JP2018069127A - Oil-and-fat containing wastewater treatment method and oil-and-fat degrading microorganism formulation - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、油脂を効率よく分解できる油脂分解菌を用いた油脂含有排水の処理方法及び油脂を効率よく分解できる油脂分解菌を含む油脂分解微生物製剤に関するものである。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for treating fat-containing wastewater using an oil-degrading bacterium capable of efficiently degrading fats and oils, and an oil-degrading microbial preparation containing an oil-degrading bacterium capable of efficiently degrading fats and oils.
油脂含有排水を処理する方法としては、加圧浮上装置による油水分離法、リパーゼ反応による油脂分解法、および油脂分解菌を用いる油脂消化方法などが知られている。これらの中で加圧浮上装置による油水分離法は、分離され発生する含油汚泥に起因する悪臭、および薬剤、汚泥処理などのランニングコストが高価となり問題である。リパーゼ反応による油脂分解法は、酵素の価格が高くランニングコストが高価となり問題である。また、酵素反応の阻害物質が存在することに起因する失活などの問題がある。また、油脂分解菌を用いる油脂消化方法についても、十分な能力に足りないため、もっぱら、加圧浮上装置による油水分離法が使用されているのが現状である。そのため、油脂分解菌、および油脂分解菌を含む微生物製剤を利用することによる、低コストであり、かつ効率的な油脂含有排水の処理方法が望まれている。 Known methods for treating oil-containing wastewater include an oil-water separation method using a pressurized flotation device, an oil-and-oil decomposition method using a lipase reaction, and an oil-and-oil digestion method using an oil-degrading bacterium. Among these, the oil-water separation method using a pressurized flotation device is problematic because of bad odor due to oil-containing sludge that is separated and generated, and running costs such as chemicals and sludge treatment are expensive. The fat and oil decomposition method using a lipase reaction is problematic because the enzyme is expensive and the running cost is high. In addition, there is a problem such as inactivation due to the presence of an enzyme reaction inhibitor. In addition, the oil and fat digestion method using the oil and fat decomposing bacteria is not sufficient in capacity, so that the oil / water separation method using a pressure levitation device is used exclusively. Therefore, there is a demand for a low-cost and efficient method for treating oil-containing wastewater by utilizing an oil-degrading bacterium and a microorganism preparation containing the oil-degrading bacterium.
油脂分解菌を用いる方法としては、特開２０１４−２３４７４号公報（特許文献１）、特開２０１３−１４６６８９号公報（特許文献２）、特開２０１２−７５３９６号公報（特許文献３）、特開２０１１−１８２７８２号公報（特許文献４）、特開２０１０−２２７８４９号公報（特許文献５）、特開２０１０−２１４３１０号公報（特許文献６）、特開２００２−１２５６５９号公報（特許文献７）などが知られている。 As a method using an oil-degrading bacterium, JP 2014-23474 A (Patent Document 1), JP 2013-14689 A (Patent Document 2), JP 2012-75396 A (Patent Document 3), JP JP 2011-182882 A (Patent Document 4), JP 2010-227849 A (Patent Document 5), JP 2010-214310 A (Patent Document 6), JP 2002-125659 A (Patent Document 7), etc. It has been known.
具体的に、特開２０１４−２３４７４号公報は、バークホルデリア マルチボランス（Burkholderia multivorans）に属する微生物を含有する微生物製剤及び該微生物により油脂を分解する廃液処理方法を開示している。特開２０１３−１４６６８９号公報は、油脂が脂肪酸とグリセロールに分解される第２条件下、遊離脂肪酸を資化するヤロウィア リポリティカを作用させる油分解除去方法において、第２条件がバークホルデリア アルボリス（Burkholderia multivorans）が存在する条件であったり、更にはグリセロールを資化する微生物を併用したりといった、多種の微生物を共存させることを特徴とする油分解除去方法を開示している。 Specifically, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2014-23474 discloses a microbial preparation containing a microorganism belonging to Burkholderia multivorans and a waste liquid treatment method for decomposing oils and fats by the microorganism. Japanese Patent Application Laid-Open No. 2013-146589 discloses an oil decomposition removal method in which Yarrowia lipolytica that assimilates free fatty acids acts under a second condition in which fats and oils are decomposed into fatty acids and glycerol. The second condition is Burkholderia alboris a method for decomposing and removing oil characterized by coexistence of various microorganisms, such as the presence of multivorans) or the combined use of microorganisms that assimilate glycerol.
このような状況下、本発明の目的は、油脂を効率よく分解できる油脂分解菌を用いた油脂含有排水の処理方法及び油脂を効率よく分解できる油脂分解菌を含む油脂分解微生物製剤を提供することにある。 Under such circumstances, an object of the present invention is to provide a method for treating fat-containing wastewater using an oil-degrading bacterium capable of efficiently degrading fats and oils and an oil-degrading microbial preparation containing an oil-degrading bacterium capable of efficiently degrading fats and oils. It is in.
本発明者は、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、リパーゼを生産し且つ脂肪酸を資化できる特定の微生物を油脂含有排水中で作用させることにより、排水中の油脂を効率よく分解できることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies to achieve the above-mentioned object, the present inventor can efficiently decompose fats and oils in wastewater by causing specific microorganisms that can produce lipase and assimilate fatty acids to act in fat-containing wastewater. As a result, the present invention has been completed.
即ち、本発明の第一の油脂含有排水の処理方法は、リパーゼを生産し且つ脂肪酸を資化できる微生物であるバークホルデリア属の菌を油脂含有排水中で作用させ、該排水中に含まれる油脂を分解することを特徴とする。 That is, in the first method for treating fat-containing wastewater of the present invention, a Burkholderia bacterium, which is a microorganism capable of producing lipase and assimilating fatty acids, is allowed to act in fat-containing wastewater and is contained in the wastewater. It is characterized by decomposing oils and fats.
本発明の第一の油脂含有排水の処理方法の好適例において、前記微生物が生産するリパーゼの活性が２００Ｕ／Ｌ以上である。 In a preferred embodiment of the first method for treating fat-containing wastewater according to the present invention, the activity of the lipase produced by the microorganism is 200 U / L or more.
本発明の第一の油脂含有排水の処理方法の他の好適例において、前記微生物が、脂肪酸に加え、グリセロールも資化できる。 In another preferred embodiment of the first method for treating fat-containing wastewater according to the present invention, the microorganism can assimilate glycerol in addition to the fatty acid.
本発明の第一の油脂含有排水の処理方法の他の好適例において、前記菌が、バークホルデリア エスピー（Burkholderia sp.）AKL-1（受託番号NITE P-02357）、AKL-5（受託番号NITE P-02359）、AKL-6（受託番号NITE P-02360）、及びAKL-7（受託番号NITE P-02358）よりなる群から選択される少なくとも１種である。 In another preferred embodiment of the first method for treating fat-containing wastewater according to the present invention, the bacterium is Burkholderia sp. AKL-1 (Accession Number NITE P-02357), AKL-5 (Accession Number) NITE P-02359), AKL-6 (Accession Number NITE P-02360), and AKL-7 (Accession Number NITE P-02358).
また、本発明の第二の油脂含有排水の処理方法は、リパーゼを生産し且つ脂肪酸を資化できる微生物であるシュードモナス属の菌を油脂含有排水中で作用させ、該排水中に含まれる油脂を分解することを特徴とする。 In addition, the second method for treating fat-containing wastewater according to the present invention is to cause Pseudomonas spp., Which is a microorganism capable of producing lipase and assimilating fatty acids, to act in fat-containing wastewater, and to remove the fat contained in the wastewater. It is characterized by decomposing.
本発明の第二の油脂含有排水の処理方法の他の好適例において、前記微生物が、脂肪酸に加え、グリセロールも資化できる。 In another preferred embodiment of the second method for treating waste oil-containing wastewater of the present invention, the microorganism can assimilate glycerol in addition to fatty acid.
本発明の第二の油脂含有排水の処理方法の好適例において、前記菌が、シュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）AKB-1（受託番号NITE P-02361）、AKB-2（受託番号NITE P-02362）、AKB-3（受託番号NITE P-02363）、及びAKB-4（受託番号NITE P-02364）よりなる群から選択される少なくとも１種である。 In a preferred embodiment of the second method for treating fat-containing wastewater according to the present invention, the bacterium is Pseudomonas sp. AKB-1 (Accession Number NITE P-02361), AKB-2 (Accession Number NITE P-02362) ), AKB-3 (Accession Number NITE P-02363), and AKB-4 (Accession Number NITE P-02364).
また、本発明の油脂分解微生物製剤は、リパーゼを生産し且つ脂肪酸を資化できる微生物であるバークホルデリア属の菌及びリパーゼを生産し且つ脂肪酸を資化できる微生物であるシュードモナス属の菌よりなる群から選択される少なくとも１種の菌を含むことを特徴とする。 The oil-and-fat decomposing microorganism preparation of the present invention comprises a Burkholderia bacterium that is a microorganism capable of producing lipase and assimilating fatty acids, and a Pseudomonas bacterium that is a microorganism capable of producing lipase and assimilating fatty acids. It includes at least one bacterium selected from the group.
本発明によれば、油脂を効率よく分解できる油脂分解菌を用いた油脂含有排水の処理方法及び油脂を効率よく分解できる油脂分解菌を含む油脂分解微生物製剤を提供する。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the oil-and-oil decomposition | disassembly microbe formulation containing the fat-and-oil decomposition microbe which can decompose | disassemble oil and fat efficiently and the processing method of the fat-and-oil containing wastewater using the oil-and-oil decomposition bacteria which can decompose | disassemble oil and fat efficiently are provided.
＜油脂含有排水の処理方法＞
以下に、本発明の油脂含有排水の処理方法について詳細に説明する。本発明の油脂含有排水の処理方法は、リパーゼを生産し且つ脂肪酸を資化できる微生物を油脂含有排水中で作用させ、該排水中に含まれる油脂を分解することを特徴とするものであるが、第一の油脂含有排水の処理方法においては、上記微生物がバークホルデリア属の菌であり、第二の油脂含有排水の処理方法においては、上記微生物がシュードモナス属の菌である。なお、これらの菌を併用することも可能である。つまり、本発明の第一の油脂含有排水の処理方法において、リパーゼを生産し且つ脂肪酸を資化できるシュードモナス属の菌を併用してもよいし、本発明の第二の油脂含有排水の処理方法において、リパーゼを生産し且つ脂肪酸を資化できるバークホルデリア属の菌を併用してもよい。
<Treatment method for oil-containing wastewater>
Below, the processing method of the fat and oil containing waste water of this invention is demonstrated in detail. The method for treating oil-containing wastewater according to the present invention is characterized in that a microorganism capable of producing lipase and assimilating fatty acids is allowed to act in oil-containing wastewater, and the oil and fat contained in the wastewater is decomposed. In the first method for treating fat-containing wastewater, the microorganism is a Burkholderia genus, and in the second method for treating fat-containing wastewater, the microorganism is a Pseudomonas bacterium. In addition, it is also possible to use these bacteria together. That is, in the first method for treating fat-containing wastewater according to the present invention, a bacterium belonging to the genus Pseudomonas that can produce lipase and assimilate fatty acids may be used in combination, or the second method for treating fat-containing wastewater according to the present invention. , A Burkholderia bacterium capable of producing lipase and assimilating fatty acids may be used in combination.
本発明の油脂含有排水の処理方法に用いる微生物は、リパーゼを生産するため、油脂をグリセロールと脂肪酸に加水分解することができる。また、上記微生物は、油脂の分解により生じる脂肪酸を資化でき、好ましくは脂肪酸に加え、グリセロールも資化できるため、排水中における脂肪酸の蓄積を防ぎ、油脂の分解効率の低下を防ぐことができる。これにより、油脂を効率よく分解することが可能となる。 Since the microorganism used in the method for treating oil-containing wastewater of the present invention produces lipase, the oil can be hydrolyzed into glycerol and fatty acids. In addition, since the microorganism can assimilate fatty acids generated by the decomposition of fats and oils, and preferably can also assimilate glycerol in addition to fatty acids, accumulation of fatty acids in wastewater can be prevented, and degradation of fats and oils degradation can be prevented. . Thereby, it becomes possible to decompose | disassemble oil and fat efficiently.
また、本発明の油脂含有排水の処理方法に用いる微生物は、リパーゼを生産するものであるが、そのリパーゼの活性は２００Ｕ／Ｌ以上であることが好ましく、２００〜１６００Ｕ／Ｌの範囲であることが更に好ましい。このような微生物としてはバークホルデリア属の菌が好ましい。 Moreover, although the microorganisms used for the processing method of the fat and oil containing waste water of this invention produce lipase, it is preferable that the activity of the lipase is 200 U / L or more, and is the range of 200-1600 U / L. Is more preferable. As such microorganisms, bacteria of the genus Burkholderia are preferable.
微生物の生産するリパーゼの活性は、以下の方法で測定できる。表１に示す、大豆油を炭素源とする最少培地を容量１５０ｍｌの三角フラスコに３０ｍｌ分注し、オートクレーブ（１２０℃、２０分）殺菌したのち、平板培地上で生育している菌株、または液体培地で生育している菌株を一白金耳量程度移植し、２５℃、１８０ｒｐｍで７０時間振とう培養し、培養液を得る。得られた培養液を、リパーゼカラーオートテストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用い説明書に従いリパーゼ活性を測定する。活性値はリパーゼ標準液（和光純薬工業株式会社製）を用いて検量線を作成し、算出する。なお、ここでいうリパーゼ活性とは、１分間に１μｍｏｌの１，２−ジアシルグリセロールを加水分解する酵素量を１ユニット(Ｕ)として定義される。 The activity of lipase produced by microorganisms can be measured by the following method. 30 ml of a minimal medium containing soybean oil as a carbon source shown in Table 1 in a 150 ml Erlenmeyer flask, sterilized by autoclaving (120 ° C., 20 minutes), and then grown on a plate medium or liquid A strain growing in the medium is transplanted by about one platinum loop, and cultured with shaking at 25 ° C. and 180 rpm for 70 hours to obtain a culture solution. The lipase activity of the obtained culture solution is measured using a lipase color auto test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) according to the instructions. The activity value is calculated by creating a calibration curve using a lipase standard solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The lipase activity here is defined as 1 unit (U) of the amount of enzyme that hydrolyzes 1 μmol of 1,2-diacylglycerol per minute.
本発明の油脂含有排水の処理方法に用いる微生物が、バークホルデリア属の菌である場合、バークホルデリア エスピー（Burkholderia sp.）AKL-1（受託番号NITE P-02357）、AKL-5（受託番号NITE P-02359）、AKL-6（受託番号NITE P-02360）、及びAKL-7（受託番号NITE P-02358）よりなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。また、本発明の油脂含有排水の処理方法に用いる微生物が、シュードモナス属の菌である場合、シュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）AKB-1（受託番号NITE P-02361）、AKB-2（受託番号NITE P-02362）、AKB-3（受託番号NITE P-02363）、及びAKB-4（受託番号NITE P-02364）よりなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。 When the microorganism used in the method for treating fat and oil-containing wastewater of the present invention is a bacterium belonging to the genus Burkholderia, Burkholderia sp. AKL-1 (accession number NITE P-02357), AKL-5 (consignment) Number NITE P-02359), AKL-6 (Accession Number NITE P-02360), and AKL-7 (Accession Number NITE P-02358) are preferred. In addition, when the microorganism used in the method for treating oil-containing wastewater according to the present invention is a bacterium belonging to the genus Pseudomonas, Pseudomonas sp. AKB-1 (Accession Number NITE P-02361), AKB-2 (Accession Number NITE) P-02362), AKB-3 (accession number NITE P-02363), and AKB-4 (accession number NITE P-02364).
本発明の処理方法において、油脂含有排水としては、例えば、食品加工工場、化学工場、乳製品関連工場、レストラン厨房、家庭等から排出される排水が挙げられる。本発明によれば、ノルマルヘキサン抽出物質の濃度が高い油脂含有排水（例えばノルマルヘキサン抽出物質の濃度が５００〜２０００ｍｇ／Ｌの油脂含有排水）であっても、短い処理時間（例えば２４時間程度）で、余剰汚泥の発生が少なく清澄な処理水を得ることができる可能性がある。なお、ノルマルヘキサン抽出物質の濃度は、試料をｐＨ４以下の塩酸酸性にして、試料中の油分をヘキサンにより抽出し、約８０℃でヘキサンを揮散させて残留する物質の質量を測定することで求めることができる。
また、油脂の加水分解、および産生した脂肪酸の消費に関しては、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による分析、評価が出来る。具体的な手順としては、検体からの脂質抽出には、メタノール：メチル−ｔ−ブチルエーテル＝１：２で混合した溶媒を使用する。ＴＬＣの展開溶媒にはｎ−ヘキサン：メチル−ｔ−ブチルエーテル：酢酸＝８５：１５：１で混合した溶媒を使用する。リンモリブデン酸／エタノール溶液噴霧後、熱処理したことで出現するスポットの強弱を、画像処理により定量解析することで分析が可能である。
また、リパーゼによる油脂加水分解で産生するグリセロールの消費に関しては、液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)による分析、評価が出来る。また、市販のキットを使用した酵素法による定量も可能である。
In the treatment method of the present invention, examples of the fat and oil-containing wastewater include wastewater discharged from food processing factories, chemical factories, dairy product-related factories, restaurant kitchens, homes, and the like. According to the present invention, a short treatment time (for example, about 24 hours) is possible even for oil-containing wastewater having a high concentration of normal hexane extract (eg, oil-containing wastewater having a concentration of normal hexane extract of 500 to 2000 mg / L). Therefore, there is a possibility that clear treated water can be obtained with less generation of excess sludge. The concentration of the normal hexane extractable substance is obtained by making the sample acidic with hydrochloric acid having a pH of 4 or less, extracting the oil in the sample with hexane, volatilizing hexane at about 80 ° C., and measuring the mass of the remaining substance. be able to.
In addition, analysis and evaluation by thin layer chromatography (TLC) can be performed with respect to hydrolysis of fats and oils and consumption of produced fatty acids. As a specific procedure, a solvent mixed with methanol: methyl-t-butyl ether = 1: 2 is used for lipid extraction from a specimen. A solvent mixed with n-hexane: methyl-t-butyl ether: acetic acid = 85: 15: 1 is used as a developing solvent for TLC. After spraying the phosphomolybdic acid / ethanol solution, it is possible to analyze the intensity of the spots that appear by heat treatment by quantitative analysis by image processing.
In addition, the consumption of glycerol produced by hydrolysis of fats and oils by lipase can be analyzed and evaluated by liquid chromatography (HPLC). Also, quantification by an enzymatic method using a commercially available kit is possible.
本発明の油脂含有排水の処理方法においては、第一の効果として、高活性のリパーゼを生産する菌を作用させることによる油脂分解、および第二の効果として、速やかに脂肪酸を資化できる微生物を油脂含有排水中で作用させることによって、該排水中に含まれる油脂を分解することができるものである。ここで、「作用させる」とは、培養した微生物を微生物製剤として排水処理施設を構成するいずれかの槽に投入にすることにより、微生物が持つリパーゼを生産する能力と脂肪酸を資化する能力を発揮させることを意味する。 In the method for treating fat and oil-containing wastewater of the present invention, as a first effect, fats and oils decomposition caused by the action of bacteria that produce highly active lipase, and as a second effect, microorganisms capable of rapidly assimilating fatty acids are obtained. By making it act in fat and oil containing wastewater, the fat and oil contained in this wastewater can be decomposed | disassembled. Here, “acting” refers to the ability of microorganisms to produce lipase and the ability to assimilate fatty acids by putting the cultured microorganisms as microbial preparations into any tank that constitutes a wastewater treatment facility. It means to show off.
本発明の油脂含有排水の処理方法において、油脂含有排水中で微生物を作用させる条件は、本微生物が生育可能で、かつリパーゼの生産や脂肪酸の資化が可能であれば限定されるものではないが、好ましい条件として以下のものが挙げられる。
好ましい温度範囲：１０〜４０℃、より好ましくは１５〜３５℃
好ましいｐＨ範囲：４〜８、より好ましくは５〜８
好ましい微生物の使用量：製剤中生菌数濃度として、１０６〜１０１１ｃｆｕ／ｍＬ（またはｇ）の製剤を、投入する反応槽容積の１／１，０００〜１／１００，０００となるように添加する。（ｃｆｕとはコロニー フォーミング ユニットの略で、生菌数を示す単位である。）
In the method for treating fat-containing wastewater according to the present invention, the conditions under which microorganisms act in the fat-containing wastewater are not limited as long as the microorganism can grow and lipase production and fatty acid assimilation are possible. However, preferable conditions include the following.
Preferred temperature range: 10-40 ° C, more preferably 15-35 ° C
Preferred pH range: 4-8, more preferably 5-8
Preferable amount of microorganism used: As a viable cell count concentration in the preparation, a preparation of 10 6 to 10 11 cfu / mL (or g) should be 1/1000 to 1 / 100,000 of the reaction tank volume to be charged. Add to. (Cfu is an abbreviation for colony forming unit and is a unit indicating the number of viable bacteria.)
本発明の油脂含有排水の処理方法においては、後述する本発明の油脂分解微生物製剤の形態で、微生物を油脂含有排水中に添加することが好ましい。 In the method for treating oil-containing wastewater of the present invention, it is preferable to add microorganisms to the oil-containing wastewater in the form of the oil-degrading microbial preparation of the present invention described later.
＜油脂分解微生物製剤＞
以下に、本発明の油脂分解微生物製剤について詳細に説明する。本発明の油脂分解微生物製剤は、リパーゼを生産し且つ脂肪酸を資化できる微生物であるバークホルデリア属の菌及びリパーゼを生産し且つ脂肪酸を資化できる微生物であるシュードモナス属の菌よりなる群から選択される少なくとも１種の菌を含むことを特徴とする。
<Oil-degrading microbial preparation>
Hereinafter, the fat-and-oil decomposing microorganism preparation of the present invention will be described in detail. The oil-and-fat decomposing microorganism preparation of the present invention comprises a bacterium belonging to the genus Burkholderia, which is a microorganism capable of producing lipase and assimilating fatty acids, and a group of bacteria belonging to the genus Pseudomonas which is a microorganism capable of producing lipase and assimilating fatty acids. It contains at least one selected bacterium.
本発明の油脂分解微生物製剤に用いる微生物は、好ましいバークホルデリア属の菌として、バークホルデリア エスピー（Burkholderia sp.）AKL-1（受託番号NITE P-02357）、AKL-5（受託番号NITE P-02359）、AKL-6（受託番号NITE P-02360）、及びAKL-7（受託番号NITE P-02358）が挙げられ、好ましいシュードモナス属の菌として、シュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）AKB-1（受託番号NITE P-02361）、AKB-2（受託番号NITE P-02362）、AKB-3（受託番号NITE P-02363）、及びAKB-4（受託番号NITE P-02364）が挙げられる。 Microorganisms used in the oil-and-fat decomposing microorganism preparation of the present invention are preferably Burkholderia sp. Burkholderia sp. AKL-1 (Accession No. NITE P-02357), AKL-5 (Accession No. NITE P) -02359), AKL-6 (Accession Number NITE P-02360), and AKL-7 (Accession Number NITE P-02358). Pseudomonas sp. AKB-1 (pseudomonas sp.) (Accession number NITE P-02361), AKB-2 (Accession number NITE P-02362), AKB-3 (Accession number NITE P-02363), and AKB-4 (Accession number NITE P-02364).
本発明において、微生物の製剤化手段は、特に限定されず、公知の製剤化手段を利用することができる。
製剤が固体（粉末形態）である場合は、菌体の培養液を、適当な乾燥方法で乾燥し、固体とする。乾燥方法としては、真空乾燥機、流動乾燥機、スプレードライヤー、凍結乾燥機、ドラムドライヤーなどによる乾燥方法があげられる。その際、賦形剤などを添加しても構わない。
また製剤が液体であれば、本実施例のように、培養液そのものや、培地成分を遠心分離等で除去したのち緩衝液、生理的食塩水などで置換したもの、あるいは培養液を適宜希釈、または濃縮した液、または栄養分を添加剤として添加したものを使用できる。
In the present invention, the means for formulating microorganisms is not particularly limited, and known formulating means can be used.
When the preparation is solid (powder form), the cell culture is dried by an appropriate drying method to form a solid. Examples of the drying method include a drying method using a vacuum dryer, a fluid dryer, a spray dryer, a freeze dryer, a drum dryer, and the like. At that time, an excipient or the like may be added.
If the preparation is liquid, as in this example, the culture solution itself, the medium components removed by centrifugation or the like and then replaced with a buffer solution, physiological saline, or the like, or the culture solution is diluted appropriately, Alternatively, a concentrated liquid or a nutrient added as an additive can be used.
本発明の油脂分解微生物製剤は、液体でもよいし、固体（好ましくは粉末形態）でもよい。 The oil-degrading microbial preparation of the present invention may be liquid or solid (preferably in powder form).
＜油脂分解菌＞
以下に、本発明に使用できる油脂分解菌について詳細に説明する。本発明に使用できる油脂分解菌は、リパーゼを生産し且つ脂肪酸を資化できるバークホルデリア属の菌又はリパーゼを生産し且つ脂肪酸を資化できる微生物であるシュードモナス属の菌である。
<Oil-degrading bacteria>
Below, the fat-and-oil decomposing bacteria which can be used for this invention are demonstrated in detail. The oil-degrading bacteria that can be used in the present invention are bacteria of the genus Burkholderia that can produce lipase and assimilate fatty acids, or those of the genus Pseudomonas that are microorganisms that can produce lipase and assimilate fatty acids.
具体例としては、以下に示す油脂分解菌を挙げることができる。
・バークホルデリア エスピー（Burkholderia sp.）AKL-1（受託番号NITE P-02357）
・バークホルデリア エスピー（Burkholderia sp.）AKL-5（受託番号NITE P-02359）
・バークホルデリア エスピー（Burkholderia sp.）AKL-6（受託番号NITE P-02360）
・バークホルデリア エスピー（Burkholderia sp.）AKL-7（受託番号NITE P-02358）
・シュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）AKB-1（受託番号NITE P-02361）
・シュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）AKB-2（受託番号NITE P-02362）
・シュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）AKB-3（受託番号NITE P-02363）
・シュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）AKB-4（受託番号NITE P-02364）
Specific examples include the oil-degrading bacteria shown below.
・ Burkholderia sp. AKL-1 (Accession number NITE P-02357)
・ Burkholderia sp. AKL-5 (Accession number NITE P-02359)
・ Burkholderia sp. AKL-6 (Accession number NITE P-02360)
・ Burkholderia sp. AKL-7 (Accession number NITE P-02358)
・ Pseudomonas sp. AKB-1 (Accession number NITE P-02361)
・ Pseudomonas sp. AKB-2 (Accession number NITE P-02362)
・ Pseudomonas sp. AKB-3 (Accession number NITE P-02363)
・ Pseudomonas sp. AKB-4 (Accession number NITE P-02364)
油脂分解菌の探索は、例えば次のようにして行われる。自然界より分離した土壌などのサンプルを、油脂を炭素源とする最少培地に適量添加し培養する。油脂分解菌が存在する場合は、培養液中で優先的に増殖する。この集積培養を数回繰り返したのち、油脂を含む寒天培地上に塗布し、油脂分解菌を選抜することが可能である。
上記のような方法によって単離される油脂分解菌の分類、同定は、任意の公知の方法を用いて行うことができる。分類、同定方法の具体例としては、電子顕微鏡による微細形態の観察、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼ−ションによるＤＮＡ類似度、リボソームＲＮＡ遺伝子塩基配列から分類、同定を行う方法などがある。例えばリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列の決定には、ＰＣＲ法等の任意の公知の方法を用いることができる。ＰＣＲ法を用いる場合、リボソームＲＮＡとしては、２３ＳｒＲＮＡ、１８Ｓ ｒＲＮＡ、５．８Ｓ ｒＲＮＡ等を適宜選択して用いることができるが、１６Ｓ ｒＲＮＡが好ましく用いられる。プライマーとしては任意のものを適宜選択して用いることができる。また、部分塩基配列の相同性の決定には、ＢＬＡＳＴ、Ｅｚｔａｘｏｎ等の任意の公知のソフトウェアを用いることができる。
上記のような方法で、リパーゼを生産し且つ脂肪酸を資化できる菌株として、バークホルデリア エスピー（Burkholderia sp.）AKL-1、AKL-5、AKL-6、AKL-7、シュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）AKB-1、AKB-2、AKB-3、AKB-4が単離された。これら菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、バークホルデリア エスピー（Burkholderia sp.）AKL-1（受託番号NITE P-02357）、AKL-5（受託番号NITE P-02359）、AKL-6（受託番号NITE P-02360）、及びAKL-7（受託番号NITE P-02358）、シュードモナス エスピー（Pseudomonas sp.）AKB-1（受託番号NITE P-02361）、AKB-2（受託番号NITE P-02362）、AKB-3（受託番号NITE P-02363）、及びAKB-4（受託番号NITE P-02364）として寄託されている。
The search for oil-degrading bacteria is performed, for example, as follows. An appropriate amount of a sample such as soil separated from the natural world is added to a minimal medium containing oil and fat as a carbon source and cultured. When oil-degrading bacteria are present, they preferentially grow in the culture solution. After this enrichment culture is repeated several times, it can be applied to an agar medium containing fats and oils, and the oil-degrading bacteria can be selected.
Classification and identification of the oil-degrading bacteria isolated by the method as described above can be performed using any known method. Specific examples of classification and identification methods include microscopic observation with an electron microscope, DNA similarity by DNA-DNA hybridization, and classification and identification from ribosomal RNA gene base sequences. For example, any known method such as a PCR method can be used to determine the base sequence of a ribosomal RNA gene. When the PCR method is used, 23S rRNA, 18S rRNA, 5.8S rRNA and the like can be appropriately selected and used as the ribosomal RNA, but 16S rRNA is preferably used. Any primer can be appropriately selected and used. In addition, any known software such as BLAST and Eztaxon can be used to determine the homology of the partial base sequence.
Burkholderia sp. AKL-1, AKL-5, AKL-6, AKL-7, Pseudomonas sp (Pseudomonas sp) are strains that can produce lipase and assimilate fatty acids by the above method. .) AKB-1, AKB-2, AKB-3, AKB-4 were isolated. These strains can be obtained from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Depositary Center at Burkholderia sp. AKL-1 (Accession Number NITE P-02357), AKL-5 (Accession Number NITE P-02359) , AKL-6 (Accession number NITE P-02360), AKL-7 (Accession number NITE P-02358), Pseudomonas sp. AKB-1 (Accession number NITE P-02361), AKB-2 (Accession) No. NITE P-02362), AKB-3 (Accession Number NITE P-02363), and AKB-4 (Accession Number NITE P-02364).
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）
油脂分解菌のスクリーニング：
菌株の分離源として、日本国内の土壌サンプルを採取した。表２に示す、大豆油を炭素源とする最少培地に土壌サンプルを適量添加し、２５℃で３日間振とう培養を行った。脂を分解し、脂質を資化し得る菌が存在する場合は、培養液中で優先的に増殖する。この集積培養を２回繰り返したのち、表３に示す、大豆油とビクトリアブルーを含む寒天培地上に塗布し、２５℃で３日間静置培養した。培養後、油脂の分解の指標である、青色の呈色を示す菌株を選抜した。
Example 1
Screening for oil-degrading bacteria:
A soil sample in Japan was collected as a source for strain isolation. An appropriate amount of a soil sample was added to a minimal medium containing soybean oil as a carbon source shown in Table 2, and cultured with shaking at 25 ° C. for 3 days. When bacteria exist that can break down fat and assimilate lipids, they grow preferentially in the culture medium. After this enrichment culture was repeated twice, it was applied onto an agar medium containing soybean oil and Victoria Blue shown in Table 3, and statically cultured at 25 ° C. for 3 days. After culturing, a strain showing blue coloration, which is an index of oil and fat decomposition, was selected.
（実施例２）
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の相同性による系統解析：
実施例１より選抜された候補株について、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列解析を行うことにより同定を行った。１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列をＰＣＲにて増幅し、シーケンス解析を行った。ＢＬＡＳＴ相同性検索のデータベースはＤＢ−ＢＡ１１．０（テクノスルガ・ラボ社）を使用し、簡易分子系統解析を行った。その結果、AKL-1、AKL-5、AKL-6、AKL-7はBurkhlderia属で構成されるクラスター内に含まれたが、何れの既知種とも異なる分子系統学的位置を示したことから、種名の同定に至らなかった。また、AKB-1、AKB-2、AKB-3、AKB-4はPseudomonas属で構成されるクラスター内に含まれたが、何れの既知種とも異なる分子系統学的位置を示したことから、種名の同定に至らなかった。
(Example 2)
Phylogenetic analysis by homology of 16S rRNA gene sequence:
The candidate strain selected from Example 1 was identified by base sequence analysis of 16S rDNA gene. The base sequence of 16S rDNA gene was amplified by PCR, and sequence analysis was performed. DB-BA11.0 (Techno Suruga Laboratories) was used as a database for BLAST homology search, and simple molecular phylogenetic analysis was performed. As a result, AKL-1, AKL-5, AKL-6, and AKL-7 were included in the cluster composed of the genus Burkhlderia, but showed a molecular phylogenetic position different from any known species, The species name was not identified. In addition, AKB-1, AKB-2, AKB-3, and AKB-4 were included in a cluster composed of the genus Pseudomonas, but they showed different molecular phylogenetic positions from any known species. The name was not identified.
（実施例３）
得られた菌株の菌学的諸性質：
光学顕微鏡による形態観察およびＢａｒｒｏｗ＆Ｆｅｌｔｈａｍの方法に基づき、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸／ガス産生、ブドウ糖の酸化／発酵（Ｏ／Ｆ）について試験した。その結果を表４〜５として示す。また、ＡＰＩ２０ＮＥキット（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製）を用いて、硝酸塩還元、インドール産生、ブドウ糖酸性化、アルギニンジヒドロラーゼ、ウレアーゼ、エスクリン加水分解、ゼラチン加水分解、β−ガラクトシダーゼ及びチトクロームオキシダーゼについての生化学試験、並びに、ブドウ糖、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、マルトース、グルコン酸カリウム、ｎ−カプリン酸、アジピン酸、ｄｌ−リンゴ酸、クエン酸ナトリウム、酢酸フェニルについての資化性試験を行った。その結果を表６として示す。さらに、AKL-1では各種糖の資化性を試験した。その結果を表７として示す。また、AKB-2では５％、および６％ＮａＣｌでの生育、Ｋｉｎｇｓ’Ｂ培地での蛍光色素産生、レバン産生、リパーゼ活性、デンプンの加水分解、カゼインの加水分解性の有無を試験した。その結果を表８として示す。
(Example 3)
Mycological properties of the obtained strain:
The catalase reaction, oxidase reaction, acid / gas production from glucose, and glucose oxidation / fermentation (O / F) were tested based on morphological observation with an optical microscope and the method of Barrow & Feltham. The results are shown in Tables 4-5. In addition, using the API20NE kit (manufactured by bioMerieux), biochemical test for nitrate reduction, indole production, glucose acidification, arginine dihydrolase, urease, esculin hydrolysis, gelatin hydrolysis, β-galactosidase and cytochrome oxidase, and Glucose, L-arabinose, D-mannose, D-mannitol, N-acetyl-D-glucosamine, maltose, potassium gluconate, n-capric acid, adipic acid, dl-malic acid, sodium citrate, phenyl acetate An assimilation test was conducted. The results are shown in Table 6. Furthermore, AKL-1 tested the assimilation of various sugars. The results are shown in Table 7. In addition, AKB-2 was tested for growth in 5% and 6% NaCl, fluorescent dye production in Kings'B medium, levan production, lipase activity, starch hydrolysis, and casein hydrolyzability. The results are shown in Table 8.
実施例２、および表４、表６、表７の結果より、AKL-1、AKL-5、AKL-6、およびAKL-7はBurkholderia sp.と推定された。また、実施例２、および表５、表６、表８より、AKB-1、AKB-2、AKB-3、およびAKB-4はPseudomonas sp.と推定された。 From the results of Example 2 and Tables 4, 6 and 7, AKL-1, AKL-5, AKL-6 and AKL-7 were estimated to be Burkholderia sp. Moreover, from Example 2, Table 5, Table 6, and Table 8, AKB-1, AKB-2, AKB-3, and AKB-4 were estimated to be Pseudomonas sp.
（実施例４）
AKL-1、AKL-5、AKL-6、AKL-7および同属株が産生するリパーゼ活性の比較：
AKL-1、AKL-5、AKL-6、AKL-7株を、表２に示す大豆油を炭素源として含む最少液体培地で２５℃、１８０ｒｐｍで７０時間振とう培養し、培養液を得た。なお、比較例として、Burkholderia属の他種菌株としてNBRC100965(Burkholderia ginsengisoli)、NBRC102086(Burkholderia multivorans)、NBRC102489(Burkholderia fungorum)、NBRC105797(Burkholderia oxyphila)を入手し、培養した。得られた培養液の濁度（ＯＤ６００値）、およびリパーゼ活性を測定した。リパーゼ活性の測定には、リパーゼカラーオートテストワコー（和光）を用い、活性値の算出にはリパーゼ標準液（和光社市販）を用いて作成した検量線を使用した。その結果を表９として示す。
Example 4
Comparison of lipase activity produced by AKL-1, AKL-5, AKL-6, AKL-7 and the same strains:
AKL-1, AKL-5, AKL-6, and AKL-7 strains were cultured with shaking in a minimal liquid medium containing soybean oil shown in Table 2 as a carbon source at 25 ° C. and 180 rpm for 70 hours to obtain a culture solution. . As comparative examples, NBRC100965 (Burkholderia ginsengisoli), NBRC102086 (Burkholderia multivorans), NBRC102489 (Burkholderia fungorum), and NBRC105797 (Burkholderia oxyphila) were obtained and cultured as other strains of the Burkholderia genus. Turbidity (OD600 value) and lipase activity of the obtained culture broth were measured. For the measurement of lipase activity, a lipase color auto test Wako (Wako) was used, and for the calculation of the activity value, a calibration curve prepared using a lipase standard solution (commercially available from Wako) was used. The results are shown in Table 9.
表９より、AKL-1、AKL-5、AKL-6及びAKL-7は、大豆油を炭素源とした培地で増殖能が高いことから油脂分解能を持ち、脂肪酸を資化することが示された。また、Burkholderia属の他種菌株と比較して高いリパーゼ活性を示し、中でも、AKL-1、AKL-5及びAKL-7のリパーゼ活性が顕著であることが分かった。 Table 9 shows that AKL-1, AKL-5, AKL-6, and AKL-7 have fat-degrading ability and assimilate fatty acids because of their high growth ability in a medium using soybean oil as a carbon source. It was. Moreover, it showed high lipase activity compared with other strains of the genus Burkholderia, and it was found that the lipase activities of AKL-1, AKL-5 and AKL-7 were particularly remarkable.
（実施例５）
AKB-1、AKB-2、AKB-3、AKB-4および同属株によるモデル液中の油脂分解試験：
油脂分解試験に使用するためにAKB-1、AKB-2、AKB-3、AKB-4および比較例としてPseudomonas属で種の異なる菌株を購入し、これらを、表２に示す組成の培地にて２５℃、１８０ｒｐｍで７０時間振とう培養し、培養液を得た。得られた培養液を、表１０に示す市販の豆乳を２０倍希釈した液を含む培地に移植し、培地に含まれる脂質の減少度を確認した。その結果を表１１に示す。比較例として、同属他種の菌株を同様に移植した。経時的にサンプリングを実施した。サンプリング液からの脂質抽出には、メタノール：メチル−ｔ−ブチルエーテル＝１：２で混合した溶媒を使用した。ＴＬＣの展開溶媒にはｎ−ヘキサン：メチル−ｔ−ブチルエーテル：酢酸＝８５：１５：１で混合した溶媒を使用した。リンモリブデン酸／エタノール溶液噴霧後、熱処理したことで出現するスポットの強弱を、画像処理により定量解析した。その結果、AKB-1、AKB-2、AKB-3、およびAKB-4は同属他種の菌株に比べ、有意に培地中の脂質を分解していた。
(Example 5)
Decomposition test of fats and oils in model liquids using AKB-1, AKB-2, AKB-3, AKB-4 and related strains:
AKB-1, AKB-2, AKB-3, AKB-4 and strains of different species in the genus Pseudomonas were purchased for use in fat and oil degradation tests, and these were stored in a medium having the composition shown in Table 2. Cultured with shaking at 25 ° C. and 180 rpm for 70 hours to obtain a culture solution. The obtained culture solution was transplanted to a medium containing a solution obtained by diluting commercially available soymilk shown in Table 10 20 times, and the degree of reduction of lipids contained in the medium was confirmed. The results are shown in Table 11. As a comparative example, a strain of another species of the same genus was transplanted in the same manner. Sampling was performed over time. For lipid extraction from the sampling solution, a solvent mixed with methanol: methyl-t-butyl ether = 1: 2 was used. As a developing solvent for TLC, a solvent mixed with n-hexane: methyl-t-butyl ether: acetic acid = 85: 15: 1 was used. After spraying the phosphomolybdic acid / ethanol solution, the intensity of the spots appearing by heat treatment was quantitatively analyzed by image processing. As a result, AKB-1, AKB-2, AKB-3, and AKB-4 significantly degraded lipids in the medium as compared to other strains of the same genus.
表１１中、ＴＧはトリグリセリド、ＦＡは脂肪酸であり、ＴＧ＋ＦＡ（ｍｇ／Ｌ）はＴＬＣによる定量分析からの合算値である。 In Table 11, TG is triglyceride, FA is fatty acid, and TG + FA (mg / L) is a total value from quantitative analysis by TLC.
（実施例６）
培養時の脂肪酸、グリセロール資化能の評価：
AKL-1、AKB-2を市販のNutrient Broth １００ｍＬ（５００ｍＬ容三角フラスコを使用）にて３０℃、１８０ｒｐｍで２４時間振とう培養し、前培養とした。得られた培養液を１００倍希釈になるように、表２に示す組成から大豆油を抜いた培地４Ｌ（１０Ｌ容ジャーファーメンターを使用）に植菌し、２５℃、７００ｒｐｍ、通気４Ｌ／ｍｉｎ条件で培養した。ｐＨ調整剤として２８％アンモニア水を使用し、ｐＨを７．０に維持した。炭素源として、培養開始時から大豆油を１ｇ／Ｌ／ｈにて連続添加した（終濃度は４８ｇ／Ｌとなる）。４８ｈ後に培養液をサンプリングし、培養上清中のトリグリセリド、脂肪酸、およびグリセロールを定量したところ、AKL-1、AKB-2共に、単独の菌でこれらの化合物は完全に資化され、菌体重量が増加していることを確認した。
(Example 6)
Evaluation of ability to assimilate fatty acids and glycerol during culture:
AKL-1 and AKB-2 were precultured by shaking in commercial Nutrient Broth 100 mL (using a 500 mL Erlenmeyer flask) at 30 ° C. and 180 rpm for 24 hours. The obtained culture broth was inoculated into 4 L of a medium from which the soybean oil was removed from the composition shown in Table 2 (using a 10 L jar fermenter), and 25 ° C., 700 rpm, aeration 4 L / min. Cultured under conditions. 28% aqueous ammonia was used as a pH adjuster, and the pH was maintained at 7.0. As a carbon source, soybean oil was continuously added at 1 g / L / h from the beginning of the culture (the final concentration was 48 g / L). After 48 hours, the culture broth was sampled and the triglycerides, fatty acids, and glycerol in the culture supernatant were quantified. As a result, both AKL-1 and AKB-2 were completely assimilated and these compounds were completely assimilated. Confirmed that the increase.
（実施例７）
実液中の油脂分解試験：
油脂分解試験に使用するために、AKL-1、AKL-5、AKL-6、AKL-7、AKB-1、AKB-2、AKB-3、及びAKB-4を表６に示す組成の培地にて２５℃、１８０ｒｐｍで７０時間振とう培養し、培養液を得た。得られた培養液を１００倍希釈となるように、食品加工工場の排水処理施設より採取された油脂含有排水に移植し、培地に含まれる脂質の減少度を確認した。比較例として、培養液無添加の系を実施した。経時的にサンプリングした液に対し、実施例５記載の分析を行った。その結果を表１２に示す。各菌株の培養液を添加した系では無添加に比べ、有意に培地中の脂質を分解していた。
(Example 7)
Oil decomposition test in actual liquid:
AKL-1, AKL-5, AKL-6, AKL-7, AKB-1, AKB-2, AKB-3, and AKB-4 were used in a medium having the composition shown in Table 6 for use in the oil degradation test. And cultured with shaking at 25 ° C. and 180 rpm for 70 hours to obtain a culture solution. The obtained culture broth was transplanted to fat-containing wastewater collected from a wastewater treatment facility of a food processing plant so as to be diluted 100 times, and the degree of reduction of lipids contained in the medium was confirmed. As a comparative example, a system without addition of a culture solution was performed. The analysis described in Example 5 was performed on the liquid sampled over time. The results are shown in Table 12. In the system to which the culture solution of each strain was added, lipids in the medium were significantly degraded as compared with the case where no strain was added.
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