JP2018064518A

JP2018064518A - Method of detecting catalase-producing microorganisms

Info

Publication number: JP2018064518A
Application number: JP2016206113A
Authority: JP
Inventors: 稔中川; Minoru Nakagawa
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 2016-10-20
Filing date: 2016-10-20
Publication date: 2018-04-26

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method of simply and quickly detecting catalase-producing microorganisms mixed in a sample.SOLUTION: The method of detecting catalase-producing microorganisms in a sample comprises: a step of putting a solution containing a sample, a fluorescent indicator, and hydrogen peroxide into a container; a step of exposing the fluorescent indicator in the container, following the previous step, to excitation light and measuring the change in intensity of fluorescent light emitted from the fluorescent indicator; and a step of determining whether a catalase-producing microorganism is present in the sample on the basis of the change in intensity of the measured fluorescent light.SELECTED DRAWING: Figure 1

Description

本発明はカタラーゼを産生する微生物の検出方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting a microorganism that produces catalase.

一般的に食品の製造においては微生物汚染が発生しないよう、その製造工程、製造環境、原料などの衛生状態が管理されている。食品工場では、このように食品の安全性が保持される取組みが徹底されているが、一般に安全性は高ければ高いほど好ましいため、さらに安全性の高い食品の製造と流通とが求められている。 In general, in the production of food, hygiene conditions such as the production process, production environment, and raw materials are controlled so that microbial contamination does not occur. In food factories, efforts to maintain the safety of food are thoroughly implemented in this way, but in general, the higher the safety, the better, so there is a demand for the production and distribution of food with higher safety. .

食品の安全性を高い精度で確認する方法として微生物検査がある。その検査方法として寒天培地を用いた混和法、塗抹法、液体培地を用いた方法等が一般的に行われている。しかし、これらの方法は所定の温度で数日間培養する必要があり、検査方法の迅速化が希求されている。 Microbiological testing is a method for confirming food safety with high accuracy. As an inspection method, a mixing method using an agar medium, a smearing method, a method using a liquid medium, and the like are generally performed. However, these methods need to be cultured for several days at a predetermined temperature, and there is a demand for rapid testing methods.

このような背景のもと、微生物検査の迅速化を目的として、自動生菌数測定装置（テンポ）、ＡＴＰ法等多くの微生物検出法が開発されている。例えば、特許文献１には微生物の産生するカタラーゼを利用した生乳中の微生物の迅速測定法が開示されている。 Against this background, many microorganism detection methods such as an automatic viable cell count device (tempo) and ATP method have been developed for the purpose of speeding up the microorganism test. For example, Patent Document 1 discloses a method for rapidly measuring microorganisms in raw milk using catalase produced by microorganisms.

特開平５−１５３９６号公報JP-A-5-15396

これらの従来の手法は装置や試薬が高価であるという問題点があった。また、操作が煩雑で熟練を要する場合もあるという問題点があった。そこで本発明者は、微生物の検出には操作が簡便で熟練を要しない、簡易な方法が必要であるという観点に着目し、一定菌数以上のものを簡易迅速に検出することを課題とし、鋭意検討を重ねた。 These conventional methods have a problem that the apparatus and the reagent are expensive. Further, there is a problem that the operation is complicated and may require skill. Therefore, the present inventor focused on the viewpoint that a simple method is necessary for detecting microorganisms, which is simple and does not require skill. We studied earnestly.

その結果、発明者は、検出対象となる微生物の多くがカタラーゼを産生することに着目し、当該カタラーゼによる酵素反応を蛍光消失時間の変化に基づいて簡易に検出できることを見出し、本発明を完成させた。 As a result, the inventor has focused on the fact that many of the microorganisms to be detected produce catalase, found that the enzyme reaction by the catalase can be easily detected based on the change in the fluorescence disappearance time, and completed the present invention. It was.

すなわち、前記課題を解決する本発明は、
被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の検出方法であって、
前記被検試料を含む溶液と、蛍光指示薬と、過酸化水素とを容器に入れる操作からなる工程、
前記工程後の前記容器内の前記蛍光指示薬に励起光を照射して、該蛍光指示薬が発光する蛍光の強度の変化を測定する工程、並びに
前記測定された蛍光の強度の変化に基づき前記被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の有無を決定する工程、を含む方法である。 That is, the present invention for solving the above problems
A method for detecting a microorganism that produces catalase in a test sample,
A process comprising an operation of putting a solution containing the test sample, a fluorescent indicator, and hydrogen peroxide into a container;
Irradiating the fluorescent indicator in the container after the step with excitation light to measure a change in the intensity of the fluorescence emitted by the fluorescent indicator, and the subject based on the change in the measured fluorescence intensity Determining the presence or absence of a microorganism that produces catalase in a sample.

前記蛍光指示薬を容器に入れる操作が蛍光指示薬を容器の内面に塗布する操作であることが好ましい。
前記蛍光の強度の変化が、蛍光の強度の単位時間当たりの消失量であることが好ましい。
前記蛍光の強度の単位時間当たりの消失量が前記被検試料中の溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量に換算されて表わされることが好ましい。
前記蛍光指示薬が遷移金属錯体、金属含有ポルフィリン、および希土類金属錯体からなる群から選択されるいずれかであることが好ましい。前記励起光が４３０〜５３０ｎｍの励起光であることが好ましい。 The operation of putting the fluorescent indicator in the container is preferably an operation of applying the fluorescent indicator to the inner surface of the container.
The change in fluorescence intensity is preferably the amount of disappearance of fluorescence intensity per unit time.
It is preferable that the disappearance amount per unit time of the fluorescence intensity is represented by being converted into an increase amount per unit time of the dissolved oxygen concentration in the test sample.
It is preferable that the fluorescent indicator is any one selected from the group consisting of transition metal complexes, metal-containing porphyrins, and rare earth metal complexes. The excitation light is preferably excitation light of 430 to 530 nm.

本発明のカタラーゼを産生する微生物の検出方法によれば、被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の有無を迅速に検出することができる。また、操作において熟練を必要とせず、定性的な検出結果を簡易に得ることができる。 According to the method for detecting a microorganism producing catalase of the present invention, the presence or absence of a microorganism producing catalase in a test sample can be rapidly detected. Further, it is possible to easily obtain a qualitative detection result without requiring skill in operation.

本発明の微生物の検出方法の一実施形態の原理を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the principle of one Embodiment of the detection method of the microorganisms of this invention. 本発明の微生物の検出方法の他の実施形態の原理を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the principle of other embodiment of the detection method of the microorganisms of this invention. 本発明の微生物の検出方法の他の実施形態の図である。It is a figure of other embodiment of the detection method of the microorganisms of this invention. 本発明の微生物の検出方法のさらに他の実施形態の原理を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the principle of other embodiment of the detection method of the microorganisms of this invention. 試験例１の結果を示す図である。It is a figure which shows the result of Test Example 1.

本発明は被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の検出方法であって、
前記被検試料を含む溶液と、蛍光指示薬と、過酸化水素とを容器に入れる操作からなる工程、
前記工程後の前記容器内の前記蛍光指示薬に励起光を照射して、該蛍光指示薬が発光する蛍光の強度の変化を測定する工程、並びに
前記測定された蛍光の強度の変化、とくに好ましくは蛍光の強度の単位時間当たりの消失量に基づき前記被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の有無を決定する工程、を含む方法である。これら３つの工程以外の工程を含んでいてもよい。 The present invention is a method for detecting a microorganism producing catalase in a test sample,
A process comprising an operation of putting a solution containing the test sample, a fluorescent indicator, and hydrogen peroxide into a container;
The step of irradiating the fluorescent indicator in the container after the step with excitation light to measure the change in the intensity of the fluorescence emitted by the fluorescent indicator, and the change in the intensity of the measured fluorescence, particularly preferably the fluorescence Determining the presence or absence of microorganisms that produce catalase in the test sample based on the disappearance amount per unit time of the intensity of. Steps other than these three steps may be included.

１．検出原理
本発明に係る微生物の検出方法は蛍光消失時間の原理と微生物由来のカタラーゼ反応とを用いる方法である。励起光を照射された蛍光分子の近傍に酸素分子が存在すると、発光した蛍光のエネルギーが酸素分子に移り蛍光強度が消失する現象（クエンチング現象）がみられる。本発明ではこの蛍光の強度の変化、例えば蛍光の強度の消失量に基づき、被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の有無を決定する。
カタラーゼとは過酸化水素を分解し、酸素と水とを発生する反応を触媒する酵素である。カタラーゼ反応とはカタラーゼが触媒することにより、過酸化水素が分解されて酸素と水とが生成する反応である。 1. Detection Principle The method for detecting a microorganism according to the present invention uses the principle of fluorescence disappearance time and a catalase reaction derived from a microorganism. When oxygen molecules are present in the vicinity of the fluorescent molecules irradiated with the excitation light, a phenomenon (quenching phenomenon) is observed in which the energy of the emitted fluorescence is transferred to the oxygen molecules and the fluorescence intensity disappears. In the present invention, the presence or absence of a microorganism producing catalase in the test sample is determined based on this change in fluorescence intensity, for example, the amount of disappearance of fluorescence intensity.
Catalase is an enzyme that catalyzes a reaction that decomposes hydrogen peroxide to generate oxygen and water. The catalase reaction is a reaction in which hydrogen peroxide is decomposed to generate oxygen and water by catalase catalyzing.

被検試料がカタラーゼを産生する微生物を含む場合、例えば、被検試料を含む溶液と、蛍光指示薬と、過酸化水素とを容器に入れる操作を行う。
過酸化水素と微生物の産生するカタラーゼとが接触することでカタラーゼ反応が起こり、被検試料中に酸素が発生する。
過酸化水素添加後の容器内の蛍光指示薬に励起光を照射して、該蛍光指示薬が発光する蛍光の強度の変化を測定する。
カタラーゼ反応により発生した酸素の存在により、蛍光の強度が消失する。
測定された蛍光の強度の変化、例えば単位時間当たりの消失量に基づき前記被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の有無を決定する。 When the test sample contains a microorganism that produces catalase, for example, an operation of putting a solution containing the test sample, a fluorescent indicator, and hydrogen peroxide into a container is performed.
Catalase reaction occurs when hydrogen peroxide comes into contact with catalase produced by microorganisms, and oxygen is generated in the test sample.
The fluorescent indicator in the container after addition of hydrogen peroxide is irradiated with excitation light, and the change in the intensity of fluorescence emitted by the fluorescent indicator is measured.
The fluorescence intensity disappears due to the presence of oxygen generated by the catalase reaction.
The presence or absence of microorganisms that produce catalase in the test sample is determined based on the measured change in the intensity of fluorescence, for example, the amount of disappearance per unit time.

２．被検試料
被検試料は液状又は流動状である。液状の被検試料は、食品、医薬品、水等であるがこれらに限定されるものではない。液状の食品は例えば牛乳、加工乳、乳飲料、果汁飲料、コーヒー飲料、豆乳、茶飲料、清涼飲料、及びスポーツ飲料等である。流動状の被検試料は、食品、医薬品等であるがこれらに限定されるものではない。流動状の食品は例えばクリーム、バターオイル等である。固形の食品、医薬品、水、包装材料等を粉砕、溶解、融解したものを滅菌水等で希釈し、液状又は流動状にした試料を被検試料として用いることができる。固形の食品は例えばバター、プロセスチーズ、チョコレート等である。 2. Test sample The test sample is liquid or fluid. The liquid test sample is food, medicine, water or the like, but is not limited thereto. Examples of the liquid food include milk, processed milk, milk drink, fruit juice drink, coffee drink, soy milk, tea drink, soft drink, and sports drink. The fluid test sample is food, medicine or the like, but is not limited thereto. Examples of fluid foods are cream and butter oil. A sample obtained by pulverizing, dissolving, and melting solid food, medicine, water, packaging material, etc. with sterilized water or the like, and making it liquid or fluid can be used as a test sample. Solid foods are, for example, butter, processed cheese, chocolate and the like.

被検試料には検査の対象となる液状の被検試料及び流動状の被検試料以外のものを含んでいてもよい。例えば、被検試料に滅菌水を添加して希釈したものを被検試料として用いることができる。被検試料としては最終製品、及び製造途中の段階の製品のいずれも用いることができる。被検試料中に存在する微生物が低濃度であるものは、微生物が増殖するような温度条件で保存したものを被検試料として用いることができる。被検試料の温度は測定する場所の気温と同等にすることが好ましい。 The test sample may include a liquid test sample to be inspected and a fluid test sample. For example, a test sample diluted with sterilized water can be used as the test sample. As the test sample, either a final product or a product in the middle of production can be used. If the microorganisms present in the test sample have a low concentration, those stored under temperature conditions that allow the microorganisms to grow can be used as the test sample. The temperature of the test sample is preferably equal to the temperature of the place to be measured.

被検試料の量は好ましくは１ｍｌ〜１００ｍｌの範囲であり、より好ましくは１ｍｌ〜１０ｍｌであり、さらに好ましくは１ｍｌ〜２ｍｌの範囲である。この被検試料の範囲であると被検試料と過酸化水素とが混ざりやすく、カタラーゼ反応により発生した酸素が良好に蛍光指示薬に接触するスケールであるため好ましい。 The amount of the test sample is preferably in the range of 1 ml to 100 ml, more preferably in the range of 1 ml to 10 ml, and still more preferably in the range of 1 ml to 2 ml. The range of the test sample is preferable because the test sample and hydrogen peroxide are easily mixed, and the oxygen generated by the catalase reaction is in good contact with the fluorescent indicator.

３．カタラーゼを産生する微生物
本発明で検出することができる微生物は、カタラーゼを産生する微生物である。
カタラーゼを産生する微生物には、ブドウ球菌科、バシラス科、モラクセラ科、エアロモナス科、アルカリゲネス科、腸内細菌科、ナイセリア科、ビブリオ科、シュードモナス科、シェワネラ科、ブレビバクテリウム科、コリネバクテリウム科、デイノコッカス科、リステリア科、マイクロコッカス科、プロピオニバクテリウム科等に属する微生物がある。 3. Microorganism that produces catalase The microorganism that can be detected in the present invention is a microorganism that produces catalase.
Catalase-producing microorganisms include staphylococci, bacillus, molaxella, aeromonas, alkaligenes, enterobacteriaceae, neisseria, vibrio, pseudomonas, chewanella, brevibacterium, corynebacteria There are microorganisms belonging to Deinococcidae, Listeriaceae, Micrococcidae, Propionibacterium, etc.

ブドウ球菌科に属する微生物としてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属がある。バシラス科に属する微生物としてＢａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｏｃｈｏｔｈｒｉｘ属がある。モラクセラ科に属する微生物としてＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ属がある。エアロモナスア科に属する微生物としてＡｅｒｏｍｏｎａｓ属がある。アルカリゲネス科に属する微生物としてＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属がある。腸内細菌科に属する微生物としてＣｅｄｅｃｅａ属、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｐａｎｔｏｅａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属がある。ナイセリア科に属する微生物としてＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属がある。ビブリオ科に属する微生物としてＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｖｉｂｒｉｏ属がある。シュードモナス科に属する微生物としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属がある。シェワネラ科に属する微生物としてＳｈｅｗａｎｅｌｌａ属がある。ブレビバクテリウム科に属する微生物としてＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属がある。コリネバクテリウム科に属する微生物としてＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属がある。デイノコッカス科に属する微生物としてＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属がある。リステリア科に属する微生物としてＬｉｓｔｅｒｉａ属がある。マイクロコッカス科に属する微生物としてＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属がある。プロピオニバクテリウム科に属する微生物としてＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属がある。 As a microorganism belonging to the staphylococci family, there is a genus Staphylococcus. Examples of microorganisms belonging to the family Bacillus include the genus Bacillus and the genus Brochothrix. As microorganisms belonging to the Moraxella family, there are Acinetobacter genus, Moraxella genus, and Psycrobacter genus. There is a genus Aeromonas as a microorganism belonging to the Aeromonasaceae family. There exists Alcaligenes genus as microorganisms which belong to Alkaligenes. The microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae include the genus Cedecea, the genus Citrobacter, the genus Enterobacter, the genus Erwinia, the genus Escherichia, the genus Hafnia, the genus Klebsiella, the genus Morganella, the genus Sera, the proteus, the proteus, is there. As a microorganism belonging to the Neisseriaceae family, there is a genus Chromobacterium. Examples of microorganisms belonging to the Vibrio family include the genus Photobacterium and the genus Vibrio. There is a genus Pseudomonas as a microorganism belonging to the family Pseudomonas. There is a genus Shewanella as a microorganism belonging to the family Shewanella. As a microorganism belonging to the Brevibacterium family, there is a genus Brevibacterium. As a microorganism belonging to the Corynebacterium family, there is a genus Corynebacterium. There is a genus Deinococcus as a microorganism belonging to the family Deinococcus. Listeria are microorganisms belonging to the Listeriaceae family. There is a genus Micrococcus as a microorganism belonging to the family Micrococcus. As a microorganism belonging to the family Propionibacterium, there is a genus Propionibacterium.

ブドウ球菌科、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物として例えば黄色ブドウ球菌がある。バシラス科、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物として例えばセレウス菌がある。腸内細菌科、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物として例えば大腸菌がある。
また、グラム陰性菌であるＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、グラム陽性菌であるＫｕｒｔｈｉａ属の細菌類を検出することが可能である。 Examples of microorganisms belonging to the genus Staphylococcus and Staphylococcus include Staphylococcus aureus. Examples of microorganisms belonging to the family Bacillus and the genus Bacillus include Bacillus cereus. Examples of microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae and the genus Escherichia include Escherichia coli.
It is also possible to detect bacteria belonging to the genus Flavobacterium, the genus Halobacterium, and the Kurthia genus that are gram-positive bacteria.

４．蛍光指示薬
蛍光指示薬は励起光を照射されることにより励起されて蛍光を発光し、蛍光指示薬の近傍に存在する酸素により消光現象（クエンチング現象）がみられるものであれば特に種類は限定なく用いることができる。蛍光指示薬として遷移金属錯体、金属含有ポルフィリン、希土類金属錯体等を用いることができる。
遷移金属錯体としては例えばルテニウム錯体、オスミウム錯体、イリジウム錯体等を用いることができる。
金属含有ポルフィリンとしては例えば白金オクタエチルポルフィリンを用いることができる。
希土類金属錯体としては例えばユーロビウム錯体を用いることができる。 4). Fluorescent indicator Fluorescent indicator is excited by irradiation with excitation light, emits fluorescence, and is not particularly limited as long as it has a quenching phenomenon (quenching phenomenon) due to oxygen present in the vicinity of the fluorescent indicator. be able to. As the fluorescent indicator, a transition metal complex, a metal-containing porphyrin, a rare earth metal complex, or the like can be used.
As the transition metal complex, for example, a ruthenium complex, an osmium complex, an iridium complex, or the like can be used.
As the metal-containing porphyrin, for example, platinum octaethylporphyrin can be used.
As the rare earth metal complex, for example, a eurobium complex can be used.

本発明において蛍光指示薬を容器に入れるためには様々な態様をとることができる。
蛍光指示薬と被検試料とが接触し、励起光の照射と発光する蛍光の測定が良好に行える態様であれば蛍光指示薬を容器に入れる態様は特に限定されない。例えば、被検試料を容器に入れた後に蛍光指示薬を被検試料に添加することができる。
被検試料を容器に入れる前に蛍光指示薬を容器に入れ、さらに被検試料を添加することができる。
蛍光指示薬と被検試料とを同時に容器に入れることができる。
予め蛍光指示薬を被検試料に添加したものを容器に入れてもよい。
予め蛍光指示薬を過酸化水素に添加したものを、容器に入れられた被検試料に添加してもよい。
図１は容器に蛍光指示薬と被検試料とを添加する場合の一例である。 In the present invention, various modes can be taken to put a fluorescent indicator in a container.
The mode in which the fluorescent indicator is placed in the container is not particularly limited as long as the fluorescent indicator and the test sample are in contact with each other and the irradiation of the excitation light and the measurement of the emitted fluorescence can be satisfactorily performed. For example, the fluorescent indicator can be added to the test sample after the test sample is placed in the container.
Before putting the test sample into the container, the fluorescent indicator can be put into the container, and further the test sample can be added.
The fluorescent indicator and the test sample can be placed in the container at the same time.
What added the fluorescent indicator to the test sample previously may be put in a container.
A fluorescent indicator previously added to hydrogen peroxide may be added to a test sample placed in a container.
FIG. 1 shows an example in which a fluorescent indicator and a test sample are added to a container.

しかしながら本発明においては、蛍光指示薬を容器に入れる操作は蛍光指示薬を容器の内面に塗布する操作である場合が好ましい。蛍光指示薬の塗布される部位は、容器の内面（側面又は底面）であり、被検試料と接触し、励起光の照射と蛍光の測定を行うことができる部位であれば特に場所は限定されない。
蛍光指示薬が容器の内面に塗布（固着）される固着の形状、厚さは励起光の照射と蛍光の検出を行うことができる状態であれば特に限定されない。蛍光指示薬を一カ所に塗布してもよいし、複数カ所に塗布してもよい。容器内面の一面に塗布することも可能である。例えば蛍光指示薬を容器の底面の中心に、直径２ｍｍの円状に、０．５ｍｍの厚さで塗布することが可能である。 However, in the present invention, the operation of putting the fluorescent indicator in the container is preferably an operation of applying the fluorescent indicator to the inner surface of the container. The site to which the fluorescent indicator is applied is the inner surface (side surface or bottom surface) of the container, and the location is not particularly limited as long as it is in contact with the test sample and can perform excitation light irradiation and fluorescence measurement.
There is no particular limitation on the shape and thickness of the sticking, in which the fluorescent indicator is applied (fixed) to the inner surface of the container, as long as it can irradiate excitation light and detect fluorescence. The fluorescent indicator may be applied at one place or at multiple places. It is also possible to apply to one side of the inner surface of the container. For example, the fluorescent indicator can be applied in the shape of a circle having a diameter of 2 mm and a thickness of 0.5 mm at the center of the bottom surface of the container.

蛍光指示薬を容器の内面に塗布するためにバインダーを用いることができる。バインダーは励起光と蛍光を吸収・反射せず、製膜性がよく、酸素の透過性が良い性質のものを用いることができる。バインダーは例えばポリジメチルシロキサン、シリコンゴム、ポリスチレン等を用いることができる。 A binder can be used to apply the fluorescent indicator to the inner surface of the container. A binder that does not absorb / reflect excitation light and fluorescence, has good film-forming properties, and good oxygen permeability can be used. As the binder, for example, polydimethylsiloxane, silicon rubber, polystyrene or the like can be used.

このように蛍光指示薬が容器の内面に予め塗布されている場合、被検試料とは別途蛍光指示薬を容器に入れる操作を省略することができるため手順が簡便になり、好ましい。いずれの態様であっても蛍光指示薬の量は測定するために必要な蛍光を発することができる量であれば特に限定されない。 Thus, when the fluorescent indicator is previously applied to the inner surface of the container, an operation for putting the fluorescent indicator into the container separately from the test sample can be omitted, which is preferable because the procedure becomes simple. In any embodiment, the amount of the fluorescent indicator is not particularly limited as long as it is an amount capable of emitting the fluorescence necessary for measurement.

蛍光指示薬を容器に入れる操作を行わない場合、さらに他の態様をとることができる。例えば、蛍光指示薬は蛍光測定器に塗布されてもよい。蛍光指示薬が蛍光測定器に塗布される場合は、蛍光指示薬の塗布される部位は被検試料と接触し、励起光の照射と蛍光の検出を行うことができる部位であれば特に場所は限定されない。図４は蛍光指示薬が蛍光測定器に塗布された場合の一例である。 When the operation of putting the fluorescent indicator into the container is not performed, another aspect can be taken. For example, the fluorescent indicator may be applied to a fluorometer. When the fluorescent indicator is applied to the fluorescence measuring device, the location is not particularly limited as long as the portion to which the fluorescent indicator is applied is in contact with the test sample and can irradiate excitation light and detect fluorescence. . FIG. 4 shows an example in which a fluorescent indicator is applied to a fluorescence measuring device.

また、蛍光指示薬を容器に入れる操作を行わない場合、蛍光指示薬が他の基材に塗布されたものを予め容器に入れておくかまたは後から被検試料に沈めてもよい。
蛍光指示薬が他の基材に塗布されたものを予め容器に入れておくかまたは後から被検試料に沈める場合は、他の基材として励起光と蛍光を吸収、反射せず、透明な材質のものを用いることができる。例えば他の基材はポリプロピレン製、石英製等である。
他の基材は容器に入れることができる大きさ、形状であり、被検試料と接触することが可能な態様であれば特に限定されない。例えば、石英製の５ｍｍ×５ｍｍ×１ｍｍのプレートを用いることが可能である。 When the operation of putting the fluorescent indicator in the container is not performed, the fluorescent indicator applied to another substrate may be put in the container in advance or may be submerged in the test sample later.
If the fluorescent indicator is applied to another substrate, put it in a container in advance, or if it will be submerged in the test sample later, it will not absorb and reflect the excitation light and fluorescence as a transparent material. Can be used. For example, the other base material is made of polypropylene, quartz or the like.
The other base material has a size and shape that can be placed in a container, and is not particularly limited as long as it is an aspect capable of coming into contact with a test sample. For example, it is possible to use a 5 mm × 5 mm × 1 mm plate made of quartz.

５．容器
容器は励起光と蛍光を吸収・反射しない透明な材質のものを用いることができる。容器は、例えばポリプロピレン製、石英製の容器を用いることができる。容器の底面の形状は平面、円柱型、円錐型、四角錐型などのものを用いることができる。容器の容積は被検試料と蛍光指示薬とが入る容積であれば特に限定されない。容器は１個単独のものを用いてもよいし、複数の容器が連結されたものを用いることも可能である。
蛍光指示薬が塗布された容器である場合には、上述の「４．蛍光指示薬」のとおり、蛍光指示薬が容器の内面に予め塗布されている。具体的には、蛍光指示薬が塗布された容器としてセンサーディッシュ（ＰｒｅＳｅｎｓ社製、形名：ＯＤ２４−１０）を用いることができる。 5. Container The container can be made of a transparent material that does not absorb and reflect excitation light and fluorescence. As the container, for example, a polypropylene container or a quartz container can be used. As the shape of the bottom surface of the container, a flat shape, a cylindrical shape, a conical shape, a quadrangular pyramid shape, or the like can be used. The volume of the container is not particularly limited as long as it contains the test sample and the fluorescent indicator. A single container may be used, or a container in which a plurality of containers are connected may be used.
In the case of a container to which a fluorescent indicator is applied, the fluorescent indicator is previously applied to the inner surface of the container as described in “4. Fluorescent indicator” above. Specifically, a sensor dish (manufactured by PreSens, model name: OD24-10) can be used as a container to which a fluorescent indicator is applied.

６．過酸化水素
本発明において過酸化水素を容器に入れるためには様々な態様をとることができる。過酸化水素が被検試料に接触し、良好にカタラーゼ反応が起こるような態様であれば特に限定されない。例えば、容器に過酸化水素を入れ、次いで被検試料と蛍光指示薬とを過酸化水素に添加してもよいし、容器に過酸化水素と蛍光指示薬とを含む被検試料を同時に添加してもよい。予め過酸化水素を被検試料に添加したものを容器に入れて、さらに蛍光指示薬を添加してもよい。 6). Hydrogen peroxide In this invention, in order to put hydrogen peroxide in a container, various aspects can be taken. There is no particular limitation as long as it is an embodiment in which hydrogen peroxide is brought into contact with the test sample and the catalase reaction occurs satisfactorily. For example, hydrogen peroxide may be put into a container, and then a test sample and a fluorescent indicator may be added to hydrogen peroxide, or a test sample containing hydrogen peroxide and a fluorescent indicator may be added to the container at the same time. Good. A sample obtained by adding hydrogen peroxide to the test sample in advance may be put in a container, and a fluorescent indicator may be further added.

しかしながら本発明では蛍光指示薬を容器に入れるとともに容器に被検試料を含む溶液を入れ、次いで過酸化水素を添加する態様が、カタラーゼ反応の開始直後に蛍光強度を測定することができるため好ましい。 However, in the present invention, an embodiment in which a fluorescent indicator is placed in a container, a solution containing a test sample is placed in the container, and then hydrogen peroxide is added is preferable because the fluorescence intensity can be measured immediately after the start of the catalase reaction.

いずれの態様であっても過酸化水素としては過酸化水素水を用いることができる。過酸化水素水の濃度は好ましくは０．３質量％〜３．０質量％の範囲であり、より好ましくは０．３質量％〜１．０質量％の範囲である。この濃度の範囲内であれば、カタラーゼを産生する微生物にカタラーゼ反応を十分に起こさせることができ、過酸化水素の自己分解が起こらないため好ましい。 In any embodiment, hydrogen peroxide water can be used as hydrogen peroxide. The concentration of the hydrogen peroxide solution is preferably in the range of 0.3% by mass to 3.0% by mass, and more preferably in the range of 0.3% by mass to 1.0% by mass. Within this concentration range, a catalase-producing microorganism can sufficiently cause a catalase reaction, and hydrogen peroxide self-degradation does not occur, which is preferable.

過酸化水素水の添加量は好ましくは被検試料に対して５体積％〜５０体積％の範囲であり、より好ましくは１０体積％〜２０体積％の範囲である。この添加量の範囲内であると、カタラーゼを産生する微生物にカタラーゼ反応を十分に起こさせることができ、過酸化水素の自己分解が起こらないため好ましい。 The amount of hydrogen peroxide added is preferably in the range of 5% to 50% by volume, more preferably in the range of 10% to 20% by volume with respect to the test sample. Within this range of addition amount, a catalase-producing microorganism can be caused to cause a catalase reaction sufficiently and hydrogen peroxide self-degradation does not occur, which is preferable.

７．励起光
被検試料を含む溶液と、蛍光指示薬と、過酸化水素とを容器に入れる操作からなる工程後の容器内の蛍光指示薬に励起光を照射する。
励起光は蛍光指示薬を励起するために必要なエネルギーを持つ波長領域のものであれば特に限定されない。
例えば蛍光指示薬として遷移金属錯体を用いる場合は４３０ｎｍ〜５３０ｎｍの波長領域の励起光を用いることができる。
蛍光指示薬として金属含有ポルフィリンを用いる場合は４６０ｎｍ〜６００ｎｍの波長領域の励起光を用いることができる。
蛍光指示薬として希土類金属錯体を用いる場合は２００ｎｍ〜４００ｎｍの波長領域の励起光を用いることができる。 7). Excitation light Excitation light is irradiated to the fluorescent indicator in the container after the process comprising the operation of putting the solution containing the test sample, the fluorescent indicator, and hydrogen peroxide into the container.
The excitation light is not particularly limited as long as it has a wavelength region having energy necessary for exciting the fluorescent indicator.
For example, when a transition metal complex is used as a fluorescent indicator, excitation light in a wavelength region of 430 nm to 530 nm can be used.
When metal-containing porphyrin is used as the fluorescent indicator, excitation light in the wavelength region of 460 nm to 600 nm can be used.
When a rare earth metal complex is used as the fluorescent indicator, excitation light in a wavelength region of 200 nm to 400 nm can be used.

８．蛍光の強度の変化の測定と微生物の有無の決定
本発明では、被検試料を含む溶液と、蛍光指示薬と、過酸化水素とを容器に入れる操作からなる工程後の容器内の蛍光指示薬に励起光を照射して、蛍光指示薬が発光する蛍光の強度の変化、蛍光が完全に消失するまでの時間、位相のずれを測定する。中でも蛍光の強度の変化の測定が解り易く好適である。
本発明では、被検試料を含む溶液と、蛍光指示薬と、過酸化水素とを容器に入れる操作からなる工程後の容器内の蛍光指示薬に励起光を照射して、蛍光指示薬が発光する蛍光の強度の変化を測定する。励起光は１回のみ、複数回、連続的、断続的に照射することができる。蛍光の強度は１回のみ、複数回、連続的、断続的に測定することができる。 8). Measurement of change in fluorescence intensity and determination of the presence or absence of microorganisms In the present invention, excitation is performed on a fluorescent indicator in a container after a process consisting of an operation of putting a solution containing a test sample, a fluorescent indicator, and hydrogen peroxide into the container. By irradiating light, a change in intensity of fluorescence emitted from the fluorescent indicator, a time until the fluorescence disappears completely, and a phase shift are measured. Among them, the measurement of the change in fluorescence intensity is easy to understand and is suitable.
In the present invention, the fluorescence indicator emits light by irradiating the fluorescent indicator in the container after the process consisting of the operation of putting the solution containing the test sample, the fluorescent indicator, and hydrogen peroxide into the container. Measure the change in intensity. Excitation light can be irradiated only once, multiple times, continuously or intermittently. The intensity of fluorescence can be measured only once, multiple times, continuously or intermittently.

さらに、測定された蛍光の強度の変化に基づき被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の有無を決定する。蛍光の強度の変化は、例えば蛍光の強度の大小の比較であっても良いし、蛍光の強度が事前に設定した閾値を超えるか否かであってもよい。また蛍光の強度の時間変化の積分をとる、蛍光の強度のある時点での微分係数を求める等であってもよい。
しかしながら本発明においては、蛍光の強度の変化としては、蛍光の強度の単位時間当たりの消失量を採用することが好ましい。
蛍光の強度の単位時間当たりの消失量を採用する場合には、蛍光の強度の変化の測定は蛍光の強度の単位時間あたりの消失量が得られる測定方法であれば特に限定されない。
単位時間は１マイクロ秒、１秒、１分等適宜設定することができる。例えば測定開始時点を基準とした場合に、発光した蛍光強度が一定以下に減少したときにアラーム音が鳴るように設定し、被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の存在を検出することができる。ここで「測定開始」の時点は、励起光を一回照射する場合又は励起光を一回継続して照射する場合は「励起光照射開始した時点」であると定義する。励起光を複数回照射する場合又は励起光を断続的に照射する場合は、「測定開始」の時点は「初回の励起光照射開始した時点」であると定義する。
蛍光の強度の変化として蛍光の強度の単位時間当たりの消失量を採用した場合測定が簡易で解り易いため好ましい。 Further, the presence or absence of a microorganism producing catalase in the test sample is determined based on the change in the measured fluorescence intensity. The change in fluorescence intensity may be, for example, a comparison of the magnitudes of fluorescence, or may be whether or not the fluorescence intensity exceeds a preset threshold value. Further, it is possible to integrate the time change of the fluorescence intensity, to obtain a differential coefficient at a certain point in time of the fluorescence intensity, or the like.
However, in the present invention, as the change in fluorescence intensity, it is preferable to employ the disappearance amount of fluorescence intensity per unit time.
When the amount of disappearance of fluorescence intensity per unit time is employed, the measurement of the change in fluorescence intensity is not particularly limited as long as it is a measurement method that can obtain the amount of disappearance of fluorescence intensity per unit time.
The unit time can be appropriately set such as 1 microsecond, 1 second, 1 minute, and the like. For example, when the measurement start time is used as a reference, it is possible to detect the presence of a microorganism producing catalase in a test sample by setting an alarm sound when the emitted fluorescence intensity decreases below a certain level. . Here, the “measurement start” time point is defined as “excitation light irradiation start time” when the excitation light is irradiated once or when the excitation light is continuously irradiated once. When the excitation light is irradiated a plurality of times or when the excitation light is irradiated intermittently, the time point of “measurement start” is defined as “the time point when the first excitation light irradiation starts”.
When the amount of disappearance of fluorescence intensity per unit time is adopted as the change in fluorescence intensity, it is preferable because measurement is simple and easy to understand.

また、蛍光の強度とカタラーゼを産生する微生物の菌数との関係を表す検量線を作成することもできる。この場合、本発明の手法を被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の定量方法に転用することが可能である。 It is also possible to create a calibration curve that represents the relationship between the intensity of fluorescence and the number of microorganisms that produce catalase. In this case, the technique of the present invention can be applied to a method for quantifying a microorganism that produces catalase in a test sample.

９．測定値の換算
測定された蛍光の強度の変化、蛍光が完全に消失するまでの時間、蛍光の位相のずれは他の物理量に換算されることが可能である。他の物理量とは被検試料中のｐＨ、ある波長における吸光度、濁度、溶存酸素濃度等であるがこれに限定されるものではない。
蛍光指示薬の発光する蛍光が完全に消失するまでの時間を測定した場合は、蛍光が完全に消失するまでの時間と溶存酸素濃度との関係の検量線を作成することが好ましい。この検量線を用いて、蛍光が完全に消失するまでの時間が一定以下である場合に、陽性であると決定することができる。 9. Conversion of measured values Changes in the intensity of the measured fluorescence, the time until the fluorescence completely disappears, and the phase shift of the fluorescence can be converted into other physical quantities. Other physical quantities include pH in the test sample, absorbance at a certain wavelength, turbidity, dissolved oxygen concentration, etc., but are not limited thereto.
When the time until the fluorescence emitted from the fluorescent indicator completely disappears is measured, it is preferable to create a calibration curve of the relationship between the time until the fluorescence completely disappears and the dissolved oxygen concentration. Using this calibration curve, when the time until the fluorescence completely disappears is below a certain level, it can be determined to be positive.

蛍光指示薬の発光する蛍光と基準となる蛍光との位相のずれを測定した場合は、蛍光の位相のずれと溶存酸素濃度との関係の検量線を作成することが好ましい。この検量線を用いて、蛍光の位相のずれが一定以上である場合に、陽性であると決定することができる。 When the phase shift between the fluorescence emitted by the fluorescent indicator and the reference fluorescence is measured, it is preferable to create a calibration curve of the relationship between the fluorescence phase shift and the dissolved oxygen concentration. Using this calibration curve, it can be determined to be positive when the phase shift of the fluorescence is above a certain level.

なかでも測定された蛍光の強度を被検試料中の溶存酸素濃度に換算して表わすことが解り易く好適である。蛍光の強度と被検試料中の溶存酸素濃度との関係の検量線を作成することが好ましい。
この検量線を用いて蛍光の強度の単位時間当たりの消失量が被検試料中の溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量に換算されて表わされる。溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量に基づき被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の有無を決定することが可能である。 In particular, it is easy to understand and express the measured fluorescence intensity in terms of the dissolved oxygen concentration in the test sample. It is preferable to create a calibration curve of the relationship between the intensity of fluorescence and the dissolved oxygen concentration in the test sample.
Using this calibration curve, the disappearance amount per unit time of the fluorescence intensity is converted into an increase amount per unit time of the dissolved oxygen concentration in the test sample. Based on the amount of increase in dissolved oxygen concentration per unit time, it is possible to determine the presence or absence of a microorganism that produces catalase in the test sample.

具体的には蛍光の強度と溶存酸素濃度との関係のキャリブレーションデータが内蔵された溶存酸素計、すなわち、蛍光消失時間式の原理を用いた溶存酸素計を用いて検出を決定することができる。具体的には、センサーディッシュリーダー（ＰｒｅＳｅｎｓ社製、形名：ＳＤＲ）が、評価手段としてのパーソナルコンピュータに接続されている。この評価手段としてのパーソナルコンピュータのソフトウェアにキャリブレーションデータが入力されている。
該評価手段によって、蛍光の強度の単位時間当たりの消失量が、被検試料の溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量に換算されて表わされる。このような蛍光消失時間式の原理を用いた溶存酸素計を用いると解り易く好適である。 Specifically, detection can be determined using a dissolved oxygen meter with built-in calibration data of the relationship between fluorescence intensity and dissolved oxygen concentration, that is, a dissolved oxygen meter using the principle of the fluorescence disappearance time formula. . Specifically, a sensor dish reader (PreSens, model name: SDR) is connected to a personal computer as an evaluation means. Calibration data is input to the software of the personal computer as the evaluation means.
By the evaluation means, the disappearance amount per unit time of the fluorescence intensity is converted into an increase amount per unit time of the dissolved oxygen concentration of the test sample. It is easy to understand and use a dissolved oxygen meter using the principle of the fluorescence disappearance time type.

蛍光の強度を被検試料中の溶存酸素濃度に換算して表わした場合、後述の試験例１に示すように、励起光照射開始直後に溶存酸素濃度が増加し始める。そのため、励起光照射開始直後、すなわち測定開始直後の一定時間の溶存酸素濃度の増加量に基づいて被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の有無を決定することができる。
例えば、後述の試験例１で示すように、測定時期は測定開始直後０分〜１５分間が好ましく、測定開始直後０分〜４分間がより好ましく、測定開始直後０分〜１分間がさらに好ましい。測定開始直後０分〜１分間の測定を行うと、わずか１分間で微生物の有無を決定することができるため好ましい。 When the intensity of fluorescence is expressed in terms of the dissolved oxygen concentration in the test sample, as shown in Test Example 1 described later, the dissolved oxygen concentration starts to increase immediately after the start of excitation light irradiation. Therefore, the presence or absence of microorganisms that produce catalase in the test sample can be determined based on the amount of increase in dissolved oxygen concentration for a certain period of time immediately after the start of excitation light irradiation, that is, immediately after the start of measurement.
For example, as shown in Test Example 1 described later, the measurement time is preferably 0 minutes to 15 minutes immediately after the start of measurement, more preferably 0 minutes to 4 minutes immediately after the start of measurement, and even more preferably 0 minutes to 1 minute immediately after the start of measurement. It is preferable to perform measurement for 0 minute to 1 minute immediately after the start of measurement because the presence or absence of microorganisms can be determined in just 1 minute.

蛍光の強度を被検試料中の溶存酸素濃度に換算して表わした場合、後述の試験例１に示すように、例えば、カタラーゼを産生する微生物の有無を決定するための溶存酸素濃度の閾値は、測定開始直後０分〜１分間の溶存酸素濃度増加量が０．０８ｐｐｍ／ｍｉｎ以上である場合において微生物の有無を決定することができる。
さらに測定開始直後０分〜１分間の溶存酸素濃度増加量が０．１ｐｐｍ／ｍｉｎ以上である場合において微生物の有無を決定することができる。
さらに測定開始直後０分〜１分間の溶存酸素濃度増加量が０．１２ｐｐｍ／ｍｉｎ以上である場合において微生物の有無を決定することができる。ここで「ｐｐｍ」とは被検試料の体積に対する被検試料中の溶存酸素の体積の百万分率を意味する。 When the fluorescence intensity is expressed in terms of the dissolved oxygen concentration in the test sample, as shown in Test Example 1 described later, for example, the threshold value of the dissolved oxygen concentration for determining the presence or absence of a microorganism that produces catalase is The presence or absence of microorganisms can be determined when the amount of increase in dissolved oxygen concentration from 0 minutes to 1 minute immediately after the start of measurement is 0.08 ppm / min or more.
Furthermore, the presence or absence of microorganisms can be determined when the amount of increase in dissolved oxygen concentration from 0 to 1 minute immediately after the start of measurement is 0.1 ppm / min or more.
Furthermore, the presence or absence of microorganisms can be determined when the amount of increase in dissolved oxygen concentration from 0 minutes to 1 minute immediately after the start of measurement is 0.12 ppm / min or more. Here, “ppm” means a percentage of the volume of dissolved oxygen in the test sample with respect to the volume of the test sample.

この溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量がこの閾値を超える場合、カタラーゼを産生する微生物が陽性であると決定することができる。溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量がこの閾値未満である場合、カタラーゼを産生する微生物が陰性であると決定することができる。
これらの溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量はカタラーゼを産生する微生物の種類によって異なるため、対象となる微生物の種類によって閾値となる溶存酸素濃度増加量を設定することができる。 When the amount of increase in dissolved oxygen concentration per unit time exceeds this threshold, it can be determined that the catalase-producing microorganism is positive. If the amount of increase in dissolved oxygen concentration per unit time is less than this threshold, it can be determined that the microorganism producing catalase is negative.
Since the amount of increase in dissolved oxygen concentration per unit time varies depending on the type of microorganism producing catalase, the amount of increase in dissolved oxygen concentration that serves as a threshold can be set depending on the type of target microorganism.

図１は本発明の微生物の検出方法の一実施形態の原理を示す模式図である。
透明の容器１の内面には蛍光指示薬２が塗布されていない。容器１には蛍光指示薬２と被検試料３とが添加されている。
この蛍光指示薬２を含む被検試料３に過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を添加し、被検試料３中のカタラーゼ産生微生物のカタラーゼ反応により発生した酸素を検出する。
光源４から蛍光指示薬２を含む被検試料３に励起光６が照射され、蛍光指示薬２が発する蛍光７を検出手段５によって検出する。
検出手段５からの出力信号が評価手段８に入力され、評価される。
評価手段８には蛍光７の強度と溶存酸素濃度との関係を表すキャリブレーションデータが予め入力されている。評価手段８にて蛍光７の強度の単位時間当たりの消失量が溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量に換算されて表わされる。 FIG. 1 is a schematic diagram showing the principle of one embodiment of the microorganism detection method of the present invention.
The fluorescent indicator 2 is not applied to the inner surface of the transparent container 1. A fluorescent indicator 2 and a test sample 3 are added to the container 1.
Hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) is added to the test sample 3 containing the fluorescent indicator 2, and oxygen generated by the catalase reaction of the catalase-producing microorganism in the test sample 3 is detected.
Excitation light 6 is irradiated from the light source 4 to the test sample 3 including the fluorescent indicator 2, and the fluorescence 7 emitted from the fluorescent indicator 2 is detected by the detection means 5.
An output signal from the detection means 5 is input to the evaluation means 8 and evaluated.
Calibration data representing the relationship between the intensity of the fluorescence 7 and the dissolved oxygen concentration is input to the evaluation means 8 in advance. In the evaluation means 8, the disappearance amount per unit time of the intensity of the fluorescence 7 is converted into an increase amount per unit time of the dissolved oxygen concentration.

図２は本発明の微生物の検出方法の他の実施形態の原理を示す模式図である。
蛍光指示薬２が底面の内面に塗布された透明の容器１には被検試料３が添加されている。
この被検試料３に過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を添加し、被検試料３中のカタラーゼ産生微生物のカタラーゼ反応により発生した酸素を検出する。
光源４から蛍光指示薬２に励起光６が照射され、蛍光指示薬２が発する蛍光７を検出手段５によって検出する。
検出手段５からの出力信号が評価手段８に入力され、評価される。
評価手段８には蛍光７の強度と溶存酸素濃度との関係を表すキャリブレーションデータが予め入力されている。評価手段８にて蛍光７の強度の単位時間当たりの消失量が、溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量に換算されて表わされる。 FIG. 2 is a schematic diagram showing the principle of another embodiment of the microorganism detection method of the present invention.
A test sample 3 is added to a transparent container 1 in which a fluorescent indicator 2 is applied to the inner surface of the bottom surface.
Hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) is added to the test sample 3, and oxygen generated by the catalase reaction of the catalase-producing microorganism in the test sample 3 is detected.
The fluorescent indicator 2 is irradiated with the excitation light 6 from the light source 4, and the fluorescence 7 emitted from the fluorescent indicator 2 is detected by the detection means 5.
An output signal from the detection means 5 is input to the evaluation means 8 and evaluated.
Calibration data representing the relationship between the intensity of the fluorescence 7 and the dissolved oxygen concentration is input to the evaluation means 8 in advance. In the evaluation means 8, the disappearance amount per unit time of the intensity of the fluorescence 7 is converted into an increase amount per unit time of the dissolved oxygen concentration.

図３は本発明の微生物の検出方法の他の実施形態の図である。
本実施形態では、蛍光指示薬２が内面に塗布された透明の容器１が複数個（計２４個）連結されたものを使用する。容器１の底面の内面にはそれぞれ蛍光指示薬２が塗布されている。
この容器１それぞれに被検試料３を入れ、この被検試料３にそれぞれ過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を添加する。
被検試料３中の微生物のカタラーゼ反応により発生した酸素を検出する。
光源４と検出手段５が一体型となった機器を使用する。
光源４から蛍光指示薬２に励起光が照射され、蛍光指示薬２から発光する蛍光を検出手段５によって検出する。
検出手段５からの出力信号が評価手段８に入力され、評価される。
評価手段８には蛍光の強度と溶存酸素濃度との関係を表すキャリブレーションデータが予め入力されている。評価手段８にて蛍光の強度の単位時間当たりの消失量が被検試料中の溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量に換算されて表わされる。 FIG. 3 is a diagram of another embodiment of the microorganism detection method of the present invention.
In the present embodiment, a plurality of (in total, 24) transparent containers 1 each having a fluorescent indicator 2 applied on the inner surface thereof are used. A fluorescent indicator 2 is applied to the inner surface of the bottom surface of the container 1.
A test sample 3 is placed in each container 1, and hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) is added to the test sample 3.
Oxygen generated by the catalase reaction of microorganisms in the test sample 3 is detected.
A device in which the light source 4 and the detection means 5 are integrated is used.
The fluorescent indicator 2 is irradiated with excitation light from the light source 4, and the fluorescence emitted from the fluorescent indicator 2 is detected by the detection means 5.
An output signal from the detection means 5 is input to the evaluation means 8 and evaluated.
Calibration data representing the relationship between fluorescence intensity and dissolved oxygen concentration is input to the evaluation means 8 in advance. In the evaluation means 8, the disappearance amount per unit time of the fluorescence intensity is converted into an increase amount per unit time of the dissolved oxygen concentration in the test sample.

図４は本発明の微生物の検出方法のさらに他の実施形態の原理を示す模式図である。
透明の容器１の内面には蛍光指示薬２が塗布されていない。
蛍光測定器としてプローブ型酸素計９を用いる。
プローブ型酸素計９の先端には、蛍光指示薬２、光源４、検出手段５が配置されており、プローブ型酸素計９の先端部位で、カタラーゼ反応によって発生した酸素を検出することが可能である。
容器１には被検試料３が添加されている。被検試料３に過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を添加し、被検試料３中のカタラーゼ産生微生物のカタラーゼ反応により発生した酸素を、蛍光指示薬２が先端に配置されたプローブ型溶存酸素計９を用いて検出する。
検出手段５からの出力信号が評価手段８に入力され、評価される。
評価手段８には蛍光の強度と溶存酸素濃度との関係を表すキャリブレーションデータが予め入力されている。評価手段８にて蛍光の強度の単位時間当たりの消失量が、溶存酸素濃度の単位時間当たりの増加量に換算されて表わされる。 FIG. 4 is a schematic view showing the principle of still another embodiment of the microorganism detection method of the present invention.
The fluorescent indicator 2 is not applied to the inner surface of the transparent container 1.
A probe oximeter 9 is used as a fluorescence measuring instrument.
The fluorescent indicator 2, the light source 4, and the detection means 5 are disposed at the tip of the probe oximeter 9. The oxygen generated by the catalase reaction can be detected at the tip of the probe oximeter 9. .
A test sample 3 is added to the container 1. Hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) is added to the test sample 3, and oxygen generated by the catalase reaction of the catalase-producing microorganism in the test sample 3 is converted into a probe-type dissolved oxygen meter in which the fluorescent indicator 2 is arranged at the tip. 9 to detect.
An output signal from the detection means 5 is input to the evaluation means 8 and evaluated.
Calibration data representing the relationship between fluorescence intensity and dissolved oxygen concentration is input to the evaluation means 8 in advance. The amount of disappearance per unit time of the fluorescence intensity is converted into an increase amount per unit time of the dissolved oxygen concentration by the evaluation means 8 and expressed.

以下に実施例を用いて本発明をさらに詳しく説明する。本発明はこれら実施例に限定されるものではない。特に断わりのない限り、「％」は「質量％」を意味する。
本明細書の検出の決定時期、時間、閾値の例については後述の試験例１に示す。
また、以下の実施例、試験例において「陽性である」とは、被検試料中にカタラーゼを産生する微生物を１０^４ＣＦＵ／ｍｌ以上含むことを意味する。「陰性である」とは、被検試料中のカタラーゼを産生する微生物が１０^４ＣＦＵ／ｍｌ未満であることを意味する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The present invention is not limited to these examples. Unless otherwise specified, “%” means “mass%”.
Examples of the determination timing, time, and threshold of detection in this specification are shown in Test Example 1 described later.
In the following examples and test examples, “positive” means that 10 ⁴ CFU / ml or more of a microorganism producing catalase is contained in the test sample. “Negative” means that the microorganism producing catalase in the test sample is less than 10 ⁴ CFU / ml.

＜試験例１＞
（目的）
試験例１では、本発明に係る方法の好ましい蛍光の測定時期及び測定時間を検討した。また、「陽性である」と検出するための溶存酸素濃度の閾値を検討した。 <Test Example 1>
(the purpose)
In Test Example 1, a preferred fluorescence measurement time and measurement time of the method according to the present invention were examined. Moreover, the threshold value of the dissolved oxygen concentration for detecting "positive" was examined.

（試料の調製）
プロセスチーズ（エムケーチーズ社製）１０ｇに滅菌水９０ｍｌを加えてよく粉砕混合したものを被検試料とした。この被検試料にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｕｏｓａを菌数が１０^５ＣＦＵ／ｍｌ以上となるように接種して半量を試料１とし、残りの半量を比較対照としての比較試料１とした。試料１は続く試験方法にて過酸化水素水が添加される試料であり、比較試料１は続く試験方法にて過酸化水素水が添加されない試料である。 (Sample preparation)
A test sample was prepared by adding 90 ml of sterilized water to 10 g of process cheese (manufactured by MK Cheese) and pulverizing and mixing it well. This test sample was inoculated with Pseudomonas aerugiuosa so that the number of bacteria was 10 ⁵ CFU / ml or more, and half of the sample was used as sample 1, and the remaining half was used as comparative sample 1 as a comparative control. Sample 1 is a sample to which hydrogen peroxide solution is added in the subsequent test method, and comparative sample 1 is a sample to which hydrogen peroxide solution is not added in the subsequent test method.

（試験方法）
試料１及び比較試料１中に含まれる微生物の数は食品衛生検査指針（微生物編）の低温細菌の測定方法により決定した。ＣＶＴ寒天培地を用いて、混和法又は塗抹法を行い、２５℃で４８時間培養した。培養後、寒天培地に生じたコロニー数をもとに菌数を算定した。
蛍光指示薬が内面に塗布された容器としてセンサーディッシュ（ＰｒｅＳｅｎｓ社製、形名：ＯＤ２４−１０）に試料１を１ｍｌ添加し、室温（２５℃）に１５分間静置した。次いで試料１に０．３質量％の過酸化水素水を１００μｌ添加した。このセンサーディッシュは蛍光指示薬が内面に塗布された容器を２４個有していた。 (Test method)
The number of microorganisms contained in Sample 1 and Comparative Sample 1 was determined by the method for measuring low-temperature bacteria in the Food Sanitation Inspection Guidelines (Microorganisms). CVT agar medium was used for mixing or smearing and culturing at 25 ° C. for 48 hours. After cultivation, the number of bacteria was calculated based on the number of colonies generated on the agar medium.
1 ml of sample 1 was added to a sensor dish (manufactured by PreSens, model name: OD24-10) as a container in which a fluorescent indicator was applied to the inner surface, and left at room temperature (25 ° C.) for 15 minutes. Next, 100 μl of 0.3% by mass of hydrogen peroxide water was added to Sample 1. This sensor dish had 24 containers in which a fluorescent indicator was applied on the inner surface.

次に光源と検出手段が一体型となったセンサーディッシュリーダー（ＰｒｅＳｅｎｓ社製、型名：ＳＤＲ）を用いて蛍光指示薬に励起光（波長４６５ｎｍ）を照射して発光する蛍光の強度を測定する操作を１５秒間隔で１５分間行った。 Next, an operation for measuring the intensity of the emitted fluorescence by irradiating the fluorescent indicator with excitation light (wavelength 465 nm) using a sensor dish reader (PreSens, model name: SDR) in which the light source and the detection means are integrated. For 15 minutes at 15 second intervals.

評価手段であるＰＣに蛍光の強度と被検試料中の溶存酸素濃度との関係を表すキャリブレーションデータを予めソフトウェアに入力した。このキャリブレーションデータを用いて発光した蛍光の強度を被検試料中の溶存酸素濃度に換算して表わした。
比較試料１について過酸化水素水を添加しない以外は、試料１と同じ実験操作を行った。 Calibration data representing the relationship between the fluorescence intensity and the dissolved oxygen concentration in the test sample was input to the software in advance in the PC as the evaluation means. Using the calibration data, the intensity of the emitted fluorescence was expressed in terms of the dissolved oxygen concentration in the test sample.
For Comparative Sample 1, the same experimental operation as Sample 1 was performed except that no hydrogen peroxide solution was added.

（結果）
試験結果を図５に示す。試料１および比較試料１の溶存酸素濃度の値を表１に示す。試料１および比較試料１の単位時間あたりの溶存酸素濃度の増加量を表２に示す。また、試料１および比較試料１ともに含まれる細菌数は１．１×１０^６ＣＦＵ／ｍｌであった。 (result)
The test results are shown in FIG. Table 1 shows the dissolved oxygen concentration values of Sample 1 and Comparative Sample 1. Table 2 shows the amount of increase in dissolved oxygen concentration per unit time for Sample 1 and Comparative Sample 1. The number of bacteria contained in both sample 1 and comparative sample 1 was 1.1 × 10 ⁶ CFU / ml.

（評価）
・測定時期について
図５は、試料１および比較試料１の溶存酸素濃度（ｐｐｍ）の変化を示している。図５及び表１の結果より、過酸化水素水を添加した試料１では、測定開始時点（０分）での溶存酸素濃度は１１．８７ｐｐｍであった。測定開始後、徐々に被検試料中の溶存酸素濃度は上昇し、４分経過時点で１２．５５ｐｐｍであった。その後も溶存酸素濃度は増加し続け、１５分経過後では溶存酸素濃度は１５．１８ｐｐｍであった。 (Evaluation)
・ About measurement time
FIG. 5 shows changes in dissolved oxygen concentration (ppm) of Sample 1 and Comparative Sample 1. From the results shown in FIG. 5 and Table 1, in Sample 1 to which hydrogen peroxide solution was added, the dissolved oxygen concentration at the measurement start time (0 minute) was 11.87 ppm. After the start of measurement, the dissolved oxygen concentration in the test sample gradually increased, and was 12.55 ppm after 4 minutes. Thereafter, the dissolved oxygen concentration continued to increase, and after 15 minutes, the dissolved oxygen concentration was 15.18 ppm.

これに対して、過酸化水素水を添加しない比較試料１では、測定開始時点（０分）での溶存酸素濃度は１２．０３ｐｐｍであった。測定開始後、ほとんど被検試料中の溶存酸素濃度は上昇せず、４分経過時点で１２．０６ｐｐｍであった。１５分経過後では被検試料中の溶存酸素濃度は１２．１３ｐｐｍであった。 On the other hand, in the comparative sample 1 to which no hydrogen peroxide solution was added, the dissolved oxygen concentration at the measurement start time (0 minute) was 12.03 ppm. After the start of measurement, the dissolved oxygen concentration in the test sample hardly increased, and was 12.06 ppm after 4 minutes. After 15 minutes, the dissolved oxygen concentration in the test sample was 12.13 ppm.

これらの結果より、過酸化水素水を添加した試料１、すなわちカタラーゼ反応が生じた被検試料では、励起光を照射開始し、測定開始した直後に溶存酸素濃度が上昇することがわかる。
一方、過酸化水素水を添加しない比較試料１、すなわちカタラーゼ反応が生じない被検試料では、励起光を照射開始し、測定開始した後ほとんど溶存酸素濃度が上昇しないことがわかる。
よって、本発明の蛍光の測定時期は測定開始直後０分〜１５分間の範囲が好ましく、測定開始直後０分〜４分間がより好ましく、測定開始直後０分〜１分間がさらに好ましい。 From these results, it can be seen that Sample 1 to which hydrogen peroxide solution was added, that is, the test sample in which the catalase reaction occurred, started to irradiate the excitation light, and the dissolved oxygen concentration increased immediately after the measurement was started.
On the other hand, it can be seen that in the comparative sample 1 to which no hydrogen peroxide solution is added, that is, the test sample in which the catalase reaction does not occur, the dissolved oxygen concentration hardly increases after starting the irradiation of excitation light and starting the measurement.
Therefore, the measurement time of fluorescence of the present invention is preferably in the range of 0 minutes to 15 minutes immediately after the start of measurement, more preferably 0 minutes to 4 minutes immediately after the start of measurement, and even more preferably 0 minutes to 1 minute immediately after the start of measurement.

・測定時間
表２は単位時間あたりの溶存酸素濃度増加量である。過酸化水素水を添加した試料１では、測定開始後０〜１分で溶存酸素濃度の増加量が０．１２ｐｐｍ／ｍｉｎであった。その後測定終了まで溶存酸素濃度の増加量は０．１２ｐｐｍ／ｍｉｎを下回ることはなかった。
これに対して過酸化水素水を添加しない比較試料１では、測定開始後０〜１分で溶存酸素濃度の増加量が０．０３ｐｐｍ／ｍｉｎであった。その後測定終了まで溶存酸素濃度の増加量は０．０３ｐｐｍ／ｍｉｎを下回った。 Measurement time Table 2 shows the amount of increase in dissolved oxygen concentration per unit time. In Sample 1 to which hydrogen peroxide water was added, the increase in dissolved oxygen concentration was 0.12 ppm / min in 0 to 1 minute after the start of measurement. Thereafter, the increase in the dissolved oxygen concentration did not fall below 0.12 ppm / min until the end of the measurement.
On the other hand, in Comparative Sample 1 in which no hydrogen peroxide solution was added, the amount of increase in dissolved oxygen concentration was 0.03 ppm / min 0 to 1 minute after the start of measurement. Thereafter, the increase in dissolved oxygen concentration was less than 0.03 ppm / min until the end of the measurement.

これらの結果より、過酸化水素水を添加した被検試料、すなわちカタラーゼ反応が生じた被検試料では、測定開始直後０分〜１５分間にて明らかに溶存酸素濃度が増加し続けていることがわかる。測定時間は測定開始直後０分〜４分間がより好ましく、測定開始直後０分〜１分間がさらに好ましい。測定開始直後０分〜１分間の測定を行うと、わずか１分間で微生物の有無を決定することができるため好ましい。 From these results, it can be seen that the dissolved oxygen concentration continues to increase clearly in 0 to 15 minutes immediately after the start of the measurement in the test sample to which hydrogen peroxide solution was added, that is, the test sample in which the catalase reaction occurred. Recognize. The measurement time is more preferably 0 minute to 4 minutes immediately after the start of measurement, and further preferably 0 minute to 1 minute immediately after the start of measurement. It is preferable to perform measurement for 0 minute to 1 minute immediately after the start of measurement because the presence or absence of microorganisms can be determined in just 1 minute.

・溶存酸素濃度の閾値
表２及び上記「測定時間」で記載したとおり、試料１では溶存酸素濃度の増加量が０．１２ｐｐｍ／ｍｉｎを下回ることはなかった。また比較試料１では、測定開始後０〜１分で溶存酸素濃度の増加量が０．０３ｐｐｍ／ｍｉｎであり、測定終了までこの溶存酸素濃度の増加量は０．０３ｐｐｍ／ｍｉｎを下回った。
そのため「測定開始直後０分〜１分間の溶存酸素濃度増加量が０．０８ｐｐｍ／ｍｉｎ以上である」ときにカタラーゼを産生する微生物の検出を「陽性である」と決定することができる。
「測定開始直後０分〜１分間の溶存酸素濃度増加量が０．１ｐｐｍ／ｍｉｎ以上である」ときにカタラーゼを産生する微生物の検出を「陽性である」と決定することができる。
「測定開始直後０分〜１分間の溶存酸素濃度増加量が０．１２ｐｐｍ／ｍｉｎ以上である」ときにカタラーゼを産生する微生物の検出を「陽性である」と決定することができる。・ Threshold of dissolved oxygen concentration
As described in Table 2 and “Measurement time” above, in Sample 1, the increase in dissolved oxygen concentration did not fall below 0.12 ppm / min. In Comparative Sample 1, the increase in dissolved oxygen concentration was 0.03 ppm / min in 0 to 1 minute after the start of measurement, and this increase in dissolved oxygen concentration was less than 0.03 ppm / min until the end of measurement.
Therefore, detection of a microorganism that produces catalase can be determined to be “positive” when “the amount of increase in dissolved oxygen concentration from 0 minute to 1 minute immediately after the start of measurement is 0.08 ppm / min or more”.
The detection of a microorganism producing catalase can be determined to be “positive” when “the amount of increase in dissolved oxygen concentration from 0 minute to 1 minute immediately after the start of measurement is 0.1 ppm / min or more”.
The detection of a microorganism that produces catalase can be determined to be “positive” when the amount of increase in dissolved oxygen concentration from 0 minutes to 1 minute immediately after the start of measurement is 0.12 ppm / min or more.

これらの溶存酸素濃度の増加量はカタラーゼを産生する微生物の種類によって異なるため、対象となる微生物の種類によって閾値となる溶存酸素濃度増加量を定めることができる。
また、「測定開始直後の０分〜１分間の溶存酸素濃度増加量が０．１２ｐｐｍ／ｍｉｎ未満である」ときにカタラーゼを産生する微生物の検出を「陰性である」と決定することができる。
「測定開始直後の０分〜１分間あたりの溶存酸素濃度増加量が０．１ｐｐｍ／ｍｉｎ未満である」ときにカタラーゼを産生する微生物の検出を「陰性である」と決定することができる。
「測定開始直後の０分〜１分間あたりの溶存酸素濃度増加量が０．０８ｐｐｍ／ｍｉｎ未満である」ときにカタラーゼを産生する微生物の検出を「陰性である」と決定することができる。 Since the amount of increase in these dissolved oxygen concentrations differs depending on the type of microorganism producing catalase, the amount of increase in dissolved oxygen concentration serving as a threshold can be determined depending on the type of target microorganism.
In addition, it is possible to determine that the detection of a microorganism that produces catalase is “negative” when “the amount of increase in dissolved oxygen concentration from 0 minute to 1 minute immediately after the start of measurement is less than 0.12 ppm / min”.
Detection of a microorganism producing catalase can be determined to be “negative” when “the increase in dissolved oxygen concentration per minute from 0 minute to 1 minute immediately after the start of measurement is less than 0.1 ppm / min”.
Detection of a microorganism producing catalase can be determined to be “negative” when “the increase in dissolved oxygen concentration per minute from 0 minute to 1 minute immediately after the start of measurement is less than 0.08 ppm / min”.

＜試験例２＞
（目的）
試験例２は、本発明で検出することができる菌の種類を確認するために行った。 <Test Example 2>
(the purpose)
Test Example 2 was conducted in order to confirm the types of bacteria that can be detected in the present invention.

（試料の調製）
（ａ）試料２
牛乳（森永乳業社製）２０ｍｌにカタラーゼを産生する微生物としてＦｌａｖｉｍｏｎａｓｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓを１０個程度接種し、菌数が１０^５ＣＦＵ／ｍｌ程度となるように培養し、試料２とした。
（ｂ）試料３
カタラーゼを産生する微生物として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａを用いた以外は試料２と同じ操作を行い、試料３とした。
（ｃ）試料４
カタラーゼを産生する微生物として、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａを用いた以外は、試料２と同じ操作を行い、試料４とした。
（ｄ）試料５
カタラーゼを産生する微生物として、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｌｗｏｆｆｉを用いた以外は、試料２と同じ操作を行い、試料５とした。 (Sample preparation)
(A) Sample 2
About 10 Flavimonas oryzibavitans were inoculated into 20 ml of milk (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) as a microorganism producing catalase, and cultured so that the number of bacteria became about 10 ⁵ CFU / ml.
(B) Sample 3
A sample 3 was prepared by performing the same operation as in the sample 2 except that Pseudomonas putida was used as a catalase-producing microorganism.
(C) Sample 4
A sample 4 was prepared by performing the same operation as in the sample 2 except that Stenotrophomonas maltophilia was used as a microorganism producing catalase.
(D) Sample 5
Sample 5 was prepared in the same manner as Sample 2, except that Acinetobacter lwoffi was used as the catalase-producing microorganism.

（ｅ）試料６
カタラーゼを産生する微生物として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａを用いた以外は、試料２と同じ操作を行い、試料６とした。
（ｆ）試料７
カタラーゼを産生する微生物として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓを用いた以外は、試料２と同じ実験操作を行い、試料７とした。
（ｇ）試料８
カタラーゼを産生する微生物として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｉｎｄｉｇｏｆｅｒａを用いた以外は、試料２と同じ操作を行い、試料８とした。
（ｈ）試料９
カタラーゼを産生する微生物を接種しない以外は、試料２と同じ操作を行い、試料９とした。
（ｉ）試料１０
カタラーゼを産生する微生物を接種せず、カタラーゼを産生しない微生物として、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓを接種した以外は、試料２と同じ実験操作を行い、試料１０とした。 (E) Sample 6
A sample 6 was prepared in the same manner as in the sample 2 except that Pseudomonas aeruginosa was used as a catalase-producing microorganism.
(F) Sample 7
Sample 7 was obtained by performing the same experimental operation as Sample 2 except that Pseudomonas fluorescens was used as a microorganism producing catalase.
(G) Sample 8
Sample 8 was obtained by performing the same operation as Sample 2 except that Pseudomonas indigofera was used as a microorganism producing catalase.
(H) Sample 9
A sample 9 was prepared in the same manner as in the sample 2 except that the microorganism producing catalase was not inoculated.
(I) Sample 10
Sample 10 was obtained by performing the same experimental operation as Sample 2, except that the microorganism producing catalase was not inoculated and Lactobacillus acidophilus was inoculated as a microorganism not producing catalase.

（試験方法）
試料２〜１０を用いて上記試験例１と同じ実験操作を行った。 (Test method)
The same experimental operation as in Test Example 1 was performed using Samples 2 to 10.

（結果）
結果を表３に示す。 (result)
The results are shown in Table 3.

表３において溶存酸素の増加量とは、測定開始直後の４分間の溶存酸素濃度変化から算出した値である。
表３から明かなように、試料２〜８に示すカタラーゼを産生する微生物が被検試料中に１０^４〜１０^６ＣＦＵ／ｍｌ程度含まれている場合、溶存酸素濃度の増加量が０．１３ｐｐｍ／ｍｉｎ以上であり「陽性」であると検出が可能であった。 In Table 3, the increased amount of dissolved oxygen is a value calculated from the dissolved oxygen concentration change for 4 minutes immediately after the start of measurement.
As is clear from Table 3, when the test sample contains about 10 ⁴ to 10 ⁶ CFU / ml of the microorganism producing catalase shown in samples 2 to 8, the amount of increase in dissolved oxygen concentration is 0.13 ppm. / Min or more, and detection was possible when it was “positive”.

試料９に示すように、カタラーゼを産生する微生物を含まない被検試料では、測定開始後にほとんど溶存酸素濃度が増加せず、「陰性」であった。
試料１０に示すように、カタラーゼを産生する微生物を含まず、カタラーゼを産生しない微生物を１．５×１０^５ＣＦＵ／ｍｌ程度含む被検試料では、測定開始後にほとんど溶存酸素濃度が増加せず、「陰性」であった。
このように、表３に示す７種類のカタラーゼを産生する微生物の検出が可能であることが示された。カタラーゼを産生する微生物であれば良好に検出できることが示唆された。 As shown in Sample 9, in the test sample that did not contain catalase-producing microorganisms, the dissolved oxygen concentration hardly increased after the start of measurement, and was “negative”.
As shown in Sample 10, in the test sample that does not contain catalase-producing microorganisms and contains about 1.5 × 10 ⁵ CFU / ml of microorganisms that do not produce catalase, the dissolved oxygen concentration hardly increases after the start of measurement, “Negative”.
Thus, it was shown that the microorganisms producing seven types of catalase shown in Table 3 can be detected. It was suggested that any microorganism producing catalase can be detected well.

以上のように、本発明によればごく短時間でカタラーゼを産生する微生物の検出することが可能であることが示された。また操作が簡便で熟練を要さず、定性的な結果を簡易に得ることができた。
表３に記載された７種類の細菌は冷蔵域（１０℃以下程度）で増殖可能である低温細菌に該当するものである。
牛乳に混入した低温細菌を検出するには、従来の方法では培養法により検出するのが一般的であるが、この方法には通常２〜３日間必要であった。本発明では、従来の方法と比較してごく短時間で簡易に食品中のカタラーゼを産生する微生物を検出することが可能であった。 As described above, according to the present invention, it has been shown that it is possible to detect a microorganism that produces catalase in a very short time. In addition, the operation was simple, no skill was required, and qualitative results could be easily obtained.
The seven types of bacteria listed in Table 3 correspond to psychrophilic bacteria that can grow in a refrigerated area (about 10 ° C. or less).
In order to detect psychrophilic bacteria mixed in milk, the conventional method generally detects by culturing method, but this method usually requires 2-3 days. In the present invention, it was possible to detect microorganisms producing catalase in foods in a very short time and easily compared with the conventional method.

＜実施例１＞
実施例１では本発明の検出方法により被検試料中のカタラーゼを産生する微生物の検出を行った。
牛乳（森永乳業社製）２０ｍｌにカタラーゼを産生する微生物としてＦｌａｖｉｍｏｎaｓｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓを１０個程度接種し、菌数が１０^５ＣＦＵ／ｍｌ程度となるように培養し、被検試料とした。
この被検試料を、蛍光指示薬が内面に塗布された容器としてセンサーディッシュ（ＰｒｅＳｅｎｓ社製、形名：ＯＤ２４−１０）に１ｍｌ添加し、室温（２５℃）に１５分間静置した。次いで被検試料に０．３質量％の過酸化水素水を１００μｌ添加した。このセンサーディッシュは蛍光指示薬が内面に塗布された容器を２４個有していた。 <Example 1>
In Example 1, a microorganism producing catalase in a test sample was detected by the detection method of the present invention.
About 10 Flavimonas oryzibitans were inoculated into 20 ml of milk (manufactured by Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) as a microorganism producing catalase, and cultured so that the number of bacteria became about 10 ⁵ CFU / ml, and used as a test sample.
1 ml of this test sample was added to a sensor dish (manufactured by PreSens, model name: OD24-10) as a container coated with a fluorescent indicator on the inner surface, and allowed to stand at room temperature (25 ° C.) for 15 minutes. Next, 100 μl of 0.3 mass% hydrogen peroxide solution was added to the test sample. This sensor dish had 24 containers in which a fluorescent indicator was applied on the inner surface.

次に光源と検出手段が一体型となったセンサーディッシュリーダー（ＰｒｅＳｅｎｓ社製、型名：ＳＤＲ）を用いて蛍光指示薬に励起光（波長４６５ｎｍ）を照射して発光する蛍光の強度を測定する操作を１５秒間隔で１５分間行った。センサーディッシュリーダーは評価手段であるＰＣに接続されていた。
評価手段であるＰＣに蛍光の強度と被検試料中の溶存酸素濃度との関係を表すキャリブレーションデータを予めソフトウェアに入力した。このキャリブレーションデータを用いて発光した蛍光の強度を被検試料中の溶存酸素濃度に換算して表した。
測定開始直後の４分間の被検試料中の単位時間あたりの溶存酸素濃度増加量が０．２３ｐｐｍ／ｍｉｎであったため、カタラーゼを産生する微生物の検出を「陽性である」と決定した。 Next, an operation for measuring the intensity of the emitted fluorescence by irradiating the fluorescent indicator with excitation light (wavelength 465 nm) using a sensor dish reader (PreSens, model name: SDR) in which the light source and the detection means are integrated. For 15 minutes at 15 second intervals. The sensor dish reader was connected to a PC as an evaluation means.
Calibration data representing the relationship between the fluorescence intensity and the dissolved oxygen concentration in the test sample was input to the software in advance in the PC as the evaluation means. Using the calibration data, the intensity of the emitted fluorescence was converted into the dissolved oxygen concentration in the test sample.
Since the amount of increase in dissolved oxygen concentration per unit time in the test sample for 4 minutes immediately after the start of measurement was 0.23 ppm / min, the detection of the microorganism producing catalase was determined to be “positive”.

＜実施例２＞
チーズ１０ｇに滅菌水９０ｍｌを加えてよく粉砕混合したものを被検試料とした以外は実施例１と同じ実験操作を行い、実施例２とした。測定開始直後１分間の被検試料中の溶存酸素濃度増加量が０．１２ｐｐｍ／ｍｉｎであったためカタラーゼを産生する微生物の検出を「陽性である」と決定した。 <Example 2>
Example 2 was performed in the same manner as in Example 1, except that 90 g of sterilized water was added to 10 g of cheese and pulverized and mixed well. Since the amount of increase in dissolved oxygen concentration in the test sample for 1 minute immediately after the start of measurement was 0.12 ppm / min, the detection of the microorganism producing catalase was determined to be “positive”.

＜比較例１＞
被検試料に過酸化水素を添加しない以外は、実施例１と同じ実験操作を行い、比較例１とした。測定開始直後１分間の溶存酸素濃度増加量が０．０１ｐｐｍ／ｍｉｎであり、その後１５分間ほとんど溶存酸素濃度が増加しなかったためカタラーゼを産生する微生物の検出はできなかった。 <Comparative Example 1>
Except that hydrogen peroxide was not added to the test sample, the same experimental operation as in Example 1 was performed to obtain Comparative Example 1. The amount of increase in dissolved oxygen concentration for 1 minute immediately after the start of measurement was 0.01 ppm / min, and the concentration of dissolved oxygen hardly increased for 15 minutes thereafter, so that microorganisms producing catalase could not be detected.

＜符号の説明＞
１…容器２…蛍光指示薬３…被検試料４…光源５…検出手段６…励起光
７…蛍光８…評価手段９…プローブ型酸素計 <Explanation of symbols>
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Container 2 ... Fluorescent indicator 3 ... Test sample 4 ... Light source 5 ... Detection means 6 ... Excitation light 7 ... Fluorescence 8 ... Evaluation means 9 ... Probe type oximeter

Claims

A method for detecting a microorganism that produces catalase in a test sample,
A process comprising an operation of putting a solution containing the test sample, a fluorescent indicator, and hydrogen peroxide into a container;
Irradiating the fluorescent indicator in the container after the step with excitation light to measure a change in the intensity of the fluorescence emitted by the fluorescent indicator, and the subject based on the change in the measured fluorescence intensity Determining the presence or absence of a microorganism that produces catalase in the sample.

The method according to claim 1, wherein the operation of putting the fluorescent indicator in a container is an operation of applying the fluorescent indicator to the inner surface of the container.

The method according to claim 1 or 2, wherein the change in fluorescence intensity is the amount of disappearance of fluorescence intensity per unit time.

The method according to claim 3, wherein the disappearance amount per unit time of the fluorescence intensity is expressed by being converted into an increase amount per unit time of the dissolved oxygen concentration in the test sample.

The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the fluorescent indicator is any one selected from the group consisting of a transition metal complex, a metal-containing porphyrin, and a rare earth metal complex.

The method according to claim 1, wherein the excitation light is 430 to 530 nm excitation light.