JP2018070569A - Hepatic stellate cell activation inhibitor and food composition for inhibiting hepatic stellate cell activation - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規な非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤及び非アルコール性脂肪性肝疾患予防用食品に関する。 The present invention relates to a novel therapeutic or preventive agent for non-alcoholic fatty liver disease and a food for preventing non-alcoholic fatty liver disease.
脂肪性肝疾患（脂肪肝）とは、肝細胞に中性脂肪（TG）が沈着して、肝障害をきたす疾患の総称である。明らかな飲酒歴がない脂肪性肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（nonalcoholic fatty liver disease: NAFLD）と呼ばれている。NAFLDは、予後良好な単純性脂肪肝と、肝硬変、肝癌へと進行する可能性のある非アルコール性脂肪肝炎 （nonalcoholic steatohepatitis: NASH）に分かれる（非特許文献１）。
日本における肝癌は、C型肝炎などウイルス性肝疾患が大部分を占めていたが、最近では非ウイルス性の症例が増加しており、その多くはNASHなど脂肪性肝炎に起因すると考えられている。NASHは少なくとも成人の1％と推定され、線維化の進行などにより症状が深刻になると肝硬変，肝細胞癌や合併症を引き起こし、肝臓癌や肝移植のケースに発展する。そこで、最近になって、NASHの予防，治療法の検討が行われるようになってきた。
Fatty liver disease (fatty liver) is a general term for diseases in which neutral fat (TG) is deposited in hepatocytes and causes liver damage. Fatty liver disease without a clear history of drinking is called nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). NAFLD is divided into simple fatty liver with good prognosis and nonalcoholic steatohepatitis (NASH) that may progress to cirrhosis and liver cancer (Non-patent Document 1).
Viral liver diseases such as hepatitis C accounted for the majority of liver cancer in Japan, but recently non-viral cases have increased, and many of them are thought to be caused by steatohepatitis such as NASH. . NASH is estimated to be at least 1% of adults, and if the symptoms become serious due to progression of fibrosis, it causes cirrhosis, hepatocellular carcinoma and complications, and develops into cases of liver cancer and liver transplantation. Therefore, recently, studies on prevention and treatment of NASH have been conducted.
NASH及びNAFLDの治療薬として、例えば、多糖類、パパイヤおよび海藻を、乳酸菌と酵母とで共棲発酵してなる発酵エキスを有効成分とする、非アルコール性脂肪性肝疾患および／または非アルコール性脂肪肝炎の治療薬（特許文献１）や、マルチトールを有効成分として含有する肝機能改善剤（特許文献２）等が提案されている。 Non-alcoholic fatty liver disease and / or non-alcoholic fat containing, for example, a fermented extract obtained by co-fermenting polysaccharides, papaya and seaweed with lactic acid bacteria and yeast as therapeutic agents for NASH and NAFLD A therapeutic agent for hepatitis (patent document 1), a liver function improving agent (patent document 2) containing maltitol as an active ingredient has been proposed.
しかし、現在のところ、NASHの治療法として確立されたものはなく、食事・運動療法による体重減少等の生活習慣の改善が基本となっている。食事・運動療法が無効のときには、薬物療法や鉄を減らす除鉄療法も行われるが、確立された薬物療法がないのが実情である。
食事・運動療法では、2〜3kgの体重減少で組織学的にも改善するが、患者は体重の増減を繰り返しがちで、体重が減ると単純性脂肪肝に改善し、逆に増えるとNASHへ進展して、風船様腫大やMallory-Denk小体の出現などの進行と改善を繰り返す症例も少なくない。治療は、長期戦となり、なかなか改善や完治に至らない症例が多いのが現状である。
However, at present, there is no established treatment for NASH, and improvement of lifestyle habits such as weight loss by diet / exercise therapy is fundamental. When dietary / exercise therapy is ineffective, drug therapy and iron-removal therapy to reduce iron are also performed, but the fact is that there is no established drug therapy.
With diet / exercise therapy, weight loss of 2 to 3 kg improves histologically, but patients tend to repeatedly increase and decrease weight, and when weight decreases, it improves to simple fatty liver, and conversely to NASH There are many cases that progress and repeat progression and improvement such as balloon-like swelling and the appearance of Mallory-Denk bodies. Treatment is a long-term battle, and there are many cases in which improvement and complete cure are difficult to achieve.
一方で、食糧、飼料等としての利用が有望視されている生物資源として、クロレラが注目されている。
クロレラは、クロレラ属(Chlorella)に属する単細胞緑藻類であって、淡水に自生する直径約3〜8μmの球体をした生物である。クロレラの種としては、プレノイドサ種（pyrenoidosa）、エルプソイデア種（ellipsoidea）、ブルガリス種（vulgaris）、レギラリス種（regularis）等が挙げられる。
クロレラには、多くのタンパク質が含有され、必須アミノ酸、核酸、ミネラルのほか、ビタミンＥやカロチノイド等も含有されている。そのため、多種類の栄養素をバランスよく摂取するためのサプリメントとしての利用や、経済的，地理的事情等からバランスのとれた栄養摂取が難しい地域での食糧資源としての利用が提案されている。また、多くの機能性があることが期待されている。
そのため、クロレラを含む緑藻類、及び緑藻類由来物質についての機能や、機能性発現のメカニズムの解明、ひいては、これら物質の利用法等の開発が望まれている。
On the other hand, chlorella is attracting attention as a biological resource that is expected to be used as food and feed.
Chlorella is a unicellular green alga belonging to the genus Chlorella, and is a living organism having a spherical shape with a diameter of about 3 to 8 μm that grows naturally in fresh water. Examples of chlorella species include prenoidosa species, ellipsoidea species, vulgaris species, and regularis species.
Chlorella contains many proteins, including essential amino acids, nucleic acids and minerals, as well as vitamin E and carotenoids. Therefore, it has been proposed to be used as a supplement for ingesting various types of nutrients in a well-balanced manner and as a food resource in areas where balanced nutrition intake is difficult due to economic and geographical circumstances. It is also expected to have a lot of functionality.
Therefore, it is desired to elucidate the functions of green algae including chlorella and substances derived from green algae and the mechanism of functional expression, and to develop methods for using these substances.
例えば、特許文献３では、クロレラのプロテアーゼ処理物を有効成分として含有する生活習慣病予防材が提案されている。特許文献２の生活習慣病予防剤によれば、肥満、高脂血（中性脂肪・遊離脂肪酸）、又は高血糖のいずれかを改善させ、インスリン感受性改善作用、肝機能（GPT）改善作用、又は腎機能（尿酸）改善作用のいずれかを有する。
しかし、特許文献３の発明によれば、肥満症、糖尿病、高脂血症などの生活習慣病を予防するが、NASH及びNAFLDの治療又は予防剤についての記載はない。
つまり、正常肝であったところに、肥満，糖尿病，高脂血症などのインスリン抵抗性によって肝臓に脂肪が蓄積して脂肪肝になるfirst hitと、次に脂質過酸化、サイトカイン、鉄などの酸化ストレスがNASHを起こすsecond hitが起こることにより発症すると考えられ、特有の発症メカニズムを有するNASH及びNAFLDの発症を抑制する作用については、検討もなされていない。
For example, Patent Document 3 proposes a lifestyle-related disease preventive material containing a chlorella protease-treated product as an active ingredient. According to the lifestyle-related disease preventive agent of Patent Document 2, any of obesity, hyperlipidemia (neutral fat / free fatty acid), or hyperglycemia is improved, insulin sensitivity improving action, liver function (GPT) improving action, Or it has any of the renal function (uric acid) improving effects.
However, according to the invention of Patent Document 3, lifestyle-related diseases such as obesity, diabetes, and hyperlipidemia are prevented, but there is no description of treatment or prevention agents for NASH and NAFLD.
In other words, in the place where it was normal liver, the first hit that fat accumulates in the liver due to insulin resistance such as obesity, diabetes, hyperlipidemia, etc., and then lipid peroxidation, cytokine, iron, etc. Oxidative stress is thought to develop as a result of the second hit that causes NASH, and no investigation has been made on the action of suppressing the onset of NASH and NAFLD, which have a specific onset mechanism.
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、新規な非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤及び非アルコール性脂肪性肝疾患予防用食品を提供することにある。
本発明の他の目的は、緑藻類由来物質の新規な利用方法となる非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤及び非アルコール性脂肪性肝疾患予防用食品を提供することにある。
The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a novel therapeutic or preventive agent for non-alcoholic fatty liver disease and a food for preventing non-alcoholic fatty liver disease. It is in.
Another object of the present invention is to provide a therapeutic or preventive agent for nonalcoholic fatty liver disease and a food for preventing nonalcoholic fatty liver disease, which are novel methods for using substances derived from green algae.
前記課題は、本発明によれば、緑藻類由来物質を有効成分として含有する非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤により解決される。
上記構成により、非アルコール性脂肪性肝疾患又は非アルコール性脂肪肝炎患者や、非アルコール性脂肪性肝疾患又は非アルコール性脂肪肝炎を発症する可能性のあるヒト、動物に緑藻類由来物質を投与すると、緑藻類由来物質が生体内において、非アルコール性脂肪肝炎の特徴の一つである肝線維化を阻害する作用を果たすため、非アルコール性脂肪肝炎の進行を抑制できる。更に、線維化が進行することによって非アルコール性脂肪肝炎が肝硬変及び肝臓癌に進展することを阻害できる。非アルコール性脂肪性肝疾患の約10％が進行性の非アルコール性脂肪肝炎であると言われており、本発明は、線維化の進行を抑制する作用を通じて、非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤として用いることができる。
According to the present invention, the above problem is solved by a non-alcoholic fatty liver disease treatment or prevention agent containing a green alga-derived substance as an active ingredient.
With the above configuration, when a substance derived from green algae is administered to a non-alcoholic fatty liver disease or nonalcoholic steatohepatitis patient, a human who may develop nonalcoholic fatty liver disease or nonalcoholic steatohepatitis, or an animal In addition, since the substance derived from green algae functions to inhibit liver fibrosis, which is one of the characteristics of nonalcoholic steatohepatitis, in vivo, the progression of nonalcoholic steatohepatitis can be suppressed. Furthermore, the progression of fibrosis can inhibit nonalcoholic steatohepatitis from progressing to cirrhosis and liver cancer. About 10% of nonalcoholic fatty liver disease is said to be progressive nonalcoholic steatohepatitis, and the present invention treats nonalcoholic fatty liver disease through the action of suppressing the progression of fibrosis. Or it can be used as a preventive agent.
このとき、前記緑藻類由来物質は、クロレラであってもよい。
このように、本発明の非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤として、食品としても認可されているクロレラを用いるため、長期間の投与又は摂取が可能であり、食事・運動療法が中心で、治療が長期化しがちな非アルコール性脂肪性肝疾患の治療又は予防に適した治療又は予防剤を提供できる。
また、非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤は、非アルコール性脂肪肝炎治療又は予防剤又は肝線維化抑制剤として使用されてもよい。
このように、本発明の非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤は、肝線維化抑制剤として作用するため、非アルコール性脂肪性肝疾患の約10％を占める非アルコール性脂肪肝炎の特徴の一つである線維化が進行することを抑制し、非アルコール性脂肪肝炎の進行を抑制できる。更に、線維化が進行することによって非アルコール性脂肪肝炎が肝硬変及び肝臓癌に進展することを阻害できる。
非アルコール性脂肪性肝疾患及び非アルコール性脂肪肝炎に罹患していないヒト、動物に対しても、本発明の非アルコール性脂肪性肝疾患予防剤を用いることができる。例えば、家族歴や、肥満，糖尿病，高血圧，脂質異常症などの生活習慣病に罹患している、睡眠時無呼吸症候群に罹患している、ある種の薬の服用履歴がある、あるいは十二指腸や膵臓の手術後に起こる栄養吸収障害が起こっている等の情報に基づいて、非アルコール性脂肪肝炎に罹患する可能性が高い状態にあると判断された場合に、投与されることにより、非アルコール性脂肪性肝疾患予防剤として用いることができる。
また、前記課題は、本発明によれば、緑藻類由来物質を有効成分として含有する非アルコール性脂肪性肝疾患予防用食品により解決される。
このように構成しているので、非アルコール性脂肪性肝疾患及び非アルコール性脂肪肝炎に罹患していないヒト、動物であっても摂取することができる。例えば、家族歴や、肥満，糖尿病，高血圧，脂質異常症などの生活習慣病に罹患している、睡眠時無呼吸症候群に罹患している、ある種の薬の服用履歴がある、あるいは十二指腸や膵臓の手術後に起こる栄養吸収障害が起こっている等の情報に基づいて、非アルコール性脂肪肝炎に罹患する可能性が高い状態にあると判断された場合に、摂取することにより、非アルコール性脂肪性肝疾患予防用食品として用いることができる。
At this time, the green algae-derived substance may be chlorella.
Thus, since chlorella, which is also approved as a food, is used as a non-alcoholic fatty liver disease treatment or prevention agent of the present invention, it can be administered or ingested for a long period of time. Thus, it is possible to provide a therapeutic or prophylactic agent suitable for treating or preventing nonalcoholic fatty liver disease, which tends to be prolonged.
Moreover, the non-alcoholic fatty liver disease treatment or prevention agent may be used as a non-alcoholic steatohepatitis treatment or prevention agent or a liver fibrosis inhibitor.
Thus, since the non-alcoholic fatty liver disease treatment or preventive agent of the present invention acts as a liver fibrosis inhibitor, it is a feature of non-alcoholic steatohepatitis that accounts for about 10% of non-alcoholic fatty liver disease It is possible to suppress the progression of fibrosis, which is one of the above, and to suppress the progression of nonalcoholic steatohepatitis. Furthermore, the progression of fibrosis can inhibit nonalcoholic steatohepatitis from progressing to cirrhosis and liver cancer.
The agent for preventing non-alcoholic fatty liver disease of the present invention can also be used for humans and animals not suffering from non-alcoholic fatty liver disease and non-alcoholic steatohepatitis. For example, family history, lifestyle diseases such as obesity, diabetes, hypertension, dyslipidemia, sleep apnea syndrome, history of taking certain drugs, or duodenum or Non-alcoholic by being administered when it is determined that there is a high possibility of suffering from non-alcoholic steatohepatitis based on information such as nutritional absorption disorders occurring after pancreatic surgery It can be used as an agent for preventing fatty liver disease.
Moreover, the said subject is solved by the foodstuff for nonalcoholic fatty liver disease prevention which contains a green algae origin substance as an active ingredient according to this invention.
Since it comprises in this way, even the human and animal which do not suffer from non-alcoholic fatty liver disease and non-alcoholic steatohepatitis can be ingested. For example, family history, lifestyle diseases such as obesity, diabetes, hypertension, dyslipidemia, sleep apnea syndrome, history of taking certain drugs, or duodenum or Non-alcoholic fat by ingesting when it is determined that the patient is highly likely to suffer from non-alcoholic steatohepatitis based on information such as a nutritional absorption disorder occurring after pancreatic surgery It can be used as a food for preventing liver disease.
本発明によれば、非アルコール性脂肪性肝疾患又は非アルコール性脂肪肝炎患者や、非アルコール性脂肪性肝疾患又は非アルコール性脂肪肝炎を発症する可能性のあるヒト、動物に緑藻類由来物質を投与すると、緑藻類由来物質が生体内において、非アルコール性脂肪肝炎の特徴の一つである肝線維化を阻害する作用を果たすため、非アルコール性脂肪肝炎の進行を抑制できる。更に、線維化が進行することによって非アルコール性脂肪肝炎が肝硬変及び肝臓癌に進展することを阻害できる。非アルコール性脂肪性肝疾患の約10％が進行性の非アルコール性脂肪肝炎であると言われており、本発明は、線維化の進行を抑制する作用を通じて、非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤として用いることができる。 According to the present invention, a non-alcoholic fatty liver disease or non-alcoholic steatohepatitis patient, a human who may develop non-alcoholic fatty liver disease or non-alcoholic steatohepatitis, a substance derived from green algae to animals When administered, the green algae-derived substance functions to inhibit liver fibrosis, which is one of the characteristics of non-alcoholic steatohepatitis, in vivo, so that progression of non-alcoholic steatohepatitis can be suppressed. Furthermore, the progression of fibrosis can inhibit nonalcoholic steatohepatitis from progressing to cirrhosis and liver cancer. About 10% of nonalcoholic fatty liver disease is said to be progressive nonalcoholic steatohepatitis, and the present invention treats nonalcoholic fatty liver disease through the action of suppressing the progression of fibrosis. Or it can be used as a preventive agent.
以下、本発明の一実施形態について説明する。
本発明は、緑藻類由来物質、特にクロレラを有効成分とする非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤及び非アルコール性脂肪性肝疾患予防用食品である。
＜非アルコール性脂肪性疾患及び非アルコール性脂肪肝炎＞
脂肪性肝疾患とは、肝細胞に中性脂肪(TG)が沈着して、肝障害をきたす疾患の総称である。
非アルコール性脂肪性肝疾患（以下、「NAFLD」という。）は、組織学的に大滴性の脂肪変性を基盤に発症し、非アルコール性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，（NAFL）），非アルコール性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，以下、「NASH」という。）に分類される。
Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described.
The present invention is a non-alcoholic fatty liver disease treatment or preventive agent and a non-alcoholic fatty liver disease preventive food comprising a green algal-derived substance, particularly chlorella, as an active ingredient.
<Non-alcoholic fatty disease and non-alcoholic steatohepatitis>
Fatty liver disease is a general term for diseases in which neutral fat (TG) is deposited in hepatocytes and causes liver damage.
Nonalcoholic fatty liver disease (hereinafter referred to as “NAFLD”) develops based on histologically large droplet fatty degeneration, and includes nonalcoholic fatty liver (NAFL), non-alcoholic fatty liver It is classified as nonalcoholic steatohepatitis (hereinafter referred to as “NASH”).
NAFLDは、組織診断あるいは画像診断で脂肪肝を認め、アルコール性肝障害など他の肝疾患を除外した病態である。純アルコールで男性30g/日，女性20g/日以上の飲酒量でアルコール性肝障害を発症しうるので、NAFLDの飲酒量はそれ未満となる。
一般に、肝臓に肝組織の10％以上の脂肪沈着があり血清トランスアミナーゼ（ALT/AST）値が上昇している病態がNAFLDと考えられている。
NASHは、肝組織で診断され、脂肪変性に壊死・炎症や線維化を伴う脂肪肝炎（steatohepatitis）を呈する。脂肪変性，炎症性細胞浸潤，肝細胞傷害（風船様変性）が特徴である。
また、肝細胞の風船様腫大や Mallory−Denk小体の出現，炎症性細胞浸潤，線維化という特徴的な肝組織像がある，NAFLDの進行性の病態が、NASHであると考えられている。
NAFLD is a condition in which fatty liver is detected by histological diagnosis or diagnostic imaging, and other liver diseases such as alcoholic liver disease are excluded. Alcohol-induced liver injury can occur with drinking alcohol over 30 g / day for men and 20 g / day for women, so NAFLD drinking is less than that.
In general, NAFLD is considered to be a pathological condition in which the liver has a fat deposit of 10% or more of the liver tissue and the serum transaminase (ALT / AST) level is elevated.
NASH is diagnosed in liver tissue and presents steatohepatitis with necrosis / inflammation and fibrosis in steatosis. It is characterized by steatosis, inflammatory cell infiltration, and hepatocellular injury (balloon-like degeneration).
Also, NASH is considered to be the progressive pathology of NAFLD with characteristic liver histology such as balloon-like enlargement of hepatocytes, appearance of Mallory-Denk bodies, inflammatory cell infiltration, and fibrosis Yes.
NAFLD及びNASH発症のメカニズムは解明されていないが、二つのヒット理論(two hits theory)が広く受け入れられている。
two hits theoryとは、正常肝であったところに、肥満，糖尿病，高脂血症などのインスリン抵抗性によって肝臓に脂肪が蓄積して脂肪肝になるfirst hitと、次に脂質過酸化、サイトカイン、鉄などの酸化ストレスがNASHを起こすsecond hitが起こるとする説である。
つまり、まず、first hitにおいて、過栄養や運動不足により内臓脂肪が蓄積する。そして、内臓脂肪からの遊離脂肪酸の分泌亢進と、アディポネクチンの分泌低下やTNF-αの分泌亢進などを来たす。遊離脂肪酸は門脈を介して肝臓の組織に到達しそこで中性脂肪として蓄積され、脂肪肝の形成に直接的に関与する。さらに、この遊離脂肪酸やあるいはアディポサイトカインの分泌異常によりインスリン抵抗性が惹起され、肝臓への脂肪蓄積がさらに促進される。ここまでの病態でとどまっているのが単純性脂肪肝である。
The mechanism of the onset of NAFLD and NASH has not been elucidated, but two hits theory is widely accepted.
Two hits theory is the first hit where normal liver is liver, fat is accumulated in the liver due to insulin resistance such as obesity, diabetes, hyperlipidemia, etc., then lipid peroxidation, cytokine It is the theory that oxidative stress such as iron causes a second hit that causes NASH.
That is, first, visceral fat accumulates in the first hit due to overnutrition or lack of exercise. In addition, increased secretion of free fatty acids from visceral fat, decreased secretion of adiponectin and increased secretion of TNF-α. Free fatty acids reach the liver tissue via the portal vein where they accumulate as neutral fat and are directly involved in the formation of fatty liver. Furthermore, insulin resistance is induced by abnormal secretion of free fatty acids or adipocytokines, and fat accumulation in the liver is further promoted. Simple fatty liver remains in the pathological conditions so far.
そして、second hitにおいて、さらにアディポサイトカインの分泌異常やインスリン抵抗性などにより、過剰な酸化ストレスが発生する。second hitを経て、肝臓における炎症や肝細胞障害、肝の線維化などが起こっている状態にまで進んだものがNASHである。
このように、肝細胞への脂肪の沈着がfirst hitであり、さらに酸化ストレスや炎症性サイトカインなどの肝細胞障害要因をsecond hitと呼んでいる。
In the second hit, excessive oxidative stress occurs due to abnormal secretion of adipocytokines and insulin resistance. Through the second hit, NASH has advanced to a state where inflammation, hepatocyte damage, and fibrosis of the liver have occurred.
Thus, fat deposition on hepatocytes is the first hit, and hepatocellular injury factors such as oxidative stress and inflammatory cytokines are called second hits.
ここで、「インスリン抵抗性」とは、肝臓や筋肉、脂肪細胞などでインスリンが正常に働かなくなった状態のことをいう。インスリン抵抗性があると、食事で高くなった血糖値を感知して、すい臓からインスリンが分泌されても、筋肉や肝臓が血液中のブドウ糖を取り込まないため、血糖値が下がらず、糖尿病の発病につながる。
NASHは、炎症や線維化を起こすが、線維化が進むと肝臓が硬くなり肝硬変になる。NASHを発症すると、10年でおよそ2割が肝硬変になるという報告があり、肝硬変になると、やがて肝癌を発症することもある。
肝線維化は、NASHに限らず、C型肝炎などウイルス性肝炎やアルコール性肝炎においても起こるものであり、C型肝炎などウイルス性肝炎やアルコール性肝炎において肝線維化が起こって、肝硬変や肝癌を発症することもある。
Here, “insulin resistance” refers to a state in which insulin does not work normally in the liver, muscles, fat cells, and the like. With insulin resistance, even if insulin is secreted from the pancreas by detecting high blood sugar levels in the diet, the muscles and liver do not take in glucose in the blood, so the blood sugar level does not drop and diabetes develops. Leads to.
NASH causes inflammation and fibrosis, but as fibrosis progresses, the liver becomes hard and cirrhosis. When NASH develops, it has been reported that about 20% of cirrhosis occurs in 10 years. When cirrhosis occurs, liver cancer may eventually develop.
Liver fibrosis occurs not only in NASH but also in viral hepatitis such as hepatitis C and alcoholic hepatitis. Liver fibrosis occurs in viral hepatitis such as hepatitis C and alcoholic hepatitis, cirrhosis and liver cancer. May develop.
＜非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤＞
本発明の非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤は、緑藻類由来物質、特にクロレラ由来物質を有効成分とする非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤である。
本発明の非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤の有効成分となる「緑藻類由来物質」とは、緑藻類又は緑藻類の乾燥粉末や微細粉末、熱水抽出物のほか、緑藻類細胞から抽出されたクロロフィル、クロロフィル粉末や、クロロフィルの加工品等が含まれる。
<Non-alcoholic fatty liver disease treatment or prevention agent>
The non-alcoholic fatty liver disease treatment or prevention agent of the present invention is a non-alcoholic fatty liver disease treatment or prevention agent containing a green algae-derived substance, particularly a chlorella-derived substance as an active ingredient.
The “green algae-derived substance” which is an active ingredient of the non-alcoholic fatty liver disease treatment or prevention agent of the present invention is extracted from green algae cells in addition to green algae or green algae dry powder and fine powder, hot water extract Chlorophyll, chlorophyll powder, processed products of chlorophyll, etc. are included.
「緑藻類」としては、緑藻植物門（Chlorophyta）に含まれる単細胞生物又は多細胞生物であって、クロロフィルによって光合成を行うものを挙げることができる。
具体的には、緑藻植物門の下位分類となる緑藻網（Class Trebouxiophyceae）、プラシノ藻網（Class Prasinophyceae）、トレボウクシア藻綱（Class Trebouxiophyceae）、アオサ藻綱（Class Ulvophyceae）、ペディノ藻綱（Class Pedinophyceae）、プレウラストルム藻綱（Class Pleurastrophyceae）等が挙げられる。
これらの中で、緑藻網やトレボウクシア藻網として多系統に分類されているクロレラが用いられることが望ましい。
Examples of “green algae” include unicellular organisms or multicellular organisms contained in the green algal plant phylum (Chlorophyta), which perform photosynthesis with chlorophyll.
Specifically, the green alga net (Class Trebouxiophyceae), the platino alga net (Class Prasinophyceae), the trevoxia algae class (Class Trevoxiophyceae), the blue alga class (Class Ulvophyceae), the pedinophyte class (Class Pedinophyceae) ), Pleurastorumae (Class Pleurastrophyceae) and the like.
Among these, it is desirable to use chlorella classified into multiple systems as a green alga net or a trevouxia algae net.
「クロレラ（パラクロレラを含む）」とは、主に緑藻植物門、緑藻綱、クロレラ属の淡水性単細胞緑藻類であって、その細胞内にクロロフィルを有し緑色に見える微生物である。
クロレラには、クロレラ属に分類される植物、その変種、その変異種の全てが含まれる。
クロレラ属の植物とは、クロロコッカス目（Chlorococcales）、オオシスティス科（Oocystaceae）に分類される植物である。
クロレラ属の微生物の種としては、プレノイドサ種、エルプソイデア種、ブルガリス種、レギラリス種、ソロキニアナ種等が挙げられる。これらの中で、広く研究に利用されているブルガリス種が用いられることが望ましい。
“Chlorella (including parachlorella)” is a freshwater unicellular green algae belonging to the genus Chlorophyta, Chlorophyta, Chlorella, and is a microorganism that has a chlorophyll in its cells and looks green.
Chlorella includes all plants classified into the genus Chlorella, their varieties, and their variants.
Plants of the genus Chlorella are plants classified into the order Chlorococcales and Oocystaceae.
Examples of species of microorganisms belonging to the genus Chlorella include prenoidosa species, Elpsoidia species, Bulgaris species, Regilaris species, Solokiniana species, and the like. Among these, it is desirable to use the Bulgarian species widely used in research.
クロレラは、公知のMBBM培地、MAM培地や、これらの一部組成を変更した改変培地を用いて培養することができる。培養容器には、坂口フラスコ、三角フラスコ、試薬ビン等を用いることができる。クロレラはCO2を資化するため、1〜5%CO2を含む空気を培地中に通過させることが好ましい。また、終濃度0.5〜1.0%（容量比）となるように培地中にエタノールを加えると良好な生育となるため好ましい。さらに、葉緑体を十分に発達させるために、培地1リットルあたり1〜5g程度のリン酸アンモニウムを加えるとよい。培養温度は、通常20〜34℃で、特に28〜30℃が好適である。
なお、培養条件にもよるが、クロレラは通常、培養開始後2〜4日で対数増殖期となり、4〜6日程度で定常期に到達する。
クロレラは、光照射下で培養（明培養）されても良く、無照射で培養（暗培養）されても良いが、好ましくは明培養が良い。この場合の照度としては光従属栄養培養では3000〜8000Lux程度が望ましい。
Chlorella can be cultured using a well-known MBBM medium, MAM medium, or a modified medium in which a partial composition thereof is changed. A Sakaguchi flask, an Erlenmeyer flask, a reagent bottle, etc. can be used for a culture container. Since chlorella to assimilate CO 2, it is preferred to pass into the medium air containing 1 to 5% CO 2. In addition, it is preferable to add ethanol to the medium so that the final concentration is 0.5 to 1.0% (volume ratio) because good growth is achieved. Furthermore, in order to sufficiently develop chloroplasts, it is preferable to add about 1 to 5 g of ammonium phosphate per liter of the medium. The culture temperature is usually 20 to 34 ° C, particularly 28 to 30 ° C.
Although depending on the culture conditions, chlorella usually enters a logarithmic growth phase 2 to 4 days after the start of culture, and reaches a stationary phase about 4 to 6 days.
Chlorella may be cultured under light irradiation (light culture) or may be cultured without irradiation (dark culture), but light culture is preferable. In this case, the illuminance is preferably about 3000 to 8000 Lux in light heterotrophic culture.
クロレラ由来物質として、遠心分離，濾過又は沈降等によって分離したクロレラ生細胞をそのまま用いることができる。クロレラ生細胞は、培養槽から収穫後そのままの状態で使用することもできるが、水若しくは生理食塩水で洗浄するのが好ましい。また、藻体スラリーの状態で用いてもよい。
また、クロレラ生細胞を凍結乾燥処理やスプレー乾燥処理して得た乾燥藻体を用いてもよい。
更に、クロレラ生細胞を超音波照射処理や、ホモゲナイズ等の機械処理を行うことにより得た藻体の機械的処理物を用いてもよい。機械的処理物に乾燥処理を施した機械的処理物乾燥物を用いてもよい。
クロレラ由来物質としては、クロレラ微細粉末を用いると好適である。
As the chlorella-derived substance, living chlorella cells separated by centrifugation, filtration, sedimentation or the like can be used as they are. The chlorella viable cells can be used as they are after harvesting from the culture tank, but are preferably washed with water or physiological saline. Moreover, you may use in the state of an algal body slurry.
Moreover, you may use the dry alga body obtained by freeze-drying or spray-drying a chlorella living cell.
Furthermore, a mechanically treated product of algal cells obtained by subjecting viable chlorella cells to mechanical treatment such as ultrasonic irradiation or homogenization may be used. You may use the dried mechanically processed material which dried the mechanically processed material.
As the chlorella-derived substance, it is preferable to use fine chlorella powder.
「クロレラ微細粉末」は、クロレラ粉末に破砕処理を加え、細胞間結合を分離し細胞壁を破砕したものであって、粒子径が小さくなったものである。例えば、全ての粒子径を10μm以下にしたものであって、400メッシュから600メッシュ以上の、粒子径が非常に小さくなったものである。
クロレラ粉末を微細粉末にすると、色は若草色になる。クロレラ微細粉末は、別の粉末を加えて混合した場合、混合に要する時間が短く、混合が均一であるため色にムラやバラツキがでないという特徴がある。
また、微細粉末になるとクロレラ特有の藻体臭は弱まり、抹茶様の香りがでてくる。クロレラ特有の藻体味も弱まる。また、粒子径が2ミクロン〜10ミクロンと微細なため、クロレラ微細粉末を直接口にすると溶けてしまいザラザラしない。
なお、クロレラ微細粉末は、平均粒子径が10μm以下であることが望ましいが、特に限定されることなく変更可能である。例えば、一般のクロレラ粉末が、粒子径2μm〜60μmまでの不均一な粒子が混在したものであるところ、全ての粒子径が20μm以下又は30μm以下にしたもの等であっても良い。
“Fine chlorella powder” is obtained by crushing chlorella powder, separating cell junctions and crushing cell walls, and having a reduced particle size. For example, all the particle diameters are 10 μm or less, and the particle diameter is very small from 400 mesh to 600 mesh or more.
When the chlorella powder is made into a fine powder, the color becomes light green. The chlorella fine powder is characterized in that when another powder is added and mixed, the time required for mixing is short and the mixing is uniform, so that there is no unevenness or variation in color.
In addition, when it becomes a fine powder, the odor of chlorella is weakened and a green tea-like scent appears. Chlorella-specific algal taste is also weakened. In addition, since the particle diameter is as fine as 2 to 10 microns, the chlorella fine powder melts directly into the mouth and does not become rough.
The fine chlorella powder desirably has an average particle size of 10 μm or less, but can be changed without any particular limitation. For example, when a general chlorella powder is a mixture of non-uniform particles having a particle size of 2 μm to 60 μm, all the particle sizes may be 20 μm or less or 30 μm or less.
本発明の緑藻類由来物質は、肝線維化発症を抑制することを通じて、NAFLD及びNASHを抑制する作用を有する。
従って、緑藻類由来物質は、アディポサイトカインの分泌異常やインスリン抵抗性などにより、過剰な参加ストレスが発生するsecond hitを阻害又は抑制することを通じて、肝線維化発症を抑制し、その結果、NASHの発症を抑制していると考えられる。
さらに、緑藻類由来物質は、肝線維化発症抑制を通じてNASHの発症を抑制することにより、NASHから進展する肝硬変、肝癌の発症も抑制する。
The green algae-derived substance of the present invention has an action of suppressing NAFLD and NASH through suppressing the onset of liver fibrosis.
Therefore, the green algae-derived substance suppresses the onset of liver fibrosis by inhibiting or suppressing the second hit in which excessive participation stress occurs due to abnormal secretion of adipocytokines or insulin resistance, resulting in the onset of NASH It is thought that it is suppressing.
Furthermore, the green algae-derived substance suppresses the development of liver cirrhosis and liver cancer that develop from NASH by suppressing the development of NASH through the suppression of liver fibrosis.
本発明の緑藻類由来物質を有効成分として含む非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤は、NAFLD又はNASH患者、NAFLD又はNASHに罹患したヒト以外の動物に投与されることで、NAFLD又はNASHの治療剤として用いることができる。
また、NAFLD又はNASHに罹患する前のヒト、NAFLD又はNASHに罹患する可能性が高いヒト、これらヒト以外の動物を対象としたNAFLD又はNASHの予防剤として用いることもできる。
NAFLD又はNASHに罹患する可能性が高いヒトとしては、NASHの発症の原因と考えられている疾患を罹患している患者、又は状態にある者が含まれる。例えば、BMI（Body mass index）が25以上の肥満者や、肥満，糖尿病，高血圧，脂質異常症などの生活習慣病の患者、睡眠時無呼吸症候群の患者やある種の薬を服用した者、あるいは十二指腸や膵臓の手術後に起こる栄養吸収障害が起こっている者等である。また、遺伝的な体質が、NASH発症に影響することが分かっており、家族や親族にNASH患者がいる者も含まれる。
また、本発明の緑藻類由来物質は、緑藻類由来物質を有効成分として含有する非アルコール性脂肪肝炎予防又は治療剤，肝線維化抑制又は予防剤，NASHから進展する肝硬変の抑制又は予防剤，NASHから進展する肝癌の抑制又は予防剤に用いることもできる。
Non-alcoholic fatty liver disease treatment or prevention agent containing the green alga-derived substance of the present invention as an active ingredient is administered to NAFLD or NASH patients, NAFLD or NASH non-human animals, and thus NAFLD or NASH It can be used as a therapeutic agent.
Moreover, it can also be used as a prophylactic agent for NAFLD or NASH targeting humans before suffering from NAFLD or NASH, humans highly likely to suffer from NAFLD or NASH, and animals other than these humans.
A human who is highly likely to suffer from NAFLD or NASH includes a patient suffering from a disease that is considered to be the cause of the onset of NASH, or a person in a condition. For example, obese people with body mass index (BMI) of 25 or more, patients with lifestyle-related diseases such as obesity, diabetes, hypertension, dyslipidemia, patients with sleep apnea syndrome and those who take certain drugs, Alternatively, those who have a nutritional absorption disorder that occurs after surgery for the duodenum or pancreas. In addition, genetic constitutions are known to affect the onset of NASH, including those who have NASH patients in their families and relatives.
Further, the green algae-derived substance of the present invention is a non-alcoholic steatohepatitis preventive or therapeutic agent containing a green algae-derived substance as an active ingredient, an inhibitor or preventive agent for liver fibrosis, an inhibitor or preventive agent for cirrhosis that develops from NASH, and NASH. It can also be used as an agent for suppressing or preventing advanced liver cancer.
本実施形態の非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤は、医薬組成物として利用することができる。
（医薬組成物）
本実施形態の非アルコール性脂肪性肝疾患治療又は予防剤は、医薬の分野では、NAFLD，NASH，肝線維化の抑制作用を有効に発揮できる量の緑藻類由来物質と共に、薬学的に許容される担体や添加剤を配合することにより、当該作用を有する医薬組成物が提供される。当該医薬組成物は、医薬品であっても医薬部外品であってもよい。
当該医薬組成物は、内用的に適用されても、また外用的に適用されても良い。従って、当該医薬組成物は、内服剤、静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射及び／又は腹腔内注射等の注射剤、経粘膜適用剤、経皮適用剤等の製剤形態で使用することができる。
当該医薬組成物の剤型としては、適用の形態により、適当に設定できるが、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、粉末剤、散剤などの固形製剤、液剤、懸濁剤などの液状製剤、軟膏剤、またはゲル剤等の半固形剤が挙げられる。
The non-alcoholic fatty liver disease treatment or prevention agent of this embodiment can be used as a pharmaceutical composition.
(Pharmaceutical composition)
The therapeutic or preventive agent for non-alcoholic fatty liver disease of the present embodiment is pharmaceutically acceptable in the field of medicine, together with NAFLD, NASH, and a green algae-derived substance that can effectively exert an action of suppressing liver fibrosis. By blending a carrier or an additive, a pharmaceutical composition having the action is provided. The pharmaceutical composition may be a pharmaceutical or a quasi drug.
The pharmaceutical composition may be applied internally or externally. Therefore, the pharmaceutical composition is used in a pharmaceutical form such as an internal preparation, intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection and / or intraperitoneal injection, transmucosal application agent, transdermal application agent, and the like. be able to.
The dosage form of the pharmaceutical composition can be appropriately set depending on the form of application, for example, solid preparations such as tablets, granules, capsules, powders, powders, liquid preparations such as liquids and suspensions, Semi-solid preparations such as ointments or gels are mentioned.
（食品組成物及び飼料）
また、本発明の緑藻類由来物質は、食品にも用いることが可能である。
本実施形態の非アルコール性脂肪性肝疾患予防用食品は、食品の分野では、NAFLD，NASH，肝線維化の抑制作用を有効に発揮できる有効な量の緑藻類由来物質を食品素材として、各種食品に配合することにより、当該作用を有する食品組成物を提供することができる。
すなわち、本発明は、食品の分野において、NAFLD予防用，NASH予防用，肝線維化予防用，等と表示された食品の食品組成物を提供することができる。当該食品組成物としては、一般の食品のほか、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、病院患者用食品、サプリメント等が挙げられる。また、食品添加物として用いることもできる。
当該食品組成物としては、例えば、調味料、畜肉加工品、農産加工品、飲料（清涼飲料、アルコール飲料、炭酸飲料、乳飲料、果汁飲料、茶、コーヒー、栄養ドリンク等）、粉末飲料（粉末ジュース、粉末スープ等）、濃縮飲料、菓子類（キャンディ（のど飴）、クッキー、ビスケット、ガム、グミ、チョコレート等）、パン、シリアル等が挙げられる。また、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等の場合、カプセル、トローチ、シロップ、顆粒、粉末等の形状であっても良い。
(Food composition and feed)
Moreover, the green algal origin substance of this invention can be used also for foodstuffs.
The food for preventing non-alcoholic fatty liver disease of the present embodiment is, in the field of foods, various foods using NAFLD, NASH, an effective amount of green algae-derived substance capable of effectively exerting an inhibitory effect on liver fibrosis as a food material. The food composition which has the said effect | action can be provided by mix | blending with.
That is, the present invention can provide food compositions for foods indicated as NAFLD prevention, NASH prevention, liver fibrosis prevention, etc. in the field of foods. Examples of the food composition include foods for specified health use, functional nutritional foods, functional labeling foods, hospital patient foods, and supplements in addition to general foods. It can also be used as a food additive.
Examples of the food composition include seasonings, processed meat products, processed agricultural products, beverages (soft drinks, alcoholic beverages, carbonated beverages, milk beverages, fruit juice beverages, tea, coffee, nutritional drinks, etc.), powdered beverages (powder) Juice, powdered soup, etc.), concentrated beverages, confectionery (candy (throat cake), cookies, biscuits, gum, gummi, chocolate, etc.), bread, cereal and the like. Moreover, in the case of food for specified health use, nutritional functional food, functional indication food, etc., it may be in the form of capsule, troche, syrup, granule, powder or the like.
ここで特定保健用食品とは、生理学的機能等に影響を与える保健機能成分を含む食品であって、消費者庁長官の許可を得て特定の保健の用途に適する旨を表示可能なものである。本発明においては、特定の保健用途としてNAFLD，NASHを予防する、肝線維化を抑えて肝臓を正常に保つことを助けるなどと表示して販売される食品となる。
また栄養機能食品とは、栄養成分（ビタミン、ミネラル）の補給のために利用される食品であって、栄養成分の機能を表示するものである。栄養機能食品として販売するためには、一日当たりの摂取目安量に含まれる栄養成分量が定められた上限値、下限値の範囲内にある必要があり、栄養機能表示だけでなく注意喚起表示等もする必要がある。
また機能性表示食品とは、事業者の責任において、科学的根拠に基づいた機能性を表示した食品である。販売前に安全性及び機能性の根拠に関する情報などが消費者庁長官へ届け出られたものである。
上記において本発明は、緑藻類由来物質を有効成分として含み、NAFLD，NASH患者、NAFLD，NASHを罹患したヒト以外の動物や、NAFLD，NASHを罹患する可能性の高いヒトやヒト以外の動物を対象としたNAFLD予防用，NASH予防用，肝線維化予防用，NASHから進展する肝硬変の予防用，NASHから進展する肝癌の予防用特定保健用食品や、NAFLD予防用，NASH予防用，肝線維化予防用，NASHから進展する肝硬変の予防用，NASHから進展する肝癌の予防用栄養機能食品、NAFLD予防用，NASH予防用，肝線維化予防用機能性表示食品，NAFLD予防用，NASH予防用，肝線維化予防用，NASHから進展する肝硬変の予防用，NASHから進展する肝癌の予防用飼料として用いることができる。
なお、本発明は、C型肝炎などウイルス性肝炎やアルコール性肝炎においても肝線維化を抑制することは、作用機序からみて当然である。本発明は、これらの肝炎における肝線維化を抑制，予防し、これらの肝炎から肝線維化により進展して発症する肝硬変及び肝癌の予防，治療剤や、予防，治療用食品，飼料として用いることができる。
Here, food for specified health use is a food containing health functional ingredients that affect physiological functions, etc., and can be used to indicate that it is suitable for specific health use with the permission of the Commissioner of the Consumer Affairs Agency. is there. In the present invention, it is a food that is marketed and labeled as preventing specific NAFLD and NASH for specific health uses, or helping to keep the liver normal by suppressing liver fibrosis.
The nutritional functional food is a food used for supplementing nutritional components (vitamins and minerals) and displays the function of the nutritional components. In order to sell as a functional nutritional food, the amount of nutrients contained in the daily intake standard amount must be within the specified upper and lower limits. You also need to.
In addition, the functional labeling food is a food that displays the functionality based on the scientific basis at the responsibility of the operator. Information on safety and functionality grounds was reported to the Commissioner of the Consumer Affairs Agency before sales.
In the above, the present invention includes a green algae-derived substance as an active ingredient, and is intended for NAFLD, NASH patients, non-human animals suffering from NAFLD, NASH, and humans and non-human animals that are highly likely to suffer from NAFLD, NASH NAFLD prophylaxis, NASH prophylaxis, liver fibrosis prophylaxis, liver cirrhosis that develops from NASH, specific health foods for the prevention of liver cancer that develops from NASH, NAFLD prophylaxis, NASH prophylaxis, liver fibrosis For prevention, prevention of liver cirrhosis that develops from NASH, nutritional functional food for prevention of liver cancer that develops from NASH, NAFLD prevention, NASH prevention, functional indication food for liver fibrosis prevention, NAFLD prevention, NASH prevention, It can be used as a feed for preventing liver fibrosis, for preventing cirrhosis that progresses from NASH, or for preventing liver cancer that progresses from NASH.
In the present invention, it is natural to suppress liver fibrosis in viral hepatitis such as hepatitis C and alcoholic hepatitis from the viewpoint of action mechanism. The present invention suppresses and prevents liver fibrosis in these hepatitis, and is used as a preventive, therapeutic agent, food for prevention and treatment, and feed for liver cirrhosis and liver cancer that develops from hepatitis due to liver fibrosis. Can do.
以下、本発明を具体的実施例により詳細に説明するが、本発明の技術的範囲が、以下の実施例に制限されないことは当然である。 Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of specific examples. However, it is a matter of course that the technical scope of the present invention is not limited to the following examples.
＜実施例１＞
緑藻類由来物質として、クロレラ粉末（（株）ユーグレナ提供）の必要量を秤量し、生理食塩水を加えて、乳鉢で懸濁液を調製した。
<Example 1>
As a green algae-derived substance, the required amount of chlorella powder (provided by Euglena Co., Ltd.) was weighed, physiological saline was added, and a suspension was prepared in a mortar.
＜対比例１＞
ポジティブコントロール物質として、テルミサルタン（Telmisartan）錠1錠を乳鉢で破砕後、RO 水を徐々に加えながら、1 mg/mLの均一な懸濁液になるように調整した。
テルミサルタンは、主に高血圧の治療に使用されるアンジオテンシンII受容体拮抗薬である。
＜対比例２＞
また、ネガティブコントロールとして、実施例１で用いた溶媒である生理食塩水を対比例２とした。
<Comparison 1>
As a positive control substance, 1 tablet of Telmisartan (Telmisartan) was crushed in a mortar and adjusted to a uniform suspension of 1 mg / mL while gradually adding RO water.
Telmisartan is an angiotensin II receptor antagonist primarily used for the treatment of hypertension.
<Comparison 2>
In addition, as a negative control, physiological saline, which is the solvent used in Example 1, was set to 2.
＜試験１＞
本試験では、実施例１の緑藻類由来物質であるクロレラ及び対比例１のポジティブコントロール物質（テルミサルタン），対比例２のネガティブコントロールを、５週齢のNASHモデルマウス（STAM(登録商標)マウス）に27日間強制経口投与し、9週齢時に屠殺して解析を行い、抗NASH効果および抗線維化効果について検討した。
NASHモデルマウスは、糖尿病を背景に6週齢時に脂肪肝、8週齢時に脂肪性肝炎、9週齢時に肝線維化、その後20週齢時に肝癌を発症するヒトのNASHの進行と予後に類似した病理所見を示すモデルマウスである。
つまり、本試験のNASHモデルマウスには、実施例１のクロレラ、対比例１のテルミサルタン、対比例２の生理食塩水を、脂肪肝発生前の5週齢から、脂肪肝発生，脂肪性肝炎発生を経て、肝が線維化する9週齢時まで、投与した。
<Test 1>
In this test, Chlorella derived from the green algae of Example 1, a positive control substance (telmisartan) with a relative ratio of 1, and a negative control with a relative ratio of 2 were transferred to a 5-week-old NASH model mouse (STAM (registered trademark) mouse). After 27 days of gavage, slaughtered and analyzed at 9 weeks of age to examine anti-NASH and anti-fibrotic effects.
NASH model mice are similar to the progression and prognosis of human NASH that develops fatty liver at 6 weeks of age, steatohepatitis at 8 weeks of age, liver fibrosis at 9 weeks of age, and then liver cancer at 20 weeks of age It is a model mouse showing the pathological findings.
In other words, the NASH model mice of this study were treated with the chlorella of Example 1, the telmisartan of proportional 1 and the physiological saline of proportional 2 from the 5th week before fatty liver development, fatty liver development, steatohepatitis development. The administration was continued until 9 weeks of age when the liver became fibrotic.
●試験動物
まず、試験動物の調製を行った。
妊娠14日の雌SPFマウス（C57BL/6J、日本エスエルシー）18匹を、馴化飼育した。全動物を自然分娩させ、出生した雄をモデル動物作製に使用した。なお、離乳は生後4週齢とした。
8:00の分娩観察時に出産が観察されたマウスは観察日前日を、20:00の分娩観察時に出産が観察されたマウスは観察日当日を出生日とし、生後0日から起算した。離乳まで母動物に哺育させた。
2日齢時の雄にストレプトゾトシン（シグマアルドリッチジャパン（株））を生理食塩液（日本薬局方、（株）大塚製薬工場）にて10mg/mL濃度とし、20μL/head（200μg/head）で背部皮下に1回投与して、NASHモデルマウスを作製した。その後は離乳まで母動物に哺育させた。生後28±2日齢時に離乳し、それ以降は、高脂肪食〔High Fat Diet 32（放射線滅菌、日本クレア（株））〕で飼育した。
● Test animals First, test animals were prepared.
Eighteen female SPF mice (C57BL / 6J, Japan SLC) on day 14 of gestation were bred. All animals were delivered naturally and the males born were used to create model animals. Weaning was performed at 4 weeks of age.
Mice whose birth was observed at the 8:00 parturition observation were taken as the day before the observation day, and mice whose birth was observed at the 20:00 parturition observation were taken as the birth day and counted from the 0th day after birth. Maternal animals were bred until weaning.
Streptozotocin (Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.) at 2 days of age is adjusted to 10 mg / mL with physiological saline (Japanese Pharmacopoeia, Otsuka Pharmaceutical Factory), and back at 20 μL / head (200 μg / head) A NASH model mouse was prepared by subcutaneous administration once. Thereafter, the mother animals were raised until weaning. Weaning was performed at the age of 28 ± 2 days after birth, and thereafter, the animals were raised on a high fat diet [High Fat Diet 32 (radiation sterilized, Nippon Claire Co., Ltd.)].
●飼育条件
マウスは、温度23 ± 3°C、相対湿度50 ± 20%、換気回数1時間40回以上、照明1日12時間（08:00-20:00、分娩観察およびストレプトゾトシン投与操作並びに出生児の調整のための点灯を除く）の動物飼育室で飼育した。
動物入荷日から離乳までは、母児ともに固形飼料CE-2（放射線滅菌、日本クレア（株））を自由に摂取させた。離乳以降は、ストレプトゾトシンを投与した動物については、高脂肪食High Fat Diet 32（放射線滅菌、日本クレア（株））を自由に摂取させた。飲料水は自由摂取とした。
● Breeding conditions Mice have a temperature of 23 ± 3 ° C, relative humidity of 50 ± 20%, ventilation rate of 1 hour 40 times or more, lighting 12 hours a day (08: 00-20: 00, labor observation and streptozotocin administration operation and birth The animals were reared in an animal breeding room (except lighting for adjustment of the infant).
From the date of arrival of animals to weaning, both mothers and infants were allowed to freely receive solid feed CE-2 (radiation sterilized, Nippon Claire Co., Ltd.). After weaning, animals given streptozotocin were freely fed with a high fat diet, High Fat Diet 32 (radiation sterilized, Nippon Claire Co., Ltd.). Drinking water was ad libitum.
●投与
試験開始日（投与開始日）の前日に、NASHモデルマウスを、平均体重が均等になるように体重層別化無作為抽出法によって、6匹／群、1ケージ当たり3匹になるよう群分けした。
マウスの各群に、実施例１のクロレラ、対比例１のポジティブコントロール物質と、対比例２のネガティブコントロール（溶媒のみ）を、強制経口投与した。投与期間は生後5週齢からの27日間、投与回数は、1日1回（7回／週）とした。
1回の投与量は、実施例１は3g/kg体重、対比例１は、10mg/kg体重とした。投与容量は10mL/kg体重とした。対比例２は、10mL/kg体重で同様に投与した。
● Administration The day before the study start date (administration start date), the NASH model mice should be 6 mice / group, 3 mice per cage by randomized stratification so that the average body weight is equal. Grouped.
To each group of mice, the chlorella of Example 1, a positive control substance with proportional 1 and a negative control with proportional 2 (solvent only) were orally administered by gavage. The administration period was 27 days from 5 weeks of age, and the administration frequency was once a day (7 times / week).
One dose was 3 g / kg body weight in Example 1, and 10 mg / kg body weight in contrast 1. The administration volume was 10 mL / kg body weight. Contrast 2 was similarly administered at 10 mL / kg body weight.
●肝臓サンプル採取
９週齢時の計画剖検時に、腹部大動脈切断により放血死させ、図１の通り、肝臓を摘出し、外側左葉Ｂを図２のように６等分した。
図２の外側左葉の中心部の2片ｂをブアン固定液（シグマアルドリッチジャパン（株））に浸漬し、24時間室温にて固定後、パラフィン包埋を行った。作製したパラフィン切片は、ヘマトキシリン・エオシン染色およびシリウスレッド染色に使用した。
図２の外側左葉の中心部の2片aは、O.C.T. compound（サクラファインテックジャパン（株））を満たしたクリオディッシュ（（株）硝英製作所）に包埋し、速やかに液体窒素にて凍結後、試験２のサンプルとして用いるため、-80°Cにて保存した。
-Liver sample collection At the time of planned necropsy at the age of 9 weeks, blood was killed by cutting the abdominal aorta, the liver was removed as shown in FIG. 1, and the outer left lobe B was divided into 6 parts as shown in FIG.
Two pieces b at the center of the outer left lobe in FIG. 2 were immersed in a Buan fixative (Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.), fixed at room temperature for 24 hours, and then embedded in paraffin. The prepared paraffin sections were used for hematoxylin and eosin staining and sirius red staining.
The two pieces a at the center of the outer left lobe in Fig. 2 are embedded in a cryodish (Shiei Seisaku Co., Ltd.) filled with OCT compound (Sakura Finetech Japan Co., Ltd.) After freezing, it was stored at -80 ° C for use as a sample in Test 2.
●ヘマトキシリン・エオシン染色（NAFLD Activity scoreの算出）
実施例１，対比例１及び２のパラフィン切片をキシレン、100%〜70%のアルコール系列およびRO水で脱パラフィン・親水化した後、リリー・マイヤーヘマトキシリン液（武藤化学（株））にて10分間浸漬した。RO水にて余分な染色液を洗い流し、流水にて10分間色出しした後、1%エオシンYエタノール水溶液（和光純薬（株））に5分間浸漬し、RO水に浸透した。染色した切片は、70%〜100%のアルコール系列およびキシレンにて脱水・透徹後、エンテランニュー（メルク（株））にて封入し観察に供した。標本は明視野顕微鏡（ライカ マイクロシステムズ、型番: DM1000）を用い観察した。
Kleiner等の報告（Kleiner DE et al.Hepatology 2005 41:1313）に従い、表１の通り、1個体あたり1切片の脂肪化（Steatosis、中心静脈を中心とした代表的な50倍の1視野について）、肝実質における炎症（Lobular inflammation、中心静脈を中心とした切片の代表的な200倍の1視野について）、肝細胞障害（Hepatocyte ballooning、中心静脈を中心とした切片の代表的な200倍の1視野について）についてそれぞれ写真を撮影し、撮影した画像を観察してスコア化した。
● Hematoxylin and eosin staining (calculation of NAFLD Activity score)
Example 1 Paraffin sections of Comparative Examples 1 and 2 were deparaffinized and hydrophilized with xylene, 100% to 70% alcohol series and RO water, and then treated with Lily-Meyer hematoxylin solution (Muto Chemical Co., Ltd.). Immerse for a minute. The excess staining solution was washed away with RO water, and the color was developed with running water for 10 minutes, and then immersed in 1% eosin Y ethanol aqueous solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) for 5 minutes to penetrate into RO water. Stained sections were dehydrated and permeabilized with 70% to 100% alcohol series and xylene, and sealed with Enteran New (Merck Co., Ltd.) for observation. The specimens were observed using a bright field microscope (Leica Microsystems, model number: DM1000).
According to the report by Kleiner et al. (Kleiner DE et al. Hepatology 2005 41: 1313), as shown in Table 1, one section of fat was obtained per individual (Steatosis, a typical 50-fold visual field centered on the central vein) Inflammation in the liver parenchyma (Lobular inflammation, one field of view that is 200 times typical of the section centered on the central vein), hepatocyte damage (Hepatocyte ballooning, 200 times 1 typical of the section centered on the central vein) For each field of view), photographs were taken, and the photographed images were observed and scored.
実施例１，対比例１及び２の、NAFLD Activity score の算出結果を表２及び図４に示す。このとき、ｎ=６とした。
また、各群の平均値の差の検定をPrism6（Version 6.07, GraphPad Software 社）を用い、Bonferroni Multiple Comparison Test により、対比例１ vs. 実施例１、対比例１ vs. 対比例２の組み合わせに対して統計解析を行った。各群の平均はmean ± SD で表し、検定はそれぞれ有意水準5％で行った。
In addition, Prism6 (Version 6.07, GraphPad Software) was used for the test of the difference between the average values of each group, and by the Bonferroni Multiple Comparison Test, the comparison 1 vs. Example 1 and the comparison 1 vs. the comparison 2 were combined. Statistical analysis was performed. The average of each group was expressed as mean ± SD, and the test was performed at a significance level of 5%.
対比例２のネガティブコントロール群では、肝細胞の風船様変性、大滴性および小滴性の脂肪滴の沈着、リンパ球および好中球を含む炎症性細胞浸潤像が認められた。
実施例１のクロレラ投与群及び対比例１のテルミサルタン投与群（ポジティブコントロール）において、対比例２のネガティブコントロール群と比較して、NAFLD Activity scoreは有意に低値を示した。
In the negative control group of contrast 2, balloon-like degeneration of hepatocytes, deposition of large and small droplets, and inflammatory cell infiltration including lymphocytes and neutrophils were observed.
In the chlorella administration group of Example 1 and the telmisartan administration group of 1 in comparison (positive control), the NAFLD Activity score was significantly lower than that in the negative control group of comparison 2.
●シリウスレッド染色（Fibrosis areaの算出）
パラフィン切片をキシレン、100%〜70%のアルコール系列およびRO水で脱パラフィン・親水化した後、0.03%ピクロ・シリウスレッド液（シリウスレッド:ワルデック社、Cat No.:1A-280）に60分間浸透した。0.5%酢酸溶液およびRO水に通した後、染色した切片は、70%〜100%のアルコール系列およびキシレンにて脱水・透徹後、エンテランニュー（メルク（株））にて封入し観察に供した。標本は明視野顕微鏡（ライカマイクロシステムズ）を用いて観察した。中心静脈を中心とした200倍の視野にて、1切片あたり5視野の写真をCCDカメラ（ライカマイクロシステムズ、型番:DFC295）を用いて撮影した。撮影した画像をもとに、ImageJ software（National Institute of Health）を用いて、各視野における撮影面積、シリウスレッド陽性面積、中心静脈内腔面積を計測した。
● Sirius Red Staining (Fibrosis area calculation)
Paraffin sections were deparaffinized and hydrophilized with xylene, 100% to 70% alcohol series and RO water, and then 0.03% Picro Sirius Red Solution (Sirius Red: Waldeck, Cat No .: 1A-280) for 60 minutes It penetrated. After passing through a 0.5% acetic acid solution and RO water, the stained sections are dehydrated and permeabilized with 70% to 100% alcohol series and xylene, and sealed with Enteran New (Merck Co., Ltd.) for observation. did. The specimens were observed using a bright field microscope (Leica Microsystems). Photographs of 5 fields per section were taken using a CCD camera (Leica Microsystems, model number: DFC295) with a field of view of 200 times centering on the central vein. Based on the photographed images, the photographing area, Sirius red positive area, and central vein lumen area in each visual field were measured using ImageJ software (National Institute of Health).
実施例１，対比例１及び２の、シリウスレッド染色像を図５に、シリウスレッド陽性面積率の算出結果を表３及び図６に示す。このとき、ｎ=６とした。統計解析は、NAFLD Activity scoreを算出したときと同様の方法で行った。
図５において、対比例２のネガティブコントロール（溶媒のみ）投与群では小葉間門脈周囲、小葉中間部の類洞壁および中心静脈壁にコラーゲンの沈着が認められた。
実施例１のクロレラ投与群において、対比例２のネガティブコントロール群と比較して、シリウスレッド陽性面積率は有意に低値を示した。
In FIG. 5, in the negative control (solvent only) administration group of proportional 2, collagen deposition was observed around the interlobar portal vein, the sinusoidal wall in the middle of the leaflet, and the central vein wall.
In the chlorella administration group of Example 1, the Sirius red positive area ratio was significantly lower than that of the negative control group of the comparative 2.
本試験では、対比例１のテルミサルタン投与群では、NAFLD Activity scoreおよびシリウスレッド陽性面積率の有意な減少が確認され、NASH病態進行および線維化を抑制することが確認された。これらの結果は、本モデルに対しテルミサルタンを使用した過去のデータと一致し、同剤は本試験においてポジティブコントロール薬として機能したと判断された。
実施例１のクロレラ投与群では、NAFLD Activity score の有意な減少が認められた。NAFLD Activity score を項目別に検証すると、炎症巣を評価するLobular inflammation スコアおよびバルーニング細胞を評価するHepatocyte ballooning スコアが減少していた。以上の結果から、クロレラはNASH 病態に対してinflammation およびhepatocyte ballooningの改善を特徴とする病態進行抑制作用を有することが分かった。
Hepatocyte ballooning は、肝細胞壊死の一過程で、酸化ストレスによって誘導される
ことが報告されており（Fujii H et al. J. Atheroscler. Thromb. 2009;16:893）、NASH 病態の進行に関わることが報告されている（Rangwala F et al. J. Pathol. 2011; 224:401）。そのため、実施例１のクロレラは抗酸化ストレス効果を有し、この作用により、hepatocyte ballooning を改善されたことが推測される。さらに、Lobular
inflammationの一部は、Hepatocyte ballooningの改善によるものであると推測される。
In this study, a significant reduction in NAFLD Activity score and Sirius red positive area rate was confirmed in the telmisartan administration group of proportionality 1, and it was confirmed that NASH disease progression and fibrosis were suppressed. These results were consistent with previous data using telmisartan for this model, and it was determined that the drug functioned as a positive control drug in this study.
In the chlorella administration group of Example 1, a significant decrease in NAFLD Activity score was observed. When the NAFLD Activity score was verified by item, the Lobular inflammation score for evaluating inflammatory lesions and the Hepatocyte ballooning score for evaluating ballooning cells decreased. From the above results, it was found that chlorella has a pathological progression inhibitory action characterized by improvement of inflammation and hepatocyte ballooning for NASH pathological conditions.
Hepatocyte ballooning has been reported to be induced by oxidative stress in the process of hepatocyte necrosis (Fujii H et al. J. Atheroscler. Thromb. 2009; 16: 893) and is involved in the progression of NASH pathology Has been reported (Rangwala F et al. J. Pathol. 2011; 224: 401). Therefore, the chlorella of Example 1 has an antioxidative stress effect, and it is presumed that hepatocyte ballooning was improved by this action. In addition, Lobular
It is speculated that part of inflammation is due to improvement of hepatocyte ballooning.
対比例２のネガティブコントロール群と比較して、実施例１のクロレラ投与群においてシリウスレッド陽性面積率の有意な減少が認められ、抗線維化効果を有することが分かった。NAFLD Activity scoreで明らかになったように、炎症を抑制することでの肝線維化の抑制の可能性が考えられる一方で、肝線維化の中心的な役割を担っている細胞として、肝星細胞があり、この細胞は活性化されることにより、コラーゲンを産生する。クロレラは、肝星細胞の活性化抑制を介して、抗線維化効果を発揮している可能性も推測される。
以上のように、本試験において、クロレラの抗NASHおよび抗線維化効果が認められた。
Compared with the negative control group of contrast 2, a significant decrease in the Sirius red positive area rate was observed in the chlorella administration group of Example 1, indicating that it had an antifibrotic effect. As revealed by the NAFLD Activity score, hepatic stellate cells may play a central role in liver fibrosis, while suppressing fibrosis by suppressing inflammation. These cells are activated to produce collagen. It is also speculated that chlorella may exert an anti-fibrotic effect through suppression of hepatic stellate cell activation.
As described above, the anti-NASH and antifibrotic effects of chlorella were observed in this study.
＜試験２＞
本試験では、試験１で採材した肝臓サンプルを用いて、F4/80およびα-SMA免疫染色およびF4/80およびα-SMA陽性面積率の算出を行った。対比例２のネガティブコントロール群における陽性面積率と実施例１の緑藻類由来物質であるクロレラ投与群における陽性面積率との比較により、実施例１のクロレラのNASHモデルマウス（STAM(登録商標)マウス）における抗炎症、肝星細胞の活性化抑制効果を評価し、実施例１のクロレラの抗NASH および抗線維化効果のメカニズムについて検討した。
<Test 2>
In this test, F4 / 80 and α-SMA immunostaining and F4 / 80 and α-SMA positive area ratios were calculated using the liver samples collected in Test 1. By comparing the positive area ratio in the negative control group of contrast 2 and the positive area ratio in the chlorella administration group of the green algae-derived substance of Example 1, the chlorella NASH model mouse of Example 1 (STAM (registered trademark) mouse) The anti-inflammation and hepatic stellate cell activation inhibitory effects were evaluated, and the mechanism of the anti-NASH and anti-fibrotic effects of chlorella in Example 1 was examined.
●F4/80 免疫染色（F4/80 陽性面積率の算出）
試験１で準備した図２の外側左葉の中心部の2辺aの凍結切片は、アセトンで常温、10 分間固定し、ドライヤーの冷風に当て、1分間乾燥させた。その後、ダコペンで切片周囲を囲み、ドライヤーの冷風に当て、10分間乾燥させた。ドーゼへ凍結切片を移し、PBS（リン酸緩衝生理食塩水）で常温で10分間洗浄した後、0.03%過酸化水素水にて常温で10分間処置し、内因性ペルオキシダーゼの阻害を行った。PBSで洗浄後、PBSTにて処置した後、ブロッキング液（ブロックエース、DS ファーマバイオメディカル（株））を常温で、10分間反応させた。その後、100倍希釈の抗F4/80抗体（BMA Biomedicals 社）を4°Cで、一晩反応させた。PBSにて洗浄し、PBSTにて処置した後、200倍希釈ビオチン標識抗ラットIgG抗体（VECTASTAIN ABC Rat IgG kit、VECTOR LABORATORIES 社）を常温30 分間反応させた。PBS にて洗浄し、PBST にて処置した後、ABC Reagent（VECTOR LABORATORIES 社）を常温30分間反応させた。PBSにて洗浄し、1%グルタールアルデヒド溶液にて常温、1 分間固定した。RO水にて洗浄し、PBSTにて処置した後、発色基質（シンプルステインDAB、ニチレイバイオサイエンス（株））にて発色させた。発色後、RO水にて洗浄し、1%グルタールアルデヒド溶液にて常温、10分間固定した。固定後、RO水にて洗浄し、8倍希釈ヘマトキシリンに1分間通し、直ちにRO水で洗浄した。その後、切片を流水中に15分間静置し、アクアテックス（メルク（株））にて封入し観察した。標本は明視野顕微鏡（ライカマイクロシステムズ）を用いて観察した。中心静脈を中心とした200倍の視野にて、1切片あたり5視野の写真をCCDカメラ（ライカマイクロシステムズ）を用いて撮影した。撮影した画像をもとに、ImageJ software（National Institute of Health）を用いて、各視野における撮影面積、F4/80陽性面積を計測した。
● F4 / 80 immunostaining (calculation of F4 / 80 positive area ratio)
The frozen section on the two sides a in the center of the outer left lobe of FIG. 2 prepared in Test 1 was fixed with acetone at room temperature for 10 minutes, dried with cold air from a dryer, and dried for 1 minute. Thereafter, the section was surrounded with dacopen, and it was dried for 10 minutes by applying cold air from a dryer. The frozen section was transferred to doze, washed with PBS (phosphate buffered saline) at room temperature for 10 minutes, and then treated with 0.03% hydrogen peroxide at room temperature for 10 minutes to inhibit endogenous peroxidase. After washing with PBS and treating with PBST, a blocking solution (Block Ace, DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) was reacted at room temperature for 10 minutes. Thereafter, a 100-fold diluted anti-F4 / 80 antibody (BMA Biomedicals) was reacted at 4 ° C overnight. After washing with PBS and treatment with PBST, a 200-fold diluted biotin-labeled anti-rat IgG antibody (VECTASTAIN ABC Rat IgG kit, VECTOR LABORATORIES) was reacted at room temperature for 30 minutes. After washing with PBS and treating with PBST, ABC Reagent (VECTOR LABORATORIES) was reacted at room temperature for 30 minutes. It was washed with PBS and fixed with a 1% glutaraldehyde solution at room temperature for 1 minute. After washing with RO water and treating with PBST, color was developed with a chromogenic substrate (Simple Stain DAB, Nichirei Bioscience Co., Ltd.). After color development, it was washed with RO water and fixed with 1% glutaraldehyde solution at room temperature for 10 minutes. After fixation, it was washed with RO water, passed through 8-fold diluted hematoxylin for 1 minute, and immediately washed with RO water. Thereafter, the sections were allowed to stand in running water for 15 minutes, sealed with Aquatex (Merck) and observed. The specimens were observed using a bright field microscope (Leica Microsystems). Photographs of 5 fields per section were taken using a CCD camera (Leica Microsystems) with a 200x field of view centered on the central vein. Based on the photographed image, the photographing area and the F4 / 80 positive area in each visual field were measured using ImageJ software (National Institute of Health).
各測定面積の一次データは整数として算出した。単位はpixelsとした。各個体5視野について、撮影面積、F4/80陽性面積、中心静脈内腔面積を算出した。1視野当たりのF4/80陽性面積率は、F4/80陽性面積を測定肝実質面積（＝撮影面積から中心静脈内腔面積を引いた値）で割った値を100倍し、小数点以下第3位で四捨五入し、小数点以下第2位まで算出した。単位は%とした。各個体のF4/80陽性面積率は、5視野の平均値を小数点以下第3位で四捨五入し、小数点以下第2位まで算出した。各群の平均値および標準偏差は、小数点以下第3位で四捨五入し、小数点以下第2位まで算出した。 The primary data for each measurement area was calculated as an integer. The unit was pixels. The imaging area, F4 / 80 positive area, and central venous lumen area were calculated for each 5 visual fields. The F4 / 80 positive area rate per visual field is 100 times the value obtained by dividing the F4 / 80 positive area by the measured liver parenchyma area (= the area obtained by subtracting the central venous lumen area from the imaging area). Rounded to the nearest decimal place and calculated to the second decimal place. The unit is%. The F4 / 80 positive area ratio of each individual was calculated to the second decimal place by rounding the average value of the five visual fields to the third decimal place. The average value and standard deviation of each group were rounded off to the second decimal place and calculated to the second decimal place.
F4/80免疫染色像を図７に、F4/80陽性面積率の算出結果を図８および表４に示す。
また、試験１と同様の方法で統計解析を行った。
Further, statistical analysis was performed in the same manner as in Test 1.
●Alpha-SMA 免疫染色（Alpha-SMA 陽性面積率の算出）
試験１で準備した図２の外側左葉の中心部の2辺aの凍結切片は、アセトンで常温、10分間固定し、ドライヤーの冷風に当て、1分間乾燥させた。その後、ダコペンで切片周囲を囲み、ドライヤーの冷風に当て、10分間乾燥させた。ドーゼへ凍結切片を移し、PBSで常温で10分間洗浄した後、0.03%過酸化水素水にて常温で10分間処置し、内因性ペルオキシダーゼの阻害を行った。PBSで洗浄後、PBSTにて処置した後、ブロッキング液（ブロックエース、DSファーマバイオメディカル（株））を常温、10分間反応させた。その後、200倍希釈の抗α-SMA抗体（Abcam社）を4°C、一晩反応させた。PBSにて洗浄し、PBSTにて処置した後、25倍希釈ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラビットIgG抗体（VECTOR LABORATORIES社）を常温、30分間反応させた。PBSにて洗浄し、1%グルタールアルデヒド溶液にて常温、1分間固定した。RO水にて洗浄し、PBSTにて処置した後、発色基質（シンプルステインDAB、ニチレイバイオサイエンス（株））にて発色させた。発色後、RO水にて洗浄し、1%グルタールアルデヒド溶液にて常温、10分間固定した。固定後、RO水にて洗浄し、8倍希釈ヘマトキシリンに1分間通し、直ちにRO水で洗浄した。その後、切片を流水中に15分間静置し、アクアテックス（メルク（株））にて封入し観察した。標本は明視野顕微鏡（ライカマイクロシステムズ）を用いて観察した。中心静脈を中心とした200倍の視野にて、1切片あたり5視野の写真をCCDカメラ（ライカマイクロシステムズ）を用いて撮影した。撮影した画像をもとに、ImageJ software（National Institute of Health）を用いて、各視野における撮影面積、α-SMA陽性面積を計測した。
● Alpha-SMA immunostaining (calculation of Alpha-SMA positive area ratio)
The frozen section on the two sides a in the center of the outer left lobe of FIG. 2 prepared in Test 1 was fixed with acetone at room temperature for 10 minutes, dried with cold air from a dryer, and dried for 1 minute. Thereafter, the section was surrounded with dacopen, and it was dried for 10 minutes by applying cold air from a dryer. The frozen section was transferred to doze, washed with PBS at room temperature for 10 minutes, and then treated with 0.03% hydrogen peroxide solution at room temperature for 10 minutes to inhibit endogenous peroxidase. After washing with PBS and treating with PBST, a blocking solution (Block Ace, DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) was reacted at room temperature for 10 minutes. Thereafter, 200-fold diluted anti-α-SMA antibody (Abcam) was reacted overnight at 4 ° C. After washing with PBS and treatment with PBST, 25-fold diluted peroxidase-labeled goat anti-rabbit IgG antibody (VECTOR LABORATORIES) was reacted at room temperature for 30 minutes. The plate was washed with PBS and fixed with a 1% glutaraldehyde solution at room temperature for 1 minute. After washing with RO water and treating with PBST, color was developed with a chromogenic substrate (Simple Stain DAB, Nichirei Bioscience Co., Ltd.). After color development, it was washed with RO water and fixed with 1% glutaraldehyde solution at room temperature for 10 minutes. After fixation, it was washed with RO water, passed through 8-fold diluted hematoxylin for 1 minute, and immediately washed with RO water. Thereafter, the sections were allowed to stand in running water for 15 minutes, sealed with Aquatex (Merck) and observed. The specimens were observed using a bright field microscope (Leica Microsystems). Photographs of 5 fields per section were taken using a CCD camera (Leica Microsystems) with a 200x field of view centered on the central vein. Based on the photographed images, the photographing area and α-SMA positive area in each visual field were measured using ImageJ software (National Institute of Health).
α-SMA陽性面積率は、F4/80陽性面積率と同様の方法で算出した。
F4/80免疫染色像を図９に、F4/80陽性面積率の算出結果を図１０および表５に示す。
また、試験１と同様の方法で統計解析を行った。
FIG. 9 shows the F4 / 80 immunostained image, and FIG. 10 and Table 5 show the calculation results of the F4 / 80 positive area ratio.
Further, statistical analysis was performed in the same manner as in Test 1.
以上の本試験では、実施例１のクロレラ投与群で、F4/80 陽性面積率の有意な減少が認められた。
免疫染色像の解析の結果、実施例１のクロレラによるF4/80陽性面積率の低下は、陽性細胞の膨化抑制および中心静脈周囲への浸潤抑制に因るものと推察され、実施例１のクロレラは肝臓のマクロファージ/Kupper細胞の活性化、遊走に対する抑制効果を有する可能性が考えられた。
また、対比例２のネガティブコントロール群と比較して、クロレラ投与群においてα-SMA陽性面積率の有意な減少が認められた。実施例１のクロレラによるα-SMA陽性面積率の低下は、肝星細胞の活性化抑制に因るものと推察され、実施例１のクロレラは肝星細胞の活性化に対する抑制効果を有する可能性が考えられた。
肝星細胞は、活性化されることによりコラーゲンを産生し、肝線維化の中心的な役割を担っている。本試験の結果より、クロレラが、肝星細胞の活性化抑制を介して抗線維化効果を発揮していることが示唆された。
In the above test, a significant decrease in the F4 / 80 positive area ratio was observed in the chlorella administration group of Example 1.
As a result of the analysis of the immunostained image, the decrease in the F4 / 80 positive area rate due to the chlorella of Example 1 is presumed to be due to the suppression of positive cell expansion and infiltration around the central vein. May have an inhibitory effect on liver macrophage / Kupper cell activation and migration.
In addition, a significant decrease in the α-SMA positive area ratio was observed in the chlorella administration group as compared with the negative control group of the comparative 2. The decrease in the α-SMA positive area ratio by chlorella in Example 1 is presumed to be due to suppression of activation of hepatic stellate cells, and the possibility that chlorella of Example 1 has an inhibitory effect on activation of hepatic stellate cells. Was considered.
When activated, hepatic stellate cells produce collagen and play a central role in liver fibrosis. The results of this study suggest that chlorella exerts an anti-fibrotic effect through suppression of hepatic stellate cell activation.
Ａ 内側右葉／左葉
Ｂ 外側左葉
Ｃ 右葉
Ｄ 尾状葉
Ｅ 残葉
A Inner right leaf / Left leaf B Outer left leaf C Right leaf D Caudate leaf E Remaining leaf
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、新規な肝星細胞の活性化抑制剤及び肝星細胞の活性化抑制用食品組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、緑藻類由来物質の新規な利用方法となる肝星細胞の活性化抑制剤及び肝星細胞の活性化抑制用食品組成物を提供することにある。
The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a novel hepatic stellate cell activation inhibitor and a food composition for inhibiting hepatic stellate cell activation. .
Another object of the present invention is to provide a novel activator inhibitor usage become hepatic stellate cells and the activation suppressing food composition for hepatic stellate cells green algae-derived material.
前記課題は、本発明によれば、クロレラ粉末を有効成分として含有し、肝星細胞の活性化を抑制するために用いられることを特徴とする肝星細胞の活性化抑制剤により解決される。
上記構成により、肝星細胞の活性化を抑制できる。
According to the present invention, the above-mentioned problem is solved by an activation inhibitor of hepatic stellate cells, which contains chlorella powder as an active ingredient and is used for suppressing the activation of hepatic stellate cells .
With the above configuration, activation of hepatic stellate cells can be suppressed .
このように、本発明の肝星細胞の活性化抑制剤の有効成分として、食品としても認可されているクロレラを用いるため、長期間の投与又は摂取が可能である肝星細胞の活性化抑制剤を提供できる。
また、前記課題は、本発明によれば、クロレラ粉末を有効成分として含有し、肝星細胞の活性化を抑制するために用いられることを特徴とする肝星細胞の活性化抑制用食品組成物により解決される。
As this, as an active ingredient of activator inhibitor hepatic stellate cells of the present invention, since the use of chlorella has also been approved as a food, the activation of hepatic stellate cells Ru can der prolonged administration or ingestion An inhibitor can be provided .
Also, the object is achieved, according to the present invention, containing a chlorella powder as an active ingredient, the activation suppressing food composition of hepatic stellate cells, characterized by used to inhibit the activation of hepatic stellate cells Solved by things .
本発明によれば、肝星細胞の活性化を抑制できる。更に、本発明は、肝星細胞の活性化抑制剤として用いることができる。 According to the present invention, activation of hepatic stellate cells can be suppressed. Furthermore , the present invention can be used as an inhibitor of hepatic stellate cell activation .
以下、本発明の一実施形態について説明する。
本発明は、緑藻類由来物質、特にクロレラを有効成分とする肝星細胞の活性化抑制剤及び肝星細胞の活性化抑制用食品組成物である。
＜非アルコール性脂肪性疾患及び非アルコール性脂肪肝炎＞
脂肪性肝疾患とは、肝細胞に中性脂肪(TG)が沈着して、肝障害をきたす疾患の総称である。
非アルコール性脂肪性肝疾患（以下、「NAFLD」という。）は、組織学的に大滴性の脂肪変性を基盤に発症し、非アルコール性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，（NAFL）），非アルコール性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，以下、「NASH」という。）に分類される。
Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described.
The present invention is a hepatic stellate cell activation inhibitor and a food composition for inhibiting the activation of hepatic stellate cells , comprising a green algae-derived substance, particularly chlorella as an active ingredient.
<Non-alcoholic fatty disease and non-alcoholic steatohepatitis>
Fatty liver disease is a general term for diseases in which neutral fat (TG) is deposited in hepatocytes and causes liver damage.
Nonalcoholic fatty liver disease (hereinafter referred to as “NAFLD”) develops based on histologically large droplet fatty degeneration, and includes nonalcoholic fatty liver (NAFL), non-alcoholic fatty liver It is classified as nonalcoholic steatohepatitis (hereinafter referred to as “NASH”).
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| J. AGRIC. FOOD CHEM., 2005, VOL.53, PP.4207-4212, JPN6017045546, ISSN: 0003813462 * |
| 北大水産彙報, 2012, VOL.62, NO.3, PP.83-88, JPN6017045555, ISSN: 0003813466 * |
| 臨床と研究, 1988, VOL.65, NO.3, PP.129-134, JPN6017045547, ISSN: 0003813463 * |
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022083885A (en) * | 2020-11-25 | 2022-06-06 | 国立大学法人京都大学 | Liver function improver |
| JP2022084029A (en) * | 2020-11-25 | 2022-06-06 | 国立大学法人京都大学 | Liver function improver |
| JP7214172B2 (en) | 2020-11-25 | 2023-01-30 | 国立大学法人京都大学 | Liver function improver |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2018084224A1 (en) | 2018-05-11 |
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