JP2018042472A - Methods for directly amplifying nucleic acid from biological sample solutions - Google Patents

Methods for directly amplifying nucleic acid from biological sample solutions Download PDF

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寛一郎 永友
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for reducing the influence of inhibitors of nucleic acid amplification in a biological sample solutions thereby enabling stable gene analysis in a method for directly amplifying nucleic acid from biological sample solutions.SOLUTION: Disclosed herein is a method for directly amplifying a nucleic acid from a biological sample solution where gelatin coexists at a concentration preferably higher than 0.01% in the solution. In some embodiments, the nucleic acid is amplified by PCR or RT-PCR.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、生体試料溶解液から、直接核酸増幅を行う際の核酸増幅を改善する方法に関する。 The present invention relates to a method for improving nucleic acid amplification when performing direct nucleic acid amplification from a biological sample lysate.

遺伝子工学分野の進歩により、細胞や組織等の生体試料からＤＮＡやＲＮＡといった核酸を抽出し、遺伝子解析を行うことが容易になった。
遺伝子解析法は現在までに様々な方法が開発されており、特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）法などの核酸増幅法が比較的一般に普及している。ＰＣＲでは、近年、測定感度の高さや迅速性から、増幅産物の生成過程を経時的にモニタリングすることが可能なリアルタイムＰＣＲ（以下「ｑＰＣＲ」と略す）が広く実施される。 Advances in the field of genetic engineering have made it easier to extract nucleic acids such as DNA and RNA from biological samples such as cells and tissues and perform genetic analysis.
Various gene analysis methods have been developed so far, and in particular, nucleic acid amplification methods such as the polymerase chain reaction (PCR) method are relatively widespread. In PCR, in recent years, real-time PCR (hereinafter abbreviated as “qPCR”) capable of monitoring the production process of an amplification product over time due to high measurement sensitivity and rapidity has been widely implemented.

核酸増幅法において、生体試料に由来するタンパク質等の物質が核酸増幅を阻害することから、一般的に生体試料から抽出・精製された核酸が用いられる。しかし、生体試料から核酸を抽出・精製する作業は煩雑で時間を要するため、ＨＴＳ(Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ)など、大量サンプルの遺伝子解析を行う場合、抽出・精製作業を省略する方法が知られている(特許文献１および２)。 In nucleic acid amplification methods, nucleic acids extracted and purified from biological samples are generally used because substances such as proteins derived from biological samples inhibit nucleic acid amplification. However, since the operation of extracting and purifying nucleic acid from a biological sample is complicated and time-consuming, a method of omitting the extraction and purification work is known when performing gene analysis of a large amount of sample such as HTS (High Throughput Screening). (Patent Documents 1 and 2).

特許文献１では、カオトロピック剤を含む生体試料処理液を用いることで、抽出精製することなく、ＲＴ−ＰＣＲを行う方法が記載されている。 Patent Document 1 describes a method of performing RT-PCR without extraction and purification by using a biological sample processing solution containing a chaotropic agent.

特許文献２には、ジメチルスルホキシドおよび界面活性剤を含有するｐＨ２．５〜５．０の水溶液からなる生体試料処理液を用いることで阻害物質の影響を低減させて標的核酸を増幅する方法が記載されている。 Patent Document 2 describes a method of amplifying a target nucleic acid by reducing the influence of an inhibitory substance by using a biological sample treatment solution comprising an aqueous solution of pH 2.5 to 5.0 containing dimethyl sulfoxide and a surfactant. Has been.

しかし、上述の方法では、いずれにおいても、阻害物質の影響低減が不十分な場合や、ＲＮＡを検出する際に必要なゲノム除去処理の妨げとなる場合があり、阻害物質の影響を軽減する新規な方法が必要である。 However, in any of the above-described methods, there is a case where the effect of the inhibitor is insufficiently reduced, or the genome removal process necessary for detecting RNA may be hindered. Is necessary.

特許第５３６７０７８号公報Japanese Patent No. 5367078 特許第４７１９４５５号公報Japanese Patent No. 4719455

本発明の目的は、培養細胞や組織等の生体試料に由来する核酸成分を抽出精製することなく直接核酸増幅を行う方法において、核酸増幅時の阻害物質の影響を低減することができる生体試料処理液およびこの生体試料処理液を用いた核酸増幅方法を提供することである。 An object of the present invention is a biological sample treatment capable of reducing the influence of an inhibitor during nucleic acid amplification in a method of directly performing nucleic acid amplification without extracting and purifying nucleic acid components derived from biological samples such as cultured cells and tissues. And a nucleic acid amplification method using the biological sample processing solution.

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ゼラチンを生体試料溶解液に共存させることで、核酸増幅時の阻害を低減させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that the inhibition during nucleic acid amplification can be reduced by allowing gelatin to coexist in a biological sample solution, and the present invention has been completed. I came to let you.

すなわち、本発明は以下の構成からなる。
項１．生体試料溶解液中に、ゼラチンを共存させることを特徴とする生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。
項２．ゼラチンを０．０１％より高い濃度で共存させることを特徴とする項１に記載の生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。
項３．核酸増幅方法がＰＣＲ法またはＲＴ-ＰＣＲ法である項１または２に記載の生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。
項４．ＰＣＲ法またはＲＴ-ＰＣＲ法がリアルタイムＰＣＲである項３に記載の生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。
項５．核酸増幅に１ステップＲＴ−リアルタイムＰＣＲ試薬を用いる項４に記載の生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。 That is, the present invention has the following configuration.
Item 1. A method for directly amplifying a nucleic acid from a biological sample lysate, wherein gelatin is allowed to coexist in the lysate of a biological sample.
Item 2. Item 2. The method for directly amplifying nucleic acid from a biological sample lysate according to Item 1, wherein gelatin is allowed to coexist at a concentration higher than 0.01%.
Item 3. Item 3. A method for directly amplifying a nucleic acid from a biological sample lysate according to Item 1 or 2, wherein the nucleic acid amplification method is a PCR method or an RT-PCR method.
Item 4. Item 4. The method for directly amplifying a nucleic acid from a biological sample lysate according to Item 3, wherein the PCR method or the RT-PCR method is real-time PCR.
Item 5. Item 5. A method for directly amplifying a nucleic acid from a biological sample lysate according to Item 4, wherein a one-step RT-real time PCR reagent is used for nucleic acid amplification.

本発明により、生体試料溶解液から直接核酸増幅する方法において、検出手順などの条件を変えることや、特殊な前処理を行うことなく、極めて簡単に核酸増幅阻害物質の影響を軽減し、安定した核酸増幅が可能となる。 According to the present invention, in a method of directly amplifying nucleic acid from a biological sample lysate, the influence of a nucleic acid amplification inhibitor can be reduced very easily and stably without changing conditions such as a detection procedure or performing a special pretreatment. Nucleic acid amplification becomes possible.

実施例１における、ｑＰＣＲの増幅曲線を示した図（ゼラチンの含有の有無における対比）である。FIG. 3 is a diagram showing a qPCR amplification curve in Example 1 (comparison with and without gelatin). 実施例１における、ｑＰＣＲの増幅曲線を示した図（ゼラチン濃度における対比）である。FIG. 3 is a diagram showing the amplification curve of qPCR in Example 1 (contrast with gelatin concentration).

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の実施形態の一つは、生体試料溶解液からの直接核酸増幅法であって、生体試料溶解液にゼラチンを共存させる方法である。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
One embodiment of the present invention is a direct nucleic acid amplification method from a biological sample lysate, in which gelatin is coexistent in the biological sample lysate.

（標的核酸）
本発明において、標的となる核酸は特に限定されず、後述する生体試料由来のＲＮＡやＤＮＡが挙げられる。 (Target nucleic acid)
In the present invention, the target nucleic acid is not particularly limited, and examples thereof include RNA and DNA derived from biological samples described later.

（核酸増幅法）
本発明における「核酸増幅法」は、核酸を増幅する方法であれば特に限定されないが、例えば、ＰＣＲ法、ＲＴ-ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が挙げられる。ＰＣＲ法またはＲＴ-ＰＣＲ法が、ｑＰＣＲであることがより好ましい。また、ＲＴ-ＰＣＲ法の場合は、１ステップＲＴ-ＰＣＲ法であることが特に好ましい。更には、これに限らず、例えば、Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｒｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＴＲＣ）法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＮＡＳＢＡ）法なども挙げることができる。 (Nucleic acid amplification method)
The “nucleic acid amplification method” in the present invention is not particularly limited as long as it is a method for amplifying a nucleic acid, and examples thereof include a PCR method and an RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) method. The PCR method or RT-PCR method is more preferably qPCR. In the case of the RT-PCR method, the one-step RT-PCR method is particularly preferable. Furthermore, the present invention is not limited to this, and, for example, the Loop-Mediated Isamplification (LAMP) method, the Transcribation Reverse Transformed Reaction Reaction (TRC) method, and the Nucleic Acid SequeAceSequence Method can be used.

（生体試料）
本発明において、生体試料とは、生物に由来する試料であれば特に限定されないが、例えばヒトや動物から採取した組織や培養した細胞、血液などの体液などが挙げられる。また、植物や微生物等に由来する試料も挙げられる。 (Biological sample)
In the present invention, the biological sample is not particularly limited as long as it is a sample derived from a living organism, and examples thereof include tissues collected from humans and animals, cultured cells, and body fluids such as blood. Moreover, the sample derived from a plant, microorganisms, etc. is also mentioned.

（生体試料溶解液）
生体試料と生体試料処理液を混合して得られる生体試料溶解液が核酸増幅の鋳型となる核酸を含有する。生体試料溶解液は、核酸増幅反応液と混合して核酸増幅に使用される。ここで、生体試料処理液とは、細胞を溶解する液であり、溶解するために含有しうる成分としては水、界面活性剤、カオトロピック塩、あるいは有機溶媒などが挙げられる。生体試料と生体試料処理液とを混合する際の条件としては、例えば、４℃から３０℃の温度で、１から６０分間処理することが好ましい。 (Biological sample solution)
A biological sample lysate obtained by mixing a biological sample and a biological sample treatment solution contains a nucleic acid that serves as a template for nucleic acid amplification. The biological sample lysate is mixed with a nucleic acid amplification reaction solution and used for nucleic acid amplification. Here, the biological sample treatment solution is a solution for lysing cells, and examples of components that can be contained for lysis include water, surfactants, chaotropic salts, and organic solvents. As a condition for mixing the biological sample and the biological sample treatment liquid, for example, it is preferable to perform the treatment at a temperature of 4 ° C. to 30 ° C. for 1 to 60 minutes.

（直接核酸増幅方法）
本発明における「直接核酸増幅方法」とは、生体試料溶解液から標的核酸を抽出精製することなく核酸を増幅する方法であれば、特に限定されない。例えば、標的核酸がＤＮＡである場合は、核酸増幅反応液と生体試料溶解液を混合すればよい。標的核酸がＲＮＡである場合は、核酸増幅反応の前に、逆転写反応試薬と生体試料溶解液を混合して作成したｃＤＮＡを核酸増幅反応液と混合してもよいし、逆転写試薬を含有する核酸増幅反応液と生体試料溶解液を混合してもよい。逆転写試薬を含有する核酸増幅反応液としては、例えば１ステップＲＴ−ＰＣＲ試薬が挙げられる。 (Direct nucleic acid amplification method)
The “direct nucleic acid amplification method” in the present invention is not particularly limited as long as it is a method for amplifying a nucleic acid without extracting and purifying a target nucleic acid from a biological sample lysate. For example, when the target nucleic acid is DNA, a nucleic acid amplification reaction solution and a biological sample solution may be mixed. When the target nucleic acid is RNA, the cDNA prepared by mixing the reverse transcription reaction reagent and the biological sample lysate may be mixed with the nucleic acid amplification reaction solution before the nucleic acid amplification reaction or contains the reverse transcription reagent. The nucleic acid amplification reaction solution and the biological sample solution may be mixed. Examples of the nucleic acid amplification reaction solution containing a reverse transcription reagent include a one-step RT-PCR reagent.

（核酸増幅反応液）
本発明における「核酸増幅反応液」は、核酸増幅反応を実行するのに必要な成分（物質）が揃っていれば、特に限定されない。一般に、核酸のハイブリダイゼーションに必要な金属イオンを含んでいることが好ましい。核酸増幅法がｑＰＣＲである場合は、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸等の基質を含んでおり、さらに金属イオンも含んでいればより好ましい。 (Nucleic acid amplification reaction solution)
The “nucleic acid amplification reaction solution” in the present invention is not particularly limited as long as components (substances) necessary for performing the nucleic acid amplification reaction are prepared. In general, it preferably contains a metal ion necessary for nucleic acid hybridization. When the nucleic acid amplification method is qPCR, it preferably contains a substrate such as a primer, DNA polymerase, deoxynucleoside triphosphate, etc., and further contains a metal ion.

（阻害物質）
本発明において「阻害物質」とは、核酸増幅反応を阻害する物質全般をいうものであり、例えば、生体試料や生体試料処理液に含まれるプロテアーゼ等のタンパク質、脂質等が挙げられる。生体試料溶解液が阻害物質を含有すると核酸増幅反応は阻害される。 (Inhibitor)
In the present invention, the “inhibiting substance” refers to all substances that inhibit the nucleic acid amplification reaction, and examples thereof include proteins such as proteases and lipids contained in biological samples and biological sample treatment solutions. When the biological sample lysate contains an inhibitor, the nucleic acid amplification reaction is inhibited.

（本発明の効果）
本発明においては、生体試料溶解液から直接核酸増幅を行う場合において、生体試料溶解液にゼラチンを共存させることにより、核酸増幅反応における阻害物質の影響を軽減することができることを特徴とする。 (Effect of the present invention)
In the present invention, when nucleic acid amplification is performed directly from a biological sample lysate, the influence of an inhibitory substance in the nucleic acid amplification reaction can be reduced by allowing gelatin to coexist in the biological sample lysate.

（増幅の改善）
本発明において「増幅の改善」の程度は、ｑＰＣＲでのＣｔ値を比較することで定量的に確認することができる。また、本発明における「増幅の改善」とは、検出できなかったＣｔ値が検出できるようになるか、あるいはＣｔ値が小さくなった場合を言う。 (Improvement of amplification)
In the present invention, the degree of “improvement of amplification” can be quantitatively confirmed by comparing Ct values in qPCR. Further, “improvement of amplification” in the present invention means a case where a Ct value that could not be detected can be detected or the Ct value becomes small.

本発明者らは、上述の通り、ＰＣＲ法を例にとって検討を行い、生体試料溶解液にゼラチンを共存させることで、阻害物質の影響を軽減できることを見出した。 As described above, the present inventors have studied using the PCR method as an example, and found that the influence of an inhibitory substance can be reduced by making gelatin coexist in a biological sample solution.

（生体試料溶解液にゼラチンを共存させる方法）
本発明において、生体試料溶解液にゼラチンを共存させる方法は特に限定されない。
例えば、ゼラチンを、生体試料処理液にあらかじめ加えておいても良いし、あるいは生体試料と共に生体試料処理液に加えても良い。あるいは、生体試料を含む生体試料溶解液に加えてもよい。また、生体試料処理液が、例えば、核酸検出キット等の形態の場合において、反応開始前にいくつかの組成に分割されていて、反応時に混合して用いるように構成されている場合は、その分割されている各組成物の少なくともいずれか１つの中に加えておけばよい。 (Method to make gelatin coexist in biological sample solution)
In the present invention, the method for allowing gelatin to coexist in the biological sample solution is not particularly limited.
For example, gelatin may be added in advance to the biological sample processing solution, or may be added to the biological sample processing solution together with the biological sample. Or you may add to the biological sample solution containing a biological sample. In addition, when the biological sample treatment liquid is, for example, in the form of a nucleic acid detection kit, etc., it is divided into several compositions before starting the reaction, What is necessary is just to add in at least any one of each composition divided | segmented.

本発明において、ゼラチンの生体試料溶解液中における濃度は、０．０１％より高く、１０％以下であることが好ましく、より好ましくは０．０３から０．５％であり、さらに好ましくは０．０５から０．１％である。また本発明において、ゼラチンの由来は特に限定されない。例えば豚、牛、魚の組織から抽出したものが挙げられる。   In the present invention, the concentration of gelatin in the biological sample solution is preferably higher than 0.01% and not higher than 10%, more preferably 0.03 to 0.5%, still more preferably 0.00. 05 to 0.1%. In the present invention, the origin of gelatin is not particularly limited. Examples include those extracted from pig, cow, and fish tissues.

本発明により、簡便かつ効果的に生体試料溶解液中の阻害物質の影響を軽減することが可能になり、従来技術と比べて顕著に優れた効果を示す。   According to the present invention, it is possible to easily and effectively reduce the influence of an inhibitory substance in a biological sample lysate, and the effect is remarkably superior to that of the prior art.

以下、実施例に基づき、本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は実施例により特に限定されるものではない。 Hereinafter, based on an Example, this invention is demonstrated more concretely. However, the present invention is not particularly limited by the examples.

実施例１：ゼラチンによる阻害物質の影響軽減効果
生体試料処理液にゼラチンを加えることによる阻害物質の影響を軽減する効果を確認する目的で、ｑＰＣＲを用いて解析を行った。
サンプルは、Ｋ５６２細胞（ヒト慢性骨髄性白血病由来の細胞）１０３ｃｅｌｌｓ、あるいはＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来の細胞）１０３ ｃｅｌｌｓを用いた。細胞の溶解には、ＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（東洋紡株式会社）を用いた。この際、Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｑＰＣＲのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに、ゼラチン（シグマ アルドリッチ株式会社）濃度が０％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．１５％、０．１７％、０．２％になるように調製した。その他の手順は取扱説明書に従って行った。 Example 1: Effect of reducing the influence of an inhibitory substance by gelatin In order to confirm the effect of reducing the influence of an inhibitory substance by adding gelatin to a biological sample treatment solution, analysis was performed using qPCR.
As a sample, K562 cells (cells derived from human chronic myeloid leukemia) 10 3 cells or HeLa cells (cells derived from human cervical cancer) 10 3 cells were used. For cell lysis, SuperPrep (registered trademark) Cell Lysis for qPCR (Toyobo Co., Ltd.) was used. At this time, the concentration of gelatin (Sigma Aldrich Co.) is 0%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.17%, 0 in the Lysis buffer of Cell Lysis for qPCR. Prepared to 2%. Other procedures were performed according to the instruction manual.

ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標） Ｐｒｏｂｅ Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（東洋紡株式会社）を用いて２０μＬの反応液をそれぞれ調製した。２０μＬの反応系に、鋳型としてＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｑＰＣＲを用いて処理した生体試料溶解液を２μＬ用いた。プライマー・プローブは、ＴｆＲ (Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ)遺伝子をターゲットとするＨｕｍａｎ ＴＦＲＣ（ＣＤ７１） (Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ) Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ （ＶＩＣ(登録商標)／ＴＡＭＲＡ ｐｒｏｂｅ, ｐｒｉｍｅｒ ｌｉｍｉｔｅｄ) Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ：４３１０８９２Ｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）（以下「ＴｆＲ」と略す）、あるいはＡＣＴＢ (β―ａｃｔｉｎ)遺伝子をターゲットとするＨｕｍａｎ ＡＣＴＢ（Ｂｅｔａ Ａｃｔｉｎ） Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ （ＶＩＣ(登録商標)／ＴＡＭＲＡ ｐｒｏｂｅ, ｐｒｉｍｅｒ ｌｉｍｉｔｅｄ) Ｐａｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ：４３１０８８１Ｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）（以下「ＡＣＴＢ」と略す）を用いた。本製品は、２０倍濃度のプライマー・プローブ混合液である。反応は５０℃、１０分の逆転写反応、９５℃、１分の前反応の後、「９５℃、１５秒→６０℃、４５秒」を４０サイクル繰り返すスケジュールでリアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）を用いて行った。 20 μL of each reaction solution was prepared using THUNDERBIRD (registered trademark) Probe One-step qRT-PCR Kit (Toyobo Co., Ltd.). In a reaction system of 20 μL, 2 μL of a biological sample lysate treated using Cell Lysis for qPCR as a template was used. The primer probe is a Human TFRC (CD71) (Transferrin Receptor) Endogenous Control (VIC (registered trademark) / TAMRA probe, Primer). (Hereinafter abbreviated as “TfR”), or Human ACTB (Beta Actin) Endogenous Control (VIC (registered trademark) / TAMRA probe, primer limited) Part 108 Fisher Scientific Cook Co., Ltd.) (hereinafter abbreviated as “ACTB”). This product is a 20 times concentrated primer / probe mixture. The reaction was performed at 50 ° C., 10 minutes reverse transcription reaction, 95 ° C., 1 minute pre-reaction, then “95 ° C., 15 seconds → 60 ° C., 45 seconds” with a schedule of repeating 40 cycles in real time PCR device (Applied Biosystems 7500 Fast Real-time PCR system).

（ゼラチンの効果）
Ｋ５６２細胞、プライマー・プローブＴｆＲを使用したｑＰＣＲにより得られた増幅曲線を、図１に示した。図中の番号は、以下に示す通りである。
１：ゼラチン０％（Ｃｔ２７．８、２７．８）
２：ゼラチン０．１７％（Ｃｔ２６．９、２７．２） (Effect of gelatin)
An amplification curve obtained by qPCR using K562 cells and the primer / probe TfR is shown in FIG. The numbers in the figure are as shown below.
1: Gelatin 0% (Ct 27.8, 27.8)
2: Gelatin 0.17% (Ct 26.9, 27.2)

その結果、ゼラチン含有していないコントロールと比較して、ゼラチンを含有する場合には、Ｃｔ値の改善がみられた（図１）。 As a result, an improvement in the Ct value was observed when gelatin was contained as compared to the control without gelatin (FIG. 1).

ＨｅＬａ細胞、プライマー・プローブＡＣＴＢを使用したｑＰＣＲにより得られた増幅曲線を、図２に示した。図中の番号は、以下に示す通りである。
１：ゼラチン０％（Ｃｔ測定不可、Ｃｔ測定不可）
２：ゼラチン０．０１％（Ｃｔ測定不可、Ｃｔ測定不可）
３：ゼラチン０．０５％（Ｃｔ２１．０、２４．９）
４：ゼラチン０．１％（Ｃｔ２４．０、２５．０）
５：ゼラチン０．１５％（Ｃｔ２５．０、２８．５）
６：ゼラチン０．２％（Ｃｔ２５．０、Ｃｔ測定不可） An amplification curve obtained by qPCR using HeLa cells and primer / probe ACTB is shown in FIG. The numbers in the figure are as shown below.
1: Gelatin 0% (Ct measurement impossible, Ct measurement impossible)
2: Gelatin 0.01% (Ct measurement impossible, Ct measurement impossible)
3: Gelatin 0.05% (Ct 21.0, 24.9)
4: Gelatin 0.1% (Ct 24.0, 25.0)
5: Gelatin 0.15% (Ct 25.0, 28.5)
6: Gelatin 0.2% (Ct 25.0, Ct measurement not possible)

その結果、ゼラチンを含有していないコントロールでは、Ｃｔ値が検出できなかった。一方、ゼラチンを０．０１％より高い濃度で含有した場合には、Ｃｔ値を検出することができた。特に、ゼラチンを０．１％含有した場合に、Ｃｔ値の顕著な改善がみられた。（図２）。これは、ゼラチンが生体試料溶解液中の阻害物質の影響を軽減したためと考えられる。 As a result, the Ct value could not be detected in the control containing no gelatin. On the other hand, when gelatin was contained at a concentration higher than 0.01%, the Ct value could be detected. In particular, when 0.1% of gelatin was contained, the Ct value was markedly improved. (FIG. 2). This is considered to be because gelatin reduced the influence of the inhibitory substance in the biological sample solution.

本発明は、生体試料溶解液から直接核酸増幅を行う場合において効果的に働く。これにより、プロテアーゼ等の阻害物質の影響を軽減して、安定したデータ収集を可能にする。本発明は、核酸増幅阻害物質を含有する生体試料溶解液を用いて遺伝子発現解析を行う場合に特に有用であり、研究用途のみならず臨床診断や環境検査等にも利用できる。 The present invention works effectively when nucleic acid amplification is performed directly from a biological sample lysate. This reduces the influence of inhibitors such as proteases and enables stable data collection. The present invention is particularly useful when gene expression analysis is performed using a biological sample lysate containing a nucleic acid amplification inhibitor, and can be used not only for research purposes but also for clinical diagnosis and environmental testing.

Claims (5)

生体試料溶解液中に、ゼラチンを共存させることを特徴とする生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。 A method for directly amplifying a nucleic acid from a biological sample lysate, wherein gelatin is allowed to coexist in the lysate of a biological sample. ゼラチンを０．０１％より高い濃度で共存させることを特徴とする請求項１に記載の生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。 The method for directly amplifying nucleic acid from a biological sample lysate according to claim 1, wherein gelatin is allowed to coexist at a concentration higher than 0.01%. 核酸増幅方法がＰＣＲ法またはＲＴ-ＰＣＲ法である請求項１または２に記載の生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。 The method for directly amplifying a nucleic acid from a biological sample lysate according to claim 1 or 2, wherein the nucleic acid amplification method is a PCR method or an RT-PCR method. ＰＣＲ法またはＲＴ-ＰＣＲ法がリアルタイムＰＣＲである請求項３に記載の生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。 The method for directly amplifying a nucleic acid from a biological sample lysate according to claim 3, wherein the PCR method or the RT-PCR method is real-time PCR. 核酸増幅に１ステップＲＴ−リアルタイムＰＣＲ試薬を用いる請求項４に記載の生体試料溶解液からの直接核酸増幅方法。 The method for directly amplifying a nucleic acid from a biological sample lysate according to claim 4, wherein a one-step RT-real-time PCR reagent is used for nucleic acid amplification.
JP2016177520A 2016-09-12 2016-09-12 Methods for directly amplifying nucleic acid from biological sample solutions Pending JP2018042472A (en)

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