CN107849737B

CN107849737B - 肽文库构建方法及相关载体

Info

Publication number: CN107849737B
Application number: CN201580081102.3A
Authority: CN
Inventors: 王珠银; 李向群
Original assignee: Hohai University HHU
Current assignee: Hohai University HHU
Priority date: 2015-07-03
Filing date: 2015-07-03
Publication date: 2020-06-26
Anticipated expiration: 2035-07-03
Also published as: AU2015401336B2; DK3294934T3; PT3294934T; PL3294934T3; JP2018518991A; JP6653979B2; EP3294934A4; EP3294934B1; AU2015401336A1; EP3294934A1; WO2017004745A1; ES2777329T3; CA2990023A1; US20180179519A1; CA2990023C; CN107849737A

Abstract

本发明描述了改进的肽文库制备方法，所述方法用于构建完整的肽文库，如完整的三肽文库、四肽文库、五肽文库、六肽文库、七肽文库或完整的八肽文库等。所述方法包括构建用于表达带标签的肽的表达载体。每个带标签的肽含有不同大小的肽阵列，并且相对于常规的化学肽合成，完整的肽文库中肽的数量可以显著地减少。此外，可以容易地重复文库。改进的肽文库制备方法可特别地用于，例如，构建完整的五肽文库。还描述了其它相关方法和相关表达载体。

Description

肽文库构建方法及相关载体

技术领域

本发明涉及用于构建完整的肽文库的方法，如完整的三肽文库、四肽文库、五肽文库、六肽文库、七肽文库或完整的八肽文库等。所述方法包括构建用于表达带标签的肽的表达载体。每个带标签的肽含有不同大小的肽阵列，并且相对于常规的化学肽合成，完整的肽文库中肽的数量可以显著地减少。此外，可以容易地重复文库。改进的肽文库制备方法可特别地用于，例如，构建完整的五肽文库。

背景技术

将包含大量具有氨基酸的系统组合的肽的肽文库广泛应用为用于筛选大量肽以在生物研究、蛋白质相关研究和药物开发中寻找关键生物活性肽的有力工具。已知低分子量的肽是低过敏性的，并且肽的多种生理作用使其成为治疗剂开发的合适候选者(Host A,Halken S.Hypoallergenic formulas–when,to whom and how long:after more than15years we know the right indication！.Allergy 2004Aug；59(Suppl.78):45-52；LaxR.The future of peptide development in the pharmaceutical industry.PharManufacturing:Int Pept Rev 2010；Agyei D,Danquah MK.Industrialscalemanufacturing of pharmaceuticalgrade bioactive peptides.Biotechnol Adv2011May-Jun；29(3):272-7.)。因此，生物活性肽是新时代药物产品的合适候选者，尤其是随着对小分子药物副作用的高度关注，以及越来越多地关注具有健康预防或健康促进特性的更新鲜和“更环保”的食品和营养品(Danquah MK,Agyei D.Pharmaceuticalapplications of bioactive peptides.OA Biotechnology 2012 Dec 29；1(2):5)。

已经发现了许多种生物活性肽，其包括抗菌肽、抗癌肽、抗氧化肽、抗高血压肽、抗血栓形成肽、阿片样物质肽、抗病毒肽、细胞调节肽和免疫调节肽等(Sharma S,Singh R,Rana S.Bioactive peptide:A Review.Int.J.Bio_AUTOMATION2011 15(4):223-250；DanquahMK,Agyei D.Pharmaceutical applications of bioactive peptides.OA Biotechnology2012Dec 29；1(2):5)。因此，肽药物开发是新药开发中最有希望的领域之一。

由于肽文库为药物开发、蛋白质-蛋白质相互作用和其它生物化学以及药物应用提供了有力工具，所以已经开发了若干方法来构建肽文库。这些肽文库构建方法分为两类：通过使用合成化学工具和通过生物技术方法。在1985年由乔治P.史密斯(George P.Smith)引入的噬菌体展示技术允许筛选大量不同的肽(Smith,G.P.Filamentous fusion phage:novel expression vectors that display cloned antigens on the virionsurface.Science 1985,228,1315-1317)。发现噬菌体衍生肽的成功基本上取决于所筛选的文库的质量(Lindner T，Kolmar H，Haberkorn U and Mier W.DNA Libraries for theConstruction of Phage Libraries：Statistical and Structural Requirements andSynthetic Methods.Molecules 2011,16,1625-1641)，然而，没有实际的方法来监测或保证噬菌体展示文库的质量。事实上，到目前为止，只有少量由噬菌体展示所选择的肽已进入临床应用(Lindner T,Kolmar H,Haberkorn U and Mier W.DNA Libraries for theConstruction of Phage Libraries:Statistical and Structural Requirements andSynthetic Methods.Molecules 2011,16,1625-1641)。

基于由梅里菲尔德(Merrifield)开发的固相合成，开发了用于肽文库构建的组合的“分裂-混合合成”方法(

.Furka,F.Sebestyen,M.Asgedom,G.Dibo,General method forrapid synthesis of multicomponent peptide mixtures.Int.J.Peptide ProteinRes.,1991,37,487-493)。理论上，可以以这种方式合成大量的肽来制备大的文库，然而在实践中，以这种方式合成的肽的数量和量受限于合成文库的高成本和低生产量。

还可以通过合成大量不同的肽来构建肽文库。由于没有很好的方法可以预测哪种肽将成为良好的候选药物，所以期望构建一个完整的肽文库，其包含氨基酸的所有可能的组合，从而在肽筛选期间有较高的可能性找到良好的候选药物。存在20个天然存在的氨基酸，需要合成8,000个三肽以构建完整的三肽文库。以类似的方式，需要合成160,000个四肽以构建完整的四肽文库，需要合成3,200,000个五肽以构建完整的五肽文库，需要合成64,000,000个六肽以构建完整的六肽文库。再次，由于合成大量肽的高成本和低生产量，应包含160,000个四肽的完整的四肽文库甚至目前在市面上还不能获得，更别提完整的五肽或六肽文库。

因此，仍然需要用于构建具有大容量的肽文库的高生产率方法。本发明的实施方案涉及这样的用于构建具有大容量的肽文库的方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供用于构建完整的肽文库的新方法，所述肽文库表达和展示大量的不同大小的肽、多肽或蛋白质。将以这样的方式设计多达200个氨基酸的肽使得：(i)如通过可用的蛋白质结构预测工具所预测的，肽不会形成明显的三级结构；(ii)肽将含有尽可能少的短肽重复，从而增加肽文库的容量。肽将作为标签蛋白质如GST、SUMO、CBD等的C-端尾部进行表达。首先将表达标签，然后将其正确地折叠，随后肽尾部将表达为自由移动的尾部。所述肽将展示在标签蛋白质的C-端，即所谓的“蛋白质展示”，所述标签将促进肽的表达和纯化。以这种方式构建的肽文库称为“蛋白质展示”肽文库。

本发明的另一个目的是提供用于从单个经表达的肽来展示大量的肽的方法，显著地增加文库容量的方法。例如，通过合理的设计，50个氨基酸的经表达的肽实际上可以包含47个不同的连续四肽、46个不同的连续五肽、45个不同的连续六肽、44个不同的连续七肽、……、3个不同的连续48-mer肽、2个不同的连续的49-mer肽和1个50-mer肽，其构成大小范围为4个至50个氨基酸的408个肽。

本发明的又一个目的是提供用于构建具有显著减少的肽数量的完整肽文库的方法。例如，通过合理的设计，50个氨基酸的经表达的肽实际上可以包含47个不同的连续四肽，3,405个经表达的50-mer肽可以构成完整的四肽文库，然而，需要160,000个合成四肽来构建完整的四肽文库。3,405个合成的50-mer肽也可以构成完整的四肽文库，但由于合成这么多长(50-mer)肽的低生产量，成本将会太高。然而，无论肽是长(50-mer)还是短，表达带标签的肽是没有问题的。

本发明的又一个目的是提供用于构建完整的五肽文库的方法。通过合理的设计，50个氨基酸的经表达的肽实际上可以包含46个不同的连续五肽，通过该蛋白质展示方法仅需要69,566个经表达的50-mer肽来代替3,200,000个合成五肽以构建完整的五肽文库。

本发明的又一个目的是提供用于构建具有显著减少的肽数量的不完整的肽文库的方法。对于较长的肽，如八肽、十肽或甚至更长的肽，如15-mer或20-mer肽，完整的文库将包含大量的所有可能的肽，其分别为2.56×10¹⁰个、1.024×10¹³个、3.277×10¹⁹个、1.049×10²⁶个。因此，化学合成这么多肽以制备完整的肽文库是不实际的。然而，构建完整的文库可能并不总是必需的，因为一些肽将共享高的序列相似性。通过合理的设计，可以大大减少构建高效的肽文库的肽数量。本发明的这种方法将进一步减少肽文库中的肽数量，从而使得高效的肽文库的构建实际化。

本发明的另一个目的是提供用于构建完整的肽文库的替代方法。可将每个肽的DNA序列克隆到用于表达和纯化带标签的肽的表达载体中。可以储存载体，并且可以随时从载体中容易地表达或重复肽。与肽合成不同，每个肽需要从头开始重新合成。该方法的另一个优点是不同大小的带标签的肽可以以相似的容易程度进行表达和纯化，然而，在化学合成过程中，较长的肽将比类似的短肽需要更多的精力。

本发明的目的是提供用于构建表达载体的方法，所述表达载体用于表达和纯化用于肽文库构建的带标签的肽。

本发明的另外的目的体现在原始权利要求中。在附图和下面的描述中阐述了本公开的实施方案的细节。其它特征、目的和优点将通过所述描述和附图以及权利要求书体现出来。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解上述发明概述以及以下发明详述。出于说明本发明的目的，在附图中示出了目前优选的实施方案。然而，应当理解，本发明不受所呈现的附图的限制。

在附图中：

图1示意性地示出了根据本发明的实施方案的蛋白质展示技术；

图2示意性地示出了根据本发明的实施方案在表达宿主中表达的高容量的带标签的肽；

图3示意性地示出了用于表达带标签的肽的表达载体。

图4示意性地示出了带标签的肽阵列；

图5示意性地示出了带标签的肽阵列的表达和纯化；

图6示意性地示出了带标签的肽阵列的检测和分析。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文。

本发明的实施方案涉及可用于构建肽文库的方法和载体。在一方面，本发明涉及通过常规化学合成对肽文库的构建的显著改进。例如，本发明提供了改进的肽文库构建方法，其中容易地表达和纯化肽，并且形成文库的肽数量显著地减少。

根据本发明的实施方案，合理地设计肽的氨基酸序列，使得每个带标签的肽可以包含不同大小的不同肽的阵列，从而增加文库的容量。根据带标签的肽的大小，每个肽可含有20个、30个、50个或甚至100个特定大小的不同肽。因此，根据本发明的实施方案的方法大大地减少了肽文库中的肽数量，因此将以显著降低的成本进行肽文库的构建和筛选。

如本文所使用的，术语“肽”、“文库”、“标签”、“蛋白质”、“载体”、“容量”、“完整的”和“阵列”在其最广泛的背景中进行采用。

在一个一般方面，与常规肽合成方法相比，本发明涉及构建具有减少的肽数量的完整的肽文库的方法。例如，如图1所示，在蛋白质标签的C-端容易表达和纯化相对长的肽，或者在蛋白质的末端展示肽，即“蛋白质展示”。与蛋白质表达相比，相对长的肽的化学合成既不高效也不成本有效。例如，50-mer肽将需要数天进行化学合成，而相似的肽可以容易地在细菌宿主中经过一夜表达出来。化学合成的50-mer肽的总产率将很低，而类似的肽可以容易地以任何规模在表达宿主中进行表达。相比之下，本发明的实施方案提供了其中可以用显著减少的肽数量构建完整的肽文库的方法，这些肽可以容易地进行表达和纯化，并且这些肽可以随时容易地重复。根据本发明的实施方案的方法大大地减少了肽文库构建所需的时间和成本。

本发明的实施方案涉及可用于展示肽的蛋白质标签。蛋白质标签之一是GST(谷胱甘肽S-转移酶)，其通常用于纯化与GST融合的靶蛋白。GST可以帮助靶蛋白或肽的表达。

在本发明的一个实施方案中，蛋白质标签包括选自，但不限于，例如，GST、Trx、SUMO、CBD、FLAG、HA、Avi标签、His标签、Myc-标签、SBP、Strep-标签、Fc-标签、Halo-标签、V5、VSV、MBP等的标签中的一种。

在本发明的一个实施方案中，蛋白质标签包括选自，但不限于，例如，GST、Trx、SUMO、CBD、FLAG、HA、Avi标签、His标签、Myc-标签、SBP、Strep-标签、Fc-标签、Halo-标签、V5、VSV、MBP等的标签的组合。

在本发明的又一个实施方案中，可以在肽的C-端或甚至在肽的中间添加另外的标签，以促进肽的表达和纯化。蛋白质标签可选自，但不限于，GST、Trx、SUMO、CBD、FLAG、HA、Avi标签、His标签、Myc-标签、SBP、Strep-标签、Fc-标签、Halo-标签、V5、VSV、MBP等。

可以将少量氨基酸或更多氨基酸的短肽接头添加在标签与肽之间以增加肽的可接近性。

如果需要，还可以将蛋白酶识别序列添加在标签与肽之间以使得可以使用蛋白酶从标签上切割肽。

对于本领域技术人员而言显而易见的是，本发明包括对上文提及的实施方案的修改以进一步改进文库构建。这些修改包括，但不限于，向上述实施方案中添加一个或多个肽序列。例如，可以在肽中添加少量Cys氨基酸以形成二硫键从而拉紧肽结构。

鉴于本公开内容，可以使用多种方法来设计肽序列以制备高效的肽文库。例如，为了促进带标签的肽的可溶性表达，应该避免含有长链疏水性氨基酸的肽序列。

对于本领域技术人员而言显而易见的是，肽可以以这样的方式设计以使得其不会形成明显的三级结构，如可通过可用的蛋白质结构预测工具所预测的。

对于本领域技术人员而言还显而易见的是，肽可以以这样的方式设计以使得肽可以包含尽可能多的不同短肽，从而增加肽文库的容量。

根据图2中所示的实施方案，50个氨基酸的经表达的肽实际上可以包含47个不同的连续四肽、46个不同的连续五肽、45个不同的连续六肽、44个不同的连续七肽、……、3个不同的连续48-mer肽、2个不同的连续的49-mer肽和1个50-mer肽，其构成大小范围为4个至50个氨基酸的408个肽。

在上文提及的实施方案中，本领域技术人员将明白，带标签的肽甚至可以含有多达200个或更多个氨基酸，尽管最佳大小应为30个至100个。更长的肽将具有更高的机会形成三级结构，其中一些肽序列将不会暴露以进行筛选。

在上文提及的实施方案中，本领域技术人员将明白，代替化学合成160,000个四肽，3,405个经表达的50-mer肽可构成完整的四肽文库。

在上文提及的实施方案中，本领域技术人员将明白，代替化学合成3,200,000个五肽，69,665个经表达的50-mer肽可构成完整的五肽文库。

在上文提及的实施方案中，本领域技术人员将明白，肽文库中的一些肽将共享高序列相似性，并且可以通过合理的设计大大地减少构建高效的肽文库的肽数量。因此，比3,405个更少数量的经表达的50-mer肽可以构成高效的四肽文库。类似地，比69,665个更少数量的经表达的50-mer肽可以构成高效的五肽文库。

在上文提及的实施方案中，本领域技术人员将明白，带标签的肽可含有多于50个氨基酸，从而进一步减少经表达的带标签的肽的数量。因此，甚至更少数量的经表达的肽可以构成高效的四肽或五肽文库。

在上文提及的实施方案中，本领域技术人员将明白，肽文库中的一些肽将共享高序列相似性和结构相似性，并且可以通过合理的设计进一步减少构建高效的肽文库的肽数量。因此，实际数量的经表达的带标签的肽可以构成高效的多肽文库，如八肽文库、十肽文库或甚至更长的肽文库，如15-mer肽文库、20-mer肽文库或甚至30-mer肽文库。

在优选的实施方案中，可以设计69,665个经表达的带GST标签的50-mer肽，将其克隆到表达载体中，表达和纯化以构成完整的五肽文库。

在上文提及的实施方案中，本领域技术人员将明白，也可以使用其它一个标签或多个标签来代替GST，所述标签可以选自，但不限于，Trx、SUMO、CBD、FLAG、HA、Avi标签、His标签、Myc-标签、SBP、Strep-标签、Fc-标签、Halo-标签、V5、VSV、MBP等

在上文提及的实施方案中，本领域技术人员将明白，带标签的肽可以包含多于或少于50个氨基酸，从而进一步减少或增加经表达的带标签的肽的数量以构成完整的肽文库。

根据图3所示的实施方案，可以构建带标签的肽的表达载体，以任选地包含一个或多个亲和标签DNA序列、接头DNA序列、任选地蛋白酶识别位点、用于插入肽表达DNA序列的多克隆位点。

在上文提及的实施方案中，本领域技术人员将明白，表达载体可以基于，但不限于，细菌表达载体、酵母表达载体、昆虫表达载体、真菌表达载体、哺乳动物表达载体和植物表达载体进行构建。

在本发明的另一个实施方案中，可以在表达宿主中表达并从表达宿主纯化带标签的肽。表达宿主选自，但不限于，细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞和植物细胞。

本领域技术人员可容易地理解，通常也可以将类似的方法应用于构建肽文库。使用固定在固体表面上的亲和标签表达、纯化所设计的肽，然后用仍附着在固体表面上的肽进行筛选。也可以从固体表面洗脱所设计的肽，然后用于筛选。

现在已经描述了本发明的多个实施方案。然而，应当注意，这些具体实施方案的描述仅是本发明构思基础的原理的说明。因此，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，预期所公开的实施方案的多种修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的。

以下具体实施例进一步说明本发明的性质，但是应当理解，本发明不限于此。

实施例

蛋白质展示

使用标准的克隆方法将三个肽阵列(Myc-V5-Flag，GAACAGAAACTGATTAGCGAGGAAGACCTT-GGTAAACCGATTCCGAACCCGTTGCTGGGCCTGGACAGCACG-GACTATAAAGATGACGATGACAAA)的DNA序列克隆到pGS21载体中的GST基因序列之后，还将TCGGATCTGGGCCACACAGGCCATAGATCTGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGGT的接头序列添加到GST与肽阵列之间。使用IPTG作为诱导物，在大肠杆菌(E.coli)菌株中表达带GST标签的肽。

使用Ni-IDA柱纯化带GST标签的肽。将带GST标签的肽结合到Ni-NDA柱上并用300mM咪唑从柱上洗脱。将洗脱液用透析溶液(0.01M Tris-HCl，pH 7.6，在水中)透析。

图5示出了将带GST标签的肽阵列表达为可溶性蛋白质，其中泳道M是蛋白质标记，其中分子量在左侧列出，泳道1是没有诱导的全蛋白质(Unind.)，泳道2是用1mM IPTG诱导的全蛋白质(Ind.)，泳道3是样品的流过液(FT)，泳道4是纯化的带GST标签的肽(tPept.)。

图6示出了ELISA结果。使用标准ELISA方法用HRP标记的第二抗体进行测定(assy)。可以通过相应的抗体识别并检测三个肽(具有EQKLISEEDL-GKPIPNPLLGLDST-DYKDDDDK的氨基酸序列的Myc-V5-Flag)中的每一个。NC是阴性对照。1X表示纯化的样品未经稀释直接用于ELISA测定，而5X和25X表示将纯化的样品分别稀释5倍和25倍。使用TMB溶液作为HRP的底物。

本文引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，所述主题的多种修改和变化对于本领域技术人员而言将是显而易见的。尽管已经结合具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应不适当地限于这些实施方案。实际上，用于实现本发明的多种修改对于本领域技术人员是显然的，并且旨在包括在所附权利要求的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> HOHAI UNIVERSITY

<120> PEPTIDE LIBRARY CONSTRUCTING METHOD AND RELATED VECTORS

<130> SG15P047HT

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 96

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Myc-V5-Flag

<400> 1

gaacagaaac tgattagcga ggaagacctt ggtaaaccga ttccgaaccc gttgctgggc 60

ctggacagca cggactataa agatgacgat gacaaa 96

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> linker sequence

<400> 2

tcggatctgg gccacacagg ccatagatct ggtaccgacg acgacgacaa ggccatgggt 60

Claims

1.一种用于构建四肽全库的方法，所述方法包括：（i）设计3,405个经表达的带标签的50-mer肽，其中，每个50 mer肽包含47个不同的连续四肽；（ii）构建一系列表达载体，其中每个载体表达单个带标签的肽；（iii）通过将亲和标签结合到固定的固体表面来纯化所述带标签的肽；（iv）洗脱所述带标签的肽并用于筛选，或使用固定的肽直接进行筛选而不从固相洗脱。

2.一种用于构建五肽全库的方法，所述方法包括：（i）设计69,665个经表达的带标签的50-mer肽，每个50 mer肽包含46个不同的连续五肽；（ii）构建一系列表达载体，其中每个载体表达单个带标签的肽；（iii）通过将亲和标签结合到固定的固体表面来纯化所述带标签的肽；（iv）洗脱所述带标签的肽并用于筛选，或使用固定的肽直接进行筛选而不从固相洗脱。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中所述标签选自GST、Trx、SUMO、CBD、FLAG、HA、Avi标签、His标签、Myc-标签、SBP、Strep-标签物、Fc-标签、Halo-标签、V5、VSV和MBP。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中表达宿主选自细菌细胞、昆虫细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞和植物细胞。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述表达载体选细菌表达载体、昆虫表达载体、真菌表达载体、哺乳动物表达载体和植物表达载体。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中将一段多肽序列作为接头添加在所述标签与所述肽之间以增加所述肽的可接近性。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中将蛋白酶识别序列添加在所述标签与所述肽之间以使得可以使用蛋白酶从所述标签上切割所述肽。

8.一种含有根据权利要求1或2任一项所述的方法所构建的多肽库的产品。

9.权利要求8所述的产品在进行多肽药物筛选中的应用。