JP2018145154A - ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカン - Google Patents
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Abstract
【課題】プロテオグリカンにおいて、ヒアルロン酸産生能が改善されたプロテオグリカンを提供する。【解決手段】以下の１）〜５）を全て満たすプロテオグリカン。１）赤外吸収スペクトルにおいて、１２３４±１０ｃｍ−１の吸光度に対する１４１７±１０ｃｍ−１の吸光度の比が０．８以上、４８１±１０ｃｍ−１の吸光度に対する５８８±１０ｃｍ−１の吸光度の比が１．１以下、２）７０℃で測定した重水中におけるプロトン核磁気共鳴スペクトルにおいて、４．７３±０．０５ｐｐｍの積分値を１とした場合に、４．０１±０．０５ｐｐｍの積分値は５以上、１．９０±０．０５ｐｐｍの積分値は０．１以上、３）乾燥重量１ｇ当たり、カルシウムイオン０．４ｍｍｏｌ以下、かつ一価のカチオン１．６ｍｍｏｌ以上、４）アルギニンに対するセリンの重量比が５．２以下、５）炭素含量に対する硫黄含量の重量比が０．２以上。【選択図】図３
Description
本発明は、ヒアルロン酸産生能が改善された新規プロテオグリカンに関する。
ヒアルロン酸は細胞外マトリックス成分として、生体内に広く存在しており、特に、関節部位に多い。ヒアルロン酸は、他の生体成分と複雑な相互作用を有し、細胞の接着、増殖、分化など細胞の維持や活動に重要な働きに関与していると言われている。ヒアルロン酸は高い保水性を有し、人の皮膚の真皮に多く存在し、線維芽細胞が作り出すことが知られており、皮膚の潤いや張りに関与することから、皮膚の健康や美容に影響する。一般に加齢とともに皮膚のヒアルロン酸は減少し、肌荒れやカサつきの原因の一つである。
皮膚の健康や美容を保つため、細胞増殖因子様作用と保水性を有する物質が求められている。近年、プロテオグリカンは細胞増殖因子様作用ばかりでなくヒアルロン酸産生能も有することが明らかにされてきた（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２）。しかし、プロテオグリカンのヒアルロン酸産生能は弱いという欠点があった。
Ｆｏｏｄ Ｓｔｙｌｅ ２１、第１３巻Ｎｏ．１、７０−７２頁、２００９年
Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ、第４２巻Ｎｏ．１、３８−４３頁、２０１４年
本発明は、ヒアルロン酸産生能が改善されたプロテオグリカンを提供することを目的とした。
上記課題を達成するためのプロテオグリカンは、以下の１）〜５）を全て満たすプロテオグリカンである。
１）ＫＢｒディスク透過法により測定した赤外吸収スペクトルにおいて、波数１４１７±１０ｃｍ−１、１２３４±１０ｃｍ−１、５８８±１０ｃｍ−１、４８１±１０ｃｍ−１すべてに吸収ピークを有し、かつ１２３４±１０ｃｍ−１の吸光度に対する１４１７±１０ｃｍ−１の吸光度の比が０．８以上、４８１±１０ｃｍ−１の吸光度に対する５８８±１０ｃｍ−１の吸光度の比が１．１以下である。
２）７０℃で測定した重水中におけるプロトン核磁気共鳴スペクトルにおいて、４．７３±０．０５ｐｐｍ、４．０１±０．０５ｐｐｍ、１．９０±０．０５ｐｐｍすべてにシグナルを有し、かつ４．７３±０．０５ｐｐｍの積分値を１とした場合に、４．０１±０．０５ｐｐｍの積分値は５以上、１．９０±０．０５ｐｐｍの積分値は０．１以上である。
３）乾燥重量１ｇ当たり、カルシウムイオン０．４ｍｍｏｌ以下、かつ一価のカチオンを１．６ｍｍｏｌ以上含んでいる。
４）アルギニンに対するセリンの重量比が５．２以下である。
５）炭素含量に対する硫黄含量の重量比が０．２以上である。
１）ＫＢｒディスク透過法により測定した赤外吸収スペクトルにおいて、波数１４１７±１０ｃｍ−１、１２３４±１０ｃｍ−１、５８８±１０ｃｍ−１、４８１±１０ｃｍ−１すべてに吸収ピークを有し、かつ１２３４±１０ｃｍ−１の吸光度に対する１４１７±１０ｃｍ−１の吸光度の比が０．８以上、４８１±１０ｃｍ−１の吸光度に対する５８８±１０ｃｍ−１の吸光度の比が１．１以下である。
２）７０℃で測定した重水中におけるプロトン核磁気共鳴スペクトルにおいて、４．７３±０．０５ｐｐｍ、４．０１±０．０５ｐｐｍ、１．９０±０．０５ｐｐｍすべてにシグナルを有し、かつ４．７３±０．０５ｐｐｍの積分値を１とした場合に、４．０１±０．０５ｐｐｍの積分値は５以上、１．９０±０．０５ｐｐｍの積分値は０．１以上である。
３）乾燥重量１ｇ当たり、カルシウムイオン０．４ｍｍｏｌ以下、かつ一価のカチオンを１．６ｍｍｏｌ以上含んでいる。
４）アルギニンに対するセリンの重量比が５．２以下である。
５）炭素含量に対する硫黄含量の重量比が０．２以上である。
本発明の上記特徴を有するプロテオグリカンは、安全で、従来のプロテオグリカンより、ヒアルロン酸産生能が高いものである。
以下、実施の形態をより具体的に説明する。本発明の技術的思想を具体化するための方法を例示するものであって、本発明の技術的思想は、下記のものに特定するものではない。本発明の技術的思想は、特許請求の範囲に記載された請求項が規定する技術的範囲内において、種々の変更を加えることができる。
プロテオグリカンは、動物や魚類に存在するグリコサミノグリカンとタンパク質の共有結合物からなる分子量数十万から数百万の天然高分子化合物である。プロテオグリカンは、糖タンパク質の一種であるが、グリコサミノグリカンの重量構成比が７０％以上であり、ウロン酸とアミノ糖がほぼ当量で大部分を占めており、タンパク質量は一般の糖タンパク質に比較し少ない。また、特徴として、グリコサミノグリカンのヒドロキシ基に硫酸基がエステル結合している割合が高い。
プロテオグリカンは、起源となる生物や抽出・製造条件により、分子量や含まれる糖（ウロン酸、アミノ糖、中性糖など）やアミノ酸の種類や含有量、比率も異なっているが、本発明の原料となるプロテオグリカンは、起源となる生物や抽出・製造条件を問わない。
より具体的に本発明は、以下の１）から５）の全ての要件を満たすプロテオグリカンである。１）ＫＢｒディスク透過法により測定した赤外吸収スペクトルにおいて、波数１４１７±１０ｃｍ−１、１２３４±１０ｃｍ−１、５８８±１０ｃｍ−１、４８１±１０ｃｍ−１すべてに吸収ピークを有し、かつ１２３４±１０ｃｍ−１の吸光度に対する１４１７±１０ｃｍ−１の吸光度の比が０．８以上、４８１±１０ｃｍ−１の吸光度に対する５８８±１０ｃｍ−１の吸光度の比が１．１以下である。２）７０℃で測定した重水中におけるプロトン核磁気共鳴スペクトルにおいて、４．７３±０．０５ｐｐｍ、４．０１±０．０５ｐｐｍ、１．９０±０．０５ｐｐｍすべてにシグナルを有し、かつ４．７３±０．０５ｐｐｍの積分値を１とした場合に、４．０１±０．０５ｐｐｍの積分値は５以上、１．９０±０．０５ｐｐｍの積分値は０．１以上である。３）乾燥重量１ｇ当たり、カルシウムイオン０．４ｍｍｏｌ以下、かつ一価のカチオンを１．６ｍｍｏｌ以上含んでいる。４）含有するタンパク質のうち、アルギニンに対するセリンの重量比が５．２以下である。５）炭素含量に対する硫黄含量の重量比が０．２以上である。
本発明品は、原料となるプロテオグリカンを、０．１ｍｏｌ濃度以下の水酸化ナトリウムや水酸化カリウム、炭酸ナトリウムなどのアルカリ性溶液に数時間接触させ、その後、アルカリ溶液を除去することにより、容易に製造することができる。
本発明のヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの使用について、その製品形態により異なるが、本発明品をおおよそ０．０１重量％以上含んだ状態で使用するのが好ましい。
本発明のヒアルロン酸産生改善とは、細胞が産生するヒアルロン酸量が増加する作用を示すことをいう。
本発明のヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンは水溶性であることから、そのまま固体での使用以外にも、水溶液に溶解した状態でも使用可能であり、ハンドリングに優れている。化粧料として使用する場合は、化粧水、乳液、クリームなどに容易に添加することができる。医薬用的な利用として、皮膚へ塗布するクリームや貼付剤の原料の一部として添加してもよい。また、他の原材料と一緒にカプセルの中に封じ込めたり、錠剤化してもよい。
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これは単に例示の目的で述べるものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの調製）
原料のプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（角弘プロテオグリカン研究所）を購入し、用いた（以降、「原料ＰＧ」と表記する）。原料ＰＧ０．１０ｇを脱イオン水５０ｍＬへ溶解した溶液へ、０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を５０ｍＬ加え、４℃で３時間撹拌した。次に４℃の低温室内において、溶液全量を透析用セルロースチューブ（エーディア（株））に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析し、水酸化ナトリウム水溶液を脱イオン水へ置換した。外液は１日に３回交換した。３日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、ロータリーエバポレーター（東京理科器械（株））にて濃縮した後、凍結乾燥（東京理科器械（株））し、０．０９ｇの白色綿状固体のヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンを得た。
原料のプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（角弘プロテオグリカン研究所）を購入し、用いた（以降、「原料ＰＧ」と表記する）。原料ＰＧ０．１０ｇを脱イオン水５０ｍＬへ溶解した溶液へ、０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を５０ｍＬ加え、４℃で３時間撹拌した。次に４℃の低温室内において、溶液全量を透析用セルロースチューブ（エーディア（株））に入れ、チューブの両端をクリップ留めし、脱イオン水を外液にして透析し、水酸化ナトリウム水溶液を脱イオン水へ置換した。外液は１日に３回交換した。３日後、透析用セルロースチューブ内液を回収し、ロータリーエバポレーター（東京理科器械（株））にて濃縮した後、凍結乾燥（東京理科器械（株））し、０．０９ｇの白色綿状固体のヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンを得た。
（水分含量）
実施例１に係るヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの水分含量を、熱天秤装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｌｕｓ ＴＧ８２１０、（株）リガク）にて、１２５℃で試料重量が恒量となるまで加熱し、重量減少分を試料に含まれていた水分とした。その結果、ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの水分含量は１０．４重量％であった。同様に、比較例の原料ＰＧの水分含量について分析したところ９．７重量％であった。なお、以降の実施例に記述した乾燥重量は、ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカン中に含まれる水分含量（１０．４重量％）および原料ＰＧの水分含量（９．７重量％）を除去した重量とした。
実施例１に係るヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの水分含量を、熱天秤装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｌｕｓ ＴＧ８２１０、（株）リガク）にて、１２５℃で試料重量が恒量となるまで加熱し、重量減少分を試料に含まれていた水分とした。その結果、ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの水分含量は１０．４重量％であった。同様に、比較例の原料ＰＧの水分含量について分析したところ９．７重量％であった。なお、以降の実施例に記述した乾燥重量は、ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカン中に含まれる水分含量（１０．４重量％）および原料ＰＧの水分含量（９．７重量％）を除去した重量とした。
（ウロン酸量の測定）
実施例１に係るヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンのウロン酸含量をカルバゾール硫酸法で求めた。ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの０．２ｍｇ／ｍＬ水溶液０．２５ｍＬに、カルバゾール溶液０．０５ｍＬと濃硫酸１．５ｍＬを添加して撹拌し、２０分間１００℃で加熱した。放冷後、分光光度計（Ｕ−３４１０、（株）日立製作所）で５３５ｎｍの吸光度を測定した。グルクロン酸（シグマアルドリッチ社）を標準物質として作成した検量線より、ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンのウロン酸含量は乾燥重量当たり４６．３重量％と算出された。同様に原料ＰＧのウロン酸について分析したところ、乾燥重量当たり４６．６重量％であった。
実施例１に係るヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンのウロン酸含量をカルバゾール硫酸法で求めた。ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの０．２ｍｇ／ｍＬ水溶液０．２５ｍＬに、カルバゾール溶液０．０５ｍＬと濃硫酸１．５ｍＬを添加して撹拌し、２０分間１００℃で加熱した。放冷後、分光光度計（Ｕ−３４１０、（株）日立製作所）で５３５ｎｍの吸光度を測定した。グルクロン酸（シグマアルドリッチ社）を標準物質として作成した検量線より、ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンのウロン酸含量は乾燥重量当たり４６．３重量％と算出された。同様に原料ＰＧのウロン酸について分析したところ、乾燥重量当たり４６．６重量％であった。
（タンパク質量の測定）
実施例１に係るヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンのタンパク質含量をローリー法で求めた。ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの１．０ｍｇ／ｍＬ水溶液０．２ｍＬに、アルカリ性銅溶液（２％炭酸ナトリウム（０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液）：０．５％硫酸銅（１％酒石酸ナトリウム水溶液）＝５０：１（ｖ：ｖ））１．０ｍＬを添加して、撹拌し、１０分間静置し、水で２倍に希釈したフォーリン＆チオカルト−フェノール試薬（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＬＬＣ）０．１ｍＬを添加して３０分静置し、分光光度計（Ｕ−３４１０、（株）日立製作所）で７５０ｎｍの吸光度を測定した。牛血清アルブミン（生化学工業（株））を標準物質として作成した検量線より、ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンのタンパク質含量は乾燥重量当たり８．４重量％と算出された。同様に原料ＰＧのタンパク質について分析したところ、乾燥重量当たり９．５重量％であった。
実施例１に係るヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンのタンパク質含量をローリー法で求めた。ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの１．０ｍｇ／ｍＬ水溶液０．２ｍＬに、アルカリ性銅溶液（２％炭酸ナトリウム（０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液）：０．５％硫酸銅（１％酒石酸ナトリウム水溶液）＝５０：１（ｖ：ｖ））１．０ｍＬを添加して、撹拌し、１０分間静置し、水で２倍に希釈したフォーリン＆チオカルト−フェノール試薬（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＬＬＣ）０．１ｍＬを添加して３０分静置し、分光光度計（Ｕ−３４１０、（株）日立製作所）で７５０ｎｍの吸光度を測定した。牛血清アルブミン（生化学工業（株））を標準物質として作成した検量線より、ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンのタンパク質含量は乾燥重量当たり８．４重量％と算出された。同様に原料ＰＧのタンパク質について分析したところ、乾燥重量当たり９．５重量％であった。
（赤外吸収スペクトルの測定）
実施例１で得られたヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの赤外吸収スペクトルをＫＢｒディスク透過法で測定した。赤外吸収スペクトルは、フーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴ／ＩＲ−４２０、日本分光（株））を用いて、測定範囲４０００〜４００ｃｍ−１、分解能４ｃｍ−１、積算回数６５、スキャンスピード２ｍｍ／秒の条件で測定した。図１のグラフの横軸は波数（ｃｍ−１）を表し、縦軸は吸光度を表す。図１において、山となっている部分が吸収ピークであり、吸収ピークに記載された数字１〜４は、ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの特徴的なピークを示す。ピーク１は波数１４１７ｃｍ−１で吸光度０．１７、ピーク２は波数１２３４ｃｍ−１で吸光度０．２０、ピーク３は波数５８８ｃｍ−１で吸光度０．１８、ピーク４は波数４８１ｃｍ−１で吸光度０．１７であった。波数１２３４ｃｍ−１の吸光度に対する１４１７ｃｍ−１の吸光度の比は０．８３、４８１ｃｍ−１の吸光度に対する５８８ｃｍ−１の吸光度の比は１．０７であった。
実施例１で得られたヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの赤外吸収スペクトルをＫＢｒディスク透過法で測定した。赤外吸収スペクトルは、フーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴ／ＩＲ−４２０、日本分光（株））を用いて、測定範囲４０００〜４００ｃｍ−１、分解能４ｃｍ−１、積算回数６５、スキャンスピード２ｍｍ／秒の条件で測定した。図１のグラフの横軸は波数（ｃｍ−１）を表し、縦軸は吸光度を表す。図１において、山となっている部分が吸収ピークであり、吸収ピークに記載された数字１〜４は、ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの特徴的なピークを示す。ピーク１は波数１４１７ｃｍ−１で吸光度０．１７、ピーク２は波数１２３４ｃｍ−１で吸光度０．２０、ピーク３は波数５８８ｃｍ−１で吸光度０．１８、ピーク４は波数４８１ｃｍ−１で吸光度０．１７であった。波数１２３４ｃｍ−１の吸光度に対する１４１７ｃｍ−１の吸光度の比は０．８３、４８１ｃｍ−１の吸光度に対する５８８ｃｍ−１の吸光度の比は１．０７であった。
比較例として、原料ＰＧの赤外吸収スペクトルをＫＢｒディスク透過法で同様に測定した。図２はその結果であり、横軸は波数（ｃｍ−１）を表し、縦軸は吸光度を表す。山となっている部分が吸収ピークであり、吸収ピークに記載された数字１〜４は、プロテオグリカンの特徴的なピークを示す。ピーク１は波数１４２１ｃｍ−１で吸光度０．２３、ピーク２は波数１２３０ｃｍ−１で吸光度０．３１、ピーク３は波数５８８ｃｍ−１で吸光度０．２８、ピーク４は波数４８６ｃｍ−１で吸光度０．２２であった。波数１２３０ｃｍ−１の吸光度に対する１４２１ｃｍ−１の吸光度の比は０．７４、４８６ｃｍ−１の吸光度に対する５８８ｃｍ−１の吸光度の比は１．２５であった。
（プロトン核磁気共鳴スペクトルの測定）
実施例１で得られたヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンについて、重水中におけるプロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルを測定した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの測定は、核磁気共鳴分光装置（ＪＮＭ−ＥＸ２７０、日本電子（株））を用いた。最初に、１０．０ｍｇのヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンを０．５ｍＬの重水（Ｄ２Ｏ、９９．８％）に溶解した。溶液を凍結乾燥した後、同じ操作を繰り返した。２回目の凍結乾燥後、０．８ｍＬの重水（Ｄ２Ｏ、９９．９％）に溶解し、石英綿を通して直径が５ｍｍの試料管に導入した。内部標準として、少量のアセトン（化学シフト値２．２２ｐｐｍ）を加えた。測定は７０℃で行った。図３は、実施例１で得られたヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの重水溶液の１Ｈ−ＮＭＲである。グラフの横軸は化学シフト（ｐｐｍ）、縦軸は相対強度を表している。実施例１で得られたヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの１Ｈ−ＮＭＲでは４．７３ｐｐｍと４．０１ｐｐｍ、１．９０ｐｐｍにシグナルが観測された。４．７３ｐｐｍのシグナルの積分値を１とした場合、４．０１ｐｐｍの積分値は５．１５、１．９０ｐｐｍの積分値は０．１１であった。
実施例１で得られたヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンについて、重水中におけるプロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルを測定した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの測定は、核磁気共鳴分光装置（ＪＮＭ−ＥＸ２７０、日本電子（株））を用いた。最初に、１０．０ｍｇのヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンを０．５ｍＬの重水（Ｄ２Ｏ、９９．８％）に溶解した。溶液を凍結乾燥した後、同じ操作を繰り返した。２回目の凍結乾燥後、０．８ｍＬの重水（Ｄ２Ｏ、９９．９％）に溶解し、石英綿を通して直径が５ｍｍの試料管に導入した。内部標準として、少量のアセトン（化学シフト値２．２２ｐｐｍ）を加えた。測定は７０℃で行った。図３は、実施例１で得られたヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの重水溶液の１Ｈ−ＮＭＲである。グラフの横軸は化学シフト（ｐｐｍ）、縦軸は相対強度を表している。実施例１で得られたヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの１Ｈ−ＮＭＲでは４．７３ｐｐｍと４．０１ｐｐｍ、１．９０ｐｐｍにシグナルが観測された。４．７３ｐｐｍのシグナルの積分値を１とした場合、４．０１ｐｐｍの積分値は５．１５、１．９０ｐｐｍの積分値は０．１１であった。
図４は、比較とした原料ＰＧについて、同じ条件で測定した１Ｈ−ＮＭＲを示した。原料ＰＧは、４．７３ｐｐｍと４．０１ｐｐｍ、１．９５ｐｐｍにシグナルが観測された。４．７３ｐｐｍのピークの積分値を１とした場合、４．０１ｐｐｍの積分値は４．９３であり、１．９５ｐｐｍの積分値は０．０２であった。
（カルシウムイオンと一価カチオンの測定）
実施例１で得られたヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの金属イオン含量を、キャピラリー電気泳動装置（ＡｇｉＬｅｎｔ７１００キャピラリー電気泳動システム、アジレント・テクノロジー（株））を用いて定量した。金属イオンの定量法は、ＵＶ吸収を有する緩衝液で満たしたキャピラリーカラムに、試料を注入して電圧をかけることで、試料中の各陽金属イオンを分離しながら移動させ、ＵＶ検出部を通過する時のＵＶ吸収の減少分により検出するという間接吸光法を採用した。カラムにフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、有効長５６ｃｍ、アジレント・テクノロジー（株））、緩衝液に陽イオン分析バッファ（ＰａｒｔＮｏ．５０６４−８２０３、アジレント・テクノロジー（株）製）を用い、電圧２５ｋＶで、陽イオン標準液（５〜１００ｐｐｍ、ＰａｒｔＮｏ．５０６４−８２０５、アジレント・テクノロジー（株）製）から作成した検量線より、カルシウムイオンおよび一価のカチオン濃度を求めた。一価のカチオン濃度はヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンに含まれるナトリウムイオン濃度とカリウムイオン濃度の和として算出した。ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの測定の結果、乾燥重量1ｇ当たりのカルシウムイオンは０．３９ｍｍｏｌ、一価のカチオンは１．６９ｍｍｏｌであった。一価のカチオンに対するカルシウムイオンのｍｏｌ比は０．２３であった。比較例として、同様の方法で原料ＰＧを測定した結果、乾燥重量1ｇ当たりのカルシウムイオンは０．７６ｍｍｏｌ、一価のカチオンは０．６０ｍｍｏｌであった。一価のカチオンに対するカルシウムイオンのｍｏｌ比は１．２７であった。
実施例１で得られたヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの金属イオン含量を、キャピラリー電気泳動装置（ＡｇｉＬｅｎｔ７１００キャピラリー電気泳動システム、アジレント・テクノロジー（株））を用いて定量した。金属イオンの定量法は、ＵＶ吸収を有する緩衝液で満たしたキャピラリーカラムに、試料を注入して電圧をかけることで、試料中の各陽金属イオンを分離しながら移動させ、ＵＶ検出部を通過する時のＵＶ吸収の減少分により検出するという間接吸光法を採用した。カラムにフューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、有効長５６ｃｍ、アジレント・テクノロジー（株））、緩衝液に陽イオン分析バッファ（ＰａｒｔＮｏ．５０６４−８２０３、アジレント・テクノロジー（株）製）を用い、電圧２５ｋＶで、陽イオン標準液（５〜１００ｐｐｍ、ＰａｒｔＮｏ．５０６４−８２０５、アジレント・テクノロジー（株）製）から作成した検量線より、カルシウムイオンおよび一価のカチオン濃度を求めた。一価のカチオン濃度はヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンに含まれるナトリウムイオン濃度とカリウムイオン濃度の和として算出した。ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの測定の結果、乾燥重量1ｇ当たりのカルシウムイオンは０．３９ｍｍｏｌ、一価のカチオンは１．６９ｍｍｏｌであった。一価のカチオンに対するカルシウムイオンのｍｏｌ比は０．２３であった。比較例として、同様の方法で原料ＰＧを測定した結果、乾燥重量1ｇ当たりのカルシウムイオンは０．７６ｍｍｏｌ、一価のカチオンは０．６０ｍｍｏｌであった。一価のカチオンに対するカルシウムイオンのｍｏｌ比は１．２７であった。
（アルギニンとセリンの測定）
実施例１で得られたヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンについて、アルギニンとセリンの含有率を測定した。最初に、ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカン２．０ｍｇを６ＮＨＣｌに溶解し、２４時間１１０℃で加水分解を行った。次に、ロータリーエバポレーター（東京理科器械（株））にて溶媒を除去した後、粒状の水酸化ナトリウムを入れたデシケーター内で一晩乾燥した。得られた黒色粉末をクエン酸リチウム緩衝液ｐＨ２．２（和光純薬工業(株)）０．８ｍＬに溶解し、遠心分離機（ＨｉｍａｃＣＴ１３Ｒ、（株）日立製作所製）により１０，０００ｒｐｍで１０分遠心分離した。上清をアミコンウルトラ０．５ｍＬ３Ｋ（分画分子量３，０００Ｄａ、メルクミリポア社）により限外ろ過し、ろ過液をクエン酸リチウム緩衝液ｐＨ２．２で５倍希釈し、測定の試料とした。測定は全自動アミノ酸分析計（ＪＬＣ―５００／Ｖ、日本電子（株））を用いた。標準試料として標準アミノ酸混合液ＡＮＩＩ型（和光純薬工業(株)）、標準アミノ酸混合液Ｂ型（和光純薬工業(株)）、２．５ｍＭアスパラギン水溶液、２．５ｍＭグルタミン水溶液、ならびに２．５ｍＭトリプトファン水溶液を等量混合し、クエン酸リチウム緩衝液ｐＨ２．２で５倍希釈したもの使用した。含有率は標準試料を基に算出し、乾燥重量当たりに換算した。実施例１に係るヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンのアルギニンの含有率は０．２重量％であり、セリンは１．１重量％であった。アルギニンに対するセリンの重量比は５．１であった。同様の測定法で原料ＰＧを測定したところ、アルギニンの含有率は０．３重量％であり、セリンは１．４重量％であった。アルギニンに対するセリンの重量比は５．５であった。
実施例１で得られたヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンについて、アルギニンとセリンの含有率を測定した。最初に、ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカン２．０ｍｇを６ＮＨＣｌに溶解し、２４時間１１０℃で加水分解を行った。次に、ロータリーエバポレーター（東京理科器械（株））にて溶媒を除去した後、粒状の水酸化ナトリウムを入れたデシケーター内で一晩乾燥した。得られた黒色粉末をクエン酸リチウム緩衝液ｐＨ２．２（和光純薬工業(株)）０．８ｍＬに溶解し、遠心分離機（ＨｉｍａｃＣＴ１３Ｒ、（株）日立製作所製）により１０，０００ｒｐｍで１０分遠心分離した。上清をアミコンウルトラ０．５ｍＬ３Ｋ（分画分子量３，０００Ｄａ、メルクミリポア社）により限外ろ過し、ろ過液をクエン酸リチウム緩衝液ｐＨ２．２で５倍希釈し、測定の試料とした。測定は全自動アミノ酸分析計（ＪＬＣ―５００／Ｖ、日本電子（株））を用いた。標準試料として標準アミノ酸混合液ＡＮＩＩ型（和光純薬工業(株)）、標準アミノ酸混合液Ｂ型（和光純薬工業(株)）、２．５ｍＭアスパラギン水溶液、２．５ｍＭグルタミン水溶液、ならびに２．５ｍＭトリプトファン水溶液を等量混合し、クエン酸リチウム緩衝液ｐＨ２．２で５倍希釈したもの使用した。含有率は標準試料を基に算出し、乾燥重量当たりに換算した。実施例１に係るヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンのアルギニンの含有率は０．２重量％であり、セリンは１．１重量％であった。アルギニンに対するセリンの重量比は５．１であった。同様の測定法で原料ＰＧを測定したところ、アルギニンの含有率は０．３重量％であり、セリンは１．４重量％であった。アルギニンに対するセリンの重量比は５．５であった。
（炭素含量と硫黄含量の測定）
炭素含量と硫黄含量を、燃焼型元素分析装置ｖａｒｉｏ ＥＬ ｃｕｂｅ（エレメンタール社製）を用い、炭素・水素・窒素・硫黄の４元素測定モードで測定した。実施例１に係るヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの炭素含量は乾燥重量当たり３７．９重量％であり、硫黄含量は乾燥重量当たり８．３重量％であった。炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．２２であった。同様の測定法で原料ＰＧを測定したところ、炭素含量は乾燥重量当たり４２．７重量％であり、硫黄含量は乾燥重量当たり６．４重量％であった。炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．１５であった。
炭素含量と硫黄含量を、燃焼型元素分析装置ｖａｒｉｏ ＥＬ ｃｕｂｅ（エレメンタール社製）を用い、炭素・水素・窒素・硫黄の４元素測定モードで測定した。実施例１に係るヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンの炭素含量は乾燥重量当たり３７．９重量％であり、硫黄含量は乾燥重量当たり８．３重量％であった。炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．２２であった。同様の測定法で原料ＰＧを測定したところ、炭素含量は乾燥重量当たり４２．７重量％であり、硫黄含量は乾燥重量当たり６．４重量％であった。炭素含量に対する硫黄含量の重量比は０．１５であった。
（ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンのヒト皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸産生促進作用）
実施例１で得られたヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンのヒアルロン酸産生の促進作用を確認するために、ヒト皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸の産生量を以下の方法で調べた。
実施例１で得られたヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンのヒアルロン酸産生の促進作用を確認するために、ヒト皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸の産生量を以下の方法で調べた。
細胞は、正常ヒト皮膚線維芽細胞（倉敷紡績（株））を使用した。正常ヒト皮膚線維芽細胞を２４ウェルプレートに２×１０４ｃｅＬＬｓ／ウェルの密度で播種し、５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下７２時間前培養を行った。その後、試験物質としてヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンまたは原料ＰＧ（添加濃度２００μｇ／ｍＬ）を添加した０．２５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地に交換して、さらに７２時間培養を行い、培養上清を回収した。ヒアルロン酸定量用キット（Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、培養上清中のヒアルロン酸量を測定した。また、同時に細胞数をセルカウンティングキット−８ (（株）同仁化学研究所)により測定し、補正を行い、ヒアルロン酸量を算出した。陽性対照はＮ−アセチルグルコサミンを使用した。また、試験物質を添加していない区分を無添加対照群とした。上記と同様にヒアルロン酸産生量を測定した。各群のサンプル数は３で行い、実験データは平均値±標準誤差で表し、無添加対照群のヒアルロン酸産生量を１００％として、テューキー法の検定により各群のヒアルロン酸産生量を比較した。
その結果、ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカン群のヒアルロン酸産生量は１５８．３±５．６％であった。原料ＰＧ群のヒアルロン酸産生量は１０９．６±３．９％であった。なお、陽性対照群のヒアルロン酸産生量は１３３．８±２．６％であった。テューキー法の検定により各群のヒアルロン酸産生量を比較したところ、ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカン群は、無添加対照群または原料ＰＧ群に対して、いずれも有意差（ｐ＜０．０１）があった。ヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンは、有意なヒアルロン酸産生の促進作用が認められた。また、原料ＰＧ及び実施例１に係るヒアルロン酸産生能が改善したプロテオグリカンを添加しても、細胞死や細胞の形態などには異常が観察されず、細胞毒性などはないものと判断された。
Claims (1)
- 以下の１）〜５）を全て満たすプロテオグリカン。
１）ＫＢｒディスク透過法により測定した赤外吸収スペクトルにおいて、波数１４１７±１０ｃｍ−１、１２３４±１０ｃｍ−１、５８８±１０ｃｍ−１、４８１±１０ｃｍ−１すべてに吸収ピークを有し、かつ１２３４±１０ｃｍ−１の吸光度に対する１４１７±１０ｃｍ−１の吸光度の比が０．８以上、４８１±１０ｃｍ−１の吸光度に対する５８８±１０ｃｍ−１の吸光度の比が１．１以下である。
２）７０℃で測定した重水中におけるプロトン核磁気共鳴スペクトルにおいて、４．７３±０．０５ｐｐｍ、４．０１±０．０５ｐｐｍ、１．９０±０．０５ｐｐｍすべてにシグナルを有し、かつ４．７３±０．０５ｐｐｍの積分値を１とした場合に、４．０１±０．０５ｐｐｍの積分値は５以上、１．９０±０．０５ｐｐｍの積分値は０．１以上である。
３）乾燥重量１ｇ当たり、カルシウムイオン０．４ｍｍｏｌ以下、かつ一価のカチオンを１．６ｍｍｏｌ以上含んでいる。
４）アルギニンに対するセリンの重量比が５．２以下である。
５）炭素含量に対する硫黄含量の重量比が０．２以上である。
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Citations (5)
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|---|---|---|---|---|
| JPS5585525A (en) * | 1978-12-19 | 1980-06-27 | Fabre Sa Pierre | Purified bacterial membranal proteoglycan* manufacture thereof and vaccine using it |
| WO2007094248A1 (ja) * | 2006-02-14 | 2007-08-23 | Kushiro Industrial Technology Center | プロテオグリカンの製造方法 |
| JP2008247803A (ja) * | 2007-03-30 | 2008-10-16 | Hirosaki Univ | サケ軟骨に含まれるプロテオグリカンの新規な薬理用途 |
| JP2012201614A (ja) * | 2011-03-24 | 2012-10-22 | Linise Co Inc | プロテオグリカンの製造方法 |
| JP2014141580A (ja) * | 2013-01-24 | 2014-08-07 | Aomori Prefectural Industrial Technology Research Center | プロテオグリカン及び化粧料 |
-
2017
- 2017-03-08 JP JP2017043756A patent/JP7070883B2/ja active Active
Patent Citations (5)
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BIOCHEM. J., vol. 234, JPN6021007923, 1986, pages 221 - 223, ISSN: 0004458358 * |
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| Publication number | Publication date |
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