JP2018512071A5

JP2018512071A5 -

Info

Publication number: JP2018512071A5
Application number: JP2017534299A
Authority: JP
Filing date: 2016-01-22
Publication date: 2020-08-06
Anticipated expiration: 2036-01-22

Description

任意の実施形態では、試料は生物試料であってよい。いくつかの実施形態では、第１の複数の異なる成分は、異なる細胞サブセットである。いくつかの実施形態では、細胞サブセットは脳細胞サブセットを含む。いくつかの実施形態では、脳細胞サブセットは、神経細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、およびミクログリアの内の少なくとも１つのサブセットを含む。いくつかの実施形態では、細胞サブセットは、間質細胞、幹細胞、神経細胞、および前駆細胞の内の少なくとも１つのサブセットを含む。いくつかの実施形態では、細胞サブセットは腫瘍細胞サブセットを含む。いくつかの実施形態では、細胞サブセットは白血球サブセットを含む。いくつかの実施形態では、細胞サブセットは腫瘍浸潤白血球のサブセットを含む。いくつかの実施形態では、細胞サブセットはリンパ球のサブセットを含む。いくつかの実施形態では、白血球サブセットは、ナイーブＢ細胞、記憶Ｂ細胞、プラズマ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ４記憶ＲＯ不活性Ｔ細胞、ＣＤ４記憶ＲＯ活性化Ｔ細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、非刺激ＮＫ細胞、刺激ＮＫ細胞、単球、マクロファージＭ０、マクロファージＭ１、マクロファージＭ２、非刺激樹状細胞、刺激樹状細胞、非刺激マスト細胞、刺激マスト細胞、好酸球、および好中球からなる群より選択される２つ以上の細胞型を含む。いくつかの実施形態では、細胞サブセットは、異なる細胞周期段階の細胞サブセットを含む。いくつかの実施形態では、異なる細胞周期段階の細胞サブセットは、間期、分裂期または細胞質分裂の内の１つまたは複数の細胞サブセットを含む。いくつかの実施形態では、異なる細胞周期段階の細胞サブセットは、分裂前期、中期、分裂後期、または分裂終期の内の１つまたは複数の細胞サブセットを含む。いくつかの実施形態では、異なる細胞周期段階の細胞サブセットは、Ｇ_０、Ｇ_１、Ｇ_２、またはＳ期の内の１つまたは複数の細胞サブセットを含む。いくつかの実施形態では、第１の複数の異なる成分は、異なる細胞内シグナル伝達経路、遺伝子調節経路、または代謝経路である。いくつかの実施形態では、異なる細胞内シグナル伝達経路には、サイトカインシグナル伝達、死因子シグナル伝達、増殖因子シグナル伝達、生存因子シグナル伝達、ホルモンシグナル伝達、Ｗｎｔシグナル伝達、ヘッジホッグシグナル伝達、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達、細胞外マトリックスシグナル伝達、インスリンシグナル伝達、カルシウムシグナル伝達、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達、神経伝達物質シグナル伝達、およびこれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、異なる代謝経路には、解糖、糖新生、クエン酸回路、発酵、尿素回路、脂肪酸代謝、ピリミジン生合成、グルタメートアミノ酸基合成、ポルフィリン代謝、アスパルテートアミノ酸基合成、芳香族アミノ酸合成、ヒスチジン代謝、分岐アミノ酸合成、ペントースホスフェート経路、プリン生合成、グルクロネート代謝、イノシトール代謝、セルロース代謝、スクロース代謝、デンプンおよびグリコーゲン代謝、およびこれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、特徴プロファイルには、遺伝子発現プロファイル、タンパク質−タンパク質相互作用プロファイル、タンパク質リン酸化プロファイル、細胞電気活性プロファイル、クロマチン修飾プロファイル、染色体結合プロファイル、酵素活性プロファイル、代謝物プロファイルまたはこれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、特徴プロファイルには、生物試料中の細胞のＲＮＡトランスクリプトームを表す遺伝子発現プロファイルが含まれる。いくつかの実施形態では、生物試料は、保管された組織試料である。いくつかの実施形態では、生物試料は、血液試料である。いくつかの実施形態では、生物試料は、固体組織試料由来である。いくつかの実施形態では、固体組織試料は腫瘍試料である。いくつかの実施形態では、固体組織試料はホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である。いくつかの実施形態では、生物試料は、精製試料である。いくつかの実施形態では、生物試料は、白血球濃縮試料である。いくつかの実施形態では、方法は、個体から試料を得ることをさらに含む。

ＣＩＢＥＲＳＯＲＴの概要および白血球デコンボリューションへの適用を示す図である。（図１ａ）手法の模式図。（図１ｂ〜１ｃ）：（図１ｂ）２０８個のアレイの異なる精製または濃縮白血球サブセット（図１７）、および（図１ｃ）非細胞株と細胞株に分割した、３，０６１個の多様なヒトトランスクリプトームの、デコンボリューションへの白血球シグネチャーマトリックス（すなわち、ＬＭ２２）の適用。図１ｃの感度（Ｓｎ）および特異性（Ｓｐ）は、方法で記載の、正および負の群に関連して定義される。ＡＵＣは曲線下面積。（図１ｄ）コールターカウンター^１１により測定した対応する比率と比較した、全血試料のリンパ球、単球、および好中球のＣＩＢＥＲＳＯＲＴ分析。図１ｂのＣＩＢＥＲＳＯＲＴ比率は、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴによりそれぞれの白血球サブセットに割り付けられた相対的比率を意味する。図１ｂの非活性化および活性化サブセットは、それぞれ「＋」および「−」で示されている。複合組織由来の多様なＲＮＡ混合物に対する性能評価を示す図である。（図２ａ〜２ｃ）：（図２ａ）添加腫瘍含量（ｘ軸）およびノイズ（ｙ軸）の全域の性能、（図２ｂ）元の未改質値からの図２ａの混合物の偏差、および（図２ｃ）漸増腫瘍含量の関数としての所与の細胞型の検出限界、の関係から見た、模擬組織中の白血球サブセット分解のためのＣＩＢＥＲＳＯＲＴ精度（各データポイント当たりｎ＝５ランダム混合物）。（図２ｄ）図２ａ〜２ｃに示した分析に対して、６つのＧＥＰデコンボリューション法とＣＩＢＥＲＳＯＲＴの比較（図７、８）。（図２ｅ）乳房組織に添加した全血のインビトロ混合物の分析。左：血液比率の報告は、遺伝子発現データ（ＬＭ２２正規化免疫指標：方法の項参照）と一致する。右：方法間の白血球デコンボリューションの安定性。（図２ｆ）独立調査間および癌タイプ間のＣＩＢＥＲＳＯＲＴの一貫性（白血球の略語については、図１６ｊ〜１６ｋを参照）。（図２ｇ〜２ｉ）：（図２ｇ）対をなす凍結とＦＦＰＥＤＬＢＣＬ試料との間で比較したＣＩＢＥＲＳＯＲＴ性能、ならびに（図２ｈ）正常肺組織および（図２ｉ）濾胞性リンパ腫腫瘍のフローサイトメトリーと比較したＣＩＢＥＲＳＯＲＴ性能。図２ｉのアスタリスクは、同じ患者からの外れ値の可能性があることを示す。図２ｈおよび図２ｉで定量化に使用した表面マーカーは、括弧中に示す。図２ｅ〜２ｉの結果は、ＬＭ２２を使って取得し、その後、分析の前に、１１種の主要白血球タイプに併合した（図１６ａ〜１６ｉ）。図２ｃおよび図２ｈの値は、中央値±９５％信頼区間として表されている。４１人のヒト対象における個々の細胞サブセットのディープデコンボリューションおよび列挙を示す図である。（図３ａ〜３ｃ）：（図３ａ）２０人の対象由来のＰＢＭＣ中の８個のサブセット、（図３ｂ）別のセットの７人の対象由来のＰＢＭＣ中のＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ、および（図３ｃ）１４人のＦＬの対象由来の腫瘍生検材料中の悪性のＢ細胞を含む３個の免疫サブセットに関して、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴとフローサイトメトリーとの間の直接比較。（図３ｄ）図３ａ〜３ｃで分析したデータセットに対して、５つの発現ベースデコンボリューション法の比較。灰色の領域は、フローサイトメトリーと有意（Ｐ＜０．０５）に相関した、デコンボリューションされた細胞型を意味する。全ての方法の散布図は図１３ａ〜１３ｂ、１４に示している。３つの事例では、相関係数が決定できなかった。このパネルに含めるために、これらは、０の値に割り付けられた（図１９ａ〜１９ｄ；図１３ａ〜１３ｂ）。データは、平均±標準偏差として表される。図１９ａ〜１９ｄには、ＲＭＳＥ値を含む全データが示されている。ＬＭ２２シグネチャーマトリックスおよびＡｂｂａｓらとの比較を示す図である。（図４ａ）２２白血球サブセット間の各遺伝子の相対発現を示すＬＭ２２シグネチャーマトリックス（図１６ａ〜１６ｉ）の色分け地図。遺伝子発現レベルを単位分散に正規化し、ユークリッド距離を使って細胞サブセットおよび遺伝子を階層的にクラスター化した（高発現、赤；低発現、青）。（図４ｂ）ＬＭ２２と、以前報告されたシグネチャーマトリックス（Ａｂｂａｓら、２００９）^５との間の、遺伝子、細胞サブセット、および発現アレイに関する重なり。ＡｂｂａｓらとＬＭ２２との間の遺伝子の重なりに対しては、我々は、ＨＵＧＯ遺伝子シンボル（ｎ＝３６）に分解できないものを含む、全てのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘｐｒｏｂｅｓｅｔを「遺伝子」と見なした。ＬＭ２２の詳細については、図１６ａ〜１６ｋを参照されたい。（図４ｃ）ＬＭ２２中のそれぞれの細胞サブセットの基準プロファイルを比較する相関係数（ピアソン）の全組み合わせ対比色分け地図（遺伝子は方法の項で記載のように正規化した；図１６ａ〜１６ｉと同様に）。精製白血球の分析によるＬＭ２２の検証を示す図である。（図５ａ）ＬＭ２２中でプロファイリングされた精製／濃縮白血球を含む検証アレイにおいてＣＩＢＥＲＳＯＲＴによりコールされた各ＬＭ２２細胞サブセットの比率（図１ｂに関連；図１７ａ〜１７ｂも参照されたい）。所与の細胞サブセットのアレイに対する結果が比率の中央値としてまとめられている。色標示凡例に示す細胞サブセットの略語は、図１６ｊ〜１６ｋで定義されている。（図５ｂ）左：ＢおよびＴリンパ球を５人のヒト扁桃腺から流動選別して、それぞれ９５％および９８％を超える平均純度レベルにした後、マイクロアレイによりプロファイリングした。右：ＣＩＢＥＲＳＯＲＴにより推定された、これらのＢ／Ｔ細胞の分数表現、ならびに残りの白血球含量。素性の明確な混合物のＣＩＢＥＲＳＯＲＴによる分解能を示す図である。異なるシグネチャーマトリックスを使って（上段）、異なる混合物に適用した（下段）ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ性能の解析。上段：（図６ａ）ＧＳＥ１１１０３^５中の精製血液癌細胞株発現プロファイル（図６ｂ）ＧＳＥ１９３８０^６中の神経遺伝子発現プロファイル、および（図６ｃ）ＬＭ２２に対する細胞集団基準発現シグネチャー（図１６ａ〜１６ｋ）。下段：（図６ａ）血液癌細胞株（ＧＳＥ１１１０３^５）と、（図６ｂ）神経細胞型（ＧＳＥ１９３８０^６）の所定の混合物に対する既知および推定比率の比較。（図６ｃ）４人の非ホジキンリンパ腫患者由来の一対の試料を含むリツキシマブ治療前後のＰＢＭＣ試料のＬＭ２２を使ったＣＩＢＥＲＳＯＲＴ分析（分かりやすくするために、１１種の白血球タイプにプールした；図１６ａ〜１６ｋを参照されたい）。付加ノイズを含む模擬腫瘍に対するデコンボリューション法の比較分析を示す図である（図２ａ、２ｂに関連）。（図７ａ）添加腫瘍含量（ｘ軸）および非ｌｏｇ線形添加ノイズ（ｙ軸）に対するそれぞれの方法の性能景観図（詳細は方法の項を参照）。（図７ｂ）各混合物のその元の非変更値からの偏差の関数として評価したそれぞれの方法の精度（ｘ軸上に１−Ｒとして表される）。図７ａの既知の細胞型比率に対する性能は、下限をゼロとしたピアソンの相関係数で表されている。推定の偏りを示すために、図７ｂに、既知と予測細胞型比率（パーセンテージとして表されている）との差異が、上限を４０とした二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）として表されている。既知の含量の模擬混合物の検出限界に対するデコンボリューション法の比較を示す図である（図２ｃ、２ｄに関連）。各色は、所定の細胞型（この場合、ジャーカット）に対する所定の入力濃度を表し、各線はＧＥＰデコンボリューションにより予測されたその濃度を表す。既知のジャーカット濃度は、異なる濃度の結腸癌株を有する４つの血液細胞株の５つの模擬混合物における広範な添加腫瘍含量範囲にわたり測定された（方法の項を参照）。データは、中央値（ｎ＝５混合物）±９５％信頼区間として表されている。ＬＭ２２中のそれぞれの細胞サブセットに対する検出限界の分析を示す図である。（図９ａ）ＬＭ２２の残りの２１細胞型の模擬混合物に添加されたナイーブＢ細胞の所定の入力を使って検出限界が評価されたことを除いて、図８と同じ（図１６ａ〜１６ｋ）。未知の含量の検出限界に対する影響は、ナイーブＢ細胞遺伝子の順序をランダムに変えることにより生成した模擬ＧＥＰを加えることにより評価された。データは、中央値（ｎ＝４混合物）±９５％信頼区間として表されている。（図９ｂ）ＬＭ２２中の全細胞型であることを除いて、図９ａと同じ。より大きいスパイクインが相関を促進するのを防ぐために、我々は、ノンパラメトリックスピアマンの順位相関係数を使って性能を集計し、全てのスパイクインおよび試験した未知の含量のレベルに対する既知および予測の比率を比較した。これらの結果を全体として考慮すると、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴは、試験した他の方法より有意に性能が優れている（Ｐ＜０．０００１；対応のある両側性ウィルコクソン符号付順位検定；ｎ＝２２細胞サブセット）。注目すべきことに、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴはまた、ピアソン相関により測定して、直線当てはめに対して、他の方法より性能が優れていた。さらなる詳細に関しては、方法の項を参照されたい。所定の混合物中の特徴（遺伝子）選択の分析を示す図である。（図１０ａ）スパイクシリーズに対するＣＩＢＥＲＳＯＲＴの適用結果。該スパイクシリーズでは、ＣＤ８Ｔ細胞に対するＬＭ２２基準プロファイルが、非活性化マスト細胞（ＭＣ−）に対する対応する基準プロファイル中に、均等増分でスパイクされた（ｎ＝２１）。（注目すべきことに、両細胞型は、ＬＭ２２中で大きく異なる発現ベクターを有する；図４ｃ参照）。（図１０ｂ）ＣＤ８Ｔ細胞のためではなく、１００％非活性化マスト細胞をデコンボリューションするためにサポートベクター回帰（ＳＶＲ）により選択された遺伝子間の比較であり、逆も同じ。それぞれの特有の遺伝子サブセットに対し、ＬＭ２２シグネチャーマトリックス中の発現レベルが、非活性化マスト細胞とＣＤ８Ｔ細胞との間でさらに比較される。対応のあるおよび対応のない両側性ウィルコクソン符号付順位検定を、それぞれ群内および群間比較に使用した。データは中央値±四分位間範囲として表される。１００％ＣＤ８Ｔ細胞試料のために特有に選択された遺伝子は、非活性化マスト細胞より、ＣＤ８Ｔ細胞中で有意に多く発現されるが、その量は小さい。さらに、逆のシナリオは、１００％非活性化マスト細胞試料中の非活性化マスト細胞遺伝子では観察されず、ＳＶＲ遺伝子選択は、混合物中の特定の細胞サブセットの存在または非存在と強く相関していないことを示唆する。（図１０ｃ）ＬＭ２２中の遺伝子発現レベルと、０％を超えるＣＤ８Ｔ細胞および０％を超える非活性化マスト細胞を含む１９混合物のセットからのＳＶＲによりそれぞれの遺伝子が選択（仮にあったとして）される頻度との間の比較（図１０ａのパネルを参照）。上段：（左）ＣＤ８Ｔ細胞または（右）非活性化マスト細胞の発現レベルの比較。下段：（左）ＣＤ８Ｔ細胞および非活性化マスト細胞または（右）ＬＭ２２中の全ての細胞サブセットの平均発現レベルの比較。スパイクイン組成に関係なく、発現と遺伝子選択頻度との間の最も高い相関は、ＬＭ２２中の全ての細胞型を考慮した場合に観察された。多重共線性のシグネチャーマトリックスベース方法に与える影響を示す図である。（図１１ａ〜１１ｄ）多重共線性のデコンボリューション性能に与える影響が、未知の含量（図１１ａ〜図１１ｃ）またはシグネチャーマトリックスに加えられたノイズを有する混合物（図１１ｄ）に対し示されている。それぞれのパネルは、次のように整理されている。上段：多様な多重共線性値（ｘ軸；方法の項参照）に対する平均相互相関係数（左ｙ軸）および対応するシグネチャーマトリックスＧＥＰの平均条件数カッパ^５（右ｙ軸）；平均相互相関は、シグネチャーマトリックス基準プロファイルの全組み合わせ対比相関比較（ピアソン）の平均値を示し、カッパは、シグネチャーマトリックス安定性の尺度（方法の項参照）である。両測定法は、シグネチャーマトリックス中の多重共線性（または、基準プロファイル中の類似度）を取得する。下段左：模擬混合物に対する４つのデコンボリューション法の相対的性能を示し、これは、既知および予測の細胞比率（ｙ軸）を比較する。２０種のレベルの多重共線性からの結果が、多重共線性の増加の順で（左から右へ）示される。多重共線性のそれぞれのレベルは、１０回模擬され、集計値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表される。下段右：それぞれの方法の性能のボックスプロットとしての集計、四分位範囲がボックス中に含まれ、最小および最大点はひげにより示される。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴと他の方法との間の群比較を、対応のある両側性ウィルコクソン符号付順位検定を使って実施した。全てのシグネチャーマトリックスおよび混合物ベクターは、分析の前に、単位分散に正規化された。更なる詳細については、方法の項を参照されたい。１８人の個体のＤＬＢＣＬ腫瘍（ＧＳＥ１８３７７^７）中の凍結とＦＦＰＥ試料との間の白血球デコンボリューション結果の比較を示す図である。（図１２ａ）それぞれの腫瘍中で分解された２２個の白血球サブセットに対する結果が示される；図２ｇに関連。データポイント（丸）は、図２ｇの場合のように着色され、細胞型を示す。試料ＩＤ：１１および１４のデコンボリューション結果は、ＦＦＰＥと凍結状態との間で有意に相関しなかった（ＮＳ）。（図１２ｂ）全１８個の腫瘍中の代表的細胞型の散布図を示す。ＰＢＭＣ中の９個の白血球サブセットの列挙のためのデコンボリューション法の比較（図３ａ、３ｂに関連）。（図１３ａ）２０個のＰＢＭＣ試料中の８個の白血球サブセットの列挙に関し、フローサイトメトリーを５つのデコンボリューション法と比較した散布図。（図１３ｂ）７個のＰＢＭＣ試料の別のコホート中でプロファイリングされたＴｒｅｇを除いて、図１３ａと同じ。分析した１０個の合計表現型（方法の項参照）の内で、ここで示した９個のサブセットは、少なくとも０．５の相関係数を有する少なくとも１つの方法でデコンボリューションされた。全１０個のサブセット（ガンマデルタＴ細胞を含む）の詳細性能測定法は、図１９ａ〜１９ｄに示されている。ＦＬ腫瘍生検材料中の３個の白血球サブセットの列挙に関し、デコンボリューション法の比較（図２ｉ、３ｃに関連）。脱凝集したＦＬリンパ節生検材料中の悪性Ｂ細胞を含む３個の白血球サブセットの列挙に関し、フローサイトメトリーを５つのデコンボリューション法と比較した散布図。個々の細胞サブセットのＲＭＳＥ値については、図１９ａ〜１９ｄを参照されたい。複合混合物に適用した５つのデコンボリューション法に対するベンチマーキング結果のまとめ。２つの性能尺度（ＲおよびＲＭＳＥ）を使って、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴは、有意に他の遺伝子発現ベースの方法（対応のある両側性ウィルコクソン符号付順位検定）より性能が優れており、一般に、複合混合物に対し、全ての他の方法より良好な性能を示す（図２ｄ）。図１９ａ〜１９ｄでは、生データは、「複合混合物」として提供される。デコンボリューション法の詳細については、図１８および方法を参照されたい。白血球シグネチャーマトリックス（ＬＭ２２）を示す図である。示されているのは、２２個の免疫細胞型を相互からおよびその他の細胞型から識別する遺伝子シグネチャーの正規化発現レベル（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ強度）である（図１６ａ〜１６ｉ）。方法の項で記載のように、遺伝子はその他の正常なおよび癌細胞に対し選別され、それらの特異性を高めた。原データは、隣接シート（試料）で提供される。付随する原稿全体に登場する白血球略語は、図１６ｊおよび１６ｋに示される。外部データセットの精製造血集団に対するＬＭ２２の検証を示す図である。精製試料を含む外部データセットにＣＩＢＥＲＳＯＲＴを適用し、それぞれの試料中のシグネチャーマトリックスに含まれる細胞型の比率を推定した。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴにより予測された最大の比率を有する細胞型のタイプを、既知の精製細胞型と比較し、これらが一致すると、正しいとしてカウントした。ＧＥＰデコンボリューション法の特徴比較を示す図である。示した全ての方法は、マーカー遺伝子、シグネチャーＧＥＰ、または細胞比率の事前の知識を必要とし、入力として、任意の数の細胞型を取り込む。詳細は、方法の項を参照されたい。「ａ」は、この研究で示されているか否かを意味する（例えば、図６ａ〜６ｃ、７ａ〜７ｂ、および８）。「ｂ」は、この研究で示されていることを意味する（図９ａ〜９ｂ、方法の項参照）。理想化混合物に対するそれぞれのアルゴリズムの性能を示す図である。細胞は、それぞれの分析に対する相対的性能に従って着色されている。相関係数については、赤＝最大、青＝最小。ＲＭＳＥについては、青＝最大、赤＝最小。ＬＭ２２を３種の主要白血球タイプ（リンパ球、単球、および好中球）に併合し、グラウンドトルース比率（ＧＳＥ２０３００）に対し比較した。「ａ」は、統計が一回の実験から得られた（すなわち、直接）のか、または中央値を使って総計したかを意味している。図１９ａは、バルク組織に対する相関係数（Ｒ）を示す。図１９ｂは、バルク組織に対するＲＭＳＥを示す。図１９ｃは、理想化混合物に対する相関係数（Ｒ）を示す。図１９ｄは、理想化混合物に対するＲＭＳＥを示す。一実施形態による本発明のシステムの概略図である。システムは、本方法を実施するように構成されたサポートベクター回帰アプリケーションを有する記憶装置を含む。サポートベクター回帰の例示的実施例を示す一群のグラフである。本開示のいくつかの実施形態による、マーカー遺伝子のデコンボリューションに対する影響を示す一群のグラフおよび表である。本開示のいくつかの実施形態による、２５個のヒト癌中の推定白血球頻度および予後関連性を示す一群のグラフである。本開示のいくつかの実施形態による、プラズマ細胞に対する浸潤ＰＭＮの比率が、多様な固形腫瘍における予後であることを示す一群のグラフである。本開示のいくつかの実施形態による、癌タイプおよびデータセット間の推定白血球比率の相関分析を示す一群のグラフである。本開示のいくつかの実施形態による、２２個の白血球サブセットと２５種の癌組織との間の予後関連性を示す一群のグラフである。本開示のいくつかの実施形態による、非小細胞肺癌および隣接する正常組織中のプラズマ細胞レベルを示す一群のグラフおよび画像である。本開示のいくつかの実施形態による、ヘルドアウト発現データセットでの、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）マーカーおよび染色定量化の評価、ならびに推定多形核（ＰＭＮ）／プラズマ細胞（ＰＣ）の予後的有意性を示す一群のグラフおよび画像である。

本明細書で使用される場合、用語の「白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）」または「白血球（ｗｈｉｔｅｂｌｏｏｄｃｅｌｌ）」は、単球、好中球、好酸球、好塩基球、およびリンパ球を含む任意の免疫細胞を意味する。本明細書で使用される場合、用語の「リンパ球」は通常、リンパ液中で認められる細胞を意味し、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｔ細胞およびＢ細胞を含む。上に列挙した免疫細胞型は、さらにサブセットに分解できることは、当業者に理解されるであろう。

本明細書で使用される場合、用語の「腫瘍浸潤白血球」は、固形腫瘍中に存在する白血球を意味する。

特定の態様では、１つまたは複数の細胞サブセットは、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）（すなわち、白血球（ｗｈｉｔｅｂｌｏｏｄｃｅｌｌ）またはＷＢＣ）であってよい。可能な白血球細胞サブセットには、単球、樹状細胞、好中球、好酸球、好塩基球、およびリンパ球が含まれる。これらの白血球サブセットは、例えば、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４ナイーブＴ細胞、ＣＤ４記憶ＲＯ不活性Ｔ細胞、ＣＤ４記憶ＲＯ活性化Ｔ細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、など）およびＢ細胞（ナイーブＢ細胞、記憶Ｂ細胞、プラズマ細胞）を含むリンパ球細胞サブセットにさらに細分できる。免疫細胞サブセットは、活性化（または刺激）状態に基づいてさらに分離し得る。

特定の態様では、白血球は、血液癌、自己免疫疾患、骨髄異形成症候群、などの白血球障害の個体由来であってよい。血液疾患の例には、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および骨髄腫が挙げられる。自己免疫疾患の例には、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病（１型）、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、いくつかの形態の心筋炎、多発性硬化症、天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、および全身性エリテマトーデスが挙げられる。

特定の態様では、１つまたは複数の細胞サブセットは、腫瘍浸潤白血球を含んでよい。腫瘍浸潤白血球は、生物試料中の癌細胞との混合物であってよく、または上記のいずれかの方法または当該技術分野において既知の方法により濃縮されてよい。

特定の態様では、細胞サブセットは、例えば、上記セクションに記載されているような白血球を含む。白血球は、腫瘍浸潤白血球（例えば、癌細胞との混合物または癌細胞から精製された）であってよい。白血球細胞サブセットは、ナイーブＢ細胞および記憶Ｂ細胞の内の１種または複数など、およびＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４ナイーブＴ細胞、ＣＤ４記憶ＲＯ不活性Ｔ細胞、ＣＤ４記憶ＲＯ活性化Ｔ細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞、および制御性Ｔ細胞の内の１種または複数などのリンパ球を含んでよい。特定の態様では、白血球細胞サブセットは、Ｂ細胞、プラズマ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、マスト細胞、好酸球、および好中球細胞サブセットの内の１種または複数を含んでよい。

上述のように、物理的試料、例えば、生物試料は、多くの物理的試料、例えば、生物試料のいずれであってもよい。特定の態様では、生物試料は、保管された組織試料、血液試料、固体組織試料、腫瘍試料、精製試料、白血球濃縮試料、またはこれらの組み合わせである。

最初の適用として、バルク腫瘍からの白血球デコンボリューションの実現性、したがって、白血球シグネチャーマトリックスの設計および有効性が見極められた。ＬＭ２２と命名されたこのシグネチャーマトリックスは、７種のＴ細胞型、ナイーブおよび記憶Ｂ細胞、プラズマ細胞、ＮＫ細胞、および骨髄サブセット（図１６、図４、方法の項参照）を含む、２２個の成熟ヒト造血集団および活性化状態を正確に識別する５４７個の遺伝子からなる。細胞サブセットは、造血ヒエラルキーの共通系統に基づいて、１１種の主要白血球タイプにさらに分類できる（図１６）。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴを使って、ＬＭ２２を最初に、種々の方法で精製した白血球サブセットのプロファイルを有する追加のデータセットに対し検証して、統合遺伝子の細胞型特異性を確認し、９３％のデータセットを異なる細胞表現型に正確に分類した（図１ｂ、図５ａ、図１７）。さらなる検証として、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴにより、５人のヒト扁桃腺から流動選別したＴおよびＢ細胞の高純度に適合する結果が得られた（図５ｂ）。

ＣＩＢＥＲＳＯＲＴの実験的ｐ値測定法の感度および特異性を評価するために、ＬＭ２２を３，０６１個のヒトトランスクリプトームのデコンボリューションに適用した^１０。モンテカルロベースランダム遺伝子サンプリングを用いて、「ゼロ」混合物を生成し（方法の項参照）、その後、既知の造血および非造血細胞源からの発現プロファイルを、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴを使って、「正」および「負」試料としてスコア化した。この区別は、種々に精製した一次組織供試体（ｎ＝１，８０１合計、正＝１，４２５、負＝３７６）および形質転換細胞（ｎ＝１，２６０合計、正＝１１８、負＝１，１４２）に対し別々に考慮に入れた。両群では、約０．０１の実験的ｐ値閾値で、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴは、負試料から正試料の識別に対し、９４％以上の感度および９５％以上の特異性を達成した（ＡＵＣ≧０．９８；図１ｃ）。注目すべきことに、ＬＭ２２の代わりに独立に得た白血球シグネチャーマトリックス^４を使っても同様の結果であり（データは示さず）、手法の一般性を裏付けた。

次に、それぞれ極めて異なる基準プロファイルを有する４種の混合血液癌細胞株４からなる、よく使われるベンチマークデータセットを用いて、未知の含量を含む混合物に対する、その他の方法に比べたＣＩＢＥＲＳＯＲＴの技術的性能が比較された（方法の項参照）。これらの混合物を結腸癌細胞株と混合することにより、ヒト固形腫瘍は種々の白血球浸潤（１％〜１００％）を有するように模擬された。非ｌｏｇ線形ノイズの添加も試験し、試料取り扱い、確率的遺伝子発現変動、およびプラットホーム間の差異を模擬した。この模擬フレームワークは固形腫瘍の生物学的混合物を完全に反映するものではないが、免疫含量および添加ノイズが細かく調節および試験可能な合理的なモデルを提供した。さらに、それぞれの方法の性能は、より複雑な混合物の場合に大きく改善できそうにない。

模擬混合物に対しＣＩＢＥＲＳＯＲＴのベンチマークを行って、バルク腫瘍を含む固体組織のインビトロおよびインビボ混合物を試験した。ＬＭ２２を全てのその後の分析のために使用し、したがって、我々の比較評価を発現ベースの方法（すなわち、ＲＬＲ、ＰＥＲＴ、ＱＰ、ＬＬＳＲ）に限定した。最初、乳房組織中に添加した全血の所定の混合物中の白血球デコンボリューションの安定性を試験した^５。加えて免疫関連遺伝子発現との比較により、相対的スパイクイン比率を検証（図２ｅ、左）後、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴが他の方法より有意に高い一貫性があることが明らかになった（Ｐ＜０．０２；ｎ＝９個の１００％未満の血液を含む試料；対応のある両側性ウィルコクソン符号付順位検定；図２ｅ、右；図１９）。別に、独立調査全体にわたり、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴにより列挙された白血球比率は、癌間より癌タイプ内でより類似性が高かった（図２ｆ）。これらの結果は、未知の含量および研究室特異的要因は、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ性能に対し、ごくわずかな影響しか与えないことを示す。

次に、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴは、長期貯蔵のために、検査室で定常的に生成されているホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料に適用可能かどうかが問われた。適合ＦＦＰＥおよび凍結ＤＬＢＣＬ腫瘍（ｎ＝１８）からなる公的に入手可能なＧＥＰを使って、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴにより推定された白血球比率は、全ての腫瘍間で有意に相関し（図２ｇ）、その他の方法より一致性が高かったことが明らかになった（図１９）。実際に、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴの結果はまた、１８個の個別腫瘍中の１６個（Ｐ＜０．０５；図１２ａ）および特定の細胞サブセット（図１２ｂ）において、有意に相関し、ＦＦＰＥ供試体中の細胞組成物の大規模分析に対する潜在的有用性を暗示した。

固体組織中の白血球含量のグラウンドトルース測定に対してＣＩＢＥＲＳＯＲＴを評価するために、フローサイトメトリーを使って、２種の組織型：初期段階非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の外科的切除中に得た肺供試体、および濾胞性リンパ腫（ＦＬ）患者由来の脱凝集したリンパ節生検材料、中の免疫サブセットを列挙した。（ｉ）正常な肺組織の独立マイクロアレイ調査または（ｉｉ）１４個の対でのバルクＦＬ試料由来のＧＥＰへの適用に係わらず、結果は、対応するフローサイトメトリー測定値に有意に相関し（Ｐ≦０．００５；それぞれ図２ｈおよび２ｉ）、両組織型において、以前の方法より厳密に実験値を反映した（図１９）。

個々の細胞サブセットに対する性能を評価するために、フローサイトメトリーを使ってＬＭ２２のほぼ５０％（２２個の細胞サブセットの１０個）の表現型レパートリーを列挙し、血液および腫瘍生検材料を含む一次ヒト試料のディープデコンボリューションに対するＣＩＢＥＲＳＯＲＴの能力を評価した。２７人の成人対象からの血液試料を、ＰＢＭＣ中のＬＭ２２に収集された１０個の異なる細胞表現型についてプロファイリングした（２０人の対象が９個の細胞型に対しプロファイリングされ、７人がＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇに対しプロファイリングされた；フローサイトメトリーの方法の項を参照されたい）。これらの１０個の表現型の内で、半分がＬＭ２２中で高度に共線的であり（例えば、ナイーブおよび記憶Ｂ細胞；図４ｃ）、半分がＰＢＭＣ中で頻度が少ない（＜５％）（ナイーブおよび記憶Ｂ細胞、活性化記憶ＣＤ４Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、およびＴｒｅｇ）。分析した表現型の多様性に係わらず、９０％の異なる白血球サブセットが、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴとフローサイトメトリーとの間で有意に相関し（Ｐ≦０．０２；図３ａ）、これには、中央値比率が５％の５個のサブセットの内の４個（例えば、Ｔｒｅｇ；図３ｂ）が含まれる。ガンマデルタＴ細胞のみが有意でなく（正に相関したにもかかわらず；Ｒ＝０．２９）、おそらく、フローサイトメトリーまたは最適でない基準プロファイルの使用に付随する技術的問題が原因であろう（図５ａ）。別に、１４人のＦＬ患者由来の腫瘍生検材料中のＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞および悪性Ｂ細胞のレベルを調査し、フローサイトメトリーおよびマイクロアレイによりプロファイリングした（すなわち、図２ｉ）。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴにより推定された全３つのサブセットの比率は、フローサイトメトリーと有意に相関した（Ｐ≦０．０２；図３ｃ）。

図２ｈに関しては、新しい正常肺組織試料を小片に切断し、４５分間のコラゲナーゼＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）消化により、単細胞懸濁液に解離させた。解離した単細胞を１ｘ１０^７／ｍＬの濃度で染色緩衝液（２％の加熱不活性化仔ウシ血清を含むＨＢＳＳ）中に懸濁させた。１０μｇ／μＬのラットＩｇＧで１０分間のブロッキング後、上記表で示した抗体細胞を使って少なくとも１０分間染色した。洗浄後、染色した細胞を１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩを含む染色緩衝液中に再懸濁し、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ装置（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使って次の集団を列挙した：合計白血球（ＣＤ４５＋）、単球（ＣＤ１４＋）、ＣＤ８Ｔ細胞（ＣＤ８＋）、ＣＤ４Ｔ細胞（ＣＤ４＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ５６＋）、およびＢ細胞（ＣＤ１９＋）。

ＬＭ２２シグネチャーマトリックス
公共ドメインから、ＨＧＵ１３３Ａプラットホームでプロファイリングされた、２２個の白血球サブセット用のＧＥＰデータを取得した（図１６）。上記のように、プローブを前処理した。それぞれの集団と全てのその他の集団との間で有意差のある発現遺伝子を、両側性不等分散ｔ検定を使って、特定した。０．３未満のｑ値（偽陽性比率２１）の遺伝子を有意と見なした。

それぞれの白血球サブセットに対し、他の細胞サブセットと比較して、有意な遺伝子を減少方向倍率変化により順序づけ、それぞれの細胞サブセットから最上位のＧマーカー遺伝子をシグネチャーマトリックスＢＧに組み入れた。Ｇを全サブセットにわたり５０〜２００繰り返し、最小条件数のシグネチャーマトリックスを保持した（条件数＝１１．４；Ｇ＝１０２；ｎ＝５４７異なる遺伝子）（図１６ａ〜１６ｋ）。注目すべきことに、このシグネチャーマトリックスの条件数は、所与の細胞型の関連細胞型および活性化状態内での一致に起因して、その他のもの（下記）よりも大きい。

ＬＭ２２中のそれぞれの白血球サブセットを識別するのに使用される遺伝子シグネチャーを検証するために、シグネチャーマトリックス中にも存在するそれぞれ１つの精製された集団を含む、種々の外部データセットにＣＩＢＥＲＳＯＲＴを適用した。ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＨＧＵ１３３ＡおよびＨＧＵ１３３Ｐｌｕｓ２．０、ならびにＩｌｌｕｍｉｎａＨｕｍａｎ−６ｖ２ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＢｅａｄＣｈｉｐの３種のマイクロアレイプラットホーム由来のＧＥＰを試験した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットホームを正規化し、シグネチャーマトリックスＧＥＰに対し記載のものと同様に処理した。ＢｅａｄＣｈｉｐデータセットを、処理された正規化マトリックスとして、ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ（Ｅ−ＴＡＢＭ−６３３）からダウンロードし、１を超えるプローブにマッピングされた遺伝子に対しては、全ての試料にわたり最大発現に関連するプローブをさらに分析した。各サンプルに対し、最大ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ推定比率を有する集団を、既知の細胞型と比較し、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴの精度を評価した（図１７）。

付加ノイズを含む模擬腫瘍の分析
６種のＧＥＰデコンボリューション法（ＲＬＲおよびその他の５種^４−８）に対するＣＩＢＥＲＳＯＲＴのベンチマークを、異なるレベルの未知の含量（すなわち、腫瘍）およびノイズを有する混合物に対するそれらの結果を比較することにより行った。適正な比較を容易にするために、あらかじめ定めたインビトロ混合物（ｎ＝１２）の４種の血液細胞株（ＧＳＥ１１１０３）を使用した（図６ａ）。この細胞株のそれぞれは、相互に大きく異なり、容易にデコンボリューションされるものである。発現ベースの方法を評価するために、約６００個の特徴的な遺伝子（上記し、図６ａで適用したもの）を含むシグネチャーマトリックスを使用し、一方、マーカーベースデコンボリューションには、上述のマーカー遺伝子（ｎ＝５００遺伝子）を選択した。浸潤白血球を有する腫瘍を模擬するために、我々は、結腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６）由来の所定の入力のＧＥＰとの細胞株混合物と混合し、２つの複写物アレイの平均（ＧＳＭ２６９５２９およびＧＳＭ２６９５３０；ＧＳＥ１０６５０）として計算した。ＧＳＥ１１００３およびＧＳＥ１０６５０データセットの両方ともＭＡＳ５であり、分析の前に一緒に分位正規化した。ノイズを導入するために、次の分布、２＾Ｎ（０，ｆｘσ）（式中、ｆは０〜１の範囲（すなわち、図２ａおよび図７ａのｙ軸）で、σは、ｌｏｇ２空間で表される元の混合物の全体標準偏差（＝１１．６））からランダムにサンプリングした値を加えた。ＧＳＥ１１１０３は、それぞれ３つの複写物を有する４種の異なる混合物からなるので、それぞれのアルゴリズムの性能を１２種の混合物の全体セットにわたり測定した（ＲおよびＲＭＳＥ；図７、図１９）。さらに、これは、９００セットの混合物が一緒に解析されるように、３０個の間隔を規則的に置いて、腫瘍含量（０％〜１００％未満）およびノイズ（ｆ、０〜１）の全域にわたり独立に反復された。

細胞サブセット検出限界の分析
２つのコンピューター実験を行って、異なるデコンボリューションアルゴリズムの検出限界を評価した。第１の実験（図８）では、上述の同じ細胞株ＧＥＰを使って、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴおよびＲＬＲをその他の５つのＧＥＰデコンボリューション法^４−８と比較した。ジャーカット細胞（スパイクイン濃度：０．５％、１％、２．５％、５％、７．５％および１０％）を使い、その基準ＧＥＰ（ＧＳＥ１１１０３中の３つの複写物の中央値）をランダムに生成したその他の３つの血液細胞株のバックグラウンド混合物中に加えて、検出限界を評価した。それぞれのスパイクイン濃度に対し５つの混合物を生成した。均一に１０％ずつ増やして、０％〜９０％のＨＣＴ１１６（上記）を加えることにより模擬した種々の腫瘍含量の存在下で予測ジャーカット比率を評価した。注目すべきことは、記載した同じマーカー／シグネチャー遺伝子も模擬腫瘍（上記）として使用されたことである。第２の実験（図９ａ）では、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴを、ＱＰ^５、ＬＬＳＲ^４、ＰＥＲＴ^６、およびＲＬＲと比較した。白血球シグネチャーマトリックス由来のナイーブＢ細胞ＧＥＰを、シグネチャーマトリックス中の残りの２１個の白血球サブセットの４つのランダムバックグラウンド混合物に添加した。同じバックグラウンド混合物をそれぞれのスパイクインに対しても使用した。所定の比率（０〜９０％）のランダムに順序を変えたナイーブＢ細胞基準トランスクリプトーム（ＬＭ２２を構築するために使用した試料からの中央値発現プロファイル、図１６）由来の表現値を加えることにより、未知の含量の添加も試験した。次に、ＬＭ２２中の残っているそれぞれの白血球サブセットに対し、この解析を繰り返した（図９ｂ）

デコンボリューションの一貫性の解析
好適に入手可能なデータセット（ＧＳＥ２９８３２）にＬＭ２２を適用し、所定のレベルの乳房組織と混合した血液に対するデコンボリューション結果の安定性を測定した。乳房組織と混合された血液の報告された比率を確認するために、これらの比率を、トランスクリプトームの中央値発現レベルで除算し、データセット全体の既知の白血球含量（図２ｅ、左）の範囲に正規化したＬＭ２２中の全ての遺伝子の中央遺伝子発現値（図１６）として、各サンプルに対し決定された正規化ＬＭ２２免疫指標と比較した。一貫性測定法として、デコンボリューション結果を、最高の免疫純度を有する試料から得た結果を有する各サンプルについて比較した（図２ｅ、右）。

実施例２：２５個のヒト癌でＣＩＢＥＲＳＯＲＴを使って推定された白血球頻度および予後関連性
材料および方法
次の材料および方法を実施例２と３で使用した。

ＴＡＬ不均一性および予後関連性。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴを、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＨＧＵ１３３プラットホーム（５７調査、２５種の癌）由来の全ての正規化ＰＲＥＣＯＧＧＥＰに適用した。全体で、５，７８２個の腫瘍ＧＥＰがうまくデコンボリューションされた（ＣＩＢＥＲＳＯＲＴＰ＜０．００５）。それぞれのデータセットに対し、それぞれの白血球サブセットの推定ｍＲＮＡ比率を、１変量Ｃｏｘ回帰を使って、生存率に関連付けした。免疫中心バージョンのＰＲＥＣＯＧ（ｉＰＲＥＣＯＧ、図２６ａ）を構築するために、ＰＲＥＣＯＧに対して記載したのと同じ手法を使って、重み付きｍｅｔａ−ｚスコアを決定し、また、重み付けなしの全体ｍｅｔａ−ｚスコアを使って、ｐａｎ−ｃａｎｃｅｒ白血球関連性を図２３ｃにまとめた。

免疫ＰＲＥＣＯＧ偽陽性比率。統計的結論を導く場合、標準的正規分布からのすべての偏差を考慮する必要があるので、推定された白血球予後関連性における確率的変動から実際の変動を区別するために、免疫ＰＲＥＣＯＧでＰ値およびｍｅｔａ−ｚスコアを最初に比較した（図２６ｂ）。（１）それぞれのデータセットに対し推定された細胞型比率を混ぜ合わせること、および（２）ｚスコアおよび対応するｍｅｔａ−ｚスコアを計算して、全生存率に対する関係を把握することにより、１０００個のゼロｍｅｔａ−ｚマトリックスを生成した。ゼロｍｅｔａ−ｚスコアの分布と、標準正規分布との間の密接な対応関係が認められた（図２６ｂ）。ｍｅｔａ−ｚスコアの正規性を検証したので、次に、一連の統計的有意性閾値を使って、およびそれぞれのカットオフ値で、図２６ａを選別し、全ての白血球予後関連性に関する観察比率と予測比率を比較した（図２６ｃ）。０．０５（｜ｚ｜＞１．９６）の両側性Ｐ値閾値で、偶然による予測よりほぼ３倍高い予後関連性が認められた；Ｐ＜０．０１で、５倍の濃縮があり、これは、より小さいＰ値カットオフで増加し続けた（図２６ｃ）。

別に、図２３ｃで、全体ｍｅｔａ−ｚスコアに対して、類似の分析を実施した。ここで、図２６ｃ由来のゼロｍｅｔａ−ｚスコアをゼロ全体ｍｅｔａ−ｚスコアに統合し、ｐａｎ−ｃａｎｃｅｒ白血球予後関連性に対し示した解析を再計算した（異なる有意性閾値で保持された白血球サブセットの比率としてプロットした；図２６ｄ）。まとめると、これらの結果は、異なる統計的カットオフでの白血球予後関連性の有意な変動対確率的変動を明示的に定量化し、所望の偽陽性比率を達成するように他者による名目上の統計的閾値の調整を可能にする。

フローサイトメトリー対ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ。非小細胞肺癌腫瘍（ｎ＝１３）供試体のフローサイトメトリー分析を後述のように実施し、ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋、ＣＤ１９^＋、ＣＤ５６^＋、およびＣＤ１４^＋集団の中央値比率を全体ＣＤ４５^＋含量により正規化した（図２３ａ）。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴとの比較のために、白血球シグネチャーマトリックス集団を同じ表面抗原分類カテゴリ：ＣＤ１４^＋、単球、マクロファージ、および樹状細胞；ＣＤ４^＋、ＣＤ８およびγδＴ細胞を除く全ての細胞サブセット；ＣＤ８^＋、ＣＤ８Ｔ細胞；ＣＤ１９^＋、ナイーブおよび記憶Ｂ細胞、ＣＤ５６^＋、非活性化および活性化ＮＫ細胞、に分類した。図２３ａに示す肺腺癌ＧＥＰの中央値ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ推定比率を、２つの公共の利用可能なマイクロアレイデータセット、ＧＳＥ７６７０^７７およびＧＳＥ１００７２^７８、から決定した。

ＴＡＬと循環白血球との間の比較。利用可能な手術前後の循環白血球（リンパ球およびＰＭＮ）数を有する患者の中で、処置日（ＤＯＰ）に最も近い、−１２０日〜＋２８日に処置した試料を解析した。この際、術前試料（合計ｎ＝４８人の肺腺癌患者）を優先した。循環白血球（ＣＬ）レベルとＴＭＡ上で定量化されたＴＡＬとの間で、関係性は認められなかった。さらに、ＭＰＯのＩＧＫＣレベルに対する比率は、この患者サブセット内では、有意に予後性が存続した（Ｐ＝０．０２）が、ＣＬレベルは、生存率に対し有意な関係性がなかった。

結果
バルク腫瘍中の白血球組成
ＣＤ８^＋およびＣＤ４５ＲＯ^＋記憶Ｔリンパ球などの特定の白血球細胞サブセットによる腫瘍の浸潤が、異なる癌における好ましい転帰と大きく関連していたが、制御性Ｔ細胞およびマクロファージなどのそのほかのものは、状況に応じて良好な予後または不良予後を与えることができる。系統的で包括的にＴＡＬの組成差異およびそれらの生存率に対する関係性をマッピングするために、既知のＲＮＡ転写物の相対的サブセットの推定による細胞型特定（またはＣＩＢＥＲＳＯＲＴ）のための新規機械学習フレームワークを適用した。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴは、複合組織（例えば、バルク腫瘍）の発現プロファイル由来の細胞サブセットの相対比率の統計的推定の点で、ノイズ、未知の混合物含量、および密接に関係した密接に関連した細胞型に対する以前のデコンボリューション法より性能が優れている。入力として、２２個の異なる白血球サブセットに対する精製発現プロファイル、および細胞型特異的マーカー遺伝子を必要としないで、これらの細胞型をロバストに識別する所定の「バーコード」の遺伝子発現シグネチャーを使用した。｜ｍｅｔａ−ｚスコア｜＞３．３（両側性Ｐ＜０．００１に相当する）で、同じ有意性閾値の合計２，８５１個のｐａｎ−ｃａｎｃｅｒ予後遺伝子の中から２８％のこれらのバーコード遺伝子（５４７個中の１５２個）が、ＰＲＥＣＯＧ中で個別に有意である。これは、偶然による予測より高かった（Ｐ＜０．００１、カイ二乗検定）。フローサイトメトリーおよび免疫組織化学に対し間接または直接比較に係わらず、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴは、固形腫瘍にロバストな性能を示し、結腸直腸癌および肺腺癌（図２３ａ）および濾胞性リンパ腫中の白血球サブセットの相対的比率を正確に推定した。

ＰＲＥＣＯＧに適用することにより、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴは、造血新生物、脳癌、および非脳固形腫瘍の間で相対的白血球組成の顕著な差異を明らかにした（図２３ｂ）。ＴＡＬ含量の変動もまた、固形腫瘍を含む同じ癌タイプの独立した調査間で、一貫性および再現性があった（図２５ａ）。注目すべきことに、ＰＲＥＣＯＧ内でプロファイリングされた大部分の腫瘍は、腫瘍含量の点で未精製、無制御であったが、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴは、多発性骨髄腫濃縮供試体中の高比率のプラズマ細胞を正確に推定した（図２３ｂ）。さらに、予測通り、Ｂ細胞シグネチャーは、Ｂ細胞悪性病変中で支配的であることが明らかになり（図２３ｂ）、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴが多様な癌の起始細胞の識別に対し、汎用性を有することを示唆している。

図２３ａ〜２３ｄ：２５種のヒト癌における推定白血球頻度および予後関連性。（図２３ａ）ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ対免疫組織化学（ＩＨＣ）またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による、独立した試料の固形腫瘍中の、列挙された相対的白血球比率。ＣＲＣ、結腸直腸癌；肺腺癌。ＣＲＣ生検材料のグラウンドトルース比率に近づけるために、前に報告された１０７人の患者の腫瘍中心および浸潤周辺部由来の白血球数を平均化することによりレベルを推定した。ＬＵＡＤ生検材料中のベースライン白血球比率をＦＡＣＳにより列挙した（ｎ＝１３腫瘍；データは中央値で表される；詳細は方法の項を参照）。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ結果は、対応する組織に対する平均白血球比率として表される。（図２３ｂ）本明細書で、分かりやすくするために１１免疫集団にプールした２５種の癌の２２個の白血球サブセット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットホームのみ、方法の項参照）の推定ｍＲＮＡ比率。（図２３ｃ）重み付けなしｍｅｔａ−ｚスコアで順位付けした２５種の癌の２２種の白血球タイプ（ｎ＝５．７８２腫瘍；左）および１４種の固形非脳腫瘍（ｎ＝３，２３８；右）に対する全体予後関連性。２５％の偽陽性比率（ＦＤＲ）閾値はそれぞれのプロットに示した。個々の癌に対しては、図２６ａを参照。（図２３ｄ）乳癌と肺腺癌との間のＴＡＬ予後関連性における一致および差異（ＦＤＲに対しては、図２６ｃ参照）。図２３ｃ、２３ｄの非活性化および活性化サブセットは、それぞれ「−」および「＋」で示されている。

図２５ａ〜２５ｃ：癌タイプおよびデータセット全体にわたる推定白血球比率の相関分析。（図２５ａ）白血球組成物ベクター（データセット当たりｎ＝２２個のサブセット）に適用した重心階層型クラスタリングの結果を示すデンドログラム。中心相関を距離測定法として使用した。独立の調査からの同じタイプの癌のクラスタリングは、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴの相対的免疫浸潤レベルの推定の再現性を示す。（図２５ｂ）免疫ＰＲＥＣＯＧで解析された全５７調査にわたるそれぞれの免疫サブセットのＫＬＲＢ１発現と推定レベルとの間のピアソン相関係数。データは中央値として表される。（図２５ｃ）癌の間の白血球予後関連性の相互相関分析。色分け地図で示されるような、免疫ＰＲＥＣＯＧ中の免疫集団のｍｅｔａ−ｚスコア間の全ての対のピアソン相関（図２６ａ）。

ＴＡＬの予後関連性
遺伝子中心生存率分析を補完するために、ヒト悪性病変全体にわたる２２個の免疫集団の予後関連性の全体マップを構築した（図２６ａ）。細胞サブセットと癌特異的転帰との間のかなりの変動が観察され、これらの関連性の多くは、統計的に有意である（図２６ｂ〜２６ｄ）。プールした癌は、有意な全体白血球予後パターンを生じ、この場合、高レベルの推定Ｔ細胞比率は、通常、優れた生存率と相関することが明らかになったが、一方、次第にレベルが増加する骨髄集団は、主に、低い生存率と相関した。腫瘍内γδＴ細胞^{３７、３８}および多形核（ＰＭＮ）^{３９、４０}シグネチャーは、それぞれ、最も有意な好ましいおよび有害な癌全体にわたる予後集団として出現した（図２３ｃ、左）。さらに、推定白血球比率が、癌のＫＬＲＢ１発現と比較される場合、γδＴ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞シグネチャーは、最も高度に相関し（図２５ｂ）、この遺伝子の予後的有意性に対する関連を示唆している。壊死の組織含量の注釈（方法の項参照）を有するデータセットで、推定ＰＭＮレベル間の関係は認められず、腫瘍内ＰＭＮが組織壊死と単純には相関しないことを示唆している。さらに、以前の報告と一致して、腫瘍関連Ｍ２マクロファージのシグネチャーは、炎症促進性のＭ１マクロファージより悪い転帰を予測することが明らかになった。また、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激されたが、非活性化されていないＣＤ４５ＲＯ^＋記憶ヘルパーＴ細胞は、優れた転帰と相関した。

図２６ａ〜２６ｄ：２２個の白血球サブセットと２５種の癌組織との間の予後関連性。（図２６ａ）造血サブセットと生存率との間の関係を示す、メタｚスコアマトリックスとして表された色分け地図。赤いセルは、有害転帰を表し、緑のセルは、好ましい転帰を表す。（図２６ｂ）白血球予後関連性の偽陽性比率。免疫ＰＲＥＣＯＧ中の細胞型比率の混合により得られたｚスコアのゼロ分布（黒色点線）の標準正規分布に対する比較は高い一致性を示す。（図２６ｃ）種々のｚスコアカットオフでの、図２６ａの結果の選別により得られた細胞型比率と転帰との間の統計的に有意な関連性の予測対観察比率。それぞれのｚスコア値に対し、Ｐ値および推定ＦＤＲが示される。カットオフの厳密さが高くなるほど、予測に対する観察の有意な関連性の比率が高くなり（Ｐ＜０．０５で３倍、Ｐ＜０．０１で５倍）、免疫ＰＲＥＣＯＧは、統計的にロバストな関連性を取得することを示す。（図２６ｄ）２５種の組織または非脳固形腫瘍にわたる個々の癌のｍｅｔａ−ｚスコアを混ぜ合わせて得た全体ｍｅｔａ−ｚスコアを適用したこと以外は図２６ｂと同様である（図２３ｃに関連する）。図２６ｂ〜２６ｄの詳細は、方法の項で提供されている。

固形腫瘍中の予後ＴＡＬ
ＰＲＥＣＯＧ中で最も高度にプロファイリングされた癌の内の２種である、乳癌および肺癌中の白血球生存シグネチャーを比較することにより、意外にも生存率に対し強力かつ相互的関係がある、２つの集団、ＰＭＮおよびプラズマ細胞（ＰＣ）を特定した（図２３ｄ）。ＰＣシグネチャーは、ヒト癌間の相互相関分析で全体的に評価した場合（図２５ｃ）、固形腫瘍全体にわたる好ましい生存率の有意な予測因子であり（図２３ｃ、右）、ＰＭＮに対し最も高く逆相関した予後集団であった（図２４ａ）。推定ＰＣレベルは、腫瘍ステージとは相関しなかった（図２７ａ）。ＰＣシグネチャーは、隣接する正常組織より腫瘍中で高いことが明らかになった（図２７ｂ）ので、腫瘍浸潤ＰＣの予後値は、全体の免疫学的な健康の代用となりそうもなく、クローン増殖および急性液性免疫応答に必要な抗原駆動プロセスに対する役割を裏付けている。さらに、ＰＣレベルに対する推定ＰＭＮの単比は、多様な固形腫瘍において有意に予後的であることが明らかになった（図２４ｂ）。

図２７ａ〜２７ｈ：非小細胞肺癌中および隣接する正常組織のプラズマ細胞レベル。（図２７ａ）ＣＩＢＥＲＳＯＲＴにより予測されたプラズマ細胞の相対的ＲＮＡ比率は、肺腺癌ステージと無関係である。（図２７ｂ）ＣＩＢＥＲＳＯＲＴにより予測された、２２個の白血球サブセットの相対的比率を、肺腺癌腫瘍および隣接する正常な供試体の両方を含む２つの独立したマイクロアレイデータセット（ＧＳＥ７６７０およびＧＳＥ１００７２）の間で比較した。（図２７ｃ、２７ｄ）肺腺癌組織供試体の代表的Ｈ＆Ｅ染色。（図２７ｃ）プラズマ細胞および（図２７ｄ）好中球に形態学的に類似している細胞を示す（矢印で示す）染色肺腺癌腫瘍切片。（図２７ｅ〜２７ｈ）肺癌中の形質細胞のフローサイトメトリー分析および形態学的評価。（図２７ｅ）ＣＤ３８^ｈｉｇｈ／ＣＤ４５^ｈｉｇｈ／ＣＤ１３８^ｌｏｗ／ＣＤ２７^＋／ＣＤ１９^＋／ＣＤ２０⁻細胞の肺腺癌腫瘍からの濃縮のためのゲーティング戦略。形質細胞に対し予測したように、前方および側方散乱により、ＣＤ３８^ｈｉｇｈ／ＣＤ４５^ｈｉｇｈ／ＣＤ１３８^ｌｏｗ／ＣＤ２７^＋／ＣＤ１９^＋／ＣＤ２０⁻細胞は、ＣＤ３８⁻／ＣＤ４５^ｈｉｇｈ／ＣＤ１３８⁻／ＣＤ２７⁻／ＣＤ１９^＋／ＣＤ２０^＋細胞（Ｂ細胞）より大きい。（図２７ｆ）図２７ｅに記載のゲーティング戦略を使って、形質細胞を新しい肺腺癌腫瘍から選別し、サイトスピンを使って顕微鏡用に単離した。形質細胞の形態学的特徴を有する代表的細胞を示す（１００ｘオイル対物レンズ）。正常な隣接組織に比べて、肺扁平上皮細胞癌（図２７ｇ）および肺腺癌（図２７ｈ）中で形質細胞のかなりの増加を示す代表的フローサイトメトリー結果。

ＰＭＮおよびＢリンパ球を含む循環白血球は、腫瘍微小環境に寄与し、末梢血中の自然および獲得エフェクターの白血球頻度は、予後値を有し得る。したがって、ＴＭＡ由来のＮＳＣＬＣ患者のサブセットを、利用可能な手術前後の全血球計算値を使って検査し、循環白血球とＴＡＬのレベル間の一致を評価した。腫瘍内ＰＣ対ＰＭＮ比は、このサブセット内で有意に予後的であるままで残されたが、循環および浸潤区画の間の有意な相関は認められず、また、循環白血球レベルに由来する予後値も認められなかった。

Claims

試料の特徴プロファイルのデコンボリューション方法であって、
ｉ）第１の複数の異なる細胞サブセットを含む物理的試料を得るステップと、
ｉｉ）前記物理的試料から特徴プロファイルｍを生成するステップであって、前記特徴プロファイルが前記第１の複数の異なる細胞サブセットに関連する特徴の組合せを含むステップと、
ｉｉｉ）ｍと、第２の複数の異なる細胞サブセットに対する特徴シグネチャーの基準マトリックスＢとの間の回帰を最適化するステップであって、ｍがＢの一次結合としてモデル化され、前記最適化が、前記回帰の一連の回帰係数を含むｆを解くことを含み、前記解くことが、線形損失関数、および、Ｌ_２ノルムペナルティ関数を最小化するステップと、
ｉｖ）前記一連の回帰係数に基づいて、前記物理的試料中の前記第２の複数の異なる細胞サブセットの内の１つまたは複数の異なる細胞サブセットの相対比率を推定するステップと、
ｖ）前記１つまたは複数の異なる細胞サブセットの前記相対比率の推定のために有意値を決定するステップと、
を含む方法。
前記ｆを解くことが、Ｂの複数の異なるサブセットの特徴シグネチャーの内のＢのサブセットの特徴を選択し、前記線形損失関数を最小化することを含む、請求項１に記載の方法。
前記線形損失関数が、線形ε−非感受性損失関数である、請求項１または２に記載の方法。
前記最適化が、サポートベクター回帰（ＳＶＲ）を使用することを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
前記サポートベクター回帰がε−ＳＶＲである、請求項４に記載の方法。
前記サポートベクター回帰がν（ニュー）−ＳＶＲである、請求項４に記載の方法。
異なる値のνを使って、それぞれの異なるνの値に対するｆの異なる解を生成するように前記方法を反復することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
前記ｆの異なる解の内で、
ａ）前記特徴プロファイルｍと、
ｂ）ｆと前記基準マトリックスＢの積、
との間の最小誤差を有する解を特定することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
前記最小誤差が、ピアソンの積率相関係数、スピアマンの順位相関係数、二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）、ユークリッド距離、または平均絶対偏差（ＭＡＤ）を使って得られる、請求項８に記載の方法。
前記１つまたは複数の異なる細胞サブセットの前記相対比率の推定のために有意値を決定するステップは、
ａ）親特徴プロファイルからランダムに選択された特徴を含むランダム特徴プロファイルｍ^＊を生成するステップであって、前記親特徴プロファイルが前記特徴プロファイルを含み、ｍおよびｍ^＊が同じユークリッドノルムを有するステップと、
ｂ）ｍ^＊と前記基準マトリックスＢとの間の回帰を最適化するステップであって、ｍ^＊がＢの一次結合としてモデル化され、前記最適化が、前記回帰の一連の回帰係数を含むｆ^＊を解くことを含み、前記解くことが、線形損失関数、および、Ｌ_２ノルムペナルティ関数、を最小化するステップと、
ｃ）ｆ^＊と前記基準マトリックスＢの積を計算し、再構成特徴プロファイルを生成するステップと、
ｄ）前記ランダム特徴プロファイルと、前記再構成特徴プロファイルとの間の差異測定値を決定するステップと、
ｅ）ステップａ）〜ｄ）のｉ回の繰り返しから決定される差異測定値の分布に基づいて前記有意値を決定するステップであって、ｉが２以上の数であるステップと、
を含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
前記差異測定値が、ピアソンの積率相関係数、スピアマンの順位相関係数、二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ）、ユークリッド距離、または平均絶対偏差（ＭＡＤ）である、請求項１０に記載の方法。
前記有意値がｐ値である、請求項１０または１１に記載の方法。
ｉが１０〜１０００である、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の方法。
前記物理的試料が、物理的試料中に存在する前記第２の複数の異なる細胞サブセットの合計量の１０％以下で特徴シグネチャー中に現れる少なくとも１つの異なる細胞サブセットを含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
特徴シグネチャー中に現れる異なる細胞サブセットが、前記物理的試料中の異なる細胞サブセットの合計量の５０％以下で前記物理的試料中に存在する、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
前記基準マトリックスＢが、前記第２の複数の異なる細胞サブセットの内の２つ以上の異なる細胞サブセットの前記特徴プロファイル中に存在する少なくとも１つの異なる特徴を含む、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
前記基準マトリックスＢが、Ｂの特徴の数とは異なる多くの特徴を含む特徴シグネチャーの初期基準マトリックスのサブセットまたはスーパーセットであり、Ｂの特徴の数が、前記初期基準マトリックスより少ない条件数を与える、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
前記第１の複数の異なる細胞サブセットの全ての異なる細胞サブセットに対する、前記物理的試料中に存在する前記第２の複数の異なる細胞サブセット中の全ての異なる細胞サブセットの量を、
前記第２の複数の異なる細胞サブセットの異なる細胞サブセットに関連する全ての特徴の中央値を、
前記試料中の全ての特徴の中央値、
で除算することにより計算することをさらに含む、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
前記試料が生物試料である、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞サブセットが脳細胞サブセットを含む、請求項１９に記載の方法。
前記脳細胞サブセットが、神経細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、およびミクログリアの内の少なくとも１つのサブセットを含む、請求項２０に記載の方法。
前記細胞サブセットが、間質細胞、幹細胞、神経細胞、および前駆細胞の内の少なくとも１つのサブセットを含む、請求項１９から２１のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞サブセットが腫瘍細胞サブセットを含む、請求項１９から２２のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞サブセットが白血球サブセットを含む、請求項１９から２３のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞サブセットが腫瘍浸潤白血球のサブセットを含む、請求項２４に記載の方法。
前記細胞サブセットがリンパ球のサブセットを含む、請求項２４または２５に記載の方法。
前記白血球サブセットが、ナイーブＢ細胞、記憶Ｂ細胞、プラズマ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ４記憶ＲＯ不活性Ｔ細胞、ＣＤ４記憶ＲＯ活性化Ｔ細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞、非刺激ＮＫ細胞、刺激ＮＫ細胞、単球、マクロファージＭ０、マクロファージＭ１、マクロファージＭ２、非刺激樹状細胞、刺激樹状細胞、非刺激マスト細胞、刺激マスト細胞、好酸球、および好中球からなる群より選択される２つ以上の細胞型を含む、請求項２４から２６のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞サブセットが異なる細胞周期段階の細胞のサブセットを含む、請求項１９に記載の方法。
異なる細胞周期段階の前記細胞サブセットが、間期、分裂期または細胞質分裂の内の１つまたは複数の細胞サブセットを含む、請求項２８に記載の方法。
異なる細胞周期段階の前記細胞サブセットが、分裂前期、中期、分裂後期、または分裂終期の内の１つまたは複数の細胞サブセットを含む、請求項２８または２９に記載の方法。
異なる細胞周期段階の前記細胞サブセットが、Ｇ_０、Ｇ_１、Ｇ_２、またはＳ期の内の１つまたは複数の細胞サブセットを含む、請求項２８または２９に記載の方法。
前記第１の複数の異なる細胞サブセットが、異なる細胞内シグナル伝達経路、遺伝子調節経路、または代謝経路である、請求項１９に記載の方法。
前記異なる細胞内シグナル伝達経路が、サイトカインシグナル伝達、死因子シグナル伝達、増殖因子シグナル伝達、生存因子シグナル伝達、ホルモンシグナル伝達、Ｗｎｔシグナル伝達、ヘッジホッグシグナル伝達、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達、細胞外マトリックスシグナル伝達、インスリンシグナル伝達、カルシウムシグナル伝達、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達、神経伝達物質シグナル伝達、およびこれらの組み合わせを含む、請求項３２に記載の方法。
前記異なる代謝経路が、解糖、糖新生、クエン酸回路、発酵、尿素回路、脂肪酸代謝、ピリミジン生合成、グルタメートアミノ酸基合成、ポルフィリン代謝、アスパルテートアミノ酸基合成、芳香族アミノ酸合成、ヒスチジン代謝、分岐アミノ酸合成、ペントースホスフェート経路、プリン生合成、グルクロネート代謝、イノシトール代謝、セルロース代謝、スクロース代謝、デンプンおよびグリコーゲン代謝、およびこれらの組み合わせを含む、請求項３２に記載の方法。
前記特徴プロファイルが、遺伝子発現プロファイル、タンパク質−タンパク質相互作用プロファイル、タンパク質リン酸化プロファイル、細胞電気活性プロファイル、クロマチン修飾プロファイル、染色体結合プロファイル、酵素活性プロファイル、代謝物プロファイルまたはこれらの組み合わせを含む、請求項１９から３４のいずれか１項に記載の方法。
特徴プロファイルが、前記生物試料中の細胞のＲＮＡトランスクリプトームを表す遺伝子発現プロファイルを含む、請求項３５に記載の方法。
前記生物試料が、保管された組織試料である、請求項１９から３６のいずれか１項に記載の方法。
前記生物試料が血液試料である、請求項１９から３７のいずれか１項に記載の方法。
前記生物試料が、固体組織試料由来である、請求項１９から３７のいずれか１項に記載の方法。
前記固体組織試料が腫瘍試料である、請求項３９に記載の方法。
前記固体組織試料がホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である、請求項３９または４０に記載の方法。
前記生物試料が精製試料である、請求項１９から４１のいずれか１項に記載の方法。
前記生物試料が白血球濃縮試料である、請求項１９から４２のいずれか１項に記載の方法。
個体から前記試料を取得することをさらに含む、請求項１９から４３のいずれか１項に記載の方法。
物理系の特徴プロファイルのデコンボリューションのためのコンピューター実装方法であって、
物理系の第１の複数の異なる細胞サブセットの組合せの第１の特徴プロファイルｍを得るステップと、
前記第１の特徴プロファイルｍを計算処理するステップであって、
ｉ）ｍと、前記物理系の第２の複数の異なる細胞サブセットに対する特徴シグネチャーの基準マトリックスＢとの間の回帰を最適化するステップであって、ｍがＢの一次結合としてモデル化され、
前記最適化が、前記回帰の一連の回帰係数を含むｆを解くことを含み、前記解くことが、線形損失関数、および、Ｌ_２ノルムペナルティ関数、を最小化するステップと、
ｉｉ）前記一連の回帰係数に基づいて、前記物理系の前記第２の複数の異なる細胞サブセットの内の１つまたは複数の異なる細胞サブセットの相対比率を推定するステップと、
ｉｉｉ）前記１つまたは複数の異なる細胞サブセットの前記相対比率の推定のために有意値を決定するステップを含む計算処理ステップと、
を含むコンピューター実装方法。
前記第１の特徴プロファイルｍを生成するためにデータを収集することをさらに含む、請求項４５に記載のコンピューター実装方法。
前記第１の特徴プロファイルｍが、第１の複数の異なる細胞サブセットを含む物理的試料から生成される、請求項４５に記載のコンピューター実装方法。
前記物理的試料が、生物試料、環境試料または食糧品試料である、請求項４７に記載のコンピューター実装方法。
前記ｆを解くことが、Ｂの複数の異なるサブセットの特徴シグネチャーの内のＢのサブセットの特徴を選択し、前記線形損失関数を最小化することを含む、請求項４５から４８のいずれか１項に記載のコンピューター実装方法。
前記１つまたは複数の異なる細胞サブセットの前記相対比率の推定のために有意値を決定するステップは、
ａ）親特徴プロファイルからランダムに選択された特徴を含むランダム特徴プロファイルｍ^＊を生成するステップであって、前記親特徴プロファイルが前記特徴プロファイルを含み、ｍおよびｍ*が同じユークリッドノルムを有するステップと、
ｂ）ｍ^＊と前記基準マトリックスＢとの間の回帰を最適化するステップであって、ｍ^＊がＢの一次結合としてモデル化され、
前記最適化が、前記回帰の一連の回帰係数を含むｆ^＊を解くことを含み、前記解くことが、線形損失関数、および、Ｌ_２ノルムペナルティ関数、を最小化するステップと、
ｃ）ｆ^＊と前記基準マトリックスＢの積を計算し、再構成特徴プロファイルを生成するステップと、
ｄ）前記ランダム特徴プロファイルと、前記再構成特徴プロファイルとの間の差異測定値を決定するステップと、
ｅ）ステップａ）〜ｄ）のｉ回の繰り返しから決定される差異測定値の分布に基づいて前記有意値を決定するステップであって、ｉが２以上の数であるステップと、を含む、請求項４５から４９のいずれか１項に記載のコンピューター実装方法。
１つまたは複数のプログラムを保存する非一時的コンピューター可読記憶媒体であって、前記１つまたは複数のプログラムが、コンピューターシステムの１つまたは複数のプロセッサーにより実行されると、１つまたは複数のプロセッサーに請求項１から４４のいずれか１項に記載の方法の少なくとも一部を実行させる命令を含む、非一時的コンピューター可読記憶媒体。
１つまたは複数のプログラムを保存する非一時的コンピューター可読記憶媒体であって、前記１つまたは複数のプログラムが、コンピューターシステムの１つまたは複数のプロセッサーにより実行されると、１つまたは複数のプロセッサーに請求項４５から５０のいずれか１項に記載の方法を実行させる命令を含む、非一時的コンピューター可読記憶媒体。
１つまたは複数のプロセッサー、および１つまたは複数のプログラムを保存する記憶装置を含むシステムであって、前記１つまたは複数のプログラムが、コンピューターシステムの１つまたは複数のプロセッサーにより実行されると、１つまたは複数のプロセッサーに請求項１から４４のいずれか１項に記載の方法の少なくとも一部を実行させる命令を含む、システム。
１つまたは複数のプロセッサー、および１つまたは複数のプログラムを保存する記憶装置を含むシステムであって、前記１つまたは複数のプログラムが、コンピューターシステムの１つまたは複数のプロセッサーにより実行されると、１つまたは複数のプロセッサーに請求項４５から５０のいずれか１項に記載の方法を実行させる命令を含む、システム。