JP2018518991A - ペプチドライブラリの構成方法及び関連ベクター - Google Patents
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Abstract
本発明は、改良されたペプチドライブラリの調製方法を提出し、前記方法は、例えば完全なトリペプチドライブラリ、テトラペプチドライブラリ、ペンタペプチドライブラリ、ヘキサペプチドライブラリ、ヘプタペプチドライブラリ、又は完全なオクタペプチドライブラリなどのような完全なペプチドライブラリを構成するための方法である。前記方法は、タグ付きペプチドを発現するための発現ベクターを構成することを含む。各タグ付きペプチドは、異なるサイズのペプチド配列を含み、また、従来の化学的ペプチド合成に比べると、完全なペプチドライブラリにおけるペプチドの数は顕著に低減され得る。さらに、このライブラリは容易に再生できる。改良されたペプチドライブラリの調製方法は特に、例えば完全なペンタペプチドライブラリを構成するために適用できる。本発明は、他の関連方法及び関連発現ベクターも提出した。【選択図】図２
Description
本発明は、例えば完全なトリペプチドライブラリ、テトラペプチドライブラリ、ペンタペプチドライブラリ、ヘキサペプチドライブラリ、ヘプタペプチドライブラリ、又は完全なオクタペプチドライブラリなどのような完全なペプチドライブラリを構成するための方法に関する。前記方法は、タグ付きペプチドを発現するための発現ベクターを構成することを含む。各タグ付きペプチドは、異なるサイズのペプチド配列を含み、また、従来の化学的ペプチド合成に比べると、完全なペプチドライブラリにおけるペプチドの数は顕著に低減され得る。それに、このライブラリは容易に再生できる。改良されたペプチドライブラリの調製方法は特に、例えば完全なペンタペプチドライブラリを構成するために適用できる。
体系的に組み合わせたアミノ酸を有するペプチドを多く含むペプチドライブラリは、バイオ研究、タンパク質関連研究、及び医薬開発において、多くのペプチドから選別して鍵になる生理活性ペプチドを見出す有力な手段として広く適用される。低分子量のペプチドは、アレルギーを起こす可能性が低く、ペプチドが有する多様な生理的役割のため、治療剤の開発に好適な候補物になることが知られている（非特許文献１〜３）。特に、低分子医薬の副作用が非常に注目され、また、健康予防又は健康促進という特性を有するもっと新鮮で環境に優しい食品と栄養品が注目されることに伴って、生理活性ペプチドは、新世代の医薬製品として好適な候補になってきた（非特許文献４）。
抗菌ペプチド、抗がんペプチド、酸化防止ペプチド、血圧降下ペプチド、抗血栓ペプチド、オピオイドペプチド、抗ウイルス性ペプチド、細胞調節ペプチド、免疫調節ペプチドなどを含む様々な生理活性ペプチドは、既に発見された（非特許文献５〜６）。そのため、ペプチド医薬の開発は、新しい医薬の開発において最も有望と視される分野の一つである。
ペプチドライブラリは、医薬開発、タンパク質間相互作用、及び他のバイオケムや医薬適用に有力な手段を提供するため、ペプチドライブラリを構成するいくつかの方法が開発された。これらのペプチドライブラリの構成方法は、合成化学手段による方法とバイオ技術による方法の２種類に分けられる。１９８５年にＧｅｏｒｇｅ Ｐ．Ｓｍｉｔｈが提出したファージ表示技術によって、多くの異なるペプチドの選別が可能になる（非特許文献７）。ファージ誘導ペプチドの成功は、基本的に選別されたライブラリの品位によることが発見された（非特許文献８）が、ファージ表示ライブラリの品位をモニター又は確保する実際の方法はない。実際的には、今まで、ファージ表示によって選択されたペプチドは、極一部だけが臨床に適用される（非特許文献９）。
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄによって開発された固相合成に基づいて、ペプチドライブラリを構成するための組み合わせ「分裂・混合合成」という方法が開発された（非特許文献１０）。論理的には、このように多くのペプチドを合成して大規模なライブラリを調製することができるが、実践する際に、このように合成されたペプチドは、数も量もライブラリ合成の高コストと低スループットに制限された。
また、多くの異なるペプチドを合成してペプチドライブラリを構成することもできる。どのペプチドが好ましい候補医薬になるかを予測する良い方法はないから、アミノ酸の全てのあり得る組み合わせを含む完全なペプチドライブラリを構成するように希望し、ペプチドの選別期間において好ましい候補医薬を見出す可能性が高い。天然に存在するアミノ酸は２０個あるため、完全なトリペプチドライブラリを構成するためには８，０００個のトリペプチドを合成する必要がある。同様に、完全なテトラペプチドライブラリを構成するために１６０，０００個のテトラペプチドを合成する必要があり、完全なテトラペプチドライブラリを構成するために３，２００，０００個のヘプタペプチドを合成する必要があり、完全なテトラペプチドライブラリを構成するために６４，０００，０００個のヘキサペプチドを合成する必要がある。また、多くのペプチドを合成する高コストと低スループットのため、完全なヘプタペプチド又はヘキサペプチドライブラリはもとより、１６０，０００個のテトラペプチドを含むべきである完全なテトラペプチドライブラリも今、市場には取得できない。
そのため、高生産率で大容量のペプチドライブラリを構成するための方法が求められる。本発明の実施形態は、このような大容量のペプチドライブラリを構成するための方法に関する。
Ｈｏｓｔ Ａ，Ｈａｌｋｅｎ Ｓ． Ｈｙｐｏａｌｌｅｒｇｅｎｉｃ ｆｏｒｍｕｌａｓ−ｗｈｅｎ，ｔｏ ｗｈｏｍ ａｎｄ ｈｏｗ ｌｏｎｇ：ａｆｔｅｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ １５ ｙｅａｒｓ ｗｅ ｋｎｏｗ ｔｈｅ ｒｉｇｈｔ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ ２００４ Ａｕｇ;５９（Ｓｕｐｐｌ．７８）：４５〜５２
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Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ． Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｓｉｏｎ ｐｈａｇｅ：ｎｏｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｄｉｓｐｌａｙ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｖｉｒｉｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８５，２２８，１３１５−１３１７
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Ｌｉｎｄｎｅｒ Ｔ，Ｋｏｌｍａｒ Ｈ，Ｈａｂｅｒｋｏｒｎ Ｕ ａｎｄ Ｍｉｅｒ Ｗ． ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｇｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１１，１６，１６２５−１６４１
Ａ．Ｆｕｒｋａ，Ｆ．Ｓｅｂｅｓｔｙｅｎ，Ｍ．Ａｓｇｅｄｏｍ，Ｇ．Ｄｉｂｏ， Ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｘｔｕｒｅｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，１９９１，３７，４８７−４９３
本発明の一つの目的は、完全なペプチドライブラリを構成する新しい方法を提供することにあり、前記ペプチドライブラリは、多くの異なるサイズのペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を発現・表示する。このようにアミノ酸が２００個と多いペプチドを設計することによって、（ｉ）利用できるタンパク質構造予測手段によって予測されるように、ペプチドは、著しい三次構造を形成しない、（ｉｉ）ペプチドは、短いペプチドの繰り返しをできるだけ少なく含み、ペプチドライブラリの容量が増える。ペプチドは、ＧＳＴ、ＳＵＭＯ、ＣＢＤなどのようなタグ付きタンパク質のＣ末端テールとして発現される。まず、タグは発現され、そして正確に折り畳まれ、その後ペプチドテールは、自由に移動するテールとして発現される。前記ペプチドは、タグタンパク質のＣ末端に表示され、「タンパク質表示」と称され、前記タグは、ペプチドの発現と精製を促進する。このように構成されるペプチドライブラリは、「タンパク質表示」ペプチドライブラリと称される。
本発明のもう一つの目的は、単一の発現されたペプチドから多くのペプチドを表示するための方法、ライブラリの容量を顕著に増加する方法を提供することにある。例えば、合理的な設計によって、５０個のアミノ酸が発現されるペプチドは実際に、４７個の異なる連続のテトラペプチド、４６個の異なる連続のヘプタペプチド、４５個の異なる連続のヘキサペプチド、４４個の異なる連続のヘプトペプチド、…、３個の異なる連続の４８−ｍｅｒペプチド、２個の異なる連続の４９−ｍｅｒペプチド、及び１個の５０−ｍｅｒペプチドを含み、サイズ範囲が４〜５０個のアミノ酸である４０８個のペプチドを構成することができる。
本発明のもう一つの目的は、ペプチドの数が顕著に低減された完全なペプチドライブラリを構成するための方法を提供することにある。例えば、合理的な設計によって、５０個のアミノ酸が発現されたペプチドは実際に、４７個の異なる連続のテトラペプチドを含むことができ、３，４０５個の発現された５０−ｍｅｒペプチドは完全なテトラペプチドライブラリを構成できるが、完全なテトラペプチドライブラリを構成するように１６０，０００個のテトラペプチドを合成する必要がある。３，４０５個の合成された５０−ｍｅｒペプチドも、完全なテトラペプチドライブラリを構成できるが、それほど多くの長い（５０−ｍｅｒ）ペプチドを合成するためにスループットが低く、コストが高くなり過ぎる。しかし、ペプチドが長く（５０−ｍｅｒ）ても短くても、タグ付きペプチドの発現は問題がない。
本発明のもう一つの目的は、完全なペンタペプチドライブラリを構成するための方法を提供することにある。合理的な設計によって、５０個アミノ酸が発現されたペプチドは実際に、４６個の異なる連続のヘプタペプチドを含むことができ、このタンパク質表示方法によって、完全なペンタペプチドライブラリを構成するように、３，２００，０００個の合成ヘプタペプチドの代わりに６９，５６６個の発現された５０−ｍｅｒペプチドだけが必要である。
本発明のもう一つの目的は、ペプチドの数が顕著に低減された非完全なペプチドライブラリを構成するための方法を提供することにある。長いペプチド、例えばオクタペプチド、デカペプチド、又は１５−ｍｅｒ又は２０−ｍｅｒペプチドのようなもっと長いペプチドにとって、完全なライブラリはそれぞれ、２．５６×１０１０個、１．０２４×１０１３個、３．２７７×１０１９個、１．０４９×１０２６個という多くの全てのあり得るペプチドを含む。そのため、それほど多くのペプチドを化学的合成して完全なペプチドライブラリを調製するのは、実際に即さない。しかし、一部のペプチドが高い配列類似性を共有するために、完全なライブラリを構成する必要がない場合もある。合理的な設計によって、効率的なペプチドライブラリを構成するペプチドの数を大幅に低減できる。本発明に係る方法は、ペプチドライブラリにおけるペプチドの数を更に低減し、効率的なペプチドライブラリの構成は実際に可能になる。
本発明のもう一つの目的は、完全なペプチドライブラリを構成するための代替的方法を提供することにある。各ペプチドのＤＮＡ配列が、タグ付きペプチドを発現・精製するための発現ベクターにクローン化される。ベクターを蓄積してもよく、また、いつでもベクターからペプチドを容易に発現又は再生してもよい。ペプチド合成と異なって、各ペプチドは、最初から改めて合成する必要がある。この方法のもう一つの利点は、同じ容易さで異なるサイズのタグ付きペプチドを発現・精製できることにあるが、化学的合成の過程において、長いペプチドは、類似した短いペプチドよりもっと多い工夫を要する。
本発明のもう一つの目的は、ペプチドライブラリを構成するためのタグ付きペプチドを発現・精製するための発現ベクターを構成するための方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、請求の範囲によって明らかになる。随付図面及び以下の記述に、本発明開示の実施形態の詳細を説明するが、他の特徴、目的及び利点は、前記した記述、随付図面及び請求の範囲によって明らかになる。
随付図面に基づいて説明すると、前記発明の概要及び以下の発明の詳述をより良く理解することになる。本発明を説明するために、好ましい実施形態を随付図面に示す。ただし、本発明は示された随付図面に制限されないことは、理解されるべきである。
特に説明しない限り、本文に用いられる全ての技術及び化学用語は、本発明が属する技術分野の業者が通常に理解する意味と同じである。本文に援用された全ての刊行物及び特許は、引用によって本文に組み込まれる。
本発明の実施形態は、ペプチドライブラリを構成するための方法及びベクターに関する。本発明は、ある局面において、従来の化学的合成によるペプチドライブラリ構成の著しい改良に関する。本発明は例えば、ペプチドを容易に発現・精製するとともに、ライブラリを形成するペプチドの数が顕著に低減された、改良されたペプチドライブラリの構成方法を提供する。
本発明の実施形態によると、ペプチドのアミノ酸配列を合理的に設計することによって、各タグ付きペプチドは、異なるサイズの異なるペプチドの配列を含み、ライブラリの容量を増加することができる。タグ付きペプチドのサイズによると、各ペプチドは、２０個、３０個、５０個、ひいては１００個という所定のサイズの異なるペプチドを含んでもよい。そのため、本発明の実施形態に係る方法によって、ペプチドライブラリにおけるペプチドの数が大幅に低減されるから、顕著に低減されたコストでペプチドライブラリの構成及び選別を行うことになる。
本文に使用されるように、用語「ペプチド」、「ライブラリ」、「タグ」、「タンパク質」、「ベクター」、「容量」、「完全な」、及び「配列」は、その最も広い状況に採用される。
ある一般の局面において、本発明は通常のペプチド合成方法より、ペプチドの数が低減された完全なペプチドライブラリを構成するための方法に関する。例えば、図１に示すように、タンパク質タグのＣ末端に相対的長いペプチドが発現・精製しやすく、又はタンパク質の末端にペプチドが表示され、すなわち「タンパク質表示」である。タンパク質発現に比べると、相対的長いペプチドの化学的合成は効率も高くなくてコストの面でも効果的ではない。例えば、５０−ｍｅｒペプチドを化学的に合成するには数日が必要であるが、類似したペプチドは、細菌宿主に一晩を過ごして容易に発現されることができる。化学的合成された５０−ｍｅｒペプチドは良品率が低いが、類似したペプチドは、いずれのスケールで容易に発現宿主に発現することができる。それに対して、本発明の実施形態は、顕著に低減されたペプチドの数で完全なペプチドライブラリを構成できる方法を提供し、これらのペプチドは容易に発現・精製でき、また、これらのペプチドはいつでも容易に再生できる。本発明の実施形態に係る方法によると、ペプチドライブラリを構成するために要する時間及びコストは大幅に低減した。
本発明の実施形態は、ペプチドの表示に有用であるタンパク質タグに関する。タンパク質タグの一つは、ＧＳＴと融合するターゲットタンパクの精製に通常に用いられるＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）である。ＧＳＴは、ターゲットタンパク又はペプチドの発現に寄与できる。
本発明の一つの実施形態において、タンパク質タグは、例えばＧＳＴ、Ｔｒｘ、ＳＵＭＯ、ＣＢＤ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ａｖｉタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃ−タグ、ＳＢＰ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｆｃ−タグ、Ｈａｌｏ−タグ、Ｖ５、ＶＳＶ、ＭＢＰなどから選択される一つのタグを含み、これに制限されない。
本発明の一つの実施形態において、タンパク質タグは、例えばＧＳＴ、Ｔｒｘ、ＳＵＭＯ、ＣＢＤ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ａｖｉタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃ−タグ、ＳＢＰ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｆｃ−タグ、Ｈａｌｏ−タグ、Ｖ５、ＶＳＶ、ＭＢＰなどから選択されるタグの組み合わせを含み、これに制限されない。
本発明のもう一つの実施形態において、ペプチドの発現・精製を促進するために、ペプチドのＣ末端、ひいてはペプチドの中に他のタグを付加してもよい。タンパク質タグは、ＧＳＴ、Ｔｒｘ、ＳＵＭＯ、ＣＢＤ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ａｖｉタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃ−タグ、ＳＢＰ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｆｃ−タグ、Ｈａｌｏ−タグ、Ｖ５、ＶＳＶ、ＭＢＰなどから選択され、これに制限されない。
タグとペプチドとの間に、少量のアミノ酸又はより多くのアミノ酸の短いペプチドリンカーを付加し、ペプチドのアクセシビリティを向上してもよい。
必要に応じて、プロテアーゼ認識配列をタグとペプチドとの間に付加してもよく、これによってプロテアーゼを使用してタグからペプチドを切ることができる。
本発明は、前記した実施形態を修飾してライブラリ構成をさらに改良することを含み、これは業者によって明らかである。このような修飾は、前記実施形態に一つ又は複数のペプチド配列を付加することを含み、これに制限されない。例えば、ペプチドに少量のＣｙｓアミノ酸を付加してジスルファイド結合を形成し、ペプチド構造を引っ張ってもよい。
本発明開示の内容に鑑みて、効率的なペプチドライブラリを調製するために、多種の方法を利用してペプチド配列を設計することができる。例えば、タグ付きペプチドの可溶性発現を促進するために、長鎖疎水性アミノ酸のペプチド配列を避けるべきである。
業者にとって明らかになるのは、このようにしてペプチドを設計することによって、利用できるタンパク質構造予測手段によって予測されるように、著しい三次構造は形成しない。
業者にとって明らかになるのは、このようにしてペプチドを設計することによって、ペプチドは、できるだけ多くの異なる短いペプチドを含みことができ、ペプチドライブラリの容量が増える。
図２に示す実施形態によると、５０個のアミノ酸が発現されたペプチドは実際に、４７個の異なる連続のテトラペプチド、４６個の異なる連続のヘプタペプチド、４５個の異なる連続のヘキサペプチド、４４個の異なる連続のヘプトペプチド、・・・、３個の異なる連続の４８−ｍｅｒペプチド、２個の異なる連続の４９−ｍｅｒペプチド、及び１個の５０−ｍｅｒペプチドを含み、サイズ範囲が４〜５０個のアミノ酸である４０８個のペプチドを構成することができる。
前記実施形態において、業者にとって明らかになるのは、タグ付きペプチドは、２００個又はこれ以上の多くのアミノ酸、最も好ましいサイズは３０〜１００個を含んでもよい。もっと長いペプチドは、三次構造を形成する可能性がもっと高く、その中の一部のペプチド配列も選別にとって必要ではない。
前記実施形態において、業者にとって明らかになるのは、１６０，０００個のテトラペプチドの化学的合成の代わりに、３，４０５個の発現された５０−ｍｅｒペプチドは、完全なテトラペプチドライブラリを構成できる。
前記実施形態において、業者にとって明らかになるのは、３，２００，０００個のヘプタペプチドの化学的合成の代わりに、６９，６６５個の発現された５０−ｍｅｒペプチドは、完全なペンタペプチドライブラリを構成できる。
前記実施形態において、業者にとって明らかになるのは、ペプチドライブラリにおける一部のペプチドは高い配列類似性を共有し、また、合理的な設計によって、効率的なペプチドライブラリを構成するペプチドの数を大幅に低減できる。そのため、３，４０５個より少ない数の発現された５０−ｍｅｒペプチドは、効率的なテトラペプチドライブラリを構成できる。同様に、６９，６６５個より少ない数の発現された５０−ｍｅｒペプチドは、効率的なペンタペプチドライブラリを構成できる。
前記実施形態において、業者にとって明らかになるのは、タグ付きペプチドは５０個より多いアミノ酸を含んでもよく、これによって発現されたタグ付きペプチドの数が更に低減される。そのため、もっと少ない数の発現されたペプチドは、効率的なテトラペプチド又はペンタペプチドライブラリを構成できる。
前記実施形態において、業者にとって明らかになるのは、ペプチドライブラリにおける一部のペプチドは高い配列類似性と構造類似性を共有し、また、合理的な設計によって、効率的なペプチドライブラリを構成するペプチドの数を低減できる。そのため、実際の数の発現されたタグ付きペプチドは、効率的なポリペプチドライブラリ、例えばオクタペプチドライブラリ、デカペプチドライブラリ、ひいてはもっと長いペプチドライブラリ、例えば１５−ｍｅｒペプチドライブラリ、２０−ｍｅｒペプチドライブラリ、ひいては３０−ｍｅｒペプチドライブラリを構成できる。
好ましい実施形態において、６９，６６５個の発現されたＧＳＴタグ付き５０−ｍｅｒペプチドを設計し、発現ベクターにクローン化して発現・精製して完全なペンタペプチドライブラリを構成してもよい。
前記した実施形態において、業者にとって明らかになるのは、ＧＳＴの代わりに他の一つ又は複数のタグを使用してもよく、前記タグは、Ｔｒｘ、ＳＵＭＯ、ＣＢＤ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ａｖｉタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃ−タグ、ＳＢＰ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｆｃ−タグ、Ｈａｌｏ−タグ、Ｖ５、ＶＳＶ、ＭＢＰなどから選択され、これに制限されない。
前記した実施形態において、業者にとって明らかになるのは、タグ付きペプチドは、５０個より多い又は少ないアミノ酸を含んでもよく、これによって、発現されたタグ付きペプチドの数をさらに低減又は増加して完全なペプチドライブラリを構成する。
図３に示す実施形態によると、任意の一つ又は複数の親和タグＤＮＡ配列、リンカーＤＮＡ配列、任意のプロテアーゼ認識サイト、ペプチド発現ＤＮＡ配列を挿入するためのマルチクローニングサイトを含むタグ付きペプチドの発現ベクターを構成してもよい。
前記した実施形態において、業者にとって明らかになるのは、発現ベクターは、細菌発現ベクター、イースト発現ベクター、昆虫発現ベクター、菌類発現ベクター、哺乳動物発現ベクター及び植物発現ベクターに基づいて構成してもよく、これに制限されない。
本発明のもう一つの実施形態において、発現宿主に発現して発現宿主からタグ付きペプチドを精製してもよい。発現宿主は、細菌細胞、イースト細胞、昆虫細胞、菌類細胞、哺乳動物細胞及び植物細胞から選択され、これに制限されない。
業者にとって容易に理解できるように、通常に、類似した方法をペプチドライブラリの構成に適用してもよい。固体表面に固定化された親和タグを利用して設計されたペプチドを発現、精製した後、まだ固体表面に付着されたペプチドを利用して選別する。設計されたペプチドを固体表面から溶離させてから、選別に使用してもよい。
本発明のいくつかの実施形態を記述したが、注意すべきは、これらの具体的な実施形態の記述はただ、本発明概念の原理の説明である。そのため、本発明の精神と範囲から逸脱しない場合、開示された実施形態の多種の修飾は、業者にとって明らかである。
以下、具体的な実施例に基づいて本発明の性質をさらに説明するが、本発明はこれに制限されないことは、理解すべきである。
（実施例）
タンパク質表示
標準クロー方法によって、三つのペプチド配列（Ｍｙｃ−Ｖ５−Ｆｌａｇ，ＧＡＡＣＡＧＡＡＡＣＴＧＡＴＴＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧＡＣＣＴＴ−ＧＧＴＡＡＡＣＣＧＡＴＴＣＣＧＡＡＣＣＣＧＴＴＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＧ−ＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＡ）のＤＮＡ配列をｐＧＳ２１ベクターにおけるＧＳＴ遺伝子配列にクローン化した後、ＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣＡＧＧＣＣＡＴＡＧＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＴＧＧＧＴのリンカー配列を、ＧＳＴとペプチド配列との間に付加した。誘導物としてＩＰＴＧを使用し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の菌株にＧＳＴタグ付きペプチドを発現した。
タンパク質表示
標準クロー方法によって、三つのペプチド配列（Ｍｙｃ−Ｖ５−Ｆｌａｇ，ＧＡＡＣＡＧＡＡＡＣＴＧＡＴＴＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧＡＣＣＴＴ−ＧＧＴＡＡＡＣＣＧＡＴＴＣＣＧＡＡＣＣＣＧＴＴＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＧ−ＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＡ）のＤＮＡ配列をｐＧＳ２１ベクターにおけるＧＳＴ遺伝子配列にクローン化した後、ＴＣＧＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣＡＧＧＣＣＡＴＡＧＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＴＧＧＧＴのリンカー配列を、ＧＳＴとペプチド配列との間に付加した。誘導物としてＩＰＴＧを使用し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の菌株にＧＳＴタグ付きペプチドを発現した。
Ｎｉ−ＩＤＡカラムを使用してＧＳＴタグ付きペプチドを精製した。ＧＳＴタグ付きペプチドをＮｉ−ＮＤＡコラムに結合し、３００ｍＭイミダゾールでコラムから溶離させた。透析溶液（０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、水中）によって溶離液を透析させた。
図５に、ＧＳＴタグ付きペプチド配列が可溶性タンパク質として発現されることを示し、その中、レーンＭはタンパク質マーカーであり、その左側に分子量がリストされ、レーン１は誘導されない全タンパク質（Ｕｎｉｎｄ．）であり、レーン２は１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導された全タンパク質（Ｉｎｄ．）であり、レーン３はサンプルの透過液（ＦＴ）であり、レーン４は精製されたＧＳＴタグ付きペプチド（ｔＰｅｐｔ．）である。
ＥＬＩＳＡ結果を図６に示す。標準ＥＬＩＳＡ方法によってＨＲＰで標記された第２の抗体を利用して測定した（ａｓｓｙ）。対応する抗体によって三つのペプチド（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ−ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ−ＤＹＫＤＤＤＤＫのアミノ酸配列を有するＭｙｃ−Ｖ５−Ｆｌａｇ）のそれぞれを認識して検出することができる。ＮＣは陰性コントロールである。１Ｘは、精製されたサンプルを希釈せずに直接にＥＬＩＳＡ測定に用いることを意味し、５Ｘと２５Ｘは、精製されたサンプルをそれぞれ５倍と２５倍希釈することを意味する。ＨＲＰの基質としてＴＭＢ溶液を使用する。
本文に援用された全ての刊行物及び特許は、いずれも引用によって本文に組み込まれる。本発明の範囲と精神から逸脱しない場合、前記趣旨の多種の修飾及び変化は、業者にとって明らかである。具体的な実施形態に基づいて本発明を説明したが、保護を請求した本発明が不当にこれらの実施形態に制限されないことは、理解すべきである。実際に、本発明を実現するための多種の修飾は業者にとって明らかであり、随付された請求の範囲に含まれる。
（付記）
（付記１）
ペプチドライブラリを構成するための集積方法であって、
一連のタグ付きペプチドを設計して前記タグ付きペプチドを発現・精製することを含み、各ペプチドは短いペプチド配列を含む、
ことを特徴とする方法。
（付記１）
ペプチドライブラリを構成するための集積方法であって、
一連のタグ付きペプチドを設計して前記タグ付きペプチドを発現・精製することを含み、各ペプチドは短いペプチド配列を含む、
ことを特徴とする方法。
（付記２）
ペプチドライブラリを構成するための方法であって、
（ｉ）一連のタグ付きペプチドを設計し、前記各ペプチドは短いペプチド配列を含み、（ｉｉ）一連の発現ベクターを構成し、前記各ベクターは単一のタグ付きペプチドを発現し、（ｉｉｉ）親和タグを固定化された固体表面に結合して前記タグ付きペプチドを精製し、（ｉｖ）前記タグ付きペプチドを溶離させて前記ライブラリを使用して選別し、（ｖ）固定化されたペプチドを任意に使用して固相から溶離せずに直接に選別する、
ことを特徴とする方法。
ペプチドライブラリを構成するための方法であって、
（ｉ）一連のタグ付きペプチドを設計し、前記各ペプチドは短いペプチド配列を含み、（ｉｉ）一連の発現ベクターを構成し、前記各ベクターは単一のタグ付きペプチドを発現し、（ｉｉｉ）親和タグを固定化された固体表面に結合して前記タグ付きペプチドを精製し、（ｉｖ）前記タグ付きペプチドを溶離させて前記ライブラリを使用して選別し、（ｖ）固定化されたペプチドを任意に使用して固相から溶離せずに直接に選別する、
ことを特徴とする方法。
（付記３）
前記ペプチドライブラリは、一連の異なるサイズのペプチドを含むペプチドライブラリであり、前記サイズの範囲は、２０〜２００個のアミノ酸である、
ことを特徴とする付記２に記載の方法。
前記ペプチドライブラリは、一連の異なるサイズのペプチドを含むペプチドライブラリであり、前記サイズの範囲は、２０〜２００個のアミノ酸である、
ことを特徴とする付記２に記載の方法。
（付記４）
前記ペプチドライブラリは、所定のサイズの全てのあり得るペプチドを含む完全なペプチドライブラリである、
ことを特徴とする付記２に記載の方法。
前記ペプチドライブラリは、所定のサイズの全てのあり得るペプチドを含む完全なペプチドライブラリである、
ことを特徴とする付記２に記載の方法。
（付記５）
前記ペプチドライブラリは、所定のサイズの一部のあり得る前記ペプチドを含む非完全なペプチドライブラリである、
ことを特徴とする付記２に記載の方法。
前記ペプチドライブラリは、所定のサイズの一部のあり得る前記ペプチドを含む非完全なペプチドライブラリである、
ことを特徴とする付記２に記載の方法。
（付記６）
前記ペプチドライブラリは、異なるサイズのペプチドを含む混合ライブラリである、
ことを特徴とする付記２に記載の方法。
前記ペプチドライブラリは、異なるサイズのペプチドを含む混合ライブラリである、
ことを特徴とする付記２に記載の方法。
（付記７）
前記タグは、ＧＳＴ、Ｔｒｘ、ＳＵＭＯ、ＣＢＤ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ａｖｉタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃ−タグ、ＳＢＰ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｆｃ−タグ、Ｈａｌｏ−タグ、Ｖ５、ＶＳＶ、及びＭＢＰから選択される、
ことを特徴とする付記２に記載の方法。
前記タグは、ＧＳＴ、Ｔｒｘ、ＳＵＭＯ、ＣＢＤ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ａｖｉタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃ−タグ、ＳＢＰ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｆｃ−タグ、Ｈａｌｏ−タグ、Ｖ５、ＶＳＶ、及びＭＢＰから選択される、
ことを特徴とする付記２に記載の方法。
（付記８）
発現宿主は、細菌細胞、イースト細胞、昆虫細胞、菌類細胞、哺乳動物細胞、及び植物細胞から選択される、
ことを特徴とする付記２に記載の方法。
発現宿主は、細菌細胞、イースト細胞、昆虫細胞、菌類細胞、哺乳動物細胞、及び植物細胞から選択される、
ことを特徴とする付記２に記載の方法。
（付記９）
前記発現ベクターは、細菌発現ベクター、イースト発現ベクター、昆虫発現ベクター、菌類発現ベクター、哺乳動物発現ベクター、及び植物発現ベクターから選択される、
ことを特徴とする付記２に記載の方法。
前記発現ベクターは、細菌発現ベクター、イースト発現ベクター、昆虫発現ベクター、菌類発現ベクター、哺乳動物発現ベクター、及び植物発現ベクターから選択される、
ことを特徴とする付記２に記載の方法。
（付記１０）
ペプチド配列をリンカーとして前記タグと前記ペプチドとの間に付加し、前記ペプチドのアクセシビリティを向上させる、
ことを特徴とする付記２に記載の方法。
ペプチド配列をリンカーとして前記タグと前記ペプチドとの間に付加し、前記ペプチドのアクセシビリティを向上させる、
ことを特徴とする付記２に記載の方法。
（付記１１）
任意にプロテアーゼ認識配列を前記タグと前記ペプチドとの間に付加し、これによってプロテアーゼを使用して前記タグから前記ペプチドを切ることができる、
ことを特徴とする付記２に記載の方法。
任意にプロテアーゼ認識配列を前記タグと前記ペプチドとの間に付加し、これによってプロテアーゼを使用して前記タグから前記ペプチドを切ることができる、
ことを特徴とする付記２に記載の方法。
（付記１２）
ベクターは、ベクター骨格と、任意の一つ又は複数の親和タグＤＮＡ配列と、リンカーＤＮＡ配列と、任意のプロテアーゼ認識配列に用いられるＤＮＡ配列と、ペプチド発現ＤＮＡ配列を挿入するためのマルチクローニングサイトとを含む、
ことを特徴とするペプチドライブラリを構成するための細菌発現ベクター。
ベクターは、ベクター骨格と、任意の一つ又は複数の親和タグＤＮＡ配列と、リンカーＤＮＡ配列と、任意のプロテアーゼ認識配列に用いられるＤＮＡ配列と、ペプチド発現ＤＮＡ配列を挿入するためのマルチクローニングサイトとを含む、
ことを特徴とするペプチドライブラリを構成するための細菌発現ベクター。
Claims (12)
- ペプチドライブラリを構成するための集積方法であって、
一連のタグ付きペプチドを設計して前記タグ付きペプチドを発現・精製することを含み、各ペプチドは短いペプチド配列を含む、
ことを特徴とする方法。 - ペプチドライブラリを構成するための方法であって、
（ｉ）一連のタグ付きペプチドを設計し、前記各ペプチドは短いペプチド配列を含み、（ｉｉ）一連の発現ベクターを構成し、前記各ベクターは単一のタグ付きペプチドを発現し、（ｉｉｉ）親和タグを固定化された固体表面に結合して前記タグ付きペプチドを精製し、（ｉｖ）前記タグ付きペプチドを溶離させて前記ライブラリを使用して選別し、（ｖ）固定化されたペプチドを任意に使用して固相から溶離せずに直接に選別する、
ことを特徴とする方法。 - 前記ペプチドライブラリは、一連の異なるサイズのペプチドを含むペプチドライブラリであり、前記サイズの範囲は、２０〜２００個のアミノ酸である、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。 - 前記ペプチドライブラリは、所定のサイズの全てのあり得るペプチドを含む完全なペプチドライブラリである、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。 - 前記ペプチドライブラリは、所定のサイズの一部のあり得る前記ペプチドを含む非完全なペプチドライブラリである、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。 - 前記ペプチドライブラリは、異なるサイズのペプチドを含む混合ライブラリである、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。 - 前記タグは、ＧＳＴ、Ｔｒｘ、ＳＵＭＯ、ＣＢＤ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ａｖｉタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃ−タグ、ＳＢＰ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ｆｃ−タグ、Ｈａｌｏ−タグ、Ｖ５、ＶＳＶ、及びＭＢＰから選択される、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。 - 発現宿主は、細菌細胞、イースト細胞、昆虫細胞、菌類細胞、哺乳動物細胞、及び植物細胞から選択される、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。 - 前記発現ベクターは、細菌発現ベクター、イースト発現ベクター、昆虫発現ベクター、菌類発現ベクター、哺乳動物発現ベクター、及び植物発現ベクターから選択される、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。 - ペプチド配列をリンカーとして前記タグと前記ペプチドとの間に付加し、前記ペプチドのアクセシビリティを向上させる、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。 - 任意にプロテアーゼ認識配列を前記タグと前記ペプチドとの間に付加し、これによってプロテアーゼを使用して前記タグから前記ペプチドを切ることができる、
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。 - ベクターは、ベクター骨格と、任意の一つ又は複数の親和タグＤＮＡ配列と、リンカーＤＮＡ配列と、任意のプロテアーゼ認識配列に用いられるＤＮＡ配列と、ペプチド発現ＤＮＡ配列を挿入するためのマルチクローニングサイトとを含む、
ことを特徴とするペプチドライブラリを構成するための細菌発現ベクター。
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