JP2018126104A - 細胞密度測定方法及び細胞密度変化追跡方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明は死んでいる細胞には影響を受けずに、生きている生細胞のみに感度があり、その密度、細胞数を誘電率から換算することで求めるもので、サンプリングの必要がなく、プロセスに直接組み入れて測定、評価できる細胞培養中の細胞の細胞密度測定方法を提供する。【解決手段】 一定の距離を有して対向配置した２枚の金属板から成る電極を、細胞を培養する培地内に浸漬し、前記電極に交流信号を印可して、細胞培養中の細胞の細胞密度測定方法であって、前記細胞に周期ＴＨからＴＬ（ＴＨ＞ＴＬ）間のＮ個の周期ＴＪを測定周期とする交流信号を、長い周期の交流信号から順次与える信号印可手段、その信号印可手段の実施により細胞内で生じる配向分極による印可周期ＴＪに対する誘電率εＪを測定する計測手段、その計測手段で得られた印可周期ＴＪと誘電率εＪから、周期毎の細胞個数比率を求める計算手段を含むことを特徴とする細胞密度測定方法。【選択図】 なし

Description

本発明は細胞培養における細胞の成長状態を把握する計測技術において、その細胞密度の測定方法と成長状態の追跡方法に関するものである。

細胞密度は生物製剤、特定細胞の生産、醸造、バイオ燃料など、細胞あるいは酵母を用いる産業において、その関連製品の製造、開発にきわめて有効な特性であり、その製造過程における変化を知ることも必要であり、その測定方法に関心が持たれている。

一般に普及している方式は光学式で、細胞あるいは酵母に色をつけ光学センサーで検知しやすくすることで、大きさ、数量を数えています。この方式では培養されている細胞を培養器からサンプリングし、測定器に入れる必要があり、培養器に直接センサーを取り付けての常時監視は難しく、そのため、実際に細胞がどのように増え、またどのような調節を行うかは人の手による分析結果に左右されてしまうことになる。

それに代わる方法として、細胞密度を、その遮光率で計測するオンライン濁度センサーを用いた方法が用いられている（例えば、特許文献１、２参照）。
しかしながら、この方法も細胞の状態によっては正確に測ることは難しく、また死んだ細胞も測定してしまう問題が生じるため、精度良く細胞密度を知ることが望まれている。

特開２００８−２２７０５号公報 特開平７−２０３９４５号公報

そこで、このような状況に鑑み、本発明は死んでいる細胞には影響を受けずに、生きている生細胞のみに感度があり、その密度、細胞数を誘電率から換算することで求めるもので、サンプリングの必要がなく、プロセスに直接組み入れて測定、評価できる細胞培養中の細胞の細胞密度測定方法を提供するものである。

本発明の第１の発明は、一定の距離を有して対向配置した２枚の金属板から成る電極を、細胞を培養する培地内に浸漬し、前記電極に交流信号を印可して、細胞培養中の細胞の細胞密度測定方法であって、前記細胞に周期Ｔ_ＨからＴ_Ｌ（Ｔ_Ｈ＞Ｔ_Ｌ）間のＮ個の周期を印可周期Ｔ_Ｊ（Ｊ＝１、・・・、Ｎ）とする交流信号を、長い印可周期の交流信号から順次与える信号印可手段、その信号印可手段の実施により細胞内で生じる配向分極による印可周期Ｔ_Ｊに応答する細胞の誘電率ε_Ｊを測定する計測手段、前記計測手段で得られた印可周期Ｔ_Ｊと細胞の誘電率ε_Ｊから、周期毎の細胞個数比率Ｐ_Ｊを求める計算手段を含むことを特徴とする細胞密度測定方法である。

本発明の第２の発明は、第１の発明における計算手段が、Ｊ番目に測定した印可周期Ｔ_Ｊにおける誘電率ε_Ｊと、Ｊ＋１番目に測定した印可周期Ｔ_Ｊ＋１における誘電率ε_Ｊ＋１の差分Δε_Ｊ＝ε_Ｊ−ε_Ｊ＋１（Ｊ＝１、２，・・・、Ｎ）を、測定したＮ個の印可周期において順に求める差分操作と、印可周期Ｔ_Ｊの交流信号において誘電率が測定された細胞の大きさの比率である細胞体積比Ｖ_Ｊを求める細胞比率操作と、その差分操作と細胞比率操作から求めたΔε_Ｊと細胞体積比Ｖ_Ｊから細胞個数比率Ｐ_Ｊを求める個数比率操作とを含むことを特徴とする細胞密度測定方法である。

本発明の第３の発明は、第２の発明における細胞比率操作が、下記（１）式により細胞体積比Ｖ_Ｊ（Ｊ＝１、２、・・・、Ｎ）を求める操作であることを特徴とする細胞密度測定方法である。

本発明の第４の発明は、第２及び第３の発明における個数比率操作が、下記（２）式により細胞個数比率Ｐ_Ｊ（Ｊ＝１、２、・・・、Ｎ）を求める操作であることを特徴とする細胞密度測定方法である。

本発明の第５の発明は、細胞の培養開始からの経過時間毎に、第１から第４の発明のいずれかに記載の細胞密度測定方法を用いて培養中の細胞における細胞密度の変化データを計測し、得られた前記変化データにより前記細胞の成長状態を可視化することを特徴とする細胞密度変化追跡方法である。

本発明の第６の発明は、第５の発明における細胞の培養開始からの経過時間が、一定時間Δｔ毎に実施されるｔ_Ｉ＝ＩΔｔ（Ｉ＝０、１、２、・・・、Ｍ）で示される経過時間であることを特徴とする細胞密度変化追跡方法である。

本発明の第７の発明は、第５の発明における細胞の培養開始からの経過時間が、予め定めたｔ_Ｉ（Ｉ＝０、１、２、・・・、Ｍ）で示される経過時間であることを特徴とする細胞密度変化追跡方法である。

本発明によれば、細胞培養の培地内において、細胞の誘電率を測定することで、生細胞のみによる影響を評価可能であり、そのために細胞自体のサンプリングを必要とせずに、より正確な測定を可能とするものである。
さらに、製造開発のプロセス内に組み入れいて測定することも可能であり、工業上顕著な効果を奏するものである。

細胞密度の誘電率測定装置の構成図で、（ａ）培地内に挿入され、誘電率測定を実施中の測定器の模式図、（ｂ）は、細胞の誘電率測定部の拡大模式図である。 印可交流信号と細胞の大きさとの関係を示す模式図である。 印可交流信号の周期と細胞の誘電率の関係を示す図である。 誘電率測定により求められる交流信号の周期と、細胞の誘電率の測定値と、周期Ｔ_Ｊのみに応答する誘電率との関係を示す図である。 交流信号の各印可周期と誘電率の測定値、各印可周期のみに応答した細胞の誘電率分布、及び測定から得られた細胞個数比率を示す図である。 培養開始からの細胞成長による細胞状態の変化の追跡図である。

本発明は、細胞に周期Ｔ_ＨからＴ_Ｌ（Ｔ_Ｈ＞Ｔ_Ｌ）間のＮ個の周期を印可周期Ｔ_Ｊ（ｊ＝１、・・・、Ｎ）とする交流信号を、長い印可周期の交流信号から順次与える信号印可手段と、その信号印可手段の実施により細胞内で生じる配向分極による印可周期Ｔ_Ｊに応答する細胞の誘電率ε_Ｊを測定する計測手段と、その計測手段で得られた印可周期Ｔ_Ｊと細胞の誘電率ε_Ｊから、周期毎の細胞個数比率Ｐ_Ｊを求める計算手段を含み、これら３手段を主構成手段とするものである。

１．細胞密度の測定方法
各手段の説明前に、先ず交流信号を用いた細胞密度の誘電率測定について概略を説明し、その後に各手段の詳細を説明する。
ところで細胞密度の誘電率とは、図１の誘電率測定装置の構成図に示すような電極の間にある細胞が持つ静電容量の比率である。図１において、１は誘電率計、２、２は交流信号が掛かる電極、１０は培地、１２は誘電率を測定する電極、２０は生細胞、３０は死細胞（細胞膜が破れている状態）、ＡＣは交流信号源で交流電源を使用している。なお、電極２、２は、通常、細い棒状のもので、その下部を樹脂に埋め込まれている、

培地１０は細胞が生きる環境を与えるもので、図１の場合は、液体の中の細胞の誘電率を測定するために培地１０は液体となっている。
誘電率計１は、図１（ｂ）に示すような電極部１２の構成、即ち平行配置となるように設置された電極１２ａ、１２ａと、その電極に電圧を掛ける配線１２ｂを有し、電源１２ｃに接続されて使用するものである。

誘電率の測定において、先ず交流信号には交流電流を選択し、印可するが、交流電流は輪を描きながら、且つ電流の流れる方向を入れ替えながら培地１０内を流れている。そこで、細胞の誘電率の測定前に、培地の誘電率を測定し、以降の細胞を含む培地における誘電率である細胞の誘電率の測定値から減ずることで誘電率のゼロ点校正を実施する。
次に、交流電流の輪がある所に細胞がくると、その細胞に交流信号がかかり、そこで、交流信号を受けた細胞は、その内部に電荷を貯め込むようになる。しかし、継続して電池やコンデンサーのように特定電位の電荷が貯まるようには電流は流れず、一定間隔で逆位の電位の電気が流れる状態が生じ、細胞内に貯められていた電荷が抜けていくような状態になる。
この細胞に電荷が貯まる・抜ける状態は、交流電流における電流方向の切り替えに合わせ交互に起こることから、貯まる時の電荷、抜ける時の電荷の量を、時間当たりの電流の変化として計測し、その値にセル定数Ｃを掛けて誘電率εが求められる。

ここで、細胞に電荷が貯まる・抜ける時間は交流信号の向きが変わる時間の長さである交流信号の「周期」に依存している。
さらに、電荷が貯まる・抜ける時間は細胞の大きさに依存し、細胞が大きくなれば、電荷が貯まる時間は、それに比例して長くなっていく、また細胞が大きいほど長い周期に応答するため、印可した交流信号の周期が細胞の大きさに対して短い場合、その細胞の誘電率が測定されることはない。

即ち、印可した交流信号の周期より大きい細胞の誘電率は測定できないことになり、長周期の交流信号側から短周期の交流信号側へと印可周期を段階的に変えた交流信号を印可することによって、印可交流信号と細胞の大きさとの関係が把握可能となる。その関係を模式的に示すと図２のような関係を得る。

以下、３つの主要手段を説明する。
先ず、「信号印可手段」と「計測手段」を説明する。この両者は、本測定方法においては対を成すものであることから併せて説明する。
細胞を含む培地が入った容器に、最も長い周期Ｔ_１の交流信号から最も短い周期Ｔ_Ｎの交流信号まで、段階的に周期を短くしていったＴ_Ｊ（Ｊ＝１、・・・、Ｎ）で表される周期の交流信号（一般に「交流電流」が用いられる）を長周期側から周期を減じながら順番に印可する。
なお、実際の測定において、Ｔ_１及びＴ_Ｎは、予め予備測定を実施し、培地内の細胞の状態に即して決定すると良い。また、誘電率を測定する測定器の印可周期の範囲がＴ_Ｈ〜Ｔ_Ｌの場合、その範囲を以てＴ_１〜Ｔ_Ｎの範囲としても良い。

その結果、最も長周期の時は大きな細胞から小さな細胞まで、くまなく電荷が貯まる・抜ける状態が生じて誘電率は最も高い値を示すようになる。一方、周期を短くしていくとそれに比例して応答可能な細胞の大きさの限界は小さくなり、その限界の大きさを上限として、それより小さな細胞の誘電率を含め測定する。その測定を順次、最も短い周期Ｔ_Ｌの交流信号まで実施して誘電率を測定していくことになる。

次に、上記のように交流信号を印可して先に説明した手法で細胞の誘電率を測定する。
その結果、図３に示すような「印可交流信号の周期と細胞の誘電率：β分散」の関係が得られる。
図３に示す測定結果では、最も長い印可周期Ｔ_１の印可交流信号の所では、最も高い細胞の誘電率ε_１が記録されるが、周期が短くなるに連れて大きな細胞の誘電率が順に測定不能となり、その誘電率は下がり続けている。

ところで、この最も長い印可周期Ｔ_１の交流信号に応答した細胞の誘電率ε_１から、次に長い周期Ｔ_２で測定された誘電率を減じると、最も長い印可周期Ｔ_１の交流信号にのみ応答した細胞の誘電率が求められる。この細胞は、測定した最も大きな細胞となる。
このように順番に隣り合う周期の交流信号の差分を求めることを順番に繰り返すことで、大きな細胞の応答から順に誘電率を求めて行くことができ、測定の最後の印可周期Ｔ_Ｎによる誘電率は、これより短い周期の応答する細胞を含むものとなる。

［計算手段］
次に、上記計測手段で求めた印可した交流信号の印可周期と細胞の誘電率の関係から細胞個数比を求める計算手段を説明する。
測定器の測定可能周期範囲Ｔ_ＨからＴ_Ｌ間において、印可する周期の数をＮ種類、最も長い印可周期をＴ_１、最も短い印可周期をＴ_Ｎ、その間の印可周期を含む、それらの印可周期に応答して測定される細胞の誘電率をε_１〜ε_Ｎとする。
最も長い印可周期Ｔ_１の交流信号のみに応答する細胞の誘電率Δε_１は、Δε_１＝ε_１−ε_２となる。

以下、同様に印可周期Ｔ_２〜Ｔ_Ｎの交流信号の各信号のみに応答する細胞の誘電率Δε_２〜Δε_Ｎを求め、纏めたものが表１、及び図４に示される。
なお、印可周期Ｔ_１、Ｔ_Ｎはそれぞれ測定可能範囲であるＴ_Ｈ、Ｔ_Ｌを用いても良く、又は周期Ｔ_Ｈ〜Ｔ_Ｌ間でもっと長い周期をＴ_１、最も短い周期をＴ_Ｎと設定しても良い。

＜細胞の大きさ＞
次に細胞の大きさの評価を行う。
隣接する印可周期（例えば、Ｔ_Ｊ、Ｔ_Ｊ＋１）の交流信号により計測された細胞の誘電率の差分Δε_Ｊは、その印可周期Ｔ_Ｊ（一義的に対応する周波数も同等）にのみ応答する細胞の大きさにより測定されることから、細胞の大きさは印可周期に比例することになる。
ところで、この誘電率から細胞の正確な大きさを求めることは難しいが、印可された交流信号の周期（又周波数）毎の細胞の大きさの比率を求めることは可能であり、最も長い印可周期Ｔ_１を基準として各印可周期から求められる細胞の大きさの比（体積比と称す）は、下記式（３）で求められ、表２のように関係付けられる。

＜細胞個数への換算＞
細胞の誘電率が細胞の大きさ（体積）に比例することから、測定された周期毎の細胞の誘電率を表２の体積比で除することで、大まかな細胞の大きさ毎の個数の比率、細胞個数比率Ｐ_Ｊを知ることができる。下記式（４）を用いて求めることができる。
表３は印可周期毎の細胞個数比率の換算表である。

以上、計算手段において求めてきた、印可した交流信号の周期毎に得られた細胞の誘電率の差分である印可周期Ｔ_Ｊの交流信号にのみ応答した細胞の誘電率Δε_J及び細胞個数比率Ｐ_Ｊを纏めて示すと図５のようになる。
図５で示すように、測定時点における培養中の細胞成長状態を細胞個数比率で知ることが可能となっている。

２．細胞密度変化の追跡
これまで述べてきた特定測定時における細胞個数比率で表現された細胞密度を用い、培養開始からの細胞成長による細胞状態の変化を追跡する方法を以下に説明する。

培養開始時の時間をｔ_０＝０［ｍｉｎ］とし、一定時間毎（Δｔ、ｔ_ｉ＝ｔ_０＋ＩΔｔ：Ｉ＝０、１、・・・、Ｍ）又は、決めた経過時間ｔ_Ｉ（Ｉ＝０、１、・・・、Ｍ）毎に、先に説明した細胞密度測定方法を実施することにより、各測定時間ｔ_Ｉにおける細胞密度（細胞個数比率）Ｐ_ＩＪ（Ｉ＝０、１、・・・、Ｍ：Ｊ＝１、２、・・・・、Ｎ））が求められる。
ここで、添字Ｉは、培養開始からの時間経過の指標であり、添字Ｊは、測定時の細胞の大きさの指標である。

得られた細胞密度（細胞個数比率）Ｐ_ＩＪを、培養開始からの経過時間毎に、同じ大きさの細胞毎、即ちＰ_ＩＪにおける同じ添字Ｊを持つ細胞密度（細胞個数比率）をプロットすることで、大きさの同じ細胞の培養中における発生頻度が得られ、培養中の細胞成長の一端を伺いことができる。
さらに、累積表示することで、培地内での細胞の成長度合いが、細胞の大きさの変化によって伺うことができる。

以下、実施例を用いて本発明を詳細する。

イースト菌を供試材の細胞に用い、その１．２ｇを煮沸水２５０ｍｌにグラニュー糖０．８５ｇ、食塩１．７ｇを溶解して作成した溶液の培地と共に容器に装入後、容器全体が３０℃を維持するように温度管理しながら、誘電率計を培地内に設置して、誘電率測定を行い、得られた誘電率の測定値から印可周期のみに応答する細胞から得られた誘電率Δε_Jを求めた。その求め方の概要を表４に示す。
使用した交流信号には交流電流を採用し、その周波数を表５に示すような「３００［ＫＨｚ］から１００００［ＫＨｚ］」間で、１７に分割し、その周波数に対応した周期の交流電流を用いた。
表５に印可周期Ｔ_Ｊ、印可周波数ｆ_Ｊ、細胞体積比（体積比）Ｖ_Ｊ、及び、応答する最大大きさの細胞の比較図を示す。

次に、細胞密度として評価する「細胞個数比率」を、測定から求めたΔε_Ｊと上記細胞体積比Ｖ_Ｊとから表６に示す式を用いて求め、その求めた「細胞個数比率Ｐ_Ｊ」を併せて表６に示すと共に、使用した交流信号の印可周期、測定された細胞の誘電率、単一の周期にのみ応答する細胞による誘電率分布Δε_Ｊ、及び細胞個数比率Ｐ_Ｊを図５に示す。

図５からもわかるように、細胞培養におけるある経過時間における細胞の成長状態を映し出している様子がわかる。
本発明の測定方法は、その測定原理上、生細胞のみの影響を受ける点、測定する経過時間を設定可能な点などから、細胞培養の初期から時間が経過した段階までの細胞の成長状態の移り変わりを捉えることが可能である。

実施例１と同様の手法で細胞の誘電率を細胞培養開始からの経過時間ごとに測定を実施して培養開始からの細胞成長による細胞状態の変化を追跡した。

培養開始時の時間をｔ_０＝０［ｍｉｎ］とし、一定時間Δｔ＝１［ｍｉｎ］毎に、細胞密度測定試験を実施し、各測定時間ｔ_Ｉにおける細胞密度（細胞個数比率）Ｐ_ＩＪ（Ｉ＝０、１、・・・、Ｍ：Ｊ＝１、２、・・・・、Ｎ））が求められる。
ここで、添字Ｉは、培養開始からの時間経過の指標であり、添字Ｊは、測定時の細胞の大きさの指標である。

追跡結果を図６に示す。
横軸は経過時間［ｍｉｎ］表示、縦軸は細胞個数比の累積を個数密度としている。
図６からは、細胞がある程度の大きさに成長すると核分裂などによって、サイズダウンした細胞になり、また成長が始まる過程を捉えている。

１ 誘電率計
２ 電極
１０ 培地
１２ 電極部
１２ａ 電極
１２ｂ 配線
１２ｃ 電源
２０ 生細胞
３０ 死細胞
ＡＣ 交流信号（交流電流）

さらに、第１の発明における計算手段が、Ｊ番目に測定した印可周期Ｔ_Ｊにおける誘電率ε_Ｊと、Ｊ＋１番目に測定した印可周期Ｔ_Ｊ＋１における誘電率ε_Ｊ＋１の差分Δε_Ｊ＝ε_Ｊ−ε_Ｊ＋１（Ｊ＝１、２，・・・、Ｎ）を、測定したＮ個の印可周期において順に求める差分操作と、印可周期Ｔ_Ｊの交流信号において誘電率が測定された細胞の大きさの比率である細胞体積比Ｖ_Ｊを求める細胞比率操作と、その差分操作と細胞比率操作から求めたΔε_Ｊと細胞体積比Ｖ_Ｊから細胞個数比率Ｐ_Ｊを求める個数比率操作とを含む細胞密度測定方法である。

また、その細胞比率操作が、下記（１）式により細胞体積比Ｖ_Ｊ（Ｊ＝１、２、・・・、Ｎ）を求める操作であることを特徴とする細胞密度測定方法である。

また、その個数比率操作が、下記（２）式により細胞個数比率Ｐ_Ｊ（Ｊ＝１、２、・・・、Ｎ）を求める操作であることを特徴とする細胞密度測定方法である。

本発明の第２の発明は、細胞の培養開始からの経過時間毎に、第１の発明に記載の細胞密度測定方法を用いて培養中の細胞における細胞密度の変化データを計測し、得られた前記変化データにより前記細胞の成長状態を可視化することを特徴とする細胞密度変化追跡方法である。

本発明の第３の発明は、第２の発明における細胞の培養開始からの経過時間が、一定時間Δｔ毎に実施されるｔ_Ｉ＝ＩΔｔ（Ｉ＝０、１、２、・・・、Ｍ）で示される経過時間であることを特徴とする細胞密度変化追跡方法である。

本発明の第４の発明は、第２の発明における細胞の培養開始からの経過時間が、予め定めたｔ_Ｉ（Ｉ＝０、１、２、・・・、Ｍ）で示される経過時間であることを特徴とする細胞密度変化追跡方法である。

Claims (7)

1. 一定の距離を有して対向配置した２枚の金属板から成る電極を、細胞を培養する培地内に浸漬し、前記電極に交流信号を印可して、細胞培養中の細胞の細胞密度測定方法であって、
   前記細胞に周期Ｔ_ＨからＴ_Ｌ（Ｔ_Ｈ＞Ｔ_Ｌ）間のＮ個の周期を印可周期Ｔ_Ｊ（Ｊ＝１、・・・、Ｎ）とする交流信号を、長い印可周期の交流信号から順次与える信号印可手段、
   前記信号印可手段の実施により細胞内で生じる配向分極による印可周期Ｔ_Ｊに応答する細胞の誘電率ε_Ｊを測定する計測手段、
   前記計測手段で得られた印可周期Ｔ_Ｊと細胞の誘電率ε_Ｊから、周期毎の細胞個数比率Ｐ_Jを求める計算手段を含むことを特徴とする細胞密度測定方法。
2. 前記計算手段が、
   Ｊ番目に測定した印可周期Ｔ_Ｊにおける細胞の誘電率ε_Ｊと、Ｊ＋１番目に測定した印可周期Ｔ_Ｊ＋１における細胞の誘電率ε_Ｊ＋１の差分Δε_Ｊ＝ε_Ｊ−ε_Ｊ＋１（Ｊ＝１、２，・・・、Ｎ）を、測定したＮ個の印可周期において順に求める差分操作と、
   印可周期Ｔ_Ｊの交流信号において誘電率が測定された細胞の大きさの比率である細胞体積比Ｖ_Ｊを求める細胞比率操作と、
   前記差分操作と細胞比率操作から求めたΔε_Ｊと細胞体積比Ｖ_Ｊから細胞個数比率Ｐ_Ｊを求める個数比率操作とを、
   含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞密度測定方法。
3. 前記細胞比率操作が、下記（１）式により細胞体積比Ｖ_Ｊ（Ｊ＝１、２、・・・、Ｎ）を求める操作であることを特徴とする請求項２に記載の細胞密度測定方法。
   
4. 前記個数比率操作が、下記（２）式により細胞個数比率Ｐ_Ｊ（Ｊ＝１、２、・・・、Ｎ）を求める操作であることを特徴とする請求項２又は３に記載の細胞密度測定方法。
   
5. 細胞の培養開始からの経過時間毎に、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞密度測定方法を用いて培養中の細胞における細胞密度の変化データを計測し、得られた前記変化データにより前記細胞の成長状態を可視化することを特徴とする細胞密度変化追跡方法。
6. 前記細胞の培養開始からの経過時間が、一定時間Δｔ毎に実施されるｔ_Ｉ＝ＩΔｔ（Ｉ＝０、１、２、・・・、Ｍ）で示される経過時間であることを特徴とする請求項５に記載の細胞密度変化追跡方法。
7. 前記細胞の培養開始からの経過時間が、予め定めたｔ_Ｉ（Ｉ＝０、１、２、・・・、Ｍ）で示される経過時間であることを特徴とする請求項５に記載の細胞密度変化追跡方法。