JP2018500546A - ドライアイ用動物モデルおよびこうした動物の使用方法 - Google Patents

Abstract

ドライアイの試験のための動物モデルを作る方法、および眼疾患に対する候補治療を試験し、こうした治療の有効性を決定するためにこうした動物モデルを使用する方法が本明細書に提供されている。本明細書に開示の方法は、スコポラミンおよび塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）の両方の投与によって齧歯類動物にＤＥＤを誘発する。スコポラミンは、注射、経皮パッチ、および齧歯類へのポンプの移植などの全身投与を含む、さまざまな手段で投与することができる。例えば、スコポラミンは、ポンプの移植によって０．４〜４．０ｍｇ／体重２０ｇ／日の濃度の注入を提供することによって投与することができる。塩化ベンザルコニウムは齧歯類の眼表面に局所的に投与することができる。例えば、ＢＡＣは０．０５〜０．４％の濃度で、１日１〜４回投与することができる。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１４年１２月２日出願の米国仮特許出願第６２／０８６，２６３号の優先権の利益を主張するものであり、当該仮特許出願の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。

ドライアイ疾患（ＤＥＤ）、または乾性角結膜炎（ＫＣＳ）はドライアイワークショップ（ＤＥＷＳ）の２００７年レポートに「涙液層の浸透圧増加および眼表面の炎症を伴う眼表面への損傷の可能性を有し、不快感、視覚障害、および涙液層の不安定性をもたらす涙液および眼表面の多因子疾患」として記述されている。（Ｏｃｕｌａｒ Ｓｕｒｆ ５（２）：７５−９２， ２００７）。５０歳以上の女性約３２３万人および男性１６８万人、合計で４９１万人のアメリカ人がドライアイを持つと推定されてきた。さらに数千万人が重症度の低い症状およびおそらくは本疾患のより突発性の発現を経験している（同文献）。

ドライアイには一般的に認識された２つのサブグループがある、つまり水分欠乏／涙液分泌減少に関連するドライアイ、および涙液層蒸発の増加に関連するドライアイ（「蒸発亢進型ドライアイ」）である。

水分欠乏群には、シェーグレン症候群（ＳＳ）ドライアイおよび非ＳＳドライアイの２つの主なサブクラスがある。シェーグレン症候群では、全身自己免疫プロセスにより涙腺が標的とされる。涙腺が活性化Ｔ細胞によって浸潤され、これが腺房細胞および導管細胞の死滅ならびに涙液の分泌不全を起こす。いくつかの自己免疫疾患は、ＳＳドライアイ症候群と関連しており、関節リウマチ、強皮症、多発性筋炎、リンパ腫、アミロイドーシス、ヘモクロマトーシス、サルコイドーシス、および全身性エリテマトーデスなどのＳＳドライアイ症候群と関連する（Ｄｊａｌｉｌｉａｎ ＡＲ， ｅｔ ａｌ． Ｄｒｙ ｅｙｅ． Ｉｎ： Ｋｒａｃｈｍｅｒ ＪＨ， Ｍａｎｎｉｓ ＭＪ， Ｈｏｌｌａｎｄ ＥＪ， ｅｄｉｔｏｒｓ． Ｃｏｒｎｅａ． ２ｎｄ ｅｄ． Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｍｏｓｂｙ； ２００５）。非シェーグレン症候群ドライアイは、涙腺不全に起因する水分欠乏の一形態であり、ＳＳドライアイの全身性自己免疫特徴は除外されている。非ＳＳドライアイの最も一般的な形態は加齢性ドライアイである（Ｏｃｕｌａｒ Ｓｕｒｆ ５（２）：７５−９２， ２００７）。

蒸発亢進型ドライアイは、正常な涙腺分泌機能にもかかわらず、眼表面からの水分損失の増加によって生じる。その原因は、瞼の構造または動態に影響する疾患に起因するなどの内因性、または過酷な環境条件など、一部の外部暴露により眼表面疾患が起こる外因性として分類されてきた。

ホルモン状態の変化（例えば、閉経後）はドライアイの発症または悪化をもたらす可能性がある。コンタクトレンズ着用、レーザー屈折矯正手術、喫煙、およびコンピュータ使用、テレビ視聴および長時間の読書などの長時間の視覚作業など、その他のいくつかの外部因子もドライアイを起こすかまたはドライアイに寄与することが知られている。ドライアイの悪化は、オフィス環境、エアコンを付けた車、および極端に暑いかまたは寒い気候で見られる低湿度条件とも関連する。ドライアイは、涙液分泌を減少させる、抗ヒスタミン薬、抗うつ薬、抗精神病薬、および利尿薬などの薬によっても生じる可能性がある（Ｏｃｕｌａｒ Ｓｕｒｆ ５（２）：７５−９２， ２００７）。
ドライアイ患者は、Ｔ細胞浸潤ならびにＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８に加えてリンパ球活性化マーカーＣＤ１１ａおよびＨＬＡ−ＤＲの上方調節によって現れる結膜炎を呈する（Ｓｔｅｒｎ ＭＥ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ． ４３：２６０９−２６１４ （２００２））。従って、ドライアイ発病機序は、Ｔ細胞活性化および自己免疫炎症に依存する可能性がある。インターロイキン（ＩＬ）−１などの炎症性サイトカイン、およびマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）もドライアイの発病機序に関与する。ＩＬ−１（ＩＬ−１αおよび成熟ＩＬ−１β）の炎症促進性形態のの増加および生物学的に不活性な前駆体ＩＬ−１βの減少が、ドライアイ患者の涙液層で認められている（Ｓｏｌｏｍｏｎ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ． ４２：２２８３−２２９２ （２００１））。

Ｏｃｕｌａｒ Ｓｕｒｆ ５（２）：７５−９２， ２００７ Ｓｔｅｒｎ ＭＥ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ． ４３：２６０９−２６１４ （２００２） Ｓｏｌｏｍｏｎ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ． ４２：２２８３−２２９２ （２００１）

本開示はドライアイ疾患の動物モデルに関連する。ヒトのドライアイ疾患（ＤＥＤ）の病態生理を反映する、齧歯類動物にドライアイ疾患を誘発する方法が本明細書に開示されている。齧歯類動物はマウスまたはラットとしうる。さらに、例えば、ＤＥＤの治療のための候補薬剤の試験など、誘発されたドライアイ疾患を持つ齧歯類動物の使用方法も開示されている。

本明細書に開示の方法は、スコポラミンおよび塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）の両方の投与によって齧歯類動物にＤＥＤを誘発する。

スコポラミンは、注射、経皮パッチ、および齧歯類へのポンプの移植などの全身投与を含む、さまざまな手段で投与することができる。例えば、スコポラミンは、ポンプの移植によって０．４〜４．０ｍｇ／体重２０ｇ／日の濃度の注入を提供することによって投与することができる。塩化ベンザルコニウムは齧歯類の眼表面に局所的に投与することができる。例えば、ＢＡＣは０．０５〜０．４％の濃度で、１日１〜４回投与することができる。

ドライアイ状態は、スコポラミンおよびＢＡＣで処置した齧歯類動物の、対照（例えば、未処置の齧歯類の眼）レベルと比較した涙液分泌の減少および眼刺激の増加によって特徴付けられる。一つの例では、涙液分泌の減少は、対照レベルと比較した涙液分泌の減少を検出することによって測定される。別の例では、眼刺激の増加は、眼内の、対照レベルと比較した、炎症細胞の増加、眼の炎症性サイトカインの増加、またはフルオレセイン染色の増加のうち一つ以上の検出によって測定される。「減少」および「増加」とは、対照レベルと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％またはそれ以上の差を意味する。

スコポラミンおよびＢＡＣを齧歯類動物に投与すると、ドライアイ状態は、例えば投与から５、７、１０、１４、２１または２８日以内など、投与から数日以内に明らかとなる。明細書に開示の方法によると、スコポラミンおよびＢＡＣの投与は、２、３もしくは４週間、および最大２か月または望ましい場合はそれより長期間など、１週間以上継続することができる。

さらに、ドライアイの治療のための候補薬の有効性を試験する方法が本明書に開示されている。方法には、齧歯類動物を提供する工程、スコポラミンおよび塩化ベンザルコニウムを齧歯類動物に投与して齧歯類動物にドライアイを誘発する工程、候補薬剤をドライアイを持つ齧歯類動物に投与する工程、候補薬剤が齧歯類動物のドライアイ治療に効果的かどうかを決定する工程が関与する。

一部の実施形態では、ＤＥＤの症状または状態を改善する候補薬剤の有効性を評価できるように、候補薬剤はスコポラミンおよび塩化ベンザルコニウムの投与開始後の時点で投与される。例えば、候補薬剤は、スコポラミンおよび塩化ベンザルコニウムの投与開始から３、４、５、６、７、１４、または２８日後に投与することができる。候補薬剤の有効性は、対照レベル（例えば、スコポラミンおよび塩化ベンザルコニウムを投与されているが候補薬剤は投与されていない動物の眼）と比較した、涙液分泌の増加および／または眼刺激の減少を測定することによって決定することができる。

一部の実施形態では、候補薬剤はスコポラミンおよび塩化ベンザルコニウムの投与開始と同時に投与される。これらの実施形態では、候補薬剤がＤＥＤを防止する（例えば、ドライアイの発症を防止もしくは遅延する、または発病を制限する）能力を評価することができる。候補薬剤の有効性は、対照レベル（例えば、スコポラミンおよび塩化ベンザルコニウムを投与されているが候補薬剤は投与されていない動物の眼）と比較して、候補薬剤が涙液分泌の減少を制限または排除するおよび／または眼刺激の増加を制限または排除する能力を測定することによって決定することができる。

候補薬剤は局所的または全身的に投与することができ、これは候補薬剤の性質に依存しうる。局所投与の例には、齧歯類動物の眼または鼻への、液滴、スプレーまたはゲル形態の候補薬剤の投与が含まれる。全身投与の例には、経口投与、注射、または注入が含まれる。

治療開始前（−３日目、ベースライン）または治療開始後７、１４、２１および２８日目の涙液分泌の測定値を示す。それぞれの日で、５本のバーは左から右に、無処置、疑似、ＢＡＣ、Ｓｃｏｐ、およびＢＡＣ＋Ｓｃｏｐ処置からの測定値を示す。涙液分泌は、対照またはＢＡＣ処置のみと比較して、スコポラミン（Ｓｃｏｐ）の投与および塩化ベンザルコニウム＋スコポラミン（ＢＡＣ ＋ Ｓｃｏｐ）の投与から４週間の間、顕著に減少する。＊＊＊ ＝ ｐ＜０．００１。 治療開始前（−３日目、ベースライン）または治療開始後７、１４、２１および２８日目の角膜フルオレセイン染色スコアの測定値を示す。それぞれの日で、５本のバーは左から右に、無処置、疑似、ＢＡＣ、Ｓｃｏｐ、およびＢＡＣ＋Ｓｃｏｐ処置からの測定値を示す。角膜フルオレセイン染色は、対照と比較して、およびＢＡＣまたはＳｃｏｐいずれかのみでの処置と比較して、ＢＡＣ ＋ Ｓｃｏｐの投与から４週間の間、顕著に増加する。＊＊＊＊ ＝ ｐ＜０．０００１。 ＣＤ３１＋細胞染色の増加によって測定される角膜血管新生は、対照と比較して、およびＢＡＣまたはＳｃｏｐのみでの処置と比較して、ＢＡＣ ＋ Ｓｃｏｐ処置の眼球では増加する。 角膜血管スケルトニゼーション（新しい血管）の長さは、対照と比較して、およびＢＡＣまたはＳｃｏｐいずれかのみでの処置と比較して、ＢＡＣ ＋ Ｓｃｏｐで４週間処置した眼では劇的に増加する。 ＬＹＶＥ１細胞染色の増加によって測定されるリンパ管新生は、対照と比較して、およびＢＡＣまたはＳｃｏｐのみでの処置と比較して、ＢＡＣ ＋ Ｓｃｏｐ処置の眼球では増加する。 リンパ管スケルトニゼーションの長さは、対照と比較して、およびＢＡＣまたはＳｃｏｐいずれかのみでの処置と比較して、ＢＡＣ ＋ Ｓｃｏｐで４週間処置した眼では劇的に増加する。 眼窩外涙腺のフローサイトメトリーを示す。ＣＤ４５＋細胞のパーセントは、対照と比較して、Ｓｃｏｐ、ＢＡＣおよびＳｃｏｐ ＋ ＢＡＣで処置した細胞では増加する。

ヒトのドライアイ疾患（ＤＥＤ）の病態生理を反映する、動物にドライアイ疾患を誘発する方法が本明細書に開示されている。さらに、ＤＥＤの治療のための候補薬剤の試験など、誘発されたドライアイ疾患を持つ齧歯類動物の使用方法も開示されている。

ドライアイ疾患（ＤＥＤ）（ドライアイ症候群（ＤＥＳ）または乾性角結膜炎（ＫＣＳ）としても知られる）は、涙液分泌の減少、涙液層蒸発の増加、眼炎症、涙液の浸透圧（塩含量）の増加、および眼表面への損傷のうち一つ以上、二つ以上、三つ以上、またはそのすべてによって生理学的に特徴付けられる状態である。ＤＥＤの症状には、眼の不快感、視力障碍、および涙液層の不安定性が含まれる。

本明細書には、齧歯類動物にドライアイ疾患を誘発する方法が開示されている。方法には、動物にドライアイ疾患を誘発するために十分な量および時間での、抗コリン薬スコポラミン、および眼刺激物、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）の齧歯類動物への投与が関与する。結果として得られる眼疾患は、ヒトＤＳＤの複数の特徴を示す。

本明細書に開示されるアプローチの開発で、発明者らは、臨床的ヒト疾患と非常に類似したドライアイ疾患を齧歯類動物に誘発することができた。例えば、開示の方法で誘発されるドライアイ状態は実施するのが容易で、数週間継続しうる。さらに、開示の方法で作られる動物モデルは、ヒトのドライアイ疾患で一般的に見られる眼炎症および涙欠乏の両方を示す。従って、このモデルは、ドライアイの病態生理学的変化の試験およびＤＥＤを治療するための治療薬候補のテストを可能にする。

動物でのドライアイ疾患の創出
プロセスの第一ステップで、マウスまたはラットなどの齧歯類動物に、スコポラミンが抗コリン薬として投与され、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）が眼刺激物として投与される。

抗コリン薬は中枢および／または末梢神経系の神経伝達物質アセチルコリンを遮断する物質である。抗コリン薬の例には、例えば、スコポラミン、塩酸スコポラミン、スコポラミンメトブロミド、アトロピン、硝酸メチルアトロピン、および硫酸アトロピンが含まれる。本明細書に開示の方法では、抗コリン薬はスコポラミンまたは塩酸スコポラミンである。

開示の方法では、スコポラミンは全身的に投与される。全身投与の方法には、注射、経皮パッチ、および実験動物の継続的投薬を可能にする浸透圧ポンプなどのポンプの移植が含まれる。動物モデルでのこうした全身投与の方法は、当技術分野で知られている。特定の実施形態では、スコポラミンは浸透圧ミニポンプで投与される。適切な浸透圧ミニポンプには、例えば、ＡＬＺＥＴ浸透圧ポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州、クパチーノ）が含まれる。

ポンプを移植するために、齧歯類が麻酔され、皮下にポンプが装備される。ポンプはスコポラミンの制御量を提供する。スコポラミンの例示的濃度には、０．１〜４．０ｍｇ／体重２０ｇ／日、０．５〜３．５ｍｇ／体重２０ｇ／日、１．０〜３．０ｍｇ／体重２０ｇ／日、または約２．０ｍｇ／体重２０ｇ／日が含まれる。スコポラミンは、数日または数週間、例えば１、２、３、４週間またはそれ以上投与される。

眼刺激物は眼に刺激を生じる物質である。眼刺激物には、界面活性剤、保存剤、アレルゲン、微粒子、および乾燥剤または環境条件が含まれる。本明細書に開示の方法では、眼刺激物は塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）である。

開示の方法では、ＢＡＣは眼表面に局所的に投与される。ＢＡＣは、０．０５〜１．０％の濃度で投与でき、特定実施形態では０．１〜０．２％で、０．５〜２．０μｌ／用量の用量、例えば１μｌ／用量で投与することができる。投与は１日あたり１〜４回、例えば、１日２回を週に１〜３日とすることができる。一部の実施形態では、投与は１日２回を週に２日実施される。ＢＡＣの投与は、１週間以上、例えば１、２、３、４週間またはそれ以上実施することができる。

モデル動物のドライアイ状態の評価
ドライアイ疾患は、対照レベルと比較した、涙液分泌の減少および眼刺激の増加を検出することによってモデル動物で確認される。ドライアイは、対照レベルと比較した血管新生および／またはリンパ管新生の増加を検出することによってさらに確認できる。

本開示全体を通して、対照レベルは未処置齧歯類動物の眼のレベルを示す。評価が、全身適用された薬剤の有効性を対象とする場合、未処置の眼は未処置齧歯類動物の眼である。未処置動物は無処置（実質的に治療を受けていない）または疑似手術を受けた動物（動物に薬剤を送達しない、または生理食塩水などのプラセボを送達する移植ポンプを装備された、またはポンプの実際の移植なしに手術を受けた）でありうる。薬剤が全身的にではなく、眼に局所的に適用される場合、対照は一つの眼を処置した動物の未処置の眼ともしうる。スコポラミンおよびＢＡＣの投与によるドライアイ状態の誘発の評価という文脈では、対照レベルは未処置動物の眼のレベルである。

涙液分泌の減少は、対照レベルと比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％の涙液分泌の減少として特定される。涙液分泌の測定方法には、フェノールレッド綿糸（ＰＲＴ）検査およびシルマー試験が含まれる。ＰＲＴ検査では、動物が麻酔なしで拘束され、フェノールレッドを負荷した糸（ＺＯＮＥ−ＱＵＩＣＫなど、ＦＣＩ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｓ、マサチューセッツ州、ペンブローク）を２０秒間、内眼角または外眼角（目頭または目尻）に配置するか、または結膜嚢または涙嚢に接触させて涙液分泌を測定する。赤色に変わる（アルカリ性涙液で濡れることによるｐＨ変化から生じる）糸の量をミリメートル単位で測定する。次に手順をもう一方の眼で繰り返して、各マウスに対して２つの測定値を得る。シルマー試験は、涙の分泌を測定するために紙片を使用する。テストには、フィルター紙の小片を下瞼の内側（結膜嚢）に配置することが含まれる。紙片を数分間、定位置に維持する。次に紙を取り除き、水分量をｍｍで測定する。

眼刺激の増加は、眼内の、対照レベルと比較した、炎症細胞の増加、眼の炎症性サイトカインの増加、またはフルオレセイン染色の増加のうち一つ以上の検出によって特定される。

炎症細胞の増加は、対照レベルに対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％の一つ以上のタイプの炎症細胞／免疫細胞の増加である。炎症細胞／免疫細胞タイプには、骨髄細胞（好中球、単球、好酸球、および好塩基球を含む）およびリンパ球（Ｔ細胞およびＢ細胞を含む）が含まれる。炎症細胞は、当技術分野で知られたさまざまな方法によって検出および測定することができる。最も一般的には、炎症細胞は、特定細胞表面マーカーで細胞の存在／存在量を決定することによって決定される。例えば、骨髄細胞およびリンパ球の両方がＣＤ４５＋であり、従ってこのマーカーは非炎症細胞と比べて炎症細胞の存在を特定するために使用することができる。リンパ球特異的マーカーにはＣＤ３（Ｔ細胞を特定する）、ＣＤ４（ヘルパーＴ細胞を特定する）、ＣＤ８（細胞毒性Ｔ細胞を特定する）、およびＢ２２０またはＣＤ１９（Ｂ細胞を特定する）が含まれる。追加的細胞表面マーカー、ならびにこれらのマーカーを検出する抗体およびその他の薬剤が当技術分野で知られている。これらのマーカーを検出する抗体は、例えば、角膜組織の組織学的検査および組織切片の抗体染色によって、炎症細胞を特定するために使用することができる。これらのマーカーを検出する抗体は、特定マーカーの発現のために、染色する細胞集団に抗体を適用して、細胞をフローサイトメトリーで処理し、マーカーを発現している細胞を定量することによっても使用することができる。

炎症性サイトカインの増加は、対照レベルに対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％の一つ以上のタイプの炎症性サイトカインの増加である。炎症性サイトカインには、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３などのインターロイキン（ＩＬ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＧＦ−β（トランスフォーミング増殖因子−β）などの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＸＣＬ９、およびＩＦＮ−γなどのインターフェロン（ＩＦＮ）が含まれる。炎症性サイトカインの測定方法には、サンプル中のサイトカインを特定し定量するためにサイトカインを検出する抗体またはその他の薬剤を使用する、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫測定法が含まれる。

フルオレセイン染色の増加は、アメリカ国立眼科研究所（ＮＥＩ）スコアリングを使用した５、８、１０、または１２よりも大きなスコアである。フルオレセイン染色については、一般的には鎮静なしで、フルオレセインナトリウムを動物の眼表面に適用する。適用から数分後に、角膜フルオレセイン染色を、青色光を使用して顕微鏡下で採点する。擦過傷および炎症などの眼の不規則性は、健康な角膜組織と比較して大きな強度で蛍光を発する。アメリカ国立眼科研究所（ＮＥＩ）採点基準を使用して、蛍光を採点する。ＮＥＩ採点では、角膜の５つの部分（中央、上部、下部、鼻側および耳側）が蛍光に対して０〜３のスケールで個別に採点されるが、０は染色なしを示し、３は広範な染色を示し、眼あたりの最大スコアは１５である。異なる採点基準または蛍光技術を使用する場合、フルオレセイン染色の増加は、対照レベルと比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％の蛍光の増加として特定されることになろう。

角膜血管新生および／またはリンパ管新生の測定で、ドライアイをさらに確認することができる。血管新生およびリンパ管新生の調査については、動物を安楽死させて角膜を切除し、リンパ管内皮ヒアルロン酸受容体１（ＬＹＶＥ１）などのリンパ管に対する抗体など、新しいリンパ管形成を特定する薬剤、またはＣＤ３１の抗体、内皮前駆細胞マーカーなどの新しい血管形成を特定する薬剤と共に培養する。新しい血管またはリンパ管成長の領域の特定は、眼の状態の悪化およびドライアイ発症の追加的指標として使用できる。

ドライアイ疾患のための候補薬剤の試験
開示の齧歯類（ラットおよびマウス）はＤＥＤの試験およびドライアイの治療のための候補薬剤の試験に有用である。

従って、ドライアイの治療のための候補薬剤の有効性を試験する方法が本明細書に開示されており、方法には、開示の方法によって誘発されたＤＥＤを持つ動物に候補薬剤を投与する工程、およびＤＥＤを治療するための候補薬の能力を試験する工程が関与する。

「治療する」とは、ＤＥＤの症状または状態を改善すること、またはＤＥＤの防止（例えば、発症を防止もしくは遅延する、またはＤＥＤの発病を制限すること）を意味する。

「試験薬剤」および「候補薬剤」という用語は本明細書では互換的に使用され、ドライアイの治療のために意図された任意の薬剤を指す。薬剤は、遺伝子組み換え、修飾もしくは天然核酸分子、修飾もしくは天然ペプチド、抗体を含む合成、修飾もしくは天然ポリペプチド、または小分子を含む有機もしくは無機化合物でありうる。「小分子」という用語は、３０００ダルトン未満、好ましくは２０００または１５００未満、より好ましくは１０００または８００ダルトン未満の分子質量を持つ化合物を指す。

評価される試験薬剤は、局所的または全身的に動物に投与することができる。例えば、薬剤は、点眼薬または鼻腔内スプレーの形態で投与しうる。あるいは、薬剤は、経口的または非経口的に投与でき、非経口的に投与される場合、溶液、懸濁液、軟膏、注射、座薬などの形態としうる。候補薬剤の適正用量は、動物の体重および投与経路に基づいて決定されうる。そのタイミングおよび回数など、投与の条件も、使用される薬剤に応じて決定される。

ＤＥＤ誘発開始時の候補薬剤の投与
一つの実施形態では、候補薬剤はＤＥＤ誘発の開始と同時に投与される。一部の実施形態では、試験される齧歯類動物のセットが、無処置（未処置）、疑似（生理食塩水の全身投与、ポンプの移植はするがスコポラミン処置はなし、またはポンプの実際の移植なしでのポンプ移植と類似した手術）、塩化ベンザルコニウム＋スコポラミン（ＢＡＣ＋Ｓｃｏｐ）、試験薬剤のみ、または試験薬剤＋ＢＡＣ＋Ｓｃｏｐといった群に無作為化される。試験薬剤群の動物には、ドライアイ誘発の開始と同時に、つまり、ＤＥＤ誘発の開始と同じ日または同じ週の間に始めて、候補薬剤が投与される。すべての治療は少なくとも１、２、３または４週間実施される。涙液分泌および角膜フルオレセイン染色は７、１４、２１、および２８日目に測定される。２８日目に、動物を安楽死させ、さらなる調査のために眼窩外涙腺および角膜を採取しうる。

ＤＥＤの発症を防止する、遅延する、またはＤＥＤの発病を制限する候補薬剤の能力は、対照レベルと類似したレベルに涙液分泌を維持する、および／または眼刺激を防止もしくは制限する候補薬剤の能力を検出することによって決定される。この文脈では、対照レベルは、未処置の眼（すなわち、候補薬剤の治療を受けない眼）のレベルであり、これにはスコポラミンおよび塩化ベンザルコニウムを投与されているが候補薬剤は投与されていない動物の眼、またはスコポラミンおよび塩化ベンザルコニウムに加えて候補薬剤を投与されている動物の眼の一つであって、候補薬剤が同じ動物のもう一方の眼に局所的に適用されているものを含みうる。

一つの実施形態では、試験薬剤＋ＢＡＣ＋Ｓｃｏｐを投与されている動物はＤＥＤを発病しない、つまり、涙液分泌は試験全体を通して対照レベルに、もしくはその５％、１０％、もしくは１５％以内に維持される、および／または炎症細胞のレベルで測定される眼炎症のレベル、眼の炎症性サイトカインのレベル、および／またはフルオレセイン染色スコアは、試験全体を通して対照レベルに、もしくはその５％、１０％、もしくは１５％以内に維持される。

別の実施形態では、試験薬剤＋ＢＡＣ＋Ｓｃｏｐを投与されている動物はＤＥＤ症状の発症の遅延を示す、つまり、ＢＡＣ＋Ｓｃｏｐは投与されているが候補薬剤は投与されていない動物と比べて、涙液分泌の減少および眼刺激の発症が１、２、または３週間遅延する。

別の実施形態では、試験薬剤＋ＢＡＣ＋Ｓｃｏｐを投与されている動物はより軽度のＤＥＤ症状を発症する、つまり、涙液分泌の減少および／または眼刺激がこれらの動物で起こるが、この涙液分泌の減少および眼刺激は、ＤＥＤ誘発処置を受けていない動物（例えば、無処置の動物）のレベルと、ＢＡＣ＋Ｓｃｏｐを投与されているが試験薬剤は投与されていない動物で観察されるレベルの間の中間レベルで起こる。

ＤＥＤ誘発に続く候補薬剤の投与
別の実施形態では、候補薬剤はＤＥＤ誘発の開始後に投与される。一部の実施形態では、試験薬剤群の動物は、ドライアイ誘発開始後１〜２週間してから、すなわちドライアイ誘発開始後７〜１４日目に候補薬剤の投与が開始される。試験薬剤は１〜３週間投与される。涙液分泌および角膜フルオレセイン染色は、ドライアイ誘発開始から７、１４、２１、および２８日目に測定される。２８日目に、動物を安楽死させ、さらなる調査のために眼窩外涙腺および角膜を採取しうる。

ＤＥＤを治療するための候補薬剤の能力は、対照レベルと比較して、候補薬剤およびＢＡＣ＋Ｓｃｏｐを投与されている動物の涙液分泌の増加、および／または眼刺激の減少を検出することによって決定され、この文脈では、対照レベルはＢＡＣ＋Ｓｃｏｐを投与されているが候補薬剤は投与されていない動物の眼のレベルでありうる。

（実施例１）動物でのドライアイ状態の創出
動物。動物に関連する手順すべてがＲｅｇｅｎｅｒｏｎ ＩＡＣＵＣによって審査・承認され、ＡＲＶＯ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈに準拠して実施された。成体Ｃ５７ＢＬ／６マウス（生後８〜１０週間）をＴａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ニューヨーク州、ジャーマンタウン）から購入した。

ドライアイモデルの誘発。成体オスＣ５７ＢＬ／６マウス２７匹が、無処置（未処置）、疑似（ポンプ移植の手術と同等の手術を受けるが、ポンプの実際の移植は受けず、スコポラミンまたはＢＡＣ処置も受けない）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、スコポラミン（Ｓｃｏｐ）またはＢＡＣ＋Ｓｃｏｐ群に無作為化された。

スコポラミンポンプの移植。Ｓｃｏｐ群については、４週間持続するＳｃｏｐが充填された（２ｍｇ／体重２０ｇ／日）浸透圧ポンプをマウスの皮下に移植した。マウスはケタミン（１２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）で麻酔をかけた。無菌顕微鏡下手術技術および手術顕微鏡を使用して、ミニ浸透圧ポンプを背中の皮膚の下に配置してから、皮膚を縫合し、感染を防ぐためにエリスロマイシン眼軟膏を創傷に塗った。

塩化ベンザルコニウム治療。ＢＡＣ治療については、１μｌの０．１〜０．２％ ＢＡＣを右目の眼表面に１日２回、週２日、４週間にわたって局所投与した。

涙液分泌測定値および角膜フルオレセイン染色スコア。涙液分泌および角膜フルオレセイン染色は、週１回、７、１４、２１、および２８日目に実施された。涙液分泌測定については、動物を拘束して、フェノールレッド綿糸を眼の側方嚢の上に（角膜に触れることなく）置き、１分間、定位置に保持した。糸の濡れた部分を涙液分泌としてｍｍで測定した。フルオレセイン染色については、０．５μｌの２％フルオレセインナトリウムを眼表面上に適用した。適用から５分後に、アメリカ国立眼科研究所（ＮＥＩ）採点基準を使用して顕微鏡下、角膜フルオレセイン染色を採点した。ＮＥＩ採点については、角膜を５つの部分（中央、上部、下部、鼻側および耳側）に分け、それぞれが蛍光に対して０〜３のスケールで個別に採点されるが、０は染色なしを示し、３は広範な染色を示し、眼あたりの最大スコアは１５である。

角膜血管新生、リンパ管新生および涙腺浸潤の定量。ドライアイの誘発後２８日目に、ケタミン（１２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）の深い麻酔下、角膜血管新生およびリンパ管新生の試験のために、眼球を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に採取した。免疫細胞浸潤を調べるため、眼窩外涙腺をフローサイトメトリー用に採取した。

組織学的分析。角膜を眼球から切除し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中の１０％正常ロバ血清および１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で室温で１時間ブロックし、抗体非特異的部位をブロックした。次に、サンプルをＰＢＳ中洗浄し、リンパ管内皮ヒアルロン酸受容体１（ＬＹＶＥ１）に対する抗体（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．、ニューヨーク州、タリータウン）の１：１０００、およびＣＤ３１に対する抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州、サンタクルーズ）の１：１００のカクテルと共に４℃で一晩培養した。その後サンプルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、二次抗体結合染料、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ロバ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）１：１００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ２１２０８、ニューヨーク州、グレースランド）およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５９４ロバ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）１：４００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ２１２０７）と共に室温で２時間培養した。培養後、サンプルをＰＢＳ中で洗浄し、ガラススライド上に平らに載せた。染色血液およびリンパ管の画像を、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ）に取り付けたデジタルＲＴ ＳＥ Ｓｐｏｔカメラを使用して捕捉した。画像分析のために画像ソフトウェアを使用した。

フローサイトメトリー。切除後、眼窩外涙腺を、３％ウシ胎児血清溶液（ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に配置した。涙腺はＭＡＣＳ ｇｅｎｔｌｅ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カリフォルニア州、サンディエゴ）プログラム脾臓−０４で分離した。細胞懸濁液を７０ ｕｍストレーナー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カリフォルニア州、サンディエゴ）でろ過し、組織片を除去した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（３％ ＦＢＳおよび２ ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で一回洗浄した。洗浄した細胞を、ＦｃＲ遮断抗体（１：５０希釈）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カリフォルニア州、サンディエゴ）を含むＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、４°Ｃで１５分間培養した。細胞を遠心沈殿させてＦｃＲ遮断抗体を除去し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｂｌｕｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（１：５００希釈）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＣＤ４５ ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、Ｃｌｏｎｅ ３０−Ｆ１１、Ｒａｔ ＩｇＧ２ｂ（１：１００希釈）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共にさらに染色した。細胞を４°Ｃで２５分間染色し、その後ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次に細胞をＳｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｆｉｘａｔｉｖｅ（ＢＤ）中に再懸濁し、会社により提供された標準プロトコルに従ってＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析した。データはＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、オレゴン州、アシュランド）で分析した。

統計分析。二元配置ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定（角膜血管長さ、リンパ管長さ試験のみに対して実施された）およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ （バージョン６．０ａ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、サンディエゴ）を使用して、パラメータデータの統計分析が実施された。データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示されている。０．０５未満のｐ値が統計的に有意であると見なされた。＊ ＝ ｐ＜０．０５； ＊＊ ＝ ｐ＜０．０１； ＊＊＊ ＝ ｐ＜０．００１； ＊＊＊＊ ＝ ｐ＜０．０００１。

結果。図１Ａに示されるように、Ｓｃｏｐの全身送達＋ＢＡＣの局所投与後の涙液分泌は有意に減少した。さらに、角膜染色スコアは顕著に増加した（図１Ｂ）。Ｓｃｏｐ＋Ｂａｃ投与から１週間後の変化は明白であった。

さらに、図２Ａおよび２Ｂに示されるように、角膜血管スケルトニゼーション長さは、４週間のＢＡＣ＋Ｓｃｏｐ処置後、有意に増加した。同様に、図２Ｃおよび２Ｄに示されるように、角膜リンパ管スケルトニゼーション長さは４週間のＢＡＣ＋Ｓｃｏｐ処置後、増加した。

さらに図３に示されるように、眼窩外涙腺は、４週間の処置後、免疫細胞浸潤を含んでいた。
（実施例２）ドライアイの発症を防止または阻害する候補薬剤の能力の試験

ドライアイの発病を予防または阻害する候補薬剤の有効性の試験については、マウスのセットが、無処置（未処置）、疑似（ポンプ移植と同等の手術を受けるが、ポンプの実際の移植は受けず、スコポラミンまたはＢＡＣ処置も受けない）、塩化ベンザルコニウム＋スコポラミン（ＢＡＣ＋Ｓｃｏｐ）、試験薬剤のみ、または試験薬剤＋ＢＡＣ＋Ｓｃｏｐといった群に無作為化される。

ドライアイは上述のように誘発される。ＢＡＣ＋Ｓｃｏｐ処置については、スコポラミン（２ｍｇ／体重２０ｇ／日）を送達する浸透圧ポンプをマウスの皮下に移植し、１μｌの０．１〜０．２％ ＢＡＣを、右目の眼表面に１日２回、週２日、局所投与する。

試験薬剤群の動物には、ドライアイ誘発の開始と同じ日に、候補薬剤投与が開始される。候補薬剤は、点眼薬、鼻腔内スプレーの形態で、または注射用溶液の形態で非経口的に動物に投与される。候補薬剤の適正用量および投与頻度は、動物の体重および投与経路に基づいて決定される。投与のタイミングおよび頻度は使用される薬剤に依存する。すべての治療は少なくとも１、２、３または４週間実施される。涙液分泌および角膜フルオレセイン染色は７、１４、２１、および２８日目に測定される。２８日目に、動物を安楽死させ、フローサイトメトリーおよび組織学のために眼窩外涙腺および角膜を採取する。角膜血管新生およびリンパ管新生も定量される。

候補薬剤の有効性は、対照レベル（例えば、スコポラミンおよび塩化ベンザルコニウムを投与されているが候補薬剤は投与されていない動物の眼でのレベル）と比較して、候補薬剤が涙液分泌維持する、および／または眼刺激を防止または制限する能力を検出することによって決定される。
（実施例３）ドライアイ状態を治療する候補薬の能力の試験

ドライアイを治療する候補薬剤の有効性の試験については、マウスのセットが、無処置（未処置）、疑似（ポンプ移植と同等の手術を受けるが、ポンプの実際の移植は受けず、スコポラミンまたはＢＡＣ処置も受けない）、塩化ベンザルコニウム＋スコポラミン（ＢＡＣ＋Ｓｃｏｐ）、試験薬剤のみ、または試験薬剤＋ＢＡＣ＋Ｓｃｏｐといった群に無作為化される。

ドライアイは上述のように誘発される。ＢＡＣ＋Ｓｃｏｐ処置については、スコポラミン（２ｍｇ／体重２０ｇ／日）を送達する浸透圧ポンプをマウスの皮下に移植し、１μｌの０．１〜０．２％ ＢＡＣを、右目の眼表面に１日２回、週２日、局所投与する。ドライアイ誘発方法は、少なくとも１、２、３、または４週間継続する。

試験薬剤群の動物は、ドライアイ誘発開始後１〜２週間してから、例えば、ドライアイ誘発開始後７〜１４日目に候補薬剤の投与が開始される。候補薬剤は、点眼薬、鼻腔内スプレーの形態で、または注射用溶液の形態で非経口的に動物に投与される。候補薬剤の適正用量および投与頻度は、動物の体重および投与経路に基づいて決定される。投与のタイミングおよび頻度は使用される薬剤に依存する。試験薬剤は１〜３週間投与される。涙液分泌および角膜フルオレセイン染色は、ドライアイ誘発開始から７、１４、２１、および２８日目に測定される。２８日目に、動物を安楽死させ、フローサイトメトリーおよび組織学のために眼窩外涙腺および角膜を採取する。角膜血管新生およびリンパ管新生も定量される。

有効性は、対照レベル（例えば、ＢＡＣ＋Ｓｃｏｐを投与されているが候補薬剤は投与されていない動物の眼のレベル）と比較して、候補薬剤およびＢＡＣ＋Ｓｃｏｐを投与されている動物の涙液分泌の増加、および／または眼刺激の減少を検出することによって決定される。

Claims (21)

1. 齧歯類動物にドライアイ疾患を誘発する方法であって、スコポラミンおよび塩化ベンザルコニウムの前記齧歯類動物への投与を含む方法。
2. 前記齧歯類がマウスまたはラットである、請求項１に記載の方法。
3. スコポラミンが注入ポンプの移植によって投与される、請求子１に記載の方法。
4. スコポラミンが０．４〜４．０ｍｇ／体重２０ｇ／日の濃度で投与される、請求項３に記載の方法。
5. 塩化ベンザルコニウムが前記齧歯類動物の眼表面に局所的に投与される、請求項１に記載の方法。
6. 塩化ベンザルコニウムが０．０５〜０．４％の濃度で１日１〜４回投与される、請求項５に記載の方法。
7. スコポラミンおよび塩化ベンザルコニウムが前記齧歯類動物に最大２か月間投与される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
8. スコポラミンおよび塩化ベンザルコニウムが前記齧歯類動物に２〜４週間投与される、請求項６に記載の方法。
9. 前記ドライアイ状態が対照レベルと比較して、処置された眼の涙液分泌の減少および眼刺激の増加によって特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
10. 涙液分泌の減少が、対照レベルと比較して少なくとも１０％の涙液分泌の減少を検出することによって検出される、請求項９に記載の方法。
11. 前記眼刺激の増加が、眼内の、対照レベルと比較した、炎症細胞の増加、眼の炎症性サイトカインの増加、またはフルオレセイン染色の増加のうち一つ以上の検出によって測定される、請求項９に記載の方法。
12. ドライアイの治療のための候補薬剤の有効性を試験する方法であって、齧歯類動物を提供する工程、スコポラミンおよび塩化ベンザルコニウムを前記齧歯類動物に投与して前記齧歯類動物にドライアイを誘発する工程、前記候補薬剤を前記齧歯類動物に投与する工程、および前記候補薬剤が前記齧歯類動物のドライアイ治療に効果的かどうかを決定する工程を含む方法。
13. 前記候補薬剤が、スコポラミンおよび塩化ベンザルコニウムの投与開始から少なくとも７日後に投与される、請求項１３に記載の方法。
14. 前記候補薬剤が、スコポラミンおよび塩化ベンザルコニウムの投与開始から少なくとも１４日後に投与される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記候補薬剤が、スコポラミンおよび塩化ベンザルコニウムの投与開始から少なくとも２８日後に投与される、請求項１３に記載の方法。
16. 前記候補薬剤が局所的または全身的に投与される、請求項１３に記載の方法。
17. 前記局所投与が、前記齧歯類動物の眼または鼻への、液滴、スプレーまたはゲル形態の前記候補薬剤の投与である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記全身投与が、経口投与、注射、または注入から選択される、請求項１６に記載の方法。
19. 前記候補薬剤の有効性が、スコポラミンおよび塩化ベンザルコニウムを投与されているが前記候補薬剤は投与されていない動物と比較して、涙液分泌の増加および／または眼刺激の減少を検出することによって決定される、請求項１３に記載の方法。
20. 前記候補薬剤が、スコポラミンおよび塩化ベンザルコニウムの投与開始と同時に投与される、請求項１２に記載の方法。
21. 前記候補薬剤の有効性が、スコポラミンおよび塩化ベンザルコニウムを投与されているが前記候補薬剤は投与されていない動物と比較して、涙液分泌の減少を制限または排除するおよび／または眼刺激の増加を制限または排除する前記候補薬剤の能力に基づいて決定される、請求項２０に記載の方法。