JP2018039824A - 網膜中および／または網膜下における液体貯留の処置のための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】網膜中および／または網膜下における液体貯留の処置のための方法および組成物の提供。
【解決手段】中心性漿液性網脈絡膜症に関連する網膜中及び/又は網膜下における液体貯留の処置における使用のための、ミネラルコルチコイドレセプター遺伝子発現インヒビターを含む、医薬組成物。さらに、グルココルチコイドを含み、ミネラルコルチコイドレセプター遺伝子発現インヒビターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡである医薬組成物。
【選択図】なし

Description

発明の分野：
本発明は、網膜中および／または網膜下における液体貯留の処置のための方法および組成物を提供する。

発明の背景：
イオンチャネルおよびアクアポリンは、網膜細胞においてディファレンシャルに発現しており、網膜の水分補給（hydration）を適切にコントロールするために極めて重大なイオンおよび水の移動に重要な役割を果たす。

これまでに同定されたＡＱＰタンパク質ファミリーのアイソフォームの中で、少なくとも４種のＡＱＰ、すなわちＡＱＰ０、ＡＱＰ１、ＡＱＰ４およびＡＱＰ９が、神経網膜に発現されていることが見出されている。ＡＱＰ０は、双極細胞、アマクリン細胞および網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の亜集団に発現している（I. Iandiev, T. Pannicke, W. Haertig, J. Grosche, P. Wiedemann, A. Reichenbach and A. Bringmann, Localization of aquaporin-0 immunoreactivity in the rat retina, Neurosci. Lett. 426 (2007), pp. 81-86）。ＡＱＰ１は、普通、網膜外層での光受容器および異なるアマクリン細胞において発現し（I. Iandiev, T. Pannicke, M.B. Reichel, P. Wiedemann, A. Reichenbach and A. Bringmann, Expression of aquaporin-1 immunoreactivity by photoreceptor cells in the mouse retina, Neurosci. Lett. 388 (2005), pp. 96-99）、一方ＡＱＰ４は、主に、網膜内層でのミュラー細胞の血管周囲および硝子体側のエンドフィートならびにアストログリア細胞において発現している（M.J. Goodyear, S.G. Crewther and B.M. Junghans, A role for aquaporin-4 in fluid regulation in the inner retina, Vis. Neurosci. 26 (2009), pp. 159-165）。

網膜における主にＡＱＰ４、およびまたＡＱＰ１のグリア発現の量および／または配置の変化が、網膜中および／または網膜下における液体貯留につながることが実証されている。ＡＱＰ１およびＡＱＰ４は、実際、虚血／再潅流を含む多様な動物モデル疾患（I. Iandiev, T. Pannicke, B. Biedermann, P. Wiedemann, A. Reichenbach and A. Bringmann, Ischemia-reperfusion alters the immunolocalization of glial aquaporins in rat retina, Neurosci. Lett. 408 (2006), pp. 108-112）およびストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導糖尿病（I. Iandiev, T. Pannicke, B. Biedermann, A. Reichenbach, P. Wiedemann and A. Bringmann, Diabetes alters the localization of glial aquaporins in rat retina, Neurosci. Lett. 421 (2007), pp. 132-136）において変化していることが見出された。

例えば虚血後に、神経線維／神経節細胞層中の網膜グリア細胞は、ＡＱＰ１を強く発現した（I. Iandiev, T. Pannicke, B. Biedermann, P. Wiedemann, A. Reichenbach and A. Bringmann, Ischemia-reperfusion alters the immunolocalization of glial aquaporins in rat retina, Neurosci. Lett. 408 (2006), pp. 108-112）。さらに、表在性血管周囲の血管周囲染色は、対照網膜でのＡＱＰ４から虚血後網膜でのＡＱＰ１に切り替わった（I. Iandiev, T. Pannicke, B. Biedermann, P. Wiedemann, A. Reichenbach and A. Bringmann, Ischemia-reperfusion alters the immunolocalization of glial aquaporins in rat retina, Neurosci. Lett. 408 (2006), pp. 108-112）。データから、網膜におけるグリア細胞介在性水輸送が虚血後に特に表在性血管網で変化していることが示唆される。

糖尿病に関して、マイクロアレイ研究からＡＱＰ１およびＡＱＰ４の遺伝子発現が糖尿病ラットの網膜においてアップレギュレーションされていることが実証された（I. Iandiev, T. Pannicke, B. Biedermann, A. Reichenbach, P. Wiedemann and A. Bringmann, Diabetes alters the localization of glial aquaporins in rat retina, Neurosci. Lett. 421 (2007), pp. 132-136）。そのうえＡＱＰ１の免疫反応性は、ＳＴＺ誘導糖尿病ラットにおいて網膜最内層に位置するグリア細胞および表在性血管周囲のグリア細胞で高まった。血管周囲のＡＱＰ４発現は、報告によれば表在性血管網で減少したが、内顆粒層（ＩＮＬ）では不変であった（I. Iandiev, T. Pannicke, B. Biedermann, A. Reichenbach, P. Wiedemann and A. Bringmann, Diabetes alters the localization of glial aquaporins in rat retina, Neurosci. Lett. 421 (2007), pp. 132-136）。

さらに、ラットにおけるエンドトキシン誘導ぶどう膜炎（ＥＩＵ）が網膜でのＫｉｒ４．１およびＡＱＰ４の発現を変化させることが示されている（Liu XQ, Kobayashi H, Jin ZB, Wada A, Nao-I N. Differential expression of Kir4.1 and aquaporin 4 in the retina from endotoxin-induced uveitis rat. Mol Vis. 2007 1;13:309-17）。

網膜変性は、Ｋｉｒ４．１の誤局在およびＡＱＰ４の発現欠如を伴った（Yuan S, Zhang W, Ding J, Yao J, Jiang Q, Hu G. Increased sensitivity to retinal light damage in aquaporin-4 knockout mice. Exp Eye Res. 2009;89(1):119-22..）。最終的に、ミュラーグリア細胞が過剰な光に応答し、Ｋｉｒ４．１タンパク質およびアクアポリン−４タンパク質の配置が変化することが実証された（Localization of glial aquaporin-4 and Kir4.1 in the light-injured murine retina. Iandiev I, Pannicke T, Hollborn M, Wiedemann P, Reichenbach A, Grimm C, Reme CE, Bringmann A. Neurosci Lett. 2008;434(3):317-21）。

要約すると、液体ホメオスタシスの脱調節に関連する全ての網膜疾患モデルにおいて、ＡＱＰ４、ＡＱＰ１およびＫｉｒ４．１が過剰または過小発現、および誤局在していることが示された。

しかしながら、網膜における生理学的または病的水−イオン調節をレギュレーションしている分子メカニズムは、まだ探究されていない。

発明の概要：
本発明は、網膜中および／または網膜下における液体貯留を処置するための方法および組成物を提供する。

ＭＲ遺伝子に機能獲得型突然変異を担持し、ラット内因性コルチコステロイドであるアルドステロンまたはコルチコステロンの眼内注射を受けているブラウンノルウェーラットが、ＣＳＣＲに非常に近似した網膜病態を発生することを実証する。 ＭＲ遺伝子に機能獲得型突然変異を担持し、ラット内因性コルチコステロイドであるアルドステロンまたはコルチコステロンの眼内注射を受けているブラウンノルウェーラットが、ＣＳＣＲに非常に近似した網膜病態を発生することを実証する。 エプレレノンによって処置された患者の例を示す。 エプレレノンによって処置された患者の例を示す。 ８および１２ヶ月のＧＫラットに生じている網膜病態を示す。 ＧＫラットにおけるスピロノラクトン（硝子体中に最終的に１μM）の硝子体内注射の効果を示す。 処置前およびスピロノラクトンの最終注射の２４時間後に行ったＥＲＧを示す。 媒体で処置されたＧＫラットは、網膜外層に浮腫（黒矢印、左欄）および外顆粒層に浮腫（黄色矢印）を呈することを示す。

発明の詳細な説明：
本発明者らは、in vitro網膜ミュラーグリア細胞（ＲＭＧ）、ex vivoラット器官培養物およびin vivoラット網膜へのイオンチャネルおよびアクアポリンの発現調節に及ぼすＭＲ活性化の直接的な役割を評価した。その結果は、アルドステロンが網膜でのアクアポリン１、４およびＫｉｒ４．１の発現および／または分布をレギュレーションすることを示している。

より具体的には、本発明者らは、正常ラットにおいて低アルドステロン用量（１〜１０nM）に２４時間曝露後にすでにアクアポリン４（ＡＱＰ４）の発現が高まり、アクアポリン１の発現が減少することを実証した。より具体的には、アルドステロンの硝子体内注射は、網膜膨化（偽注射された眼に比べて２４％の増加）およびＲＭＧの強い活性化を誘導する。それは、ＲＭＧの頂端側微絨毛方向へのＫｉｒ４．１およびＡＱＰ４の追加的な誤配置を促進する。したがって、これらの結果は、神経網膜のミネラルコルチコイド感受性を際立たせ、アルドステロンがＲＭＧにおけるイオンチャネル／水チャネル発現のレギュレーションにより健康な網膜の水分補給をコントロールすることを示している。まとめると、これらの結果から、神経網膜、より具体的にはＲＭＧ細胞がアルドステロンおよび／またはＭＲの新規なターゲットであることが実証される。したがって、ホルモンおよびそのレセプターを健康な網膜のホメオスタシスおよび水分補給のレギュレーションでの新規な演じ手と見なすことができる。

したがって今回、本発明者らは、糖尿病網膜症などの代謝撹乱時に網膜組織のアルドステロン感受性が増加し、かつ／または血液網膜関門の崩壊が原因でアルドステロンが眼球に浸透し、その結果ＲＭＧ中のＡＱＰ４およびＫｉｒ４．１の発現および誤配置が高まり、網膜中および／または網膜下における液体貯留につながると考える。したがって、ＭＲアンタゴニストは、糖尿病網膜症などの代謝撹乱、または緑内障、虚血、近視、中心性漿液性網脈絡膜症、および滲出型加齢性黄斑変性において観察される、網膜中および／または網膜下における液体貯留の処置に有用でありうる。

本発明は、糖尿病網膜症、緑内障、虚血、近視、中心性漿液性網脈絡膜症、または滲出型加齢性黄斑変性に関連する網膜中および／または網膜下における液体貯留の処置に使用するためのミネラルコルチコイドレセプター（ＭＲ）アンタゴニストに関する。

本明細書に使用される「ミネラルコルチコイドレセプター」または「ＭＲ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ミネラルコルチコイドに対して高い親和性を有するレセプターである核内レセプターサブファミリー３、グループＣ、メンバー２（ＮＲ３Ｃ２）を表す。ミネラルコルチコイドレセプターは、アルドステロンレセプターとも呼ばれる。化合物のＭＲアンタゴニストまたはアゴニスト活性は、J, Souque A, Wurtz JM, Moras D, Rafestin-Oblin ME. Mol Endocrinol. 2000 Aug;14(8):1210-21; Fagart J, Seguin C, Pinon GM, Rafestin-Oblin ME. Mol Pharmacol. 2005 May;67(5):1714-22またはHellal-Levy C, Fagart J, Souque A, Wurtz JM, Moras D, Rafestin-Oblin ME. Mol Endocrinol. 2000 Aug;14(8):1210-21に記載されている様々な方法を用いて決定することができる。典型的には、ＣＯＳ細胞にヒトミネラルコルチコイドレセプターをルシフェラーゼ発現レポーター遺伝子と一緒にトランスフェクションすることで、候補化合物の存在下でそのトランス活性化活性を測定することが可能になる。

本発明に関連して、ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストは、好ましくはアンドロゲンレセプター、エストロゲンレセプター、グルココルチコイドレセプター、プロゲステロンレセプター、甲状腺ホルモンレセプター、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター、レチノイン酸レセプター、ファルネソイドＸレセプター、プレグナンＸレセプター、肝臓Ｘレセプター、ビタミンＤレセプター、レチノイドＸレセプターおよび構成的アンドロスタンレセプターなどの関連レセプターよりもミネラルコルチコイドレセプターに選択的である。「選択的」によって、ミネラルコルチコイドレセプターに対するアンタゴニストの親和性が、関連レセプターに対する親和性の少なくとも１０倍、好ましくは２５倍、より好ましくは１００倍、なお好ましくは５００倍であることが意味される。

一態様では、ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストは、低分子量アンタゴニスト、例えば小型有機分子である。「小型有機分子」という用語は、医薬品に一般に使用される有機分子に匹敵する大きさの分子を表す。この用語から生体高分子は除外される（例えばタンパク質、核酸など）。好ましい小型有機分子は、大きさが最大約５０００Da、より好ましくは最大２０００Da、最も好ましくは最大約１０００Daの範囲である。

典型的には、本発明によるミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストは、一般にスピロラクトン型ステロイド化合物である。「スピロラクトン型」という用語は、ステロイド核に、典型的にはステロイド「Ｄ」環でスピロ結合配置により結合したラクトン部分を含む構造を特徴づけるものとする。スピロラクトン型ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニスト化合物のサブクラスは、エプレレノンなどのエポキシ−ステロイド系ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニスト化合物から成る。スピロラクトン型アンタゴニスト化合物の別のサブクラスは、スピロノラクトンなどの非エポキシ−ステロイド系ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニスト化合物から成る。

本発明の方法に使用されるエポキシステロイド系ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニスト化合物は、一般に、ステロイド核がエポキシ型部分で置換されている。「エポキシ型」部分という用語は、酸素原子を２個の炭素原子間の架橋として有することを特徴とする任意の部分を包含するものとする。

語句「エポキシステロイド系」に使用される「ステロイド系」という用語は、シクロペンテノ−フェナントレン部分によって提供される、通常の「Ａ」環、「Ｂ」環、「Ｃ」環、および「Ｄ」環を有する核を意味する。エポキシ型部分は、シクロペンタフェナントレン核に、結合可能または置換可能な任意の位置で結合していてもよく、すなわち、ステロイド核の環の一つに縮合していてもよく、またはその部分は環系の一環員上で置換していてもよい。「エポキシステロイド系」という語句は、１個または複数のエポキシ型部分が結合しているステロイド核を包含するものとする。

本方法に使用するために適するエポキシステロイド系ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストには、エポキシ部分がステロイド核の「Ｃ」環に縮合している一群の化合物が含まれる。例には、９α，１１α−置換エポキシ部分の存在によって特徴づけられる２０−スピロキサン化合物、例えば以下：
− プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、メチルエステル、（７α，１１α，１７β）
− プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、ジメチルエステル、（７α，１１α，１７β）
− ３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、（６β，７β，１１α，１７β）
− プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、７−（１−メチルエチル）エステル、一カリウム塩、（７α，１１α，１７β）
− プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、７−メチルエチル）エステル、一カリウム塩、（７α，１１α，１７β）
− ３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−１，４，６−トリエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、Γ−ラクトン（６β，７β，１１α）
− ３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、メチルエステル、（６β，７β，１１α，１７β）
− ３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、一カリウム塩、（６β，７β，１１α，１７β）
− ３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−１，４，６−トリエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン（６β，７β，１１α，１７β）
− プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、エチルエステル、（７α，１１α，１７β）
− プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、１−メチルエチルエステル（７α，１１α，１７β）
が含まれる。

エプレレノンを例とするエポキシステロイド系ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストを使用する特定の利点は、この群のミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストのミネラルコルチコイドレセプターに対する高い選択性である。エプレレノンの優れた選択性は、アンドロゲンレセプターまたはプロゲステロンレセプターなどの関連レセプターへの非選択的な結合を示すミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストによって起こりうる副作用の減少を招く。

これらのエポキシステロイドは、Grobら、米国特許第４，５５９，３３２号に記載された手順によって製造することができる。９，１１−エポキシステロイド系化合物およびそれらの塩の追加的な製造方法は、Ngら、国際公開公報第９７／２１７２０号およびNgら、国際公開公報第９８／２５９４８号に開示されている。

特に関心が持たれるのは、エポキシメクスレノンとしても知られている化合物エプレレノン（（プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、メチルエステル、（７α，１１α，１７β））（CAS No. 107724-20-9）である。エプレレノンはミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストであって、ミネラルコルチコイドレセプターに対して例えばスピロノラクトンよりも高い選択性を有する。本方法におけるミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストとしてエプレレノンを選択することは、より低い特異性を有するミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストの使用で生じる女性化乳房などのある種の副作用を減らすために有益であろう。

本方法での使用に適する非エポキシステロイド系ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストには、式Ｉ：

によって定義されるスピロラクトン型化合物のファミリーが含まれ、上式で：

であり、
− Ｒは、炭素原子が最大５個の低級アルキルであり、

である。

低級アルキル残基には、分枝状の基および非分枝状の基、例えばメチル、エチルおよびｎ−プロピルが含まれる。

対象となる式Ｉの範囲内の具体的な化合物は、以下：
− ７α−アセチルチオ−３−オキソ−４，１５−アンドロスタジエン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
− ３−オキソ−７α−プロピオニルチオ−４，１５−アンドロスタジエン−［１７（（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
− ６β，７β−メチレン−３−オキソ４，１５−アンドロスタジエン−［１７（（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
− １５α，１６α−メチレン−３−オキソ−４，７α−プロピオニルチオ−４−アンドロステン［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
− ６β，７β，１５α，１６α−ジメチレン−３−オキソ−４−アンドロステン［１７（β−１’）−スピロ−５’］−ペルヒドロフラン−２’−オン；
− ７α−アセチルチオ−１５β，１６β−メチレン−３−オキソ−４−アンドロステン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
− １５β，１６β−メチレン−３−オキソ−７β−プロピオニルチオ−４−アンドロステン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；および
− ６β，７β，１５β，１６β−ジメチレン−３−オキソ−４−アンドロステン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン
である。

式Ｉで示される化合物を製造する方法は、１９７８年１２月１２日に発行されたWiechartらの米国特許第４，１２９，５６４号に記載されている。

対象となる非エポキシステロイド系化合物の別の一群は、式ＩＩ：

［式中、Ｒ１は、Ｃ１−３−アルキルまたはＣ１−３アシルであり、Ｒ２は、ＨまたはＣ１−３−アルキルである］によって定義される。

対象となる式ＩＩの範囲内の具体的な化合物は、以下：
− １α−アセチルチオ−１５β，１６β−メチレン−７α−メチルチオ−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−２１，１７−カルボラクトン；および
− １５β，１６β−メチレン−１α，７α−ジメチルチオ−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−２１，１７−カルボラクトン
である。

式ＩＩで示される化合物を製造する方法は、１９８８年１２月６日に発行されたNickischらの米国特許第４，７８９，６６８号に記載されている。

対象となる非エポキシステロイド系化合物のさらに別の一群は、式ＩＩＩ：

［式中、Ｒは低級アルキルであり、その例には、メチル、エチル、プロピルおよびブチルの低級アルキル基が含まれる］で示される構造によって定義される。対象となる具体的な化合物には、以下：
− ３β，２１−ジヒドロキシ−１７α−プレグナ−５，１５−ジエン−１７−カルボン酸γ−ラクトン；
− ３β，２１−ジヒドロキシ−１７α−プレグナ−５，１５−ジエン−１７−カルボン酸γ−ラクトン３−アセテート；
− ３β，２１−ジヒドロキシ−１７α−プレグン−５−エン−１７−カルボン酸γ−ラクトン；
− ３β，２１−ジヒドロキシ−１７α−プレグン−５−エン−１７−カルボン酸γ−ラクトン３−アセテート；
− ２１−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−１７−カルボン酸γ−ラクトン；
− ２１−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナ−４，６−ジエン−１７−カルボン酸γ−ラクトン；
− ２１−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナ−１，４−ジエン−１７−カルボン酸γ−ラクトン；
− ７α−アシルチオ−２１−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−１７−カルボン酸γ−ラクトン；および
− ７α−アセチルチオ−２１−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−１７−カルボン酸γ−ラクトン
が含まれる。

式ＩＩＩで示される化合物を製造する方法は、１９６６年６月２１日に発行されたPatchettの米国特許第３，２５７，３９０号に記載されている。

対象となる非エポキシステロイド系化合物のなお別の一群は、式ＩＶ：

［式中、Ｅ’は、エチレン基、ビニレン基および（低級アルカノイル）チオエチレン基から成る群より選択され、Ｅ”は、エチレン基、ビニレン基、（低級アルカノイル）チオエチレン基および（低級アルカノイル）チオプロピレン基から成る群より選択され；Ｅ’およびＥ”がそれぞれエチレン基および（低級アルカノイル）チオエチレン基であるときにＲが水素およびメチル基から成る群より選択される場合を除き、Ｒはメチル基であり；Ｅ’およびＥ”の選択は、少なくとも１個の（低級アルカノイル）チオ基が存在するように行われる］によって表される。

式ＩＶの範囲内の非エポキシステロイド系化合物の一群は、式Ｖ：

によって表される。

式Ｖで表される別の化合物は、１−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−アンドロスタ−４−エン−３−オンラクトンである。

式ＩＶの範囲内の非エポキシステロイド系化合物の別の一群は、式ＶＩ：

式ＶＩの範囲内の例示的な化合物には、以下：
− ７α−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−アンドロスタ−４−エン−３−オンラクトン；
− ７β−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−アンドロスタ−４−エン−３−オンラクトン；
− １α，７α−ジアセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−アンドロスタ−４，６−ジエン−３−オンラクトン；
− ７α−アセチルチオ−１７αｅ−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−アンドロスタ−１，４−ジエン−３−オンラクトン；
− ７α−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−１９−ノルアンドロスタ−４−エン−３−オンラクトン；および
− ７α−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−６α−メチルアンドロスタ−４−エン−３−オンラクトン
が含まれる。

式ＩＶ〜ＶＩにおいて、「アルキル」という用語は、１〜約８個の炭素を含む直鎖状アルキル基および分枝状アルキル基を包含するものとする。「（低級アルカノイル）チオ」という用語は、式

で示される基を包含する。

特に関心が持たれるのは、以下の構造：

を有する化合物スピロノラクトン（１７−ヒドロキシ−７α−メルカプト−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−２１−カルボン酸γ−ラクトンアセテート）である。

式ＩＶ〜ＶＩに示される化合物を製造する方法は、１９６１年１２月１２日に発行されたCellaらの米国特許第３，０１３，０１２号に記載されている。スピロノラクトンは、G. D. Searle & Co.（Skokie, Ill.）によって「ALDACTONE」の商標で１錠２５mg、５０mgおよび１００mgの用量の錠剤剤形で販売されている。

ステロイド系ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストの別の一群は、ドロスピレノン、すなわち（６Ｒ−（６α，７α，８β，９α，１０β，１３β，１４α，１５α，１６α，１７β））−１，３’，４’，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，２０，２１−ヘキサデカヒドロ−１０，１３−ジメチルスピロ［１７Ｈ−ジシクロプロパ（６，７：１５，１６）シクロペンタ（ａ）フェナントレン−１７，２’（５’Ｈ）−フラン）−３，５’（２Ｈ）−ジオン、ＣＡＳ登録番号６７３９２−８７−４によって例示される。ドロスピレノンを製造および使用する方法は、特許GB 1550568、１９７９年、優先権DE 2652761、１９７６年に記載されている。

取り扱いが容易で、形に再現性があり、製造が容易で、安定性があり、かつ吸湿性でない結晶形が、ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストであるエプレレノンについて同定されている。これらには、Ｈ型、Ｌ型、様々な結晶性溶媒和物、および非結晶性エプレレノンが含まれる。これらの結晶形、これら結晶形の製造方法、ならびに組成物および医薬を製造する際のこれら結晶形の使用については、Bartonら、国際公開公報第０１／４１５３５号およびBartonら、国際公開公報第０１／４２２７２号に開示されており、その両方がその全体で本明細書に組み入れられる。

本発明によるミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストとして使用されうる小型有機分子は、非ステロイド系であってもよい。例えば、非ステロイド系ＭＲアンタゴニストのクラスは、過去数年で現れ始めたばかりである（Meyers, Marvin J1; Hu, Xiao Expert Opinion on Therapeutic Patents, Volume 17, Number 1, January 2007 , pp. 17-23（７）。近年、ジヒドロピリミジンが、ＭＲ拮抗作用を表すことが示された（Activation of Mineralocorticoid Receptors by Exogenous Glucocorticoids and the Development of Cardiovascular Inflammatory Responses in Adrenalectomized Rats. Young MJ, Morgan J, Brolin K, Fuller PJ, Funder JW. Endocrinology. 2010 Apr 21）。さらに、Arhancetらは、他のクラスの非ステロイド系ＭＲアンタゴニストを開示している（Arhancet GB, Woodard SS, Dietz JD, Garland DJ, Wagner GM, Iyanar K, Collins JT, Blinn JR, Numann RE, Hu X, Huang HC. Stereochemical Requirements for the Mineralocorticoid Receptor Antagonist Activity of Dihydropyridines. J Med Chem. 2010 Apr 21）。他の例示的な非ステロイド系ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストには、非限定的に、米国特許出願公開第２００９０１６３４７２号、国際公開公報第２００４０５２８４７号、国際公開公報第２００８０５３３００号に記載されたものが含まれ、それらは、本明細書によって参照により本開示に組み入れられる。例えば国際公開公報第０６／０７６２０２号（２００６年７月２０日公開）は、ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストとしてイミダゾールカルボキサミドの一クラスを報告している。国際公開公報第０６／０１２６４２号（２００６年２月２日公開）は、ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストとしてピロールカルボキサミドの一クラスを報告している。国際公開公報第０４／０５２８４７号（２００４年６月２４日公開）は、ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストとしてジベンゾスベランの一クラスを報告している。国際公開公報第０５／０６６１６１号（２００５年７月２１日公開）は、ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストとしてジベンゾスベランの一クラスを報告している。国際公開公報第０３／０７８３９４号（２００３年９月２５日公開）は、ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストとして３，３−ビスアリールオキシインドールの一クラスを報告している。国際公開公報第０５／０９７１１８号（２００５年１０月２０日公開）は、ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストとして４−アリール−１，４−ジヒドロピリジンの一クラスを報告している。国際公開公報第０４／０６７５２９号（２００４年８月１２日公開）は、ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストとして３−ベンジルインドールの一クラスを報告している。国際公開公報第０６／０７７８２１号（２００６年７月２７日公開）は、ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストとしてベンゾオキサジンチオンのクラスおよびテトラヒドロキノリンのクラスを報告している。国際公開公報第０６／０１０１４２号（２００６年１月２６日公開）は、ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストとしてアリールベンゾオキサジノン／アリールベンゾオキサジンチオンの一クラスを報告している。

アンタゴニストの別の例には、カンレン酸塩が含まれる。カンレン酸は、体内でカンレノンに代謝されるプロドラッグである、カンレン酸カリウムなどのカンレン酸塩が、眼内投与のために適切な場合がある。

または、ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストは、また、抗体（この用語は「抗体フラグメント」を含む）にある場合がある。特に、ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストが、ミネラルコルチコイドレセプターに対する抗体にあることにより、該抗体は、そのレセプターと拮抗する場合がある。

抗体は、公知の方法にしたがって、例えばとりわけブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、およびマウスより選択されるホスト動物に適切な抗原またはエピトープを投与することによって、産生させることができる。当業界で公知の様々なアジュバントを、抗体産生を高めるために使用することができる。本発明の実施に有用な抗体はポリクローナル抗体でありうるものの、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は、培養した連続継代細胞系により抗体分子の産生のために手段を講じる任意の技法を用いて調製および単離することができる。産生および単離のための技法には、非限定的にハイブリドーマ技法；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法；およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法が含まれる。または、単鎖抗体の産生のために記載された技法（例えば米国特許第４，９４６，７７８号参照）を、抗ミネラルコルチコイドレセプター単鎖抗体を産生させるために適用することができる。本発明の実施に有用なミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニスト（例えばアゴニスト、部分アゴニストまたはアンタゴニスト）には、また、非限定的にＦ（ａｂ’）２フラグメント（インタクトな抗体分子のペプシン消化によって生成させることができる）、およびＦａｂフラグメント（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成させることができる）などの抗ミネラルコルチコイドレセプター抗体フラグメントが含まれる。または、ミネラルコルチコイドレセプターに所望の特異性を有するフラグメントの迅速同定を可能にするように、Ｆａｂおよび／またはｓｃＦｖ発現ライブラリーを構築することができる。

ヒト化抗体およびその抗体フラグメントも、公知の技法により調製することができる。「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含む非ヒト（例えばげっ歯類）キメラ抗体の形態である。主としてヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲ）由来残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合により、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含む場合がある。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良するために行われる。一般にヒト化抗体は、全てまたは実質的に全ての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに相当し、全てまたは実質的に全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合により免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部も含む。ヒト化抗体を製造するための方法は、例えばWinter（米国特許第５，２２５，５３９号）およびBoss（Celltech、米国特許第４，８１６，３９７号）によって記載されている。

次に、上記のように抗体を産生させた後、当業者は、ミネラルコルチコイドレセプターと拮抗する抗体を容易に選択することができる。

別の態様において、ミネラルコルチコイドレセプターアンタゴニストはアプタマーである。アプタマーは、分子認識の点で抗体の代替となる分子クラスである。アプタマーは、事実上、任意のクラスのターゲット分子を高い親和性および特異性で認識する能力を有するオリゴヌクレオチド配列またはオリゴペプチド配列である。そのようなリガンドは、Tuerk C.およびGold L.、１９９０年に記載されたように、ランダム配列ライブラリーの指数濃縮によるリガンドの系統進化（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）（ＳＥＬＥＸ）により単離することができる。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって入手可能である。このライブラリーにおいて各メンバーは、最後には化学的に改変されたユニーク配列の直鎖オリゴマーである。このクラスの分子の改変、使用および利点になりうるものは、Jayasena S.D.、１９９９年に総説されている。ペプチドアプタマーは、E. coliチオレドキシンＡなどのプラットフォームタンパク質によってディスプレイされた、立体配座が束縛された抗体可変領域から成り、コンビナトリアルライブラリーからツーハイブリッド法によって選択される（Colas et al., 1996）。オリゴペプチドに基づくアプタマーは、ＴＡＴまたはＶＰ２２配列などの透過配列と融合させてもよい。

次に、上記のようにミネラルコルチコイドレセプターに対するアプタマーを産生させた後、当業者は、ミネラルコルチコイドレセプターと拮抗するアプタマーを容易に選択することができる。

本発明は、糖尿病網膜症、緑内障、虚血、近視、中心性漿液性網脈絡膜症、または滲出型加齢性黄斑変性に関連する網膜中および／または網膜下における液体貯留の処置に使用するためのミネラルコルチコイドレセプター遺伝子発現阻害剤に関する。

本発明における使用のための発現阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物に基づくことができる。アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子などのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミネラルコルチコイドレセプターｍＲＮＡに結合することによってその翻訳を直接遮断することで、タンパク質の翻訳を阻止またはｍＲＮＡの分解を増加させ、それ故に細胞中のミネラルコルチコイドレセプターのレベル、したがって活性を減少させるように作用する。例えば、ミネラルコルチコイドレセプターをコードするｍＲＮＡ転写物の配列のユニーク領域に相補的な、少なくとも約１５個の塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば従来のホスホジエステル技法によって合成し、例えば静脈内注射または注入によって投与することができる。配列が公知の遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためのアンチセンス技法を使用するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；第６，５６６，１３１号；第６，３６５，３５４号；第６，４１０，３２３号；第６，１０７，０９１号；第６，０４６，３２１号；および第５，９８１，７３２号参照）。

低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）も、本発明における使用のための発現阻害剤として機能する場合がある。ミネラルコルチコイドレセプター遺伝子の発現は、ミネラルコルチコイドレセプター遺伝子の発現が特異的に阻害されるように、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または低分子二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクターもしくは構築物と対象または細胞を接触させることによって減少させることができる（すなわちＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ）。適切なｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡコードベクターを選択するための方法は、配列が公知の遺伝子に関して当技術分野で周知である（例えば、Tuschl, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002)；米国特許第６，５７３，０９９号および第６，５０６，５５９号；ならびに国際公開公報第０１／３６６４６号、国際公開公報第９９／３２６１９号、および国際公開公報第０１／６８８３６号参照）。本発明のｓｉＲＮＡのホスホジエステル結合の全てまたは部分は、好都合に保護される。この保護は、一般に当技術分野により公知の方法を用いて化学的経路により実施される。ホスホジエステル結合は、例えばチオールもしくはアミン官能基によって、またはフェニル基によって保護することができる。本発明のｓｉＲＮＡの５’末端および／または３’末端も、例えばホスホジエステル結合を保護するための上記技法を用いて好都合に保護される。ｓｉＲＮＡ配列は、好都合には、少なくとも１２個の連続ジヌクレオチドまたはその誘導体を含む。

この核酸配列に関連して本明細書に使用される「ｓｉＲＮＡ誘導体」という用語は、エリスロポエチンまたはそのフラグメントと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、一例として少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９８％の同一率を有する核酸を表す。

本明細書に使用される、二つの核酸配列の間の「同一率」は、比較されるべき二つの配列の最良のアライメントで得られた、該配列の間で同一な核酸の率を意味し、この率は、全く統計的であり、これら二つの配列の間の差は、核酸配列にわたりランダムに分布している。本明細書に使用される「最良のアライメント」または「最適なアライメント」は、決定された同一率（下記参照）が最高であるアライメントを意味する。二つの核酸配列の間の配列比較は、通常、予め最良のアライメントに基づいてアライメントされたこれらの配列を比較することによって実現され；局所類似領域を同定および比較するために、比較セグメントでこの比較が実現される。比較を行うための最良の配列アライメントは、手作業以外に、SMITHおよびWATERMANによって開発された大域的相同性アルゴリズムを使用することによって（Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981）、NEDDLEMANおよびWUNSCHによって開発された局所相同性アルゴリズムを使用することによって（J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970）、PEARSONおよびLIPMANによって開発された類似性方法を使用することによって（Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988）、そのようなアルゴリズムを使用したコンピュータソフトウェアを使用することによって（Wisconsin Genetics software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USAのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ）、ＭＵＳＣＬＥ多重アライメントアルゴリズムを使用することによって（Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004）実現することができる。最良の局所アライメントを得るために、好ましくはＢＬＡＳＴソフトウェアを使用することができる。二つの核酸配列の間の同一率は、最適にアライメントされたこれらの二つの配列を比較することによって決定され、これらの二つの配列の間で最適アライメントを得るために、核酸配列が参照配列に関して付加または欠失を含むことが可能である。これら二つの配列の間で同一な位置の数を決定し、その数を比較された位置の総数で割り、得られた結果に１００を乗じ、これら二つの配列の間の同一率を求めることによって、同一率が計算される。

ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）も、本発明における使用のための発現阻害剤として機能することができる。

リボザイムも、本発明における使用のための発現阻害剤として機能することができる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用メカニズムは、相補的ターゲットＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションに続くヌクレオチド鎖内切断を伴う。その結果、ミネラルコルチコイドレセプターｍＲＮＡ配列のヌクレオチド鎖内切断を特異的かつ効率的に触媒する、操作されたヘアピンモチーフまたはハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、本発明の範囲内で有用である。リボザイム切断部位（典型的には以下の配列ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣが挙げられる）を求めてターゲット分子をスキャンすることによって、任意の潜在的ＲＮＡターゲット内から最初に特異的リボザイム切断部位が同定される。同定後に、切断部位を含むターゲット遺伝子領域に相当する約１５から２０個の間のリボヌクレオチドの低分子ＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切にするおそれのある二次構造などの予測される構造的特徴について評価することができる。

発現阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの両方は、公知の方法によって調製することができる。これらには、例えば固相ホスホルアマダイト（phosphoramadite）化学合成などによる化学合成技法が含まれる。または、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のin vitroまたはin vivo転写で生成させることができる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターが組み込まれた多種多様なベクターに組み込むことができる。細胞内安定性および半減期を増大させる手段として、本発明のオリゴヌクレオチドに様々な改変を導入することができる。改変となりうるものには、非限定的に、分子の５’および／または３’末端へのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、またはオリゴヌクレオチド主鎖内のホスホジエステラーゼ結合に代わるホスホロチオエートまたは２’−Ｏ−メチルの使用が含まれる。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびリボザイムは、単独で、またはベクターと関連させてin vivo送達してもよい。「ベクター」は、その最も広い意味で、細胞への、好ましくはミネラルコルチコイドレセプターを発現している細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはリボザイム核酸の輸送を促進できる任意の媒体である。好ましくは、ベクターは、ベクターの不在下で生じる分解よりも程度の低い分解で核酸を細胞に輸送する。一般に、本発明に有用なベクターには、非限定的にプラスミド、ファージミド、ウイルス、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはリボザイム核酸配列の挿入または組み込みによって操作されたウイルスまたは細菌起原の他の媒体が含まれる。ウイルスベクターが好ましい種類のベクターであり、それには、非限定的に以下のウイルス由来の核酸配列が含まれる：モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳腺癌ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスなどのレトロウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン−バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；およびレトロウイルスなどのＲＮＡウイルス。挙げられていないが当技術分野において公知の他のベクターを容易に採用することができる。

好ましいウイルスベクターは、可欠遺伝子が対象遺伝子により置き換えられている非細胞変性真核ウイルスをベースとする。非細胞変性ウイルスにはレトロウイルス（例えばレンチウイルス）が含まれ、その生活環は、ゲノムウイルスＲＮＡからＤＮＡへの逆転写に続くホスト細胞ＤＮＡへのプロウイルス組み込みを伴う。レトロウイルスは、ヒト遺伝子治療の試験のために認可されている。複製欠損の（すなわち、所望のタンパク質の合成を指令できるが、感染性粒子を製造できない）レトロウイルスが最も有用である。そのような遺伝的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、遺伝子のin vivo高効率トランスダクションに一般に有用である。複製欠損レトロウイルスを産生させるための標準プロトコール（プラスミドへの外来遺伝物質の組み込み、パッケージング細胞系へのプラスミドのトランスフェクション、パッケージング細胞系によるリコンビナントレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の収集、およびターゲット細胞へのウイルス粒子の感染のステップを含む）は、Kriegler、１９９０年およびMurry、１９９１年に提供されている）。

ある種の適用に好ましいウイルスは、アデノウイルスおよびアデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルスであり、それらは、遺伝子治療でのヒト応用について既に認可されている二本鎖ＤＮＡウイルスである。実際に、それぞれが異なる組織向性を有する１２種の異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜１２）が知られている（Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27）。リコンビナントＡＡＶは、依存性パルボウイルスＡＡＶ２から得られる（Choi, VW J Virol 2005; 79:6801-07）。アデノ随伴ウイルス１〜１２型は、複製欠損となるように操作することができ、広範囲の細胞型および種に感染させることが可能である（Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27）。アデノ随伴ウイルスは、さらに、熱および脂質溶媒安定性；造血細胞を含む多様な系列の細胞における高いトランスダクション頻度；および重感染阻害の欠如により多系列のトランスダクションが可能などの利点を有する。報告によると、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的にヒト細胞ＤＮＡに組み込むことができ、それによって挿入突然変異誘発の確率およびレトロウイルス感染に特徴的な挿入遺伝子発現の変動性が最小限になる。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、組織培養において選択圧の不在下で１００回よりも多い継代の間追跡され、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みが比較的安定な事象であることが暗に示された。アデノ随伴ウイルスは、染色体外で機能する場合もある。

他のベクターには、プラスミドベクターが含まれる。プラスミドベクターは、当技術分野において広く記載されており、当業者に周知である。例えばSambrookら、１９８９年を参照されたい。最近数年の間に、プラスミドベクターは、抗原コード遺伝子を細胞にin vivo送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されている。それらは、多くウイルスベクターと同じような安全上の懸念を有さないことから、これについて特に有利である。しかしながら、これらのプラスミドは、ホスト細胞と適合性のプロモーターを有するので、プラスミド内に作動的にコードされる遺伝子からペプチドを発現するおそれがある。いくつかの一般に使用されるプラスミドには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣｌ９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、およびｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが含まれる。他のプラスミドも、当業者に周知である。追加的に、制限酵素および連結反応を使用してプラスミドを特別設計し、ＤＮＡの特定フラグメントを除去および付加してもよい。プラスミドは、多様な非経口、粘膜および局所経路によって送達することができる。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、または他の経路によって注射することができる。それは、また、鼻腔内スプレーまたは点鼻、直腸坐剤によって、および経口的に投与することができる。それは、また、遺伝子銃を使用して表皮または粘膜表面に投与することができる。プラスミドは、水溶液の状態で、金粒子上に乾燥させて、または非限定的にリポソーム、デンドリマー、コクリエート（cochleate）およびマイクロカプセル化を含む別のＤＮＡ送達系と関連させて与えてもよい。

好ましい一態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはリボザイム核酸配列は、異種調節領域、例えば異種プロモーターのコントロール下にある。プロモーターは、ミュラーグリア細胞、ミクログリア細胞、内皮細胞、周皮細胞および星状膠細胞に特異的でありうる。例えば、ミュラーグリア細胞での特異的発現は、適切なグルタミンシンセターゼ遺伝子プロモーターによって得ることができる。プロモーターは、例えばＣＭＶプロモーターなどのウイルスプロモーターまたは任意の合成プロモーターでもありうる。

さらに本発明者らは、網膜に及ぼすコルチコステロイドの抗浮腫効果が、主に、ＧＲ経路に対する作用よりもＭＲ経路を介した作用によって大きく説明されると考える。実際に本発明者らは、グルココルチコイド（例えばトリアムシノロンアセトニド）の投与がＡＱＰ４の発現に対してＭＲアンタゴニストと同じ効果を提供することを観察した。したがってＭＲアンタゴニストは、網膜中および／または網膜下における液体貯留の処置においてグルココルチコイドの効果と相乗的に作用するが、グルココルチコイドの重篤な副作用は防止するであろう。

したがって本発明のさらなる一局面は、糖尿病網膜症、緑内障、虚血、近視、中心性漿液性網脈絡膜症、または滲出型加齢性黄斑変性に関連する、網膜中および／または網膜下における液体貯留の処置に使用するための、グルココルチコイドと、ＭＲアンタゴニストまたはミネラルコルチコイドレセプター遺伝子発現阻害剤との組み合わせに関する。

ＭＲアンタゴニストとグルココルチコイドとの組み合わせは、グルココルチコイドの効果を増強し、グルココルチコイドの用量を減らすことによってその有害副作用を限定できるようにする。

本明細書に使用される「グルココルチコイド」という用語は、当技術分野において一般的な意味を有し、ＮＲ３Ｃ１（核内レセプターサブファミリー３、グループＣ、メンバー１）としても知られているグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）と結合し、それを活性化する化合物を表す。

本発明にしたがって使用されうるグルココルチコイドには、非限定的に、２１−アセトキシプレグネノロン、アルクロメタゾン、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコート、デソニド、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルアザコート、フルクロロニド（flucloronide）、フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオロメトロン、酢酸フルペロロン、酢酸フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルランドレノリド、プロピオン酸フルチカゾン、ホルモコータル、ハルシノニド、プロピオン酸ハロベタゾール、ハロメタゾン、酢酸ハロプレドン、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、エタボン酸ロテプレドノール、マジプレドン（mazipredone）、メドリゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、フロ酸モメタゾン、パラメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、プレドニゾロン２５−ジエチルアミノ−アセテート、リン酸プレドニゾロンナトリウム、プレドニゾン、プレドニバール、プレドニリデン、リメキソロン、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニド、トリアムシノロンヘキサアセトニド、酢酸アネコルタブ、および任意のそれらの誘導体が含まれる。

本発明は、また、糖尿病網膜症、緑内障、虚血、近視、中心性漿液性網脈絡膜症、または滲出型加齢性黄斑変性に関連する網膜中および／または網膜下における液体貯留の処置に使用するための、ある量の少なくとも１種のグルココルチコイドと、ある量の少なくとも１種のＭＲアンタゴニストもしくはミネラルコルチコイドレセプター遺伝子発現阻害剤とを含む薬学的組成物（本明細書後述）に関する。

本発明は、また、糖尿病網膜症、緑内障、虚血、近視、中心性漿液性網脈絡膜症、または滲出型加齢性黄斑変性に関連する網膜中および／または網膜下における液体貯留の処置に使用するための、少なくとも１種のグルココルチコイドと、少なくとも１種のＭＲアンタゴニストまたはミネラルコルチコイドレセプター遺伝子発現阻害剤とを含むキットに関する。

本発明は、また、糖尿病網膜症、緑内障、虚血、近視、中心性漿液性網脈絡膜症、または滲出型加齢性黄斑変性に関連する網膜中および／または網膜下における液体貯留の処置時にグルココルチコイドによって誘導される副作用の予防に使用するための、ＭＲアンタゴニストまたはミネラルコルチコイドレセプター遺伝子発現阻害剤に関する。

最終的に本発明者らは、ＭＲをトランス活性化可能なＭＲアゴニストまたはグルココルチコイドが、ぶどう膜炎、色素性網膜炎、網膜細胞毒性浮腫または神経毒性浮腫に関連するＡＱＰ４発現欠如に起因する網膜中および／または網膜下における液体貯留の処置に有用でありうると考える。

したがって、本発明は、ぶどう膜炎または色素性網膜炎または網膜細胞毒性浮腫または神経毒性浮腫に関連する網膜中および／または網膜下における液体貯留の処置に使用するためのＭＲアゴニストに関する。

本明細書に使用される「ミネラルコルチコイドレセプター（ＭＲ）アゴニスト」という用語は、ミネラルコルチコイドレセプターと結合して、経路シグナリングおよびさらなる生物学的過程を開始するために該ミネラルコルチコイドレセプター部位を活性化する天然または合成化合物である。

典型的にはＭＲアゴニストは、アルドステロンまたはそのアナログである。本明細書に使用される「アナログ」は、別の薬剤に構造的に類似する薬剤であるが、組成がわずかに異なる薬剤（例えば異なる元素または官能基の原子による１個の原子の置換）を表す。例えば、アルドステロンのアナログは、９−フルオロ−１１，１７−ジヒドロキシ−１７−（２−ヒドロキシアセチル）−１０，１３−ジメチル−１，２，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−オンであるフルドロコルチゾンである。

本発明によれば、本発明の活性成分（例えばＭＲアンタゴニストまたはアゴニスト）は、治療有効量で対象に投与される。

「治療有効量」によって、任意の医学的処置に適用可能で妥当な便益−リスク比で網膜中および／または網膜下における液体貯留を処置するために十分な量の活性成分が意味される。

本発明の化合物および組成物の１日合計使用量は、担当の医師によって健全な医学的判断の範囲内で決定されることが了解されている。任意の特定の対象についての特異的治療有効用量レベルは、処置されている障害およびその障害の重症度；用いられる特異的化合物の活性；用いられる特異的組成物、対象の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事；投与時間、投与経路、および用いられる特異的化合物の排泄速度；処置の継続期間；採用された特異的ポリペプチドと組み合わせてまたは同時に使用される薬物；ならびに医学の分野で周知の同様の要因を含む様々な要因に左右される。例えば、所望の治療効果を達成するために必要な用量よりも低いレベルで化合物の用量を開始すること、および所望の効果が達成されるまで薬用量を徐々に増加させることは、当技術分野における技能の範囲内に十分入る。しかしながら、製品の１日薬用量は、成人１人あたり１日０．０１〜１，０００mgの広い範囲にわたり変動しうる。好ましくは、組成物は、処置される対象への薬用量を症状により調整するために０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０および５００mgの活性成分を含有する。医薬は、典型的には約０．０１mg〜約５００mgの活性成分、好ましくは１mg〜約１００mgの活性成分を含有する。有効量の薬物が、通常、１日０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重、特に１日約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重の薬用量レベルで供給される。

本明細書に使用される「対象」という用語は、げっ歯類、ネコ、イヌ、および霊長類などの哺乳類を意味する。好ましくは、本発明による対象はヒトである。

本発明の活性成分（例えばＭＲアンタゴニストまたはＭＲアゴニスト）は、薬学的に許容されうる賦形剤、および場合により生分解性ポリマーなどの徐放性マトリックスと組み合わせて薬学的組成物を形成させることができる。

「薬学的に」または「薬学的に許容されうる」という用語は、必要に応じて哺乳類、特にヒトに投与した場合に有害反応、アレルギー反応または他の有害反応を生じない分子実体および組成物を表す。薬学的に許容されうる担体または賦形剤は、無毒性で固体、半固体または液体の増量剤、希釈剤、封入物質または任意の種類の製剤化補助物質を表す。

本発明の薬学的組成物中の本発明の活性成分は、ユニット投与剤形で従来の薬学的支持体との混合物として動物およびヒトに投与することができる。適切なユニット投与剤形は、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤および経口用懸濁剤または液剤などの経口経路剤形、舌下および口内投与剤形、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、髄腔内および鼻腔内投与剤形ならびに直腸投与剤形を含む。

好ましくは、硝子体内注射、局所注射、眼周囲注射（結膜下、眼球周囲、眼球側方、眼球後、テノン下、脈絡膜上）などの局所眼経路、眼内もしくは眼周囲インプラント（強膜内、強膜周囲、強膜上）、硝子体内インプラントもしくは脈絡膜上のインプラントもしくは粒子もしくはポリマー組成物などの局所眼経路、または乳剤、固体の非生分解性もしくは分解性のインプラントもしくは錠剤、ミニポンプもしくは任意の局所製剤などの任意の放出システムを使用すべきである。

好ましくは、薬学的組成物は、注射可能な製剤にとって薬学的に許容されうる媒体を含有する。これらは、特に等張無菌食塩水（リン酸一ナトリウムまたはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、またはそれらの塩の混合物）、または場合に応じて無菌の水または生理食塩水を添加すると注射液を構成できる乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物でありうる。

注射用途に適する薬学的剤形には、無菌水剤または分散物；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールなどの製剤；および無菌注射液または無菌分散物を即時調製するための無菌散剤が含まれる。全ての場合で、剤形は無菌でなければならず、容易な注射可能性（syringability）が存在する程度に流動性でなければならない。剤形は、製造および保存の条件で安定でなければならず、細菌、ウイルスおよび真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。

本発明の化合物を遊離塩基または薬理学的に許容されうる塩として含む液剤は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水に入れて調製することができる。分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物に入れて、ならびに油に入れて調製することができる。通常の保存および使用条件で、これらの製剤は微生物の成長を阻止するために保存料を含有する。

本発明の活性成分は、中性または塩形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容されうる塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）が含まれ、それは、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸を用いて作られる。遊離カルボキシル基を用いて作られた塩は、また、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から得ることができる。

担体は、また、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒でありうる。妥当な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合は必要な粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の阻止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合に、等張化剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含ませることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。

無菌注射液は、本発明の活性成分を必要な量で、必要に応じ上に列挙した様々な他の成分と共に適切な溶媒中に混合し、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散物は、基本分散媒および上に列挙した成分からの、必要な他の成分を含有する無菌媒体中に様々な無菌活性成分を混合することによって調製される。無菌注射液の調製用の無菌散剤の場合、好ましい調製方法は、予め濾過滅菌された溶液から活性成分の他に任意の追加的な所望の成分の粉末が得られる真空乾燥技法および凍結乾燥技法である。

製剤化されると、液剤は、投与剤形に適合する方法で、治療有効量で投与される。製剤は、上記注射液の種類などの様々な投与剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども採用することができる。

水溶液での非経口投与のために、例えば、その溶液を必要に応じて適切に緩衝化すべきであり、液体希釈剤を最初に十分な食塩水またはグルコースで等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、特に静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に適する。これに関して、採用できる無菌水性媒は、本開示に照らして当業者に公知である。例えば、１回量を等張ＮａＣｌ溶液１mlに溶解し、皮下点滴液１０００mlに添加するか、または計画された注入部位に注射することができる。薬用量の幾分の変動は、処置されている対象の状態に応じて必然的に起こる。いずれにせよ投与の責任を負う者が、個別の対象に適切な用量を決定する。

静脈内または筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された本発明の活性成分に加えて、他の薬学的に許容されうる剤形には、例えば錠剤または経口投与用の他の固形剤；リポソーム製剤；持続放出カプセル；および現在使用されている任意の他の剤形が含まれる。

活性成分は、また、眼周囲、結膜、テノン嚢下、前房内、硝子体内、眼内、網膜下、結膜下、眼球後、脈絡膜上または小管内注射などの眼組織注射によって；カテーテルまたは他の留置装置、例えば網膜ペレット、眼内挿入物、坐剤または多孔性、非多孔性、もしくはゼラチン状材料を含むインプラントを使用した眼への直接適用によって；局所点眼液もしくは眼軟膏によって；または結膜嚢中の、もしくは強膜に隣接して（経強膜）もしくは強膜中に（強膜内）もしくは脈絡膜上もしくは眼内に埋め込まれた遅延放出装置によって、眼に直接送達することができる。前房内注射は、角膜を通過して前眼房中に入り、薬剤を小柱網に到達させるようにできる。小管内注射は、シュレム管に流入する静脈集合チャネル（venous collector channel）またはシュレム管内に行うことができる。

眼送達のために、活性成分を眼科的に許容されうる保存料、共溶媒、界面活性剤、増粘剤、透過促進剤、緩衝剤、塩化ナトリウム、または水と組み合わせて、水性無菌眼用懸濁物または液剤を作ることができる。液剤の製剤は、活性成分を生理学的に許容されうる等張水性緩衝液中に溶解することによって調製することができる。さらに、液剤は、活性成分の溶解を助けるために、許容されうる界面活性剤を含む場合がある。ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの増粘剤（viscosity building agent）を本発明の組成物に添加して化合物の保持を改善することができる。

無菌眼軟膏製剤を調製するために、活性成分は、鉱物油、液体ラノリン、または白色ワセリンなどの適切な媒体中で保存料と混合される。無菌眼用ゲル製剤は、例えばCARBOPOL（登録商標）-940（BF Goodrich、Charlotte, NC）などの組み合わせから調製された親水性基剤中に活性成分を当業界で公知の方法にしたがって懸濁することによって調製することができる。VISCOAT（登録商標）（Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, TX）は、例えば眼内注射のために使用することができる。活性成分が眼にあまり浸透性でない場合、本発明の他の組成物は、クレモフォール（cremophor）およびTWEEN（登録商標）80（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（monolaureate）、Sigma Aldrich, St. Louis, MO）などの浸透促進剤を含有してもよい。

特定の一態様では、本発明の薬学的組成物は点眼製剤である。点眼剤は、一般に使用される任意の製剤の状態で、例えば水性点眼溶液、水性点眼懸濁液、粘性点眼溶液、可溶化点眼溶液などの水性点眼剤の剤形、または非水性点眼溶液、非水性点眼懸濁液などの非水性点眼剤の剤形で提供される。本発明の組成物が水性点眼剤として調製される場合、それは、好ましくは水性点眼剤の状態で普通使用される添加剤を含有する。そのような添加剤の例には、保存料、等張化剤、緩衝化剤、安定化剤、ｐＨ調節剤などが含まれる。

別の特定の一態様では、本発明の活性成分は、生分解性眼用インプラントを通して送達される。

インプラントは、活性成分が生分解性ポリマーマトリックスを通して均一に分布または分散するように作ることができる。追加的に、インプラントは、様々な期間にわたり眼の眼領域中に活性成分を放出させるように作ることができる。したがって、活性成分は、本発明にしたがって製造されたインプラントから例えば３０〜２００日間放出させることができる。

活性成分は、インプラントの約１０重量％〜約９０重量％を構成しうる。一変形形態では、薬剤はインプラントの約４０重量％〜約８０重量％である。好ましい一変形形態では、薬剤はインプラントの約６０重量％を構成する。

特定の一態様では、活性成分は、インプラントの生分解性ポリマー中に均一に分散させることができる。インプラントは、例えば連続押出または二重押出法によって製造することができる。使用される生分解性ポリマーの選択は、所望の放出動態、患者の耐容能、処置される疾患の性質などに応じて変動しうる。考慮されるポリマーの特徴には、非限定的に植込部位での生体適合性および生分解性、対象となる活性成分との適合性、および加工温度が含まれる。生分解性ポリマーマトリックスは、通常、インプラントの少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、または少なくとも約９０重量％を構成する。一変形形態では、生分解性ポリマーマトリックスは、インプラントの約４０重量％〜５０重量％を構成する。

使用できる生分解性ポリマーには、非限定的に有機エステルまたは有機エーテルなどのモノマーから作られたポリマーであって、分解すると生理学的に許容されうる分解産物を生じるポリマーが含まれる。無水物、アミド、オルトエステルなども、それ自体でまたは他のモノマーと組み合わせて使用される場合がある。ポリマーは、一般に縮合ポリマーである。ポリマーは、架橋または非架橋でありうる。架橋の場合、ポリマーは、普通多くとも軽度架橋であって、５％未満の架橋、普通は１％未満の架橋である。特に関心がもたれるのは、ヒドロキシ脂肪族カルボン酸のポリマー、ホモポリマーまたはコポリマーのいずれか、および多糖である。対象となるポリエステルの中に含まれるのは、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸、ラセミ乳酸、グリコール酸、カプロラクトン、およびその組み合わせのホモポリマーまたはコポリマーである。グリコール酸と乳酸のコポリマーは、特に関心がもたれ、その際、生分解速度は、グリコール酸対乳酸の比によってコントロールされる。乳酸−グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）中の各モノマーの率は、０〜１００％、約１５〜８５％、約２５〜７５％、または約３５〜６５％でありうる。ある変形形態では、２５／７５ＰＬＧＡおよび／または５０／５０ＰＬＧＡコポリマーが使用される。他の変形形態では、ＰＬＧＡコポリマーは、ポリラクチドポリマーまたはポリウレタンと併用される。

他の薬剤を、多様な目的のために製剤中に用いることができる。例えば、緩衝化剤および保存料を用いてもよい。使用されうる保存料には、非限定的に亜硫酸水素ナトリウム、重硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、メチルパラベン、ポリビニルアルコールおよびフェニルエチルアルコールが含まれる。使用されうる緩衝化剤の例には、所望の投与経路についてＦＤＡによって認可された炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムなどが含まれるが、それに限定されるわけではない。塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどの電解質も製剤中に含まれる場合がある。

生分解性眼用インプラントは、また、活性成分の放出を加速または遅延させる追加的な親水性化合物または疎水性化合物も含むことができる。加えて、米国特許第５，８６９，０７９号に記載されたような放出モデュレーターがインプラント中を含むことができる。用いられる放出モデュレーターの量は、所望の放出プロファイル、モデュレーターの活性、およびモデュレーター不在下での活性成分の放出プロファイルに依存する。緩衝化剤または放出増強剤またはモデュレーターが親水性の場合、それは、放出促進剤としても作用しうる。親水性添加剤は、薬物粒子周囲の物質のより速い溶解により放出速度を増加させるように作用し、そのことが露出した薬物の表面積を増加させることによって薬物の拡散速度を増加させる。同様に、疎水性緩衝化剤または増強剤またはモデュレーターは、よりゆっくりと溶解し、薬物粒子の露出を減速し、それによって薬物の拡散速度を減速することができる。

本発明のインプラントの放出動態は、インプラントの表面積に一部依存しうる。より大きい表面積がより多くのポリマーおよび活性成分を眼液に曝露し、ポリマーマトリックスのより速い侵食および活性成分の液への溶解を引き起こす。したがって、インプラントの大きさおよび形状も、放出速度、処置期間、および埋め込み部位での活性成分濃度をコントロールするために使用することができる。等しい活性成分のロードで、より大きなインプラントは、比例的により大きな用量を送達するが、表面対質量比に依存してより遅い放出速度を有しうる。眼領域に埋め込むために、インプラントの合計重量は、好ましくは例えば約２００〜１５０００［mu]g、普通は約１０００〜５０００[mu]gの範囲である。一変形形態では、インプラントの合計重量は、約１２００〜約１，８００[mu]gである。別の変形形態では、インプラントの合計重量は、約２４００〜約３，６００[mu]gである。好ましくは、インプラントは約１００[mu]gと約２mgの間の重量を有する。

本発明のインプラントは、典型的には固体であり、粒子、シート、パッチ、プラーク、フィルム、ディスク、ファイバー、ロッドなどとして形成してもよく、またはインプラントが所望の放出動態を有し、インプラントが対象となる眼の医学的状態の治療に役立つ量の活性成分を送達する限り、選択された埋め込み部位に適合する任意の大きさもしくは形状であってもよい。インプラントの大きさの上限は、所望の放出動態、埋め込み部位でのインプラントについての耐容、挿入時の大きさの制約、および取扱いの容易さなどの要因によって決定される。例えば、硝子体腔は、一般に直径約０．０５mm〜３mmおよび長さ約０．５〜約１０mmを有する、比較的大型のロッド形インプラントを収容することが可能である。一変形形態では、ロッドは、約０．１mm〜約１mmの直径を有する。別の変形形態では、ロッドは、約０．３mm〜約０．７５mmの直径を有する。なおさらなる一変形形態では、多様なジオメトリーであるがおよそ類似した体積を有する他のインプラントも使用することができる。

生分解性インプラントは、強膜切開後に鉗子、トロッカー（trocard）、または他の種類のアプリケーターによる留置などの多様な方法によって眼に挿入することができる。場合により、トロッカーまたはアプリケーターは、切開を行わずに使用することができる。好ましい一変形形態では、手持ち型アプリケーターは、眼に一つまたは複数の生分解性インプラントを挿入するために使用される。手持ち型アプリケーターは、典型的には１８〜３０GAステンレス鋼針、レバー、アクチュエーター、およびプランジャーを備える。後眼領域または部位に一つまたは複数のインプラントを挿入するために適する装置には、米国特許出願第１０／６６６，８７２号に開示された装置が含まれる。

以下の実施例および図面によって本発明をさらに例示する。しかしながら、これらの実施例が何らかの点で本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。

実施例１：神経網膜は新規なミネラルコルチコイドターゲットである：アルドステロンはミュラーグリア細胞におけるイオンチャネルおよび水チャネルをアップレギュレーションする
要約
グルココルチコイド（Ｇ）は糖尿病黄斑浮腫を軽減するが、Ｇの効果の根底をなすメカニズムの解明は不十分である。Ｇは、グルココルチコイド（ＧＲ）レセプターおよびミネラルコルチコイド（ＭＲ）レセプターに結合することができる。本発明者らは、ＭＲの活性化が網膜の水分補給に影響しうるという仮説を立てている。培養網膜ミュラーグリア細胞（ＲＭＧ、網膜の液体ホメオスタシスに寄与する）、ルイスラット網膜外植片、およびアルドステロンを注射された眼由来の網膜におけるイオン／水チャネルの発現に及ぼすＭＲアゴニストであるアルドステロンの効果（２４時間）を検討した（リアルタイムＰＣＲ、ウエスタンブロット、免疫蛍光）。本発明者らは、ＭＲ、ＧＲおよび１１−βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＩ型の細胞特異的発現を証明した。アルドステロンは、ＭＲおよびＧＲを占有することによりナトリウムチャネルＥＮａＣ−α（６．５倍）およびカリウムチャネルＫｉｒ４．１（１．９倍）の発現を有意に高め、その一方でアクアポリン４（ＡＱＰ４、２．９倍）のアップレギュレーションはＭＲ選択的である。アルドステロンの硝子体内注射は、網膜膨化（偽注射された眼よりも２４％増加）およびＲＭＧの活性化を誘導する。それは、ＲＭＧの頂端側微絨毛方向へのＫｉｒ４．１およびＡＱＰ４の追加的な配置を促進する。本発明者らの結果は、神経網膜のミネラルコルチコイド感受性を際立たせ、アルドステロンがＲＭＧでのイオンチャネル／水チャネル発現のレギュレーションにより健康な網膜の水分補給をコントロールすることを示している。これらの結果は、病的網膜における異常なＭＲシグナル伝達を将来的に研究するための理論的根拠を提供している。

緒言
イオンチャネルおよびアクアポリンは、網膜細胞においてディファレンシャルに発現され、網膜水分補給を適切にコントロールするために重大なイオンおよび水の移動において重要な役割を果たす。特に、網膜ミュラーグリア細胞（ＲＭＧ）は、一方で網膜ニューロンと網膜血管の間の、他方で硝子体腔および網膜下腔との解剖学的で機能的な関係を確立することから、網膜の水分補給のコントロールおよびカリウムのホメオスタシスのための主要な要素である。網膜排水過程における任意の変化は、網膜浮腫につながる。

高用量のコルチコステロイドは、網膜に及ぼすその抗炎症効果および抗浮腫効果のため、現在、黄斑浮腫を有する患者の硝子体腔に注射されるが、しばしばおよび時々、眼内高血圧などの重篤な副作用またはパラトーシスによる網膜細胞生存率の減少が原因の毒性と関連していることがある。眼におけるグルココルチコイドの効果の根底となる分子メカニズムは、ほとんど未知のままであって、グルココルチコイドホルモンがグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）およびまたミネラルコルチコイドレセプター（ＭＲ）への結合によって作用することまで分かっている。実際、ＭＲは、アルドステロンおよび血漿中に広く存在するグルココルチコイドホルモンに対して類似の高い親和性を有する。循環中のグルココルチコイドによるＭＲの永続的占有は、ＭＲおよびＨＳＤ２を共発現するミネラルコルチコイド感受性組織中の代謝酵素１１−βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼＩＩ型（ＨＳＤ２）によって大部分阻止される。ＧＲおよびＭＲの両方は、核内レセプタースーパーファミリーに属するリガンド依存性転写因子である。ＧＲは細胞のホメオスタシスおよび代謝に多面的効果を発揮するが、ＭＲは古典的に腎臓のナトリウム再吸収のレギュレーションに関与している。実際、アルドステロン／ＭＲ経路は、複雑な事象のカスケードを経由して腎臓集合管における上皮ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）の活性をアップレギュレーションし、Ｋチャネルのレギュレーションによってカリウム排出にも有利に働く。

新規なＭＲターゲット組織（心臓、血管、脳、皮膚、脂肪細胞、マクロファージなど）が次々と同定されることで、このレセプターの予想外の役割が明らかとなった。興味深いことに、ＭＲは眼にも発現されるが、その生物学的活性および潜在的臨床的関連性に関する情報が欠如している。特に網膜では、ＭＲ、ＧＲおよびＨＳＤ２の機能および細胞特異的発現は、完全に確立された状態からほど遠い。コルチコステロイドホルモン、特にアルドステロンが正常な網膜のホメオスタシスに寄与しているかどうか、そしてどのように寄与しているかは、現在未確定である。本発明者らは、ＭＲが網膜の液体ホメオスタシスに関与しうるという仮説を立てた。

これに関連して、イオンチャネルおよび水チャネルのレギュレーターとしてのアルドステロンの応答（２４時間）を実証するために本研究を計画した。本発明者らは、ＭＲ、ＧＲおよびＨＳＤ２がラット神経網膜に共発現されることを示す。本発明者らは、急速眼内アルドステロン注射がおそらく神経網膜中の液体貯留によって網膜厚を増大させることを見出した。ＲＭＧにおいて、アルドステロンは、ＭＲおよび主にＧＲの活性化により内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ４．１およびＥＮａＣのαサブユニットの発現をレギュレーションし、一方でアクアポリン４（ＡＱＰ４）は、アルドステロン／ＭＲ経路によって特異的にアップレギュレーションされる。アルドステロンは、また、ミュラー細胞の頂端側微絨毛方向へのＫｉｒ４．１およびＡＱＰ４の配置に有利に働く。まとめると、本発明者らの結果は、神経網膜、より具体的にはＲＭＧ細胞がアルドステロンの新規なターゲットであることを実証している。したがって、このホルモンを健康な網膜のホメオスタシスおよび水分補給のレギュレーションでの新規な演じ手と見なすことができる。

材料および方法
動物：全ての実験は、European Communities Council Directive 86/609/EECに準じて行われ、地域の倫理委員会によって承認された。成雌性ルイスラット（８〜１２週齢、Janvier, Le Genest-Saint-Isle, France）をＲＭＧ初代培養物の調製、網膜器官培養物およびin vivo実験のために使用した。二酸化炭素の吸入によってラットを屠殺した。

ラットＲＭＧ初代培養：記載されたようにラットＲＭＧ細胞を得た（de Kozak, Y., Naud, M. C., Bellot, J., Faure, J. P., and Hicks, D. (1994) Differential tumor necrosis factor expression by resident retinal cells from experimental uveitis-susceptible and -resistant rat strains. J Neuroimmunol 55, 1-9）。簡潔には、生後（ＰＮ）１７日（ＲＭＧ細胞が成熟する時期）のラットを屠殺し、眼を摘出した。インタクトな眼球をＤＭＥＭ中で一晩室温において暗条件で維持し、次に２mg/mlトリプシン／コラゲナーゼＩと共に３７℃で４５分間インキュベーションした。神経網膜を水晶体および硝子体から分離し、小さなフラグメントに切断し、１０％ＦＣＳ、１００ユニット/mlペニシリン、１００μg/mlストレプトマイシン、および０．２％アンホテリシンＢを補充されたＤＭＥＭが入ったペトリ皿に蒔いた。５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で培養物を３７℃で維持した。５〜６日後に、培養物を培地で徹底的に洗浄し、強く接着した扁平な細胞集団だけが残るようにした。

培養細胞のコルチコステロイド処置：ミュラー細胞を６ウェル組織培養プレート（Becton Dickinson, Le Pont de Claix, France）中に蒔いた。ラットＰＮ１７ ＲＭＧ細胞をその最初のペトリ皿中に維持した。集密近い（８０％）細胞を、１０％無ステロイド（炭末処理）ＦＣＳを補充された培地中で２４時間インキュベーションした。次に、コルチコステロイド（Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France）処理をそれぞれさらに２４時間適用した：１０nMアルドステロン、１０nMアルドステロン＋１μM ＲＵ３８４８６（ＧＲ特異的アンタゴニスト）、１０nMアルドステロン＋１μM ＲＵ２６７５２（ＭＲ特異的アンタゴニスト）または１μM デキサメタゾン。０．１％エタノール含有２％無ステロイドＦＣＳ培地中にステロイドを予め溶かしておいた。培地中の０．１％エタノールで対照細胞を処理した。アンタゴニスト単独の添加（すなわちアルドステロン不在下）もミュラー細胞に行ったが、分析された遺伝子の発現を誘導しなかった。

ラット網膜外植片：眼球摘出後に、ラット網膜を無菌条件で直ちに単離し、４片に切断した。次に、それらをCyclopore０．２μmポリカーボネート膜（Whatman, Maidstone, England）上に移し、硝子体側を上にフラットマウントした。１０％無ステロイドＦＣＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび０．１％アンホテリシンＢを補充されたＤＭＥＭ ２mlが入っている６ウェル組織培養プレート中に支持膜を配置した。培養細胞に関して記載したように外植片をコルチコステロイドで処理した。同様に、網膜外植片に及ぼすアルドステロン（０．１〜１００nM）の用量依存効果を別々の実験で分析した。

逆転写とリアルタイムＰＣＲ：処理されたＲＭＧ細胞および網膜外植片からRNeasy Mini Kit（Qiagen, Courtaboeuf, France）を使用して総ＲＮＡを単離した。DNase I（Qiagen）処理後にランダムプライマー（Invitrogen）およびsuperscript II逆転写酵素（Invitrogen）を使用して第一鎖ｃＤＮＡを合成した。TaqMan（登録商標）（Applied Biosystems）またはSYBR（登録商標）Green（Invitrogen, Cergy Pontoise, France）のいずれかの検出を用いて、7500 Real-Time PCR System（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）で行ったリアルタイムＰＣＲによってＥＮａＣ−α、Ｋｉｒ４．１およびＡＱＰ４の転写物レベルを分析した。内部対照として１８Ｓを使用した。

ウエスタンブロット：プロテアーゼ阻害剤の存在下、Ｎｐ４０緩衝液中で網膜外植片をホモジェナイゼーションした。ブラッドフォード法によってタンパク質濃度を決定した。等量のタンパク質（１２μg）をNovex（登録商標）４％〜１２％トリス−グリシンゲル（Invitrogen）上で分離し、ニトロセルロースに転写し、ブロットを一次抗体と共に４℃で一晩インキュベーションした。その膜を洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：３０００、Vector, AbCys, Paris, France）と共に室温で１時間インキュベーションし、ECL Plusウエスタンブロット検出試薬（GE healthcare, Orsay, France）を使用して現像させた。β−アクチンを内部対照として使用した。以下の一次抗体を使用した：ウサギ抗αＥＮａＣ（１：５００、Abcam, Cambridge, MA, USA）、ウサギ抗Ｋｉｒ４．１（１：４００、Alomone Labs, Jerusalem, Israel）、ウサギ抗ＡＱＰ４（１：７５０、Millipore, St Quentin en Yvelines, France）およびウサギ抗β−アクチン（１：１０００、Abcam）。

ラット眼への硝子体内注射：ケタミン（１００mg/kg, Virbac, Carros, France）およびクロルプロマジン（０．６５mg/kg, LARGACTIL（登録商標）, Sanofi Aventis, Livron sur Droeme, France）の筋肉内注射によってラットの麻酔を誘導した。３０Ｇ針を装着した微小（３００μl）シリンジを使用して局所麻酔（テトラカイン１％、Aldrich, Lyon, France）下で硝子体内注射を行った。０．９％食塩水中に希釈して注射用濃度２００nM（硝子体内終濃度２０nMに対応）にしたアルドステロン５μlをラットの眼に注射した。対照ラットの眼に食塩水５μlを注射した。注射の２４時間後に、ラットを屠殺した。次に、網膜のフラットマウント、免疫組織化学分析および形態分析をそれぞれ行うために、眼を取り出した。

網膜のフラットマウント：４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、LADD, Inland Europe, Conflans-sur-Lanterne, France）中で眼を１５分間固定した。洗浄後、網膜を単離し、直角の４回の切開により切断し、アセトン１００％で−２０℃において１５分間後固定した。次に、それらを１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で再水和させ、ＡＱＰ４に対するウサギポリクローナル抗体（１：１００）またはグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対するウサギポリクローナル抗体（１：１００、Dako, Trappes, France）と共に室温で撹拌しながら一晩インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄後にAlexa Fluor 488結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：１００、Molecular Probes, Leiden, Netherlands）を１時間適用した。Bandeiraea simplicifolia BS-1由来ＴＲＩＴＣラベル化レクチン（１：１００、Sigma-Aldrich）で血管を染色した。ゲルマウント剤（Biomeda Corp., VWR, Fontenay-sous-Bois, France）を使用して網膜をフラットマウントした。共焦点レーザ走査顕微鏡Zeiss LSM 710（Oberkochen, Germany）を使用して画像を取得した。

免疫蛍光：Tissue-Tek OCT配合物（Bayer Diagnostics, Puteaux, France）中で眼を急速凍結させた。ラット眼の１０μmクリオスタット切片を４％ＰＦＡ中で１５分間固定し、０．１％トリトンＸ−１００で３０分間透過処理した。非特異的結合部位を５％正常ヤギ血清で１時間ブロッキングした。次に、切片を一次抗体と共に室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳ中で洗浄し、さらに二次抗体と共に１時間インキュベーションした。洗浄後に、スライドを４’，６−ジアミジノ−２−フェニル−インドール（ＤＡＰＩ、１：３０００、Sigma-Aldrich）で５分間染色し、再度洗浄し、ゲルマウント剤でマウントした。対照切片を一次抗体不在下で染色した。ＣＣＤカメラ（Olympus DP70）を備える蛍光顕微鏡（Olympus BX51, Rungis, France）を使用して画像を取得した。以下の抗体を使用した：ウサギ抗αＥＮａＣ（１：１００）、ウサギ抗Ｋｉｒ４．１（１：２００）、ウサギ抗ＡＱＰ４（１：２００）、Alexa Fluor 488結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：２００）、およびAlexa Fluor 596結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：２００、Molecular Probes）。

免疫組織化学法：摘出した眼を４％ＰＦＡ中で２時間固定し、脱水し、パラフィン中に包埋した。キシレン中で１０μｍ切片からパラフィンを除去し、段階的なアルコール系列で水和させ、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）中で洗浄した。クエン酸緩衝液中で加熱することによる抗原賦活化および３％ Ｈ２Ｏ２による内因性ペルオキシダーゼの不活性化の後に、３％正常ウマ血清またTyramide Signal Amplification（ＴＳＡ）キット（Perkin Elmer, Courtaboeuf, France）中のブロッキング緩衝液と共に切片をインキュベーションし、非特異的シグナルを減少させた。一次抗体を４℃で一晩適用した。ＰＢＳＴ中で洗浄後に、切片をビオチン化二次抗体と共に室温で４５分間インキュベーションした。ＴＳＡキットまたはVECTASTAIN ABCキット（Vector）を用いて、製造業者の説明書に準じてシグナルの増幅を得た。３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（Dako）を用いてシグナルを明らかにした。ラット腎臓切片を陽性対照として使用した。陰性対照は一次抗体不在下で行った。以下の抗体を使用した：マウス抗ＭＲモノクローナル抗体６Ｇ１（１：１００、親切にもC. Gomez-Sanchez, Division of Endocrinology, University of Mississippi Medical Center, Jackson, MSから提供を受けた）、ヒツジ抗１１β ＨＳＤ２（１：２０００、Millipore）、ウサギ抗ＧＲ（１：２０００、Santa Cruz, Heidelberg, Germany）、ウサギ抗αＥＮａＣ（１：２００）、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ ＢＡ２０００（１：２５０、Vector)、ビオチン化ウサギ抗ヒツジＩｇＧ ＢＡ６０００（１：４００、Vector）、およびビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ ＢＡ１０００（１：５００、Vector）。

形態：摘出した眼をカコジル酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中の２．５％グルタルアルデヒド中で固定した。３０分後に、角膜縁のレベルで眼を解剖し、水晶体を取り出した。後部をさらに５時間固定し、段階的なアルコール系列（５０％、７０％、９５％および１００％）中で脱水させ、エポキシ樹脂中で包埋した。ウルトラミクロトーム（Reichert Ultracut E, Leica, Wetzlar, Germany）を使用して準薄切片（１μm）を切り出し、トルイジンブルーで染色した。形態を光学顕微鏡（DMRB, Leica）下で観察した。周辺から後極に１００μm毎に網膜厚を手作業で測定した。分析のために、網膜を周辺、中間および後極の３個のゾーンに分けた。各ゾーンにおいて、各切片で３〜４回の個別の測定を行った。ラット１匹あたり２〜６枚の切片を分析した（アルドステロン硝子体内注射を受けたラット３匹および偽注射を受けた３匹）。

統計：データを平均±ＳＥとして表示した。Graphpad Prism5プログラム（Graphpad Software, San Diego, CA, USA）を使用して統計解析を行った。２群についてはスチューデントのｔ検定を用い、多群については一元配置ＡＮＯＶＡ検定に続くボンフェローニ比較を行った。Ｐ＜０．０５を有意と見なした。

結果
ＭＲ、ＧＲおよびＨＳＤ２は、網膜細胞において共発現される：アルドステロン依存性効果を調査するための必要条件として、ラット網膜におけるコルチコステロイドレセプターの発現を評価した（正常なラット網膜の準薄切片中に網膜の異なるゾーンを理解のために用意する）。本発明者らは、ＧＲがいくつかの網膜ゾーンに発現し、ＭＲも同じ網膜領域、すなわち神経節細胞（神経節細胞層、ＧＣＬ）の核、ならびに双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞およびＲＭＧ細胞を含む内顆粒層（ＩＮＬ）中の細胞の核に発現していることを見出した。ＲＭＧ細胞の核は、主としてＩＮＬの中央部分に位置する。網膜ＭＲの免疫組織化学検査の特異性を評価するために、ＭＲ抗体を腎臓切片に使用し、免疫ラベルが予想通り遠位ネフロンに限定されることを示した。ＭＲプロテクター酵素ＨＳＤ２はＭＲと類似の配置を有し、神経節細胞およびＩＮＬの細胞、ならびに陽性対照として提供された遠位ネフロンに存在した。免疫組織化学法は定量法ではないものの、網膜および腎臓集合管においてＭＲとＨＳＤ２のラベル強度が匹敵することから、腎臓と同様に眼におけるそれらの顕著な発現レベルがアルドステロン／ＭＲ特異的効果を完全に可能にするはずであることが示唆される。

アルドステロンは網膜内液体貯留を誘導する：ルイスラットの硝子体腔内へのアルドステロン（２０nM）の単回注射は、２４時間後に網膜の形態変化を誘導する。準薄切片の観察から、偽注射された網膜に比べて網膜全体、特に外顆粒層（ＯＮＬ）の顆粒の中間への液体貯留が示される。延長したＲＭＧ細胞の頂端側突起またはそれら周辺の細胞外腔が膨潤して見えた。網膜厚は、偽注射された眼よりもアルドステロンを注射された眼の方が有意に増加している。

アルドステロンはグリアの活性化を高める：ＧＦＡＰは、ＲＭＧおよび網膜星状膠細胞に存在する中間フィラメントタンパク質である。そのアップレギュレーションは、網膜ストレス条件下での初期事象である。偽注射された網膜に比べてアルドステロンを注射された網膜における延長したＲＭＧ細胞に沿ったＧＦＡＰ分布によって示唆されるように、アルドステロンはグリアの活性化を高める。偽注射された網膜では、ＧＦＡＰは、主にＲＭＧのエンドフィートおよび神経線維層（ＮＦＬ）の星状膠細胞中に発現している。アルドステロンを注射された網膜では、ＮＦＬでＧＦＡＰの免疫染色が高まり、延長したＲＭＧ全体に沿って外境界膜（ＯＬＭ）中の頂端側突起まで伸びる。

アルドステロンおよびデキサメタゾンは、ＲＭＧ細胞におけるＥＮａＣ−αをアップレギュレーションする：ナトリウムチャネルＥＮａＣは、ナトリウムを輸送する網膜集合管細胞における主なミネラルコルチコイドターゲットである。本発明者らは、ＥＮａＣが網膜細胞中に発現しており、その発現がコルチコステロイドによってレギュレーションされることを見出した。アルドステロン（１０nM、２４時間）は、ラットＲＭＧ初代培養物およびラット網膜外植片においてＥＮａＣ−αサブユニットのｍＲＮＡ発現の有意なアップレギュレーションを誘導する。ＥＮａＣ−αサブユニット転写物の増加は、ＭＲ（ＲＵ２６７５２）アンタゴニストおよびＧＲ（ＲＵ３８４８６）アンタゴニストの両方によって阻害されるが、これは、アルドステロンによって誘導されたＥＮａＣ−αのアップレギュレーションがＭＲ依存性で、かつ大部分ＧＲ依存性であることを示している。このことは、グルココルチコイドアゴニストであるデキサメタゾンがＥＮａＣ−αの発現を増加させる効率によってさらに確認される。アルドステロンは、ＥＮａＣ−α転写物を用量依存的に増加させ；タンパク質レベルでのその発現もアップレギュレーションされ、アルドステロンによって誘導されるＥＮａＣタンパク質は、ＭＲアンタゴニストＲＵ２６７５２の存在下で減少しない。

食塩水を注射されたラット由来の網膜でのＥＮａＣの免疫局在は、ＥＮａＣ−αがＩＮＬ中の細胞に発現しており、細胞膜に一部が局在していることを示している。アルドステロンを注射された眼では、ＥＮａＣ−α発現の強度およびＥＮａＣ−αを発現している細胞数は、ＩＮＬで増加している。同じＥＮａＣ抗体を使用した腎臓切片に対する対照実験（ペルオキシダーゼ免疫組織化学法）から、ＥＮａＣ−αラベル化の特異性が集合管に限定されるが、一次抗体なしの組織化学法で陰性であることが確認される。

アルドステロンおよびデキサメタゾンは、網膜におけるカリウムチャネルＫｉｒ４．１の発現をコントロールする：Ｋｉｒ４．１は、ＲＭＧ細胞における主要なカリウムチャネルと見なされ、その発現パターンが実証されている。ラットＲＭＧ初代培養物および網膜外植片において、アルドステロンおよびデキサメタゾンの両方がＫｉｒ４．１をアップレギュレーションし；ＧＲアンタゴニストＲＵ３８４８６は、それを減少させる効果が十分にあり、一方でＭＲアンタゴニストの方が弱い効果（または無効果）を有する。転写物における用量依存的増加は、１０nMアルドステロンで十分に飽和しているように見える。タンパク質レベルでのチャネル発現も、アルドステロンによってアップレギュレーションされ；アルドステロンによって誘導されるＫｉｒ４．１タンパク質は、ＭＲアンタゴニストＲＵ２６７５２の存在下で減少する。本発明者らは、ｍＲＮＡおよびタンパク質に対するＲＵ２６７５２の多様な効果に関して明らかな説明はできないが、本発明者らは、ウエスタンブロットによって観察された効果がアルドステロンによるＫｉｒ４．１レギュレーションを最もよく反映しうると考える。したがって全体として、本発明者らは、Ｋｉｒ４．１が（ＧＲ依存性であることに加えて）ＭＲ経路によってレギュレーションされうることを示すデータを提供する。

加えて、本発明者らは、アルドステロンを注射されたルイスラット眼の網膜中のＫｉｒ４．１の配置における変化を観察した。偽注射されたラットでは、Ｋｉｒ４．１は、主にＩＮＬ中および内網膜層の血管に沿って、ならびに内境界膜レベルでミュラーエンドフィート中に局在する。硝子体内アルドステロンは、ＯＬＭ中のＲＭＧ頂端側微絨毛におけるＫｉｒ４．１免疫蛍光の強化につながる。これらの結果は、アルドステロンがＫｉｒ４．１の発現をアップレギュレーションするだけでなく、ＲＭＧ細胞内のその空間分布も変化させることを示している。

アルドステロンは、ＲＭＧ細胞では特異的ＭＲ活性化によって、およびラット網膜ではin vivoで、ＡＱＰ４をアップレギュレーションする：ミュラー細胞は網膜体積のレギュレーションに関与し、ニューロン活動時の過剰な水の貯留を阻止する。これは、ＡＱＰ４を通過する水の流動を促進することによって達成される。アルドステロンをＲＭＧ初代培養物または網膜外植片に添加した場合、本発明者らは、ＡＱＰ４ ｍＲＮＡの発現増加を観察したが、グルココルチコイドアゴニストであるデキサメタゾンは無効である。アルドステロンの効果は、ＭＲアンタゴニストＲＵ２６７５２によって完全に抑制され、その効果が主にＭＲ活性化に依存することを示している。ＧＲアンタゴニストＲＵ３８４８６は、おそらく種差が原因で（ラット網膜においてＡＱＰ４の発現はアルドステロンによって活性化されたＧＲに部分的に依存しうるが、ヒト細胞ではそうでない）、アルドステロンによるラット試料中のＡＱＰ４誘導を何らかの理由で減少させる。ｍＲＮＡにおけるアルドステロン依存性増加は１０nMで飽和している。このホルモンは、タンパク質レベルでもＡＱＰ４の発現を増加させるが、この作用はＲＵ２６７５２によって遮断される。全体として、ＡＱＰ４は、ミュラー細胞における真のミネラルコルチコイド特異的ターゲットのように見える。

本発明者らは、アルドステロンが網膜内のＡＱＰ４の発現パターンを変化させることも見出した。偽注射されたラットでは、ＡＱＰ４は、ＲＭＧのエンドフィートおよび血管周囲の延長したＲＭＧ細胞に配置されているが、ＯＬＭレベルでは発現していない。アルドステロンを注射された眼では、ＡＱＰ４の発現は、ＲＭＧのエンドフィートおよび血管周囲で高まるだけでなく、延長したＲＭＧ全体に沿ってＯＬＭのその頂端側微絨毛まで伸びる。

偽注射またはアルドステロン注射された眼由来のフラットマウントされたラット網膜の共焦点イメージングは、in vivoでアルドステロンによって誘導されるＡＱＰ４配置の変化を示す。偽注射された眼よりもアルドステロンを注射された眼の方が、ＧＣＬおよびＮＦＬに局在する表在性血管ならびに深部毛細血管周囲で血管周囲のＡＱＰ４蛍光が強い。そのうえ、偽注射された眼よりもアルドステロンを注射された眼の方がＯＬＭにおけるＡＱＰ４シグナルがずっと大きい。したがってアルドステロンは、ＲＭＧ細胞におけるＡＱＰ４の発現レベルをアップレギュレーションし、その細胞分布をin vivoで改変する。

考察
アルドステロンおよびミネラルコルチコイドレセプターは、腎尿細管の遠位部における腎臓ナトリウム再吸収の重要なモデュレーターであって、心筋細胞、血管内皮細胞、角化細胞またはニューロンのような非上皮細胞を含むいくつかの非腎臓組織においても作用する。基礎をなすシグナル伝達経路が大きく未確定なままであるものの、腎外効果の際立った特徴は、過度のミネラルコルチコイド活性化と病態の間の関連にある。例えば、心不全におけるＭＲ拮抗の有益効果に関する報告は、過度のＭＲシグナル伝達が心血管の損傷を引き起こすという考えを導いた。マウスにおける脳特異的なＭＲの過剰発現から推測されるように、ニューロンＭＲは、脳において不安のモデュレーションに関与し得る。最近になって、眼もＭＲを発現することが示され、網膜の血管病態へのその関与が、酸素誘導網膜症のラットモデルで示された。アルドステロン自体は、網膜血管新生を促進しないのに対し、ＭＲの拮抗作用はこのモデルにおける炎症および酸化ストレスに関連する病的血管新生を軽減した。この報告は、網膜におけるＭＲの発現も実証した。本研究は、ＭＲが神経節細胞および内顆粒層細胞に発現していることを確認している。ＭＲの発現は、また、ラットＲＭＧの初代培養物およびラット網膜外植片から見出された。加えて、本発明者らは、以前に決定されなかった網膜における細胞特異的なＧＲ発現パターンを提供する。本発明者らは、ＭＲがＭＲプロテクター酵素ＨＳＤ２と共発現することでアルドステロン特異的なＭＲ占有およびＲＭＧ細胞における効果を許すことも示している。レセプター後の選択性メカニズムに関連する、ＨＳＤ２による大部分のグルココルチコイドの不活性化は、網膜における特異的アルドステロン作用のための条件を提供するはずである。

健康な網膜におけるアルドステロンの一次効果を解明する第一ステップとして、本発明者らは、眼の硝子体へのアルドステロン注射が２４時間後の網膜厚増加につながることを示した（液体貯留を暗示）。アルドステロンは、ＧＦＡＰの免疫染色によって実証されるようにＲＭＧ細胞も活性化する。そのような活性化は、非特異的なＲＭＧストレスを示す。ＲＭＧ細胞の関与を実証するために、本発明者らは、培養ＲＭＧ細胞および網膜外植片における２４時間アルドステロン処置の効果を評価した。ＲＭＧ細胞がアルドステロンに感受性でありうるという考えは、文献で以前にほとんど想起されていない。注目すべきは４０年前にアルドステロンがニワトリ胚の発生途中の網膜においてグルココルチコイドとほぼ同じ効力でグルタミンシンセターゼ活性（ＲＭＧ特異的酵素）を誘導したことが報告された。

腎臓集合管において、ＥＮａＣは、アルドステロン／ＭＲの古典的ターゲットである。ＲＭＧ中のアミロライド感受性ナトリウムチャネルの存在が以前に報告されており、ＥＮａＣが細胞体積のレギュレーションに関与しうることが提唱されている。ミネラルコルチコイドおよびグルココルチコイドの誘発後のＲＭＧにおけるＥＮａＣ−α発現強化という本発明者らの結果は、上皮細胞に関してなされたいくつかの報告と対応する。それは、コルチコステロイドホルモンおよびＥＮａＣが細胞膨化に順応し、かつ／または網膜腔から網膜血管または硝子体方向の液体クリアランスに参加する役割に疑問を投げかける。したがって、アルドステロン介在性のＮａ流入は、ＲＭＧ細胞においてホルモン誘発時に起こりうる。

本研究は、アルドステロンがカリウムチャネルＫｉｒ４．１および水チャネルＡＱＰ４をアップレギュレーションすることを示す。Ｋｉｒ４．１は、ＲＭＧの主要なカリウムチャネルであり、ＲＭＧで、その極性化発現は活動ニューロン周囲の細胞外腔からＲＭＧへのＫ流入、および網膜血管および硝子体へのその送達（「カリウムサイフォン」と呼ばれる過程）を可能にする。水チャネルＡＱＰ４は、ＲＭＧ細胞内外への水の移動を可能にすることが示されている。ＡＱＰ４を通過する水の流動が網膜膨化および細胞毒性浮腫をコントロールするために重要であるという証拠が提供されている。Ｋｉｒ４．１とＡＱＰ４との共発現および機能的相互作用は、網膜内層の浸透圧ホメオスタシスを確実にする。Ｋｉｒ４．１の分布がＡＱＰ４ノックアウトマウス由来のＲＭＧで影響されず、ＡＱＰ４ノックアウトマウス由来のＲＭＧにおける水透過性の減少がＫ電流の変化を伴わないことから、この機能的相互作用は、最近疑問視されている。

本明細書に報告されたデータは、１０nMアルドステロン（すなわち、ex vivoでミネラルコルチコイドの効果を誘発するために通常見られる濃度）（より低い用量がin vivoで実際に有効である）で組織／細胞を処置後に得られたものである；例えば、ＭＲ介在性応答は、腎細胞、大動脈内皮細胞または網膜内皮細胞において少なくとも１０nMのアルドステロンで誘発後に起こることが報告された。観察された応答の特異性を実証するために、本発明者らは、１）アルドステロンの用量依存的効果ならびに古典的ＭＲアンタゴニストおよびＧＲアンタゴニストを用いた競合実験、ならびに２）デキサメタゾン処置から生じた情報を組み合わせた。全体的に見て（そして種／組織／細胞の状況に応じた応答の幾分の差、および網膜細胞におけるアルドステロンとグルココルチコイドの間の遺伝子発現コントロールのある程度のオーバーラップにもかかわらず）、ＡＱＰ４は、ＥＮａＣおよびＫｉｒ４．１はＧＲ／ＭＲの協調したコントロール下にありうるが、本質的にアルドステロンによるＭＲ活性化によってレギュレーションされるように見える。一般にＭＲおよびＧＲは、細胞の状況により各レセプターの相対的寄与に変動を伴うものの、部分的にオーバーラップする遺伝子発現コントロールを行うと考えられる。しかしながら、ＭＲおよびＧＲは、各レセプターの不活性化が周生期死につながり、それが他のレセプターによって救済できないことから、機能重複しない（not redundant）。

本発明者らは、２４時間のアルドステロン処置が、神経網膜と脈絡膜血管の間の関門を形成する網膜色素上皮（ＲＰＥ）に面する網膜外層でのＲＭＧの頂端側領域方向へのＫｉｒ４．１およびＡＱＰ４の配置も促進することを見出した。これは、健康な網膜でのミネラルコルチコイドシグナル伝達の強化が網膜の異なる区画内の正常な液体ホメオスタシスを改変しうることを示す。硝子体内アルドステロン注射後に観察された網膜厚の増大は、液体貯留を示唆している。ＲＰＥおよび脈絡膜毛細血管に面するミュラー細胞領域中のチャネルの再配置は、ミュラー細胞から網膜下腔方向への液体移動に有利に働くはずである。しかしながら、ＲＰＥを通過する脈絡膜毛細血管方向への網膜液体クリアランスは、網膜最外部においてアルドステロンが推進するＡＱＰ４／Ｋｉｒ４．１介在性液体移動に打ち勝ちには不十分なことから、網膜膨化に至るおそれがある。ＡＱＰ４の発現増加が、星状膠細胞およびミュラー細胞の膨化を示して存在する低酸素網膜において報告されている。したがって、本発明者らの結果は、ＡＱＰ４が網膜膨化に重要な役割を果たすという考えに一致する。

腎組織で実証された、ＭＲの拮抗が組織損傷を限定する効力から、糖尿病では過度のＭＲ活性が推定されている。アルドステロン／ＭＲシグナル伝達障害が、糖尿病網膜症と同様に慢性網膜浮腫の構成に関与しうることは、まだ検討されていない。ＭＲ活性がスピロノラクトンまたはエプレレノンのようなアンタゴニストの硝子体内注射によってブロッキングできることから、これは、明らかに重要な問題である。

結論として、本研究は、ホルモンであるアルドステロンが網膜の液体ホメオスタシスに寄与する新しいシグナル伝達経路を確認するものである。それは、病理学、特に糖尿病における網膜でのＭＲの機能をさらに検討するための理論的根拠を提供するはずである。

実施例２：少量のグルココルチコイドとＭＲアンタゴニストとの同時投与は、糖尿病網膜症、緑内障、虚血、近視、中心性漿液性網脈絡膜症、または滲出型加齢性黄斑変性に関連する網膜中および／または網膜下における液体貯留の処置に特に適する。
本発明者らは、いくつかの実験を行った。以下にその結果を示す：
− アルドステロンは、ＲＭＧ細胞での水チャネルＡＱＰ４のｍＲＮＡ発現をアップレギュレーションする；アルドステロンとＭＲ特異的アンタゴニスト（ＲＵ２６７５２）との同時投与は、その誘導を完全にブロッキングし、ＡＱＰ４のアップレギュレーションがＭＲの占有により起こることを示している。
− トリアムシノロン（ＴＡ）は、ＡＱＰ４の発現を減少させ、これは、アルドステロンと明らかに反対の効果であることから、ＭＲ特異的アンタゴニストの効果を模倣している。したがって、グルココルチコイドおよびＭＲアンタゴニストは、ＡＱＰ４の発現に対して匹敵する効果を有し、これは、ＭＲアンタゴニストの投与が、トリアムシノロン処置の際に観察された効果に匹敵する抗浮腫効果を網膜に提供することを示唆している。
− グルココルチコイドであるデキサメタゾン（Ｄｅｘ）は、ＭＲの遺伝子発現を減少させ、これは、ＭＲアンタゴニストの添加によって反転されない効果である。

したがって、ＭＲアンタゴニストと共に少量のグルココルチコイドを投与することは、特に、糖尿病網膜症、緑内障、虚血、近視、中心性漿液性網脈絡膜症、または滲出型加齢性黄斑変性に関連する網膜中および／または網膜下における液体貯留の処置に適する。実際に、そのような組み合わせは、網膜におけるＭＲ活性化によって誘導される有害作用を回避するであろう。

実施例３：中心性漿液性網脈絡膜症
中心性漿液性網脈絡膜症（ＣＳＣＲ）は、主に後極、より具体的には黄斑を襲う急性漿液性網膜剥離である。この疾患は、脈絡膜血管拡張から始まり、次に網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）間結合装置の開放、次に網膜中および／または網膜下における液体貯留が続く。

認識されているリスク因子の中で、コルチコステロイド療法（corticotherapy）およびストレスが主な事象として同定されている。ステロイドが黄斑下でこの液体貯留を誘導するメカニズムは分かっていない。

７０％の症例で状態は約３ヶ月で自然回復するが、慢性化が観察される場合があり、視力不良を生じる。約４０％の症例で、びまん性網膜上皮症（diffuse retinal epitheliopathy）につながる再発が観察される場合がある。慢性状態では、最終的に嚢胞を形成する黄斑網膜内液体貯留が観察される場合がある。

本発明者らは、内因性コルチゾールまたはコルチコステロイド療法による網膜での不適切なＭＲ活性化が内因性排液メカニズムを妨害するおそれがあるという事実から、ＣＳＣＲをＭＲアンタゴニストで効率的に処置できるという仮説を立てた。

本発明者らは、本明細書において、ＭＲ遺伝子に機能獲得型突然変異を担持し、ラット内因性コルチコステロイドであるアルドステロンまたはコルチコステロンの眼内注射を受けているブラウンノルウェーラットが、ＣＳＣＲに非常に近似した網膜病態を発生することを実証する（図１および２）。

黄斑液体貯留を呈する非消散性または慢性びまん性上皮症を有する患者は、特異的ＭＲアンタゴニストである経口エプレレノンで処置されている。

図３および４に、エプレレノンによって処置された患者の例を示す。図示のように、エプレレノンは、網膜における網膜下および／または網膜中の液体の非常に迅速で効率的な軽減を誘導する。効力の動態は、早くも使用の第１週である。

図３に、ＣＳＣＲを呈し、４ヶ月間追跡され、網膜における網膜下液体貯留の回復を示さなかった患者の症例を示す。反対に、４ヶ月後で処置の１週間前に液体量が貯留していた。患者は、特異的ミネラルレセプターアンタゴニストである２５mg/日のエプレレノンの経口投与を８日間受け、網膜下液の著しい減少を示した。次に、エプレレノンの用量を５０mg/日、８日間に増大させたところ、患者は再度改善を示し、２週間処置後にほぼ完全寛解した。４週間処置後に処置を中止し、６ヶ月目に患者は全く再発を示さなかった。

図４に、慢性型ＣＳＣＲ（またはびまん性上皮症）を有する患者の症例を示す。患者は、両眼に再発性ＣＳＣＲの長い病歴を有する。患者は、左眼（ＯＳ）に網膜下液を有する黄斑浮腫および網膜嚢胞を呈する。左眼の視覚は１／１０に低下し、浮腫は２年よりも前から慢性的である。

患者の右眼（ＯＤ）は、唯一の機能する眼であるが、２、３週間前から同様に網膜下液体貯留を示している。

患者は、エプレレノン２５mg/日で８日間、次に５０mg/日で３ヶ月処置された。処置から早くも１５日で、両眼の網膜下液の完全寛解があり、驚くことに数ヶ月間慢性であった黄斑嚢胞の全寛解もある。そのうえ、左眼の視覚は６／１０に回復した。６ヶ月の時点でもどちらの眼にも再発が観察されなかった。

結論
まとめると、本発明者らの実験結果は、ＭＲアンタゴニストの臨床効果と一緒に、ＭＲ活性化が網膜下液体貯留を誘導すること、およびＭＲアンタゴニストがＣＳＲＣまたはびまん性上皮症が原因の網膜下および／または網膜中の液体貯留を呈する患者の処置に有効であることを実証している。

実施例４：糖尿病網膜症に関する追加的な結果
Goto-Kakizaki（ＧＫ）ラットは、糖尿病網膜症のモデルとして使用されている。

本研究に使用された動物を、Association for Research in Vision and Ophthalmology（ＡＲＶＯ）にしたがって処置した。実験手順を提出し、それはParis Descartes Universityの倫理委員会によって承認された。

非インスリン依存性２型糖尿病のWistar系非肥満モデルであるＧＫラット（Taconic Europe, Denmark）を異なる高血糖齢で使用した。Accutrend ＧＣ装置およびAccu-checkコンパクト装置（Roche）を使用して血糖を測定し、血漿グルコース＞２５０mg/dlを糖尿病状態と見なした。ＧＫ糖尿病ラットは、生後１４週から屠殺時点まで対照に比べて高血糖を有した。対照は、齢がマッチし、血漿グルコース＜１５０mg/dlの非糖尿病ラットより選択した。

図５に、８および１２ヶ月のＧＫラットに生じている網膜病態を示す。

図６に、ＧＫラットにおけるスピロノラクトン（sprironolactone）（硝子体中に最終的に１μM）の硝子体内注射の効果を示す。

注射の２４時間後に（右欄）、網膜外層の厚さは減少し（赤色二重矢印）、外顆粒層（光受容器層）中の液体貯留（黄色矢印）は減少した。

１８月齢ＧＫラットでは、網膜電図（ＥＲＧ）測定を行った。それらの動物でα波およびβ波は、糖尿病発病時の３ヶ月の時点で行ったＥＲＧよりも有意に減少した。

１８ヶ月糖尿病ラットを１、３、５日目に硝子体内注射（１μM）で処置し、各注射の２４時間後に動物をＥＲＧで再検査した。

３回目の注射の２４時間後に、動物を屠殺し、準薄切片を使用して網膜を分析した。

図７に、処置前およびスピロノラクトンの最終注射の２４時間後に行ったＥＲＧを示す。

本実施例に示すように、β波は、処置前（左欄）と処置後（右欄）を比べたとき、処置後の方が有意に増加している。

屠殺後に、眼を切開した。

図８に、媒体で処置されたＧＫラットは、網膜外層に浮腫（黒矢印、左欄）および外顆粒層に浮腫（黄色矢印）を呈することを示す。脈絡毛細管は拡張している（二重赤色矢印）。

処置眼では、浮腫が内節／外節（ＩＳ／ＯＳ）と外顆粒層（ＯＮＬ）の両方で減少している。脈絡膜毛細血管で血管拡張は軽減した。

結論
眼内スピロノラクトンは、ＧＫ糖尿病ラットにおいて網膜浮腫を効率的に軽減し、外節の形成を高める。これらの変化は、ＥＲＧによって実証される網膜の機能改善と相関する。

これにより、糖尿病網膜液体貯留における眼内スピロノラクトンの有益効果が実証される。

参考文献
様々な参考文献が、本出願を通して本発明が属する技術分野の現況を説明している。これらの参考文献の開示は、本明細書によって本開示への参照により組み入れられる。

Claims (13)

1. 糖尿病網膜症、緑内障、虚血、近視、中心性漿液性網脈絡膜症、または滲出型加齢性黄斑変性に関連する網膜中および／または網膜下における液体貯留の処置に使用するためのミネラルコルチコイドレセプター（ＭＲ）アンタゴニストまたはミネラルコルチコイドレセプター遺伝子発現阻害剤。
2. グルココルチコイド、および
   ＭＲアンタゴニストまたはミネラルコルチコイドレセプター遺伝子発現阻害剤
   を含む、糖尿病網膜症、緑内障、虚血、近視、中心性漿液性網脈絡膜症、または滲出型加齢性黄斑変性に関連する網膜中および／または網膜下における液体貯留の処置に使用するための薬学的組成物。
3. ａ）グルココルチコイド；および
   ｂ）ＭＲアンタゴニストまたはミネラルコルチコイドレセプター遺伝子発現阻害剤
   を含む、糖尿病網膜症、緑内障、虚血、近視、中心性漿液性網脈絡膜症、または滲出型加齢性黄斑変性に関連する網膜中および／または網膜下における液体貯留の処置に使用するためのキット。
4. 眼送達のための、請求項１記載のミネラルコルチコイドレセプター（ＭＲ）アンタゴニスト、請求項２記載の薬学的組成物または請求項３記載のキット。
5. ミネラルコルチコイドレセプター（ＭＲ）アンタゴニストまたはミネラルコルチコイドレセプター遺伝子発現阻害剤を含む点眼製剤。
6. 薬学的組成物が点眼製剤である、請求項２記載の薬学的組成物。
7. ａ）グルココルチコイドを含む点眼製剤；および
   ｂ）ＭＲアンタゴニストまたはミネラルコルチコイドレセプター遺伝子発現阻害剤を含む点眼製剤
   を含む、請求項３記載のキット。
8. ミネラルコルチコイドレセプター（ＭＲ）アンタゴニストまたはミネラルコルチコイドレセプター遺伝子発現阻害剤を含む、生分解性眼用インプラント。
9. グルココルチコイドをさらに含む、請求項８記載の生分解性眼用インプラント。
10. 糖尿病網膜症、緑内障、虚血、近視、中心性漿液性網脈絡膜症、または滲出型加齢性黄斑変性に関連する網膜中および／または網膜下における液体貯留の処置時にグルココルチコイドによって誘導される副作用の予防に使用するためのＭＲアンタゴニストまたはミネラルコルチコイドレセプター遺伝子発現阻害剤。
11. ぶどう膜炎または色素性網膜炎または網膜細胞毒性浮腫または神経毒性浮腫に関連する網膜中および／または網膜下における液体貯留の処置に使用するためのＭＲアゴニスト。
12. ＭＲアゴニストを含む生分解性眼用インプラント。
13. ＭＲアゴニストがアルドステロンまたはそのアナログである、請求項１１記載のＭＲアゴニストまたは請求項１２記載の生分解性眼用インプラント。

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