JP2018052990A

JP2018052990A - がん治療のためのｅｇｆｒ−ｓｇｌｔ１相互作用の標的化

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Publication number: JP2018052990A
Application number: JP2018003217A
Authority: JP
Inventors: ウェイフアザン; Zhang Weihua
Original assignee: University of Houston System
Current assignee: University of Houston System
Priority date: 2013-05-08
Filing date: 2018-01-12
Publication date: 2018-04-05
Anticipated expiration: 2034-05-08
Also published as: EP2994155A4; US9334307B2; US20160228495A1; JP6309080B2; CN105358173B; US20140336129A1; WO2014182955A2; EP2994155B1; WO2014182955A3; US9770482B2; JP6706635B2; CN115814056A; CN105358173A; JP2016520066A; EP2994155A2

Abstract

【課題】ＥＧＦＲチロシナーゼインヒビターに抵抗性であるがん細胞を適切に処置することができる方法および組成物を提供すること。【解決手段】化合物は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）とナトリウム／グルコース共輸送体１（ＳＧＬＴ１）の間の結合相互作用を不活性化することができる。一実施形態において、該化合物は、ＥＧＦＲの相互作用ドメインに由来するペプチドである。別の実施形態において、該ペプチドは、がんを処置するために患者に投与される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年５月８日に出願された米国仮出願第６１／８２１，０２８号に基づく優先権を主張し、この出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
政府支援
アメリカがん協会（ＲＳＧ−０９−２０６−０１）
米国国防総省前立腺癌研究プログラム（Ｗ９１ＺＳＱ８３３４Ｎ６０７）

上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は、上皮由来のがんの大部分において過活動であり／過剰発現される受容体チロシンキナーゼである（ＨｙｎｅｓＮＥら、ＥＲＢＢｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｃａｎｃｅｒ：ｔｈｅｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙｏｆｔａｒｇｅｔｅｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＣａｎｃｅｒ、５巻（５号）：３４１〜３５４頁（２００５年））。ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性の阻害は、ＥＧＦＲに基づくがん治療の基本的戦略となっている。しかしながら、受容体チロシンキナーゼの小分子インヒビターによるＥＧＦＲの標的化は、満足のいく治療効果を生じさせていない。一般的な応答率は、様々なヒト悪性腫瘍全体で１０〜２０％である（ＷｅｉｓｓＪ．、ＦｉｒｓｔｌｉｎｅｅｒｌｏｔｉｎｉｂｆｏｒＮＳＣＬＣｐａｔｉｅｎｔｓｎｏｔｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙＥＧＦＲｍｕｔａｔｉｏｎ：ｋｅｅｐｃａｒｒｙｉｎｇｔｈｅＴＯＲＣＨｏｒｔｉｍｅｔｏｌｅｔｔｈｅｆｌａｍｅｄｉｅ？Ｔｒａｎｓｌ．ＬｕｎｇＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、１巻（３号）：２１９〜２２３頁（２０１２年）；ＣｏｈｅｎＳＪら、ＰｈａｓｅＩＩａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒＲ１１５７７７ａｓｉｎｉｔｉａｌｔｈｅｒａｐｙｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｍｅｔａｓｔａｔｉｃｐａｎｃｒｅａｔｉｃａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ、Ｊ．ＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ、２１巻（７号）：１３０１〜１３０６頁（２００３年）；ＤａｎｃｅｙＪＥら、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ−−ａｒｅｗｅｍｉｓｓｉｎｇｔｈｅｍａｒｋ？、Ｌａｎｃｅｔ３６２巻（９３７７号）：６２〜６４頁（２００３年））。換言すると、ＥＧＦＲチロシンキナーゼインヒビターに応答しないがん患者の主要な集団がある。例えば、ＥＧＦＲは、後期前立腺がんの８０％超で過剰発現し、予後と負に相関するが、前立腺がんはＥＧＦＲインヒビターに抵抗性である（ＨｅｒｎｅｓＥ．ら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｆａｍｉｌｙｉｎｐｒｏｓｔａｔｅｃａｒｃｉｎｏｍａｂｅｆｏｒｅａｎｄｄｕｒｉｎｇａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ、ＢｒｉｔｉｓｈＪ．Ｃａｎｃｅｒ、９０巻（２号）：４４９〜４５４頁（２００４年）；ＰｕＹＳら、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＰＤ１６８３９３）ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓｃｙｔｏｔｏｘｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｆｐａｃｌｉｔａｘｅｌａｇａｉｎｓｔａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ、ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、７１巻（６号）：７５１〜７６０頁（２００６年）；ＳｈｅｒｗｏｏｄＥＲら、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄｐｅｐｔｉｄｅｓａｎｄｔｈｅｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｎｏｒｍａｌａｎｄｍａｌｉｇｎａｎｔｐｒｏｓｔａｔｅ、ＷｏｒｌｄＪ．Ｕｒｏｌｏｇｙ、１３巻（５号）：２９０〜２９６頁（１９９５年）；ＺｅｌｌｗｅｇｅｒＴ．ら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｏｆｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｔａｒｇｅｔｓｉｎｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪ．Ｃａｎｃｅｒ、１１３巻（４号）：６１９〜６２８頁（２００５年）；ＣａｎｉｌＣＭら、ＲａｎｄｏｍｉｚｅｄｐｈａｓｅＩＩｓｔｕｄｙｏｆｔｗｏｄｏｓｅｓｏｆｇｅｆｉｔｉｎｉｂｉｎｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ：ａｔｒｉａｌｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣａｎａｄａ−ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓＧｒｏｕｐ、Ｊ．ＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ、２３巻（３号）：４５５〜４６０頁（２００５年）；ＧｒｏｓｓＭら、ＡｐｈａｓｅＩＩｔｒｉａｌｏｆｄｏｃｅｔａｘｅｌａｎｄｅｒｌｏｔｉｎｉｂａｓｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｅｌｄｅｒｌｙｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｓｔａｔｅ
ｃａｎｃｅｒ、ＢＭＣＣａｎｃｅｒ７巻：１４２頁（２００７年））。

証拠は、ＥＧＦＲがチロシンキナーゼ非依存性機能を有することを示す。例えば、ＥＧＦＲノックアウト動物は生後すぐに死亡する（ＴｈｒｅａｄｇｉｌｌＤＷら、ＴａｒｇｅｔｅｄｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅＥＧＦｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｅｆｆｅｃｔｏｆｇｅｎｅｔｉｃｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｏｎｍｕｔａｎｔｐｈｅｎｏｔｙｐｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９巻（５２２１号）：２３０〜２３４頁（１９９５年））。しかしながら、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性が重度に障害されたマウスは、完全に生存可能であり、いくらかの上皮欠損だけを示す（ＬｕｅｔｔｅｋｅＮＣら、Ｔｈｅｍｏｕｓｅｗａｖｅｄ−２ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｒｅｓｕｌｔｓｆｒｏｍａｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＥＧＦｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、８巻（４号）：３９９〜４１３頁（１９９４年））。別の例として、野生型とキナーゼ失活型（ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ）のＥＧＦＲは両方とも、ＥＧＦＲ陰性３２Ｄ造血細胞の生存を高めた（ＥｗａｌｄＪＡら、Ｌｉｇａｎｄ− ａｎｄｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｓｕｒｖｉｖａｌｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｔｈｅｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎ３２Ｄｃｅｌｌｓ、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ２８２巻（２号）：１２１〜１３１頁（２００３年））。また、ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性とは独立して、ナトリウム−グルコース共輸送体１（ＳＧＬＴ１）と相互作用し、安定化させることによってがん細胞の基底細胞内グルコースレベルの維持に関与することが発見されている（ＷｅｉｈｕａＺら、ＳｕｒｖｉｖａｌｏｆｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｉｓｍａｉｎｔａｉｎｅｄｂｙＥＧＦＲｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｆｉｔｓｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ、ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ、１３巻（５号）：３８５〜３９３頁（２００８年））。

ＳＧＬＴ１は、グルコース濃度とは独立して、細胞内にグルコースを輸送するために細胞外のナトリウム濃度に依存する活性なグルコース輸送体である（ＷｒｉｇｈｔＥＭら、Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆｈｕｍａｎｓｏｄｉｕｍｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ、ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ、９１巻（２号）：７３３〜７９４頁（２０１１年））。ＳＧＬＴ１は、生体内でグルコース吸収および保持に重要な役割を果たす（Ｃａｓｔａｎｅｄａ−ＳｃｅｐｐａＣら、Ｓｏｄｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｐｒｏｔｅｉｎａｓａｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｔａｒｇｅｔｆｏｒｉｍｐｒｏｖｉｎｇｇｌｙｃｅｍｉｃｃｏｎｔｒｏｌｉｎｄｉａｂｅｔｅｓ、ＮｕｔｒｉｔｉｏｎＲｅｖｉｅｗｓ、６９巻（１２号）：７２０〜７２９頁（２０１１年））。がんの顕著な特徴の１つは、がん細胞が、変換されたエネルギー代謝を示し、すなわち、がん細胞が、それらの正常な対応物よりも実質的に高い量の栄養素およびエネルギー基質を消費することである（ＨａｎａｈａｎＤら、Ｈａｌｌｍａｒｋｓｏｆｃａｎｃｅｒ：ｔｈｅｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、Ｃｅｌｌ、１４４巻（５号）：６４６〜６７４頁（２０１１年））。この高まったエネルギー消費は、原形質膜輸送体の過剰発現によって達成される、高い比率の栄養素の取り込みを要求する（ＧａｎａｐａｔｈｙＶら、Ｎｕｔｒｉｅｎｔｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓｉｎｃａｎｃｅｒ：ｒｅｌｅｖａｎｃｅｔｏＷａｒｂｕｒｇｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓａｎｄｂｅｙｏｎｄ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ１２１巻（１号）：２９〜４０頁（２００９年））。研究により、ＳＧＬＴ１が、卵巣癌、口腔扁平上皮癌、結腸直腸がん、膵臓がんおよび前立腺がんを含む様々な種類のがんにおいて過剰発現することが見出された（ＬａｉＢら、ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＧＬＴ１ｉｓｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｕｍｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｐｏｏｒｐｒｏｇｎｏｓｉｓｏｆｏｖａｒｉａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＧｙｎｅｃｏｌｏｇｙａｎｄＯｂｓｔｅｔｒｉｃｓ、２８５巻（５号）：１４５５〜１４６１頁（２０１２年）；ＨａｎａｂａｔａＹら、ＣｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＧＬＴ１ａｎｄＥＧＦＲｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｕｍｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｏｒａｌｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ、Ｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ／ｔｈｅＳｏｃｉｅｔｙｏｆｔｈｅＮｉｐｐｏｎＤｅｎｔａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、１００巻（２号）：１５６〜１６３頁（２０１２年）；ＧｕｏＧＦら、ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＧＬＴ１ａｎｄＥＧＦＲｉｎｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｓｈｏｗｉｎｇａｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｐｒｏｇｎｏｓｉｓ、ＭｅｄｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ２８巻、補遺１：Ｓ１９７〜２０３頁（２０１１年）；ＣａｓｎｅｕｆＶＦら、ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＧＬＴ１，Ｂｃｌ−２ａｎｄｐ５３ｉｎｐｒｉｍａｒｙｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｒｅｌａｔｅｄｔｏｓｕｒｖｉｖａｌ、ＣａｎｃｅｒＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ２６巻（８号）：８５２〜８５９頁（２００８年）；ＢｌｅｓｓｉｎｇＡら、Ｓｏｄｉｕｍ／ＧｌｕｃｏｓｅＣｏ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＩｎｃｒｅａｓｅｓｉｎＨｕｍａｎＤｉｓｅａｓｅｄＰｒｏｓｔａｔｅ、Ｊ．ＣａｎｃｅｒＳｃｉ．Ｔｈｅｒ．４巻（９号）：３０６〜３１２頁（２０１２年））。例として、後期前立腺がんは、高いレベルのＥＧＦＲを発現し、高い量のグルコースを取り込む（ＨｅｒｎｅｓＥ．ら、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｆａｍｉｌｙｉｎｐｒｏｓｔａｔｅｃａｒｃｉｎｏｍａｂｅｆｏｒｅａｎｄｄｕｒｉｎｇａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ、ＢｒｉｔｉｓｈＪ．Ｃａｎｃｅｒ、９０巻（２号）：４４９〜４５４頁（２００４年）；ＰｕＹＳら、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＰＤ１６８３９３）ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓｃｙｔｏｔｏｘｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｆｐａｃｌｉｔａｘｅｌａｇａｉｎｓｔａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ、ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、７１巻（６号）：７５１〜７６０頁（２００６年）；ＳｈｅｒｗｏｏｄＥＲら、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄｐｅｐｔｉｄｅｓａｎｄｔｈｅｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｎｏｒｍａｌａｎｄｍａｌｉｇｎａｎｔｐｒｏｓｔａｔｅ、ＷｏｒｌｄＪ．Ｕｒｏｌｏｇｙ、１３巻（５号）：２９０〜２９６頁（１９９５年）；ＬｅｅＳＴら、ＰＥＴｉｎｐｒｏｓｔａｔｅａｎｄｂｌａｄｄｅｒｔｕｍｏｒｓ、ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＮｕｃｌｅａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ４２巻（４号）：２３１〜２４６頁（２０１２年）；ＯｙａｍａＮら、Ｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆ［１８Ｆ］ｆｌｕｏｒｏｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅｉｎｕｎｔｒｅａｔｅｄｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ、ＪａｐａｎｅｓｅＪ．ＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ、２９巻（１２号）：６２３〜６２９頁（１９９９年））。ＥＧＦＲとＳＧＬＴ１の間の機能的関係のより良い理解により、がん治療のための新規な治療標的が同定される可能性がある。
したがって、ＥＧＦＲチロシナーゼインヒビターに抵抗性であるがん細胞を適切に処置することができる方法および組成物が当該技術分野において必要とされる。

ＨｙｎｅｓＮＥら、ＥＲＢＢｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｃａｎｃｅｒ：ｔｈｅｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙｏｆｔａｒｇｅｔｅｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＣａｎｃｅｒ、５巻（５号）：３４１〜３５４頁（２００５年）

本明細書に開示されている特定の実施形態の概要を以下に記載する。この節は、読者に特定の実施形態の概要を単に提供するために示され、これらの記載は本出願の範囲を限定することを意図していないことが理解される。実際に、この開示は、本明細書に記載されていない可能性のある様々な実施形態を包含し得る。

本出願は、がんを処置するための方法および組成物を開示する。一実施形態において、化合物は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）およびナトリウム／グルコース共輸送体１（ＳＧＬＴ１）の間の結合相互作用を不安定化する。別の実施形態において、化合物は、フロリジン様化合物、またはＥＧＦＲの相互作用ドメインに由来するペプチドである。

ある実施形態において、ＥＧＦＲとＳＧＬＴ１の間の結合相互作用を不安定化する化合物は、対象に、腫瘍内、静脈内または全身的に投与される。化合物は、フロリジン様化合物、またはＥＧＦＲの相互作用ドメインに由来するペプチドであり得る。さらに別の実施形態において、化合物は、チロシンキナーゼインヒビターと併用して投与することができる。
本明細書は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）とナトリウム／グルコース共輸送体１（ＳＧＬＴ１）の間の結合相互作用を不安定化させる化合物を含む組成物。
（項目２）
前記化合物が、ペプチドおよびペプチド類似体のうちの少なくとも１つである、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記ペプチドが、ＥＧＦＲのＳＧＬＴ１相互作用ドメインに由来する、項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＬＶＷＫＱＳＣＳＳＴＳＳＴＨ（配列番号００１）を含む、項目２に記載の組成物。
（項目５）
前記ペプチドが、配列番号００２、配列番号００３、配列番号００４、配列番号００５、配列番号００６、配列番号００７、配列番号００８、配列番号００９、配列番号００１０および配列番号００１１のうちの少なくとも１つに実質的に類似する化合物を含む、項目２に記載の組成物。
（項目６）
前記化合物が、フロリジンＳＧＬＴ１インヒビターおよびフロリジン様ＳＧＬＴ１インヒビターのうちの少なくとも１つである、項目１に記載の組成物。
（項目７）
対象におけるがん細胞を処置する方法であって、該対象に、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）とナトリウム／グルコース共輸送体１（ＳＧＬＴ１）の間の結合相互作用を不安定化させる化合物を投与することを含む方法。
（項目８）
前記化合物が、ペプチドおよびペプチド類似体のうちの少なくとも１つである、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＬＶＷＫＱＳＣＳＳＴＳＳＴＨ（配列番号００１）を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記ペプチドが、配列番号００２、配列番号００３、配列番号００４、配列番号００５、配列番号００６、配列番号００７、配列番号００８、配列番号００９、配列番号００１０および配列番号００１１のうちの少なくとも１つを含む、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記対象にチロシンキナーゼインヒビターを投与することをさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目１２）
前記対象にプロテアソーム機構を標的とする化合物を投与することをさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目１３）
前記がん細胞が、乳がん細胞、前立腺がん細胞および結腸がん細胞のうちの少なくとも１つである、項目７に記載の方法。
（項目１４）
前記ペプチドを使用してＥＧＦＲ−ＳＧＬＴ１相互作用によって制御される下流の生存経路を同定することにより、がん治療の標的を同定することをさらに含む、項目８に記載の方法。
（項目１５）
対象におけるがん細胞を処置する方法であって、該対象に、チロシンキナーゼインヒビターと、フロリジンＳＧＬＴ１インヒビターおよびフロリジン様ＳＧＬＴ１インヒビターのうちの少なくとも１つとを投与することを含む方法。
（項目１６）
前記投与が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）とナトリウム／グルコース共輸送体１（ＳＧＬＴ１）の間の結合相互作用を不安定化させる、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記対象にチロシンキナーゼインヒビターを投与することをさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記がん細胞が前立腺がん細胞である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記チロシンキナーゼインヒビターが、ゲフィチニブ、エルロチニブ、イコチニブ、ムブリチニブ、バンデタニブ、ラパチニブ、ペリチニブ、カネルチニブ、ネラチニブ、アファチニブおよびダコミチニブのうちの少なくとも１つである、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記フロリジンＳＧＬＴ１インヒビターが、カナグリフロジンおよびダパグリフロジンのうちの少なくとも１つである、項目１５に記載の方法。

前述の概要および以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めば、より良く理解される。例示のみを目的として、図面においてある種の実施形態が示されている。しかしながら、本明細書に開示される発明概念は、図面に示される正確な配置および手段に限定されないことが理解される。

図１Ａは、実施形態に従った、ヒトＥＧＦＲの様々な構築物の概略図である。図１Ｂは、実施形態に従った、変異したＥＧＦＲとＳＧＬＴ１の間の相互作用の、免疫沈降と組み合わせたウェスタンブロットを示す図である。

図２Ａは、実施形態に従った、ＷＴ−ＥＧＦＲ、ＫＤ−ＥＧＦＲおよびΔ自己リン酸化−ＥＧＦＲと共トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＳＧＴＬ１の発現レベルのウェスタンブロット分析を示す図である。図２Ｂは、実施形態に従った、図２Ａのウェスタンブロットのバンドの濃度測定による定量化を示す図である。図２Ｃは、実施形態に従った、Δ自己リン酸化−ＥＧＦＲによるＳＧＬＴ１の下方制御におけるプロテアソームインヒビターであるＭＧ１３２の効果のウェスタンブロット分析を示す図である。図２Ｄは、実施形態に従った、図２Ｃのウェスタンブロットのバンドの濃度測定による定量化を示す図である。

図３Ａは、実施形態に従った、ＥＧＦまたはＡＥＥ７８８で処理されたＨＥＫ２９３細胞におけるＥＧＦＲ−ＨＡとＳＧＬＴ１−ｆｌａｇの間の相互作用の、免疫沈降と組み合わせたウェスタンブロット分析を示す図である。図３Ｂは、実施形態に従った、ＥＧＦまたはＡＥＥ７８８で処理されたＰＣ３細胞における内因性ＥＧＦＲとＳＧＬＴ１の間の相互作用の、免疫沈降と組み合わせたウェスタンブロット分析を示す図である。

図４Ａは、実施形態に従った、前立腺がん組織アレイからの前立腺がん組織におけるＳＧＬＴ１とＥＧＦＲの共局在を示す図である。図４Ｂは、実施形態に従った、ＰＣ３細胞およびＬＮＣａＰ細胞における内因性ＥＧＦＲとＳＧＬＴ１の発現のウェスタンブロット分析を示す図である。図４Ｃは、実施形態に従った、ＰＣ３細胞におけるゲフィチニブおよびエルロチニブの増殖阻害効果における、ＳＧＬＴ１の阻害効果を示すＭＴＴアッセイを示す図である。図４Ｄは、実施形態に従った、ＬＮＣａＰ細胞におけるゲフィチニブおよびエルロチニブの増殖阻害効果における、ＳＧＬＴ１の阻害効果を示すＭＴＴアッセイを示す図である。

図５Ａは、実施形態に従った、両方のタンパク質を不安定化するペプチドの小分子によるＥＧＦＲ−ＳＧＬＴ１の相互作用の破壊を示す図である。図５Ｂは、実施形態に従った、ＥＧＦＲ−ＳＧＬＴ１を破壊するペプチド（ＭＴＧ−０１）を用いたＰＣ３細胞の処理は、ＥＧＦＲおよびＳＧＬＴ１タンパク質を有意に下方制御することを示す図である。

図６Ａ〜Ｅは、実施形態に従った、がん性ＰＣ３、Ｄｕ１４５、ＨＣＴ１１６およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の生存率、ならびにＭＴＧ−０１で処理した際の非がん性ＨＥＫ２９３細胞の処置を示す図である。図６Ａ〜Ｅは、実施形態に従った、がん性ＰＣ３、Ｄｕ１４５、ＨＣＴ１１６およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の生存率、ならびにＭＴＧ−０１で処理した際の非がん性ＨＥＫ２９３細胞の処置を示す図である。図６Ａ〜Ｅは、実施形態に従った、がん性ＰＣ３、Ｄｕ１４５、ＨＣＴ１１６およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の生存率、ならびにＭＴＧ−０１で処理した際の非がん性ＨＥＫ２９３細胞の処置を示す図である。

少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本明細書に記載されている発明概念は、それらの応用において、以下の説明に記載されているまたは図面に例示されている構成詳細または成分配置に限定されないことを理解すべきである。さらに、本明細書で用いられる言い回しおよび用語は、記述的目的にすぎず、限定とみなすべきではないことを理解する必要がある。

さらに、記載されている特徴のいずれか１つが、他の特徴とは別個にまたはそれと組み合わせて使用され得ることを理解すべきである。他の発明に係るシステム、方法、特徴および利点は、図面および本明細書における詳細な説明を考察することにより、当業者に明らかでありまたは明らかとなる。すべてのこのような追加のシステム、方法、特徴および利点は、添付の特許請求の範囲によって保護されることが意図される。

本出願において引用されている全ての参考文献は、全体として参照により組み込まれる。

上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の過剰発現は、悪性腫瘍における予後不良と関連する。ナトリウム／グルコース共輸送体１（ＳＧＬＴ１）は、前立腺がんを含むがんにおいて過剰発現する活性なグルコース輸送体である。ＥＧＦＲは、がん細胞においてＳＧＬＴ１と相互作用し、それを安定化させることが見出されている。

以下において非常に詳細に説明されるように、以下の実施態様は本出願において特定されている：
・ＳＧＬＴ１とのその十分な相互作用およびＳＧＬＴ１との相互安定化に必要とされるＥＧＦＲの重要なマイクロドメイン；
・ＥＧＦＲ−ＳＧＬＴ１相互作用におけるＥＧＦＲの活性化／不活性化の効果；
・前立腺がんの組織および細胞株におけるＥＧＦＲおよびＳＧＬＴ１の発現測定；
・ＥＧＦＲチロシンインヒビターに対する前立腺がん細胞の感受性に対するＳＧＬＴ１の阻害効果；
・合成されたペプチドであるＥＳＤ−０１のアミノ酸配列；
・がん細胞におけるＥＧＦＲおよびＳＧＬＴ１タンパク質の安定性に対するＥＳＤ−０１の効果；および
・非がん細胞（ＨＥＫ２９３）およびインビトロで培養された数種類のがん細胞の生存に対するＥＳＤ−０１の効果。
・Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸のいずれかで作製されたＥＳＤ−０１ペプチドは、インビトロにおけるがん細胞の死滅に同等に有効である。

一実施形態において、ＥＧＦＲの自己リン酸化領域（９７８〜１２１０アミノ酸）は、ＳＧＬＴ１とのその十分な相互作用に必要とされる。この相互作用は、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性に依存しない。最も重要なことは、別の実施形態において、ＥＧＦＲ−ＳＧＬＴ１相互作用は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼモジュレーター（ＥＧＦインヒビターおよびチロシンキナーゼインヒビター）に非応答性である。さらに別の実施形態において、ＥＧＦＲおよびＳＧＬＴ１は、前立腺がん組織に共局在する。さらに別の実施形態において、ＳＧＬＴ１インヒビター（フロリジン）によるＳＧＬＴ１の阻害は、ＥＧＦＲインヒビター（ゲフィチニブおよびエルロチニブ）に対して前立腺がん細胞（ＰＣ３およびＬＮＣａＰ）を感作させる。さらなる実施形態において、ＥＳＤ−０１（配列番号００１）は、ＥＧＦＲ−ＳＧＬＴ１相互作用を不安定化させる。このデータのすべては、がん細胞におけるＥＧＦＲが、２種の状態−チロシンキナーゼモジュレーター応答性状態および非応答性状態において外れ得ることを示唆する。したがって、ある実施形態において、ＳＧＬＴ１は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼインヒビターに非応答性であるＥＧＦＲ機能に関与するタンパク質であり、ＥＧＦＲ−ＳＧＬＴ１相互作用は、前立腺がん治療の新規な標的であり得る。

ＳＧＬＴ１との相互作用に必要とされるＥＧＦＲタンパク質領域

一実施形態において、ＳＧＬＴ１とのその相互作用に必要とされるＥＧＦＲタンパク質領域を決定するために、様々な変異を有する、ｆｌａｇタグ付きＳＧＬＴ１^２３およびＨＡタグ付きＥＧＦＲを作り出し得る（ＢｌｅｓｓｉｎｇＡら、Ｓｏｄｉｕｍ／ＧｌｕｃｏｓｅＣｏ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＩｎｃｒｅａｓｅｓｉｎＨｕｍａｎＤｉｓｅａｓｅｄＰｒｏｓｔａｔｅ、Ｊ．ＣａｎｃｅｒＳｃｉ．Ｔｈｅｒ．４巻（９号）：３０６〜３１２頁（２０１２年））。図１Ａは、ほんの一例として、ＳＧＬＴ１とのその相互作用に必要とされるＥＧＦＲタンパク質領域を決定するために使用され得る、ヒトＥＧＦＲ構築物の概略図を示す。例えば、いくつかの実施形態において、以下の構築物を含んでもよい：野生型ＥＧＦＲ（「ＷＴ」）；キナーゼ失活型ＥＧＦＲ（Ｒ８１７Ｍ）（「ＫＤ」）（配列番号０１２）；膜貫通ドメイン欠失（６４５〜６７０ａａ）（「ΔＴＭ」）（配列番号０１３）；細胞外ドメイン欠失（１〜６４４ａａ）（「Δ細胞外」）（配列番号０１４）；細胞内ドメイン欠失（６７１〜１２１０ａａ）（「Δ細胞内」）（配列番号０１５）；チロシンキナーゼドメイン欠失（６７０〜９７７ａａ）（「ΔＴＫ」）（配列番号０１６）；または自己リン酸化ドメイン欠失（９７８〜１２１０ａａ）（「Δ自己リン酸化」）（配列番号０１７）。

ある実施形態において、ｆｌａｇ付きＳＧＬＴ１および上記で同定されたＨＡタグ付きＥＧＦＲは、ＨＥＫ２９３細胞に一過性に共トランスフェクトされ得る。別の実施形態において、ＳＧＬＴ１は、抗ｆｌａｇ抗体を使用して免疫沈降させ得る。さらに別の実施形態において、ウェスタンブロット分析をＨＡタグ付きＥＧＦＲについて行ってもよい。図１Ｂは、ほんの一例として、変異したＥＧＦＲとＳＧＬＴ１の間の相互作用のウェスタンブロット分析を示す。この場合、ＩＰ＝免疫沈降、ＩＢ＝免疫ブロット、およびインプット＝免疫沈降用に使用されるＨＥＫ２９３全細胞溶解物中に示された外因性タンパク質の発現レベルである。図１Ｂに示すように、全体の細胞内ドメインまたはＥＧＦＲの自己リン酸化ドメインの欠失は、ＳＧＬＴ１との相互作用を実質的に減少させる。一実施形態において、ＥＧＦＲの自己リン酸化ドメインはＳＧＬＴ１とのその十分な相互作用に必要とされる。

これまでに、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン、およびＥＧＦＲＴＭドメインを含有しない細胞内ドメインを使用して、ＥＧＦＲの細胞外ドメインが、その細胞内ドメインよりも良好にＳＧＬＴ１と相互作用することが発見された（ＷｅｉｈｕａＺら、ＳｕｒｖｉｖａｌｏｆｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｉｓｍａｉｎｔａｉｎｅｄｂｙＥＧＦＲｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｆｉｔｓｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ、ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ１３巻（５号）：３８５〜３９３頁（２００８年））。ある実施形態において、原形質膜におけるＥＧＦＲ−ＳＧＬＴ１相互作用をさらに特徴付けるために、ＴＭドメインを切断型ＥＧＦＲの構築物中に含ませてもよい。一実施形態において、ＥＧＦＲの細胞内ドメイン、特に自己リン酸化ドメインを含有するＴＭは、細胞外ドメインよりＳＧＬＴ１とより強く相互作用する。この実施形態と以前の報告に示されたデータの間の不一致は、以前の研究において使用された細胞内ドメイン構築物におけるＴＭドメインの欠落に起因している可能性が非常に高い。

プロテアソーム媒介性ＳＧＬＴ１分解を防ぐために必要とされるＥＧＦＲの自己リン酸化ドメイン

ある実施形態において、ＥＧＦＲの自己リン酸化ドメインがＳＧＬＴ１の安定性を持続するために必要とされるかどうかを決定するために、ＨＥＫ２９３細胞にＷＴ−ＥＧＦＲ、ＫＤ−ＥＧＦＲおよびΔ自己リン酸化−ＥＧＦＲと共トランスフェクトされたＳＧＬＴ１の発現レベルを測定し得る。例えば、図２Ａは、ほんの一例として、ＷＴ−ＥＧＦＲ、ＫＤ−ＥＧＦＲおよびΔ自己リン酸化−ＥＧＦＲと共トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＳＧＴＬ１の発現レベルについてのウェスタンブロット分析を示す。ＳＧＬＴ１とＥＧＦＲの同量のＤＮＡプラスミドを、各群の処理に使用することができる。さらに、対照細胞に空のベクターの同量のＤＮＡをトランスフェクトし得る。アクチンを装填対照として使用することができる。図２Ｂは、ほんの一例として、図２Ａのウェスタンブロットのバンドの濃度測定による定量化を示す。アスタリスク記号は、３重の実験からの連結された代表的な群間の統計的有意性を示す。

図２Ａ〜２Ｂに示されるように、一実施形態において、ＷＴ−ＥＧＦＲとＫＤ−ＥＧＦＲがトランスフェクトされた細胞におけるＳＧＬＴ１レベルは、対照ベクターまたはΔ自己リン酸化−ＥＧＦＲがトランスフェクトされた細胞におけるレベルよりも非常に高い。別の実施形態において、ＥＧＦＲの自己リン酸化ドメインは、ＳＧＬＴ１の発現レベルを維持することができる。さらに別の実施形態において、Δ自己リン酸化−ＥＧＦＲがトランスフェクトされた細胞におけるＳＧＬＴ１レベルは、対照細胞よりも有意に低い。さらに別の実施形態において、ＥＧＦＲとのＳＧＬＴ１相互作用の喪失は、ＳＧＬＴ１の下方制御を促進し得る。

ある実施形態において、プロテアソームが、ＳＧＬＴ１の下方制御を誘導したＥＧＦＲとの相互作用の喪失に関与するかどうかを決定するために、ＳＧＬＴ１とΔ自己リン酸化−ＥＧＦＲが共トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、限定されないが、ＭＧ２３１などのプロテアソームインヒビターで処理することができる。例えば、図２Ｃは、Δ自己リン酸化−ＥＧＦＲによるＳＧＬＴ１の下方制御に対するプロテアソームインヒビターであるＭＧ１３２の効果についてのウェスタンブロット分析を示す。アクチンを装填対照として使用することができる。図２Ｄは、ほんの一例として、図２Ｃのウェスタンブロットにおけるバンドの濃度測定による定量化を示す。アスタリスク記号は、３重の実験からの連結された代表的な群間の統計的有意性を示す。

図２Ｃ〜２Ｄに示されるように、ほんの一例として、一実施形態において、ＭＧ２３１は、Δ自己リン酸化−ＥＧＦＲがトランスフェクトされた細胞におけるＳＧＬＴ１の下方制御を阻害することができる。別の実施形態において、プロテアソーム機構は、ＳＧＬＴ１下方制御を誘導したＥＧＦＲとの相互作用の喪失に関与する。換言すると、プロテアソームは、ＥＧＦＲ−ＳＬＧＴ１相互作用が低下すると、ＳＧＬＴ１の最終的な分解を引き起し得る。さらに別の実施形態において、プロテアソーム機構は、単独でまたはＥＧＦＲ−ＳＬＧＴ１相互作用と組み合わせて、潜在的な治療標的であり得る。

一実施形態において、ＥＧＦＲにおけるＳＧＬＴ１相互作用ドメインの欠失は、プロテアソーム機構を介したＳＧＴＬ１の下方制御を促進する。別の実施形態において、ＥＧＦＲ陽性がん細胞におけるＥＧＦＲ−ＳＧＬＴ１相互作用のこの破壊は、ＳＧＬＴ１の下方制御をもたらし得る。さらに、以前のデータは、ｓｈＲＮＡによるＳＧＬＴ１のノックダウンが、前立腺がん細胞のオートファジー（ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ）細胞死をもたらすことを示す（ＷｅｉｈｕａＺら、ＳｕｒｖｉｖａｌｏｆｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｉｓｍａｉｎｔａｉｎｅｄｂｙＥＧＦＲｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｆｉｔｓ
ｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ、ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ１３巻（５号）：３８５〜３９３頁（２００８年））。ある実施形態において、ＥＧＦＲ−ＳＧＬＴ１相互作用は、がんについてのＥＧＦＲに基づく治療を改善するための重要な標的であり得る。

ＥＧＦＲ−ＳＧＬＴ１相互作用はＥＧＦＲチロシンキナーゼインヒビターに非応答性である

ある実施形態において、ＳＧＬＴ１とのＥＧＦＲ相互作用に対するＥＧＦＲチロシンキナーゼインヒビターの効果を決定することができる。ある実施形態において、ＷＴ−ＥＧＦＲとＳＧＬＴ１が共トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞をＥＧＦまたはＥＧＦＲチロシンキナーゼインヒビターであるＡＥＥ７８８のいずれかで処理し得る。ＳＧＬＴ１を免疫沈降し得、ＳＧＬＴ１と共免疫沈降されたＥＧＦＲレベルを測定することができる。例えば、図３Ａは、ほんの一例として、ＥＧＦまたはＡＥＥ７８８で処理されたＨＥＫ２９３細胞におけるＥＧＦＲ−ＨＡとＳＧＬＴ１−Ｆｌａｇの間の相互作用の、免疫沈降と組み合わせたウェスタンブロット分析を示す。この場合、ＥＧＦＲ＝総ＥＧＦＲ、ｐＥＧＦＲ＝リン酸化ＥＧＦＲ、ＩＰ＝免疫沈降、ＩＢ＝免疫ブロットおよびインプット＝免疫沈降用に使用されたＨＥＫ２９３全細胞溶解物中の示された外因性タンパク質の発現レベルである。図３Ａに示されるように、一実施形態において、ＥＧＦとＡＥＥ７８８はいずれもＥＧＦＲ−ＳＧＬＴ１相互作用に有意に影響を与えない。さらに別の実施形態において、ＳＧＬＴ１と共沈されたＥＧＦＲはリン酸化されない。

一実施形態において、内因性ＥＧＦＲ−ＳＧＬＴ１相互作用に対するＥＧＦおよびＡＥＥ７８８の効果、ならびにＳＧＬＴ１と相互作用する内因性ＥＧＦＲのリン酸化状態を決定するために、ＥＧＦまたはＡＥＥ７８８で処理されたＰＣ３細胞の内因性ＳＧＬＴ１を免疫沈降することができる。別の実施形態において、ＳＧＬＴ１と共沈したＥＧＦＲのリン酸化状態を測定することができる。ほんの一例として、図３Ｂは、ＥＧＦまたはＡＥＥ７８８で処理されたＰＣ３細胞における内因性ＥＧＦＲと内因性ＳＧＬＴ１の間の相互作用の、免疫沈降と組み合わせたウェスタンブロット分析を示す。ある実施形態において、ＥＧＦとＡＥＥ７８８はいずれもＥＧＦＲ−ＳＧＬＴ１相互作用に影響を与えない。さらに別の実施形態において、ＥＧＦＲと相互作用する内因性ＳＧＬＴ１はリン酸化されない。さらに別の実施形態において、ＥＧＦＲ−ＳＧＬＴ１相互作用は、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性のモジュレーターに非応答性である。なおさらなる実施形態において、ＥＧＦＲは、その非キナーゼ機能性におけるがん治療を標的とすることができ、例えば、限定されないが、ＳＧＬＴ１とのその相互作用が挙げられる。

ＥＧＦＲの自己リン酸化ドメイン内のチロシンがリン酸化されると、自己リン酸化ドメインは、下流のシグナル伝達を転写活性化するアダプター／エフェクタータンパク質を動員するための主要なドッキング部位として機能することは十分に実証されている（ＢａｚｌｅｙＬＡら、Ｔｈｅｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｆａｍｉｌｙ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−ＲｅｌａｔｅｄＣａｎｃｅｒ、１２巻、補遺１：Ｓ１７〜２７頁（２００５年））。図３Ａの結果に基づいて、ある実施形態において、ＥＧＦＲ−ＳＧＬＴ１相互作用は、ＥＧＦＲ活性化／不活性化とは独立している。ＥＧＦＲの自己リン酸化ドメインは、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性とは独立して、タンパク質間相互作用ドメインとして機能する。一実施形態において、ＥＧＦＲは、そのチロシンキナーゼ活性とは独立して、生存促進機能を有する。例えば、ＥＧＦＲは、２種類の状態−チロシンキナーゼ応答性状態とチロシンキナーゼ非応答性状態で存在することができる。ＥＧＦＲのリガンドによる活性化の際に、キナーゼ応答性ＥＧＦＲの自己リン酸化ドメインはリン酸化され得、下流シグナルを誘発するためにエフェクターを動員することができる。あるいは、キナーゼ非応答性ＥＧＦＲは、ＥＧＦＲリガンドの存在にかかわらず、およびそのチロシンキナーゼの活性化または不活性化にかかわらず、タンパク質と常に相互作用し得る。さらに別の実施形態において、ＳＧＬＴ１は、キナーゼ非応答性状態にあるＥＧＦＲに結合し、それを保つこのようなタンパク質の１つであり得る。さらに別の実施形態において、ＥＧＦＲのリン酸化されていない自己リン酸化ドメインは、治療標的を同定するためのツールとして使用することができる。

ＳＧＬＴ１インヒビターによるＳＧＬＴ１の阻害はＥＧＦＲインヒビターに対して前立腺がん細胞を感作させる

ある実施形態において、ＥＧＦＲ−ＳＧＬＴ１相互作用の臨床的関連性を決定するために、前立腺がんの組織マイクロアレイ（ｎ＝４４）におけるＥＧＦＲとＳＧＬＴ１の免疫蛍光共染色を行ってもよい。例えば、図４Ａは、ほんの一例として、前立腺がん組織アレイからの３つの代表的な前立腺がん組織の結果を示す。ある実施形態において、ＳＧＬＴ１（緑色）およびＥＧＦＲ（赤色）は、前立腺組織において共局在し得る（例えば、矢印で示すように、オレンジ色または黄色）。別の実施形態において、間質細胞は、ＳＧＬＴ１について陽性であり得るが、しかし、ＥＧＦＲについては陰性であり得る（例えば、矢頭によって示される）。さらに別の実施形態において、ＥＧＦＲ陽性のがん試料（ｎ＝４１）では、ＳＧＬＴ１はがん細胞においてＥＧＦＲと共局在するが、間質細胞においては共局在しない。

さらに別の実施形態において、ＥＧＦＲ−ＳＧＬＴ１相互作用は、前立腺がんの病態形成に寄与し得る。例えば、ある実施形態において、前立腺がん組織におけるＳＧＬＴ１とのＥＧＦＲの共局在は、ＥＧＦＲ−ＳＧＬＴ１相互作用ががんに関連することを示し得る。現在、病院においては、ＥＧＦＲチロシンキナーゼインヒビターは、前立腺がんに対して満足のいく治療効果をいまだに示されていない（ＣａｎｉｌＣＭら、ＲａｎｄｏｍｉｚｅｄｐｈａｓｅＩＩｓｔｕｄｙｏｆｔｗｏｄｏｓｅｓｏｆｇｅｆｉｔｉｎｉｂｉｎｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ：ａｔｒｉａｌｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣａｎａｄａ−ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓＧｒｏｕｐ、Ｊ．ＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ、２３巻（３号）：４５５〜４６０頁（２００５年）；ＧｒｏｓｓＭら、ＡｐｈａｓｅＩＩｔｒｉａｌｏｆｄｏｃｅｔａｘｅｌａｎｄｅｒｌｏｔｉｎｉｂａｓｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｅｌｄｅｒｌｙｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ、ＢＭＣＣａｎｃｅｒ７巻：１４２頁（２００７年））。一実施形態において、ＥＧＦＲ発現が前立腺がんの疾患進行およびＥＧＦＲチロシンキナーゼインヒビターへの前立腺がんの臨床的非応答性と相関するという事実を考慮すると、ＥＧＦＲは、そのチロシンキナーゼ活性とは独立して、前立腺がんの疾患進行に寄与する可能性がある。さらに、以前の知見によれば、（１）前立腺がん組織はＳＧＬＴ１の発現を増大させた^２３、（２）ＥＧＦＲタンパク質の喪失は、そのチロシンキナーゼ活性ではなく、化学療法剤に対して前立腺がん細胞を感作させた^２９、および（３）ＥＧＦＲ誘導によるオートファジー細胞死の喪失はＳＧＬＴ１タンパク質の下方制御によって媒介された、と結論付けられる（ＢｌｅｓｓｉｎｇＡら、Ｓｏｄｉｕｍ／ＧｌｕｃｏｓｅＣｏ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＩｎｃｒｅａｓｅｓｉｎＨｕｍａｎＤｉｓｅａｓｅｄＰｒｏｓｔａｔｅ、Ｊ．ＣａｎｃｅｒＳｃｉ．Ｔｈｅｒ．４巻（９号）：３０６〜３１２頁（２０１２年）；ＸｕＳら、ＬｏｓｓｏｆＥＧＦＲｉｎｄｕｃｅｄａｕｔｏｐｈａｇｙｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓｈｏｒｍｏｎｅｒｅｆｒａｃｔｏｒｙｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｔｏａｄｒｉａｍｙｃｉｎ、ＴｈｅＰｒｏｓｔａｔｅ．１７巻：１２１６〜１２２４頁（２０１１年）；ＷｅｉｈｕａＺら、ＳｕｒｖｉｖａｌｏｆｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｉｓｍａｉｎｔａｉｎｅｄｂｙＥＧＦＲｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｆｉｔｓｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ、ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ、１３巻（５号）：３８５〜３９３頁（２００８年））。さらに別の実施形態において、ＥＧＦＲは、後期がん細胞のグルコースの高需要を持続するために、ＳＧＬＴ１の安定化を介して前立腺がんの進行を促進することができる。この実施形態は、本明細書に記載される全ての実施形態によって裏付けられているだけでなく、ＳＧＬＴ１の過剰発現が、腎上皮細胞および腸上皮細胞をアポトーシスから防ぐという過去のデータによっても裏付けられている（ＩｋａｒｉＡら、Ｓｏｄｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｒｅｄｕｃｅｓｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅａｎｄｃｅｌｌｉｎｊｕｒｙｃａｕｓｅｄｂｙｃｉｓｐｌａｔｉｎｉｎｒｅｎａｌｔｕｂｕｌａｒｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ、ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ１７１７巻（２号）：１０９〜１１７頁（２００５年）；ＹｕＬＣら、ＳＧＬＴ−１−ｍｅｄｉａｔｅｄｇｌｕｃｏｓｅｕｐｔａｋｅｐｒｏｔｅｃｔｓｈｕｍａｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓａｇａｉｎｓｔＧｉａｒｄｉａｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ−ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｊｏｕｒｎａｌｆｏｒｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ３８巻（８〜９号）：９２３〜９３４頁（２００８年））。

グルコースレベルの増加がＥＧＦＲを活性化すること、ＳＧＬＴ１が前立腺がん組織において過剰発現すること、および前立腺がんがＥＧＦＲインヒビターに抵抗性であることは周知である。（ＨａｎＬら、ＨｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅｐｒｏｍｏｔｅｓｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｖｉａｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆＥＧＦｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＥＧＦＲ、ＰｌｏＳＯｎｅ６巻（１１号）：ｅ２７０７４頁（２０１１年）；ＢｌｅｓｓｉｎｇＡら、Ｓｏｄｉｕｍ／ＧｌｕｃｏｓｅＣｏ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＩｎｃｒｅａｓｅｓｉｎＨｕｍａｎＤｉｓｅａｓｅｄＰｒｏｓｔａｔｅ、Ｊ．ＣａｎｃｅｒＳｃｉ．Ｔｈｅｒ．４巻（９号）：３０６〜３１２頁（２０１２年）；ＣａｎｉｌＣＭら、ＲａｎｄｏｍｉｚｅｄｐｈａｓｅＩＩｓｔｕｄｙｏｆｔｗｏｄｏｓｅｓｏｆｇｅｆｉｔｉｎｉｂｉｎｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ：ａｔｒｉａｌｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣａｎａｄａ−ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓＧｒｏｕｐ、Ｊ．
ＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ、２３巻（３号）：４５５〜４６０頁（２００５年）；ＧｒｏｓｓＭら、ＡｐｈａｓｅＩＩｔｒｉａｌｏｆｄｏｃｅｔａｘｅｌａｎｄｅｒｌｏｔｉｎｉｂａｓｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｅｌｄｅｒｌｙｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ、ＢＭＣＣａｎｃｅｒ７巻：１４２頁（２００７年））。ある実施形態において、ＳＧＬＴ１およびＥＧＦＲは、前立腺がんの増殖を相乗的に促進することができる。一実施形態において、ＳＧＬＴ１の阻害が、ＥＧＦＲインヒビターに対して前立腺がん細胞を感作させることができるかどうかを試験するために、前立腺がん細胞株（例えば、ＰＣ３およびＬＮＣａＰ（ともにＥＧＦＲとＳＧＬＴ１に対して陽性））をＳＧＬＴ１インヒビター（例えば、フロリジンおよびフロリジン誘導体、例えばカナグリフロジンおよびダパグリフロジン）の存在／非存在下でＥＧＦＲチロシンキナーゼインヒビター（例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、イコチニブ、ムブリチニブ、バンデタニブ（Ｖａｎｄｅｒｔａｎｉｂ）、ラパチニブ、ペリチニブ、カネルチニブ、ネラチニブ、アファチニブおよびダコミチニブ）を用いて処理され得る（ＥｈｒｅｎｋｒａｎｚＪＲら、Ｐｈｌｏｒｉｚｉｎ：ａｒｅｖｉｅｗ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ／ＭｅｔａｂｏｌｉｓｍＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＲｅｖｉｅｗｓ２１巻（１号）：３１〜３８頁（２００５年））。一実施形態において、処置の増殖阻害効果を決定することができる。例えば、ある実施形態において、ＭＴＴアッセイに供する前に、ＥＧＦＲインヒビター（ゲフィチニブ、１０μＭ；エルロチニブ、１０μＭ）の有無でＳＧＬＴ１インヒビターであるフロリジン（５０μＭ）を用いて、４８時間細胞を処理することができる。対照細胞のＯＤ値を人為的に１に設定することができる。全ての実験は、少なくとも３回繰り返されてもよい。アスタリスク記号は、連結された群間の統計的有意性を示す。

図４Ｂは、ほんの一例として、ＰＣ３細胞およびＬＮＣａＰ細胞における内因性ＥＧＦＲおよび内因性ＳＧＬＴ１発現のウェスタンブロット分析を示す。一実施形態において、乳がん細胞および結腸がん細胞は、ＥＧＦＲおよびＳＧＬＴ１を発現する。図４Ｃは、ＰＣ３細胞に対するゲフィチニブおよびエルロチニブの増殖阻害効果に対する、ＳＧＬＴ１の阻害効果のＭＴＴアッセイを示す。図４Ｄは、ＬＮＣａＰ細胞に対するゲフィチニブおよびエルロチニブの増殖阻害効果に対する、ＳＧＬＴ１の阻害効果のＭＴＴアッセイを示す。これらの結果に基づいて、一実施形態において、ＳＧＬＴ１およびＥＧＦＲの機能の同時阻害は、より効果的にがん細胞増殖を阻害することができる。さらに別の実施形態において、フロリジンは、ゲフィチニブおよびエルロチニブの増殖阻害効果に対して前立腺がん細胞を顕著に感作させることができる。ある実施形態において、がんを処置するために静脈内、腫瘍内または全身的にフロリジンまたはフロリジン様化合物を患者に投与することができる。さらに別の実施形態において、がんを処置するためにチロシンキナーゼインヒビターを併用して、フロリジンまたはフロリジン様化合物を患者に投与することができる。

別の実施形態において、ペプチドは、がん細胞のＥＧＦＲタンパク質およびＳＧＬＴ１タンパク質を不安定化することができる。図５Ａは、ほんの一例として、がん細胞のＥＧＦＲタンパク質およびＳＧＬＴ１タンパク質を不安定化することができるＥＳＤ−０１（配列番号００１）と呼ばれるペプチドの実施形態を示す。一実施形態において、ＥＳＤ−０１ペプチドは、ＥＧＦＲのＳＧＬＴ１相互作用ドメインから選択され得る。別の実施形態において、ＥＳＤ−０１は、ヒトＥＧＦＲタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＨ９４７６１．１）のアミノ酸１０４９〜１０６２を含む。さらに別の実施形態において、培養細胞（例えば、ＰＣ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨＣＴ１１６細胞）におけるＥＧＦＲおよびＳＧＬＴ１の安定性に対するＥＳＤ−０１の効果は、ウェスタンブロット分析によって決定することができる。図５Ｂは、ほんの一例として、ＥＳＤ−０１処理（２００μＭ、６時間）が、プロテアソームインヒビターであるＭＧ１３２によって阻害される、ＰＣ３細胞におけるＥＧＦＲレベルおよびＳＧＬＴ１レベルを有意に下方制御することを示す。ある実施形態において、ＥＳＤ−０１によるＳＧＬＴ１およびＥＧＦＲの下方制御のＭＧ１３２による阻害は、ＭＴＧ−０１がタンパク質分解を介してＥＧＦＲおよびＳＧＬＴ１を不安定化させることを示唆する。さらに別の実施形態において、培養されたがん細胞（例えば、ＰＣ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨＣＴ１１６細胞）の生存性に対するＥＳＤ−０１の効果は、トリパンブルー取り込みアッセイによって決定することができる。図６Ａ〜Ｅは、ほんの一例として、ＥＳＤ−０１処理（１００μＭ、２４時間）が、前立腺がんＰＣ３およびＤｕ１４５細胞、乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞ならびに結腸がんＨＣＴ１１６細胞を含む種々のがん細胞の生存性を有意に低下させることを示す。さらに別の実施形態において、ＥＳＤ−０１処理は、非がん性ＨＥＫ２９３細胞の生存性を減少させることはできない。

類似した化学的特性を有する別のアミノ酸を用いた、タンパク質／ペプチドにおけるアミノ酸の置換は、同一機能を有するタンパク質／ペプチドを生成し得ることは周知である。ある実施形態において、ＥＳＤ−０１（配列番号００１）は、類似した化学的特性を有するアミノ酸またはがん細胞のＥＧＦＲおよびＳＧＬＴ１タンパク質を不安定化する任意の他の変異を有するアミノ酸で置換することができる。例えば、一実施形態において、アミノ酸は、Ｌ体またはＤ体のキラル異性体のいずれかであり得る。別の実施形態において、ＥＳＤ−０１におけるセリン（Ｓ）をスレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）または任意の他の非天然ヒドロキシル含有アミノ酸で置換することができる（例えば、配列番号００２）。さらに別の実施形態において、ＥＳＤ−０１におけるスレオニン（Ｔ）をセリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）または任意の他の非天然ヒドロキシル含有アミノ酸で置換することができる（例えば、配列番号００３）。さらに別の実施形態において、ＥＳＤ−０１におけるリジン（Ｋ）をスレオニン（Ｔ）で置換することができる（例えば、配列番号００４）。ある実施形態において、ＥＳＤ−０１におけるグルタミン（Ｑ）をヒスチジン（Ｈ）で置換することができる（例えば、配列番号００５）。別の実施形態において、ＥＳＤ−０１の１０位のスレオニン（Ｔ）をアラニン（Ａ）で置換することができる（例えば、配列番号００６）。さらに別の実施形態において、ＥＳＤ−０１の１２位のセリン（Ｓ）をロイシン（Ｌ）で置換することができる（例えば、配列番号００７）。さらに別の実施形態において、ＥＳＤ−０１における正に荷電した極性アミノ酸であるリジン（Ｋ）およびヒスチジン（Ｈ）は、任意の他の天然および非天然の正に荷電したアミノ酸であり得る（例えば、配列番号００８）。一実施形態において、ＥＳＤ−０１における極性アミノ酸であるグルタミン（Ｑ）およびシステイン（Ｃ）は、任意の他の天然および非天然の極性アミノ酸であり得る（例えば、配列番号００９）。別の実施形態において、ＥＳＤ−０１におけるシステイン（Ｃ）は、任意の他の天然および非天然のチオール側鎖（−ＳＨ）を含有するアミノ酸であり得る（例えば、配列番号０１０）。さらに別の実施形態において、ＥＳＤ−０１における非極性アミノ酸であるロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）およびトリプトファン（Ｗ）は、任意の他の天然および非天然の非極性アミノ酸であり得る（例えば、配列番号０１１）。

上記の説明は例示であって限定的でないことを意図していることは理解される。材料は、当業者が、本明細書に記載されている発明概念を作製し、使用することができるように提示され、特定の実施形態の文脈において提供され、それらの変形は、当業者に容易に明らかとなる（例えば、開示された実施形態のいくつかは互いに組み合わせて使用され得る）。多数の他の実施形態は、上記の説明を検討することにより当業者には明らかとなる。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲、ならびにこのような特許請求の範囲が権利を受ける同等物の全範囲を参照して決定されるべきである。添付の特許請求の範囲において、用語「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「ここで（ｉｎｗｈｉｃｈ）」は、それぞれの用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「ここで（ｗｈｅｒｅｉｎ）」の平易な英語の同等物として使用される。

細胞および試薬。ＨＥＫ２９３細胞株、前立腺がん細胞株ＰＣ３、ＬＮＣａＰ、Ｄｕ１４５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨＣＴ１１６細胞は、元々はアメリカン・タイプ・オブ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手し、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ中で５％ＣＯ_２下、３７℃で維持された。マウス抗Ｆｌａｇタグ抗体（Ｆ１８０４）、プロテアソームインヒビターＭＧ２３１およびフロリジン二水和物をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。ＡＥＥ７８８、ゲフィチニブおよびエルロチニブをＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）から入手した。ｐＥＧＦＲに対する抗体（Ｙ１１７３）（カタログ番号２４３４Ｌ）をＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）から入手した。Ｃ２２５に対するモノクローナル抗体をＬｅｅＥｌｉｓ博士（Ｍ．Ｄ．アンダーソンがんセンター）から入手した。ウサギ抗アクチン（カタログ番号ｓｃ−７２１０）、ウサギ抗ＨＡタグ抗体（ｓｃ−８０５）、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したウサギおよびマウスに対する二次抗体、ならびにプロテインＡ／Ｇコンジュゲート化アガロースビーズ（カタログ番号ｓｃ−２００３）をＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＣＡ）から入手した。ＭＴＴキット（カタログ番号３０−１０１０Ｋ）をＡＴＣＣから入手した。ｆｌａｇタグ付きヒトＳＧＬＴ１を発現するプラスミド、ならびに免疫組織化学分析（ＳＧＬＴ１−ＩＨＣ）およびウェスタンブロッティング分析（ＳＧＬＴ１−ＷＢ）用のウサギ抗ヒトＳＧＬＴ１ポリクローナル抗体は、これまでに記載されている（ＢｌｅｓｓｉｎｇＡら、Ｓｏｄｉｕｍ／ＧｌｕｃｏｓｅＣｏ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＩｎｃｒｅａｓｅｓｉｎＨｕｍａｎＤｉｓｅａｓｅｄＰｒｏｓｔａｔｅ、Ｊ．ＣａｎｃｅｒＳｃｉ．
Ｔｈｅｒ．４巻（９号）：３０６〜３１２頁（２０１２年））。

プラスミド構築。ヒト野生型ＥＧＦＲは、他のすべてのＥＧＦＲ構築物を生成するために親ベクターとして使用されたｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＣＡ）にクローニングした。Ｃ末端のＨＡタグを含むｐＲＫ５発現プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＣＡ）をすべてのＨＡタグ付きＥＧＦＲを構築するために使用した。全長ヒトＥＧＦＲをフォワードプライマーＥＧＦＲ−Ｆ（ＡＴＴＣＴＣＧＡＧＣＧＧＧＧＡＧＣＡＧＣＧＡＴＧ）およびリバースプライマーＥＧＦＲ−Ｒ（ＣＣＴＡＡＧＣＴＴＴＧＣＴＣＣＡＡＴＡＡＡＴＴＣＡＣＴＧ）を用いて増幅した。ＤＮＡ断片をＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、ｐＲＫ５ベクターの対応部位にクローニングした。細胞外ドメイン欠失のあるＥＧＦＲ（Δ細胞外、１〜６４４ａａ）をクローニングするためのプライマーは、Δ細胞外−Ｆ：ＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＴＣＣＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＧＡＴＧおよびΔ細胞外−Ｒ：ＣＣＴＡＡＧＣＴＴＴＧＣＴＣＣＡＡＴＡＡＡＴＴＣＡＣＴＧＣであり；細胞内欠失（Δ細胞内、６７１〜１２１０ａａ）用のプライマーは、Δ細胞内−Ｆ：ＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＧＡＣＣＣＴＣＣＧＧＧＡＣＧＧＣおよびΔ細胞内−Ｒ：ＣＣＴＡＡＧＣＴＴＣＣＴＴＣＧＣＡＴＧＡＡＧＡＧＧＣＣであり；自己リン酸化ドメイン欠失（Δ自己リン酸化、９７８〜１２１０ａａ）用のプライマーは、Δ自己リン酸化−Ｆ：ＡＴＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＴＣＣＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＧＡＴＧおよびΔ自己リン酸化−Ｒ：ＣＣＴＡＡＧＣＴＴＧＴＡＧＣＧＣＴＧＧＧＧＧＴＣＴＣＧＧであり；細胞内ドメイン欠失（６４５〜１２１０ａａ）用プライマーは、Δ細胞内ａ−Ｆ：ＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＧＡＣＣＣＴＣＣＧＧＧＡＣＧＧＣおよびΔ細胞内−Ｒ：ＣＣＴＡＡＧＣＴＴＣＣＴＴＣＧＣＡＴＧＡＡＧＡＧＧＣである。ＥＧＦＲのキナーゼ失活型変異体（ＫＤ−ＥＧＦＲ、Ｒ８１７Ｍ）、膜貫通ドメイン欠失（ΔＴＭ、６４５〜６７０ａａ）およびチロシンキナーゼドメイン欠失（ΔＴＫ、６７０〜９７７ａａ）プラスミドは、製造業者のプロトコールに従って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＬｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＣＡ）を使用した部位特異的突然変異誘発法によってｐＲＫ５−ＷＴ−ＥＧＦＲ−ＨＡから構築された。プライマーは、ＫＤ−ＥＧＦＲ−Ｆ：ＧＣＡＣＣＧＣＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＡＴＧＡＡＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＣＡＣＣおよびＫＤ−ＥＧＦＲ−Ｒ：ＧＧＴＧＴＴＴＴＣＡＣＣＡＧＴＡＣＧＴＴＣＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＴＣＧＣＧＧＴＧＣ；ΔＴＭ−Ｆ：ＣＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＣＴＡＣＣＧＧＡＣＴＣＣＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣおよびΔＴＭ−Ｒ：ＣＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＣＴＡＣＣＧＧＡＣＴＣＣＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣ；ΔＴＫ−Ｆ：ＣＧＣＴＧＣＧＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＴＡＣＣＴＴＧＴＣＡＴＴＣＡＧＧＧＧＧおよびΔＴＫ−Ｒ：ＣＣＣＣＣＴＧＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＧであった。構築物のすべては、Ｃ末端ＨＡタグを有する融合タンパク質を生じさせた。すべてのプラスミドを配列決定によって確認した。

一過性トランスフェクションおよび免疫沈降。ｆｌａｇ付きＳＧＬＴ１単独を発現するプラスミドまたは示されるＨＡタグ付きＥＧＦＲ構築物をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を１×リン酸緩衝液中で洗浄し、プロテアーゼインヒビターカクテルを補足したＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１．０％のＩｇｅｐａｌＣＡ−６３０（ＮＰ−４０）、０．５％デオキシコール酸ナトリウムおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）を用いて６時間、４℃にて振とう機上で溶解した。次に、細胞溶解物を２分間、１２０００×ｒｐｍで遠心分離した。その後、抗ｆｌａｇ抗体または抗ＳＧＬＴ１抗体とコンジュゲートしたセファロースプロテインＡ／Ｇビーズとともに上清を４℃で一晩インキュベートした。続いて、試料を遠心分離し、ＲＩＰＡ緩衝液で３回洗浄し、その後、レムリ緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｅｂｕｆｆｅｒ）（Ｂｉｏｒａｄ、ＣＡ）中で煮沸し、ウェスタンブロット分析に供した。ＥＧＦＲ−ＳＧＬＴ１相互作用におけるＥＧＦＲのチロシンキナーゼの役割を決定するために、ＳＧＬＴ１および野生型ＥＧＦＲをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。１８時間後、細胞を無血清培地中で６時間、飢餓状態にし、その後、３０〜６０分間、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＥＧＦ＋ＡＥＥ７８８（５μＭ）で処理した。対照細胞を等体積のビヒクルのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で処理した。次に、上記のように、細胞溶解物を免疫沈降に供した。

ウェスタンブロット分析。ウェスタンブロット（ＷＢ）分析に関して、細胞をＲＩＰＡ緩衝液（Ｈ_２Ｏ中の１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１％ＳＤＳ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、２０μｇ／ｍｌのアプロチニン、２０μｇ／ｍｌのロイペプチン、２０μｇ／ｍｌのペプスタチン、１％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ_３ＶＯ_４）で溶解した。８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、続いて、５％脱脂粉乳でブロッキングし、次に、最適化濃度の一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。膜を０．１％ＴＢＳ／Ｔ（１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて各回５分間、３回洗浄し、その後、二次抗体とともに室温で１時間インキュベーションを行った。シグナルを増強化学発光によって可視化した。

免疫蛍光共染色。ＳＧＬＴ１とＥＧＦＲの免疫蛍光共染色に関して、前立腺がん組織アレイのスライドを脱パラフィン化および再水和し、その後、抗原を煮沸クエン酸緩衝液中で１０分間回復させた。次に、冷却した組織スライドをブロッキング溶液（ＰＢＳ中の５％ロバ血清）中で１時間室温にてインキュベートし、その後、１０％ロバ血清を含有するＰＢＳ中でＳＧＬＴ１（ＳＧＬＴ１−ＩＨＣ）（１：２００希釈）およびＣ２２５（１：２００）に対するウサギポリクローナル抗体とともに４℃で一晩インキュベートした（ＢｌｅｓｓｉｎｇＡら、Ｓｏｄｉｕｍ／ＧｌｕｃｏｓｅＣｏ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ
１ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＩｎｃｒｅａｓｅｓｉｎＨｕｍａｎＤｉｓｅａｓｅｄＰｒｏｓｔａｔｅ、Ｊ．ＣａｎｃｅｒＳｃｉ．Ｔｈｅｒ．、４巻（９号）：３０６〜３１２頁（２０１２年））。ＰＢＳで３回洗浄後、組織を、１０％ロバ血清を含有するＰＢＳに溶解させた、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲート化ロバ抗ウサギＩｇＧとＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４コンジュゲート化ロバ抗マウスＩｇＧの混合物とともに室温で３０分間インキュベートした。次に、染色した試料を室温にてＰＢＳで３回（洗浄１回あたり５分間）洗浄した。蛍光画像を共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で撮像し、分析した。細胞核を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。

細胞増殖アッセイ。細胞増殖は、製造業者によって提供されたプロトコールに従って、９６ウェルプレート中で３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイによって決定された。簡単に言えば、１００μＬの培地に懸濁させた５０００個の細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。２日目に、フロリジン（Ｐｈｌｏｚｉｄｉｎ）（５０μＭ）とＥＧＦＲインヒビター（イレッサ：２０μＭ；エルロチニブ：２０μＭ）を含有する培地で培地を交換した。薬物とともに２４時間または４８時間のインキュベーション後、１０μＬのＭＴＴ試薬を各ウェルに添加し、４時間インキュベートした。培地を除去後、細胞内のホルマザン沈殿物を１００μＬのＤＭＳＯに溶解した。吸光度を５７０ｎｍにてＭｕｌｔｉＳｋａｎプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＣ）で測定した。各群内の試料の３点を使用した。細胞生存率をトリパンブルー取り込みアッセイによって決定した。生細胞の割合を３点の１０×倍率下でランダムに選択されたエリア（各サンプルについてｎ＝３）において計数した。

統計分析。ステューデントｔ検定を使用して、ＳＧＬＴ１インヒビターの存在／非存在下でのＥＧＦＲインヒビターで処理された細胞の増殖の差異を評価した。０．０５未満であるＰ値を統計的有意性を有するものとして定義した。

Claims

本明細書に記載の発明。