JP2018078823A - Methods for distinguishing strains of fusobacterium nucleatum - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムを菌株レベルで識別する方法に関する。本発明はまた、本発明の方法に使用するプライマーの組合せ、および当該組合せを含むキットに関する。 The present invention relates to a method for identifying Fusobacterium nucleatum in a sample at the strain level. The present invention also relates to a combination of primers used in the method of the present invention and a kit containing the combination.
フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）はヒト口腔や大腸に生息する細菌である。本菌には５つの亜種（フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種アニマリス（F. nucleatum subsp. animalis）、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルファム（F. nucleatum subsp. polymorphum）、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヌクレアタム（F. nucleatum subsp. nucleatum）、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヴィンセンティ（F. nucleatum subsp. vincentii）、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種フシフォルメ（F. nucleatum subsp. fusiforme）が存在するが、その病原性の強度は亜種よりもさらに細かい分類である菌株レベルで異なることが知られている（非特許文献１）。そのため、簡便に菌株レベルでの判別が行えることが望ましい。 Fusobacterium nucleatum is a bacterium that lives in the human oral cavity and large intestine. There are 5 subspecies (F. nucleatum subsp. Animalis), Fusobacterium nucleatum subsp. Polymorphum (F. nucleatum subsp. Polymorphum), and Fusobacterium nucleatum subsp. Nucleatum subsp. nucleatum), Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii, and Fusobacterium nucleatum subsp. fusiforme, but their pathogenicity is even stronger than the subspecies It is known that the strain level is a fine classification (Non-Patent Document 1), and therefore it is desirable that discrimination at the strain level can be easily performed.
菌株を判別するための既存の方法は、臨床検体より分離培養を行って複数の純粋培養株を取得し、さらにＤＮＡフィンガープリント法にて同じ菌株かどうかの判別を行うために最短でも１週間程度の日数を要する。 The existing method for discriminating strains is to obtain a plurality of pure culture strains by separating and culturing from clinical specimens, and to determine whether or not they are the same strain by DNA fingerprinting, at least about one week. Takes days.
フソバクテリウム・ヌクレアタムの検出に関する他の方法としては、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（16S rRNA）の配列を同定する手法や、特定の菌株の16S rRNAに特異的なプローブを用いる手法など、16S rRNAが菌種によって異なることを利用した検出法が挙げられる（特許文献１、２）が、これらの手法は菌株レベルでの検出は困難である。 Other methods for detecting Fusobacterium nucleatum include 16S rRNA depending on the species, such as a method for identifying the sequence of the 16S ribosomal RNA gene (16S rRNA) and a method using a probe specific for the 16S rRNA of a specific strain. Although the detection method using a different thing is mentioned (patent documents 1, 2), these methods are difficult to detect at the strain level.
CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）は、細菌ゲノム上に１箇所ないし複数箇所に限局して存在する反復配列領域であり、細菌の獲得免疫機構に関与することが知られている（非特許文献２）。具体的には、CRISPRは細菌や古細菌の細胞内でCRISPR関連タンパク質（Ｃａｓ：CRISPR-associated proteins）と共に働き、ファージやプラスミドの感染防御に関わる機能を有する領域である。この領域は一般的に、CRISPRとCRISPR関連たんぱく質（Ｃａｓ）とを合わせてCRISPR-Casシステムと呼ばれている。CRISPR-Casシステムは、そのシステムが有するＣａｓ遺伝子の種類によって大きく３つのタイプ、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩに分けられ、さらに、Ｉ−Ａ、Ｉ−Ｂ、Ｉ−Ｃ、Ｉ−Ｄ、Ｉ−Ｅ、Ｉ−Ｆ、Ｉ−Ｕ、ＩＩ−Ａ、ＩＩ−Ｂ、ＩＩＩ−Ａ、ＩＩＩ−Ｂ、ＩＩＩ−Ｕの１２種類のサブタイプに分類されている（非特許文献３、４）。CRISPRはその細菌が過去に感染したファージやプラスミドなどの履歴を記録している部位で、スペーサーと呼ばれるファージやプラスミド由来の21〜72ヌクレオチドの配列断片が、リピート配列と呼ばれる２３〜５５ヌクレオチドの配列に両側を挟まれた状態で並列（多くのケースで５０以下）している（非特許文献５）。菌株によってファージやプラスミドなどの感染歴が異なるため、CRISPRに含まれるスペーサー量は異なり、結果的にCRISPRの長さや配列の違いとして現れる。CRISPRの配列の検出を利用した菌株タイピングの手法が開発されてきている（特許文献３、４）が、フソバクテリウム・ヌクレアタムの菌株タイピングに利用した例は存在しない。 CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) is a repetitive sequence region localized in one or more places on the bacterial genome, and is known to be involved in bacterial acquired immune mechanisms (Non-Patent Documents) 2). Specifically, CRISPR is a region having a function related to infection protection of phages and plasmids by working together with CRISPR-associated proteins (Cas) in bacteria and archaeal cells. This region is generally referred to as the CRISPR-Cas system by combining CRISPR and CRISPR-related protein (Cas). The CRISPR-Cas system is roughly divided into three types, Type I, Type II, and Type III, depending on the type of Cas gene that the system has, and is further divided into IA, IB, IC, ID, It is classified into 12 subtypes: IE, IF, IU, II-A, II-B, III-A, III-B, and III-U (Non-Patent Documents 3 and 4) . CRISPR is a site that records the history of phages and plasmids that have been infected by the bacteria in the past. Sequence fragments of 21-72 nucleotides derived from phages and plasmids called spacers are sequences of 23-55 nucleotides called repeat sequences. Are parallel (with 50 or less in many cases) with both sides sandwiched between them (Non-Patent Document 5). Since the infection history of phages and plasmids differs depending on the strain, the amount of spacer contained in CRISPR is different, resulting in differences in CRISPR length and sequence. Strain typing techniques using detection of CRISPR sequences have been developed (Patent Documents 3 and 4), but no examples have been used for Fusobacterium nucleatum strain typing.
本発明は、試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムを菌株レベルで識別する方法を提供する。本発明はまた、本発明の方法に使用するプライマーの組合せ、および当該組合せを含むキットを提供する。 The present invention provides a method for identifying Fusobacterium nucleatum in a sample at the strain level. The present invention also provides a combination of primers used in the method of the present invention and a kit containing the combination.
以上に鑑み、本件の発明者は、CRISPRに注目し、研究を開始した。鋭意検討の結果、フソバクテリウム・ヌクレアタムのゲノム中にCRISPRを持つ可能性のある領域を特定し、この領域のＤＮＡについてＰＣＲによる増幅が可能なプライマーを設計するための領域のＤＮＡ配列を特定した。そして、当該プライマーを設計するための領域のＤＮＡ配列に基づきプライマーを作成したところ、フソバクテリウム・ヌクレアタムを菌株レベルで効率よく識別できることを見いだした。当該知見に基づいて、本発明は完成された。 In view of the above, the inventor of the present case focused on CRISPR and started research. As a result of intensive studies, a region having the possibility of having CRISPR in the genome of Fusobacterium nucleatum was identified, and a DNA sequence of a region for designing a primer capable of amplification by PCR was identified for the DNA in this region. And when the primer was created based on the DNA sequence of the region for designing the primer, it was found that Fusobacterium nucleatum can be efficiently identified at the strain level. Based on this finding, the present invention has been completed.
すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。 That is, in one aspect, the present invention may be as follows.
［１］試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）を菌株レベルで識別する方法であって、当該試料由来のＤＮＡにおいて、以下：
（１）国際塩基配列データベース（ＩＮＳＤ）アクセッションナンバーCP012713であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種アニマリス（Fusobacterium nucleatum subsp. animalis） KCOM 1279株のゲノムの2,454,881 bp〜2,463,504 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプI-B）の３’側に存在するCRISPR領域；
（２）ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP013121であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルファム（Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum） ChDC F306株のゲノムの1,070,083 bp〜1,078,752 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプI-B）の３’側に存在するCRISPR領域；
（３）ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP012714であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヴィンセンティ（Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii）ChDC F8 KCOM 1231株のゲノムの1,100,111 bp〜1,106,109 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプII-A）の３’側に存在するCRISPR領域；および
（４）ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP013121であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルファム ChDC F306株のゲノムの279,908 bp〜289,159 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプIII-A）の３’側に存在するCRISPR領域；
からなる群より選択される少なくとも１つの領域について、当該領域を含むCRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さを検出することを含む、前記方法。
[1] A method for discriminating Fusobacterium nucleatum in a sample at the strain level, and in DNA derived from the sample, the following:
(1) Cas gene present in the 2,454,881 bp to 2,463,504 bp or the corresponding region of the genome of Fusobacterium nucleatum subsp. Animalis KCOM 1279 strain with international base sequence database (INSD) accession number CP012713 CRISPR region present 3 'to group (type IB);
(2) Fusobacterium nucleatum subsp. Polymorphum of INSD accession number CP013121 (cass gene group (type IB) present in the region of 1,070,083 bp to 1,078,752 bp or its corresponding region of ChDC F306 strain) CRISPR region present on the 3 'side;
(3) Cas gene group (types) present in the genome of Fusobacterium nucleatum subsp. Vincentii ChDC F8 KCOM 1231 with INSD accession number CP012714 or the corresponding region (type) II-A) 3'-side CRISPR region; and (4) INSD accession number CP013121 Fusobacterium nucleatum subsp. Polymorphum ChDC F306 genome 279,908 bp to 289,159 bp or the corresponding region CRISPR region present 3 ′ of Cas gene group (type III-A);
Detecting at least one region selected from the group consisting of the presence / absence of a CRISPR-Cas sequence containing the region and the length of the sequence.
［２］CRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さの検出が、（１）〜（４）からなる群より選択される少なくとも１つの領域について、当該領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行うことを含む、上記［１］に記載の方法。 [2] Primer capable of amplifying DNA containing the region of at least one region selected from the group consisting of (1) to (4), wherein the presence / absence of the CRISPR-Cas sequence and the length of the sequence are detected The method according to [1] above, comprising performing PCR using a combination of the above.
［３］（１）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、配列番号１に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号２に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せであり、
（２）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、配列番号３に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号４に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せであり、
（３）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、配列番号５に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号６に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せであり、
（４）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、配列番号７に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号８に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せである、
上記［２］に記載の方法。
[3] A combination of primers capable of amplifying DNA containing the region of (1) is a part of a base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 1, and comprises 15 to 30 bases A combination of a forward primer having a length and a reverse primer having a length of 15 to 30 bases complementary to a part of the base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 2 ,
The primer combination capable of amplifying DNA containing the region (2) is a part of a base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 3, and has a length of 15 to 30 bases A forward primer having a reverse primer having a length of 15 to 30 bases complementary to a part of the base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 4,
The combination of primers capable of amplifying DNA containing the region of (3) is part of a base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 5, and has a length of 15 to 30 bases A forward primer having a reverse primer having a length of 15 to 30 bases complementary to a part of the base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 6,
The combination of primers capable of amplifying DNA containing the region of (4) is a part of a base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 7, and has a length of 15 to 30 bases A forward primer having a reverse primer having a length of 15 to 30 bases complementary to a part of the base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 8.
The method according to [2] above.
［４］（１）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、
5’- TGAAAAATATAAAYTATAATTATGCTTGGG -3’（配列番号９）を含むプライマーおよび
5’- TTTAAAAGRGTWTCTGGATCTGCTAA -3’（配列番号１０）を含むプライマーの組合せであり、
（２）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、
5’- AAATCTTTTCAAATGTGGTGGTGA -3’（配列番号１１）を含むプライマーおよび
5’- TTTTTTCTAACTTGYCCTAAAAAACTCA -3’（配列番号１２）を含むプライマーの組合せであり、
（３）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、
5’- CAAATGATTTATCATTAGTGAGA -3’（配列番号１３）を含むプライマーおよび
5’- ACTATTGGTATTTTTTATGCAACTC -3’（配列番号１４）を含むプライマーの組合せであり、ならびに
（４）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、
5’- TTTGATGAAAAAAGTGGAGGAG -3’（配列番号１５）を含むプライマーおよび
5’- GTAAAGGCAAATTTYCCATGTAAAG -3’（配列番号１６）を含むプライマーの組合せである、
上記［２］に記載の方法。
[4] A primer combination capable of amplifying DNA containing the region of (1) is:
A primer comprising 5′-TGAAAAATATAAAYTATAATTATGCTTGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 9) and
A primer combination comprising 5′-TTTAAAAGRGTWTCTGGATCTGCTAA-3 ′ (SEQ ID NO: 10),
A combination of primers capable of amplifying DNA containing the region of (2)
A primer comprising 5′-AAATCTTTTCAAATGTGGTGGTGA-3 ′ (SEQ ID NO: 11) and
A primer combination comprising 5′-TTTTTTTCTAACTTGYCCTAAAAAACTCA-3 ′ (SEQ ID NO: 12),
A combination of primers capable of amplifying DNA containing the region of (3)
A primer comprising 5′-CAAATGATTTATCATTAGTGAGA-3 ′ (SEQ ID NO: 13) and
A combination of primers comprising 5′-ACTATTGGTATTTTTTATGCAACTC-3 ′ (SEQ ID NO: 14), and a primer combination capable of amplifying DNA comprising the region of (4),
A primer comprising 5'-TTTGATGAAAAAAGTGGAGGAG-3 '(SEQ ID NO: 15) and
A primer combination comprising 5′-GTAAAGGCAAATTTYCCATGTAAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 16),
The method according to [2] above.
［５］識別対象の試料由来のＤＮＡに対するＰＣＲ産物の電気泳動パターンと、比較対象の試料由来のＤＮＡに対するＰＣＲ産物の電気泳動パターンとが一致する場合、識別対象の試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムは、比較対象の試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムと同一菌株であると識別する、上記［２］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。 [5] When the electrophoresis pattern of the PCR product for the DNA derived from the sample to be identified matches the electrophoresis pattern of the PCR product for the DNA derived from the sample to be compared, Fusobacterium nucleatum in the sample to be identified is The method according to any one of [2] to [4] above, wherein the strain is identified as the same strain as Fusobacterium nucleatum in the sample to be compared.
［６］以下：
配列番号１に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号２に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せ；
配列番号３に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号４に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せ；
配列番号５に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号６に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せ；ならびに
配列番号７に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号８に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せ；
からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーの組合せ。
[6] The following:
A part of a sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 1, a forward primer having a length of 15-30 bases, and at least 85% identity to SEQ ID NO: 2 A combination of reverse primers having a length of 15 to 30 bases, which is complementary to a part of the sequence having sex;
A portion of a sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 3, a forward primer having a length of 15-30 bases, and at least 85% identity to SEQ ID NO: 4 A combination of reverse primers having a length of 15 to 30 bases, which is complementary to a part of the sequence having sex;
A portion of a sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 5, a forward primer having a length of 15-30 bases, and at least 85% identity to SEQ ID NO: 6 A combination of reverse primers having a length of 15 to 30 bases complementary to a part of the sequence having sex; and a part of the sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 7, A forward primer having a length of 15 to 30 bases and a reverse primer having a length of 15 to 30 bases complementary to a part of the sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 8 A combination of
A combination of at least one primer selected from the group consisting of:
［７］以下：
配列番号１を含むプライマーおよび配列番号２を含むプライマーの組合せ；
配列番号３を含むプライマーおよび配列番号４を含むプライマーの組合せ；
配列番号５を含むプライマーおよび配列番号６を含むプライマーの組合せ；ならびに
配列番号７を含むプライマーおよび配列番号８を含むプライマーの組合せ；
からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーの組合せ。
[7] The following:
A combination of a primer comprising SEQ ID NO: 1 and a primer comprising SEQ ID NO: 2;
A combination of a primer comprising SEQ ID NO: 3 and a primer comprising SEQ ID NO: 4;
A combination of a primer comprising SEQ ID NO: 5 and a primer comprising SEQ ID NO: 6; and a combination of a primer comprising SEQ ID NO: 7 and a primer comprising SEQ ID NO: 8;
A combination of at least one primer selected from the group consisting of:
［８］上記［６］は［７］に記載のプライマーの組合せを含む、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）を菌株レベルで識別するためのキット。 [8] A kit for identifying Fusobacterium nucleatum at the strain level, comprising the combination of primers according to [7] above [6].
本発明は、試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムを菌株レベルの識別に利用できる点で有用である。特に、唾液や糞便、組織などの臨床検体中に含まれるフソバクテリウム・ヌクレアタムを培養を経ずに菌株レベルで検出・識別できる点で有用である。 The present invention is useful in that Fusobacterium nucleatum in a sample can be used for strain level discrimination. In particular, it is useful in that Fusobacterium nucleatum contained in clinical specimens such as saliva, feces and tissues can be detected and identified at the strain level without culturing.
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 The present invention will be specifically described below, but the present invention is not limited thereto.
本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。 Unless defined otherwise herein, scientific and technical terms used in connection with the present invention shall have the meanings that are commonly understood by those of ordinary skill in the art.
本明細書においてCRISPRとは、細菌ゲノムにおいて、CRISPR関連たんぱく質（Ｃａｓ）をコードする遺伝子の下流側に存在する反復配列をいう。本明細書においてCRISPR領域とは、CRISPRを持つ可能性のある領域を意味する。CRISPR領域にはスペーサーと呼ばれる配列断片が通常複数存在するが、菌株によってはスペーサーを含まないものもあり得る。本明細書においては、このスペーサーを含まない菌株についても、スペーサーを含み得るＣａｓ遺伝子の下流側に存在する領域を、便宜上CRISPR領域と記載する。 As used herein, CRISPR refers to a repetitive sequence present downstream of a gene encoding a CRISPR-related protein (Cas) in the bacterial genome. In this specification, the CRISPR region means a region that may have CRISPR. A plurality of sequence fragments called spacers are usually present in the CRISPR region, but some strains may not contain a spacer. In the present specification, even for a strain not containing a spacer, a region existing on the downstream side of a Cas gene that may contain a spacer is referred to as a CRISPR region for convenience.
本明細書においてCRISPR-Cas領域とは、CRISPR領域およびＣａｓ遺伝子の少なくとも一部を含む細菌ゲノム中の領域をいう。本明細書においてCRISPR-Cas配列とは、Ｃａｓ遺伝子の少なくとも一部およびCRISPR領域の配列を含む配列をいう。 In the present specification, the CRISPR-Cas region refers to a region in the bacterial genome including at least a part of the CRISPR region and the Cas gene. In the present specification, the CRISPR-Cas sequence refers to a sequence including at least a part of the Cas gene and the sequence of the CRISPR region.
本発明者らは、フソバクテリウム・ヌクレアタムのゲノム中に、４箇所のCRISPR領域が存在することを見出した。この４箇所のCRISPR領域を、非特許文献３、４の分類法に従い、それぞれタイプＩ−Ｂ（１）、タイプＩ−Ｂ（２）、タイプＩＩ−Ａ、タイプＩＩＩ−Ａとして特定した。上記のCRISPR領域は、図１〜４の模式図に表され、それぞれ以下のように特定できる。
・タイプＩ−Ｂ（１）：国際塩基配列データベース（ＩＮＳＤ）アクセッションナンバーCP012713であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種アニマリスKCOM 1279株のゲノムの2,454,881 bp〜2,463,504 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプI-B）の３’側に存在するCRISPR領域。ここで、KCOM 1279株のゲノムにおけるタイプＩ−Ｂ（１）のCas遺伝子は、上記アクセッションナンバーで開示されている配列に対して相補鎖側の５’→３’の向きで存在する。
・タイプＩ−Ｂ（２）：ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP013121であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルファムChDC F306株のゲノムの1,070,083 bp〜1,078,752 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプI-B）の３’側に存在するCRISPR領域。ここで、ChDC F306株のゲノムにおけるタイプＩ−Ｂ（２）のCas遺伝子は、上記アクセッションナンバーで開示されている配列に対して相補鎖側の５’→３’の向きで存在する。
・タイプＩＩ−Ａ：ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP012714であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヴィンセンティChDC F8 KCOM 1231株のゲノムの1,100,111 bp〜1,106,109 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプII-A）の３’側に存在するCRISPR領域。ここで、ChDC F8 KCOM 1231株のゲノムにおけるタイプＩＩ−ＡのCas遺伝子は、上記アクセッションナンバーで開示されている配列に対して相補鎖側の５’→３’の向きで存在する。
・タイプＩＩＩ−Ａ：ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP013121であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルファム ChDC F306株のゲノムの279,908 bp〜289,159 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプIII-A）の３’側に存在するCRISPR領域。ここで、ChDC F306株のゲノムにおけるタイプＩＩＩ−ＡのCas遺伝子は、上記アクセッションナンバーで開示されている配列における５’→３’の向きで存在する。
The present inventors have found that there are four CRISPR regions in the genome of Fusobacterium nucleatum. These four CRISPR regions were identified as type IB (1), type IB (2), type II-A, and type III-A, respectively, according to the classification methods of Non-Patent Documents 3 and 4. Said CRISPR area | region is represented to the schematic diagram of FIGS. 1-4, and can each be specified as follows.
Type IB (1): Cas gene group present in the 2,454,881 bp to 2,463,504 bp or the corresponding region of the genome of Fusobacterium nucleatum subspecies animalis KCOM 1279 strain with international base sequence database (INSD) accession number CP012713 CRISPR region existing on the 3 'side of (Type IB). Here, the type I-B (1) Cas gene in the genome of the KCOM 1279 strain exists in the 5 ′ → 3 ′ direction on the complementary strand side with respect to the sequence disclosed in the above accession number.
Type IB (2): 3 of Cas gene group (type IB) existing in the genome of 1,070,083 bp to 1,078,752 bp of Fusobacterium nucleatum subsp. Polymorphum ChDC F306 strain with INSD accession number CP013121 or the corresponding region 'CRISPR region that exists on the side. Here, the type I-B (2) Cas gene in the genome of the ChDC F306 strain is present in the 5 ′ → 3 ′ direction on the complementary strand side with respect to the sequence disclosed in the above accession number.
Type II-A: Cas gene group present in the 1,100,111 bp to 1,106,109 bp or the corresponding region of the genome of Fusobacterium nucleatum subspecies Vincenti ChDC F8 KCOM 1231 strain with INSD accession number CP012714 (type II-A) CRISPR region existing on the 3 'side of Here, the type II-A Cas gene in the ChDC F8 KCOM 1231 genome exists in the 5 ′ → 3 ′ direction on the complementary strand side with respect to the sequence disclosed in the accession number.
-Type III-A: 3 'of Cas gene group (type III-A) present in 279,908 bp to 289,159 bp of the genome of Fusobacterium nucleatum subsp. Polymorphum ChDC F306 strain having INSD accession number CP013121 or a region corresponding thereto CRISPR region that exists on the side. Here, the type III-A Cas gene in the genome of the ChDC F306 strain exists in the 5 ′ → 3 ′ direction in the sequence disclosed in the above accession number.
したがって、本明細書において、タイプＩ−Ｂ（１）、タイプＩ−Ｂ（２）、タイプＩＩ−ＡまたはタイプＩＩＩ−ＡのCRISPR領域というときは、上記の特定に従ってその領域が特定される。 Therefore, in this specification, when referring to a type I-B (1), type I-B (2), type II-A or type III-A CRISPR region, the region is specified according to the above specification.
本明細書においてＤＮＡとはデオキシリボ核酸を意味する。 In this specification, DNA means deoxyribonucleic acid.
フソバクテリウム・ヌクレアタムを菌株レベルで識別する方法
一態様において本発明は、試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムを菌株レベルで識別する方法であって、当該試料由来のＤＮＡにおいて、タイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR領域、タイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR領域、タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域、およびタイプＩＩＩ−ＡのCRISPR領域、からなる群より選択される少なくとも１つの領域について、当該領域を含むCRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さを検出することを含む、前記方法に関する。
Method for identifying Fusobacterium nucleatum at strain level In one embodiment, the present invention relates to a method for identifying Fusobacterium nucleatum in a sample at the strain level, wherein the DNA derived from the sample is CRISPR of type IB (1). CRISPR-Cas containing the region for at least one region selected from the group consisting of region, type I-B (2) CRISPR region, type II-A CRISPR region, and type III-A CRISPR region It relates to said method comprising detecting the presence or absence of a sequence and the length of said sequence.
好ましい態様において本発明の方法は、タイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR領域、タイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR領域、タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域、およびタイプＩＩＩ−ＡのCRISPR領域、からなる群より選択される少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つすべての領域について、当該領域をCRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さを検出することを含んでもよい。 In a preferred embodiment, the method of the present invention comprises a type I-B (1) CRISPR region, a type I-B (2) CRISPR region, a type II-A CRISPR region, and a type III-A CRISPR region. For at least two, at least three, or all four regions selected from the group, the region may include detecting the presence or absence of the CRISPR-Cas sequence and the length of the sequence.
本発明の方法に使用する試料は、フソバクテリウム・ヌクレアタムのゲノムＤＮＡを含む試料であれば、いかなる試料であってもよい。試料の例としては、唾液、血液、糞便、組織、単離したフソバクテリウム・ヌクレアタムの細胞、が挙げられるが、これらに限定されない。試料は凍結試料であってもよい。 The sample used in the method of the present invention may be any sample as long as it is a sample containing Fusobacterium nucleatum genomic DNA. Examples of samples include, but are not limited to, saliva, blood, stool, tissue, and isolated Fusobacterium nucleatum cells. The sample may be a frozen sample.
本発明の方法において、試料由来のＤＮＡとは、試料より単離または抽出された状態のＤＮＡであってもよく、試料を溶解液等で溶解しただけのクルードの状態のＤＮＡであってもよい。 In the method of the present invention, the sample-derived DNA may be DNA in a state isolated or extracted from the sample, or may be in a crude state in which the sample is simply dissolved in a lysing solution or the like. .
したがって、本発明の方法は、CRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さを検出する工程の前に、試料を得る工程、または試料由来のＤＮＡを得る工程を含んでいてもよい。 Therefore, the method of the present invention may comprise a step of obtaining a sample or a sample-derived DNA prior to the step of detecting the presence or absence of the CRISPR-Cas sequence and the length of the sequence.
本発明の方法におけるCRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さの検出は、タイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR領域、タイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR領域、タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域、およびタイプＩＩＩ−ＡのCRISPR領域、からなる群より選択される少なくとも１つの領域、好ましくは少なくとも２つの領域、少なくとも３つの領域、または４つすべての領域について、当該領域を含むCRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さの検出が可能な公知の手法を用いて行うことができる。好ましくは、そのような手法は、当該領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことが含まれる。 The presence / absence of the CRISPR-Cas sequence and the length of the sequence in the method of the present invention are detected by CRISPR region of type IB (1), CRISPR region of type IB (2), and CRISPR region of type II-A. And at least one region selected from the group consisting of a CRISPR region of type III-A, preferably at least two regions, at least three regions, or all four regions. Can be carried out using a known technique capable of detecting the presence or absence of the DNA and the length of the sequence. Preferably, such a technique includes performing a polymerase chain reaction (PCR) using a combination of primers capable of amplifying DNA containing the region.
ＰＣＲの条件は、使用するプライマーのＴｍ等に基づいて当業者が適宜決定することができる。例えば、後述する実施例４（２）に示した反応液および反応条件を採用することができる。 PCR conditions can be appropriately determined by those skilled in the art based on the Tm and the like of the primers used. For example, the reaction solution and reaction conditions shown in Example 4 (2) described later can be employed.
本発明の方法に使用するプライマーの組合せは、次の「プライマー」の項目に記載するプライマーを含む組合せであってよい。 The primer combination used in the method of the present invention may be a combination including the primers described in the following “Primer” item.
CRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さの検出は、例えば、ＰＣＲ産物の電気泳動により行うことができる。電気泳動は、当業者に公知の方法により行えばよく、例えばアガロースゲル電気泳動により行ってもよい。別の態様において、CRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さの検出は、例えば、ＰＣＲ産物についての塩基配列決定により行うこともできる。 The presence or absence of the CRISPR-Cas sequence and the length of the sequence can be detected, for example, by electrophoresis of PCR products. Electrophoresis may be performed by a method known to those skilled in the art, for example, agarose gel electrophoresis. In another embodiment, the presence / absence of the CRISPR-Cas sequence and the length of the sequence can be detected, for example, by determining the nucleotide sequence of the PCR product.
本発明の方法において、試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムの識別は、識別対象の試料由来のＤＮＡに対するＰＣＲ産物の電気泳動パターンと、比較対象の試料由来のＤＮＡに対するＰＣＲ産物の電気泳動パターンとが一致する場合、識別対象の試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムは、比較対象の試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムと同一菌株であると識別することを含んでもよい。電気泳動パターンが一致するとは、当該ＰＣＲ産物について電気泳動で現れるバンドの位置（すなわちＰＣＲ産物の長さ）が、識別対象の試料由来のＤＮＡについて得られるＰＣＲ産物と比較対象の試料由来のＤＮＡについて得られるＰＣＲ産物とで一致することをいう。 In the method of the present invention, for the identification of Fusobacterium nucleatum in the sample, the electrophoresis pattern of the PCR product for the DNA derived from the sample to be identified matches the electrophoresis pattern of the PCR product for the DNA derived from the sample to be compared. In some cases, the Fusobacterium nucleatum in the sample to be identified may include identifying the same strain as the Fusobacterium nucleatum in the sample to be compared. When the electrophoresis pattern matches, the position of the band that appears in electrophoresis for the PCR product (ie, the length of the PCR product) is the same as that for the DNA derived from the sample to be identified and the DNA from the sample to be compared. Matching with the obtained PCR product.
本明細書において、「識別対象の試料」とは、フソバクテリウム・ヌクレアタムの有無、または当該試料中に含まれるフソバクテリウム・ヌクレアタムの菌株の識別について検査または分析の対象となる試料をいう。 In the present specification, the “sample to be identified” refers to a sample to be examined or analyzed for the presence or absence of Fusobacterium nucleatum or the identification of a strain of Fusobacterium nucleatum contained in the sample.
本明細書において「比較対象の試料」とは、比較対象のフソバクテリウム・ヌクレアタムを含む試料であれば特に限定されない。比較対象のフソバクテリウム・ヌクレアタムは、菌株レベルで分離・同定されたもの（すなわち、F. nucleatumの分離株または公知の標準菌株）であってもよく、菌株の分離・同定がされていないものであってもよい。 In the present specification, the “sample for comparison” is not particularly limited as long as it is a sample containing Fusobacterium nucleatum for comparison. The Fusobacterium nucleatum to be compared may be one that has been isolated and identified at the strain level (ie, an isolate of F. nucleatum or a known standard strain) and has not been isolated or identified. May be.
比較対象のフソバクテリウム・ヌクレアタムが、菌株レベルで分離・同定されたものである場合、本発明の方法は識別対象の試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムが、既に同定された菌株と同一か否かを判定するのに用いることができる。 When the comparison Fusobacterium nucleatum is isolated and identified at the strain level, the method of the present invention determines whether the Fusobacterium nucleatum in the sample to be identified is the same as the strain already identified. Can be used.
比較対象のフソバクテリウム・ヌクレアタムが、菌株レベルで分離・同定されたものではない場合としては、例えば、本発明の方法を以下の目的に適用する場合が想定される。
・識別対象の試料中に含まれるフソバクテリウム・ヌクレアタムが、比較対象の別検体中に含まれる菌株未知のフソバクテリウム・ヌクレアタムと同一株であるか否かを識別する。
・ある集団の検体について、個体の違いを超えて同一菌株が存在するか否かを識別する。・ある個体の検体またはある集団の検体について、何種類の菌株が存在するかを判定する。
As a case where Fusobacterium nucleatum to be compared is not separated and identified at the strain level, for example, a case where the method of the present invention is applied to the following object is assumed.
Identify whether Fusobacterium nucleatum contained in the sample to be identified is the same strain as Fusobacterium nucleatum unknown in the other sample to be compared.
・ Identify whether or not the same strain exists in a group of specimens across individual differences. Determine how many strains exist for a sample of an individual or a sample of a group.
プライマー
一態様において本発明は、上記タイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR領域、タイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR領域、タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域、およびタイプＩＩＩ−ＡのCRISPR領域、からなる群より選択される少なくとも１つの領域、好ましくは少なくとも２つの領域、少なくとも３つの領域、または４つすべての領域について、当該領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーに関する。
In one embodiment of the primer , the present invention comprises the above type IB (1) CRISPR region, type IB (2) CRISPR region, type II-A CRISPR region, and type III-A CRISPR region. The present invention relates to a primer capable of amplifying DNA containing at least one region selected from the group, preferably at least two regions, at least three regions, or all four regions.
上記タイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーには、配列番号１に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および／または配列番号２に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーが含まれる。上記のフォワードプライマーとリバースプライマーはプライマーの組合せとして用いてもよい。上記プライマーの位置についての概略図を図１に示す。配列番号１は、上記タイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR領域の上流側（５’側）に存在するＣａｓ遺伝子の一部の配列である。配列番号２は、上記タイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR領域の下流側（３’側）に存在する保存遺伝子の一部の配列である。ここで、上記タイプＩ−Ｂ（１）のCas遺伝子はＩＮＳＤアクセッションナンバーCP012713で開示されているゲノム配列に対して相補鎖側の５’→３’の向きで存在する点に留意すべきである。CRISPR領域の上流側、下流側は、近接して存在しているＣａｓ遺伝子コード鎖の方向に従う。フォワードプライマーおよびリバースプライマーを上記の観点で設計することにより、上記タイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR領域を挟むプライマーの組合せを得ることができる。 The primer capable of amplifying DNA containing the CRISPR region of type IB (1) is a part of a base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 1, A forward primer having a base length and / or a reverse primer having a length of 15 to 30 bases complementary to a part of the base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 2 included. The above forward primer and reverse primer may be used as a combination of primers. A schematic diagram of the positions of the primers is shown in FIG. SEQ ID NO: 1 is a partial sequence of the Cas gene existing upstream (5 ′ side) of the CRISPR region of type IB (1). SEQ ID NO: 2 is a partial sequence of a conserved gene existing downstream (3 ′ side) of the CRISPR region of type IB (1). Here, it should be noted that the Cas gene of type IB (1) is present in the 5 ′ → 3 ′ direction on the complementary strand side with respect to the genomic sequence disclosed in INSD accession number CP012713. is there. The upstream side and the downstream side of the CRISPR region follow the direction of the Cas gene coding chain existing in close proximity. By designing the forward primer and the reverse primer from the above viewpoint, a combination of primers sandwiching the CRISPR region of type IB (1) can be obtained.
上記タイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーには、配列番号３に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および／または配列番号４に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーが含まれる。上記のフォワードプライマーとリバースプライマーはプライマーの組合せとして用いてもよい。上記プライマーの位置についての概略図を図２に示す。配列番号３は、上記タイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR領域の上流側（５’側）に存在するＣａｓ遺伝子の一部の配列である。配列番号４は、上記タイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR領域の下流側（３’側）に存在する保存遺伝子の一部の配列である。ここで、上記タイプＩ−Ｂ（２）のCas遺伝子はＩＮＳＤアクセッションナンバーCP013121で開示されているゲノム配列に対して相補鎖側の５’→３’の向きで存在する点に留意すべきである。CRISPR領域の上流側、下流側は、近接して存在しているＣａｓ遺伝子コード鎖の方向に従う。フォワードプライマーおよびリバースプライマーを上記の観点で設計することにより、上記タイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR領域を挟むプライマーの組合せを得ることができる。 The primer capable of amplifying DNA containing the CRISPR region of type IB (2) is a part of a base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 3, A forward primer having a base length and / or a reverse primer having a length of 15 to 30 bases complementary to a part of the base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 4 included. The above forward primer and reverse primer may be used as a combination of primers. A schematic diagram of the positions of the primers is shown in FIG. SEQ ID NO: 3 is a partial sequence of the Cas gene present on the upstream side (5 ′ side) of the CRISPR region of type IB (2). SEQ ID NO: 4 is a partial sequence of a conserved gene existing downstream (3 ′ side) of the CRISPR region of type IB (2). Here, it should be noted that the above type IB (2) Cas gene exists in the 5 ′ → 3 ′ direction on the complementary strand side with respect to the genomic sequence disclosed in INSD accession number CP013121. is there. The upstream side and the downstream side of the CRISPR region follow the direction of the Cas gene coding chain existing in close proximity. By designing the forward primer and the reverse primer from the above viewpoint, a combination of primers sandwiching the CRISPR region of type IB (2) can be obtained.
上記タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーには、配列番号５に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および／または配列番号６に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーが含まれる。上記のフォワードプライマーとリバースプライマーはプライマーの組合せとして用いてもよい。上記プライマーの位置についての概略図を図３に示す。配列番号５は、上記タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域の上流側（５’側）に存在するＣａｓ遺伝子の一部の配列である。配列番号６は、上記タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域の下流側（３’側）に存在する保存遺伝子の一部の配列である。ここで、上記タイプＩＩ−ＡのCas遺伝子はＩＮＳＤアクセッションナンバーCP012714で開示されているゲノム配列に対して相補鎖側の５’→３’の向きで存在する点に留意すべきである。CRISPR領域の上流側、下流側は、近接して存在しているＣａｓ遺伝子コード鎖の方向に従う。フォワードプライマーおよびリバースプライマーを上記の観点で設計することにより、上記タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域を挟むプライマーの組合せを得ることができる。 The primer capable of amplifying DNA containing the CRISPR region of type II-A is a part of a base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 5, and has a length of 15 to 30 bases And / or a reverse primer having a length of 15 to 30 bases complementary to a part of the base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 6. The above forward primer and reverse primer may be used as a combination of primers. A schematic diagram of the positions of the primers is shown in FIG. SEQ ID NO: 5 is a partial sequence of the Cas gene existing upstream (5 ′ side) of the type II-A CRISPR region. SEQ ID NO: 6 is a partial sequence of a conserved gene present on the downstream side (3 ′ side) of the CRISPR region of type II-A. Here, it should be noted that the type II-A Cas gene is present in the 5 'to 3' direction on the complementary strand side with respect to the genomic sequence disclosed in INSD accession number CP012714. The upstream side and the downstream side of the CRISPR region follow the direction of the Cas gene coding chain existing in close proximity. By designing the forward primer and the reverse primer from the above viewpoint, a combination of primers sandwiching the CRISPR region of type II-A can be obtained.
上記タイプＩＩＩ−ＡのCRISPR領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーには、配列番号７に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および／または配列番号８に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーが含まれる。上記のフォワードプライマーとリバースプライマーはプライマーの組合せとして用いてもよい。上記プライマーの位置についての概略図を図４に示す。配列番号７は、上記タイプＩＩＩ−ＡのCRISPR領域の上流側（５’側）に存在するＣａｓ遺伝子の一部の配列である。配列番号８は、上記タイプＩＩＩ−ＡのCRISPR領域の下流側（３’側）に存在する保存遺伝子の一部の配列である。ここで、上記タイプＩＩＩ−ＡのCas遺伝子はＩＮＳＤアクセッションナンバーCP013121で開示されているゲノム配列の５’→３’の向きで存在し、CRISPR領域の上流側、下流側は、近接して存在しているＣａｓ遺伝子コード鎖の方向に従う。フォワードプライマーおよびリバースプライマーを上記の観点で設計することにより、上記タイプＩＩＩ−ＡのCRISPR領域を挟むプライマーの組合せを得ることができる。 The primer capable of amplifying DNA containing the CRISPR region of type III-A is a part of a base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 7, and has a length of 15 to 30 bases And / or a reverse primer having a length of 15 to 30 bases complementary to a part of the base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 8. The above forward primer and reverse primer may be used as a combination of primers. A schematic diagram of the positions of the primers is shown in FIG. SEQ ID NO: 7 is a partial sequence of the Cas gene existing upstream (5 ′ side) of the type III-A CRISPR region. SEQ ID NO: 8 is a partial sequence of a conserved gene present on the downstream side (3 ′ side) of the type III-A CRISPR region. Here, the above type III-A Cas gene is present in the 5 ′ → 3 ′ direction of the genome sequence disclosed in INSD accession number CP013121, and the upstream and downstream sides of the CRISPR region are close to each other. Follow the direction of the Cas gene coding strand. By designing the forward primer and the reverse primer from the above viewpoint, a combination of primers sandwiching the type III-A CRISPR region can be obtained.
本明細書において、特定の塩基配列に対して「少なくとも８５％以上の同一性」は、好ましくは、特定の塩基配列に対して少なくとも９０％以上、少なくとも９５％以上、少なくとも９８％以上、少なくとも９９％以上、または１００％の同一性であってもよい。 In the present specification, “at least 85% or more identity” with respect to a specific base sequence is preferably at least 90% or higher, at least 95% or higher, at least 98% or higher, or at least 99 with respect to a specific base sequence % Or more, or 100% identity.
本明細書において、ＤＮＡ配列についての同一性は、視覚的検査や数学的計算により決定することができるが、コンピュータープログラムを使用して２つの核酸の配列情報を比較することにより決定してもよい。配列比較コンピュータープログラムとしては、例えば、MUSCLE（Edgar, R. C., Nucleic acids research, Vol.32, No.5, 1792-1797, 2004）やClustalW（Higgins D.ら、Nucleic Acids Res. Vol.22, pp.4673-4680, 1994）等があげられる。配列の整列に使用する標準的なデフォルトパラメーターの設定は、MUSCLEではgap penaltiesパラメーターのgap openは-400、gap extendは0である。その他のパラメーターとして、max memoryは849MB、max iterationsについては8回、オプションのclustering methodはすべてUPGMB、min diag lengthは24である。ClustalWでは、pairwise alignmentパラメーターならびにmultiple alignmentパラメーターのgap opening penaltyは15、gap extension penaltyは6.66であり、DNA weight matrixはIUB、transition weightは0.5、negative matrixの仕様はOFF、delay divergent cutoffは30%である。 In the present specification, the identity of a DNA sequence can be determined by visual inspection or mathematical calculation, but may be determined by comparing the sequence information of two nucleic acids using a computer program. . Examples of the sequence comparison computer program include MUSCLE (Edgar, RC, Nucleic acids research, Vol. 32, No. 5, 1792-1797, 2004) and ClustalW (Higgins D. et al., Nucleic Acids Res. Vol. 22, pp. .4673-4680, 1994). The standard default parameter settings used to align sequences are -400 for gap open and -0 for gap extend in the gap penalties parameter for MUSCLE. As other parameters, max memory is 849MB, max iterations is 8 times, optional clustering method is UPGMB, and min diag length is 24. In ClustalW, pair opening alignment parameter and multiple alignment parameter gap opening penalty is 15, gap extension penalty is 6.66, DNA weight matrix is IUB, transition weight is 0.5, negative matrix specification is OFF, delay divergent cutoff is 30% is there.
別の態様において、上記タイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーに、配列番号９を含むフォワードプライマー、および／または配列番号１０を含むリバースプライマーが含まれる。上記のフォワードプライマーとリバースプライマーはプライマーの組合せとして用いてもよい。 In another embodiment, the primer capable of amplifying a DNA containing the CRISPR region of type IB (1) includes a forward primer containing SEQ ID NO: 9 and / or a reverse primer containing SEQ ID NO: 10. The above forward primer and reverse primer may be used as a combination of primers.
上記タイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーには、配列番号１１を含むフォワードプライマー、および／または配列番号１２を含むリバースプライマーが含まれる。上記のフォワードプライマーとリバースプライマーはプライマーの組合せとして用いてもよい。 The primer capable of amplifying DNA containing the CRISPR region of type IB (2) includes a forward primer containing SEQ ID NO: 11 and / or a reverse primer containing SEQ ID NO: 12. The above forward primer and reverse primer may be used as a combination of primers.
上記タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーには、配列番号１３を含むフォワードプライマー、および／または配列番号１４を含むリバースプライマーが含まれる。上記のフォワードプライマーとリバースプライマーはプライマーの組合せとして用いてもよい。 The primer capable of amplifying DNA containing the CRISPR region of type II-A includes a forward primer containing SEQ ID NO: 13 and / or a reverse primer containing SEQ ID NO: 14. The above forward primer and reverse primer may be used as a combination of primers.
上記タイプＩＩＩ−ＡのCRISPR領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーには、配列番号１５を含むフォワードプライマー、および／または配列番号１６を含むリバースプライマーが含まれる。上記のフォワードプライマーとリバースプライマーはプライマーの組合せとして用いてもよい。 The primer capable of amplifying DNA containing the type III-A CRISPR region includes a forward primer containing SEQ ID NO: 15 and / or a reverse primer containing SEQ ID NO: 16. The above forward primer and reverse primer may be used as a combination of primers.
キット
一態様において、本発明は、上記「プライマー」の項目において記載するプライマーを含む、フソバクテリウム・ヌクレアタムを菌株レベルで識別するためのキットに関する。
In one embodiment of the kit , the present invention relates to a kit for distinguishing Fusobacterium nucleatum at the strain level, comprising the primer described in the item “Primer” above.
本発明のキットは、本発明のプライマーを溶液または凍結乾燥品として含むものであってもよい。当該溶液または凍結乾燥品は適切に包装されていてよい。本発明のキットはまた、本発明の方法を実施するための指示が記載された説明書を含むものであってもよい。 The kit of the present invention may contain the primer of the present invention as a solution or a lyophilized product. The solution or lyophilized product may be appropriately packaged. The kit of the present invention may also include instructions containing instructions for performing the method of the present invention.
本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供する。しかし、これらは例示目的とするものであって、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
Although the present invention has been generally described, specific examples are provided herein for reference for further understanding. However, these are for illustrative purposes, and the scope of the present invention is not limited thereto.
実施例１：フソバクテリウム・ヌクレアタムのCRISPR−Ｃａｓ領域の探索
NCBIデータベースに登録されているフソバクテリウム・ヌクレアタム（F. nucleatum）の５亜種２８株（表１）のゲノム配列中のCRISPR関連タンパク質（Ｃａｓ）遺伝子の検索、ならびにCRISPRfinderプログラム (http://CRISPR.i2bc.paris-saclay.fr/Server/)を用いてCRISPRの探索を行い、CRISPR-Cas領域を探索した。
Example 1: Search for CRISPR-Cas region of Fusobacterium nucleatum
Search for CRISPR-related protein (Cas) genes in the genome sequence of F. nucleatum 5 subspecies 28 strains (Table 1) registered in the NCBI database, and the CRISPRfinder program (http: // CRISPR. CRISPR was searched using i2bc.paris-saclay.fr/Server/), and the CRISPR-Cas region was searched.
上記の探索の結果、F. nucleatumは亜種に限らず、CRISPR-Casを保存する可能性のある領域をゲノム中に４か所有し、その前後の遺伝子は保存されていることが分かった（図１〜４）。CRISPRはＣａｓ遺伝子の種類などによってタイプ分けされているが（非特許文献３、４）、F. nucleatumで見つかった４つのCRISPRタイプは、タイプＩ−Ｂが２種類（タイプＩ−Ｂ（１）、タイプＩ−Ｂ（２）と記載する）、タイプＩＩ−Ａ、タイプＩＩＩ−Ａが各一種類ずつであった（表１）。タイプＩ−Ｂ（１）は亜種アニマリス（F. nucleatum subsp. animalis）、タイプＩ−Ｂ（２）は亜種ポリモルファム（F. nucleatum subsp. polymorphum）と亜種ヌクレアタム（F. nucleatum subsp. nucleatum）、タイプＩＩ−Ａは亜種ヴィンセンティ（F. nucleatum subsp. vincentii）、タイプＩＩＩ−Ａは亜種ポリモルファムが保有する傾向が見られた。 As a result of the above search, it was found that F. nucleatum is not limited to subspecies but possesses 4 regions in the genome that may conserve CRISPR-Cas, and the genes before and after that are conserved ( 1 to 4). CRISPR is classified according to the type of Cas gene (Non-Patent Documents 3 and 4), but the four CRISPR types found in F. nucleatum are two types (Type IB (1)). , Type IB (2)), type II-A, and type III-A, one each (Table 1). Type IB (1) is a subspecies animalis (F. nucleatum subsp. Animalis), type IB (2) is a subspecies polymorphum (F. nucleatum subsp. Polymorphum) and subspecies nucleatum (F. nucleatum subsp. Nucleatum) ), Type II-A tends to be retained by subspecies Vincentii, and type III-A possesses subspecies polymorphum.
ここで、上記F. nucleatumで見つかったCRISPRは、それぞれ次のように特定することもできる。
・タイプＩ−Ｂ（１）は、ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP012713であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種アニマリスKCOM 1279株のゲノムの2,454,881 bp〜2,463,504 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプI-B）の３’側に存在するCRISPR領域である。
・タイプＩ−Ｂ（２）は、ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP013121であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルファムChDC F306株のゲノムの1,070,083 bp〜1,078,752 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプI-B）の３’側に存在するCRISPR領域である。
・タイプＩＩ−Ａは、ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP012714であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヴィンセンティChDC F8 KCOM 1231株のゲノムの1,100,111 bp〜1,106,109 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプII-A）の３’側に存在するCRISPR領域である。
・タイプＩＩＩ−Ａは、ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP013121であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルファム ChDC F306株のゲノムの279,908 bp〜289,159 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプIII-A）の３’側に存在するCRISPR領域である。
Here, CRISPR found in the above F. nucleatum can also be specified as follows.
-Type IB (1) is a gene group of Cas genes (type IB) present in the 2,454,881 bp to 2,463,504 bp or corresponding region of the genome of Fusobacterium nucleatum subspecies animalis KCOM 1279 having INSD accession number CP012713 It is a CRISPR region existing on the 3 ′ side.
-Type IB (2) is a Cas gene group (type IB) present in the genome of 1,070,083 bp to 1,078,752 bp of Fusobacterium nucleatum subtype polymorphum ChDC F306 strain having INSD accession number CP013121 or the corresponding region. It is a CRISPR region existing on the 3 ′ side.
Type II-A is a group of Cas genes (type II-A) present in 1,100,111 bp to 1,106,109 bp of the genome of Fusobacterium nucleatum subspecies Vincenti ChDC F8 KCOM 1231 having INSD accession number CP012714 or the corresponding region. ) On the 3 ′ side.
Type III-A is a group of Cas genes (type III-A) present in the 279,908 bp to 289,159 bp of the genome of Fusobacterium nucleatum subsp. Polymorphum ChDC F306 strain having INSD accession number CP013121 or a region corresponding thereto. 'It is the CRISPR region that exists on the side.
実施例２：試験に使用するフソバクテリウム・ヌクレアタム菌株の調製
（１）試験に使用したF. nucleatum株
標準菌株としてはF. nucleatum subsp. animalis JCM 11025T、F. nucleatum subsp. fusiforme JCM 11024T、F. nucleatum subsp. nucleatum JCM 8532T、F. nucleatum subsp. polymorphum JCM 12990T、F. nucleatum subsp. vincentii JCM 11023Tの５株（国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンターに登録されている標準菌株）と、協同乳業（株）研究所で保存していた臨床検体から分離した分離株２１株を使用した。各菌株は、純粋培養し、16S rRNA遺伝子の全長を27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（配列番号１７））（Young, B. K.ら、Prostaglandins and medicine, Vol.6, No.3, pp.257-265 (1981)）と1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’（配列番号１８））（Lane, D.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.82, pp.6955-6959 (1985)）プライマーを使用して増幅し、増幅断片をサンガーシークエンスした。得られた配列より分離株の亜種を決定し、実験に供した。分離株の亜種の内訳は、アニマリスが１０株、ポリモルファムが９株、ヴィンセンティが１株、ヌクレアタムが１株であった。
Example 2: Preparation of Fusobacterium nucleatum strain used for test (1) F. nucleatum subsp. Animalis JCM 11025 T , F. nucleatum subsp. Fusiforme JCM 11024 T , F nucleatum subsp. nucleatum JCM 8532 T , F. nucleatum subsp. polymorphum JCM 12990 T , F. nucleatum subsp. vincentii JCM 11023 T (standard strains registered with the RIKEN BioResource Center) 21 isolates isolated from clinical specimens stored at Kyodo Dairy Co., Ltd. Laboratories were used. Each strain was purely cultured and the full length of the 16S rRNA gene was 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '(SEQ ID NO: 17)) (Young, BK et al., Prostaglandins and medicine, Vol. 6, No. 3, pp. 257). -265 (1981)) and 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 '(SEQ ID NO: 18)) (Lane, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.82, pp.6955-6959 (1985) )) Amplification was performed using primers, and the amplified fragment was subjected to Sanger sequencing. The subspecies of the isolate was determined from the obtained sequence and used for the experiment. The breakdown of the isolates was 10 animalis, 9 polymorphams, 1 Vincenti and 1 Nucleatum.
アービトラリリーポリメラーゼ連鎖反応（Arbitrarily primed polymerase chain reaction／ＡＰ−ＰＣＲ)
単離した複数のコロニーが同じ株由来か否かの確認はＡＰ−ＰＣＲ法を用いて確認した（Haraldsson, G., et al., J. Med. Microbiol., Vol.53, pp.161-165, doi:10.1099/jmm.0.5441-0 (2004)）。プライマーはC1 (5’-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-3’（配列番号１９）)、D8635 (5’-GAGCGGCCAAAGGGAGCAGAC-3’（配列番号２０）)、もしくはD11344 (5’-AGTGAATTCGCGGTGAGATGCCA-3’（配列番号２１）)を使用した。クルードサンプルをテンプレートとし、１× Ex Taq Buffer、２００μＭの各ｄＮＴＰ、８００ｎＭのプライマー、０．３８Ｕ Ex Taq Hot Start Version （TaKaRa）を含む全溶液量１５μｌのＰＣＲ反応液を使用した。温度条件はHaraldssonら（同上）と同じ条件（９４℃５分の変性と３５℃５分間のアニーリング後、９４℃３分、３７℃３分、７２℃３分の３ステップを５回、さらに９４℃１分、５５℃１分、７２℃３分の３ステップを３０回繰り返し、最後に７２℃１０分間の伸長を行った）でＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物は１×ＴＢＥに溶解した１．５％アガロースにローディングし、１×ＴＢＥ中で５０Ｖ、６０分間電気泳動した。ゲルはエチジウムブロマイドで染色し、ＤＮＡ断片のバンドパターンは紫外線のイメージャーを用いて可視化した。３種類のプライマーによる増幅産物のすべてで同じバンドパターンを示すものを、同じ株由来の菌体とした。
Arbitrarily primed polymerase chain reaction / AP-PCR
Whether or not a plurality of isolated colonies originated from the same strain was confirmed using the AP-PCR method (Haraldsson, G., et al., J. Med. Microbiol., Vol. 53, pp. 161- 165, doi: 10.1099 / jmm.0.5441-0 (2004)). The primer is C1 (5'-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-3 '(SEQ ID NO: 19)), D8635 (5'-GAGCGGCCAAAGGGAGCAGAC-3' (SEQ ID NO: 20)), or D11344 (5'-AGTGAATTCGCGGTGAGATGCCA-3 '(SEQ ID NO: 21)) It was used. Using a crude sample as a template, a PCR reaction solution having a total solution amount of 15 μl containing 1 × Ex Taq Buffer, 200 μM each dNTP, 800 nM primer, and 0.38 U Ex Taq Hot Start Version (TaKaRa) was used. Temperature conditions are the same as those of Haraldsson et al. PCR was carried out at 30 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 3 minutes 30 times, and finally extension at 72 ° C. for 10 minutes. The PCR product was loaded on 1.5% agarose dissolved in 1 × TBE and electrophoresed in 1 × TBE at 50V for 60 minutes. The gel was stained with ethidium bromide, and the band pattern of the DNA fragment was visualized using an ultraviolet imager. Those showing the same band pattern in all amplification products of the three types of primers were defined as cells derived from the same strain.
実施例３：CRISPR検出用プライマーの設計
表１のF. nucleatumの２８株のゲノム配列と、実施例２の分離株のシークエンスによって得られた配列を基に、実施例１で特定した４箇所のCRISPR領域のそれぞれに特異的なＰＣＲプライマーを設計した。フォワードプライマーはCRISPR上流に必ず存在するＣａｓ１もしくはＣａｓ２遺伝子配列の中で設計し、リバースプライマーはデータベースに登録されているF. nucleatum ２８株がすべて有しているCRISPR下流に存在する保存遺伝子を標的としてプライマーを設計し、調製した。調製したプライマーは以下のとおりである。
・タイプＩ−Ｂ（１）のCRISPR領域を増幅するプライマーセット
Type I-B No. 1 F：5’- TGAAAAATATAAAYTATAATTATGCTTGGG -3’（配列番号９）
Type I-B No. 1 R：5’- TTTAAAAGRGTWTCTGGATCTGCTAA -3’（配列番号１０）
・タイプＩ−Ｂ（２）のCRISPR領域を増幅するプライマーセット
Type I-B No.2 F：5’- AAATCTTTTCAAATGTGGTGGTGA -3’（配列番号１１）
Type I-B No.2 R：5’- TTTTTTCTAACTTGYCCTAAAAAACTCA -3’（配列番号１２）
・タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域を増幅するプライマーセット
Type II-A F：5’- CAAATGATTTATCATTAGTGAGA -3’（配列番号１３）
Type II-A R：5’- ACTATTGGTATTTTTTATGCAACTC -3’（配列番号１４）
・タイプＩＩ−ＡのCRISPR領域を増幅するプライマーセット
Type III-A F：5’- TTTGATGAAAAAAGTGGAGGAG -3’（配列番号１５）
Type III-A R：5’- GTAAAGGCAAATTTYCCATGTAAAG -3’（配列番号１６）
実施例４：分離株と標準菌株を対象にしたＰＣＲプライマーによるフソバクテリウム・ヌクレアタムのCRISPR検出
（１）細菌細胞からのＤＮＡ抽出
F. nucleatumの標準菌株および分離株（実施例２）はＥＧ培地上で嫌気条件下にて３７℃、４８時間培養し、生育したコロニーを回収してＰＢＳで２回洗浄した後、２００μｌのＰＢＳに懸濁した。
Example 3 Design of CRISPR Detection Primer Based on the genomic sequence of 28 strains of F. nucleatum in Table 1 and the sequence obtained by sequencing the isolate of Example 2, the four sites identified in Example 1 were identified. PCR primers specific to each of the CRISPR regions were designed. The forward primer is designed within the Cas1 or Cas2 gene sequence that is always present upstream of CRISPR, and the reverse primer is targeted to the conserved gene present downstream of CRISPR that all F. nucleatum 28 strains registered in the database have. Primers were designed and prepared. The prepared primers are as follows.
-Primer set that amplifies CRISPR region of type I-B (1)
Type IB No. 1 F: 5'- TGAAAAATATAAAYTATAATTATGCTTGGG-3 '(SEQ ID NO: 9)
Type IB No. 1 R: 5'-TTTAAAAGRGTWTCTGGATCTGCTAA-3 '(SEQ ID NO: 10)
-Primer set that amplifies CRISPR region of type IB (2)
Type IB No.2 F: 5'-AAATCTTTTCAAATGTGGTGGTGA-3 '(SEQ ID NO: 11)
Type IB No.2 R: 5'-TTTTTTCTAACTTGYCCTAAAAAACTCA-3 '(SEQ ID NO: 12)
・ Primer set to amplify type II-A CRISPR region
Type II-A F: 5'-CAAATGATTTATCATTAGTGAGA-3 '(SEQ ID NO: 13)
Type II-A R: 5'-ACTATTGGTATTTTTTATGCAACTC-3 '(SEQ ID NO: 14)
・ Primer set to amplify type II-A CRISPR region
Type III-A F: 5'-TTTGATGAAAAAAGTGGAGGAG-3 '(SEQ ID NO: 15)
Type III-A R: 5'-GTAAAGGCAAATTTYCCATGTAAAG-3 '(SEQ ID NO: 16)
Example 4: CRISPR detection of Fusobacterium nucleatum with PCR primers targeting isolates and standard strains (1) DNA extraction from bacterial cells
F. nucleatum standard strains and isolates (Example 2) were cultured on an EG medium under anaerobic conditions at 37 ° C. for 48 hours. The grown colonies were collected and washed twice with PBS, and then 200 μl of PBS. It was suspended in.
ＤＮＡの抽出はMatsukiらの方法（Matsuki, T.ら、Appl. Environ. Microbiol., Vol.70, No.1, pp.167-173 (2004)）の一部を改変して行った。２００μｌのＰＢＳに懸濁した菌体は、直径０．１ｍｍビーズ（３００ｍｇ）と溶菌バッファー（100 mM Tris-HCl・50mM EDTA pH8 (３５０μｌ)、１０％ＳＤＳ（５０μｌ））およびＴＥ飽和フェノール（５００μｌ）を加え、熱処理後（７０℃、１０分間）、Micro Smash MS-100（(TOMY社）にて菌体を物理的に破砕する（4000 rpm、１分間）と同時に菌体タンパクの変性処理を行った。遠心（４℃、20000 ×ｇ、5分間）の後、上清５００μｌにフェノール-クロロフォルム-イソアミルアルコール(２５：２４：１）（５００μｌ）を加え、遠心後の上清３５０μｌをエタ沈メイト（Takara）によりＤＮＡを抽出した。冷７０％エタノール（１ｍｌ）を用いて２回の遠心洗浄後、風乾して１００μｌのヌクレアーゼ不含水（nuclease free water）に溶解した。
（２）ＰＣＲ
タイプＩ−Ｂ（１）、タイプＩ−Ｂ（２）、タイプＩＩ−Ａ、タイプＩＩＩ−Ａの４箇所のCRISPR領域の増幅にそれぞれ特異的なプライマーセット（実施例３）を用い、上記（１）で抽出した分離株と標準菌株のＤＮＡをテンプレートにＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応はテンプレートとなるＤＮＡ溶液１．０μｌ、１× Ex Taq Buffer、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２００ｎＭの各プライマー、０．３８Ｕ Ex Taq Hot Start Version (TaKaRa)を含む全溶液量１５μｌの反応液中で行った。タイプＩ−Ｂ（１）、タイプＩ−Ｂ（２）、およびタイプＩＩＩ−ＡのプライマーセットのＰＣＲ条件は、９４℃２分の変性の後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１０分の３ステップを４０回繰り返し、その後７２℃１０分の伸長を行った。タイプＩＩ−ＡのＰＣＲ条件は、９４℃２分の変性の後、９８℃１０秒、５５℃１５秒、７２℃７分の３ステップを３０回繰り返した。各菌株に対して４回のＰＣＲを行った。
DNA extraction was performed by modifying a part of the method of Matsuki et al. (Matsuki, T. et al., Appl. Environ. Microbiol., Vol. 70, No. 1, pp. 167-173 (2004)). The cells suspended in 200 μl of PBS were 0.1 mm diameter beads (300 mg), lysis buffer (100 mM Tris-HCl / 50 mM EDTA pH8 (350 μl), 10% SDS (50 μl)) and TE saturated phenol (500 μl). After heat treatment (70 ° C, 10 minutes), the cells are physically disrupted with Micro Smash MS-100 (TOMY) (4000 rpm, 1 minute) and at the same time, cell proteins are denatured. After centrifugation (4 ° C., 20000 × g, 5 minutes), phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25: 24: 1) (500 μl) was added to 500 μl of the supernatant, and 350 μl of the centrifuged supernatant was added to eta precipitate. The DNA was extracted with (Takara), washed twice with cold 70% ethanol (1 ml), then air-dried and dissolved in 100 μl of nuclease-free water.
(2) PCR
Using primer sets (Example 3) specific for amplification of four CRISPR regions of type IB (1), type IB (2), type II-A, and type III-A, respectively, PCR was performed using the isolated strain and the standard strain DNA extracted in 1) as templates. PCR reaction is performed in a reaction solution of 15 μl in total solution containing 1.0 μl of DNA solution as a template, 1 × Ex Taq Buffer, 200 μM of each dNTP, 200 nM of each primer, and 0.38 U Ex Taq Hot Start Version (TaKaRa). went. PCR conditions for type I-B (1), type I-B (2), and type III-A primer sets were 94 ° C. for 2 minutes, 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. Three steps of 10 minutes were repeated 40 times, and then extension at 72 ° C. for 10 minutes was performed. The type II-A PCR conditions were as follows: after denaturation at 94 ° C. for 2 minutes, three steps of 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 15 seconds and 72 ° C. for 7 minutes were repeated 30 times. Four PCRs were performed for each strain.
ＰＣＲ結果を図５に示す。プライマーセットごとに、各分離株・標準菌株を同じ順序で電気泳動した（すなわち、図５の４枚のゲル電気泳動写真において、縦に同じ菌株が並んでいる）。ａ１〜ａ１０はF. nucleatum subsp. animalis、ｐ１〜ｐ９はF. nucleatum subsp. polymorphum、ｖ１はF. nucleatum subsp. vincentii、ｎ１はF. nucleatum subsp. nucleatumに同定された分離株を示す。星印の付いたａ３とａ４、ａ５とａ６、ｐ２とｐ３、ｐ７とｐ８の菌株は、同一被験者から分離され、かつ同じＡＰ−ＰＣＲバンドパターンを示す菌株である。図５において、ａ（亜種アニマリス）、ｐ（亜種ポリモルファム）、ｖ（亜種ヴィンセンティ）、ｎ（亜種ヌクレアタム）、ｆ（亜種フシフォルメ）は国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンターに登録されている標準菌株である。また、これら標準菌株は国際塩基配列データベース（ＩＮＳＤ）にゲノム配列の全部または一部がすでに登録されており、４か所のCRISPRを持つ可能性のある領域についてはすべての株で配列情報が存在するため、ポジティブコントロールもしくはネガティブコントロールとして用いた。 PCR results are shown in FIG. For each primer set, each isolate / standard strain was electrophoresed in the same order (that is, the same strain was lined up vertically in the four gel electrophoresis photographs of FIG. 5). a1 to a10 are F. nucleatum subsp. animalis, p1 to p9 are F. nucleatum subsp. polymorphum, v1 is F. nucleatum subsp. vincentii, and n1 is an isolate identified as F. nucleatum subsp. nucleatum. Strains a3 and a4, a5 and a6, p2 and p3, and p7 and p8 with an asterisk are strains isolated from the same subject and exhibiting the same AP-PCR band pattern. In FIG. 5, a (subspecies animalis), p (subspecies polymorphum), v (subspecies Vincenti), n (subspecies Nucleatum), and f (subspecies fusiforme) are available at the RIKEN BioResource Center. It is a registered standard strain. In addition, all or part of the genome sequences of these standard strains have already been registered in the International Base Sequence Database (INSD), and there are sequence information for all strains that may have four CRISPRs. Therefore, it was used as a positive control or a negative control.
分離株・標準菌株ごとに異なる位置に０〜３個のCRISPRの増幅断片が検出された。標準菌株では、ゲノム配列情報によるCRISPRの有無と、ＰＣＲ増幅断片の有無が一致していた。同じ被験者の異なる部位から分離され、かつ同じＡＰ−ＰＣＲバンドパターンを持つ菌株（星印）については、２つの株で同じ長さの増幅断片が確認された。 0 to 3 CRISPR amplified fragments were detected at different positions for each isolate and standard strain. In the standard strain, the presence / absence of CRISPR based on the genomic sequence information was consistent with the presence / absence of the PCR amplified fragment. For strains (asterisks) isolated from different sites of the same subject and having the same AP-PCR band pattern, amplified fragments of the same length were confirmed in the two strains.
本発明の方法は、試料中のフソバクテリウム・ヌクレアタムを菌株レベルで識別することが可能である。フソバクテリウム・ヌクレアタムは、疾患への関与が菌株レベルで議論されているため、臨床検体中に含まれるフソバクテリウム・ヌクレアタムの培養を必要としない簡便な菌株識別検査への応用が期待される点でも有用である。 The method of the present invention can distinguish Fusobacterium nucleatum in a sample at the strain level. Fusobacterium nucleatum is useful in that it is expected to be applied to a simple strain identification test that does not require the culture of Fusobacterium nucleatum contained in clinical specimens because its involvement in disease is discussed at the strain level. is there.
Claims (8)
（１）国際塩基配列データベース（ＩＮＳＤ）アクセッションナンバーCP012713であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種アニマリス（Fusobacterium nucleatum subsp. animalis） KCOM 1279株のゲノムの2,454,881 bp〜2,463,504 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプI-B）の３’側に存在するCRISPR領域；
（２）ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP013121であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルファム（Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum） ChDC F306株のゲノムの1,070,083 bp〜1,078,752 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプI-B）の３’側に存在するCRISPR領域；
（３）ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP012714であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヴィンセンティ（Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii）ChDC F8 KCOM 1231株のゲノムの1,100,111 bp〜1,106,109 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプII-A）の３’側に存在するCRISPR領域；および
（４）ＩＮＳＤアクセッションナンバーCP013121であるフソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルファム ChDC F306株のゲノムの279,908 bp〜289,159 bpまたはそれに対応する領域に存在するCas遺伝子群（タイプIII-A）の３’側に存在するCRISPR領域；
からなる群より選択される少なくとも１つの領域について、当該領域を含むCRISPR-Cas配列の存否及び当該配列の長さを検出することを含む、前記方法。 A method for identifying Fusobacterium nucleatum in a sample at the strain level, wherein in the DNA derived from the sample, the following:
(1) Cas gene present in the 2,454,881 bp to 2,463,504 bp or the corresponding region of the genome of Fusobacterium nucleatum subsp. Animalis KCOM 1279 strain with international base sequence database (INSD) accession number CP012713 CRISPR region present 3 'to group (type IB);
(2) Fusobacterium nucleatum subsp. Polymorphum of INSD accession number CP013121 (cass gene group (type IB) present in the region of 1,070,083 bp to 1,078,752 bp or its corresponding region of ChDC F306 strain) CRISPR region present on the 3 'side;
(3) Cas gene group (types) present in the genome of Fusobacterium nucleatum subsp. Vincentii ChDC F8 KCOM 1231 with INSD accession number CP012714 or the corresponding region (type) II-A) 3'-side CRISPR region; and (4) INSD accession number CP013121 Fusobacterium nucleatum subsp. Polymorphum ChDC F306 genome 279,908 bp to 289,159 bp or the corresponding region CRISPR region present 3 ′ of Cas gene group (type III-A);
Detecting at least one region selected from the group consisting of the presence / absence of a CRISPR-Cas sequence containing the region and the length of the sequence.
（２）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、配列番号３に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号４に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せであり、
（３）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、配列番号５に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号６に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せであり、
（４）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、配列番号７に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号８に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する塩基配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せである、
請求項２に記載の方法。 The primer combination capable of amplifying DNA comprising the region (1) is a part of a base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 1, and has a length of 15 to 30 bases And a forward primer having a length of 15 to 30 bases complementary to a part of the base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 2,
The primer combination capable of amplifying DNA containing the region (2) is a part of a base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 3, and has a length of 15 to 30 bases A forward primer having a reverse primer having a length of 15 to 30 bases complementary to a part of the base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 4,
The combination of primers capable of amplifying DNA containing the region of (3) is part of a base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 5, and has a length of 15 to 30 bases A forward primer having a reverse primer having a length of 15 to 30 bases complementary to a part of the base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 6,
The combination of primers capable of amplifying DNA containing the region of (4) is a part of a base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 7, and has a length of 15 to 30 bases A forward primer having a reverse primer having a length of 15 to 30 bases complementary to a part of the base sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 8.
The method of claim 2.
5’- TGAAAAATATAAAYTATAATTATGCTTGGG -3’（配列番号９）を含むプライマーおよび
5’- TTTAAAAGRGTWTCTGGATCTGCTAA -3’（配列番号１０）を含むプライマーの組合せであり、
（２）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、
5’- AAATCTTTTCAAATGTGGTGGTGA -3’（配列番号１１）を含むプライマーおよび
5’- TTTTTTCTAACTTGYCCTAAAAAACTCA -3’（配列番号１２）を含むプライマーの組合せであり、
（３）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、
5’- CAAATGATTTATCATTAGTGAGA -3’（配列番号１３）を含むプライマーおよび
5’- ACTATTGGTATTTTTTATGCAACTC -3’（配列番号１４）を含むプライマーの組合せであり、ならびに
（４）の領域を含むＤＮＡの増幅が可能なプライマーの組合せが、
5’- TTTGATGAAAAAAGTGGAGGAG -3’（配列番号１５）を含むプライマーおよび
5’- GTAAAGGCAAATTTYCCATGTAAAG -3’（配列番号１６）を含むプライマーの組合せである、
請求項２に記載の方法。 A combination of primers capable of amplifying DNA containing the region of (1)
A primer comprising 5′-TGAAAAATATAAAYTATAATTATGCTTGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 9) and
A primer combination comprising 5′-TTTAAAAGRGTWTCTGGATCTGCTAA-3 ′ (SEQ ID NO: 10),
A combination of primers capable of amplifying DNA containing the region of (2)
A primer comprising 5′-AAATCTTTTCAAATGTGGTGGTGA-3 ′ (SEQ ID NO: 11) and
A primer combination comprising 5′-TTTTTTTCTAACTTGYCCTAAAAAACTCA-3 ′ (SEQ ID NO: 12),
A combination of primers capable of amplifying DNA containing the region of (3)
A primer comprising 5′-CAAATGATTTATCATTAGTGAGA-3 ′ (SEQ ID NO: 13) and
A combination of primers comprising 5′-ACTATTGGTATTTTTTATGCAACTC-3 ′ (SEQ ID NO: 14), and a combination of primers capable of amplifying DNA comprising the region of (4),
A primer comprising 5'-TTTGATGAAAAAAGTGGAGGAG-3 '(SEQ ID NO: 15) and
A primer combination comprising 5′-GTAAAGGCAAATTTYCCATGTAAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 16),
The method of claim 2.
配列番号１に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号２に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せ；
配列番号３に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号４に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せ；
配列番号５に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号６に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せ；ならびに
配列番号７に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部であって、１５〜３０塩基の長さを有するフォーワードプライマー、および、配列番号８に対して少なくとも８５％以上の同一性を有する配列の一部に相補的な、１５〜３０塩基の長さを有するリバースプライマーの組合せ；
からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーの組合せ。 Less than:
A part of a sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 1, a forward primer having a length of 15-30 bases, and at least 85% identity to SEQ ID NO: 2 A combination of reverse primers having a length of 15 to 30 bases, which is complementary to a part of the sequence having sex;
A portion of a sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 3, a forward primer having a length of 15-30 bases, and at least 85% identity to SEQ ID NO: 4 A combination of reverse primers having a length of 15 to 30 bases, which is complementary to a part of the sequence having sex;
A portion of a sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 5, a forward primer having a length of 15-30 bases, and at least 85% identity to SEQ ID NO: 6 A combination of reverse primers having a length of 15 to 30 bases complementary to a part of the sequence having sex; and a part of the sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 7, A forward primer having a length of 15 to 30 bases and a reverse primer having a length of 15 to 30 bases complementary to a part of the sequence having at least 85% identity to SEQ ID NO: 8 A combination of
A combination of at least one primer selected from the group consisting of:
配列番号１を含むプライマーおよび配列番号２を含むプライマーの組合せ；
配列番号３を含むプライマーおよび配列番号４を含むプライマーの組合せ；
配列番号５を含むプライマーおよび配列番号６を含むプライマーの組合せ；ならびに
配列番号７を含むプライマーおよび配列番号８を含むプライマーの組合せ；
からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーの組合せ。 Less than:
A combination of a primer comprising SEQ ID NO: 1 and a primer comprising SEQ ID NO: 2;
A combination of a primer comprising SEQ ID NO: 3 and a primer comprising SEQ ID NO: 4;
A combination of a primer comprising SEQ ID NO: 5 and a primer comprising SEQ ID NO: 6; and a combination of a primer comprising SEQ ID NO: 7 and a primer comprising SEQ ID NO: 8;
A combination of at least one primer selected from the group consisting of:
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