JP2018522250A - 分子分光分析用顕微鏡 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、試料の分子分光分析用顕微鏡に関し、該顕微鏡は、赤外線(IR)放射する少なくとも1つの量子カスケードレーザー(QCL)と、QCLと試料との間に配置された位相変調器と、位相変調器と試料との間に配置された少なくとも1つの光学素子と、試料を透過したおよび/またはそれによって反射されたIR放射を検出するセンサとを有するビーム経路を有する。更に、本発明は、試料の分子分光分析方法にも関し、該方法は、量子カスケードレーザー(QCL)を用いて赤外線(IR)を放射する工程であって、該IRが位相変調器および少なくとも1つの光学素子を経て試料に向けられる工程と、試料によって反射されたおよび/またはそれを透過するIRを検出する工程とを有する。
好ましい実施形態では、各光学素子は互いに独立したレンズまたは対物レンズである。
好ましい実施形態では、顕微鏡は参照用の装置を有する。参照により、測定中のレーザーパワーおよび波長の制御が可能となる。それは例えば、位相依存干渉計またはスペクトル測定範囲で吸収するガス(例えばエタノール)で満たされた耐熱性のガスセルによって行われてもよい。
1.好ましい実施態様
図1は本発明の顕微鏡1の一般的な第一実施形態を示す。顕微鏡1は2つのQLC3を有しており、そのレーザービームは、方向変換ミラー12およびビームスプリッタを通して、回転する位相変調器へ放射される。その後、放射はレンズ6を通過し、試料ホルダ8に固定されている試料2に至る。試料2が発するIR放射はセンサ4により検出される。同時に、QCL3のレーザー放射の一部は、ビームスプリッタ24を通して波長参照装置7へ供給される。顕微鏡1の制御および検証は、レーザー制御装置9、記録装置10、およびロックイン増幅器11を通して行われる。
位相変調器の構成を確立するため2つのブランク測定の参照操作が行われたが、その場合、散乱板の回転速度および照明は様々であった。全ての測定が、1027cm−1から1087cm−1のスペクトル範囲を有するQCLで行われた。照明の光学構成が図3Bに示してある。散乱板は両方とも直径25.4mmを有していた。レーザービームの直径は約10mmであった。各ブランク測定において、1027cm−1から1087cm−1まで、約11秒間に3回QCLの調整が行われた。検出は、有効画素サイズ3.65μmを用いて撮像スケール4:1で行われた。マイクロボロメータはフレームレート50Hzで作動した。
関数:y = b1 *(2*π*7.3 μm* ((350−x)+b2) * 62.5 Hz + b3
(ここで、yは平均空間標準偏差(a.u.)であり、xは列番号であり、b1は経路速度と平均空間標準偏差との間の比例定数(a.u./(m/s))であり、b2は右側画像縁からの、散乱板の中心間隔であり、b3は経路速度から独立した、平均空間標準偏差の割合(a.u.)である。)
右側画像縁からの散乱板の中心間隔として、200列または1000列(1.46mmおよび7.3mmに対応)が採用された。1つの列は7.3μmの間隔に対応する。
3.1 機器および方法
大腸の試料を健康なC57BL/6成熟マウスから取り出し固定した。該組織から厚さ8μmのパラフィン切片を得て、IR顕微鏡で検査した。
1.いわゆるトレーニングサンプルとして使用された6つの薄切片の1つを無作為に選択。
2.トレーニングサンプルの情報のみを用いたサンプルデータの非監視分類。トレーニングデータにk平均アルゴリズムを適用し、全部で10のグループを選別し、その中で3つをパラフィンスペクトルまたはブランクサブストレートに対応づけ、7つを組織に対応付けた。分類方法をトレーニングするのに、全部で323,300の個々のスペクトルが使用された。
3.工程2に基づく分類方法のトレーニング(ランダムデシジョンフォーレスト)。トレーニングサンプルだけが使用された。全部で100のデシジョンツリーが創出された。
4.工程1〜3の後、追加のトレーニング(「再訓練」)または変更は受け付けなかった。トレーニングされた分類方法はその後残りの薄切片に適用され(ブラインドバリデーション)、分析結果として使用された。
3.2 結果
取得画像の品質に関する第一印象を得るには単一波長の分析で既に十分であった。完全な大腸切片に関する1218cm−1(+/−1.2cm−1)での透過記録は、大腸上皮および筋肉組織(粘膜筋層)によって囲まれた中央ルーメンを明瞭に示している。デジタルズームにより上皮の下部構造も同定できた。単一波長の記録から驚くほど広範囲な情報が得られたが、データ分析の第二工程(k平均)による全スペクトルも追加検査として使用された。得られたIR画像は、組織形態並びに大腸内部のムチン層を明瞭に示していた。ムチン層はビーカー状細胞により生成されるムチンを特に含んでおり、非常にグリコシル化されたペプチドの割合が大きいので、炭水化物の範囲(1000cm−1から1100cm−1)に顕著なIR吸収を有する。ハイパースペクトル記録の各画素を特定の組織に対応付けるため、1079cm−1および1181cm−1における吸光率並びに1027cm−1から1087cm−1までの吸光全体が計算された(表1)。従って、ムチン層およびビーカー状細胞だけでなく、筋層、固有層、およびビーカー状細胞を取り囲んでいる上皮細胞も同定できた。
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2 試料
3 QCL
4 センサ
5 位相変調器
6 光学素子
7 波長参照装置
8 試料ホルダ
9 レーザー制御装置
10 記録装置
11 ロックイン増幅器
12 方向変換ミラー
20 マイクロボロメータFPA
21 IR透過散乱板(可動)
22 試料上で位相変調器を結像させるためのレンズ
23 IR透過散乱板(非可動)
24 ビームスプリッタ
25 IR反射散乱ミラー(可動)
26 IR反射散乱ミラー(非可動)
27 回転している位相変調器にQCL放射の焦点を合わせるためのレンズ
28 試料からの放射の焦点を検出器に合わせるためのレンズ
29 レーザー放射
30 コレクタレンズ(セレン化亜鉛、f=25mm)
31 セレン化亜鉛レンズ(f=50mm)
32 コンデンサレンズ(フッ化バリウム、f=30/22.8mm)
33 絞り
34 明視野絞り
Claims (12)
- 試料(2)の分子分光分析用顕微鏡であって、該顕微鏡は、
赤外線(IR)放射する少なくとも1つの量子カスケードレーザー(QCL)(3)と、
前記量子カスケードレーザー(QCL)(3)と前記試料(2)との間に配置された位相変調器(5)と、
前記位相変調器(5)と前記試料(2)との間に配置された少なくとも1つの光学素子(6)と、
前記試料(2)を透過したおよび/または前記試料(2)によって反射された赤外線(IR)放射を検出するセンサ(4)と
を有するビーム経路を有するものあり、
前記位相調整器(5)は、回転自在な赤外線(IR)透過散乱板(21)または赤外線(IR)放射を反射する回転自在な散乱ミラー(25)であり、
前記位相変調器(5)は分析中連続して回転され、前記位相変調器(5)の中心部において散乱した赤外線(IR)放射が前記試料(2)に衝突しないように、前記顕微鏡(1)のビーム経路に配置されることを特徴とする、
顕微鏡。 - 請求項1記載の顕微鏡(1)において、前記位相変調器(5)は、前記位相変調器(5)の中心部が前記赤外線(IR)放射に含まれないように、前記顕微鏡(1)のビーム経路に配置されることを特徴とする顕微鏡。
- 請求項1または2記載の顕微鏡(1)において、前記量子カスケードレーザー(QCL)(3)は外部共振器型量子カスケードレーザー(3)(EC−QCL)であることを特徴とする顕微鏡。
- 請求項1〜3のいずれか1つに記載の顕微鏡(1)において、前記量子カスケードレーザー(QCR)(3)は分析中連続して調整されることを特徴とする顕微鏡。
- 請求項1〜4のいずれか1つ記載の顕微鏡(1)において、前記量子カスケードレーザー(QCR)(3)は、分析中5cm−1/s〜30cm−1/sの速度で、好ましくは10cm−1/s〜20cm−1/sの速度で、更に好ましくは約10cm−1/sの速度で調整されることを特徴とする顕微鏡。
- 請求項1〜5のいずれか1つ記載の顕微鏡(1)において、前記センサ(4)は温度センサであり、好ましくはマイクロボロメータ(20)であることを特徴とする顕微鏡。
- 請求項1〜6のいずれか1つ記載の顕微鏡(1)において、前記位相変調器(5)は、前記センサ(4)よりもフレームレートの少なくとも5%、好ましくは少なくとも8%、更に好ましくは少なくとも20%速い速度で回転することを特徴とする顕微鏡。
- 請求項1〜7のいずれか1つ記載の顕微鏡(1)において、さらに、第二の静的位相変調器を有するものである顕微鏡。
- 試料(2)を分子分光分析する方法であって、
量子カスケードレーザー(QCL)(3)を用いて赤外線(IR)を前記試料(2)に対して放射する工程であって、前記IR放射は位相変調器(5)と少なくとも1つの光学素子(6)を通して前記試料(2)に向けられるものである、前記放射する工程と、
前記試料(2)によって反射されたおよび/または前記試料(2)を透過した赤外線(IR)放射を検出する工程とを有し、
前記位相調整器(5)は、回転自在な赤外線(IR)透過散乱板(21)または赤外線(IR)放射を反射する回転自在な散乱ミラー(25)であり、
前記位相変調器(5)は前記検出する工程中に連続して回転されることにより、前記位相変調器(5)の中心部で散乱される赤外線(IR)が前記試料(2)に対して放射されないことを特徴とする、
方法。 - 請求項9記載の方法において、前記位相変調器(5)の中心部は前記赤外線(IR)放射には含まれないことを特徴とする方法。
- 請求項9または10記載の方法において、少なくとも2つの異なる波長、好ましくは2〜10の異なる波長、更に好ましくは2〜6のの異なる波長、更に好ましくは2から4の異なる波長を有する透過したおよび/または反射された赤外線(IR)放射が検出されることを特徴とする方法。
- 請求項9〜11のいずれか1つ記載の方法において、前記IR放射は、1cm−1〜8cm−1のスペクトル分解能、好ましくは2cm−1〜8cm−1のスペクトル分解能、更に好ましくは4cm−1〜8cm−1のスペクトル分解能で検出されることを特徴とする方法。
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