／ＡＴの両方でアップレギュレートされたパスウェイの共有セット（図２Ｄ〜２Ｅ）は、抗原提示遺伝子から構成され、ＡＡにおける毛包微小環境及び免疫活性化の免疫特権の喪失という病原性のテーマを支持する。興味深いことに、「ケモカインシグナル伝達経路」も有意にアップレギュレートされていることが分かり、他の自己免疫性皮膚疾患のために提案されているように、これらの細胞間輸送分子を治療目的に標的化する可能性を高めた。これらの結果は、ＡＡ中の活性な免疫経路の大部分が、疾患のより軽度の形態において、並びに疾患のより重症な形態において同じであることを示す。
ペアリングされた(paired)病変(lesional)サンプル及び非病変(nonlesional)サンプルは、遺伝子発現プロファイルにおいて類似している
ＡＡ特異的遺伝子シグニチャが症状の発症後に存在するのか、又はむしろ未罹患の対象者からＡＡ対象者を区別するために使用できるグローバルシグニチャの一部として存在するのかは不明である。ＡＡ患者からの非病変皮膚が、正常な患者の皮膚と有意に異なるかどうかを試験するため、ＡＡ患者からの非病変皮膚（ＡＡＰ−Ｌ）の追加の１８サンプルを、トレーニングセットのいびつとして対応する病変皮膚（ＡＡＰ−ＬＳ）で分析した。そして対応するＡＡＰ−ＬＳを有する追加のＡＡＰ−ＮＬサンプル８個はバリデーションセットのために使用した。ＦＣ＞１．５及びｐ値＜０．０５に基づいて、ＡＡＰ−ＬＳ皮膚及びＡＡＰ−ＮＬ間の発現差異がある遺伝子が決定された。ここで、２７遺伝子はＡＡＰ−ＬＳが増加した発現を示し、１４３遺伝子はＡＡＰ−ＬＳが減少した発現を示す。遺伝子のこのセットの発現レベルの検討は、ＡＡＰ−ＮＬがＡＡＰ−ＬＳとＮＣとの間の中間であるプロファイルを示すことを示した（図３Ａ）。
遺伝子発現によって検出可能なこれらの３つの集団間の差異をより明確に視覚化するために、主成分（principal component,ＰＣ）分析を行った。この分析は、遺伝子発現に基づいてサンプルを最大限に分離する非常に複雑なデータにおける最小の次元を同定することを試みる。この分析の最終結果は、類似の遺伝子発現プロファイルを有するサンプルが互いに密接にクラスタ化し、且つ、非類似のプロファイルを有するサンプルが互いに別々にクラスタ化することである。非病変サンプル（ＡＡＰ−ＮＬ）は、ＰＣ分析の第１の成分に基づいて、患者適合性病変サンプル（ＡＡＰ−ＬＳ、図３Ｂ）から非常に可変の非類似性を示した（ＡＡＰ−ＬＳ，図３Ｂ）。最初の２つの主成分に対して全てのサンプルを配列することは、このデータと一致した。ここで、ＡＡＰ−ＬＳ及びＮＣサンプルは異種のクラスタリングを示し、且つ、ＡＡＰ−ＮＬはＡＡＰ−ＬＳとＮＣとの中間であるプロファイルを示した（図３Ｃ）。検証データセットからの８個のＡＡＰ−Ｌ／ＡＡＰ−ＮＬペアのＰＣ分析の第１の成分のプロットは、発見データセットにおいて観察されたペアにわたって同一の非常に可変の非類似性を示した。非病巣サンプルと非病変サンプルとの間に示差的に発現される遺伝子を機能的アノテーションについて分析した。そして、非病変サンプル中に存在する最も一般的な遺伝子（但し、病変サンプルに存在しない）は、毛髪関連ケラチン及び一握りの炎症応答遺伝子であったことが分かった（図３Ｄ）。ＣＣＬ５／１３、ＰＲＦ１、ＧＺＭＢ／Ｋ、ＩＴＧＡＭ、及びＣＤ２０９を包含する免疫応答及び浸潤に関連する遺伝子は、非病変サンプルから欠けていた。これらの結果は、ＡＡ患者からの非病変サンプル生検は完全に病変領域に似ていない一方、健康なコントロール頭皮にも似ていないことを示している。これらのサンプルは、正常な、未罹患サンプルとは異なるが、病変サンプルに見られるように完全な自己免疫応答をまだ誘発していない中間状態で存在する。
浸潤遺伝子発現シグニチャは、ＡＡ表現型と相関する
ＡＡＰ及びＡＴ／ＡＵ患者コホート両方における有意な浸潤物の存在、及び遺伝子発現アレイコホートにおける免疫関連マーカー遺伝子の存在により、これらの浸潤物がマイクロアレイ解析において直接検出され得るか否かが疑われた。浸潤集団を検出する能力は、ＡＡの病理学及び特徴付けに有益であることが証明するであろう。侵襲性免疫組織を同定するために、いくつかの浸潤性免疫細胞の各々を定義し、且つ、免疫遺伝子シグニチャ（Immune Gene Signature,ＩＧＳ）として使用されるユニークな遺伝子発現シグニチャを採用した。この作業は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー及びマスト細胞を包含するがこれらに限定されない、いくつかの免疫型について、包括的で相互に排他的な遺伝子マーカーを提供した。これらの組織型のそれぞれの相対浸潤の数値的相対的測定値を、対応するＩＧＳの発現の関数として構築した（図４Ａ）。この測定基準を使用して、発明者らは、患者毎に各免疫組織の相対的浸潤を定量し、そして、ＡＡ開始及び重症度との相関についてそれらを試験することができた（図７Ａ〜７Ｂ）。試験した浸潤物のうち、ＣＤ８ Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞のランキングだけが、ＮＣをＡＡＰ又はＡＴ／ＡＵから分離する能力を有していた。ＣＤ８活性によるランキングは、３つの臨床症状の間に用量依存性の分離を生じ、３つの集団を有意に分離した（ハッシュは各コホートの中央値を表す）。ＮＫ特異的マーカーは、ＣＤ８ Ｔ細胞特異的マーカーの能力を反映していなかったが、相関は、ＮＫ浸潤または共有ＮＫ／ＣＤ８ Ｔ細胞遺伝子の結果ではない可能性があることを示す。
ＩＧＳメトリック(metrics)を用いて、本発明者らは、ＡＡＰサンプル（図４Ｂ、左の円グラフ(pie)）及びＡＴ／ＡＵサンプル（図４Ｂ、右の円グラフ）を汚染する全浸潤シグナルも推定した。各免疫組織型の浸潤における全体的な推定変化も示されている（図４Ｂ、チャート）。遺伝子発現データから、０．８〜１．４％の推定浸潤物汚染が観察され、ＡＡの増加した臨床的重症度と相関した。一致して、ＣＤ８＋浸潤物は、ＡＡＰ又はＡＴ／ＡＵ患者由来のサンプルにおいてのみ、全浸潤負荷量の６５％超からなっていた。３つの症状(presentations)にわたる各免疫組織浸潤の絶対変化もまた示され（図４Ｃ）、ＣＤ８＋浸潤のみが３つの集団にわたって有意に変化することを示す。これらの結果は、複数の浸潤組織型に関するいくつかの発現に基づく証拠があるとはいえ、ＡＡに関連する最も有意に存在する型は非ＮＫ、ＣＤ８＋細胞であることを示す。さらに、本発明者らは、マクロファージ、総ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセット、ＮＫ細胞及びＢ細胞に関連するマーカーの上昇したレベルを検出することができたが、これらはＣＤ８ Ｔ細胞画分と比較してわずかな画分を示した。全体として、各サンプル内の汚染は比較的小さく、試験された免疫組織の全集団は全シグナルの約３％を超えない。
さらに、患者サンプルで検出された相対Ｔｈ１及びＴｈ２画分を推定するため、ＩＧＳスコアを用いた（図４Ｄ）。各患者（ＡＡ又は未罹患コントロール）について、サンプル生検内のＴｈ負荷はＴｈ１：Ｔｈ２シグナルの比として表され、そして、ＡＡ患者サンプルは正常コントロールと比較してより高いＴｈ１比へのシフトを示すことが観察された。ＡＡ症状(presentation)に関連するＴｈ１：Ｔｈ２のランクシフトは、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定（ｐ＝１．０２×１０−４）によって統計学的に有意であり、全体としてＡＡ患者由来の皮膚は、未罹患していない患者と比較して、Ｔｈ２シグニチャに関連するＴｈ１シグニチャの上昇したレベルを含有するが、Ｔｈ２及びＴｈ２シグニチャの両方を有するＡＡ患者がいることを示す。
ＡＬＡＤＩＮスコアは、疾患の表現型と平行している
本発明者らは、病状の定量的評価を可能にするであろうＡＡ疾患シグニチャの最も顕著な特徴を同定したメトリックを作成しようとした。ＡＡと健常コントロールとの間で発現差異がある遺伝子の加重遺伝子同時発現解析（weighted gene co-expression analysis,ＷＧＣＮＡ）は、同時発現遺伝子の２０個のクラスタを明らかにした（図５Ａ）。これら遺伝子セットは、共発現したモジュールを表し、共調節、共有された生物学的機能及び／又は共有経路の可能性を示す。これらのモジュールのそれぞれについて、本発明者らは、各モジュール内の遺伝子に由来する遺伝子発現シグニチャの第１の主成分を用いて、色分けされた固有遺伝子(eigengenes)又はメタ遺伝子(metagenes)を定義することができる。ＡＡコホートとＮＣコホートとの間で差異的に発現された遺伝子のランク付けされたリストを有する、これらモジュールの遺伝子セット濃縮分析（gene set enrichment analysis,ＧＳＥＡ）、並びに、モジュールメタ遺伝子と疾患表現型との間の関連性の試験は、グリーンのモジュール及びブラウンのモジュールが疾患表現型と最も有意に関連していること、及びこれらのモジュール（図５Ｂ、８Ａ及び８Ｂ）が、免疫及び免疫応答シグニチャ（グリーン）及び構造ケラチン（ブラウン）を含有することを明らかにした。グリーンモジュールの経路濃縮分析は、自己免疫応答に関連するいくつかの遺伝子経路を明らかにした（図５Ｃ）。これは、ＣＤ８、ＣＤ４、ＭＩＣＢ、ＣＣＬ４／５、ＣＣＲ７、及びＩＣＯＳなどの遺伝子を包含した。パーフォリン及びグランザイムＢの両方が、ＩＣＯＳ、ＩＲＦ１及びＣＩＩＴＡを包含する、ＧＷＡＳメタアナリシスによって以前に関与した遺伝子と同様に、検出された。
オリジナルなスコアリングシステム、円形脱毛症疾患活動係数（Ａｒｅａｔａ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ, ＡＬＡＤＩＮ）が開発された。これは、病気の重症度及び治療への応答を追跡するためのバイオマーカーとしての潜在的使用のため、３次元定量的複合体遺伝子発現スコアであった。メトリックは、細胞傷害性Ｔリンパ球浸潤（ＣＴＬ）、ＩＦＮ関連マーカー（ＩＦＮ）、及び毛髪ケラチンパネル（ＫＲＴ）の組み合わせに沿って患者を評価する。興味深いことに、ＣＴＬシグニチャは、２つの遺伝子、ＣＤ８Ａ及びＰＲＦ１を含む。これらは上記のＣＤ８ Ｔ細胞シグニチャを構成する（図４）。グリーンモジュールの構成要素を調べると、ＡＬＡＤＩＮ ＣＴＬとＩＦＮシグニチャの両方に含まれる遺伝子の存在が明らかになった。そして、ブラウンのシグニチャは、ＡＬＡＤＩＮ ＫＲＴシグニチャを構成する遺伝子を含有していた。新しいデータセットに対するＡＬＡＤＩＮの堅牢性を試験するために、患者ＣＴＬ、ＩＦＮ及びＫＲＴスコアが決定された（図９）。９６のＡＴ／ＡＵ、ＡＡＰ、及びＮＣサンプルの組み合わせた発見及びバリデーションデータセットのための３次元プロットは、ＡＴ／ＡＵサンプルがＮＣサンプルから最も離れてクラスタリングされたことを示した。ここで、ＡＡＰサンプルは、これらのセット両方の間の中間位置に配置された（図５Ｄ）。後続のＧＳＥＡは、ＡＡＰ及びＡＴ／ＡＵコホートの両方における正常コントロールと比較して、ＡＡサンプルにおけるオリジナルのＡＬＡＤＩＮ遺伝子セットの統計的に有意な濃縮を示した（図８Ｃ）。これらのデータは、ＡＬＡＤＩＮスコアが重症度の異なるＡＡ形態を区別できることを示し、及び臨床試験においてこのメトリックの使用を招く。
さらに、本発明者らは、病気の期間がＡＬＡＤＩＮスコアに影響を及ぼしたか否かを評価した。病気が５年以上経過したＡＴ／ＡＵ患者由来の皮膚サンプルは、より短い期間のＡＴ／ＡＵ患者のサンプルと比較し場合、ＩＦＮ及びＣＴＬスコアにおいて統計的に有意な減少を示した（図５Ｅ）。この関係は、長期及び短期ＡＡＰサンプルの間には見られなかった（図１０）。これらのデータは、ＡＬＡＤＩＮスコアが重症度が異なるＡＡ形態を区別することができること、及びさらに、ＡＡのより重篤な形態の中で炎症及び免疫浸潤スコアが時間の経過とともに減少することを示している。
Ｃ．考察
ＡＡの生物学への基本的な洞察を行うため、マイクロアレイベースの全ゲノム遺伝子発現アッセイを利用した。ここでの作業は、ＡＡを有する患者及び健常コントロール由来の１２０を超える頭皮生検標本の使用を包含する。本発明者らは、病因のいくつかの重要な特徴を同定するため、この方法を初めて利用する。
第１に、ＡＴ／ＡＵは、正常コントロール及びＡＡＰサンプルと比較して、比較的高いレベルの免疫活性を示す。ＡＴ／ＡＵの患者が効果的に治療できないという考えは、これらの患者を以前に利用可能な局所及び経口薬で治療することの歴史的困難と、重症患者の皮膚生検標本における相当数の未発達の(rudimentary)毛髪の特定が困難であることに起因するようである。しかし、このデータは、ＡＡＰにおいて見られるものと等しい（より大きくない場合）ＡＴ／ＡＵサンプルにおける持続的な免疫学的活性の証拠を提供することによって、このアイデアに挑戦する。ＡＴ／ＡＵを有する患者におけるこの免疫活性は、ＡＴ／ＡＵ疾患の自発的解消の稀ではあるが、症例報告と組み合わせて、免疫応答の維持に必要な経路を標的とする、十分に強力な免疫抑制剤又は治療が、これらのタイプの患者にとって有効であり得ることを意味する。事実、最近の機構的データは、ＡＡにおけるヤヌスキナーゼ媒介経路の役割を支持しており、及びいくつかの症例報告は、重症又は広範な疾患の場合でも、小分子ＪＡＫインヒビターがＡＡのための薬の有望なクラスと思われることを確証している。
第２に、ＡＡの分子の定義は、ヒト疾患の病因におけるＣＤ８ Ｔ細胞の顕著な役割を支持する。ＮＣ、ＡＡＰ及びＡＴ／ＡＵサンプルを比較した場合、用量応答のような関係が見られ、且つ、支持球周囲／毛包周囲Ｔ細胞傾向も観察され得る。以前の研究は、ＣＤ８ Ｔ細胞がＡＡのマウスモデルにおいて必要かつ十分であることを示した。そして、ＡＡ病因においてＫＧ２Ｄの発現及びＡＡとＮＫＧ２ＤＬとの間に見出される関連のためにＣＤ８ Ｔ細胞の役割を示唆していた。当該データは、疾患の病因におけるＣＤ８ Ｔ細胞の役割をさらに支持するだけでなく、ＣＤ８ Ｔ細胞の関与のレベルと疾患の重症度／表現型との間の相関をも引き出す。
第３に、非病変ＡＡＰ皮膚サンプルと病変ＡＡＰ皮膚サンプルとの間の相対的類似性は、病変ＡＡＰと正常皮膚サンプルとの間に観察された関係と比較して、ＡＡ患者における未罹患皮膚は、ＡＡ患者の皮膚が脱毛を発症するよう仕向ける因子の少なくとも一部を共有することを示唆する。しかしながら、疾患の臨床的欠如のために、非病変皮膚のサンプルは、毛髪毛包の自己免疫破壊に必要な因子の完全なコンステレーション(constellation)を有しない。臨床的疾患の兆候のためには、耐性の崩壊に対するいくつかの免疫調節障害が克服されなければならないようである。ここで、これらの状況の全てが発生した場合にのみ脱毛症が観察される。ＡＡ患者由来の未罹患皮膚サンプルと罹患皮膚サンプルとの間の差異の更なる検討は、おそらく素因を有する(predisposed)個体における新たな治療又は予防戦略を明らかにする、ＡＡ発症のための最終的な刺激トリガー関して有益であり得る。
この仕事の主要部は、皮膚における疾患プロセスの分子的な定義を確立し、そしてタンパク質メディエーター又は細胞当事者に対応するシグニチャについて調べることができる。これらのデータは、ＡＡにおける病原性疾患のメカニズム及び治療標的を追求する研究者のための豊富なリソースとして役立つ。
Ｄ．材料及び方法
人間の患者の人口統計
４つのＮａｔｉｏｎａｌ Ａｌｏｐｅｃｉａ Ａｒｅａｔａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＮＡＡＦ）登録サイトから２つの独立したデータセットを収集した。発見データセットは、６３人の患者からの８１サンプルから構成された（２０人のＡＡＰ、２０人のＡＴ／ＡＵ、及び２３人の正常コントロール。ＡＡＰの１８人はまた、ＡＡＰ病変周囲と非病変との間の遺伝子発現の一対比較を可能にするため、非病変皮膚の生検を寄与した。）。検証データセットは、３３人の患者からの４１のサンプルから構成された。（８人のＡＡＰ、１２人のＡＴ／ＡＵ、及び２３人の正常コントロール。前記ＡＡＰ患者のうち８人はまた、ＡＡＰ病変と非病変サンプルとの間の遺伝子発現の一対比較を可能にするため、非病変皮膚の生検を寄与した。）
ヒト組織のサンプリング及び処理
皮膚パンチ生検標本をＰＡＸｇｅｎｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓに固定し、コロンビア大学に一晩で輸送した。サンプルを二等分にした。サンプルの半分を、ＲＮＡを抽出するため、ＰＡＸｇｅｎｅ組織ｍｉＲＮＡキットを用いて処理し、そして残りの半分をパラフィンに包埋した。ライブラリー調製(prep)は、Ｏｖａｔｉｏｎ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｖ２及びＢｉｏｔｉｎ Ｅｎｃｏｒｅキット（ＮｕＧｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）を用いたマイクロアレイ分析のために行った。その後、サンプルをヒトゲノムＵ１３３プラス２．０チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）にハイブリダイズさせ、コロンビア大学病理学コア又はＹａｌｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＹＣＧＡ）においてスキャンした。
分析パッケージ
マイクロアレイの品質管理はhttp://arrayanalysis.org/からのａｆｆｙＡｎａｌｙｓｉｓＱＣパッケージを使用して行った。バッチ効果補正であった。これらの研究における差次的発現は、絶対倍率変化(fold change)閾値１．５で定義した。有意差閾値０．０５はＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正した。クラスタリング及び主成分分析はＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｒパッケージに提供されたモジュールを使用して行われた。Ｃｙｔｏｓｃａｐｅでネットワーク画像を生成した。
マイクロアレイの前処理及び品質管理
マイクロアレイの前処理は、ＲにおけるＢｉｏＣｏｎｄｕｃｔｏｒを用いて行った。２つのデータセット、発見データセット（６３サンプル）及び検証データセット（３３サンプル）、の前処理は、同一パイプラインを使用して別々に実行した。品質管理はｈｔｔｐ：／／ａｒｒａｙａｎａｌｙｓｉｓ．ｏｒｇ／からのａｆｆｙａｎａｌｙｓｉｓＱＣパッケージを使用して実施した。発見データセット及び検証データセットは、ＧＣＲＭＡ及びＭＡＳ５を用いて別々に正規化した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＧＵ−１３３Ｐｌｕｓ２アレイは、５４６７５ プローブセット（ＰＳＩＤ）を収容する。フィルタリングを行った。それにより、Ｘ又はＹ染色体上にあったＰＳＩＤ、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘコントロールプローブセットであったＰＳＩＤ、又はＧｅｎｅ Ｓｙｍｂｏｌ注釈をもたないＰＳＩＤを、更なる下流分析のために全てのアレイから除去した。ＡＬＡＤＩＮスコアの３Ｄプロットについては、ＧＣＲＭＡの正規化及びバッチ効果の補正を行う前に、両方のデータセットからの全９６サンプルを組み合わせた。
サンプルフィルタリングバッチ修正
発見データセット中の６３個のＡＡ病変（ＡＴ／ＡＵ及びＡＡＰの両方）及びＮＣサンプルについての分析を行うために、３６９５４ ＰＳＩＤを生じる少なくとも１つの６３アレイ上の存在と呼ばれていなかったＰＳＩＤsを除去するため、ＰＳＩＤｓをさらにフィルタリングした。バッチ効果の補正は、共変量として使用される性別及びＡＡ群（ＡＴ／ＡＵ、ＡＡＰ、及び正常）を有するｓｖａパッケージで利用可能な関数ＣｏｍＢａｔの実施を用いて行った。検証セットにはバッチ修正は必要なかった。ペアリングされた病変／非病変マイクロアレイは、正常のコントロールと一緒に同一マイクロアレイバッチ内で一緒に処理された。ペアリングされた病変／非病変分析のための発見セットは、１８病変／非病変ＡＡＰペアと２３コントロールとから構成された。検証セットは、８つの病変／非病変ＡＡＰペアと１３のＮＣサンプルとを有した。
ペアリングされた病変及び非病変サンプル間の関係を検討するため、ＰＳＩＤを、各バッチ内の正常サンプルの平均発現レベルに集中させた。バリデーションセットはバッチ修正を必要としなかった。
発現差異解析(differential expression analysis)
Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒにおけるｌｉｍｍａパッケージに実装されている線形モデルを使用して、バッチ修正された発見データセットに対して微分解析を実施した。ＡＡ患者対（versus）正常コントロール、ＡＡＰ患者対正常コントロール、及びＡＴ／ＡＵ患者対正常コントロールにおいて発現差異があるＰＳＩＤを同定するため、２サンプル比較を別々に実施した。性別を固定因子として扱った。一対比較を、性別を固定効果として扱う、ＡＡＰ−ＬＳ／ＡＡＰ−ＮＬサンプルに対して行った。
遺伝子発現シグニチャに保持された誤った発見の数を減少させるため、ほとんどのＰＳＩＤについてｌｏｇ２（fold-change）が１を超えなかったため、本発明者らは、発見データセットをサブサンプリングした。一度に１バッチ由来のサンプルを除外し(leaving out)、且つ、全データセット並びに全サブサンプリングにおいて発現差異があると識別されたＰＳＩＤのみを保持した。
主成分分析
発現差異解析を行うために使用された全ての３６９５４ ＰＳＩＤについて、主成分分析を実施した。２変量分布を仮定しながら、各グループ（ＡＴ／ＡＵ、ＡＡＰ、ＮＣ）について、最初の２つの主成分の確率密度を推定した。主成分分析を行った。発見セットにおける４１ ＡＡＰ−ＬＳ、ＡＡＰ−ＮＬ、及び正常コントロールサンプルは、発現差異があると同定された１７０ ＰＳＩＤを使用した。
組織病学的染色
免疫組織化学は、クローンＬＮ１０抗ＣＤ３一次抗体を用いたＢｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｒｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）プロトコルを用いて行った。球周囲／毛包周囲病理組織学スコアリングシステム（ＨＰＳ）を、図２Ｃに示す代表的な例で、０〜３スケール（０−免疫浸潤なし；１−軽度；２−中間；３−重度）を用いて行った。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を用いて、ＣＤ３スコアの平均ランクが全群において０．０５の有意水準において同じであったという帰無仮説は否定された（Ｈ＝１６．５１、ｄｆ＝２、ｐ＝０．０００２６）。Ｗｉｌｃｏｘｏｎの順位和検定は、全ての一対比較について実施され、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を用いて多重比較について調整された。ＡＵ／ＡＴ群及び正常群（ｐ＝４ｅ−０４）とＡＡＰ群及び正常群（ｐ＝０〜４）との間に有意差が認められた（分布＝「漸近」(asymptotic）を使用するＲにおけるcoinパッケージからのｗｉｌｃｏｘ＿ｔｅｓｔ）。
ＡＡ重症度のための線形ユークリッド分類指標(classifier)の生成
ＡＡ疾患シグニチャの主成分分析及び地形マッピングは、最初の２つの主成分（principal components,ＰＣ）によって規定された発現空間におけるＮＣ、ＡＡＰ、及びＡＴ／ＡＵ患者間の近線形依存性を明らかにした。発現地形マップは、ユークリッド距離をメトリックとして、１０個の最近傍をクラスタリングパラメータとして使用する、ＭｅＶソフトウェアスイートで生成された。これは、重症度を予測する、より直感的な数値スコアに変換するために、本発明者らは、ＰＣ１及びＰＣ２に有意に寄与する遺伝子のリストを生成した。これは、各ＰＣに対する遺伝子の加重寄与を順位ソートし、そして、重み分布の変曲点の前に遺伝子のセットを選択することによって行われた。次いで、これらの遺伝子の発現ベクターをｚスコア変換し、そして、非ゼロの、統計的に比較可能な発現値を生成するため、順位正規化した。患者毎に、適切なＰＣベクター中の重心値を構築するため、各正規化ベクター中の全ての遺伝子を使用した。各重心値は、その後、各患者についてＰＣ１ｘＰＣ２として定義されたグリッドの基点に対応する。次に、｛ＰＣｌｍｉｎｘＰＣ２ｍｉｎ｝と｛ＰＣｌｍａｘｘＰＣ２ｍａｘ｝との間に直線投影を構築し、そして各患者をこの線にマッピングした。次いで、０から１０の間の値を結びつけるためにベクターを正規化した。各コホートのスコアブレークポイント（ＮＣ ０−２、ＡＡＰ ２−６、ＡＴ／ＡＵ ６−１０）は、各スコア範囲内に入るＮＣ及びＡＡＰ、並びにＡＡＰ及びＡＴ／ＡＵのオッズ比を最大化するスコア値を同定する、スライディングウインドウ分析を行うことにより得られた。
コンセンサス免疫遺伝子シグニチャの生成
浸潤集団の各々についてユニークなシグニチャ遺伝子が採用された。浸潤をランキングする相対的な分類指標(classifiers)を生成するため、相互に排他的な遺伝子の各グループを、個々の患者ごとにコンセンサススコアに統合する前に、共分離及び識別力について独立に試験した。統合は、以下のステップにおいて行われた：スケール比較可能な発現値を得るために全ての遺伝子ベクターを形質転換するｚスコア；各遺伝子シグナルについて順序付けられた非負の値を得るため、これらのベクターを順位変換するステップ；及び各浸潤組織について順位序列発現のコンセンサス値を作成するため、ランクを最終的に平均化するステップ。１サンプルあたりの全浸潤負荷量の推定のために、コンセンサスｚスコアを各個々の遺伝子の発現スペースに戻して変換し、そして、集団全体にわたる最小変動係数を有するハウスキーピング遺伝子のコンセンサスに正規化した。
次の表は、各細胞タイプのシグニチャを示す。
Figure 2018526362
Figure 2018526362
無監督の(unsupervised)機械学習、加重遺伝子共発現解析
加重遺伝子共発現解析（Weighted Gene Co-expression Analysis，ＷＧＣＮＡ）は、全てのＰＳＩＤの分散(variance)の中央値を超えているＣｏｍＢａｔ調節発現セットにおけるＰＳＩＤに対して実施した。ＰＳＩＤ間の隣接性(adjacency)は、１０に設定されたソフト閾値化出力に上昇されたサンプルにわたる発現プロファイルのピアソン相関として定義された。得られた隣接行列は、相違行列が算出されたトポロジカルオーバーラップ行列（Topological Overlap matrix,ＴＯＭ）に変換した。非類似行列に対して階層クラスタリングを行い、そして樹状図の得られる枝からモジュールを同定した。図５における共発現ヒートマップと樹状図は、ＴＯＭを隣接基準として使用して、２０個のモジュールに割り当てられたＰＳＩＤの１／３の層別サンプリングから作成された。モジュール固有遺伝子(eigengenes)とカテゴリー形質との間の関連、疾患表現型、性別、及びＮＡＡＦサイト由来(originating)について試験するため、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を実施した。Ｐｅａｒｓｏｎの相関係数及びｐ値は、各モジュール固有遺伝子と対象者年齢の間で推定した。異なるＷＧＣＮＡモジュールにおける正常コントロール関して、ＡＡにおいて過剰／過少発現した遺伝子の過剰出現についてさらに試験するため、遺伝子セット濃縮分析（gene set enrichment analysis,ＧＳＥＡ）を使用した。正規化された濃縮スコア（normalized enrichment score,ＮＥＳ）は、モジュールサイズの差異を考慮に入れて、ランク付けされた遺伝子リストの上位または下位において、遺伝子セットが過剰出現される程度を反映する。予備ランク付けされた遺伝子リストは、ランキングのためにｔ統計で作成された。
ＡＬＡＤＩＮスコアの計算
ＣＴＬ、ＩＦＮ及びＫＲＴ ＡＬＡＤＩＮスコアを各サンプルについて計算した。簡潔に述べると、正常コントロールの平均及び標準偏差と比較して各ＰＳＩＤについてｚ−スコアが計算される。各遺伝子のｚスコアは、その遺伝子にマッピングされたＰＳＩＤのｚスコアを平均することによって得られる。次いで、シグニチャスコアは、対応するシグニチャに属する遺伝子についてのｚスコアの計算された平均である。
６．２ 実施例２
Ａ．はじめに
ＡＡは、表現型的には、脱毛により特徴付けられ、且つ、組織学的には、毛包球を取り囲むＴ細胞に浸潤することによって特徴付けられる、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患である。全Ｔ細胞（但し、Ｂ細胞又は血清ではない）の移動は、ヒト異種移植モデルにおける、並びにヒトＡＡとかなり類似した自発的ＡＡを発症するマウス株であるＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおいて、疾患を引き起こし得る。広範に作用する病巣内ステロイドは、ＡＡに対して最も一般的に用いられる療法であり、様々な成功を収めている。合理的に標的化された効果的な治療法の開発に進歩は、ＡＡにおける根底にある主要なＴ細胞炎症性経路の機構的理解の欠如によって制限されていた。
ＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋Ｔ細胞の細胞傷害性サブセットが、ヒトＡＡ毛包を取り囲む浸潤物内で同定された。また、「危険信号」ＵＬＢＰ３及びＭＩＣＡ、２つのＮＫＧ２Ｄリガンド（ＮＫＧ２ＤＬ）、及び２つのＮＫＧ２Ｄリガンドの毛包自体における付随するアップレギュレーションも同定された。疾患の病因におけるその重要性は、ゲノムワイドな関連研究によっても示唆されている。
Ｂ．結果
ＡＡ病因に対するＣＤ８＋ＫＧ２Ｄ＋ Ｔ細胞の寄与を決定するために、本発明者らは、自発的に脱毛症を発症し、且つ、ヒトＡＡの多くの病理学的特徴を再現する（recapitulates）Ｃ３Ｈ/ＨｅＪマウスモデルを使用した。脱毛症マウスの病変皮膚生検において、ＣＤ８＋ＫＧ２Ｄ＋ Ｔ細胞は毛包の上皮層に浸潤する。これは、ヒトＡＡの皮膚生検において観察されたものと同様に、ＫＧ２ＤＬ、Ｈ６０及びＲａｅ−１を過剰発現する（図１１Ａ〜１１Ｂ）。皮膚におけるＣＤ４５＋白血球集団のフローサイトメトリー分析は、疾患のないＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスと比較して、皮膚リンパ節腫脹及び総細胞充実性の増加と併せて、罹患Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスの皮膚におけるＣＤ８＋ＫＧ２Ｄ＋ Ｔ細胞数の顕著な増加を明らかにした（図１１Ｃ〜１１Ｄ）。ＣＤ４＋ Ｔ細胞４及びマスト細胞を包含する、他の細胞タイプは、はるかに少ない数で存在した。
ＡＡを有するマウスにおける皮膚浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫表現型は、皮膚リンパ節に見出されるＣＤ８＋ＫＧ２Ｄ＋集団のものと類似していた：ＣＤ８αβ＋エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ，ＣＤ８ｈｉＣＤ４４ｈｉＣＤ６２ＬｌｏｗＣＤ１０３＋）は、ＣＤ４９ｂ及びＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ及びＮＫＧ２Ｅを包含する、複数のナチュラルキラー（ＮＫ）免疫受容体を保持する（図１１Ｅ）。これらのＣＤ８＋ＴＥＭ細胞は、高レベルのＩＦＮ−γを発現し、ex vivoで増殖した同系真皮鞘標的細胞に対して、ＮＫＧ２Ｄ依存性細胞傷害性を示した（図１１Ｆ）。ＲＮＡ−ｓｅｑを用いた脱毛症Ｃ３Ｈ／ＨｅＪリンパ節細胞から単離したＣＤ８＋ＫＧ２Ｄ＋Ｔ細胞の遺伝子発現解析は、エフェクター細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に特徴的な転写プロファイルを示し、且つ、いくつかの追加のＮＫ特異的転写物を同定した。
本発明者らは次に、疾患の病因におけるこれらＣＤ８＋ＴＥＭ細胞の必要性を評価した。罹患(diseased)マウス由来の細胞傷害性ＣＤ８＋ＫＧ２Ｄ＋細胞又は全リンパ節細胞の転移は、移植後１４週までに５匹の健常Ｃ３Ｈ／ＨｅＪレシピエント全てにおいてＡＡを誘発した一方、ＮＫＧ２Ｄ＋細胞を枯渇したリンパ節細胞集団は疾患を転移させることができなかった（図１１Ｇ）。従って、ＣＤ８＋ＫＧ２Ｄ＋Ｔ細胞は真皮浸潤物中の優勢細胞型であり、ＡＡのＴ細胞介在転移のために必要かつ十分である。
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス及びヒトＡＡからのＡＡ病変皮膚の転写プロファイルを特徴づけるため、ＡＡを有する個体と、疾患のないコントロール個体由来の皮膚との間で、皮膚における発現差異がある遺伝子を同定するため、本発明者らはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ分析を行った。３つの遺伝子発現シグニチャが、病変皮膚において同定された：ヒト及びマウスのＡＡ皮膚の両方において、ＩＦＮ応答遺伝子、例えばＩＦＮ−誘導性ケモカインＣＸＣＬ−９、ＣＸＣＬ−１０及びＣＸＣＬ−１１をコードするものなど、いくつかの重要なＣＴＬ特異的転写物、例えばＣＤ８Ａ及びグランザイムＡ及びＢをコードするものなど、並びにγｃサイトカイン及びそれらの受容体、例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）及びＩＬ−１５の転写物など。ＩＬ−２Ｒαは、ヒトＡＡ毛包周囲の浸潤リンパ球上で発現することが以前に示されていたので、本発明者らは、皮膚におけるＩＬ−１５のソースを同定するため、ＩＬ−１５及びそのシャペロン受容体ＩＬ−１５Ｒａの両方について免疫蛍光分析を行った。本発明者らは、ヒトＡＡ及びマウスＡＡの両方においてＡＡ毛包における両方の成分の顕著なアップレギュレーションを検出し、そして、ヒトにおける浸潤性ＣＤ８＋ Ｔ細胞上に発現されたＩＬ−１５Ｒβを見出した。
ＩＬ−２及びＩＬ−１５は、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞及びＮＫ細胞による細胞傷害活性の周知のドライバーであり、自己反応性ＣＤ８＋ Ｔ細胞の誘導及び／又は維持に関与している。in vivoでのＩＦＮ−γ−及びγｃ−標的療法の有効性を試験するために、本発明者らは、ＡＡのよく確立した移植片モデルを使用した。ここで、自然発生的なＡＡを有するマウスからの皮膚移植片を１０週齢の未罹患レシピエントＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの背中に移植する。このモデルでは、ＡＡは６〜１０週間以内に移植されたレシピエントの９５〜１００％において確実に発症し、疾患の予防または回復を目的とした介入を試験することを可能にする。
ＡＡにおけるＩＦＮ−γの役割は、ノックアウト研究及びＩＦＮ−γの投与の両方を使用して、以前に調査された。その場合、ＩＦＮ−γ欠損マウスが耐性及び外因性ＩＦＮ−γ沈降疾患であった。移植時にＩＦＮ−γに対する中和抗体の投与は、移植されたレシピエントにおけるＡＡ発症を防ぎ、そして、皮膚における主要組織適合複合体（major histocompatibility complex,ＭＨＣ）アップレギュレーション及びＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋浸潤を抑制した(abrogated)（図１２Ａ〜１２Ｃ）。同様に、ＡＡ病因におけるＩＬ−２の役割は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪバックグラウンドに対するＩＬ−２ハプロ不全が移植片モデルを使用する約５０％だけ、病気耐性を付与する遺伝子実験を使用して以前に確立されていた。そして、この役割は、ヒトにおいてゲノムワイドな関連研究により支持されている。ＩＬ−２（図１２Ｄ〜１２Ｆ）又はＩＬ−１５Ｒβ（図１２Ｇ〜１２Ｉ）のいずれかに対する全身投与ブロッキング抗体は、移植マウスにおけるＡＡを防ぎ、皮膚におけるＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋ Ｔ細胞の蓄積を阻止し、そしてＭＨＣアップレギュレーションを抑制した(abrogated)。しかし、ＩＬ−２１遮断は、移植Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおけるＡＡの発症を妨ぐことに失敗した。特に、これらのブロッキング抗体単独では、確立されたＡＡを逆転させることができなかった（データ示さず）。
本発明者らは次に、広範囲の細胞表面受容体の下流にシグナル伝達するＪＡＫキナーゼの小分子阻害剤を用いて下流に介在することによって、本発明者らが、Ｉ型サイトカイン遮断の効果を再現できるかどうかを検討した。特に、ＩＦＮ−γ受容体及びγｃファミリー受容体は、それぞれＪＡＫ１／２及びＪＡＫ１／３を介してシグナル伝達する。ＪＡＫの活性化は、ヒト及びマウスの脱毛症の毛包において、リン酸化されたシグナル伝達兼転写活性化因子（signal transducer and activator of transcription,ＳＴＡＴ）タンパク質（ｐＳＴＡＴ１、ｐＳＴＡＴ３及びより少ない程度ではｐＳＴＡＴ５）の存在によって示されたが、正常な毛包においては示されなかった。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来のin vitro培養真皮鞘細胞では、外因性ＩＦＮ−γはＳＴＡＴ１活性化を増加させた一方、ＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−αは表面ＩＬ−１５発現を増加させた。ＩＦＮ−γＲシグナル伝達に重要なＪＡＫ１／Ｊキナーゼ（ＪＡＫ選択性は、ＪＡＫ１＝ＪＡＫ２＝Ｔｙｋ２＞＞＞ＪＡＫ３である）のアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）承認小分子インヒビターである、ルキソリチニブ（Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ）は、これらの応答を阻害した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来の培養ＣＴＬエフェクターにおいて、ＦＤＡ承認小分子ＪＡＫ３インヒビタートファシチニブ（ＪＡＫ３＞ＪＡＫ１＞＞ＪＡＫ２選択性）は、ＩＬ−１５誘発ｐＳＴＡＴ５活性化を遮断した。トファシチニブはまた、真皮鞘細胞の殺傷及びグランザイムＢのＩＬ−１５誘発アップレギュレーション及びＩＦＮ−γ発現を遮断した。
これらのシグナル伝達経路の阻害がin vivoで治療的に有効であるかどうかを試験するために、本発明者らは、移植時にルキソリチニブ（図１３Ａ〜１３Ｃ）及びトファシチニブ（図１３Ｆ〜１３Ｈ）を全身投与した。そして、それらが、移植された全てのレシピエントにおけるＡＡの発症及びＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋ Ｔ細胞の拡大を防止することを見出した。
いずれか一方の薬剤で処理したマウスの皮膚は、組織学的な炎症の徴候を示さなかった（図１３Ｄ及び１３１）。全皮膚生検の全体的転写分析は、両方の薬剤が、円形脱毛症疾患活動係数（ＡＬＡＤＩＮ、図１３Ｅ及び１３Ｊ）及び遺伝子発現ダイナミックインデックス（Gene Expression Dynamic Index,ＧＥＤＩ）分析によって測定される皮膚の炎症性シグニチャも遮断することを示した。
次に、本発明者らは、全身性トファシチニブ治療が、移植後７週間に治療を開始することによって確立された疾患を逆転できるかどうかを質問した。全身療法は体全体に実質的な毛の再生をもたらし、ＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋ Ｔ細胞の頻度を低下させ、及び組織学的マーカーを逆転させたが、これらの全ては治療の中止後２〜３ヶ月間持続した。
次に、より臨床的に関連する送達経路を試験するために、本発明者らは、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤の局所投与が、全身送達の動力学に類似した動力学を有するマウスにおいて確立されたＡＡを逆転できるか否かを尋ねた。確立された疾患では、本発明者らは、局所ルキソリチニブ及び局所的トファシチニブが両方とも、治療された病変（背中の皮膚に適用される）において疾患を逆転させるのに非常に有効であることを見出した。ルキソリチニブ又はトファシチニブで処置したマウスにおいて、毛の完全な被覆が７週間の処置によって現れた。そして、本発明者らは、局所療法後１２週間以内に完全な毛の再生を観察した（図１４Ａ〜１４Ｂ）。局所療法は、処置された皮膚及びリンパ節におけるＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋ Ｔ細胞の著しく減少した割合（図１４Ｃ）と、ＡＬＡＤＩＮ転写シグニチャの正規化（図１４Ｄ）と、疾患の組織学的マーカーの逆転（図１４Ｅ）と、全ての処置されたマウスにおけるＧＥＤＩの修正と関連した。特に、腹部の未治療領域は脱毛症のままであり（例えば、図１４Ａ）、局所療法が局所的に作用したこと、及び観察された治療効果が全身吸収の結果ではないことを実証した。これらの効果は、治療の開始後早くも２〜４週間で視認され、且つ、治療の中止後２〜３ヶ月間持続した（図１４Ａ）。
ＡＡを有するヒト対象者におけるＪＡＫインヒビターの有効性を試験するために、本発明者らは、軽度から重度の疾患の３人の患者を、１日２回、２０ｍｇのルキソリチニブで経口的に処置した。ルキソリチニブは現在、造血成長因子受容体の下流に野生型及び突然変異体ＪＡＫ２シグナル伝達によって引き起こされる疾患である骨髄線維症の治療のためにＦＤＡ承認されている。さらに、乾癬における局所的ルキソリチニブを用いた小規模な臨床研究では、ＩＬ−１７シグナル伝達軸の中断に起因する抗炎症活性が実証されている。ルキソリチニブで治療した３人の患者の全ては、経口治療の３〜５ヶ月以内にほぼ完全な毛の再成長を示した（例えば、図１４Ｆ）。ベースライン時及び１２週間の処置後に得られた生検の比較は、減少した毛包周囲のＴ細胞浸潤と、ヒト白血球抗原クラスＩ及びクラスＩＩ発現の減少した毛包発現（図１４Ｇ）と、置後のＡＬＡＤＩＮ炎症性及び毛髪ケラチンシグニチャの正規化（図１４Ｈ及び１４Ｉ）と、を実証した。
Ｃ．考察
まとめると、当該データは、ＣＤ８＋ＫＧ２Ｄ＋ Ｔ細胞が、毛包の自己免疫攻撃の原因となる細胞溶解性エフェクターとして作用しながら、ＡＡ病原性を促進することを示唆している。本発明者らは、ＣＤ８ Ｔ細胞によって産生されたＩＦＮ−γは、ＩＬ−１５の更なる産生及びＩ型細胞自己免疫を促進するフィードフォワードループを誘導しながら、毛包における免疫特権の崩壊をもたらすと仮定する。ＪＡＫ１／２インヒビタールキソリチニブによる治療に対する少数のＡＡ患者の臨床反応は、この化合物、又は現在臨床開発中の他のＪＡＫタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤の将来の臨床評価がＡＡにおいて保証されると示唆している。
Ｄ．材料及び方法
マウス
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス株（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を全ての動物試験に使用した。雌マウスのみが使用された。脱毛症皮膚移植片のマウスレシピエントは、移植の時点で７〜１０週齢であった。予防実験のために、薬物投与は、移植の翌日に開始された。全身治療研究のために、マウスが毛を喪失してから約３ヶ月後に薬物投与を開始した。局所治療研究のために、薬物投与は、移植後２０週間に開始した。全ての動物処置は、コロンビア大学メディカルセンター機関動物管理及び使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われた。
ヒトの研究
全てのヒトの研究は、コロンビア大学医療センターの制度審査委員会の承認を受け、ヘルシンキ宣言の原則のもとに行われた。研究に含める前に、同意書を参加者から受け取った。
円形脱毛症における経口ルキソリチニブの臨床的評価
本発明者らは、コロンビア大学メディカルセンターの皮膚科の臨床試験ユニットにおいて、「中等度〜重度の脱毛症におけるルキソリチニブの有効性を評価するためのオープンラベルのパイロット試験」と題する単一試験実証実験臨床試験を開始した（clinicaltrials.gov識別子: NCT01950780）。
この初期パイロット研究の主要な有効性のエンドポイントは、ベースラインと比較して治療終了時に５０％以上の再増殖を達成したレスポンダーの割合である。二次エンドポイントは、連続変数として測定された治療中及び治療後の両方における育毛の変化；患者の包括的評価；クオリティオブライフ評価；及び治療中止後の応答の持続性；を包含する。
組み入れ基準は、ＳＡＬＴスコアで測定した円形脱毛症（ＡＡ）に起因する３０〜９５％脱毛；少なくとも３ヶ月の脱毛期間；再増殖について積極的なエビデンスなしに安定した脱毛；対象年齢１８〜７５歳；を包含した。
除外基準は、ＡＡ以外の活動的な頭皮疾患；ルキソリチニブに関連するリスクを増大させるかもしれない診療歴、例えば血液学的、感染性、免疫関連疾患又は悪性腫瘍など；ＡＡ応答に影響を与える可能性のあるいずれのモダリティによる現在の治療；ルキソリチニブと相互作用することが知られている薬物治療；妊娠；等；を包含した。
研究対象者は、少なくとも３ヶ月間、経口ルキソルチニブ２０ｍｇ ＢＩＤで処置される。この文書における患者は９０％以上の再生を達成した。ベースライン時及び１２週間の治療後に皮膚パンチ生検（４ｍｍ）を得た。
マウス処置、フローサイトメトリー、免疫染色及びウェスタンブロット分析に使用される抗体
これらの研究で使用される全ての抗体は、以下の表の形式で列挙される。
フローサイトメトリー分析は以下の抗マウス抗体を使用した：ＣＤ３（１７Ａ２，Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４（ＧＫ１．５，ＢＤ）、ＣＤ８α（５３−６．７，ＢＤ）、ＣＤ８β（ＹＴＳ１５６．７．７，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＮＫＧ２Ｄ（ＣＸ５，Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＮＫＧ２Ａ／Ｃ／Ｅ（クローン２０ｄ５，Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４４（ＩＭ７，ＢＤ）、ＣＤ４５（３０−Ｆ１１，ＢＤ）、ＣＤ４９ｂ（Ｄｘ５，ＢＤ）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４，ＢＤ）、ＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３，ＢＤ）、ＣＤ１０３（２Ｅ７，eBioscience）、ＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２，Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、グランザイムＢ（ＮＧＺＢ，eBioscience）、Ｒａｅ−１（１８６１０７，Ｒ＆Ｄ）。
マウス皮膚の免疫組織化学的研究のために、８μＭメタノール固定凍結皮膚切片を、以下のものを包含する一次ラット抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した：抗ＣＤ８（クローン５３−６．７）、ビオチン抗ＭＨＣクラスＩ（クローン３６−７．５）、抗ＭＨＣクラスＩＩ（クローンＭ５／１１４．１５．２）。ビオチン標識されたヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を二次抗体として使用した。免疫蛍光研究のために、抗−Ｈ６０（Ｒ＆Ｄ、クローン２０５３２６）、抗Ｐａｎ Ｒａｅ−１（Ｒ＆Ｄ、クローン１８６１０７）、抗ＫＧ２Ｄ（Ｒ＆Ｄクローン１９１００４）、抗ＩＬ−１５（ＳＣＢＴ、Ｈ−１１４）、抗ＩＬ−１５ ＲＡ（ＳＣＢＴ、Ｎ−１９）、抗Ｋ７１（Ａｂｅａｍ）、一次抗体を免疫蛍光において使用した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４結合(conjugated)ヤギ抗ラット、ロバ抗ウサギ又はロバ抗ヤギ抗体を二次抗体として使用した（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
ヒトの皮膚の免疫組織化学的研究のために、５μＭのホルマリン固定及びパラフィン皮膚切片を使用した。熱抗原回収後、皮膚切片を、以下のものを包含する一次抗ヒト抗体で染色した：抗ＣＤ８（Ａｂｃａｍ ａｂ４０５５）、抗ＣＤ４（Ｌｅｉｃａクローン１−Ｆ６）、ＨＬＡクラス１ ＡＢＣ（ＡｂｃａｍクローンＥＭＲ８−５）、ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰ／ＤＱ（ＳＣＢＴクローンＣＲ３／４３）。ＩｍｍＰＲＥＳＳ ＨＲＰ抗ウサギＩｇ又はマウスＩｇ（ペルオキシダーゼ）ポリマー（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ）を二次抗体として使用した。
ヒト毛包を顕微解剖し、切片化及び染色の前にＯＣＴ化合物に包埋した。８μＭのメタノール固定凍結切片を、ＩＬ−１５（ＳＣＢＴ，Ｈ−１１４）及び抗ＩＬ−１５ ＲＡ（ＳＣＢＴ，Ｎ−１９）又は抗ＩＬ−１５ ＲＢ（ＳＣＢＴ，Ｃ−２０）及びＣＤ８（ＳＣＢＴ，Ｃ８／１４４Ｂ）で染色した。続いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４結合二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。全ての画像は、ＳＤＲＣ Ｚｅｉｓｓ Ｅｘｃｉｔｅｒ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅで撮影した。
ウェスタンブロッティングのために、処置されたサンプルを４〜１２％ＳＤＳＰＡＧＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で溶解し(resolved)、次いでＷｅｓｔｒａｎ ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。ブロットを、以下の抗体（Ａｂ）（全てＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）でプローブした：抗ホスホＳＴＡＴ１（Ｔｙｒ７０１）、抗ホスホ−ＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）、抗ＳＴＡＴ１及び抗ＳＴＡＴ５。
in vivo治療のための抗体
Figure 2018526362
フローサイトメトリー用抗体(１／１００希釈)
Figure 2018526362
免疫染色及びウェスタンブロット用抗体（別段記載がなければ１／１００希釈）
Figure 2018526362
Figure 2018526362
Figure 2018526362
ＳＴＡＴ，ＳＴＡＴ５、ｐＳＴＡＴ１及びｐＳＴＳＴ５ab’はウェスタンブロットのために１／１０００希釈された。
ＩＬ−１５及びＩＬ−１５ＲＡ染色ブロッキング試薬
Figure 2018526362
ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析
ＨｉＳｅｑ ２０００シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）上で５０サイクルにわたってサンプルを配列決定した。ＲＮＡ−Ｓｅｑファイルは、ロックフェラー大学ゲノミクスコア施設によって多重分離された(demultiplexed)。サンプルｆａｓｔｑファイルの品質管理は、ｆａｓｔｑｅを使用して実行した。転写物をｉＧｅｎｏｍｅからＵＣＳＣ ｍｍ９参照ゲノムにマッピングするため、ＴｏｐＨａｔを使用した。ＵＣＳＣ ｍｍ９のこのｉＧｅｎｏｍｅバージョンでパッケージ化されたＲｅｆＳｅｑ遺伝子注釈が使用された。ＴｏｐＨａｔ ｂａｍファイルを、ｅｄｇｅＲで、発現差異の下流解析のための入力として使用できるカウントに変換するため、ＨＴＳｅｑパッケージからのｈｔｓｅｑ−ｃｏｕｎｔユーティリティを使用した。存在しない遺伝子が除去され、そして、下流解析においてゼロ除算を避けるため、１の疑似カウントが加えられた。３つの生物学的複製を有するマッチドペア設計を用いて発現差異がある遺伝子を同定するため、ＥｄｇｅＲを使用した。
マイクロアレイ解析
品質管理、前処理
マウスの場合、ｃＤＮＡサンプルをＭｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ ４３０ ２．０遺伝子チップにハイブリダイズさせ、及び続いて洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリンで染色し、及びＨＰ ＧｅｎｅＡｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）でスキャンした。ヒトの場合、増幅したｃＤＮＡをヒトゲノムＵ１３３プラス２．０遺伝子チップにハイブリダイズさせた。
マイクロアレイ品質管理及び前処理は、ＲにおいてＢｉｏＣｏｎｄｕｃｔｏｒを用いて行った。３つの実験、
１）自発性ＡＡマウス対正常マウス、
２）３つの処置による予防マウス対プラセボ及び擬似手術マウス、及び
３）２つの処置のための処置マウス対プラセボ、
の予備処理を、同じパイプラインを用いて別々に実施した。
品質管理はｈｔｔｐ：／／ａｒｒａｙａｎａｌｙｓｉｓ．ｏｒｇ／のａｆｆｙａｎａｌｙｓｉｓＱＣパッケージを使用して実施した。ＡｆｆｙａｎａｌｙｓｉｓＱＣは、Ｒ／ＢｉｏＣｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージ、即ち単一スクリプト内でＱＣを実行するため、ａｆｆｙ、ａｆｆｙｃｏｍｐ、ａｆｆｙｐｄｎｎ、ａｆｆｙＰＬＭ、ａｆｆｙＱＣＲｅｐｏｒｔ、ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓ、ｂｉｏＤｉｓｔｍ ｂｉｏｍａＲｔ、ｓｉｍｐｌｅａｆｆｙ、及びｙａｑｃａｆｆｙ、を使用する。ＲＭＡの正規化は、各実験群ごとに別々に行った。予防実験にはＣｏｍＢａｔを用いたバッチ効果補正が必要であった。バッチ、処置及び時点は、各処置群効果を時間とともに一定として処理し、且つ、処理及び時間の両方を反映する群におけるＰＢＳコントロールをグループ化することによりモデル化した。
マウス皮膚サンプルに対して行われた前処理に加えて、ヒト皮膚サンプルの画像欠陥を補正するため、Ｈａｒｓｈｌｉｇｈｔを使用した。
データの寄託(deposition)
マイクロアレイ及びＲＮＡ−ｓｅｑデータは、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）、受入番号ＧＳＥ４５６５７、ＧＳＥ４５５１２、ＧＳＥ４５５１３、ＧＳＥ４５５１４、ＧＳＥ４５５５１及びＧＳＥ５８５７３において寄託された。
遺伝子シグニチャの同定
発現差異解析(differential expression analysis)
異なる(differential)遺伝子発現の初期分析を、ｌｉｍｍａを用いた自発的マウス３×３及びヒト５×５データセットに対して行った。１．５倍率変化(fold change)の閾値及び０．０５の未調整のｐ値。
無監督の分析
階層的クラスタリングは、閾値ａｂｓ（ｌｏｇＦＣ）＞１、未調整ｐ値＜＝０．０５を満たしたヒト５×５由来の３６３遺伝子及び自発的マウス３×３由来の５８３遺伝子に対して、クラスタを用いて行った。遺伝子は、中央値に集中し(median centered)、且つ、正規化されていた。類似性尺度としてＳｐｅａｒｍａｎ順位相関を使用し、そして、列(row)（遺伝子）及び行(column)（サンプル）のクラスタリングを行うため、平均連結法を使用した。階層的クラスタの可視化は、Ｊａｖａ（登録商標） ＴｒｅｅＶｉｅｗを使用して行った。自己組織化マップアルゴリズムで同定された「メタ遺伝子」がサンプルによってどのように異なるかを視覚化するため、遺伝子発現ダイナミックインデックス（ＧＥＤＩ）分析を使用した。メタ遺伝子は、サンプルにわたって同様の発現パターンを示し、且つ、２次元グリッド内の単一ピクセルに割り当てられる遺伝子のクラスタである。
ＲＴ−ＰＣＲ検証
ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ヒト及びマウスにおける予測された発現差異のある遺伝子を確認した。２：１ランダムプライマー（製造業者の指示に従ってＯｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマー及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の比を使用して、１本鎖ｃＤＮＡ(first-strand cDNA)を合成した。ｑＲＴ−ＰＣＲをＡＢＩ ７３００装置で行い、そして、ＡＢＩ相対定量試験ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）で分析した。プライマーはＡＢＩガイドラインに従って設計し、全ての反応は、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、２５０ｎＭプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２０μＬ反応体積中の２０ｎｇ ｃＤＮＡを使用して行った。次のＰＣＲプロトコルを使用した：ステップ１：５０℃で２分間；ステップ２：９５℃で１０分間；ステップ３：９５℃で１５秒；ステップ４：６０℃で１分間；ステップ３及び４を４０サイクル繰り返す。全てのサンプルを、３回の独立した実行のために４回繰り返し、そして示されているように内因性内部コントロールに対して正規化した。
ＡＬＡＤＩＮスコア
二変量スコア統計を展開するため、ＩＦＮ及びＣＴＬシグニチャを使用した。個々のシグニチャＩＦＮ及びＣＴＬスコアは、ヒトＳＬＥで使用された手順に従って決定された。ＩＦＮシグニチャ及びＣＴＬシグニチャを含むように選択された遺伝子のセットは、ＣＴＬシグニチャについてはＣＤ８Ａ、ＧＺＭＢ及びＩＣＯＳであり、ＩＦＮシグニチャについてはＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＳＴＡＴ１及びＭＸ１であった。予防マウスのスコアは、偽マウスに関して計算した一方、局所治療実験のスコアは、０週目の全サンプルに対して計算した。ヒトの研究に基づいて、ＡＬＡＤＩＮは、毛髪ケラチン（ＫＥＲ）シグニチャを包含するようにさらに拡張された。ＫＥＲシグニチャを含むように選択された遺伝子のセットは、ＤＳＧ４、ＨＯＸＣ３１、ＫＲＴ３１、ＫＲＴ３２、ＫＴ３３Ｂ、ＫＲＴ８２、ＰＫＰ１及びＰＫＰ２である。経口ルキソリチニブ臨床試験に登録された対象者から得られたベースライン及び１２週の皮膚生検の場合のＡＬＡＤＩＮスコアを、ベースラインにおける健常コントロールと比較して計算した。
検定力(power)分析
処置に対する応答の分析のために、本発明者らは、処置に応答することが予想される集団１（処置群）の真の割合が０．９５である場合、及び応答が期待される集団２（プラセボ群）の真の割合が０．２０である場合、処置群及びプラセボマウスについて、それぞれ５つの群サンプルサイズについて、比率検定力(power)計算について２つのサンプルの比較を行った。有意水準α＝０．０５において、Ｂａｒｎａｒｄの正確な検定を用いて、本発明者らは、２つの集団の割合が０．９５及び０．２０であり、グループのサンプルサイズが各々５に等しい場合に、比率の差を検出する片側検定について０．８０３の累乗を計算した。１実験につき１群当たり５匹未満の動物が存在するいくつかの例では、統計力を保証するために多数の(multiple)実験が崩壊した。
治療効果の統計的分析
マウスは、脱毛皮膚の移植の４〜１２週間後に脱毛症を発症することが予想された。コントロールマウスが８週間まで脱毛を示さなかった実験は中止された。予防実験のために、区間打ち切り(interval censored)データについての時間対イベント生存分析を実施した。ログランクテストを実施するため、Ｒのsurvival及びintervalパッケージを使用した。育毛指数(hair growth index)を算出した。
治療実験（図１４Ｂ）について、時間相互作用による治療が存在するという仮説を試験するため、ＲパッケージｎｐａｒＬＤを使用した。分析は、各処置からの３匹のマウス及び各群からの合計９匹のマウスのプラセボ群を含む３回の反復実験からの育毛指数を用いて行った。Ｆ１−ＬＤ−Ｆ１設計を採用した。ＪＡＫ１／２ｉ治療対プラセボの場合、相互作用のない仮説、すなわち平行時間プロファイルは、Ｗａｌｄ−Ｔｙｐｅ統計及びＡＮＯＶＡ−Ｔｙｐｅ統計値の両方を使用する５％レベルにおいて拒絶される。ここで、ｐ値はそれぞれ４．４０ｅ−２１及び３．３５ｅ−１８である。ＪＡＫ３ｉ治療対プラセボの場合、相互作用のない仮説、すなわち平行時間プロファイルは、Ｗａｌｄ−Ｔｙｐｅ統計及びＡＮＯＶＡ−Ｔｙｐｅ統計値の両方を使用する５％レベルにおいて拒絶される。ここで、ｐ値はそれぞれ１．４５ｅ−３０及び２．４２ｅ−２１である。
全てのマウスは、生存（時間対イベント）分析統計に含められた。リンパ節及び皮膚細胞分析の場合、コントロールマウスと並行して処置後の指示された時点で生検を採取した。ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２中和実験において、脱毛を示さなかった５匹のコントロールマウスのうちの１匹が写真に含まれていなかった。これらのマウスは、脱毛のモニタリングを継続するために犠牲にされなかったが、皮膚細胞分析の統計的目的のために、これらの未分析サンプルには、処置されたマウスとの厳密かつ控えめな統計的比較を可能にするため、０％ＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋細胞の細胞カウント値が割り当てられた。
ランダム化は使用されず、実験中又は結果を評価する際に研究者はグループ割り当てに盲目化されなかった。
独立した(unpaired)パラメトリックな両側ｔ検定を用いて、治療群と未治療群との間の平均及び頻度の差異を試験した。統計的目的のために、本発明者らは、全ての変動(variances)が各群について同じであると仮定する。
イベント生存分析までの全ての時間(all time)を実施するため、期間打ち切りログランク（log-rank）検定を使用した。この検定では、正確なイベント時刻がわからないがイベントがある間隔内にあることが分かっているデータを適切に説明する。
ノンパラメトリックな縦方向データ分析を用いて、応答ｘ時間相互作用について試験した。これらの方法は、小さなサンプルサイズに特に適している。
サンプルサイズ、複製数、及び実験間の統計的試験
Figure 2018526362
in vivo研究では、データは累積データとして提供される。上記のように複製数が提供される。例えば、「３＋３＋３＋３」は、３つの実験マウスを包含する４つの別々の実験を指す。in vitro研究のために、実験を３回行った。
６．３ 実施例３
要約
円形脱毛症（ＡＡ）は、１．７％の生涯リスクをもつ、米国で非常に頻繁な自己免疫疾患である。しかしながら、ＡＡは皮膚科学において未だに満たされていない必要性であり続けており、治療法は欠けている。ヤヌスキナーゼインヒビターは、ごく最近ではＡＡを含む、多くの自己免疫状態のための潜在的な治療法として浮上している。本発明者らは、ＡＡについて、有意な毛の再生（regrowth）、並びに同時に起こる皮膚及び血液のバイオマーカーの変化をもたらす、優先的な（preferential）ＪＡＫ３／ＪＡＫ１インヒビターである経口トファシチニブクエン酸塩で処置を受けた患者を報告する。本発明者らは、円形脱毛症の有効なトファシチニブ処置は、循環中の血清ＣＸＣＬ１０レベルと同様に、皮膚におけるＡＡ関連遺伝子の発現の変化を伴うであろうと仮説した。パンチ生検は、ベースラインにおいて、及び４週間の処置後に採取された。全ＲＮＡは、抽出され、逆転写され、増幅され、ビオチン化され、次いでＨｕｍａｎ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０遺伝子チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）にハイブリダイズされた。ＡＬＡＤＩＮスコアは、ベースラインにおける健常コントロールと比較して、先に記述されたように計算した。トファシチニブ処置の開始前及び４週間の処置後に採取された採取血液（blood draws）からの血清は、製造業者の指示に従ってＨｕｍａｎ ＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０ ＥＬＩＳＡキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して、製造者の指示に従ってＣＸＣＬ１０レベルについて評価された。
結果
持続性で中等度／重度のＡＡを有する４０歳の白人女性が、ＡＡに対する経口トファシチニブの有効性を試験するために、オープンラベルパイロット研究に登録された（https://clinicaltrials.gov/NCT02299297）。彼女のＡＡは、登録の５年前から彼女の頭皮上に始まり、１年以内に妊娠の状況（setting）において完全に解決された。出産から数ヶ月後、彼女のＡＡは斑状の疾患として再発した。局所コルチコステロイド、アントラリンクリーム及び病変内コルチコステロイドによる処置には、限定的な利益があった。彼女のＡＡは、全ての体肢、睫毛及び眉毛に斑状の頭皮の波及を伴うまで進行し、臨床試験への彼女の登録まで安定したままであった（図１５）。彼女の過去の病歴は平凡なものであり、彼女はＡＡの家族歴を否定した。
その患者は、１日２回のトファシチニブ５ｍｇを用いて治療を開始した。斑状の再生は１ヶ月目に認められた。２ヶ月及び３ヶ月の処置の後、彼女の頭皮の毛の再生はそれぞれ６２．５％及び９４％であった。彼女の眉毛及び睫毛の有意な再生が認められた。頭皮の毛の再生は、処置開始後４ヶ月でほぼ完全であった（図１５）。有害事象は報告されておらず、彼女の全血球数、全代謝パネル（complete metabolic panel）又は脂質プロファイルにおける検査異常（laboratory abnormalities）もなかった。トファシチニブによる処置の中断は、ほぼ完全な脱毛を結果としてもたらした（図１６）。
頭皮のパンチ生検（図１７）及び血液採取は、血液の採取を行い、遺伝子発現及びバイオマーカーの変化を観察（monitor）するために、ベースラインにおいて、及び４週間の処置後に実行された。ＡＡ皮膚において高レベルで見出されるインターフェロン（ＩＦＮ）誘発ケモカインであるＣＸＣＬ１０の血清レベルは、４週間の処置後に減少した（図１７）。加えて、マイクロアレイ解析が皮膚生検サンプルに対して実行された。ＡＡ疾患活性係数（ＡＬＡＤＩＮ）に基づいて、患者は、ベースラインにおいて高いＩＦＮ及び細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）シグニチャを示し、それは、正常コントロールのレベルまでではないが、４週間の処置によって低下した（図１７）。
結論
円形脱毛症は、免疫機能を有する遺伝子に極めて接近した遺伝子座との強い関連性を有する自己免疫疾患である。疾患の病態形成に寄与し得る候補免疫経路を標的とすることは、研究の活発な領域であり、ＪＡＫインヒビターは、ＡＡに関わる複数の免疫シグナル経路を標的とする。本発明者らは、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおけるＡＡの移植モデルにおいて、全身及び局所のトファシチニブが、ＡＡの発症を予防すること及び確立されたＡＡを逆転させること（reversing）に有効であることを、先に示した。本発明者らは、ここで、ベースラインに比較して小さくされたＡＬＡＤＩＮプロファイルと相関する、持続性の斑状ＡＡを有する人間の対象者の有効な処置を報告する。
６．４ 実施例４
要約
円形脱毛症（ＡＡ）は１．７％の生涯リスクをもつ一般的な自己免疫疾患であり、円形脱毛症（ＡＡ）に関してＦＤＡに承認された処置法がない。本発明者らは、ヒト及びマウスのＡＡ皮膚における細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）内の優勢なＩＦＮｇ転写シグニチャを先に同定し、ＪＡＫインヒビターによる処置は、この経路を標的とすることによってマウスにおいて耐久性のある毛の再生を誘導することを示した。ここで、本発明者らは、中等度から重度のＡＡを有する患者の処置における経口ＪＡＫ１／２インヒビタールキソリチニブの使用を研究した。
本発明者らは、３‐６ヶ月の処置にわたって経口ルキソリチニブ２０ｍｇＢＩＤを使用して、中等度から重度のＡＡを有する１２名の患者のオープンラベル臨床試験を開始し、３ヶ月間のフォローアップ薬物離脱（follow-up off drug）が続いた。主要なエンドポイントは、ベースラインから処置の終了までの毛髪の再生が５０％又はそれ以上の被験者の割合であった。
１２人の患者のうちの９人（７５％）が、処置に対する顕著な応答を示し、処置の終了時において９２％の平均の毛髪の再生であった。安全パラメータは大部分が正常限度内にとどまり、深刻な有害作用は報告されなかった。遺伝子発現プロファイリングは、ＣＴＬ及びＩＦＮ応答遺伝子に関するシグニチャを含む、処置に関係する炎症性マーカーのダウンレギュレーション、並びに毛特異的マーカーのアップレギュレーションを明らかにした。
このパイロット研究において、ルキソリチニブをもちいて処置された１２人の患者のうちの９人（７５％）が、有意な頭皮の毛の再生及びＡＡの改善を示した。ＡＡの処置におけるルキソリチニブの安全性及び有効性を更に評価するためには、より大きな無作為化比較試験が必要とされる。
はじめに
円形脱毛症（ＡＡ）は、重要な医学的問題であり、米国で最も頻繁な自己免疫疾患であり、生涯リスクは１．７％である。ＡＡは全ての民族にわたって両性に影響を与え、アンドロゲン性脱毛症のみに次いで、ヒト脱毛症の２番目に最も一般的な形態に相当する。ＡＡは通常、斑状の脱毛を示す。これらの患者の３分の１が、最初の１年以内に自然寛解を経験するであろう。しかし、多くの患者の疾患は、完全脱毛症（ＡＴ、全頭皮の脱毛）又は汎発性脱毛症（ＡＵ、全身の毛の喪失）に進行するであろう。持続性で中等度／重度のＡＡは、罹患した個人に対して、有意な外見への影響及び精神的苦痛を引き起こす。臨床上の実践において、ＡＡのためのエビデンスベースの処置は存在しないが、様々な処置が提供されており、最も一般的には局所ステロイド及び病変内ステロイドが提供され、それらは限定的な有効性をもつ。
最近の研究は、インターフェロンγを産生するＮＫＧ２Ｄを有するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって媒介される、ＡＡの病態形成におけるＩ型細胞性免疫の支配的役割を実証した。Ｉ型細胞性免疫の中心的役割はまた、ＩＦＮ応答遺伝子及びＣＴＬシグニチャによって支配される、ヒト及びマウスにおけるＡＡ病変皮膚の転写状況（transcriptional landscape）にも反映される。これらの知見は、ＡＡにおけるＪＡＫ１／２キナーゼを治療的に標的とするための理論的根拠を提供し、実際に、本発明者らは、ＪＡＫインヒビターによる処置はＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおいてＡＡを逆転させ、皮膚におけるＩ型炎症応答をなくすことを示した。
前臨床的知見に基づいて、本発明者らは、中等度から重度のＡＡにおけるフェーズ２有効性シグナル追求臨床試験を開始し、骨髄増殖性疾患の処置に関して現在ＦＤＡに承認されているＪＡＫ１／２インヒビターである、経口ルキソリチニブによる処置に対する臨床的及び免疫病理学的応答を評価した。
方法
研究デザイン、監督、参加者
研究は、コロンビア大学の調査チームによって考案され、実施された。全ての著者はデータへのアクセスを持ち、その正確性とこの報告書の研究プロトコルに対する忠実度を証明した。この研究は、ハーモナイゼーションに関する国際会議（ＩＣＨ）によって規定されるような、優良臨床試験基準（ＧＣＰ）に従い、且つ欧州連合指令２００１／２０／ＥＣ及び米国連邦規則、タイトル２１、パート５０（２１ＣＦＲ５０）の根底にある倫理原則に従って、実施された。研究開始に先立って、プロトコル及び全ての研究関連材料についてコロンビア大学ＩＲＢから承認が得られた。スクリーニング又は研究関連手順の前に、自由に与えられた書面によるインフォームドコンセントが全ての被験者から得られた。規則遵守及びＩＲＢ承認プロトコルへの固守のための監視は、コロンビア大学臨床試験室及び外科規則チームの部門によって実行された。研究は、開始前にｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖに登録された。本発明者らは、中等度から重度のＡＡ（３０−９５％の脱毛）を有する１０人の患者及びＡＴ又はＡＵを有する２人の患者を含む、１２人の成人患者を登録した。
研究評価及び予後（Outcomes）
研究の主要な有効性エンドポイントは、標準化され、検証されたＡＡにおける脱毛を推定するための方法である、脱毛症の重症度ツール（ＳＡＬＴ）スコアによって評価されるベースラインに比較して少なくとも５０％の再生を達成しているそれらの被験者として定義される、処置の終了時におけるレスポンダーの割合であった。副次的な有効性エンドポイントは、連続変数として毛髪の再生を含んでいた。加えて、生活習慣測定（皮膚科学生活の質指標‐ＤＬＱＩ及びＳｋｉｎｄｅｘ）は、規則的な予め指定された間隔で行われたが、実行された比較において統計的差異を示さなかった（データは示されていない）。応答耐久性（response durability）を評価するために、レスポンダーは、処置か完了した後に３ヶ月間にわたって追跡された。安全性分析は、少なくとも１回のルキソリチニブの投与を受け、記載されたように毎月の訪問時に観察された全ての被験者に関して、副次的なエンドポイントとして含まれていた。
除外基準
患者が３ヶ月未満のＡＡを有する場合；活動的、不安定なＡＡ又は再生するＡＡを有する場合；毛髪の再生に影響を与える可能性のある（登録に先立って１ヶ月以内に）併用処置を受けていた場合；又は患者が根底にある感染、悪性腫瘍、免疫不全又は不安定な医学的状態の証拠を有していた場合に、その患者は除外された。また、頭皮上に付随する皮膚疾患を有する患者；又は先月の内又は薬物の半減期の３倍の内に実験的な薬物療法を受けている患者も、除外された。最近又はＤＭＡＲＤｓ（疾患修飾性抗リウマチ薬）の使用を報告している患者は、除外された。
有害作用
有害事象は、その事象が研究処置と因果関係を有すると考えられたかどうかに関わらず、治験薬の少なくとも１回の投与を受けた患者における、任意の新しい不都合な（untoward）医学的な出来事（徴候、症状又は異常な検査所見）、又は既存の医学的状態の悪化として分類された。有害事象は、毎月の訪問時に評価された。患者はまた、心配な新しい兆候又は症状を発症した場合には、訪問の間に研究センターに接触することも奨励された。数人の患者が最初に白血球数の緩やかな減少を発症したが、レベルは正常限界内に留まり、したがって用量調整（dose adjustment）は要求されなかった。１人の患者がヘモグロビンレベル低下を発症し、それは用量変更を要求した。血小板数の有意な減少は観察されなかった。１人の患者が、発疹／膿瘍の２回のエピソードを発症した。両方のエピソードは、患者の主治医によって評価され、その患者が調査チームによって評価される前に解決された。同患者はまた可能性のある生検部位の感染を報告し、そのために彼女は医学的な配慮を求め、国外で経口抗生物質による処置を受けたと報告されている。数人の患者は、季節性で薬物とは無関係であると思われる軽度のＵＲＩｓを発症した。１人の患者は、胸部Ｘ線で確認された肺炎の軽度のエピソードを有し、これは経口抗生物質によって処置された。この患者は、研究参加の数年前に肺炎のエピソードの遠い病歴を有していた。臨床的に有意な低下した血小板の発生は観察されなかった。肝臓の異常は認められなかった。１人の患者は、ベースライン時及び処置中に脂質の上昇を有した。彼は、研究薬物に接する間彼の主治医によって監視され、脂質レベルに関連する臨床的に明らかな有害作用を有しなかった。２人の患者は、座瘡又は頭皮の毛包炎と一致する病変を発症した。両方のエピソードは、数週間で解決された。３人の患者は、下痢を含むＧＩ症状を有した。１人の患者は、予め計画された眼科手技に続く結膜出血（手技の一般的に見られる副作用）及び一過性の痔核出血を発症した。血小板の循環レベルに付随する変化はなかった。数人の患者は、尿分析／顕微鏡検査で軽度の異常を有していた。１人の患者は、尿路感染症のために処置を受けた。
バイオマーカー評価及び臨床相関的研究
生検及び末梢血は、免疫監視及び分子研究のために、ベースライン及び１２週間後に得られた。数人の患者は処置の過程で中間の時点で追加的な生検を提供し、１人の患者は２４週で追加的なサンプルを提供した。組織標本は固定され、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓに保存された。全ＲＮＡは、ＰＡＸｇｅｎｅ組織ｍｉＲＮＡキットを使用して、臨床試験の過程で採取された皮膚生検標本から抽出された。ライブラリー調製は、Ｏｖａｔｉｏｎ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｖ２及びＢｉｏｔｉｎ Ｅｎｃｏｒｅ Ｋｉｔｓ（ＮｕＧｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）を使用したマイクロアレイ解析のために実行された。続いて、サンプルは、ヒトゲノムＵ１３３プラス２．０チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）にハイブリダイズされ、Ｙａｌｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓにおいてスキャンされた。３人の健常コントロールからの皮膚生検から抽出されたＲＮＡのライブラリー調製及びマイクロアレイハイブリダイゼーションは、処置された患者からのサンプルと一緒に合計３１のサンプルについて実行された。遺伝子発現解析は、ＡＬＡＤＩＮスコアの計算、遺伝子発現シグニチャの同定のための発現レベルの発現差異解析、主成分分析、及びＡＬＡＤＩＮスコアの統計解析を含んだ。３１のサンプルからのマイクロアレイデータは、受入番号ＧＳＥ８０３４２でＧＥＯに寄託されている。
マイクロアレイの前処理及び品質管理
マイクロアレイの品質管理及び前処理は、ＲにおけるＢｉｏＣｏｎｄｕｃｔｏｒを使用して実行された。品質管理は、ｈｔｔｐ：／／ａｒｒａｙａｎａｌｙｓｉｓ．ｏｒｇからのａｆｆｙＡｎａｌｙｓｉｓＱＣのＲスタンドアロンバージョンを使用して実行された。
本研究からの３１に含まれたサンプルと、加えてＧＥＯ受入番号ＧＳＥ５３５７３からの健常コントロールからの３つの追加的なサンプルは、ＧＣＲＭＡを使用して一緒に正規化された。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットは、Ｒ内に実装されるＭＡＳ５アルゴリズムを使用してａｆｆｙＡｎａｌｙｓｉｓＱＣによって存在又は不在であると呼ばれた。Ｘ又はＹ染色体上にあったプローブセットＩＤｓ（ＰＳＩＤｓ）、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘコントロールプローブセットであったＰＳＩＤ、又はＧｅｎｅ Ｓｙｍｂｏｌ注釈をもたないＰＳＩＤは、更なる下流分析のための全てのアレイから除去された。データは、発現レベルについてｌｏｇ２（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を使用して解析された。
バッチ効果修正は、ＡＬＡＤＩＮスコアの計算のため及び発現差異解析における向上した検定力（increased power）のために以前のデータセットＧＳＥ５８５７３からの３つの健常コントロールサンプルを含めるために要求された。改変されたバージョンのＣｏｍＢａｔ（Ｍ‐ＣｏｍＢａｔ）は、以前のＧＥＯデータセットからの正常のサンプルを統合するために使用された。ＧＳＥ５８５７３からの３つの健常コントロールサンプルを現在の健常コントロールサンプルと統合するためにＭ‐ＣｏｍＢａｔが使用された間、現在のデータセットからのサンプルの発現レベルは、固定されて保持された。Ｍ‐ＣｏｍＢａｔは、バッチのうちの１つが基準バッチ（reference batch）として使用されることを可能にする、ｓｖａパッケージにおいてＣｏｍＢａｔが利用可能な機能の実装である。
ＡＬＡＤＩＮスコアの計算
ＡＬＡＤＩＮスコアは、バッチ修正された発現データを使用して、全３４サンプルについて計算された。ＣＴＬ、ＩＦＮ及びＫＲＴ ＡＬＡＤＩＮスコアは、先に概説された手順に従って決定された。ｚ−スコアは、簡潔に述べると、各ＰＳＩＤについて正常コントロールの平均及び標準偏差と比較して計算される。各遺伝子のスコアは、その遺伝子へのＰＳＩＤｓマッピングのｚスコアを平均することによって得られる。次いで、シグニチャスコアは、対応するシグニチャに属する遺伝子についてのスコアの計算された平均である。
遺伝子発現シグニチャの同定
正常コントロール（ｎ＝６）と共にベースラインにおけるルキソリチニブサンプル（ｎ＝１２）対する更なる分析を実行するために、ＰＳＩＤｓは、１８サンプルの少なくとも１つに存在すると呼ばれた特徴のみを保持するように、更にフィルタリングされ、３６１４７個のＰＳＩＤｓが更なる下流解析のために残った。
ルキソリチニブ処置に応答した患者からの、時間ｔ＝０及びｔ＝１２におけるペアリングされたサンプルのフィルタリング
ＱＣの後、ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ治療に応答した、ｔ＝０及びｔ＝１２の両方にマイクロアレイデータを有する８人の患者がいた。ＰＳＩＤｓは、１６サンプルのうちの少なくとも１サンプルに存在すると呼ばれた特徴のみを保持するように、更にフィルタリングされ、３５５６３個のＰＳＩＤｓが更なる発現差異解析のために残った。
発現差異解析
発現差異解析は、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒのｌｉｍｍａパッケージ内に実装された線形モデルを用いて、ｔ＝０且つ正常コントロールからのサンプルに対して、及び、レスポンダーからの、ｔ＝０及びｔ＝１２からのペアリングされたデータに対して実行された。２．０倍の変化の閾値及び０．０５の未調整のｐ値が使用された。
比較は、ベースラインにおけるレスポンダーと正常コントロールとの間、レスポンダーとベースラインにおける非レスポンダーとの間、ベースラインにおける非レスポンダーと正常コントロールとの間、ベースラインにおけるレスポンダーと１２週間の処置におけるレスポンダーとの間、並びに、最後に１２週間の処置におけるレスポンダーと正常コントロールとの間で行われた。
ｔ＝０及びｔ＝１２における６人の健常コントロール及びルキソリチニブ処置患者の主成分分析
主成分分析は、ベースラインにおけるレスポンダーと正常コントロールとの間で差次的に発現されたＰＳＩＤｓからなるレスポンダーシグニチャを使用して、ベースライン及び１２週間において６人の健常コントロール及びルキソリチニブ処置患者からのサンプルに対して実行された。
統計解析
全ての変数は、分布仮定のために検討され、精度及び範囲外の値についてチェックされた。先験的な定義（priori definition）に基づいて、本発明者らは、処置の終了時のＳＡＬＴスコアに基づいて、彼女ら及び／又は彼らがベースラインから５０％又はそれ以上の毛髪の再生を経験した場合に、患者をレスポンダーとして分類した。本発明者らは、人口統計学的要因の全体的な分布を検討し、レスポンダーと非レスポンダーとの間の可能性のある差異を調べ、カテゴリー変数についてフィッシャーの正確確率検定（Fisher’s Exact Test）（両側性）を使用し、連続変数についてマン・ホイットニーのＵ検定（Mann-Whitney U test）を使用して有意性について試験した。次いで、本発明者らは、マン・ホイットニーのＵ検定又はウィルコクソン符号順位検定（Wilcoxon Signed Rank test）のいずれかを採用して、関連する変数全体に対して、及びレスポンダー及び非レスポンダーについて、ベースライン、処置の終了時（ＥＯＴ）及び試験終了（ＥＯＳ）のスコアの間の変化を検討した。時間にわたる再生の程度を推定するために、本発明者らは、反復測定データをモデル化するための一般化推定方程式（Generalized Estimating Equation）及び混合モデルアプローチの両方を考慮し、ＧＥＥの強い正規性（normality）仮定及び比較的小さな例数を前提として後者を選択した。これらの混合モデルについて、本発明者らは、ベースラインから処置の終わりまでの再生を最初にモデル化し、ここでは時間（週）が独立変数であった。次いで、本発明者らは、観察された効果の維持を評価するために、処置の終わりから研究の終りまでの再生をモデル化し、ここでも同様に時間が独立変数であった。両方のモデルにおいて、本発明者らは、初期共分散構造として化合物対称性を特定した。
ＡＬＡＤＩＮスコアの統計解析
レスポンダー及び非レスポンダー、レスポンダー及び正常コントロール並びに非レスポンダー及び正常コントロールにおけるＣＴＬ、ＩＦＮ及びＫＲＴ ＡＬＡＤＩＮスコアのそれぞれの間の可能性のある差異を検討するために、本発明者らは、Ｒにおけるcoinパッケージに実装されるようなウィルコクソン順位和検定（Wilcoxon Rank Sum tests）が続く、クラスカル・ワリス検定を使用して、３つの群の間の差異について試験した。次いで、本発明者らは、Ｒにおけるcoinパッケージに実装されるようなウィルコクソン符号順位検定を使用して、レスポンダーについて、ベースラインと１２週におけるＡＬＡＤＩＮ値との間の変化を検討した。本発明者らは、１２週におけるレスポンダーと正常コントロールとの間の３つのスコアの差異について更に試験した。
ＡＬＡＤＩＮスコアは、平均ＣＴＬ、ＩＦＮ及びＫＲＴスコアがゼロに等しくなるように定義され、平均全体（全患者）スコア、レスポンダーのみのスコア、及び非レスポンダーのみのスコアをもたらし、これらの平均差及び通常のコントロールに対応する。統計的に有意な差異は、ベースラインにおける全体スコア対正常コントロールの間ではＣＴＬ（ｐ＜０．０００２）、ＩＦＮ（ｐ＜０．００５）及びＫＲＴ（ｐ＜０．０００２）スコアにおいて観察され、ベースラインにおけるレスポンダーのみ対正常コントロールの間ではＣＴＬ（ｐ＜０．０００４）、ＩＦＮ（ｐ＜０．０００４）、及びＫＲＴ（ｐ＜０．００４）において観察され；１２週における全体スコア対正常コントロールの間ではＣＴＬ（ｐ＜０．０４）及びＩＦＮ（ｐ＜０．０００４）において観察され；また、
レスポンダーのみ対正常コントロールとの間では、アルファ＝０．０５でＫＲＴ（ｐ＜０．０００７）において観察された。ベースラインにおける全体対正常コントロールにおけるＩＦＮスコアにおいて；又は、１２週におけるレスポンダーのみ対正常コントロールにおけるＣＴＬ及びＩＦＮスコアにおいて、統計学的に有意な差は観察されなかった。３つのＡＬＡＤＩＮスコアのいずれにおいても、ベースラインにおける非レスポンダーと正常コントロールとの間に統計学的に有意な差は観察されなかった。
ベースラインと１２週との間で、個別の患者におけるＡＬＡＤＩＮスコアの変化が評価された。統計的に有意な差は、全体のベースラインと１２週目との間でＣＴＬ及びＩＦＮスコアにおいて観察され、ＫＲＴスコアは限界的有意性（marginal significance）（α＝０．０５）に到達しつつあった。ＣＴＬスコアは８．３０から１．５１に低下し（ｐ＜０．００４）、ＩＦＮスコアは３１．０８から−０．３７に低下し（ｐ＜０．００４）、ＫＲＴスコアは−３９．３６から−１５．０２に増加した（ｐ＝０．０５４）。レスポンダーのみの間では、ＣＴＬスコアは９．３７から１．６に低下し（ｐ＜０．００８）、ＩＦＮスコアは３８．３７から０．２４に低下し（ｐ＜０．００８）、ＫＲＴスコアは−３７．８４から−１５．４２に増加した（ｐ＝０．０３９）。統計的に有意な差は、レスポンダーと非レスポンダーとの間で、ベースラインにおけるＣＴＬ及びＩＦＮスコアにおいて観察された（平均スコア差＝−５．９１及び４０．１１、それぞれｐ＜０．０３６及び０．０３６）が、ＫＲＴスコアにおいては観察されなかった
（平均スコア差＝−１９．７４、ｐ＝０．２２）。
結果
有効性
本研究は、中程度／重度のＡＡの処置において２０ｍｇＰＯ、毎日２回のルキソリチニブ（Ｊａｋａｆｉ，Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を調査するためのオープンラベル臨床試験であった。全ての患者は、３〜６ヶ月間にわたったルキソリチニブを受け、処置応答耐久性を評価するための３ヶ月の観察フェーズが続いた。
１２人の患者のうちの９人（７５％）が、有意な毛髪の再生を有し、少なくとも５０％の再生の主要な予後を達成した。６５．８±２８．０％の平均ベースラインＳＡＬＴスコアは、３ヶ月で２４．８±２２．９％のスコアに、６ヶ月の処置の終了時で７．３±１３．５％に低下した（ｐ＜０．００４）。１つの群として、レスポンダーはベースラインから脱毛の９２％の減少を示し（図１８及び図１９）、９人のレスポンダーのうちの７人が処置の終了時までに９５％以上の再生を達成した。
再生は、研究投薬か開始された後４週間後すぐにレスポンダーに見られ、主に灰色の毛髪の再生を示し、白斑を併発した１人の患者（被験者４）を除いて、色素性末端毛からなる再生の可変性の微妙な斑状の領域として初期的に現れた。注目すべきは、この患者の白斑の領域もまた、ルキソリチニブ処置で改善することが認められた。全てのレスポンダーの毛髪の再生は、毎月の有意な増加で着実に増加し、１２週の訪問までにレスポンダーの大半（９人中８人）が少なくとも５０％の再生を達成することを結果としてもたらした。３ヶ月において再生の証拠を有する応答する患者は、被験者が９５‐１００％の再生を達成するか、又は６ヶ月の処置を完了するまで、処置を継続した。
応答の耐久性は、処置から３ヶ月のフォローアップ期間内に評価された。９人のレスポンダーのうちの３人は、ルキソリチニブ投与中止に続いて３週で脱落の開始を認め、投薬から１２週で有意な脱毛を有した（図２１）；しかしながら、脱毛はベースラインレベルに達しなかった（図１８）。９人のレスポンダーのうちの６人が軽度の脱落増加を報告した。
バイオマーカー及び臨床相関的研究
遺伝子発現プロファイリングは、ベースラインにおいて、１２週の処置に続いて採取された皮膚生検に対して実行され、処置過程の早期に追加的、選択的な生検が実行された。ベースラインの頭皮サンプルは、罹患していない患者から採取したサンプルに比較された場合に、別個の（distinct）遺伝子発現プロファイルを示した（図２０Ａ）。ルキソリチニブ処置に続いて、ＡＡ患者頭皮サンプルは、ベースラインＡＡサンプルよりも健常コントロール頭皮サンプルに、より密接に集まり、ＡＡ病原性応答の全体的な正常化を示した（図２０Ｂ）。インターフェロン（ＩＦＮ）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、及び毛髪ケラチン（ＫＲＴ）シグニチャに帰する遺伝子発現プロファイルは、ＡＡ病原性炎症応答及び毛髪の再生の要約指標である、三変量円形脱毛症疾患活動指標（ＡＬＡＤＩＮ、図２０Ｃ）で評価された。重要なことに、最終的なＡＡレスポンダーは、ベースラインにおいてＡＬＡＤＩＮマトリックス上に一緒に集まり、高いＩＦＮ及びＣＴＬスコアを共有した（図２０Ｃ、図２０Ｄ）。
注目すべきことに、最終的なＡＡ非レスポンダーからのベースラインサンプルは、正常コントロールサンプルと統計的に異ならない、比較的低いＩＦＮ及びＣＴＬスコアを示した（図２０Ｄ、図２０Ｅ）。その上に、記述されたようなルキソリチニブ処置に関するＡＡ患者のコホートにおいて、ＣＴＬ及びＩＦＮシグニチャスコアは、ベースラインにおいて最終的なレスポンダー及び非レスポンダーを区別することができた（ＣＴＬ及びＩＦＮスコアについて、それぞれｐ＜０．０３６及びｐ＜０．０３６）。
処置の的確な活動（on-target activity）と一致して、応答する患者から１２週間の処置に続いて採取された皮膚サンプルは、はるかに低いＩＦＮ及びＣＴＬスコアを示し、ＡＬＡＤＩＮマトリックス上の正常コントロール患者から採取された皮膚サンプルに、はるかに密接に集まった（図２０Ｄ、図２０Ｅ）。処置後生検における低下したＩＦＮ及びＣＴＬスコアは、早くも処置の開始後２週間で明白であった（図２２）。
有害事象
ルキソリチニブは、１２人の患者全員において耐容性が良好であり、安全に投与された。深刻な有害作用はなく、治療の中止が要求される患者はいなかった。観察された有害作用はまれであり、（同じ患者における）３つの軽度の細菌性皮膚感染、７人の患者におけるＵＲＩ／アレルギー症状の９回のエピソード、１例のＵＴＩ、１例の軽度の肺炎、軽度のＧＩ症状、及び外科手技に続く１例の結膜出血を含んだ。１人の患者はヘモグロビン低下を発症し、用量変更により解決された。
考察
この実証実験研究において、３から６ヶ月間、１日２回、２０ｍｇのルキソリチニブは、１２人の患者のうち９人において有意な毛髪の再生を誘導し、ＡＡの処置において、ルクスリチニブに対する全体で７５％の応答率であった。対照的に、中等度から重度のＡＡを有する患者における予想される自然寛解率（処置なしでの毛髪の再生の発生）は、類似する被験者集団での２つの無作為化比較試験（randomized controlled trials）に基づいて１２％未満である。最も重度の形態の脱毛症、ＡＴ／ＡＵ、でさえ応答し、自己免疫プロセスが病原的に活性なままであり、ＪＡＫ阻害によって可逆的であることを示した。毛髪の再生は、レスポンダーにおいて１ヶ月以内に明らかであり、急速に進行した。応答は、９人のレスポンダーのうちの８人において６ヶ月の処置によってほぼ完了し、大多数のレスポンダーにおいて最大の臨床的寛解を誘導するために６ヶ月の治療が十分であることを示唆した。
この９ヶ月の研究において、ルキソリチニブは耐容性が良好であった。その他の点で健常なＡＡ患者のこの小規模な研究における安全信号は、特に血液学的関連する有害事象がより頻繁であると理解される、骨髄増殖性疾患を有する患者におけるルキソリチニブについての従来の臨床経験と比較して優れており、乾癬患者の治療におけるトファシチニブの使用による所見と一致する。
ペアリングされたベースライン及び処置中の頭皮生検の転写プロファイリングは、機構的及び臨床的の両方で情報価値があった。レスポンダーからのベースライン皮膚サンプルは、高炎症性のＡＬＡＤＩＮ ＩＦＮ及びＣＴＬスコアを有したが１２週間の処置の後にほぼ正常化し、自己反応性ＣＤ８Ｔ細胞応答のＪＡＫ１／２ｉ媒介性抑制を示す。事実、処置開始に続いて２週目という早期のＡＬＡＤＩＮの正常化（図２２）は、好ましい第１２週の臨床予後を予測する可能性がある。逆に、非レスポンダーサンプルは、低いベースラインＩＦＮ／ＣＴＬスコアを示し、正常患者サンプルに対して比較的密接に集まっており、これらの非レスポンダーにおける脱毛の代替的な炎症性又は非炎症性の病因を示唆する（図２３）。１人の非レスポンダーはＡＡとアンドロゲン性脱毛症の両方を有し、他の非レスポンダーの脱毛症は組織学的にＡＡと一致したが、この疾患のまれな拡散型であると思われ、最後の非レスポンダーは蛇行状脱毛ＡＡパターンを示した。
最近の単一症例報告は、トファシチニブ、ルキソリチニブ、及びバリシチニブを含む他のＪＡＫインヒビターを用いて処置されたＡＡ患者における臨床応答を記載している。これらの実証実験データは、たとえ長期又はより重度の疾患の形態の患者においても、ＡＡの根底にあるＩ型炎症応答の免疫病理学的可逆性を実証し、ＡＡの処置のための経口及び／又は局所ＪＡＫインヒビターの臨床開発のための強力な理論的根拠を提供する。
６．５ 実施例５
要約
癌などの複雑な疾患の研究では、生理学的挙動のネットワークベースの分子モデリングが非常に重要であることが証明されているが、これらのアプローチは、自己免疫などの相互作用する組織を含む状況（contexts）では大部分が未試験のままである。ここでは、円形脱毛症（ＡＡ）をモデルとして使用し、本発明者らは、自己免疫疾患における免疫細胞の動員に寄与する皮膚における生理学的挙動を特異的に分離するために、制御ネットワーク分析を適合させた。本発明者らは、ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４を主要制御因子（マスターレギュレーター）（ＭＲｓ）として、皮膚特異的制御モジュールの畳み込みを解き（deconvolve）、同定するために、状況特異的（context-specific）制御ネットワークを使用する。これらのＭＲｓは、３つの培養細胞株において生体外（インビトロ）でＡＡ様の分子状態を誘導するのに十分であり、誘導されたＮＫＧ２Ｄ依存細胞傷害性をもたらす。この仕事は、自己免疫疾患における組織間の相互作用に寄与する分子挙動を区画化及び標的化するためのネットワークベースのアプローチの実現可能性を実証する。
はじめに
逆行分析された制御ネットワークを使用したシステムレベルの分析は、癌やアルツハイマー病などの複雑な疾患の研究において大きな有望性を実証した新しい計算規範（computational discipline）である。このアプローチは、主要制御因子（ＭＲｓ）によって制御される遺伝子のモジュール（疾患と関連する示差的に発現する遺伝子のサブセット）としての複雑な生理学的挙動のモデリングを可能にする。ＭＲｓは、標的モジュールを特異的に活性化又は抑制すると予測される転写因子（ＴＦｓ）の最小限の数、及び、拡張によって、関連する生理学的挙動を表す。それらは、生理学的挙動を調節する分子「スイッチ」とみなすことができる。ＭＲｓの推論は、ＡＲＡＣＮｅのような計算アルゴリズムを使用した状況特異的な制御ネットワークの逆行分析を通じて可能になる。
これらのＭＲｓは、生物学的に検証され、疾患の病理を支配する標的化可能な「ハブ」として働く。これらのアプローチは、癌などの疾患における細胞自律挙動の研究のために効果が高いと証明されている。グリア芽腫における間葉系形質転換及びＢ細胞リンパ腫又は乳癌における腫瘍発生、並びにアルツハイマー病の発病などの生理学的挙動は、比較的少数のＭＲｓに機能的につながっており、これは次に患者のドライバー突然変異を推論するために使用され得る「ボトルネック」となるか、又は処置のための薬物スクリーニングの標的となる。
しかしながら、この種類の計算アプローチは、自己免疫疾患のような、異なる組織間の病原性で非細胞性の自律的相互作用を標的とするために実施され始めているのみである。特に、ＭＲｓを推論することは、制御ネットワークの生成の間になされる根本的な仮定のために、典型的なＡＲＡＣＮｅベースの分析を使用して直接行うことはできない：（１）使用されるサンプルは比較的純粋であるか、又は一つの根底にある転写ネットワークを表す；及び（２）データセットの根底にある分子挙動は定常状態で存在し、そのため各サンプルはネットワーク全体の中の制御依存性の「スナップショット」として扱われてもよい。特に異なる状況特異的な制御ネットワークを示す組織によって汚染されたサンプルは、制御予報（predictions）の精度を損ない得る。さらに、病態形成が２つの組織間の相互作用に依存する場合は、汚染遺伝子シグニチャとそれらを動員するが他の組織で発現される分子モジュールとの間のアーチファクト相関が常に存在するであろう。これは、２つの組織の混合物から生成された遺伝子発現データを解析する場合に、１つの組織又は他の組織に独占的なモジュールを明確に定義することを困難にする。
円形脱毛症（ＡＡ）は、典型的には正常な皮膚には存在しない毛包及び頭皮皮膚に能動的に浸潤する細胞傷害性Ｔ細胞によって特徴付けられるので、そのような研究のために理想的なモデルを提供する。ＡＡは、典型的に個別のランダムな斑状の毛髪の喪失として現れ、それは全頭皮（完全脱毛症）又は全身（汎発性脱毛症）に広がる可能性がある。以前の調査は、ＡＡに免疫遺伝子を直接的に関係させており、それらの多くは１型糖尿病、セリアック病及び関節リウマチなどの他の自己免疫疾患と共有されている。以前の研究は、ＡＡの皮膚の中への細胞傷害性ＣＤ８陽性、ＮＫＧ２Ｄ陽性Ｔ細胞の浸潤を同定しており、ＡＡの病理にはＩＦＮガンマ依存性シグナル経路が関係しており、それは癌における免疫回避に伴ってしばしば途絶される（disrupted）。
ＡＡにおける頭皮皮膚のような、疾患に寄与する「終末器官（end organ）」（自己免疫攻撃を受ける組織）内に内因子が存在するかどうかを決定し、この分子成分を分析の主要な標的とするための仕事はほとんど行われていない。本発明者らは、頭皮皮膚の分子プロフィールの病原性変化が浸潤Ｔ細胞との相互作用を媒介する遺伝子を包含すると予期する。必然的に、ＭＲｓを同定することは、免疫動員を誘導するために十分なモジュールへの制御調節を与えるであろう。これを研究するために、本発明者らは、ＡＡ患者の混合シグニチャ遺伝子発現プロフィールの制御デコンボリューション（regulatory deconvolution）のために、状況特異的な制御ネットワークを活用する。この仕事の目標は、混合されたＡＡ組織生検遺伝子発現データをＡＡ病理及び浸潤動員の皮膚特異的モジュールに分離することができるフレームワークを開発することであった。
本発明者らは、皮膚特異的ネットワークに正確にマッピングされない遺伝子をフィルタリングすることにより、頭皮皮膚における浸潤動員の遺伝子モジュールを含むＡＡの分子プロファイルを同定した。この頭皮皮膚シグニチャは、頭皮皮膚の２つのＭＲｓ：ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の、浸潤への寄与のその後の同定を可能にした。これらの２つの遺伝子は、主要頭皮生検において発現され、独立した野生型細胞状況においてＡＡ様分子シグニチャ及びＮＫＧ２Ｄ依存細胞傷害性を誘導するのに十分であり、免疫媒介細胞傷害性の直接遺伝的誘導を可能にする。
結果
ＡＡにおける病原性発現シグニチャの初期定義は、局所的な頭皮皮膚及び浸潤免疫シグナルの存在を明らかにする
第１に、本発明者らは、ＡＡ患者をコントロールに比較してＡＡの分子表現（molecular representation）を生成する分子シグニチャを作成した。本発明者らは、３４のユニークな生検サンプルの最初のコホートからの患者生検のマイクロアレイ研究の訓練セットを分析した：様々な臨床プレゼンテーションの２１人のＡＡ患者、及び１３人の罹患していないコントロール。本発明者らは加えて、２１人のＡＡ患者のうちの１２人について、患者適合性の（patient-matched）、非病変頭皮生検を行った。これらの３４人の患者は、合計で９６人の患者の２つのコホートのうちの最初のものとして集められ、その残りは検証研究のために蓄えられた。
本発明者らは、２つの個別の臨床プレゼンテーション、斑状ＡＡ（ＡＡＰ）並びに完全及び汎発性（ＡＴ／ＡＵ）の患者を全て、罹患していないコントロールに対して比較することにより全体的な遺伝子発現シグニチャを作成した。脱毛などの浸潤の二次的影響と関連するシグニチャにおけるアーチファクトを説明するために、次いで本発明者らは、患者適合性の病変（脱毛を伴う症候性の皮膚）サンプル及び非病変（毛髪を持つ非症候性の皮膚）サンプルのセットに対する、この遺伝子シグニチャを使用した階層的クラスタリングを実行した。この分析は、これらのサンプルの間で差次的に発現された遺伝子クラスタ、並びに、病変サンプル及び非病変サンプルにわたって全身的に同等（systemically equivalent）であった遺伝子クラスタを同定した。本発明者らは続いて、第１の発現セットから、病変対非病変の状態と相関するクラスタに分類された任意の遺伝子を除去した。これは主に、ケラチン及びケラチン関連タンパク質のかなりの数（ただし全てではない）をシグニチャから除去した。
結果として得られる遺伝子発現シグニチャである円形脱毛症遺伝子シグニチャ（ＡＡＧＳ）は、合計１３６個のユニークな遺伝子から成り（表Ａ）、全訓練コホートを、コントロール及び疾患状態に対応する２つの適切なスーパークラスタにクラスタ化するために十分な情報を提供した（図２４Ａ）。同時発現によってこれらの遺伝子をクラスタ化することはまた、疾患状態において上方制御された遺伝子において、同時発現のより大きな多様性を伴い、２つの個別の遺伝子のモジュールを明らかにした（図２４Ｂ）。罹患した患者と罹患していない患者との間で差次的に発現された遺伝子の定性的尺度として、本発明者らは、機能予測エンリッチメント（functional annotation enrichments）についてそれらを分析した。この分析は、罹患した患者サンプルにおけるＨＬＡ遺伝子、免疫応答要素、並びに炎症及び細胞死経路遺伝子発現の存在を明らかにした（図２４Ｃ）。ＡＡＧＳの２つの最も有意なスーパークラスタは、膜貫通シグナルペプチド（ｐ＝２．８×１０−１１）及び分泌型細胞間シグナルペプチド（ｐ＝２．１×１０−１０）であった。予想されるように、このリストはまた、ＡＡ及び自己免疫疾患に関連するいくつかの抗原提示要素及び免疫応答要素も含む（図３０）。これらの結果は、ＡＡ提示細胞において複数の生物学的プロセスの有意な変化があることを示す。本発明者らは、これらの遺伝子のいくつかのサブセットが頭皮皮膚から生じ、浸潤動員を誘導するために要求されると推論する。
予めフィルタリングされなければならない；さもなければ、それらが皮膚特異的分子プログラムの同定を混乱させる可能性がある、浸潤性免疫細胞に由来する免疫関連遺伝子についての有意な証拠もある。免疫細胞又は免疫応答と関連する遺伝子マーカーは、ＣＤ８ａ、ＣＸＣＬ９／１０及びＣＣＬ５／１８／２０／２６を含むＡＡＧＳの一部として検出された。一次患者の生検サンプルにおいて、ＡＡに寄与する皮膚特異的分子挙動を定義することは、ＡＡ皮膚サンプルにおける浸潤性Ｔ細胞及び二次応答経路の存在のために困難な作業である。
ＡＡＧＳの皮膚及び免疫シグニチャを制御モジュールにデコンボルブするための制御ネットワークの活用
疾患シグニチャの明確な定義により、本発明者らは、ＡＡＧＳの皮膚分子プログラムを、浸潤性免疫細胞に由来する分子プログラムから、全身的で偏りのない様式でデコンボルブしようとした。先験的知識及び潜在的にあいまいな予測に依存するＧＯ経路エンリッチメント又は他の予測ベースの方法を使用するよりはむしろ、本発明者らは代わりに、皮膚特異的な制御ネットワークにマッピングされることができない遺伝子を同定することによって本発明者らは非皮膚（免疫浸潤）遺伝子発現をフィルタリングすることができるという仮説の下で、推論される制御ネットワークを利用する。
頭皮皮膚の転写制御ネットワークは、ＡＲＡＣＮｅアルゴリズム及び関連するソフトウェアスイート（実験手順を参照）を使用して生成された。具体的には、ネットワークを生成するために、本発明者らは、正常（罹患していない）全皮膚生検、並びに、Ｔ細胞浸潤をほとんど又は全く含まない、一次培養真皮線維芽細胞及び真皮乳頭細胞のいくつかのサンプルからなる、１０６の一次頭皮皮膚サンプルのコホートを含めた。このネットワークは、非浸潤皮膚由来組織における制御ネットワークを表し、図２５に詳しく示されるように２つの主要なステップにおいて起こるデコンボリューションの基礎として働く。
制御モジュールのデコンボリューションのために、ＡＡＧＳ中の遺伝子は、制御ネットワークに直接マッピングされる（図２５Ａ；詳細は実験手順を参照）。ＡＡＧＳ中の遺伝子は、皮膚ＡＲＡＣＮｅネットワーク（赤色、実線のエッジ）の制御ロジックを使用して、それとＴＦとの間に直接的な調節相互作用がある場合にのみ保持される。ユニークに浸潤性免疫細胞から由来する遺伝子は、ＡＲＡＣＮｅネットワークに有意な表現を持たず、続いて皮膚についてのＡＡＧＳ（黒色、点線のエッジ）から除去され、免疫遺伝子シグニチャ（ＩＧＳ）に加えられる。
ＩＧＳは、癌免疫浸潤を特徴付ける以前の仕事から適応された「陰性コントロール」シグニチャとして使用された。そのシグニチャは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞及びマクロファージを含む各免疫細胞型において特異的に発現する遺伝子のセットとして定義された。このステップは、非浸潤制御ネットワーク（ＡＡＧＳ）によって制御が説明され得るそれらの遺伝子を、できないもの（ＩＧＳ）から分離することによって、ＡＡＧＳ及びＩＧＳを反復的に再定義する。拡張によって、本発明者らは、正確な皮膚特異的レギュロン（regulons）を生成するために、皮膚遺伝子発現において、フィルタリングされたＡＡＧＳが十分にエンリッチされることを予想した。
図２５Ｂに示されるように、皮膚特異的制御ネットワークを通過させられた場合に、ＡＡＧＳから１３個の浸潤特異的遺伝子が除去された（全シグニチャの９．５％）。これらの遺伝子は、表Ａにも列挙されている。これは、２つの相互に排他的な遺伝子モジュール（重複遺伝子なし、ｐ＝１．７７×１０−４）、ＡＡＧＳ及びＩＧＳをもたらした。続く経路エンリッチメント分析は、「Ｔ細胞活性化」及び「免疫応答」カテゴリーの統計的エンリッチメントの喪失を更に確認し、一方では既知の皮膚免疫応答要素（ＨＬＡ遺伝子など）を含む他のクラスタを保持した。これは、終末器官に開始される免疫動員及び免疫応答を含む、本発明者らがＡＡ病理に関連する全ての終末器官プログラムを表すと解釈する、ＡＡＧＳ中の合計１２３の遺伝子を残した（表Ａ、星印項目）。
本発明者らは、免疫細胞（例えば、ＣＤ８ａ）に関連する注釈と、免疫応答遺伝子（例えば、ＨＬＡ）に関連する注釈とを区別したことに留意されたい。前者は、皮膚の制御ネットワークに表されていない制御ネットワークによって除去される。後者は、皮膚における応答要素を表し、疾患の病理に関連するので、発明者が保持しようとするシグニチャ遺伝子である。
フィルタリングされたＡＡＧＳをクラスタ化することは、罹患していない患者（図２５Ｂ、第２）からＡＡ疾患状態（図２５Ｂ、第３図）への移行を定義する２つの別個の分子モジュールを明らかにした。各ノードはシグニチャ内の遺伝子を表し、そのサイズは各状態における相対的な発現を表す（より大きいことは、より高い発現を意味する）。本発明者らは、これらの遺伝子群を標識した：（１）疾患状態に移行するときに発現が増大する遺伝子、及び（２）上記の移行において発現が失われる遺伝子。このフィルタリングされたＡＡＧＳは、終末器官特異的遺伝子モジュールを反映し、ＭＲ解析への入力として働く。
ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４は、皮膚ＡＡＧＳ及び、拡張によって、浸潤動員のＭＲである
次のステップは、終末器官特異的ＭＲｓを同定する上で最も重要である。本発明者らは、頭皮皮膚制御ネットワーク（図２５Ｃ、第１、赤色の輪郭線）を使用して、デコンボルブされたＡＡＧＳ及びＩＧＳの両方について、独立かつ並列にＭＲ分析を実行した。皮膚に表される調節相互作用のみを使用して、本発明者らは、デコンボルブされたＡＡＧＳ（赤色の矢印）について最も高い特異性を有した転写制御因子を同定し、ＩＧＳ（黒色の矢印）についての分析を繰り返した。このステップは、遺伝子発現の直接的なカバレッジとは対照的に、頭皮皮膚における制御ロジックに関してＡＡＧＳをＩＧＳに対して比較する。この分析は、皮膚に特異的な分子制御ネットワークを使用して、いずれのＴＦｓがデコンボルブされたＡＡＧＳのための（ＩＧＳのためではない）最良の候補であるかを評価する。本発明者らは、ＡＡＧＳカバレッジにおいて有意であり、ＩＧＳカバレッジにとって有意でない両方の候補のみを保持することによって、皮膚特異的候補ＭＲｓを同定する。
特異的にＡＡＧＳのために有意な候補ＭＲｓのうちで、本発明者らは、ＡＡＧＳのカバレッジを最大化するために必要とされる制御因子の最小限の数を同定するために貪欲ソート（greedy sort）を採用した。本発明者らは、２つのＭＲｓがＡＡＧＳの＞６０％をカバーするために十分であったことを見出した：ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４。任意の追加的な候補は、統計的に有意でないマージン（＜５％）でカバレッジを押し上げた。本発明者らは、最大のＡＡＧＳ忠実度（発現シグニチャの最も忠実な再現）及び効率（必要な最小の制御因子）は、これら２つの遺伝子（ＩＫＺＦ１ｐ＝４．１７×１０−４及びＤＬＸ４ｐ＝４．８×１０−１０、ＦＤＲ修正）を通じて達成され得ると結論する。
ＩＧＳモジュールについて実施された同等のＭＲ分析は、頭皮皮膚制御ネットワークを使用して統計的に有意又は意義のあるＭＲｓを生成できなかった。具体的には、ＡＡＧＳ、ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４のための最良の候補は、統計的に無関係まで落ちる（それぞれ第１及び第２から第１５９及び第２１０まで低下する、ＦＤＲ＝１）（図２５Ｃ、ＩＧＳ．ＦＤＲ）。デコンボリューションを用いずにＡＡＧＳについてＭＲ分析を行うことは、ＭＲに正確にマッピングされ得ず、それにも関わらず分析におけるエンリッチメントには不利になるシグニチャ中の混入遺伝子の存在により、（ｐ値及びシグニチャカバレッジの両方において）典型的に期待される閾値でＭＲ候補を生成することができない。
これらの２つの候補は、この方法を使用して離れてデコンボルブされた（deconvolved away）如何なる免疫特異的制御モジュールからも別個の、特定の組織状況（頭皮皮膚）由来の調節相互作用を使用してＡＡＧＳを再現するために要求される制御因子の最小の数を表す。したがって、ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４は、ＡＡ病態形成に寄与する頭皮皮膚における遺伝制御モジュールを表し（図２５Ｃ、最後）、ＡＡ様の様式で浸潤動員を誘導するために十分であり得る。
それが免疫系の外側の細胞において役割を有し得ることは前例がないことはないものの、ＩＫＺＦ１はよく確立されたＴ細胞分化因子であるため、ＩＫＺＦ１の同定は予想外であった。しかしながら、この分析は、ＩＫＺＦ１のようなＭＲがＡＡ病態形成に寄与するＴ細胞に何の役割も持たないことを意味せず、むしろ、ＩＫＺＦ１は頭皮皮膚において追加的に機能して組織間の相互作用を媒介するという有意な証拠があることを留意することは重要である。
ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の発現は、正常な毛嚢胞乳頭及びヒトケラチノサイトにおいてＡＡＧＳ様シグニチャを誘導する
機能的研究によるＭＲ予報を検証するために、本発明者らは、皮膚由来細胞株及び培養細胞においてＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４を外因的に過剰発現させ、ＡＡＧＳの発現に影響することにおける十分性を試験した。本発明者らは、培養細胞における外因性発現のためにＤＬＸ４及びＩＫＺＦ１の２つのアイソフォームをクローン化した。活性ＩＫＺＦ１アイソフォームは研究の実験アームとして働き、一方でＤＮＡ結合ドメインを欠くアイソフォームは陰性コントロール（ＩＫＺＦ１δ）として含められた。本発明者らは、培養初代ヒト毛嚢胞乳頭（ｈｕＤＰ）及びヒトケラチノサイト（ＨＫ）においてこれらの遺伝子を発現させた。この実験系は、我々が、２つの別個であるが関連する仮説を直接的に試験することを可能にした：（１）ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４は、免疫細胞のＡＡ様動員を誘導することができる、（２）それらは、（免疫浸潤物ではなく）皮膚における発現を通じて、それを行う。
本発明者らは、両方の細胞型にわたるＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４形質移入（transfections）において、同じ方向に有意に差次的に発現された遺伝子のセットを同定した。これらの転写産物に基づく全てのサンプルの無監督階層的クラスタリングは、ＩＫＺＦ１δ及びＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）コントロールからのＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４形質移入のきれいな共分離（co-segregation）を明らかにする（図２６Ａ）。その上に、本発明者らは、これらのスーパーグループ内のサブクラスタリングは使用された細胞型に基づいて偏っていない（ＨＫはＨＫとクラスタ化せず、ＤＰはＤＰとクラスタ化しなかった）ことを観察し、本発明者らがＭＲ過剰発現の状況非依存性の効果を同定したことを支持する。興味深いことに、本発明者らは、ＤＬＸ４形質移入がＩＫＺＦ１転写物及びタンパク質のレベルの上昇をもたらしたのに対し、ＩＫＺＦ１形質移入はＤＬＸ４発現に影響しないことを観察した（図２６Ｂ及び図２６Ｃ）。
続いて本発明者らは、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）を使用して、ＡＡＧＳ遺伝子を濃縮について発現データを調べた。本発明者らは、ＩＫＺＦ１形質移入対ＲＦＰコントロール及びＤＬＸ４形質移入対ＲＦＰコントロールを比較する、２つの差次的遺伝子発現研究を実行した。結果は、そのＭＲｓの異所性発現の後に、ＡＡＧＳの誘導において有意なエンリッチメントが続くことを示す（ＩＫＺＦ１ｐ＝０．０１２及びＤＬＸ４ｐ＝２．０８×１０−４；図２６Ｄ及び図２６Ｅ）。
ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の発現は、正常な培養皮膚においてＮＫＧ２Ｄ媒介細胞傷害性を誘導するために十分である
ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の過剰発現は、これら２つの遺伝子が、ＨＫ及びｈｕＤＰに適用された場合にＡＡＧＳを媒介することができるＭＲｓであることを示唆する。しかしながら、自己免疫及び免疫浸潤に対するこれらのＭＲの機能的関連性は、それらの発現が標的化された自己免疫応答を誘導するために十分であるかどうかである。これを生体外（ex vivo）で調査するために、本発明者らは、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）に曝露された場合のＨＫ細胞及びｈｕＤＰ細胞における細胞傷害性細胞死のレベルを測定する実験を実行した。
本発明者らは、４つの発現構築物：ＩＫＺＦ１、ＤＬＸ４、ＲＦＰ（陰性コントロール）又はＩＫＺＦ１δ（陰性コントロール）のうちの１つを用いて、ＨＫ細胞及びｈｕＤＰ細胞の両方を再度形質移入した。形質移入の２４時間後に、これらの細胞は、新鮮な精製ＰＢＭＣｓと共にインキュベートされた。本発明者らは、ヒト皮膚線維芽細胞及び自己（autologous）健常ドナーＰＢＭＣｓを追加的に培養した。ＰＢＭＣｓは、ＡＡ又は他の自己免疫疾患の病歴のない健常コントロール被験者から得られた。
全ての比較において、本発明者らは、ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の形質移入について、ＲＦＰ及びＩＫＺＦ１δコントロールと比較して、ＰＢＭＣ依存性細胞傷害性の統計的に有意な増大を観察した（図２７、中央の柱、全体のバー高さ）。患者適合性のＰＢＭＣｓ及びＲＦＰコントロール形質移入された線維芽細胞は、健常標的細胞において予想されるように、細胞傷害性相互作用の証拠を示さなかった（図２７Ａ、中央）。しかしながら、ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の導入は、これらの以前には相互作用していない細胞の間に相互作用を誘導するために十分であり、全体の細胞障害性の有意な増加をもたらした。同様の様式で、ｈｕＤＰ細胞（図２７Ｂ、中央）及びＨＫ細胞（図２７Ｃ、中心）の両方が、ＰＢＭＣに対する細胞障害性感受性において、バックグラウンドレベルより高い有意な増大を示した。
本発明者らはＡＡにおけるあり得る病原性免疫細胞がＣＤ８＋ＮＫＧ２Ｄ＋活性化Ｔ細胞であることを以前に示したので、本発明者らはまた、ＮＫＧ２Ｄ依存性相互作用を防止するためにＮＫＧ２Ｄ遮断抗体（実験手順参照）を添加して全ての処置を実行した。全ての場合において、本発明者らは、ＮＫＧ２Ｄの遮断が、ＩＫＺＦ１処置及びＤＬＸ４処置の両方における細胞傷害性を、コントロールに匹敵するレベルまで抑制したことを観察した（図２７、中央、灰色のバー）。インヒビター処置細胞と未処置細胞との間の差異から、本発明者らは、ＮＫＧ２Ｄ依存性である細胞傷害性（図２７、中央、白色のバー）を推論することができ、それは、相対倍率変化分析のためにコントロールにおいて観察されるものに対して正規化されることができる。ＮＫＧ２Ｄ遮断から、本発明者らは、全ての試験わたって、ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４形質移入において特異的に統計学的に有意な増大を観察した（図２７右）。コントロールの形質移入と比較し再び有意な細胞傷害性を示さなかった。ＮＫＧ２Ｄ非依存性細胞傷害性における統計的に有意であるが小さい（＜１０％）増大にも関わらず、両方のコントロールと比較して、ＮＫＧ２Ｄ依存性細胞傷害性において約２倍から８倍の増大があった。本発明者らは、これらの実験から、ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４は、正常なＰＢＭＣｓとのＮＫＧ２Ｄ依存性相互作用を誘導することができ、それは、正確な組織型に関係なく形質移入された細胞の毒性をもたらすと結論する。
重要なことに、これらの実験は、外因性修飾が厳密に正常培養細胞に対して行われ、自己免疫疾患の病歴のない供給源からの健常ＰＢＭＣｓに対して曝露されたため、浸潤細胞とは対照的に、頭皮皮膚におけるＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４のための細胞自律機能を確立する。
ＭＲ発現は、浸潤動員の方向性皮膚特異的ＭＲモジュールの再構築を可能にする
ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４がＡＡＧＳを誘導するために十分であることを確立した後、本発明者らは、このデータを使用してＡＡ ＭＲモジュールを完全に再構築しようとした。本発明者らは制御がＴＦ Ｍａｔｈ Ｅｑ Ｔであると推論することができるので、ＡＲＡＣＮｅは、ＴＦと潜在的標的（Ｔ）である非制御遺伝子との間の直接的な転写依存性を検出することができる。ＡＲＡＣＮｅは、ＴＦ‐ＴＦペアの間の方向性の相互作用を推論することができず、ＴＦｓの制御等価性により、その後にＭＲｓの二次Ｔ（secondary T）を推論することができない（図２８Ａ、最初）。しかしながら、本発明者らは特異的ＭＲｓを用いてＨＫｓ及びｈｕＤＰｓを直接的に攪乱したので（図２８Ａ、アスタリスク）、本発明者らは、遺伝子発現データを用いて方向性を推論することができる。もしＴＦＢがＭＲ（ＴＦＡ）のＴであるならば、そのときＴＦＡの過剰発現はＴＦＢの差次的発現をもたらすであろうし、本発明者らはＴＦＡ Ｍａｔｈ Ｅｑ ＴＦＢであると推論することができる。続いて、ＴＦＢに関連するシグニチャ中の任意のマーカー遺伝子は、二次ＴとしてＭＲに関連付けられることができるＴＦＡ Ｍａｔｈ Ｅｑ ＴＦＢ Ｍａｔｈ Ｅｑ Ｔ（図２８Ａ、上）。もしＴＦＢがＭＲの上流で機能するか又はＭＲと並行に機能するならば、そのときＴＦＢ及びＴの発現は、ＴＦＡの過剰発現によって影響されないであろう（図２８Ａ、下）。
この論理を使用して、本発明者らは、これらの細胞状況においてＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４を過剰発現させることによって得られるカバレッジの全範囲を測定するために、制御モジュールを再構成した。本発明者らは、（１）実験においてＩＫＺＦ１／ＤＬＸ４発現に応答し、（２）制御モジュールへのＡＲＡＣＮｅによって、発現されたＭＲとの相互情報を有すると予測される、両方の、ＴＦｓの任意の下流Ｔをマッピングした。本発明者らは、応答するＡＡＧＳの７８％が、これらの基準に基づいてＭＲｓ ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４からの下流の分離の２°以内にあることを見出した（図２８Ｂ）。
ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４は、独立したコホートにおける免疫浸潤及び疾患重症度の両方を予測するために使用され得る
このモジュールの検証として、本発明者らは、元のＡＡアレイコホートに戻り、機械学習分析を実行した。本発明者らは、推測されたＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４活性のみを使用して、検証ＡＡセットをコントロールと罹患したサンプルに分類することを試みた。図２４からの初期の訓練セットを用いて、本発明者らは、二次元：ＩＫＺＦ１のコンセンサス活性（ｘ軸）及びＤＬＸ４のコンセンサス活性（ｙ軸）の検索空間にサンプルを配列した（実験手順を参照）。訓練セットから、本発明者らは、コンセンサス活性空間の地形図（topographical map）を生成し、コントロールサンプル、斑状ＡＡ及びＡＴ／ＡＵサンプルに関連するＩＺＫＦ１及びＤＬＸ４活性の範囲を定義した（図２８Ｃ、黒色の線）。プロットの原点に最も近い図２８Ｃ内の領域は、最も低い複合されたＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の活性を表す；その上限（下方の黒色の線）は、コントロールと全てのＡＡ患者との間の差を最大化するサポートベクタマシン（ＳＶＭ）マージンである。次の上限（上方の黒色の線）は、ＡＡＰからのＡＴ／ＡＵ患者の分離を最大化するＳＶＭマージンを表す。
ＭＲ活性のこれらの尺度を使用して、本発明者らは、検証セットに目を向け、患者及びコントロールを分離する際のこれらのパラメータの予知力について試験した。本発明者らは、臨床的重症度に加えて、サンプルを疾患状態とコントロール状態とに分離する強い能力を観察した（図２８Ｃ、上、ｐ＜１×１０−５）。各患者サブグループの重心マップ（centroid map）は、コントロール（ＮＣ）からＡＡＰ及びＡＴ／ＡＵへの患者群の移行が、相対的なＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４活性によってどのように反映されるかを、より明確に明らかにする（図２８Ｃ、下）。比較のために、本発明者らはまた、訓練セットに含まれていない、ＡＡＰ非病変サンプル生検についての重心を含めた。
独立した炎症性皮膚疾患に適用されたデコンボリューションは、既知の遺伝子を同定する
比較のために、及びアプローチの一般性についての概念実証を提供するために、本発明者らは、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）及び乾癬（Ｐｓ）についての公に利用可能な遺伝子発現データセットをダウンロードした。本発明者らは、ＡＡ分析と同様に、病変生検を罹患していない生検と比較することにより、各疾患について遺伝子発現シグニチャを生成した（図２９Ａ及び３１）。ＡＡ、ＡＤ及びＰｓシグニチャ内の遺伝子の直接的な比較は、ＡＡＧＳがＡＤ及びＰｓの両方から別個のものであるという統計的に有意な証拠を明らかにした（それぞれ、ｐ＝０．００３及び３．９３×１０−１３）。対照的に、ＡＤシグニチャ及びＰｓシグニチャの互いへの比較は、共有された分子シグニチャ、及び、拡張によって、可能な共有された分子病理についての統計的に有意な証拠が明らかにした（ｐ＝０．０１７３）。
これらの２つのシグニチャは、パイプラインに適用された。図２９Ｂは、適切な疾患シグニチャ（Ｐｓ又はＡＤ）のそれらの総カバレッジによってランク付けされた、分析後に同定された上位５つのＭＲｓを報告する。また、対応するデコンボルブされたＩＧＳを使用したＭＲｓのランクも提供される。これら結果は、ＡＡに関連する重要な制御ハブ（特にＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４）が、ＡＡに特有であることを示す。各疾患には、それ自体のユニークなＭＲｓのリストが割り当てられたが、追加的に、ＡＤ及びＰｓにおける２つの候補ＭＲｓ：ＳＭＡＤ２及びＨＬＴＦの重複もあった。ＳＭＡＤ２及びＴＧＦＢＲ１は、Ｐｓにおける関与の公表された証拠があるＴＦであり、パイプラインは、Ｐｓ遺伝子発現シグニチャの基本的な定義を用いて、先験的な証拠なしにそれらを同定することができた。これらの結果は、病理のメカニズムを識別するための制御モジュールとして複雑な遺伝的挙動をモデリングすることの有効性を実証する。
考察
ゲノムワイドなプロファイリングを利用する遺伝子調節ネットワーク及び遺伝子発現データの全身生成及び分析は、複雑な疾患の研究の手段になっていることが証明されている。機能的相互作用を調べるための統合的プロジェクトは、最近、糖尿病及びアテローム性動脈硬化症におけるゲノムワイドな発現シグニチャ逆畳み込み（deconvolution,デコンボリューション）及び組織間（cross-tissue）相互作用に活用されている。これらの研究は、病気に関連する病原性免疫浸潤のタイプについての洞察を提供する浸潤遺伝子シグニチャを同定する上で非常に貴重であった。また、これらの研究は（they）、癌やアルツハイマー病の研究で開発されている系統的アルゴリズムと同様に、相互作用する組織の調節活性や組織レベルの遺伝子パネルについて有意なゲノムレベルのカバレッジを提供することにより、ｅＱＴＬやその他のゲノム関連試験からドライバー遺伝子を同定するのに役立った。
しかしながら、特にＡＡのような文脈では、遺伝子発現プロファイル内の個々の病原性分子挙動のモジュラー調節を特徴づけること、及びそれらが疾患の組織間の生理学的相互作用にどのように翻訳するかを特徴付けることはほとんど行われていない。ＭＲによって制御される遺伝的プログラムとしての生理学的形質のモデリングは、複雑な疾患の研究におけるユニークで強力な視点を提供する。このアプローチは、大きな遺伝子発現シグニチャを、比較的少数の選択されたＭＲに方向づけ、前記ＭＲは（that）、続いて遺伝子治療又は薬物及び小分子を介した操作のＴになる。
ここで、発明者らは、様々な皮膚の状況（浸潤及び正常）の調節ネットワークを比較することによって、ＡＡにおける組織の終末器官（頭皮）及び浸潤（免疫浸潤）組織の混合サンプルの複雑な分子状態を調べるために調節ネットワークの適用を拡張する。本発明者らは、分子表現型スイッチを支配する重要な制御ハブを同定するためのそれらの典型的な使用に加えて、これらが独立した状況依存ネットワークで正確に表現されているかどうかに基づいて、異なる組織に由来する分子挙動を単離し、及び区画化するために、これらのネットワークを使用することができることを確立する。これは、免疫浸潤のような統合された相互作用的生理学的挙動に寄与する混合サンプルから組織特異的分子プログラムをより正確に同定することを可能にする。このパイプラインを使用して、本発明者らは、ＡＡの文脈だけでなく皮膚からの浸潤を媒介するＭＲを再構築することができたが、Ｐｓ及びＡＤの分析は、一般的に炎症性皮膚疾患の遺伝子調節のための追加の候補を提供し、且つ、このアプローチの一般的な適用性を実証する。
ＡＡ病理における直接の影響とは別に、この研究は、２つの重要かつ一般化可能な概念の原理の証明を提供する：（１）２つの組織間の複雑な相互作用は、定量化可能な分子遺伝子発現モジュールとしてモデル化することができる；並びに、（２）これらのモジュール及びそれらの調節因子は、発現データから抽出され、組織に区画化され、且つ、正常細胞型において関連する相互作用を誘導するように選択される。これは、ＭＲｓ ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の異所性発現時にＡＡＧＳを再現し、その後、終末器官自体内のＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４発現の操作のみを介して正常（非ＡＡ）ＰＢＭＣを使用して、非ＡＡ細胞系において増強された細胞毒性を誘発する能力によって立証された（ＰＢＭＣの遺伝子操作なし）。
具体的には、この分析は、頭皮でのみ発現された場合に免疫細胞との相互作用を誘導するのに十分であるＭＲを同定した。健常なＡＡ未罹患患者由来のサンプルとの患者適合状況においてさえ、ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４発現は、皮膚線維芽細胞とＰＢＭＣとの間の異常なＮＫＧ２Ｄ依存性相互作用を誘導して細胞毒性を引き起こすのに十分であった。これらの相互作用はコントロール形質移入には存在せず、且つ、ＩＫＺＦ１又はＤＬＸ４の発現が特定の組織又は宿主の一致にかかわらず正常な免疫細胞との相互作用を誘導するのに十分であることを示す、２つの他の（非患者適合性）細胞型で繰り返された。元のＡＡＧＳに浸透しているシグニチャの有意な存在が候補ＭＲのいずれの正確な同定を妨げてしまったため、ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の同定はネットワークベースのデコンボリューションなしでは不可能であったであろう。代わりに、ネットワークベースのデコンボリューションは、ＡＡ自体とは完全に独立したいくつかの分子状況のいずれかにおいて特定の分子相互作用を誘導することができるＭＲを同定した。
ＩＫＺＦ１はＴ細胞分化の文脈で広く研究されているので、ＩＫＺＦ１の同定は予想外であった。しかし、その同定は、皮膚由来の規制論理を使用して、ＩＧＳではなく、デコンボリューションされたＡＡシグニチャを使用することからのみ得られた。本発明者らが、遺伝子発現データをフィルタリングするための公開データベース、以前の文献、又はＧＯ注釈に依拠していたならば、本発明者らは、Ｔ細胞分化因子としての広範な注釈のためにＩＫＺＦ１を完全に無視して除去したであろう。そうではなく、制御ネットワークに目を向けることによって、本発明者らは、ＩＫＺＦ１の局所発現は、免疫細胞においてその確立された役割とは直接には無関係に、病原性関連性を有する可能性があるという可能性を同定することができた。
ＩＫＺＦ１は免疫細胞の文脈において十分に特徴付けされているが、免疫細胞外でのＩＫＺＦ１の役割は文献において前例がないわけではない。ＩＫＺＦ１遺伝子座及びＤＬＸ４遺伝子座の喪失は、結腸直腸癌、肺癌及び乳癌における腫瘍形成及び低悪性度扁平上皮内病変にも関連する。これらの研究は、腫瘍塊から直接ゲノム情報を取得し、これら２つの遺伝子座の体細胞喪失(somatic losses)が最終臓器のゲノム改変として癌病態生理に寄与し得ることを示している。免疫浸潤を誘発するＭＲとしてのＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の研究は、これらの結果を支持し、且つ、これらの遺伝子座の喪失が癌における免疫回避に寄与する可能性を高める。さらに、これらの観察、及び免疫浸潤補充のＭＲとしてのＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４の同定は、Ｔ細胞特異的分化因子としての役割の外にＩＫＺＦ１の機能があることを支持し、並びに、ＡＡにおける自己免疫及び腫瘍免疫回避が正常な免疫相互作用の反対の極端に存在するという仮説の指示を提起する。免疫浸潤のＭＲの喪失は癌に関連しており、且つ、その過剰発現はＡＡにおける自己免疫疾患の発症に関連する。
本発明者らは、システム生物学及びネットワーク分析は、２つの異なる組織間の相互作用を媒介する分子メカニズムをモデル化し、主要な調節因子を同定するために、及び他の状況において相互作用形質を再創造するためにそれらを使用するために使用され得ることを示した。これらのＭＲの検証のための出力は最終的に細胞死の誘導であったが、自己免疫疾患の状況におけるこれらのＭＲの機能は、最終的に免疫浸潤物にシグナル伝達し、且つ、免疫浸潤物を補充する分子プロファイルを誘導することである。これまで、システム生物学の応用は、主に、癌の細胞自律的分子挙動における「ブレークポイント」を特定することであった。組織間(cross-tissue)相互作用、特に免疫系に関与する相互作用、の制御された誘導は、これまで可能ではなかった調節ネットワークとの複雑な遺伝形質のモデリングの潜在的に有意な道を招く。本発明者らは、異なる組織間の相互作用を含む複雑な疾患においても、研究のための分子挙動を能動的に区画化するために使用することができる概念実証フレームワークを提供する。
実験手順
このセクションでは、この研究で実施されているあまり一般的でない、もしくはユニークな方法について説明する。
ＡＲＡＣＮｅ
頭皮用の文脈特異的転写相互作用ネットワークを生成するために、本発明者らは、この研究における分析コホートとは独立した１２８マイクロアレイ実験のセットでＡＲＡＣＮｅアルゴリズムを使用した。これらの実験は、正常全皮膚生検、ＡＡ患者生検、顕微解剖された真皮乳頭突起、並びに分離した真皮及び表皮サンプルの混合物から全皮膚サンプルに対して得られたプラットフォーム適合（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３ ２ｐｌｕｓ）データを表す。これらのサンプルは、頭皮における転写依存性の正確な検出に必要な異質性をまとめて提供する。上記のように実験をプールし、後処理し、そして標準的なＡＲＡＣＮｅ分析を行った。ＡＲＡＣＮｅソフトウェアスイートは、Ｃａｌｉｆａｎｏ研究室のＷｅｂサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｉｋｉ．ｃ２ｂ２．ｃｏｌｕｍｂｉａ．ｅｄｕ／ｃａｌｉｆａｎｏｌａｂ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ）から入手できる。
ＭＲ解析
特定の遺伝子発現シグニチャについてのＭＲｓは、直接的なＡＲＡＣＮｅ予測Ｔ（レギュロン）が遺伝子発現シグニチャにおいて統計的に富化されたＴＦとして定義された。フィッシャーの正確確率検定（Fisher’s exact test）、ＦＤＲ＝０．０５を用いて各ＴＦのレギュロンをＡＡＧＳの濃縮について試験した。この分析により、生理学的形質に関連する遺伝子発現モジュールを特異的にカバーするために必要とされるＴＦの最小数のランク付け及び決定が可能になる。ｈｔｔｐ：／／ｗｉｋｉ．ｃ２ｂ２．ｃｏｌｕｍｂｉａ．ｅｄｕ／ｃａｌｉｆａｎｏｌａｂ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＭＡＲＩＮＡ
ＭＲ活動分類指標
ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４のＡＲＡＣＮｅ予測Ｔは、ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４のＴとしてマッピングされ得るＡＡＧＳのすべての遺伝子を同定するために、外因性遺伝子発現研究と統合された。これは、ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４のＡＲＡＣＮｅレギュロンとＡＡＧＳとを交差させることによって行われた。次いで、これらの２つのセットの交差を、少なくとも２５％フォールドチェンジ(fold change)で応答するいずれの遺伝子の発現研究においてスクリーニングした。この遺伝子セットを用いて、ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４遺伝子座のコンセンサス「メタ活性」を構築した。ＡＡ患者コホートにわたる各遺伝子のランク正規化された変化は、親ＭＲの相対活性のコンセンサス尺度として平均値に統合された。
これらの値は、その後、ＡＡトレーニングセット内の患者の各々を分類するために、２Ｄ検索空間、Ｍａｔｈ Ｅｑ（Ｘ＝ＩＫＺＦ１ メタアクティビティ及びＹ＝ＤＬＸ４ メタアクティビティ）を定義するために使用された。メタアクティビティベクトル(vectors)は、最小値が検索空間の原点（０，０）に結合され、且つ、活動指標が正であるようにランク変換された。この変換は、検索空間を表示目的のためのより直観的なグリッドに投影する以外、結果には影響しない。［０、ｎ］の間に両方の軸が結合し、ここでｎは正の数である。
この空間における分類は、修正された非線形のソフトマージンＳＶＭアルゴリズムを用いて行われた。アルゴリズムは公式化される。：
Figure 2018526362
このアルゴリズムは、検索空間Ｍａｔｈ Ｅｑ内に存在するベクトル集合Ｍａｔｈ Ｅｑを定義しており、それにより、与えられた各対Ｍａｔｈ Ｅｑが尤度比(likelihood ratio)Ｍａｔｈ Ｅｑを最大にするようにする。この関数は、Ｍａｔｈ ＥｑがＭａｔｈ Ｅｑに対する疾患重症度の次の順序であるように定義され、且つ、Ｍａｔｈ Ｅｑ及びＭａｔｈ Ｅｑは、超平面Ｍａｔｈ Ｅｑ及びＭａｔｈ Ｅｑによって作成されたグリッドの象限Ｉ及びＩＩＩである。トレーニングセット中のサンプルは、既知の分子サブタイプを有する各グリッドにマッピングされ、そして尤度比は、Ｍａｔｈ Ｅｑによって定義されるサブタイプの分離のために計算される。Ｍａｔｈ Ｅｑに使用された重症度のランキングは、正常(Ｎｏｒｍａｌ)＜軽度(Ｍｉｌｄ)＜重度(Ｓｅｖｅｒｅ)であった。従って、Ｍａｔｈ Ｅｑにおける各座標セットは、ＩＫＺＦ１／ＤＬＸ４メタアクティビティ空間における異なる分子クラスのサンプル間の分離を最大化する非線形平面への点を定義する。
細胞毒性アッセイ
Ｐｒｏｍｅｇａを介して入手可能なＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞毒性アッセイを用いて、ＰＢＭＣ依存性細胞傷害性を測定した。サンプル及び溶液の処理のために、発明者らは製造者のプロトコルに従った。ＰＢＭＣ：Ｔの最適化は以下のように、但し、可変濃度を用いて（１：１，５：１及び１０：１）行った（図３２）。
細胞毒性実験を９６ウェル形式で行い、各処理を三重に行った。形質移入は、実験の３６時間前に行った。実験の日に、ＨＫ及びｈｕＤＰ細胞をトリプシン処理し、ダルベッコの改変イーグル培地（Dulbecco’s modified Eagle’s medium,ＤＭＥＭ）で希釈して作業ストックにした。１ウェルあたりのＴ濃度は５０μＬのＤＭＥＭ中で８０，０００細胞であり、８００，０００個のＰＢＭＣと組み合わせた。ＮＫＧ２Ｄインヒビターは、２０μｇ／ｍＬの最終濃度で用いたＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｔ．ＭＡＢ１３９）からのヒトＮＫＧ２Ｄ ＭＡｂ（クローン１４９８１０）であった。各形質移入は、製造者の指示に従って三重に割り当てた。
遺伝子発現研究
９６人の患者からの合計１２２のサンプルを、２８人のＡＡＰ患者、３２人のＡＴ／ＡＵ患者、及び３６人の未罹患コントロールからなるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３ ２Ｐｌｕｓアレイでプロファイリングした。残りの２６のサンプルは、ＡＡＰコホートからの患者適合非病変生検に対応する。これらの非病変サンプルは、初期シグニチャの推論には含まれなかったが、後で使用されました（下記）。これらの患者生検からのＲＮＡを単離し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３ ２Ｐｌｕｓアレイで処理した。データの後処理は、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒを介して入手可能な標準パッケージでＭＡＳ５正規化を使用してＲを介して行われた。これらのデータは、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＯｍｎｉｂｕｓでＧＳＥ６８８０１として入手可能である。このデータセットは、トレーニングと検証のために２つのセットに分かれていた。
遺伝子マーカーの最初のパネルは、（１）ＡＡ対罹患していない、及び（２）トレーニングセットにおける病変対非病変、を比較する２つの異なる発現解析によって同定された。閾値は、ｐ＜０．０５及びフォールドチェンジ＞２５％での発現差異(differential expression)のために設定した。この比較的緩慢な閾値は、ネットワーク分析がコンセンサスに基づくため実施された。分析は、主として候補ランクに関係するものではなく、それよりもＴＦ活性を推論するのに十分な分子情報を有することに依存する。このアプローチは、ノイズの加算がデータセット全体に適用され、且つ、ＡＲＡＣＮｅとマスターレギュレータ解析（下記参照）の両方でコンセンサスから正規化されるため、より緩和した閾値によって導入される可能性のあるノイズに対して必然的に強固である。発現差異のある遺伝子のランク付け及びクラスタ化におけるいずれの可能性のあるジェンダーバイアスを除去するために、すべてのＸ結合遺伝子及びＹ結合遺伝子をさらに除去した。
遺伝子セット濃縮分析（Gene Set Enrichment Analysis,ＧＳＥＡ）
ＧＳＥＡは、定義された遺伝子パネルの発現差異におけるノンパラメトリックな統計的濃縮を測定する方法である。実験コホートとコントロールコホートとの間のデフォルトの発現差異解析が行われ、そして、遺伝子は閾値なしの発現差異によってランクソートされる（すべての遺伝子が含まれる）。これは、ユーザーが指定したいずれの基準（フォールドチェンジ、ｐ値など）に従って行うことができる。
次いで、この濃縮スコアは、サンプルラベルをシャッフルすることによって、すなわちケースサンプル及びコントロールサンプルをランダム化し、且つ、分析を繰り返すことによって、経験的に生成された帰無分布(null distribution)と比較される。これを１０００回の反復にわたって繰り返して、濃縮スコアの帰無分布を生成し、観察されたスコアをｐ値を生成するために比較することができる。
クローニング
下記に提供される各プライマー対を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に由来するｃＤＮＡについての製造業者のプロトコルに従って、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ Ｔａｑ ＰＣＲミックスとのＰＣＲ反応において使用した。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いて培養細胞からｃＤＮＡを生成した。ＰＣＲ産物をゲル電気泳動で使い果たし、そして、存在するいずれのアイソフォームをＱｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて別々に切除した。
Ｇｅｎｅｗｉｚからの配列決定を介してｍＲＮＡの忠実性を確認し、且つ、ＳｍａｒｔＣｕｔ緩衝液中のＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの適切な酵素（ＳＰＥＩ及びＡＳＣＩ）で２時間消化した。ｐＬＯＣ−ＲＦＰベクターを並行して消化し、そして切断されたバックボーンをゲル抽出によって切除した。バックボーン及びインサートの精製後、製造業者のプロトコルに従ってＲｏｃｈｅからのＲａｐｉｄＬｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて各インサートを切断ｐＬＯＣベクターに連結し、そして、増幅のためにＤＨ５α細胞に形質転換した。
成功した形質転換は、コロニーＰＣＲ及び配列決定（Ｇｅｎｅｗｉｚ）を介して配列忠実度について検証された。正確な構築物を増幅し、及びＭａｘｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）によって実験用に精製した。
ｐＬＯＣベクターへの挿入のために遺伝子をクローニングするために使用されるプライマーは、以下のフォーマット、５’から３’： スペーサ−酵素−ｍＲＮＡ配列で以下に提供される。
ＩＫＺＦ１．１
フォワード(Forward) ＧＧＣ−ＡＣＴＡＧＴ−ＡＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＧＧＴＣＡＡ
リバース(Reverse) ＡＴＴ−ＧＧＣＧＣＧＣＣ−ＴＴＡＧＣＴＣＡＴＧＴＧＧＡＡＧＣＧＧＴ
ＩＫＺＦ１．２
フォワード ＧＧＣ−ＡＣＴＡＧＴ−ＡＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＧＧＴＣＡＡＧ
リバース ＡＴＴ−ＧＧＣＧＣＧＣＣ−ＴＴＡＧＣＴＣＡＴＧＴＧＧＡＡＧＣＧＧＴ（１．１と同一）
ＤＬＸ４
フォワード ＧＧＣ−ＡＣＴＡＧＴ−ＡＴＧＡＡＡＣＴＧＴＣＣＧＴＣＣＴＡＣＣＣＣ
リバース ＡＴＴ−ＧＧＣＧＣＧＣＣ−ＴＣＡＴＴＣＡＣＡＣＧＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧ
細胞培養及び形質移入
ｈｕＤＰ及びＨＫ細胞の両方を、増殖のための標準条件： ３７℃及び５％ＣＯ２においてＤＭＥＭ １０％ＦＢＳにおいて、維持した。ｈｕＤＰ細胞は、ヒトの皮膚サンプルから顕微解剖された培養初代ヒト真皮乳頭である。この研究の実験では、継代数が６未満（＜６）のｈｕＤＰ及びＨＫ細胞のみを使用した。
製造元のプロトコルに従ってＪｅｔＰＲＩＭＥ形質移入試薬を用いて細胞をｐＬＯＣ発現構築物で形質転換した。形質移入は、試薬（ｕｌ）とＤＮＡ（ｕｇ）との２：１濃度を用いて一晩行われた。
ＭＲレスキューのマイクロアレイ
ＩＫＺＦ１及びＤＬＸ４のＨＫ及びｈｕＤＰ細胞への形質移入を、上記のように、１０ｃｍプレートで培養した細胞中で行った。形質移入の３６時間後(36 hours post-transfection)、細胞を掻き取りしたＰＢＳ中でこれらの細胞を回収し、次いで、製造元のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙキットを用いて精製したＲＮＡを溶解し、処理した。ＲＮＡ品質管理は、分光計を使用して行い、且つ、コロンビア施設（病理学科）によってＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトＵ１３３ ２Ｐｌｕｓアレイ上で処理するために提出された。アレイデータを再び正規化し、そして、ＲにおけるＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージを介したＭＡＳ５正規化を用いて処理した。
ｑＰＣＲｓ
８つの一次病変(primary lesional)生検（１つは劣化していることがわかり、研究から除外された）、４つの未罹患コントロール、及び患者適合性病変サンプルと非病変サンプルとのペア５対の独立したコホートから抽出されたｃＤＮＡについて、定量ＰＣＲ反応を行った。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いた反応ミックスを、製造業者のプロトコルに従って２５ｕＬ容量で作製し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの７３００シリーズリアルタイムＰＣＲ装置で分析した。各遺伝子のプライマーは、このセクションの最後に提供される。
全てのサンプルをスタンププレート形式の技術的三連体で試験した（それぞれの複製は、すべての試料及びコントロールを一度に調製し、３回反復して１つのプレートで行った）。これらの複製からのデータを、δδＣＴ法により分析し、すべての実験系列をコントロール組織の平均正規化値に正規化した。平均値の標準誤差（ＳＥＭ）は、標準的な統計的誤差伝搬を用いて比較にわたって得られた。
ｑＰＣＲによる転写産物をアッセイするためのプライマーは、５’から３’で以下に提供される。転写物が約３００ｂｐである（提供されたプロトコルの最適転写物長が２００〜３００ｂｐである）ため、ＤＬＸ４の全長増幅のためのプライマーを使用した。
ＩＫＺＦ１
フォワード ＡＣＴＣＣＧＴＴＧＧＴＡＡＡＣＣＴＣＡＣ
リバース ＣＴＧＡＴＣＣＴＡＴＣＴＴＧＣＡＣＡＧＧＴＣ
ＤＬＸ４
＊クローニングプライマーと同じ＊
ＡＣＴＢ
フォワード ＧＡＡＧＧＡＴＴＣＣＴＡＴＧＴＧＧＧＣＧＡＣ
リバース ＧＧＧＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＧＣＧＧＴＴＧ
新鮮な末梢血単核球(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMC)の分離
意図された細胞毒性アッセイの前の夕方に引き出される(draws)全血から新鮮なＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣを、滅菌ＰＢＳ中の全血 １：１の８ｍＬアリコートを希釈し、及び最終体積比２：１でＦｉｃｏｌｌ上に前記溶液を重層することにより、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７試薬（Ｆｉｃｏｌｌ）を用いて全血から分離した。この溶液を１２００ｒｐｍで４５分間遠心分離した。単球含有界面層を単離し、５倍容量の滅菌ＰＢＳで希釈し、及び１５００ｒｐｍで１５分間再度遠心分離した。上清を捨て、ペレットを３ｍｌのＤＭＥＭ １０％ＦＢＳに再懸濁した。血球計数器を用いて細胞計数を行い、そして、溶液をＤＭＥＭ １０％ＦＢＳで１ｍＬあたり１×１０６細胞の最終濃度に希釈した。これを翌朝実験のために３７℃及び５％ＣＯ２で一晩保存した。
図示され特許請求される様々な実施形態に加えて、開示される主題はまた、本明細書に開示され、特許請求される特徴の他の組み合わせを有する他の実施形態に関する。このように、本明細書に提示される特定の特徴は、開示される主題が本明細書に開示される特徴の任意の適切な組合せを含むように、開示される主題の範囲内の他の方法で互いに組み合わせることができる。開示された主題の特定の実施形態の前述の説明は、例示及び説明のために提示されている。包括的であること、又は開示された主題を開示された実施形態に限定することを意図するものではない。
様々な刊行物、特許及び特許出願、及びプロトコルが本明細書に引用されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (26)

  1. 対象者の円形脱毛症（ＡＡ）を処置する方法であって、
    （ａ）前記対象者のＡＡ疾患重症度を、前記疾患重症度を示すバイオマーカーを検出することによって同定するステップ、及び
    （ｂ）同定された疾患重症度に適切な治療的介入を前記対象者に施すステップ、
    を含む、方法。
  2. 対象者の円形脱毛症（ＡＡ）を処置する方法であって、
    （ａ）ＡＡを有する対象者のＪＡＫインヒビター処置に応答する傾向を、前記傾向を示すバイオマーカーを検出することによって同定するステップ、及び
    （ｂ）前記対象者が前記インヒビターに応答する傾向を、同定されたバイオマーカーが示す場合に、ＪＡＫインヒビターを前記対象者に投与するステップ、
    を含む、方法。
  3. 対象者の円形脱毛症（ＡＡ）を処置する方法であって、
    （ａ）ＪＡＫインヒビターを前記対象者に投与するステップ、及び
    （ｂ）ＪＡＫインヒビター処置への応答性を示すバイオマーカーを検出するステップ、及び、
    （ｃ）その後、（１）前記ＪＡＫインヒビターの投与を続けること、（２）前記ＪＡＫインヒビターの投与を変更すること、又は（３）前記ＪＡＫインヒビターの投与をやめることのいずれかによって、前記応答性に基づいて前記ＪＡＫインヒビターの投与を適合させるステップ、
    を含む、方法。
  4. 前記バイオマーカーを検出することは、前記対象者から得られたサンプルに対して実行され、前記サンプルは、皮膚、血液、血清、血漿、尿、唾液、痰、粘液、精液、羊水、口腔洗浄液及び気管支洗浄液からなる群から選択される、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記対象者は、ヒトである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記サンプルは、皮膚サンプルである、請求項４に記載の方法。
  7. 前記サンプルは、血清サンプルである、請求項４に記載の方法。
  8. 前記バイオマーカーは、遺伝子発現シグニチャである、請求項４に記載の方法。
  9. 前記遺伝子発現シグニチャは、以下の遺伝子の群：ＫＲＴ関連遺伝子、ＣＴＬ関連遺伝子及びＩＦＮ関連遺伝子、のうちの一つ又はそれ以上の遺伝子発現情報を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ＫＲＴ関連遺伝子は、ＤＳＧ４、ＨＯＸＣ３１、ＫＲＴ３１、ＫＲＴ３２、ＫＲＴ３３Ｂ、ＫＲＴ８２、ＰＫＰ１及びＰＫＰ２を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ＣＴＬ関連遺伝子は、ＣＤ８Ａ、ＧＺＭＢ、ＩＣＯＳ及びＰＲＦ１を含む、請求項９に記載の方法。
  12. 前記ＩＦＮ関連遺伝子は、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＳＴＡＴ１及びＭＸ１を含む、請求項９に記載の方法。
  13. 前記遺伝子発現シグニチャは、円形脱毛症疾患活性係数（ＡＬＡＤＩＮ）である、請求項８に記載の方法。
  14. 前記遺伝子発現シグニチャは、表Ａに定められる一つ又はそれ以上の遺伝子を含む円形脱毛症遺伝子シグニチャ（ＡＡＧＳ）である、請求項８に記載の方法。
  15. 前記遺伝子発現シグニチャは、ＩＫＺＦ１、ＤＬＸ４又はそれらの組み合わせである、請求項１４に記載の方法。
  16. 検出は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイによって実行される、請求項８に記載の方法。
  17. 検出は、マイクロアレイ解析によって実行される、請求項８に記載の方法。
  18. 検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は核酸シークエンシングによって実行される、請求項８に記載の方法。
  19. 前記バイオマーカーはタンパク質である、請求項４に記載の方法。
  20. 前記タンパク質の存在は、前記タンパク質と特異的に結合する試薬を使用して検出される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記試薬は、モノクローナル抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又はポリクローナル抗体若しくはその抗原結合フラグメントである、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記タンパク質の存在は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光測定、又はウェスタンブロットアッセイによって検出される、請求項２０に記載の方法。
  23. 対象者の円形脱毛症（ＡＡ）を処置するためのキットであって、
    （ａ）対象者の疾患重症度を示すバイオマーカーを検出するために有用な、一つ又はそれ以上の検出試薬、及び
    （ｂ）ＡＡを処置するために有用な、一つ又はそれ以上の処置試薬、
    を含む、キット。
  24. 対象者の円形脱毛症（ＡＡ）を処置するためのキットであって、
    （ａ）前記対象者の、ＡＡを処置するために有用な処置試薬に応答する傾向を示すバイオマーカーを検出するために有用な、一つ又はそれ以上の検出試薬、及び
    （ｂ）ＡＡを処置するために有用な、一つ又はそれ以上の処置試薬、
    を含む、キット。
  25. 一つ又はそれ以上のプローブセット、アレイ／マイクロアレイ、バイオマーカー特異的抗体及び／又はビーズを更に含む、請求項２３又は請求項２４に記載のキット。
  26. 当該キットの使用のための一組の説明書を更に含む、請求項２３又は請求項２４に記載のキット。
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Al Mashhadani From Lübeck Institute for Experimental Dermatology (LIED) Supervised by Prof. Hauke Busch
JP2023543763A (ja) バイオマーカー