JP2018507164A - 光により活性化される二成分タンパク質結合マトリックス - Google Patents

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Abstract

目的の分子のクロマトグラフ的な分離または精製のための結合対であって、この対の一方の結合メンバーが異性化可能な有機分子であり、およびこの対の他方の結合メンバーが、目的の分子に結合する異性体特異的親和性因子である、結合対。この結合対は、光、低輝度の光、暗闇、熱、ストレス、イオン、異性体親和性因子、ｐＨの変化またはこれらの組合せを使用するなど、結合因子への曝露時に会合および解離する。

Description

関連出願
本出願は、２０１４年１０月３０日に出願された米国仮出願第６２／０７２，７２７号明細書の利益を主張する。上記出願の教示全体が参照により本明細書に援用される。
複合体タンパク質混合物の高スループット分割、キャラクタリゼーションのために、ならびに商業的実施に適した量、スケールおよびコストのタンパク質精製のために、効率的な分析ツールおよび調製用ツールが必要とされている。液体クロマトグラフィーはプロテオミクスおよび大規模タンパク質精製において重要なツールであり、様々な特性によるタンパク質の分離を可能にする。それにもかかわらず、費用対効果の高い方法でのより効率的なタンパク質精製を可能にするクロマトグラフツールが必要とされている。
Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｆａｎ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｓ．，Ｓｈｅｎｇ，Ｘ．＆Ｙａｏ，Ｊ．Ｂａｓｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｐｉｒｏｐｙｒａｎ：ｔｏｗａｒｄｓ ｖｉｓｕａｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｓｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｗａｔｅｒ．Ｎｅｗ Ｊ Ｃｈｅｍ（２００７） Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ，Ｙ．，Ａｄａｃｈｉ，Ｋ．，Ｉｔｏｈ，Ｍ．＆Ｈｉｒａｉ，Ｔ．Ｓｐｉｒｏｐｙｒａｎ ａｓ ａ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ Ｃｙａｎｉｄｅ Ａｎｉｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１１，３４８２−３４８５（２００９）
本発明は、目的の分子を制御的および選択的に結合および遊離させるための二成分システムの発見に関する。本発明は、様々な異性体型を有する異性化可能な有機分子（この二成分システムでの第１の成分）を利用しており、第１の異性体型では、この異性化可能な有機分子は結合パートナー（この二成分システムでの第２の成分）に結合することができ、第２の異性体型では、この結合パートナーは異性化可能な有機分子から遊離または解離することができる。異性体型間の変化は条件（例えば、光、温度、ｐＨ、異性体特異的因子またはこれらの組合せ）により誘発され、そのため、この二成分システムは誘発条件に従って会合および解離する。この二成分システムは、例えばクロマトグラフィーカラム中において、組換えタンパク質を分離および／または精製するために、異性化可能な有機分子と、この有機分子の親和性結合パートナーとを使用する。
第１の態様では、本発明は、異性化可能な有機分子（例えば光異性化可能な有機分子）である第１の結合メンバーと、異性体特異的親和性因子（ｉｓｏｍｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｇｅｎｔ）である第２の結合メンバーとを含み、異性化可能な有機分子が、第１の条件下で第２の結合メンバーに対してある結合親和性を有し、かつ第２の条件下で第２の結合メンバーに対して異なる結合親和性を有する、結合対である。本発明の第１の態様の例示的実施形態では、結合親和性の差異は、第１の結合メンバーと第２の結合メンバーとが第１の条件下で会合し、かつ第２の条件下で解離するようなものである。別の例示的実施形態では、この異性体特異的親和性因子はペプチドアプタマーまたは核酸アプタマーを含む。別の例示的実施形態では、この異性体特異的親和性因子は、このペプチドアプタマーまたは核酸アプタマーに共有結合しているリンカーを更に含み、このリンカーは目的の分子に非共有結合的にまたは共有結合的に結合可能である。別の例示的実施形態では、このリンカーはプロテアーゼ感受性の切断部位を含む。別の例示的実施形態では、このペプチドアプタマーは、ジペプチド、３〜６個のアミノ酸を有するポリペプチド、７個のアミノ酸からなるポリペプチド、長さが８〜１１個のアミノ酸であるポリペプチド、１２個のアミノ酸からなるポリペプチド、長さが１３〜５２個のアミノ酸であるポリペプチド、または長さが５２個を超えるアミノ酸であるポリペプチドである。別の例示的実施形態では、このリンカーはペプチドアプタマーと同じアミノ酸配列を有する。別の例示的実施形態では、第１の条件は、光、低輝度の光もしくは暗闇、熱、ｐＨ、ストレス、イオン、異性体特異的親和性因子またはこれらの組合せへの曝露であり、および第２の条件は、第１の条件と異なる光、低輝度の光、暗闇、熱、ｐＨ、ストレス、イオン、異性体特異的親和性因子またはこれらの組合せへの曝露である。別の例示的実施形態では、ａ）第１の条件は、可視スペクトルもしくはその一部上の広範囲の波長の光への曝露であり、および第２の条件は、紫外スペクトルもしくはその一部上の広範囲の波長の光への曝露であるか、ｂ）第１の条件は、可視スペクトルもしくはその一部上の波長の光への曝露であり、および第２の条件は、第１の条件と異なる低輝度の光もしくは暗闇への曝露であるか、またはｃ）第１の条件は、ある波長の光への曝露であり、および第２の条件は、第１と１０ナノメートル超の波長だけ異なる波長の光への曝露である。別の例示的実施形態では、この異性化可能な有機分子は光異性化可能な有機分子である。更に別の例示的実施形態では、この光異性化可能な有機分子はスピロピランコア構造またはスピロピランの誘導体化型を有する。この異性化可能な有機分子が光異性化可能な有機分子である場合、第１の条件は第１の波長の光であり、および第２の条件は第２の波長の光である。
第２の態様では、本発明は、本発明の結合対を使用して目的の分子を選択的に結合および遊離させる方法を対象とする。例示的実施形態によれば、この方法は、ａ）第１の異性体立体配置における異性化可能な有機分子（例えば光異性化可能な有機分子）で被覆されているか、またはそれに共有結合的に連結されている固体基材を準備すること、ｂ）第１の条件下で、この被覆固体基材と、異性体特異的親和性因子（例えば、親和性タグ、親和性ペプチド、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー）に共役している目的の分子を含む溶液とを接触させて、この親和性因子と固体基材上を被覆する異性化可能な有機分子との間に複合体を形成すること、ｃ）工程（ｂ）で形成された複合体を洗浄して、この複合体と会合していない物質（例えば非特異的結合）を除去すること、およびｄ）第１の異性体立体配置における異性化可能な分子を、（例えば適切な異性化誘発因子の適用により）第２のまたは更なる条件下で第２のまたは更なる異性体立体配置へと変換することであって、この分子の第２のまたは更なる異性体立体配置への変換により、目的の分子が異性化可能な有機分子から解離することが可能となり、それにより目的の分子を溶出させる、変換することを含む。本発明の第２の態様の例示的実施形態では、これらの異性化可能な有機分子および異性体特異的親和性因子は共にその結合対である。別の例示的実施形態では、この異性化可能な有機分子は光異性化可能な有機分子、例えばスピロピランコア構造またはスピロピランの誘導体化型を有する有機分子である。別の実施形態では、この異性化誘発因子は、広範囲のまたは特定の波長の光を照射するように構成されている光源、例えば発光ダイオードまたはランプである。別の実施形態では、この適切な異性化誘発因子は熱源または冷却源である。別の実施形態では、この方法は、工程（ａ）の前に、固体基材を、第１の異性体立体配置における異性化可能な有機分子で被覆するか、またはそれと共有結合的に連結させることを更に含む。
第３の態様では、本発明は、目的の分子を選択的に結合および遊離させるためのクロマトグラフ装置（例えばカラム、多孔質膜またはフィルタ）であって、ハウジングと、このハウジング内に充填されている被覆固体基材（例えば複数の被覆ビーズ）であって、被覆が、第１の異性体立体配置、第２のもしくは更なる異性体立体配置または両方の組合せにおける光異性化可能な有機分子である、被覆固体基材と、第１の異性体立体配置における光異性化可能な有機分子を第２のまたは更なる異性体立体配置へと変換するのに適した波長の少なくとも１個の光源とを含み、被覆固体基材（例えば複数の被覆ビーズ）がこの少なくとも１個の光源と光接触する、クロマトグラフ装置に関連する。本発明の第３の態様の一実施形態では、クロマトグラフ装置は、同心シリンダに構成されているハウジングを有するカラムであり、このシリンダの中心は中空である。ハウジングおよび／またはシリンダの中空コアの外部は、制御的に照射し得る少なくとも１個の光源を含む。本発明の第３の態様の別の実施形態では、カラムの外部のみが、制御的に照射し得る少なくとも１個の光源を含む。
第４の態様では、本発明は、本明細書で説明する結合対を使用して目的の分子を選択的に結合させるためのキットに関連する。キットは、第１の異性体立体配置、第２のもしくは更なる異性体立体配置またはこれらの組合せにおける光異性化可能な有機分子で被覆されているか、またはそれに共有結合的に連結されている固体基材と、第２のまたは更なる異性体立体配置における光異性化可能な有機分子に対して親和性を有する異性体特異的親和性因子と、この親和性因子を目的の分子に結合させ、かつ光異性化可能な有機分子に更に選択的に結合させ、および任意選択的にそれからこの親和性因子を遊離させるための説明書とを含む。本発明の第４の態様の変形形態では、このキットは、第１の異性体立体配置における光異性化可能な有機分子を第２のまたは更なる立体配置へと変換するのに適した広範囲のまたは特定の波長の光源を更に含む。
本発明の結合対と本明細書で説明する結合対を使用して目的の分子に選択的に結合および遊離させる方法とは、目的の分子を精製、分離、単離、またはパターン化するために使用することができる。目的の分子のクロマトグラフ媒体への結合およびこの目的の分子の遊離を、異性化可能な有機分子の異性体型、光の存在、温度、ｐＨ、異性体特異的親和性分子またはこれらの組合せの変化により制御する。例えば、クロマトグラフ装置（例えばカラム）中において、目的の分子を溶出させるための溶出刺激として溶媒ではなく光を使用する。本明細書で説明する本発明により、刺激が強いまたは高価な溶出バッファーを必要とすることなく目的の分子（例えば組換えタンパク質）の迅速な精製が可能となる。加えて、光はマクロスケールおよびナノメートルスケールの両方に適用され得、周囲の溶媒の化学的性質を本質的に変更せず、非常に広範囲な時間スケールで照射され得、かつ順次のまたは同時の溶出用に自動化され得るため、便利な溶出刺激である。
上述したことは、添付図面に示すように、下記の本発明の例示的実施形態のより具体的な説明から明らかになるであろう。図面は必ずしも縮尺通りではなく、代わりに本発明の実施形態を説明することに重点が置かれている。
光異性化後の特異な結合親和性を示す。図１Ａは、２種の異性体状態モデルを示し、光異性体Ａは光に反応して、この光異性体Ａの化学的特性および／または構造的特性を光異性体Ｂへと変化させる。図１Ｂは、異性体特異的アプタマーを使用する二成分システムの別の変形形態を示す。 図１Ｃは、固体支持体の表面が異性化可能な有機分子で修飾されている二成分システムの変形形態を示す。 スピロピラン分子で修飾されているプレートへの様々なペプチドの結合を表す棒グラフである。 スピロピラン分子で選択的に修飾されているビーズへのペプチドの結合を表す折れ線グラフである。 異性化前後の例示的な精製カラムを示す。図４Ａは、光により媒介される標的タンパク質の結合および遊離の例示的方法を示す。 図４Ｂは、支持体（例えば、架橋したアガロースビーズまたは他のクロマトグラフ媒体）上の光異性化可能な分子の例示的実施形態を示し、この光異性化可能な有機分子は親和性ペプチドまたは親和性アプタマーに結合している。 図４Ｃは、カラムの周囲を覆うハウジングと、光異性化可能な有機分子で誘導体化されているビーズを制御的に照射する（例えば順次にまたは同時に照射する）ための、カラムと接触している少なくとも１個の光源とを有するように適合されているクロマトグラフィーカラムの例示的実施形態を示す。 可視（Ｖｉｓ）光への曝露によるメロシアニン（ＭＣ）アイソフォームのスピロピラン（ＳＰ）アイソフォームへの変換を示し、濃さの消失が異性化を示す（赤色／オレンジ色の色相 − 図示せず）。 例示的な光異性化可能な有機分子の異性化を示す。 例示的な光異性化可能な有機分子の異性化を示す。 例示的な光異性化可能な有機分子の異性化を示す。 例示的な光異性化可能な有機分子の異性化を示す。 ビーズ共役技術の例を示す。
生物学的製品（例えば組換えタンパク質）のアフィニティ分離用の二成分システムが説明され、この二成分は、光の波長または他の誘発性条件（例えば、光、暗闇もしくは低輝度の光、温度、ｐＨ、異性体特異的親和性因子もしくはこれらの組合せ）に従って会合することができる、または解離することができる。この二成分システムは、異性化可能な有機分子と異性体特異的親和性因子とで構成されている。本発明は、様々な異性体型を有する異性化可能な有機分子（この二成分システムでの第１の成分）を利用しており、第１の異性体型では、この有機分子は結合パートナー（この二成分システムでの第２の成分）に結合することができ、この有機分子の第２の異性体型では、この結合パートナーは異性化可能な有機分子から遊離または解離することができる。異性体型間の変化は条件（例えば、光、低輝度の光、暗闇、温度、ｐＨ、異性体特異的親和性因子またはこれらの組合せ）により誘発され、そのため、この二成分システムは誘発条件に従って会合すおよび解離する。この二成分システムは、例えばクロマトグラフィーカラム中において、組換えタンパク質を分離するためにおよび／または精製するために、異性化可能な有機分子と、この有機分子の親和性結合パートナーとを使用する。
本発明の二成分システムを使用して、溶出刺激として例えば光を使用して目的の分子を結合または遊離させることができる。本発明は、異性化可能な有機分子である第１の結合メンバーと異性体特異的親和性因子である第２の結合メンバーとを含む結合対を説明する。この異性化可能な有機分子は、第１の条件下で第２の結合メンバーに対してある結合親和性を有し、かつ第２の条件下で第２の結合メンバーに対して異なる結合親和性を有する。本発明に有用な異性化可能な有機分子の一例は、光異性化可能な有機分子である。光異性化可能な有機分子の特定の異性化状態により結合親和性を制御することができるため、光を使用して、異性体特異的親和性因子（または異性体特異的親和性因子に付着している他の分子エンティティ）と光異性化可能な有機分子（またはこの有機分子により修飾されている表面）との間の会合を制御することができる。例えば、結合親和性の差異により、第１の結合メンバーと第２の結合メンバーとが第１の条件下で会合し、かつ第２の条件下で解離することができる。これに関して光は有用である。なぜなら、光は、マクロスケールおよびナノメートルスケールの両方に適用され得、周囲の溶媒の化学的性質を本質的に変更せず、かつ非常に広範囲な時間スケールで照射され得るからである。
従って、「異性化可能な有機分子」は、本明細書で使用する場合、第１の条件または第２のもしくは更なる条件への（例えば適切な異性化誘発因子による）曝露に反応して１種または複数の構造的変化または化学的変化を起こす有機分子を意味する。第１の条件は、光、低輝度の光、暗闇、熱、ｐＨ、ストレス、イオン、異性体特異的親和性因子またはこれらの組合せへの曝露であり得る。異性化可能な有機分子は、第２のまたは更なる条件に曝露された場合に、以前の構造または状態への復帰等の１種または複数の構造的変化を起こすことができる。第２のまたは更なる条件は、第１の条件と異なる光、低輝度の光、暗闇、熱、ｐＨ、ストレス、イオン、異性体特異的親和性因子またはこれらの組合せへの曝露であり得る。溶媒を使用して、ある異性体型を別のものよりも優先的に安定化させることにより、ストレスを与えることができる。適切な溶媒の例として、例えば水、リン酸塩で緩衝化されている水、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、エタノール、プロパノール、メタノールおよび同類のもの等の溶媒が挙げられる。例えば、スピロピラン分子をテトラヒドロフラン中に置いた場合、この分子は開環（またはメロシアニン）立体配置を好む。あるいは、例えばスピロピラン分子を脱イオン水中に置いた場合、この分子は閉環立体構造を好む。イオン溶液を使用してストレスを与えることもできる。イオンを、イオン強度が高い水性溶媒により供給することができる。異性化可能な有機分子は、イオン濃度が高い溶媒に曝露された場合、ある立体配置をとることができ、イオン濃度がわずかであるかまたはない溶媒に曝露された場合には別の立体配置をとることができる。イオン成分が溶解しているか、またはイオン強度が高い水性溶媒は、例えばスピロピラン分子の開環立体配置を安定化させることができる。加えて、イオン溶液を使用して（例えば二価イオン溶液により）、ある異性体を他の異性体よりも優先的に安定化させることによりストレスを与えることができる。ｐＨをバッファーへの曝露により変更することができる。適切なバッファーの例として、ｐＨが約２〜約３である酸性バッファーが挙げられる。温度変化により、異性化可能な有機分子が１種または複数の構造的変化または化学的変化を起こすこともできる。例えば、異性化可能な有機分子は、７０℃超の温度で、ある立体配置をとることができる。別の例では、異性化可能な有機分子は、４℃未満で別の立体配置をとることができる。熱源は、熱を加えて異性化可能な有機分子の立体配置の変化を促進する。冷却源は、冷却または他の手段で温度を低下させて、異性化可能な有機分子の立体配置の変化を促進する。
用語「アルキル」は、本明細書で使用する場合、規定の数の炭素原子を有する、飽和脂肪族の分枝したまたは直鎖の一価炭化水素ラジカルの両方を意味する。そのため、「（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル」は、直鎖のまたは分枝した配置中に１〜６個の炭素原子を有するラジカルを意味する。「（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル」の例として、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、２−メチルブチル、２−メチルペンチル、２−エチルブチル、３−メチルペンチルおよび４−メチルペンチルが挙げられる。アルキルを、ハロゲン、−ＯＨ、オキソ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ニトロ、シアノ、アジドならびに−Ｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）（ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立して、−Ｈおよび（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルから選択される）で任意選択的に置換することができる。
用語「アルケニル」は、本明細書で使用する場合、１個または複数の炭素−炭素二重結合を有する直鎖のまたは分枝したアルキル基を意味する。そのため、「（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル」は、１個または複数の二重結合を有する直鎖のまたは分枝した配置中に２〜６個の炭素原子を有するラジカルを意味する。アルケニル基の例として、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ブタジエニル基、ペンタジエニル基、ヘキサジエニル基および同類のものが挙げられるがこれらに限定されない。１個または複数の炭素−炭素二重結合は、内部（例えば２−ブテン）または末端（例えば１−ブテン）であり得る。
用語「アルキニル」は、本明細書で使用する場合、１個または複数の炭素−炭素三重結合を有する直鎖のまたは分枝したアルキル基を意味する。そのため、「（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル」は、１個または複数の三重結合を有する直鎖のまたは分枝した配置中に２〜６個の炭素原子を有するラジカルを意味する。アルキニル基の例として、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニルおよび同類のものが挙げられるがこれらに限定されない。１個または複数の炭素−炭素三重結合は、内部（例えば２−ブチン）または末端（例えば１−ブチン）であり得る。
用語「アルコキシ」は、本明細書で使用する場合、「アルキル−Ｏ−」基（アルキル基は上記で規定されている）を意味する。アルコキシ基の例として、メトキシ基またはエトキシ基が挙げられる。
用語「アミノ」は、本明細書で使用する場合、「−ＮＨ２」基、「ＮＨＲｐ」基または「ＮＲｐＲｑ」基（ＲｐおよびＲｑは、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、シクロアルキル基、シクロアルコキシ基、アリール基、ヘテロアリール基および二環式炭素環式基のいずれかであり得る）を意味する。本発明では、アミノは第１級（ＮＨ２）、第２級（ＮＨＲｐ）または第３級（ＮＲｐＲｑ）であり得る。（ジ）アルキルアミノ基は、１個または２個のアルキルで置換されているアミノ基の一例である。
用語「アリール」は、本明細書で使用する場合、芳香族の単環式のまたは多環式（例えば二環式または三環式）の炭素環系を意味する。そのため、「（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール」は６〜１０員の単環系または多環系である。アリール系には、フェニル、ビフェニル、ナフチル、フェナントリル、アントラセニル、ピレニル、フルオランチルまたはフルオレニル等の任意選択的に置換された基が含まれる。アリールを任意選択的に置換することができる。アリール上の適切な置換基の例として、ハロゲン、ヒドロキシル、（Ｃ１〜Ｃ１２）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ６）ハロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルアミノ、（Ｃ１〜Ｃ３）ジアルキルアミノ（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールアミノ、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール、（５〜１２個の原子の）ヘテロアリール、−ＮＯ２、−ＣＮおよびオキソが挙げられる。
いくつかの実施形態では、フェニル、インデニルまたはナフチルから選択される（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールである。いくつかの実施形態では、フェニルまたはナフタレンから選択される（Ｃ６〜Ｃ１０）アリールである。
用語「ヘテロ」は、本明細書で使用する場合、Ｎ、ＳおよびＯから選択される少なくとも１個のヘテロ原子による環系中の少なくとも１個の原子炭素メンバーの置き換えを意味する。「ヘテロ」はまた、非環式系中の少なくとも１個の炭素原子メンバーの置き換えも意味する。ヘテロ環系またはヘテロ非環系は、ヘテロ原子で置き換えられた１個、２個または３個の炭素原子メンバーを有することができる。
用語「ヘテロアリール」は、本明細書で使用する場合、ヘテロ原子（Ｏ、ＳまたはＮ）である１個または複数の原子を含む芳香族基を意味する。ヘテロアリール基は単環式または多環式であり得、例えば、１個または複数の炭素環式芳香族基または他の単環式ヘテロアリール基に融合した単環式ヘテロアリール環であり得る。本発明のヘテロアリール基には、１個または複数のオキソ部分で置換されている環系も含まれ得る。ヘテロアリール基の例として、ピリジニル、ピリダジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、キノリル、イソキノリル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、シンノリニル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、イソインドリル、プリニル、オキサジアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、ジヒドロキノリル、テトラヒドロキノリル、ジヒドロイソキノリル、テトラヒドロイソロキノリル、ベンゾフリル、フロピリジニル、ピロロピリミジニルおよびアザインドリルが挙げられるがこれらに限定されない。
用語「ハロゲン」または「ハロ」は、本明細書で使用する場合、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。
用語「オキソ」は、本明細書で使用する場合、＝Ｏを意味する。オキソ基が炭素原子上の置換基である場合、これらはカルボニル基（Ｃ（Ｏ））を形成する。
「光異性化可能な有機分子」は、本明細書で使用する場合、光に反応して１種または複数の構造的変化または化学的変化を起こす分子を意味する。光異性化可能な有機分子の一例は、少なくとも第１の異性体立体配置および第２のまたは更なる異性体立体配置を有するスピロピランである。「スピロピラン」は、本明細書で使用する場合、下記式（Ｉ）：
Figure 2018507164
 のスピロピランコア構造で示されるように、２位の水素原子がスピロ様式で第２の環系に置き換えられている、任意選択的に置換されている２Ｈ−ピランを意味しており、式中、第２の環系は炭素環または複素環であり得る。少なくとも第１の異性体立体配置および第２のまたは更なる異性体立体配置を有するスピロピランの一例は、下記式（ＩＩ）：
Figure 2018507164
 の化合物であり、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は同一であるか、または異なり、かつそれぞれ独立して、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルもしくは置換アルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール、（５〜１２個の原子の）ヘテロアリール、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、アミノ、ハロゲン、シアノ、トリクロロメチル、トリフルオロメチル、ニトロ、硫黄、マレイミド、−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、アジドまたはＨＯ−（Ｏ）Ｃ−（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルから選択され、
Ｘは酸素であり、および
ＹはＳｅまたはＣ（ＣＨ３）２である。
別の例では、式（ＩＩ）の化合物は式（ＩＩａ）：
Figure 2018507164
 のポリマーであり得、式中、Ｒ１〜Ｒ９、ＸおよびＹは式（ＩＩ）に関して上記で定義しており、ｎは１を超える整数である。別の例示的実施形態では、ｎは１〜５００である。式（ＩＩ）の化合物は、付着Ｒ１〜Ｒ９のうちの任意の位置で重合することができる。加えて、式（ＩＩ）の化合物は、付着Ｒ１〜Ｒ９のうちの任意の位置で固体基材に結合することができる。
本発明の光異性化可能な有機分子の例として、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ−１）、（ＩＶ−２）、（Ｖ−１）および（Ｖ−２）：
Figure 2018507164
 の化合物が挙げられ、式中、Ｒ１は式（ＩＩ）に関して上記で定義されている。
第１の異性体立体配置の一例は式（ＩＩＩａ）の化合物であり、第１の条件（例えば可視スペクトル中の光）に曝露された場合に式（ＩＩＩ）の化合物に変わる。第２の異性体立体配置の一例は式（ＩＩＩ）の化合物であり、第２の条件（例えば紫外光）に曝露された場合に式（ＩＩＩａ）の化合物に変わる。下記に表す異性化は、この概念を説明することのみを意図しており、下記に示す反応または構造に限定することを意図するものではなく、図５Ａに同様に表す。
Figure 2018507164
本明細書で説明する異性体は平衡状態で存在することが理解され、換言すると、所与の試料として式（ＩＩＩ）の例示的化合物を使用する場合には式（ＩＩＩ）の化合物と式（ＩＩＩａ）の化合物との両方の濃度が存在することが理解される。これは、式（ＩＶ−１）および（ＩＶ−１ａ）、（ＩＶ−２）および（ＩＶ−２ａ）、（Ｖ−１）および（Ｖ−１ａ）、ならびに（Ｖ−２）および（Ｖ−２ａ）の化合物の場合にも当てはまり、（ＩＶ−１ａ）、（ＩＶ−２ａ）、（Ｖ−１ａ）および（Ｖ−２ａ）は下記の通りである。
Figure 2018507164
従って、「異性化」は、分子が化学的異性化または構造的異性化を起こすにつれて、ある異性体の濃度が低下して別の異性体が増加する、所与の試料中の異性体の濃度の変化、または別の異性体を支持するある異性体の濃度を増加させる、ある異性体を別の異性体よりも支持する媒体への異性体の曝露を意味する。
「光異性化可能な有機分子」に言及する場合、通常は「異性化可能な有機分子」にも言及していることが理解される。
本発明での使用に適した光異性化可能な有機分子の追加の例として、ジアリエテン（ｄｉａｒｙｅｔｈｅｎｅ）、具体的にはスチルベンおよびジチエニルエテン；アゾベンゼン；スピロピラン；フルギド；ナフタセンキノン；ヒンダードアルカン（ｈｉｎｄｅｒｅｄ ａｌｋａｎｅ）、クラウンエーテル；レチノイド；シアニン色素；ならびにこれらのポリマーが挙げられるがこれらに限定されない。ヒンダードアルカンの一例は、式（ＶＩ）：
Figure 2018507164
 の化合物である。
光異性化可能な有機分子は、共有結合的または非共有結合的な手段により、固体基材の表面上に共役、結合、または他に被覆され得、光により制御される表面特性を付与する。この特性により、この固体表面は、疎水性、電荷の変化および発生、立体構造の変化またはこれらの性質の組合せにもかかわらず、異性体特異的親和性因子との相互作用が可能になる。親和性ペプチドは、概して、粗溶解物から融合タンパク質を精製するために高い親和性を必要としており、そのため、光異性化可能な有機分子（光異性化可能な親和性分子または「ＰＩＡＭ」としても知られている）の一例は、複数の異性体状態（典型的にはシスおよびトランス）の間に大きい自由エネルギーの差異（例えば好ましくは２０ｋＪ／モルを超える）を有する。結合するペプチドの自由エネルギーにより、最初のペプチド結合状態が安定化する傾向がある。そのため、光により触媒された大きい「駆動力」により、ペプチド標識タンパク質のマトリックスからの急速な解離が可能になる。
ＰＩＡＭ分子の他の適切な特性は、１）水中でおよび／または生理的ｐＨで異性化する能力、２）一般的なバッファー（例えばＴｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩）と実質的に反応しないこと、３）電荷特性、好ましくは正電荷、４）エタノール中で実質的に分解しないこと、５）還元条件および非還元条件下での異性化、６）様々な塩濃度（例えば０〜４００ｍＭのＮａＣｌ）での異性化、ならびに７）アガロースマトリックスへの安定したおよび高効率の共役が形成可能であることである。列挙した制限を仮定すると、下記の化合物がＰＩＡＭ分子の適切なクラスの例を表す：１）ジアリエテン、具体的にはスチルベンおよびジチエニルエテン；２）アゾベンゼン；３）フルギド；４）スピロピラン；５）ナフタセンキノン；６）ヒンダードアルカン；７）クラウンエーテル誘導体；８）レチノイド；ならびに９）シアニン色素。追加の例示的化合物として上記の組合せが挙げられ、例えば高分子のアゾベンゼン、スチルベンまたはスピロピランが挙げられる。図６Ａ〜Ｄを参照されたい。
「光源」は、本明細書で使用する場合、特定の波長または特定の範囲の波長で光を発することが可能なあらゆる発光素子を意味しており、本明細書で定義するように、この特定の波長は、光異性化可能な有機分子の異性化状態を変えるのに適している。例えば、本発明のある実施形態では、光異性化可能な有機分子は式（ＩＩＩ）の分子（上記に示す）であり、特定の波長の紫外光の適用により、第１の異性体から第２の異性体（式（ＩＩＩａ）で示す）へと変換される。適切な波長範囲の例として、可視（ｖｉｓ）スペクトルまたはこの一部、紫外（ＵＶ）スペクトルまたはこの一部、および赤外スペクトル（ＩＲ）またはこの一部が挙げられるがこれらに限定されない。第１の異性体から第２の異性体への変換に適した波長の一例は３５０ｎｍである。別の実施形態では、光への曝露は、光異性化可能な有機分子の異性化状態の変化を誘発するのに十分である。例えば、光異性化可能な有機分子は、最小の光に曝露された場合または光に曝露されない場合に（例えば暗所に置かれた場合に）第１の立体配置で存在することができ、任意の発光装置（例えばランプ等）からの光に曝露された場合に第２の立体配置で存在することができる。ランプは、白熱電球、ハロゲン電球またはガス放電により、例えばガス（例えばアルゴン、ネオン、クリプトンもしくはキセノンまたは前記ガスの組合せ）の使用により、光を発することができる。
「異性体特異的親和性因子」または「親和性タグ」は、本明細書で使用する場合、特定のタンパク質、抗体、薬剤、核酸、ポリマー、有機分子、金属イオン、ペプチドまたは酵素に対する親和性で目的の標的分子に結合するペプチド配列またはオリゴヌクレオチド配列を意味しており、異性化可能な有機分子の単一の異性化状態または複数の異性化状態のサブセットに対して特異な親和性を示す。従って、この親和性タグを使用することにより、親和性技術を使用して粗生物学的供給源から目的の標的分子を容易に分離することができる。この親和性タグを、例えば化学結合により共有結合的に結合させるか、または例えば水素結合もしくは静電的相互作用により非共有結合的に結合させることができる。親和性技術は、この親和性タグと別の構造（例えば限定されないがタンパク質、抗体、酵素、薬剤、基質、受容体またはリガンド）との間の特異的相互作用を依拠とする。例示的な親和性タグとしてアプタマーが挙げられる。「アプタマー」は、本明細書で使用する場合、特定の目的の分子への高親和性の結合を容易にする分子を意味する。例示的なアプタマーは、ペプチド、オリゴ核酸または核酸であり得る。「ペプチドアプタマー」は、本明細書で使用する場合、特定の標的分子に結合する天然のまたは合成されたペプチド分子を意味する。「核酸アプタマー」は、本明細書で使用する場合、天然のまたは合成された核酸配列（例えばＲＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマーまたは還元型マイクロＲＮＡアプタマー（ｒｅｄｕｃｅｄ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ａｐｔａｍｅｒ））を意味する。
いくつかの実施形態では、ペプチドアプタマーはジペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドアプタマーは、長さが３〜６個のアミノ酸であるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドアプタマーは、長さが３個、４個、５個または６個のアミノ酸であるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドアプタマーは、長さが７個のアミノ酸であるポリペプチドである。別の実施形態では、ペプチドアプタマーは、長さが８〜１１個のアミノ酸であるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドアプタマーは、長さが８個、９個、１０個または１１個のアミノ酸であるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドアプタマーは、長さが１２個のアミノ酸であるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドアプタマーは、長さが１３〜５２個のアミノ酸であるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ペプチドアプタマーは、長さが１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個または５２個のアミノ酸であるポリペプチドである。別の実施形態では、ペプチドアプタマーは、５２個を超えるアミノ酸を含むポリペプチドである。別の実施形態では、ペプチドアプタマーは１２０個未満のアミノ酸を含む。別の実施形態では、ペプチドアプタマーは、長さが３〜１８個のアミノ酸であるポリペプチドである。別の実施形態では、ペプチドアプタマーは、長さが３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個または１８個のアミノ酸であるポリペプチドである。「アミノ酸」は、本明細書で使用する場合、天然アミノ酸または改変アミノ酸のいずれかを意味する。７個を単位とするポリペプチドの一例はＬＡＲＥＰＴＳ（配列番号１）である。１２個を単位とするポリペプチドの一例はＴＬＲＶＰＰＮＰＮＭＮＶ（配列番号５３）である。別の例示的実施形態では、ペプチドアプタマーはペプチド配列ＥＹＳＰＫＬＦＰＰＨＲＬ（配列番号５６）である。下記のペプチド配列は、本発明での使用に適した例示的ペプチドアプタマーを表すが、表１に示すペプチドに限定されない。表１に示す配列は、Ｃ末端に付加されるグリシンを有するか、またはＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに付加される１種または複数のアミノ酸を有することができる。適切なアプタマーが類似の構造の異性体のセットに結合するように設計され得、十分に、この適切なアプタマーはそのようなアプタマーを製造および設計するための当業者の技術の範囲内であることを理解すべきである。当業者は、異性化可能な有機分子と相互作用するのに十分な長さであるという条件で、任意の長さのアプタマーを作ることができるはずであることも理解すべきである。従って、当業者は任意の長さのアプタマーを設計することができ、このアプタマーは本発明の範囲内に入るであろう。
Figure 2018507164
異性体特異的親和性因子は、ペプチドアプタマーまたは核酸アプタマーに結合しているリンカーを更に含むことができる。「リンカー」は、本明細書で使用する場合、アプタマーに結合している天然のまたは合成されたポリペプチドまたは核酸の配列を意味しており、目的の分子に結合可能である。リンカーは、異性体特異的親和性因子が異性化可能な有機分子と相互作用する場合、あらゆる潜在的な立体的制限を克服するのに十分な量の余長を異性体特異的親和性因子に付与することができる。このリンカーは、最終的には、異性体特異的親和性因子の異性化可能な有機分子との会合を可能にする回転自由度を付与することができる。このリンカーに関して、用語「結合している」は、このリンカー、アプタマーおよび目的の分子の間の共有結合を意味する（例えば、このリンカーがアプタマーおよび目的の分子に共有結合している）。このリンカーは、ペプチドアプタマーまたは核酸アプタマーと同じアミノ酸配列または核酸配列であってもよく、または異なっていてもよい。下記の式（Ｖ）：
［アプタマー］−［リンカー］−［目的の分子］ （Ｖ）
で示すように、リンカーは、アプタマーおよび目的の分子の両方に同時に結合することができる。
ファージディスプレイを使用して、ＰＩＡＭの特定のアイソフォームに結合する高親和性ペプチド配列を決定することができる。所与のＰＩＡＭ／マトリックスの組合せの場合、共役ＰＩＡＭは、適切な波長の光を使用してシス異性体またはトランス異性体のいずれかに均質化され得る。ファージペプチドライブラリを結合させることができ、マトリックスを高塩濃度バッファーで洗浄して非特異的結合剤を除去する。次いで、光の波長を切り換えた後に特定のファージ結合剤を溶出させて、ＰＩＡＭ分子の異性化を促進させることができる。このプロセスを高ストリンジェンシー条件下で繰り返して、光異性化で特異的に溶出するマイクロモル親和性ファージペプチドおよびナノモル親和性ファージペプチドを見出すことができる。成功したヘプタペプチドを、組換え発現タンパク質用の親和性タグとして試験することができる。
「洗浄する」は、本明細書で使用する場合、光異性化可能な親和性分子に結合または会合していない実質的に全ての物質の除去を意味する。洗浄プロセスでは全ての物質が除去され得ないことを理解すべきである。微量の残留物が許容され得る。
「目的の分子」とは、本明細書で使用する場合、使用者が所望するあらゆる分子または構造である。例えば、目的の分子は、目的のタンパク質、抗体、薬剤、核酸、ポリマー、有機分子、金属イオン、ペプチドまたは酵素であり得る。本発明の方法および組成物を使用して、目的の分子を精製、単離、選択的に結合、選択的に遊離、分離、またはパターン化することができる。目的の分子を、上記に記載したもの等の異性体特異的親和性因子または親和性タグを含むように遺伝子操作により製造することができる。目的の分子を、当業者に既知の任意の方法で製造することができ、例えば、親和性タグで修飾されているタンパク質の合成を促進するように設計されているプラスミドベクターの使用により製造することができる。
「会合する」は、本明細書で使用する場合、結合対（例えば光異性化可能な有機分子および異性体特異的親和性因子または親和性タグ等）の捕捉、結合または組立てを意味する。同様に、「解離する」は、本明細書で使用する場合、結合対（例えば光異性化可能な有機分子および異性体特異的親和性因子または親和性タグ等）の遊離または分解を意味する。「親和性」は、本明細書で使用する場合、結合対（例えば光異性化可能な有機分子および親和性タグ等）の２種の結合パートナー間の結合相互作用の強さを意味する。光異性体が原子的に平らである場合にのみ、この光異性体に例示的な親和性タグが結合することができるように、結合対間の会合は極めて高度に特異的であり得る。親和性タグが原子的に平らな異性体にのみ結合するという示唆は、本発明の概念の説明を提供しているに過ぎず、いずれか１つの特定の理論または原子の立体配置に限定することを意図するものではない。
本明細書で使用する場合、「固体基材」には、多数の形状および形態（例えば、ストリップ、棒、粒子、ビーズ（固体またはゲル）、メッシュ、膜およびゲル（ヒドロゲル等））のいずれか１つを有することができる多孔質または非多孔質の物質が含まれ得る。適切な物質は当技術分野で公知であり、この物質として、例えばデキストラン、アガロース、樹脂、紙、ろ紙、ナイロン、ガラス、セラミック、シリカ、アルミナ、珪藻土、セルロース、ポリメタクリレート、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニルおよびこれらそれぞれの誘導体を挙げることができる。この固体基材はカラムの側部および底部であり得るか、またはカラムに加えられる物質であり得る。固体基材の例として、アガロースビーズ、免疫アッセイプレオート、細胞培養プレートおよび同類のものが挙げられる。上記で定義したように、この固体基材を使用して目的の分子を固定することができる。
例えば異性化可能な有機分子との共有結合的または非共有結合的な結合の形成により、固体基材を被覆することができる。例示的実施形態では、異性化可能な有機分子は共有結合により固体基材を被覆することができる。この共有結合を、当業者に既知の任意の方法により形成することができ、この方法として、例えばクリック化学およびペプチド結合形成、ＣＯＯＨまたはアミンを介したＥＤＣ／ＮＨＳカップリングが挙げられる。本発明の別の態様では、異性化可能な有機分子を、当技術分野で既知の方法を使用して単一点付着または複数点付着により固体基材に共有結合的に付着させることができる。付着点は、異性化可能効果が妨げられないように選択すべきである。
これより、例示的実施形態を説明して図面に示す。図１Ａは、光異性化後の特異な結合親和性を概略的に示す。例えば、特定の分子は、光に反応して、この分子の化学的特性および／または構造的特性を変化させる。図１Ａを参照すると、ｈｖ１およびｈｖ２は、分子の異性化状態を操作するために選択される光の波長を意味する。図１Ａに示す例では分子は２種の状態のモデルであるが、異性化可能な有機分子は多数の化学的異性体および構造的異性体を有することができる。
図１Ｂを参照すると、本発明の例示的実施形態を、光による結合の制御を順に可能にする光異性化可能な有機分子の１種または複数の化学的異性体に対して高い結合親和性を有する異性化可能な有機分子（例えば光異性化可能な有機分子）である２種の成分で構成することができる。図１Ｂ中の例を参照すると、光異性体Ａは異性体特異的アプタマーに高い親和性で結合するが、光異性体Ｂは、この異性体特異的アプタマーに対する親和性が非常に低い。
図１Ｃは、例示的な異性化可能な有機分子で修飾された表面を示す。図１Ｃでは、異性体特異的アプタマーは、繋ぎ止められた目的の分子（目的の分析物とも称される）に結合している。この異性体特異的アプタマーは、修飾された表面上の光異性体Ａに結合する。異性化させる光に曝露された場合、光異性化可能な有機分子は光異性体Ｂへの構造的変化を起こし、そのため、修飾された表面から異性体特異的アプタマーおよび目的の分子が遊離される。
光異性化可能な有機剤は多くの用途を有することができる。例示的実施形態では、光異性化可能な小さい有機分子と親和性タグとの間の光反応性結合を使用して、溶液から組換えタンパク質を精製することができる。例示的実施形態では、本発明は、光異性化可能な有機分子（例えばスピロピラン）で修飾されているか、被覆されているか、またはそれに共有結合的に連結されている固体基材、例えばビーズを準備することを含む方法である。図４Ａを参照されたい。この固体基材と、親和性タグ（例えばペプチドＢ７）に共役している目的の分子を含む溶液とを、この親和性タグと固体基材上を被覆する異性化可能な有機分子との間に複合体を形成する条件下で接触させる。この複合体の説明を図４Ｂに示す。親和性タグと被覆固体基材との会合を、プルダウンアッセイにより「プルダウン」と称することもできる。この固体基材を洗浄して、複合体に会合していない物質を除去する。次いで、光異性化可能な有機分子を適切な異性化誘発因子（例えば光）に曝露して、異性化可能な有機分子の構造を、親和性タグにもはや結合しない別の異性体型へと変化させ、その結果、目的の分子が溶出される。上記の方法を、例えば図４Ａおよび図４Ｃに示すカラム中で実行することができる。
別の実施形態では、本発明は、より集中した溶出ピークを作るために順次にまたは同時に光を発するカラムハウジングである。図４Ｃは、目的の分子を選択的に結合および遊離させるためのクロマトグラフィーカラムであって、ハウジングと、このハウジング内に充填されている複数の被覆ビーズであり、被覆が、第１の異性体立体配置における光異性化可能な有機分子である、被覆ビーズと、第１の異性体立体配置における光異性化可能な有機分子を第２の異性体立体配置へと変換するのに適した波長の少なくとも１個の光源とを含み、複数の被覆ビーズが少なくとも１個の光源と光接触する、クロマトグラフィーカラムを示す。図４Ｃに示すように、このカラムは、被覆ビーズが充填されているハウジングを囲む複数の光源を有することができる。これらの光源を、順次にまたは同時に作動させることができる。図４Ｃを参照すると、これらの光源に符号１〜５を付している。光源１が最初に作動し、続いて２が、続いて３が、続いて４が、次いで５が作動し得る。光源１〜５の順次の作動により、図４Ｃに示すように鋭い溶出ピークを作ることができる。一方、全ての光源１〜５を同時に作動させる場合、溶出ピークは平らになり得る。
図５Ｂは、カラムが可視光から遮断されているＴ＝０秒での図４Ｃのカラムの色調／色相と、カラムが可視光に曝露されているＴ＝５秒での図４Ｃのカラムの色調／色相とを示す。濃さの消失は異性化可能な有機分子の異性化を示す。赤色／オレンジ色の色相を図示しない。
光異性化可能な親和性分子（１−（β−カルボキシエチル）−３’，３’−ジメチルスピロ（２’Ｈ−１’−ベンゾピラン−２，２’−インドリン））（式（ＩＩ））の合成
Figure 2018507164
 ２，３，３−トリメチルインドレニン（６ｍＬ、３７ｍｍｏｌ）と３−ヨードプロパン酸（７．４７ｇ、３７ｍｍｏｌ）との混合溶液を、３時間にわたり１００℃においてアルゴン（または窒素）下で２−ブタノン（７ｍＬ）中で還流させた。ロータリーエバポレーターを使用した溶媒の蒸発後、生じた固体物質を水に溶解させてジクロロメタンで洗浄した。水相を回収し、ロータリーエバポレーターを使用して水を蒸発させた。７３％（９．６ｇ）の代表的な収率で、更に精製することなく、ＣＥ−ＴＭＩとして知られているＦｉｓｈｅｒの塩基１−（β−カルボキシエチル）−２，３，３−トリメチルインドレニウムヨージド（白色粉末）を得た。前記ヨウ化物塩（８．１７ｇ、２３ｍｍｏｌ）を５−ニトロサリチルアルデヒド（３．８５ｇ、２３ｍｍｏｌ）およびピペリジン（２．４ｍＬ、２３ｍｍｏｌ）および２−ブタノン（１０ｍＬ）と混合し、この混合物を１００℃において３時間にわたり還流させた。（ブタノンをメチルエチルケトンに置き換えてもよい）。次いで、この混合物を室温で一晩放置し、生成物が黄色粉末として再結晶化した。この生成物をろ過してメタノールで洗浄した。一晩真空下で乾燥した後、ＳＰ−ＣＯＯＨを黄色粉末として回収した（５．１ｇ、５８％収率）。図５Ａを参照されたい。
特異な結合
図２は、スピロピラン分子で修飾したプレートへの様々なペプチドの結合を表す棒グラフである。スピロピラン修飾プレートに結合するための親和性に関して２種のビオチン化ペプチド、即ちＥＹＳＰＫＬＦＰＰＨＲＬＧＫ（配列番号５６）およびＬＡＧＰＱＭＨＧＫ（配列番号６２）を試験し、ビオチン化陰性コントロールペプチドとして作用するＳ．ｐｅｐも試験した。吸光度は、どの程度のビオチン化ペプチドが洗浄後にスピロピラン修飾プレートに結合したままかを表す。インキュベーション条件および洗浄条件を下記で説明する。
ビオチン化ペプチドを、示した濃度（薄い灰色：１μＭ、濃い灰色：１００ｎｍ、白色：１μＭ＋光への曝露）でインキュベートし、１０回洗浄し、次いでＨＲＰが共役したストレプトアビジンと共にインキュベートした。洗浄を１０回繰り返し、次いで、プレートを３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質で顕在化させて９６ウェルプレートリーダーで定量化した。全ての場合において、ビオチンは、Ｃ末端リシン残基上のアミンを介して供給結合的に連結されている。
ペプチドを、示した濃度で３０分にわたりインキュベートした。プレートを、リン酸緩衝生理食塩水が入ったＴｅｃａｎ Ｈｙｄｒｏｆｌｅｘ ９６プレート洗浄機で１０回洗浄した。プレートを２時間にわたり１％ＢＳＡでブロックした。ＨＲＰに共役しているストレプトアビジンを１時間かけて添加した。プレートを再度、ＰＢＳが入ったプレート洗浄機で１０回洗浄した。市販のＥＬＩＳＡ基質であるＴＭＢ／Ｈ２０２を添加し、顕在化の１５分後にＨ２ＳＯ４を添加して反応をクエンチさせた。
ビオチンをプルダウンさせるためのスピロピラン修飾ビーズの使用
図３は、スピロピラン分子で選択的に修飾されているビーズへのペプチドの結合を表す折れ線グラフである。選択的に修飾されているビーズを、示した時間の長さにわたり１０μＭのペプチドＢ７（ＬＡＧＰＱＭＨＧＫ（配列番号６２））と共にインキュベートし、次いでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。ビーズを１μＭのセイヨウワサビ（ＨＲＰ）共役ストレプトアビジンと共にインキュベートし、残留するＨＲＰ−ストレプトアビジンを溶液中で測定した。図３は、インキュベートした期間後のビーズの吸光度を％で示す。吸光度が高いほど、バルク溶液中のストレプトアビジンの濃度が高い。時間＝６０分において矢印で示すように、ストレプトアビジン修飾ビーズが時間＝６０分で光に曝露された場合、ストレプトアビジンが遊離してバルク溶液中に戻った。
全ての実験は、「ＳＰ−ビーズ／ペプチドＢ７」（ｎ＝６である）を除いてＮ＝３であり（エラーバーは標準偏差である）、次いで、示したように、試料を、光に曝露する（Ｔ＝６０秒）Ｎ＝３と暗闇のままのｎ＝３とに半分に分けた。
アガロースビーズ修飾の方法
１ｍＬのアガロースビーズを２カラム体積のＤＭＳＯ（無水状態でボトルから取り出す）で洗浄する。別の容器中で、２．５ｍｇのスピロピランおよび８０ｍｇのＥＤＣおよび１００ｍｇのＮＨＳを混合する。これらの化合物をＤＭＳＯに溶解させ、室温で１０分間待つ。この混合物にビーズ（ＤＭＳ中である）を添加する。良好な混合／懸濁を確認する。即ち、ＤＭＳＯがマトリックス全体を完全に懸濁させるのに十分であるかを確認する。１２時間撹拌する。修飾されたマトリックスを２０カラム体積のＤＭＳＯで洗浄し、遊離している化合物を洗い落とす。ＤＭＳＯを２０カラム体積の水で除去する。次いで、水中でまたは２０％エタノール中で貯蔵する。ビーズ共役技術の例に関して図７を参照されたい。
参考文献
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本明細書で参照する全ての特許、公開出願および参考文献の教示は、その全体が参照により援用される。
本発明を具体的に示し、本発明の例示的実施形態を参照して説明したが、当業者は、添付した特許請求の範囲により包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細における様々な変更形態がなされ得ることを理解するであろう。

Claims (30)

  1. 異性化可能な有機分子である第１の結合メンバーと、
    異性体特異的親和性因子である第２の結合メンバーと
    を含み、
    前記異性化可能な有機分子が、第１の条件下で前記第２の結合メンバーに対してある結合親和性を有し、かつ第２の条件下で前記第２の結合メンバーに対して異なる結合親和性を有する、結合対。
  2. 結合親和性の差異は、前記第１の結合メンバーと前記第２の結合メンバーとが第１の条件下で会合し、かつ第２の条件下で解離するようなものである、請求項１に記載の結合対。
  3. 前記異性体特異的親和性因子がペプチドアプタマーまたは核酸アプタマーを含む、請求項１に記載の結合対。
  4. 前記異性体特異的親和性因子が、前記ペプチドアプタマーまたは前記核酸アプタマーに共有結合的に連結されているリンカーを更に含み、前記リンカーは目的の分子に非共有結合的にまたは共有結合的に結合可能である、請求項３に記載の結合対。
  5. 前記ペプチドアプタマーが、
    ａ）ジペプチド、
    ｂ）３〜６個のアミノ酸を有するポリペプチド、
    ｃ）７個のアミノ酸を有するポリペプチド、
    ｄ）８〜１１個のアミノ酸を有するポリペプチド、
    ｅ）１２個のアミノ酸を有するポリペプチド、
    ｆ）１３〜５２個のアミノ酸を有するポリペプチド、または
    ｇ）５２個を超えるアミノ酸を有するポリペプチド
    である、請求項３または４に記載の結合対。
  6. 前記ペプチドアプタマーが、３〜１８個のアミノ酸を有するポリペプチドである、請求項３〜５のいずれか一項に記載の結合対。
  7. 前記リンカーがプロテアーゼ感受性の切断部位を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結合対。
  8. 前記第１の条件が、光、低輝度の光、暗闇、熱、ｐＨ、ストレス、イオン、前記異性体特異的親和性因子またはこれらの組合せへの曝露であり、および前記第２の条件が、前記第１の条件と異なる光、低輝度の光、暗闇、熱、ｐＨ、ストレス、イオン、前記異性体特異的親和性因子またはこれらの組合せへの曝露である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結合対。
  9. ａ）前記第１の条件が、可視スペクトルもしくはその一部上の広範囲の波長の光への曝露であり、および前記第２の条件が、紫外スペクトルもしくはその一部上の広範囲の波長の光への曝露であるか、
    ｂ）前記第１の条件が、可視スペクトルもしくはその一部上の波長の光への曝露であり、および前記第２の条件が、前記第１の条件と異なる低輝度の光もしくは暗闇への曝露であるか、または
    ｃ）前記第１の条件が、ある波長の光への曝露であり、および前記第２の条件が、前記第１と１０ナノメートル超の波長だけ異なる波長の光への曝露である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の結合対。
  10. 前記異性化可能な有機分子が光異性化可能な有機分子である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の結合対。
  11. 前記光異性化可能な有機分子がスピロピランコア構造を有する、請求項１０に記載の結合対。
  12. 前記光異性化可能な有機分子が、式（Ｉ）：
    Figure 2018507164
     のスピロピラン構造を有し、
    式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９が同一であるか、または異なり、かつそれぞれ独立して、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルもしくは置換アルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール、（５〜１２個の原子の）ヘテロアリール、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、アミノ、ハロゲン、シアノ、トリクロロメチル、トリフルオロメチル、ニトロ、マレイミド、硫黄、−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、アジドまたはＨＯ−（Ｏ）Ｃ−（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルから選択され、
    Ｘが酸素であり、および
    ＹがＳｅまたはＣ（ＣＨ３）２である、請求項１１に記載の結合対。
  13. 目的の分子を選択的に結合および遊離させる方法であって、
    ａ）第１の異性体立体配置における異性化可能な有機分子で被覆されているか、またはそれに共有結合的に連結されている固体基材を準備すること、
    ｂ）第１の条件下で、前記被覆固体基材と、異性体特異的親和性因子に共役している目的の分子を含む溶液とを接触させて、前記親和性因子と前記固体基材上を被覆する前記異性化可能な有機分子との間に複合体を形成すること、
    ｃ）工程（ｂ）で形成された前記複合体を洗浄して、前記複合体と会合していない物質を除去すること、および
    ｄ）前記第１の異性体立体配置における前記異性化可能な分子を、（例えば適切な異性化誘発因子の適用により）第２のまたは更なる条件下で第２のまたは更なる異性体立体配置へと変換することであって、前記有機分子の前記第２のまたは更なる異性体立体配置への前記変換により、前記目的の分子が前記異性化可能な有機分子から解離することが可能となる、変換すること
    を含む方法。
  14. 前記異性化可能な有機分子および前記異性体特異的親和性因子が共に請求項１〜１２のいずれか一項に記載の結合対である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記異性化可能な有機分子が光異性化可能な有機分子、例えばスピロピランコア構造を有する有機分子である、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記適切な異性化誘発因子が、特定のまたは広範囲の波長の光を照射するように構成されている光源、例えば発光ダイオードまたはランプである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記適切な異性化誘発因子が熱源または冷却源である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記目的の分子を精製、分離、単離、またはパターン化するために実施される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 工程（ａ）の前に、前記固体基材を、前記第１の異性体立体配置における前記異性化可能な有機分子で被覆するか、またはそれと共有結合的に連結させることを更に含む、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記第１の異性体立体配置における前記異性化可能な有機分子が式（ＩＶ−１ａ）または（Ｖ−１ａ）：
    Figure 2018507164
     の化合物であり、
    前記第２のまたは更なる異性体立体配置における前記異性化可能な有機分子が式（ＩＶ−１）または（Ｖ−１）：
    Figure 2018507164
     の化合物であり、
    式中、Ｒ１が、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルもしくは置換アルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール、（５〜１２個の原子の）ヘテロアリール、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、アミノ、ハロゲン、シアノ、トリクロロメチル、トリフルオロメチル、ニトロ、マレイミド、硫黄、−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、アジドまたはＨＯ−（Ｏ）Ｃ−（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルから選択される、請求項１３に記載の方法。
  21. 前記固体基材がハウジング中に配置され、および工程（ｃ）の洗浄が、前記ハウジングを通して溶液を洗浄して、前記固体基材複合体と会合していない物質を除去することを更に含む、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記目的の分子が、タンパク質、抗体、薬剤、核酸、ポリマー、有機分子、金属イオンまたはペプチドである、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記異性体特異的親和性因子が、ＬＡＲＥＰＴＳ（配列番号１）、ＨＥＬＶＲＳＰ（配列番号２）、ＷＡＬＤＲＧＡ（配列番号３）、ＡＰＳＴＰＴＰ（配列番号４）、ＳＭＰＱＴＡＧ（配列番号５）、ＥＰＬＱＬＫＭ（配列番号６）、ＡＴＰＬＷＬＫ（配列番号７）、ＡＫＩＤＡＲＴ（配列番号８）、ＹＮＨＱＲＰＰ（配列番号９）、ＡＬＩＰＫＰＲ（配列番号１０）、ＱＬＩＴＫＰＬ（配列番号１１）、ＳＴＰＩＱＱＰ（配列番号１２）、ＴＦＡＫＳＡＹ（配列番号１３）、ＳＴＦＴＫＳＰ（配列番号１４）、ＴＰＡＨＮＤＹ（配列番号１５）、ＳＬＳＬＩＱＴ（配列番号１６）、ＮＱＤＶＰＬＦ（配列番号１７）、ＧＰＨＬＧＬＫ（配列番号１８）、ＬＡＧＰＱＭＨ（配列番号１９）、ＳＱＡＳＳＬＫ（配列番号２０）、ＳＤＬＳＳＰＹ（配列番号２１）、ＬＶＴＴＷＰＡ（配列番号２２）、ＡＬＹＫＮＴＳ（配列番号２３）、ＱＱＩＳＴＱＭ（配列番号２４）、ＡＷＬＰＡＧＡ（配列番号２５）、ＧＴＷＬＳＲＧ（配列番号２６）、ＧＨＱＶＳＲＬ（配列番号２７）、ＧＰＭＬＡＲＧ（配列番号２８）、ＴＡＳＬＶＲＰ（配列番号２９）、ＴＤＳＬＲＬＬ（配列番号３０）、ＡＫＰＤＷＲＦ（配列番号３１）、ＶＱＴＹＡＲＶ（配列番号３２）、ＹＴＥＰＶＲＥ（配列番号３３）、ＭＳＬＱＱＥＨ（配列番号３４）、ＭＫＷＱＴＶ（配列番号３５）、ＮＥＲＡＬＴＬ（配列番号３６）、ＳＰＳＴＨＷＫ（配列番号３７）、ＷＳＴＴＮＶＰ（配列番号３８）、ＹＨＫＬＤＰＬ（配列番号３９）、ＬＳＮＮＮＬＲ（配列番号４０）、ＬＰＡＧＲＶＬ（配列番号４１）、ＳＴＳＦＷＩＴ（配列番号４２）、ＬＧＳＰＭＳＮ（配列番号４３）、ＷＥＬＲＰＲＴ（配列番号４４）、ＴＮＩＥＳＬＫ（配列番号４５）、ＬＹＡＥＶＩＲ（配列番号４６）、ＮＨＳＴＱＭＹ（配列番号４７）、ＮＬＱＩＹＡＶ（配列番号４８）、ＹＤＴＳＳＡＳ（配列番号４９）、ＭＨＳＮＴＷＤ（配列番号５０）、ＴＰＴＴＶＳＹ（配列番号５１）、ＴＳＨＳＩＬＱ（配列番号５２）、ＴＬＲＶＰＰＮＰＮＭＮＶ（配列番号５３）、ＨＶＫＬＶＡＶＡＤＬＭＮ（配列番号５４）、ＹＨＰＮＧＭＮＰＹＴＫＡ（配列番号５５）、ＥＹＳＰＫＬＦＰＰＨＲＬ（配列番号５６）、ＨＨＬＴＨＡＮＳＬＴＮＴ（配列番号５７）、ＷＨＷＧＬＬＹＰＡＳＡＮ（配列番号５８）、ＫＰＬＭＴＹＫＶＩＨＹＶ（配列番号５９）、ＱＰＤＬＳＨＰＳＴＮＡＹ（配列番号６０）、ＦＰＴＮＬＡＴＲＳＡＭＶ（配列番号６１）、ＬＡＧＰＱＭＨＧＫ（配列番号６２）、ＰＬＲＰＫＳＥＹＰＦＨＹ（配列番号６３）、ＳＹＳＰＫＬＦＰＰＨＲＬ（配列番号６４）、ＳＤＬＳＳＰＹＧ（配列番号６５）、ＳＤＬＳＳＰＹＧＧ（配列番号６６）、ＳＤＬＳＳＰＹＧＧＣ（配列番号６７）もしくはＥＹＳＰＫＬＦＰＰＨＲＬＧＫ（配列番号６８）、またはグリシンがＣ末端に付加されている配列番号１〜６７のいずれか１つ、または１種もしくは複数のアミノ酸がＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに付加されている配列番号１〜６７のいずれか１つから選択されるペプチドアプタマーを含む、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記固体基材がビーズ、例えばアガロースビーズである、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 目的の分子を選択的に結合および遊離させるためのクロマトグラフ装置であって、
    ハウジングと、
    前記ハウジング内に充填されている被覆固体基材であって、被覆が、第１の異性体立体配置、第２のもしくは更なる異性体立体配置またはこれらの組合せにおける光異性化可能な有機分子である、被覆固体基材と、
    前記第１の異性体立体配置における前記光異性化可能な有機分子を第２のまたは更なる異性体立体配置へと変換するのに適した波長の少なくとも１個の光源と
    を含み、
    前記被覆固体基材が前記少なくとも１個の光源と光接触する、クロマトグラフ装置。
  26. 前記被覆固体基材が複数の被覆ビーズである、請求項２５に記載の装置。
  27. カラム、多孔質膜またはフィルタである、請求項２６に記載の装置。
  28. 前記第１の異性体立体配置における前記光異性化可能な有機分子が式（ＩＶ−１ａ）または（Ｖ−１ａ）：
    Figure 2018507164
     の化合物であり、および
    前記第２のまたは更なる異性体立体配置における前記光異性化可能な有機分子が式（ＩＶ−１）または（Ｖ−１）：
    Figure 2018507164
     の化合物であり、
    式中、Ｒ１が、水素、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルもしくは置換アルキル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニル、（Ｃ６〜Ｃ１０）アリール、（５〜１２個の原子の）ヘテロアリール、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシ、アミノ、ハロゲン、シアノ、トリクロロメチル、トリフルオロメチル、ニトロ、マレイミド、硫黄、−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、アジドまたはＨＯ−（Ｏ）Ｃ−（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルから選択される、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の装置。
  29. 目的の分子を選択的に結合させるためのキットであって、
    請求項１〜１２のいずれか一項に記載の結合対と、
    前記親和性因子を目的の分子に結合させ、かつ前記異性化可能な有機分子に更に選択的に結合させ、および任意選択的にそれから前記親和性因子を遊離させるための説明書と
    を含むキット。
  30. 前記異性化可能な有機分子が光異性化可能な有機分子である場合に、前記第１の異性体立体配置における前記光異性化可能な有機分子を第２のまたは更なる立体配置へと変換するのに適した広範囲のまたは特定の波長の光源を更に含む、請求項２９に記載のキット。
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