JP2018513854A

JP2018513854A - 血糖降下化合物

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Publication number: JP2018513854A
Application number: JP2017552503A
Authority: JP
Inventors: ブルースボールドウィン，デイヴィッド; マイケルビールズ，ジョン; イホーコリトコ，アンドリュー; ローディアスマクラフリン，ブライアント; シェレンバーガー，ヴォルケー
Original assignee: イーライリリーアンドカンパニー; アムニックスオペレーティングインク．
Priority date: 2016-02-24
Filing date: 2017-02-16
Publication date: 2018-05-31
Anticipated expiration: 2037-02-16
Also published as: JOP20210201A1; WO2017146979A1; JOP20170040B1; TWI633116B; JP6320648B1; AR107560A1; US20170240614A1; US10035839B2; TW201738265A

Abstract

本発明は、医療分野に関するものであり、当該分野での糖尿病又は高血糖症の治療に関するものである。より具体的には、本発明は、血糖を降下させる化合物、かかる化合物を含有する医薬組成物、かかる化合物の治療的使用に関するものである。

Description

本発明は医療分野に関する。より具体的には、本発明は、糖尿病及び高血糖症の治療に関する分野にある。本発明は血糖を降下させる化合物、かかる化合物を含有する医薬組成物、及びかかる化合物の治療的使用に関する。

糖尿病患者へのインスリン補充療法は、健常者の内因性インスリンの分泌パターンに可能な限り類似させることが理想的である。インスリンに対する生理的要求は、２つの段階に分けることができる：（ａ）食事に関連した血糖の急上昇に対処するための、「プランディアル」インスリン（ｐｒａｎｄｉａｌｉｎｓｕｉｎ）としても知られているインスリンのパルスを必要とする栄養吸収段階、及び（ｂ）最適な空腹時血糖を維持するための、肝臓グルコース生産を制御する、「基礎」インスリン（ｂａｓａｌｉｎｓｕｌｉｎ）としても知られているインスリンの持続的な送達を必要とする吸収後の段階。

糖尿病を患う人々に対する効果的なインスリン療法には多くの場合、２つのタイプの外因性インスリン製剤の併用が含まれ得る：即効作用型の食事時のプランディアルインスリンと、食間の血糖値を調節するために１日に１回又は２回投与される長時間作用型の基礎インスリンである。インスリン療法の１つの目的は、低血糖症を引き起こすことなく、内因性インスリンの分泌及び活性の正常パターンを可能な限り模倣することである。模倣することが望ましい内因性インスリンの特性としては、ヒトインスリン受容体に対する結合アフィニティ、ヒトＩＧＦ−１受容体を超えるヒトインスリン受容体への優先的結合、ヒトインスリン受容体のリン酸化、及び血中におけるグルコース降下が挙げられる。外因性インスリンの他の望ましい特性は、肝臓及び末梢組織での内因性インスリンの活性を模倣することであってもよい。

また、望ましい外因性基礎インスリンは、延長された、及び「フラットな」作用時間を提供しなければならない−すなわち、少なくとも１２時間、好ましくは２４時間以上、低血糖症の重大なリスクを伴うことなく血糖値を制御する。一部の基礎インスリンは２４時間以上の作用期間を有しているが、さらに長い作用時間を有するインスリンであれば、さらに多くの患者がより優れた血糖管理を得る助けとなるであろう。例えば２４時間以上など、作用時間が延長された化合物であれば、夜間低血糖のリスクを低減させ、患者の低血糖のリスクを上昇させることなく、日々の投与時刻により多くの可変性をもたらすことができるであろう。ＷＯ１３１３０６８３は概して、タンパク質結合体を使用することによってペプチドの半減期を延長させたことを記載している。

その必要のある患者において、糖尿病と高血糖症を治療するための、延長され、フラットな作用期間プロファイルを伴う新たな改善された基礎インスリン化合物が求められている。

本発明化合物は、延長され、フラットな作用時間をもたらし、最大で７２時間、血糖値を制御することが示されているインスリン化合物を含有している。本発明のインスリン化合物は、毎日の投与で、その延長された作用期間の間、ピークと谷の比率が低いフラットな薬物動態を有するよう企図されている。ある実施形態では、本発明は、その必要のある患者における糖尿病の治療、ヘモグロビンＡｌｃの低下、及び血糖値の降下に有用な化合物を提供する。本発明の化合物は、最大で８９％のグルコース降下と、最大で７２時間の作用期間を示している。

本発明は、Ａ鎖及びＢ鎖を備えるインスリン化合物を提供するものであり、この場合においてＡ鎖のアミノ酸配列は配列番号１であり、Ｂ鎖は配列番号２であり、ならびにこの場合においてＡ鎖及びＢ鎖は、Ａ鎖の７位のシステインとＢ鎖の７位のシステインの間にジスルフィド結合、Ａ鎖の２０位のシステインとＢ鎖の１９位のシステインの間にジスルフィド結合、及びＡ鎖の６位のシステインとＡ鎖の１１位のシステインの間にジスルフィド結合を含有している。本発明化合物は、本明細書において化合物３３０と呼称される場合もある。

本発明はまた、Ａ鎖及びＢ鎖を備える化合物、ならびに１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含有する医薬組成物を提供するものであり、この場合においてＡ鎖のアミノ酸配列は配列番号１であり、Ｂ鎖は配列番号２であり、ならびにこの場合においてＡ鎖及びＢ鎖は、Ａ鎖の７位のシステインとＢ鎖の７位のシステインの間にジスルフィド結合、Ａ鎖の２０位のシステインとＢ鎖の１９位のシステインの間にジスルフィド結合、及びＡ鎖の６位のシステインとＡ鎖の１１位のシステインの間にジスルフィド結合を含有している。

本発明はさらに、Ａ鎖及びＢ鎖を備える有効量の化合物をそれを必要とする患者に投与することを含む、患者の糖尿病又は高血糖症を治療する方法を提供するものであり、この場合においてＡ鎖のアミノ酸配列は配列番号１であり、Ｂ鎖は配列番号２であり、ならびにこの場合においてＡ鎖及びＢ鎖は、Ａ鎖の７位のシステインとＢ鎖の７位のシステインの間にジスルフィド結合、Ａ鎖の２０位のシステインとＢ鎖の１９位のシステインの間にジスルフィド結合、及びＡ鎖の６位のシステインとＡ鎖の１１位のシステインの間にジスルフィド結合を含有している。さらなる実施形態において、本発明は、Ａ鎖及びＢ鎖を備える化合物、ならびに１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含有する有効量の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、患者の糖尿病又は高血糖症を治療する方法を提供するものであり、この場合においてＡ鎖のアミノ酸配列は配列番号１であり、Ｂ鎖は配列番号２であり、ならびにこの場合においてＡ鎖及びＢ鎖は、Ａ鎖の７位のシステインとＢ鎖の７位のシステインの間にジスルフィド結合、Ａ鎖の２０位のシステインとＢ鎖の１９位のシステインの間にジスルフィド結合、及びＡ鎖の６位のシステインとＡ鎖の１１位のシステインの間にジスルフィド結合を含有している。

本発明は、治療における使用のための、Ａ鎖及びＢ鎖を備える化合物を提供するものであり、この場合においてＡ鎖のアミノ酸配列は配列番号１であり、Ｂ鎖は配列番号２であり、ならびにこの場合においてＡ鎖及びＢ鎖は、Ａ鎖の７位のシステインとＢ鎖の７位のシステインの間にジスルフィド結合、Ａ鎖の２０位のシステインとＢ鎖の１９位のシステインの間にジスルフィド結合、及びＡ鎖の６位のシステインとＡ鎖の１１位のシステインの間にジスルフィド結合を含有している。本発明はさらに、糖尿病の治療における使用のための、Ａ鎖及びＢ鎖を備える化合物を提供するものであり、この場合においてＡ鎖のアミノ酸配列は配列番号１であり、Ｂ鎖は配列番号２であり、ならびにこの場合においてＡ鎖及びＢ鎖は、Ａ鎖の７位のシステインとＢ鎖の７位のシステインの間にジスルフィド結合、Ａ鎖の２０位のシステインとＢ鎖の１９位のシステインの間にジスルフィド結合、及びＡ鎖の６位のシステインとＡ鎖の１１位のシステインの間にジスルフィド結合を含有している。さらなる実施形態において、本発明は、高血糖症の治療における使用のための、Ａ鎖及びＢ鎖を備える化合物を提供するものであり、この場合においてＡ鎖のアミノ酸配列は配列番号１であり、Ｂ鎖は配列番号２であり、ならびにこの場合においてＡ鎖及びＢ鎖は、Ａ鎖の７位のシステインとＢ鎖の７位のシステインの間にジスルフィド結合、Ａ鎖の２０位のシステインとＢ鎖の１９位のシステインの間にジスルフィド結合、及びＡ鎖の６位のシステインとＡ鎖の１１位のシステインの間にジスルフィド結合を含有している。

本発明はまた、糖尿病の治療のための医薬の製造における、Ａ鎖及びＢ鎖を備える化合物の使用を提供するものであり、この場合においてＡ鎖のアミノ酸配列は配列番号１であり、Ｂ鎖は配列番号２であり、ならびにこの場合においてＡ鎖及びＢ鎖は、Ａ鎖の７位のシステインとＢ鎖の７位のシステインの間にジスルフィド結合、Ａ鎖の２０位のシステインとＢ鎖の１９位のシステインの間にジスルフィド結合、及びＡ鎖の６位のシステインとＡ鎖の１１位のシステインの間にジスルフィド結合を含有している。本発明は、高血糖症の治療のための医薬の製造における、Ａ鎖及びＢ鎖を備える化合物の使用を提供するものであり、この場合においてＡ鎖のアミノ酸配列は配列番号１であり、Ｂ鎖は配列番号２であり、ならびにこの場合においてＡ鎖及びＢ鎖は、Ａ鎖の７位のシステインとＢ鎖の７位のシステインの間にジスルフィド結合、Ａ鎖の２０位のシステインとＢ鎖の１９位のシステインの間にジスルフィド結合、及びＡ鎖の６位のシステインとＡ鎖の１１位のシステインの間にジスルフィド結合を含有している。

本明細書において使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、糖尿病もしくは高血糖症、又は他の状態を有する患者の管理及びケアを指し、それら状態とは、それら状態の症状及び合併症に拮抗させること又はそれらを緩和させることを目的としてインスリンの投与が指示されているものである。治療には、症状もしくは合併症の発現を予防するため、症状もしくは合併症を緩和するため、又は疾患、状態もしくは障害を消失させるために、その必要のある患者に対し本発明化合物又は本発明化合物を含有する組成物を投与することを含む。治療される患者は動物であり、好ましくはヒトである。

本明細書において使用される場合、「有効量」という用語は、患者もしくは対象への単回投与又は反復投与で、研究者、獣医師、医師、又は他の臨床医の目的である組織、システム、動物、哺乳動物、又はヒトに対して、生物学的反応もしくは医学的反応又は所望される治療効果を惹起する、本発明化合物、又は本発明化合物を含有する医薬組成物の量又は投与量を指す。投与量は、最初に高い負荷投与量、次いで低い投与量を含んでもよい。

本明細書において相互交換可能に使用される「患者」、「対象」及び「個体」という用語は、動物を指し、好ましくはこの用語はヒトを指す。特定の実施形態において、患者、好ましくは、ヒトはさらに、血糖値を降下させることで利益を得る疾患、又は障害、又は状態を特徴としている。

本発明化合物を含有する医薬組成物は、かかる治療を必要としている患者に対し非経口的に投与されてもよい。非経口投与は、シリンジ、任意選択的にペン型シリンジ、又は機械操作型注射器の手段を用いて、皮下、筋肉内、又は静脈内の注射により行ってもよい。あるいは、非経口投与は、点滴ポンプの手段を用いて行うことができる。本発明の実施形態は、本発明化合物の治療有効量及び１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を、その必要のある患者に投与することを含む、患者への投与に適した医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物は、当分野に公知である、医薬品に標準的な賦形剤を用いて、任意の様々な技術により調製されてもよい（Remington’s Pharmaceutical Sciences, 21st Edition, University of the Sciences in Philadelphia, Philadelphia, PA, USA (2006)）。

本発明化合物は、当分野の当業者に公知の様々な技術により調製されてもよい。化合物は、組み換えＤＮＡ技術を用いて、前駆タンパク質分子を介して調製されてもよい。ｃＤＮＡ及び合成ＤＮＡをはじめとするＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖であってもよい。本明細書に記載される前駆タンパク質分子をコードするコード配列は、遺伝子コードの冗長性又は縮重の結果として変化してもよい。本発明の前駆タンパク質を産生させるため、ＤＮＡは宿主細胞へと導入されてもよい。宿主細胞は、例えば大腸菌のＫ１２又はＢ系統などの細菌細胞、例えば酵母細胞などの真菌細胞、又は例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：ｃｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙ）細胞などの哺乳動物細胞であってもよい。

本発明化合物は、配列番号３のアミノ酸配列を有する前駆タンパク質を介して調製されてもよい。適切な宿主細胞は、本発明の前駆タンパク質を産生させるための発現系を用いて、一過性又は安定的のいずれかでトランスフェクト又は形質転換されている。発現ベクターは、多くの場合、エピソームとして、又は宿主染色体ＤＮＡの必須部分としてのいずれかで宿主器官中で複製可能である。通常、発現ベクターは、所望されるＤＮＡ配列で形質転換されている細胞が選択できるよう、例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、及びジヒドロ葉酸還元酵素などの選択マーカーを含む。

改変ｐＢＲ３２２プラスミドに基づくプラスミドを発現に使用してもよく、及びプラスミドからの発現はＰｈｏＡプロモーターに誘導されてもよい。前駆タンパク質は、細胞ペリプラズムへの自身の分泌が可能となるよう、分泌シグナルを含有してもよい。前駆タンパク質の蓄積は、細胞質、ペリプラズム、及び細胞外の増殖培地のいずれかにおいて発生してもよい。前駆タンパク質はフォールディングし、及びジスルフィド結合は、フォールディングプロセスの間に形成される。２〜４日の発酵の後、培地、細胞ペリプラズム、及び／又は総細胞溶解物から、前駆タンパク質産物が回収されてもよい。

本発明化合物は、当分野に公知の様々な手段、ならびに以下に記載される方法により調製することができる。記載される各経路の具体的な合成工程は、本発明化合物を調製するための異なる方法と組み合わせることもできる。

実施例１
化合物３３０の発現及び精製
化合物３３０の前駆タンパク質は、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社、製品番号Ｃ２５３０Ｈの大腸菌Ｂ系統、ＢＬ２１株で発現される。前駆タンパク質は、改変ｐＢＲ３２２プラスミドから産生され、このプラスミドの遺伝子は、ｐｈｏＡプロモーターにより制御されている。典型的な発酵が３６〜７２時間行われ、その間にタンパク質が培地中へと分泌される。

培地は、氷酢酸でｐＨを低下させることにより調整される。ｐＨ４で、多くの混入タンパク質、脂質、細胞残渣及び他の物質が沈殿し、遠心により除去される。塩を除去し、タンパク質を５ｍＭ酢酸、１０ｎＭＮａＣｌ、ｐＨ４に交換するよう設定された超ろ過／透析ろ過（ＵＦＤＦ）工程の前に、馴化培地をデプスフィルターに通す。前駆タンパク質は、発酵から生じた微粒子及び他の残渣の通過を許容する大きな孔サイズのアニオン交換体であるＢｉｇＢｅａｄＱ樹脂上、低ｐＨで捕捉される。荷電樹脂を洗浄し、前駆タンパク質を塩勾配により溶出する。

アニオン交換から得たプールをトリプシンとカルボキシペプチダーゼＢで処置し、前駆タンパク質部位を取り除き、２鎖のインスリンを生成する。切断プロセスはｐＨ７．５、１５℃で２４時間行われる。酸を加えてｐＨを４に降下させることにより反応を終了させる。得られた溶液を濃縮し、ＴＦＦにより、５ｍＭ酢酸、ｐＨ４へと透析ろ過する。

化合物は、化合物の正荷電部分に結合するその能力によって選択されるカチオン交換体（ＦａｓｔＦｌｏｗＳＳｅｐｈａｒｏｓｅ）により捕捉される。荷電樹脂を洗浄し、塩勾配により化合物を溶出する。カチオン交換工程から得たプールをさらに逆相クロマトグラフィーにより精製する。化合物を０．１６％リン酸の存在下で１０μｍのビーズサイズのＹＭＣｂａｓｉｃＣ８樹脂に結合させ、アセトニトリル勾配により溶出させる。最終プールは、一晩の透析工程と、次いで濃縮工程、及びスピン濃縮器を用いた緩衝液交換工程を行い、２０ｍＭトリス、１３５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５の最終緩衝液中に置くことにより、保管用に調製する。

Ｉｎｖｉｔｒｏの受容体アフィニティ
タンパク質の結合アフィニティは、ヒトインスリン受容体アイソフォームＡ（ｈＩＲ−Ａ）を過剰発現している安定的トランスフェクトが為された２９３ＥＢＮＡ細胞（ＥＢＮＡ−１を発現する２９３ＨＥＫヒト胚性腎細胞）、Ｃ末端にＣ９エピトープタグを含有するヒトインスリン受容体アイソフォームＢ（ｈＩＲ−Ｂ）を過剰発現している安定的トランスフェクトが為された２９３ＨＥＫ細胞、又はヒトＩＧＦ−１受容体（ｈＩＧＦ−１Ｒ）を過剰発現している安定的トランスフェクトが為された２９３ＨＥＫ細胞から調製された膜上で行われた受容体結合アッセイにおいて決定される。

受容体結合アフィニティ（Ｋ_ｉ）は、ヒト組み換え（３−［１２５Ｉ］−ヨードチロシル−Ａ１４）−インスリン（２２００Ｃｉ／ミリモル、ｈＩＲ−ＡとｈＩＲ−Ｂのアッセイ用）、又はヒト組み換え［１２５Ｉ］−インスリン様増殖因子−１（１８００〜２６００Ｃｉ／ミリモル、ｈＩＧＦ−１Ｒのアッセイ用）、（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＬｉｆｅａｎｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ社）のいずれかを用いた競合放射性リガンド結合アッセイから決定される。このアッセイは、ポリビニルトルエン（ＰＶＴ）コムギ胚芽凝集素結合ＳＰＡビーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＬｉｆｅａｎｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いたシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）法で行われる。ＳＰＡアッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％ｗ／ｖ無脂肪酸ＢＳＡ）をすべての試薬調製に使用する。

Ｆｒｅｅｄｏｍ／Ｅｖｏｒｏｂｏｔ（Ｔｅｃａｎ社）を用いて試験サンプルの連続希釈物をアッセイ緩衝液中で調製し、５０μＬの希釈物を、ＴｅＭＯｒｏｂｏｔ（Ｔｅｃａｎ社）で９６ウェルの白色透明底のマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ／Ｃｏｓｔａｒ社）に加える。放射性リガンド（５０μＬ）、膜（５０μＬ）、及びＳＰＡビーズ（５０μＬ）を、Ｍｕｌｔｉ−ｄｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）機器を用いて加える。室温で１０時間インキュベーションを行った後、放射能を、ＭｉｃｒｏｂｅｔａＴｒｉｌｕｘシンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＬｉｆｅａｎｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて決定する。

試験サンプルの値は、非特異結合を補正した後、未標識のヒトインスリン、又はＩＧＦ−１の活性と比較した割合として算出される。ＩＣ_５０値は、４パラメーターのロジスティック非線形回帰分析（ＸＬＦｉｔ、バージョン４．０、ＩＤＢＳ）から決定される。必要がある場合には、曲線の頂上及び底のパラメーターを、それぞれ１００又は０に設定する。アフィニティ定数（Ｋ_ｉ）は、以下の方程式に基づき、ＩＣ_５０値から算出される。Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋Ｄ／Ｋ_ｄ）。Ｄは、本実験で使用された放射性リガンドの濃度に等しく、Ｋ_ｄは、飽和結合分析から決定された放射性リガンドの平衡結合アフィニティ定数と等しい（ｈＩＲ−Ａ＝０．２５１ｎＭ；ｈＩＲ−Ｂ＝０．２０５ｎＭ；ｈＩＧＦ−１Ｒ＝０．２３３ｎＭ）。Ｋｉに関し報告された値は、幾何平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示されており、繰り返しの測定数は、「ｎ」で示されている（表１）。修飾語句の（＞）は、そのデータが最大結合と比較し５０％阻害に達していないこと、それに伴い、Ｋ_ｉが、このアッセイで試験された化合物の最も高い濃度を用いて算出されており、標準誤差は算出されていないことを示す。

化合物３３０は、ｈＩＲ−Ａ及びｈＩＲ−Ｂの両方での結合アフィニティ、及びｈＩＧＦ−１Ｒを上回る選択性を有している（表１）。
[表１]

表１：ヒトインスリン受容体アイソフォームＡ又はＢ（ｈＩＲ−Ａ又はｈＩＲ−Ｂ）、及びヒトインスリン様増殖因子−１受容体（ｈＩＧＦ−１Ｒ）の結合アフィニティ

受容体の機能的活性
機能的活性は、ｈＩＲ−Ａ、ｈＩＲ−Ｂ、又はｈＩＧＦ−１Ｒの自己リン酸化のＥＬＩＳＡ定量により決定される。それぞれＣ末端Ｃ９エピトープタグ（ＴＥＴＳＱＶＡＰＡ）を含有しているｈＩＲ−Ａ、ｈＩＲ−Ｂ又はｈＩＧＦ−１Ｒを過剰発現する、安定的トランスフェクトされたヒト２９３ＨＥＫ細胞を、０．１％画分Ｖ−無脂肪酸ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ））を補充された無血清培地（ＤＭＥＭ、グルタミンを伴う高グルコース、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．８ｍｇ／ｍＬジェネティシン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中、３倍連続希釈された試験化合物とともに３７℃で１時間処置する。氷冷ＰＢＳで細胞をリンスし、氷冷ＮＰ４０緩衝液［１％ＮＰ−４０（ＩＧＥＰＡＬＣＡ−６３０）、１５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、２ｍＭバナジウム酸塩、及びｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤］で溶解する。

チロシンのリン酸化は、抗Ｃ９モノクローナル抗体（ＲＨＯ１Ｄ４抗体、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＢｒｉｔｉｓｈＣｏｌｕｍｂｉａ）を用いた捕捉と、抗ホスホチロシンモノクローナル抗体４Ｇ１０（登録商標）−西洋ワサビペルオキシダーゼ（４Ｇ１０（登録商標）−ＨＲＰ）結合体（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）、及び３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ＰｉｅｒｃｅＨＲＰ基質（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いた検出によるサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して決定する。吸光度は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍで記録する。吸光度の値は、ヒトインスリン（１００ｎＭ、ｈＩＲ−Ａ及びｈＩＲ−Ｂのアッセイ用）又は１０ｎＭＩＧＦ−１（ｈＩＧＦ−１Ｒのアッセイ用）で処置された対照細胞の最大応答に対して標準化される。データは、４−パラメーター（曲線最大、曲線最小、ＥＣ５０、Ｈｉｌｌｓｌｏｐｅ）のロジスティック（シグモイド）非線形回帰ルーチン（ＸＬＦｉｔバージョン４．０：ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ、ＩＤＢＳ）を用いて分析される。機能的能力は、半値最大反応（ＥＣ５０）を惹起させる濃度として報告されており、値は幾何平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示され、繰り返しの測定数は、「ｎ」で示されている。

化合物３３０は、ｈＩＲ−Ａ及びｈＩＲ−Ｂのアゴニストであり、ｈＩＧＦ−１Ｒと比較し、インスリン受容体に対して選択的である（表２）。
［表２］

表２：２９３細胞におけるヒトインスリン受容体（ｈＩＲ−Ａ及びｈＩＲ−Ｂ）、及びヒトインスリン様増殖因子−１受容体（ｈＩＧＦ−１Ｒ）のリン酸化。

Ｉ型糖尿病のラットモデルにおける、Ｉｎｖｉｖｏ性能の評価
化合物３３０の効果を、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処理されたラット糖尿病モデルにおいて検証する。４００〜４２５グラムの体重のオスのＳｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＨａｒｌａｎＬａｂｓ、インディアナポリス、インディアナ州から入手する。およそ１週間、馴化させた後、ラットをイソフルランで麻酔し、ストレプトゾトシンを１回注射する（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標）、商品番号８９２５６、ＴｅｖａＰａｒｅｎｔｅｒａｌＭｅｄｉｃｉｎｅｓ社、４０ｍｇ／ｋｇＩＶ）。ストレプトゾトシンの注射を行った３日後、ラットを実験で使用する。非空腹時血糖値が４００〜５５０ｍｇ／ｄｌの動物のみ、これらの実験に使用する。

ラットを群に分配し、血糖値と体重に関し同等の分散とする。ラットはＢｌｏｃｋＲａｎｄｏｍｉｚｅｄＡｌｌｏｃａｔｉｏｎＴｏｏｌを用いて無作為化する。血糖値は、ＡｃｃｕｃｈｅｃｋＡｖｉｖａｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて測定する。ＳＴＺ処置ラットに、化合物３３０又はビヒクルである滅菌通常生理食塩水（０．９％ｗ／ｖの塩化ナトリウム溶液）の単回皮下注射（ＳＣ）を行う。グルコース測定用の血液サンプルを尾出血により採取する。実験期間を通じて、動物は食物と水を自由に取ることができる。これらの実験から得た血漿サンプルを、化合物レベルの分析のために送付する。

化合物３３０の血糖値は、（ＳＴＺ）処置ラットにおいて３つの用量レベル、３０、１００、３００ｎｍｏｌ／ｋｇで測定される。血糖は、注射後、０、０．５、１、２、４、６、８、１０、１２、２４、３６、４８、７２、及び９６時間で測定される。示されているデータは、平均±（平均標準誤差）ＳＥＭ（ｎ＝５）である。統計分析は、ＪＭＰソフトウェアを使用して行われ、処置群とビヒクル対照群が比較されている（^＊Ｐ＜０．０５）。

化合物３３０は対照群よりも、１００ｎｍｏｌ／ｋｇの投与量で８時間後、最大で７６％、３００ｎｍｏｌ／ｋｇの投与量で２４時間後、最大で８９％の降下を示している（表３）。
［表３］

表３：化合物３３０の投与後の継時的な血糖値（ｍｇ／ｄＬ）

［配列］
配列

ポリペプチド配列（配列番号１）
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ポリペプチド配列（配列番号２）
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ポリペプチド配列（配列番号３）
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［配列］
配列

ポリペプチド配列（配列番号１）
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ポリペプチド配列（配列番号２）
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ポリペプチド配列（配列番号３）
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本発明は、以下の態様を含む。
［１］
Ａ鎖及びＢ鎖を備える化合物であって、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は配列番号１であり、及び前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は配列番号２であり、ならびに前記Ａ鎖及びＢ鎖は、前記Ａ鎖の７位のシステインと前記Ｂ鎖の７位のシステインの間にジスルフィド結合、前記Ａ鎖の２０位のシステインと前記Ｂ鎖の１９位のシステインの間にジスルフィド結合、及び前記Ａ鎖の６位のシステインと前記Ａ鎖の１１位のシステインの間にジスルフィド結合を含有している、前記化合物。
［２］
［１］に記載の化合物、及び１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含有する医薬組成物。
［３］
有効量の［１］に記載の化合物、又は有効量の［２］に記載の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者の糖尿病を治療する方法。
［４］
有効量の［１］に記載の化合物、又は有効量の［２］に記載の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者の高血糖症を治療する方法。
［５］
治療における使用のための、［１］に記載の化合物。
［６］
糖尿病の治療における使用のための、［１］に記載の化合物。
［７］
高血糖症の治療における使用のための、［１］に記載の化合物。
［８］
糖尿病の治療のための医薬の製造における、［１］に記載の化合物の使用。
［９］
高血糖症の治療のための医薬の製造における、［１］に記載の化合物の使用。

Claims

Ａ鎖及びＢ鎖を備える化合物であって、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は配列番号１であり、及び前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は配列番号２であり、ならびに前記Ａ鎖及びＢ鎖は、前記Ａ鎖の７位のシステインと前記Ｂ鎖の７位のシステインの間にジスルフィド結合、前記Ａ鎖の２０位のシステインと前記Ｂ鎖の１９位のシステインの間にジスルフィド結合、及び前記Ａ鎖の６位のシステインと前記Ａ鎖の１１位のシステインの間にジスルフィド結合を含有している、前記化合物。
請求項１に記載の化合物、及び１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含有する医薬組成物。
有効量の請求項１に記載の化合物、又は有効量の請求項２に記載の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者の糖尿病を治療する方法。
有効量の請求項１に記載の化合物、又は有効量の請求項２に記載の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、患者の高血糖症を治療する方法。
治療における使用のための、請求項１に記載の化合物。
糖尿病の治療における使用のための、請求項１に記載の化合物。
高血糖症の治療における使用のための、請求項１に記載の化合物。
糖尿病の治療のための医薬の製造における、請求項１に記載の化合物の使用。
高血糖症の治療のための医薬の製造における、請求項１に記載の化合物の使用。