JP2018033393A - 自閉症スペクトラム障害の判定方法と判定用キット - Google Patents
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Abstract
Description
前記ヒドロキシラジカル消去活性の測定値を含む場合、当該測定値が前記ヒドロキシラジカル消去活性の判定値未満であるという第1の判定要件、
前記スーパーオキシド消去活性の測定値を含む場合、当該測定値が前記スーパーオキシド消去活性の判定値以上であるという第2の判定要件、
前記アルコキシラジカル消去活性の測定値を含む場合、当該測定値が前記アルコキシラジカル消去活性の判定値以上であるという第3の判定要件、
前記ペルオキシラジカル消去活性の測定値を含む場合、当該測定値が前記ペルオキシラジカル消去活性の2つの判定値の間にあるという第4の判定要件、および、
前記一重項酸素消去活性の測定値を含む場合、当該測定値が前記一重項酸素消去活性の2つの判定値の間にあるという第5の判定要件、を含むことを特徴とする。
(1)活性酸素消去活性の測定
本発明に係るASDの判定方法では、各活性酸素消去活性の測定値を使用する。活性酸素とは、酸素がより反応性の高い分子種であるスーパーオキシド、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、一重項酸素などに変化した場合の呼称である。フリーラジカルとは不対電子を有する分子のことをいい、スーパーオキシドやヒドロキシルラジカルなどがある。活性酸素消去活性として、ヒドロキシラジカル消去活性、アルコキシラジカル消去活性、スーパーオキシド消去活性がある。更に、ペルオキシラジカル消去活性および/または一重項酸素消去活性を測定することが好ましい。活性酸素種は反応性が高く、常温常圧では安定に存在する時間(寿命)が短いが、電子スピン共鳴装置(Electron Spin Resonance:以下、単にESRと称する)を用いたスピントラップ法で測定することができる。一定量の活性酸素が生成できる溶液に試料を加え、発生する活性酸素量が減少すれば活性酸素消去活性ありと評価することができる。
「判定値」とは、対象の活性酸素消去活性の測定値を所定の区分に割り振るための数値である。活性酸素消去活性毎に1個以上を設定することができる。
本方法は、対象由来の測定値と判定値とを比較し、その比較結果に基づき、対象がASDに罹患している可能性を求める判定工程を含む。判定工程では、比較結果が、(i)対象のヒドロキシラジカル消去活性の測定値がヒドロキシラジカル消去活性の判定値未満という第1の判定要件、(ii)対象のスーパーオキシド消去活性の測定値がスーパーオキシド消去活性の判定値以上という第2の判定要件、(iii)対象のアルコキシラジカル消去活性の測定値がアルコキシラジカル消去活性の判定値以上という第3の判定要件の、いずれか2つ以上満たす場合に前記対象はASDに罹患している可能性ありと判定する。上記第1〜第3の判定要件に加え、(iv)ペルオキシラジカル消去活性の測定値を含む場合には、対象の測定値がペルオキシラジカル消去活性の2つの判定値の間にあるという第4の判定要件、および(v)一重項酸素消去活性の測定値を含む場合には、対象の測定値が一重項酸素消去活性の2つの判定値の間にあるという第5の判定要件の、いずれか1つ以上満たす場合に、より高確率でASDに罹患している可能性が高いと判断する。
各活性酸素消去活性を判定値によって区分に割り振り、各区分にスコアを割り付け、スコアの合計でASD罹患可能性を判定することもできる。各前記活性酸素消去活性の前記測定値を、各活性酸素消去活性毎に対応する1つ以上の前記判定値と比較していずれかの区分に振り分け、各活性酸素消去活性のスコアの合計から、ASDへの罹患可能性を判定する。
ASDを判定する対象は、ヒトの他、マウス、ラット、モルモットなどのげっ歯類、サルなどの霊長類であってもよい。これらは非特許文献2に示すようにASDのモデル動物として使用される場合がある。モデル動物構築の指標として、本方法の判定方法を適用することができる。また、対象がヒトの場合、年齢に制限はない。言語能力等が未発達な幼児や小児を対象に含めることができる。
本発明のASDの判定用キットは、活性酸素発生剤と、スピントラップ剤とを、対象由来の生体材料に含まれる活性酸素消去活性の測定試薬として含む。活性酸素発生剤としては、過酸化水素、リボフラビン、2,2’−アゾビス[2−アミノジプロパン]ジヒドロクロライド(2,2’-azobis[2-aminodipropane]dihydrochloride(以下AAPHと称す。)、t-butylhydroperoxide(以下t−BuOOHと称す)およびロゼベンガルなどがあり、スピントラップ剤としては、CYPMPO、4−OH−TEMPなどがある。ただし、活性酸素の発生法やスピントラップ剤にはこれらに限定されるものではない。
各種活性酸素消去活性は、表3に記載する活性酸素発生法、スピントラップ剤を使用し、ESRによるスピントラップ法で測定し、表3に記載する消去活性評価物質の相当量に換算した。
超純水に活性酸素発生剤として過酸化水素およびCYPMPOを各々最終濃度10mMとなるように加えた。これを、ESR(ラジカルリサーチ社製、商品名「RRX−1X」)キャビティー内にセットした測定用セルに導入し、波長300〜400nmの紫外光を5秒間照射してヒドロキシラジカルを発生させた。生成したフリーラジカルを、CYPMPOでスピントラップしてCYPMPO−OHを生成させ、ESR解析用ソフトウエア(ラジカルリサーチ社製、商品名「WIN−RAD」)でCYPMPO−OH信号の波高を測定した。この信号値を(I0)とする。
ついで、サンプルを最終濃度10%となるように、上記過酸化水素およびCYPMPOを各々最終濃度10mM含有する溶液に添加し、上記と同様に操作し、CYPMPO−OH信号の波高を測定した。この信号値を(IS)とし、I0/(IS−1)の値を算出した。
一方、上記サンプルに代えて抗酸化物質としてGSHを用い、上記過酸化水素およびCYPMPOを各々最終濃度10mM含有する溶液に添加し、上記と同様に操作し、CYPMPO−OH信号の波高を測定し、信号値を(IG)とした。複数濃度のGSHで測定し、GSH濃度をX軸、IO/(IG−1)をY軸にプロットして検量線を作成した。この検量線を用い、サンプルのヒドロキシラジカル消去活性であるI0/(IS−1)を、対応するGSHの相当量で算出した。
過酸化水素に代えて最終濃度20μMのリボフラビンを加え、および紫外光照射に代えて波長500〜600nmの可視光を60秒照射した以外は(1)のヒドロキシラジカルの測定と同様に操作し、信号値(IS)を測定し、およびI0/(IS−1)を算出した。次いで、GSHに代えてスーパーオキシド不均化酵素(SOD)を使用した以外は(1)のヒドロキシラジカルの測定と同様に操作して検量線を作成し、サンプルのスーパーオキシド消去活性であるI0/(IS−1)を、対応するSODの相当量で算出した。
過酸化水素に代えて、最終濃度1mMのAAPHを加えた以外は(1)のヒドロキシラジカルの測定と同様に操作し、信号値(IS)を測定し、およびI0/(IS−1)を算出した。次いで、GSHに代えてトロロクスを使用した以外は(1)のヒドロキシラジカルの測定と同様に操作して検量線を作成し、サンプルのアルコキシラジカル消去活性であるI0/(IS−1)を、対応するトロロクスの相当量で算出した。
過酸化水素に代えて、最終濃度10mMのt−BuOOHを加えた以外は(1)のヒドロキシラジカルの測定と同様に操作し、信号値(IS)を測定し、およびI0/(IS−1)を算出した。次いで、GSHに代えてα−リポ酸を使用した以外は(1)のヒドロキシラジカルの測定と同様に操作して検量線を作成し、サンプルのペルオキシラジカル消去活性であるI0/(IS−1)を、対応するリポ酸の相当量で算出した。
過酸化水素最終濃度200μMのロゼベンガルを加え、および紫外光に代えて波長500〜600nmの可視光を60秒照射し、CYPMPOに代えて4−OH−TEMPを用いた以外は(1)のヒドロキシラジカルの測定と同様に操作し、信号値(IS)を測定し、およびI0/(IS−1)を算出した。次いで、(1)のヒドロキシラジカルの測定と同様に操作して検量線を作成し、サンプルの一重項酸素消去活性であるI0/(IS−1)を、対応するGSHの相当量で算出した。
定型発達群とASD群を所定の判定値で区分すると、表4に示すようにTN(真陰性)、TP(真陽性)、FN(偽陰性)およびFP(偽陽性)の4区分に分画される。TNは、ヒドロキシラジカル消去活性が、カットオフ値を超える定型発達群であり、またスーパーオキシドおよびアルコキシラジカル消去活性においてカットオフ値を下回る定型発達群であり、定型発達群が正常であると判定される区分である。また、TPは、ヒドロキシラジカル消去活性においてカットオフ値を下回るASD群であり、またスーパーオキシドおよびアルコキシラジカル消去活性においてカットオフ値を超えるASD群であり、ASD群がASDであると判定される区分である。一方、FNはASDでありながら正常と判定される区分、同様にFPは正常であるにも関わらずASDと判定される区分である。
事前確率とは、条件付確率の一種で、ある変数について知られていることを確率として表現したものであり、当該方法を用いる前の段階でASDと考えられる確率である。また、事後確率とは、事前確率の判断の後に当該方法を用い陽性と判断された場合ASDを有する確率であり、例えば、当該方法を用い陽性と判断された場合にASDを有する確率である。
児童精神医学専門医の診察を受けた5歳以下のASD(n=22〜23)および定型発達児(n=33〜34)の末梢血液を採取した。生体成分に含まれるヒドロキシラジカル消去活性、スーパーオキシド消去活性、アルコキシラジカル消去活性、ペルオキシラジカル消去活性および一重項酸素消去活性を上記したESRによるスピントラップ法により測定した。
感度(SN)=TP/(TP+FN)=13/22=0.59
特異度(SP)=TN/(TN+FP)=26/33=0.79
陽性尤度比=SN/(1−SP)=(13/22)/(7/33)=2.79
AUC=0.85
感度(SN)=TP/(TP+FN)=16/23=0.70
特異度(SP)=TN/(TN+FP)=32/33=0.97
陽性尤度比=SN/(1−SP)=(16/23)/(1/33)=23.0
AUC=0.87
感度(SN)=TP/(TP+FN)=15/23=0.65
特異度(SP)=TN/(TN+FP)=25/34=0.74
陽性尤度比=SN/(1−SP)=(15/23)/(9/34)=2.46
AUC=0.86
感度(SN)=TP/(TP+FN)=18/23=0.78
特異度(SP)=TN/(TN+FP)=23/33=0.70
陽性尤度比=SN/(1−SP)=(18/23)/(10/33)=2.58
感度(SN)=TP/(TP+FN)=9/23=0.39
特異度(SP)=TN/(TN+FP)=27/33=0.81
陽性尤度比=SN/(1−SP)=(9/23)/(6/33)=2.15
実施例1のASD(n=22〜23)および定型発達児(n=33〜34)の末梢血液について、実施例1の判定値を使用して各活性酸素消去活性値を区分し、各区分に表6に記載のスコアを付した。
Claims (10)
- 対象由来の生体材料のヒドロキシラジカル消去活性、スーパーオキシド消去活性およびアルコキシラジカル消去活性からなる群より選択される少なくとも2以上の活性酸素消去活性の測定値を、前記各活性酸素消去活性に対応する判定値と比較し、当該比較結果に基づき、前記対象が自閉症スペクトラム障害に罹患している可能性を求める判定工程を含むことを特徴とする自閉症スペクトラム障害の判定方法。
- 前記活性酸素消去活性は、ペルオキシラジカル消去活性および/または一重項酸素消去活性をさらに含む、請求項1に記載の判定方法。
- 前記判定工程では、前記比較結果が、以下に列記する判定要件、
前記ヒドロキシラジカル消去活性の測定値を含む場合、当該測定値が前記ヒドロキシラジカル消去活性の判定値未満であるという第1の判定要件、
前記スーパーオキシド消去活性の測定値を含む場合、当該測定値が前記スーパーオキシド消去活性の判定値以上であるという第2の判定要件、
前記アルコキシラジカル消去活性の測定値を含む場合、当該測定値が前記アルコキシラジカル消去活性の判定値以上であるという第3の判定要件、
前記ペルオキシラジカル消去活性の測定値を含む場合、当該測定値が前記ペルオキシラジカル消去活性の2つの判定値の間にあるという第4の判定要件、および、
前記一重項酸素消去活性の測定値を含む場合、当該測定値が前記一重項酸素消去活性の2つの判定値の間にあるという第5の判定要件、を満たすか否かを示すものである、請求項1または2に記載の判定方法。 - 前記判定工程では、前記比較結果が、前記第1の判定要件、第2の判定要件および第3の判定要件のいずれか2つ以上満たす場合に前記対象は自閉症スペクトラム障害に罹患している可能性ありと判定する、請求項3に記載の判定方法。
- 前記判定工程では、前記比較結果が、前記第1の判定要件、前記第2の判定要件、および前記第3の判定要件のうち2つ以上満たし、且つ、前記第4の判定要件または前記第5の判定要件を満たす場合に前記対象は自閉症スペクトラム障害に罹患している可能性がより高いと判定する、請求項3に記載の判定方法。
- 前記判定工程は、前記各活性酸素消去活性の前記測定値を、対応する1つ以上の前記判定値と比較し、当該比較結果に基づいて前記各活性酸素消去活性にスコアを割り付け、自閉症スペクトラム障害への罹患可能性を前記スコアの合計値として求める、請求項1または2に記載の判定方法。
- 前記各活性酸素消去活性は、電子スピン共鳴によるスピントラップ法で測定されることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の判定方法。
- 前記判定値は、定型発達群および/または自閉症スペクトラム障害群での前記活性酸素消去活性の測定値に基づき予め決定される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の判定方法。
- 前記生体材料は、血液、唾液、涙、汗、リンパ液、尿、髄液、口腔粘膜、毛根、皮膚および大便からなる群から選択されるいずれか1種以上である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の判定方法。
- 活性酸素発生剤と、スピントラップ剤とを、対象由来の生体材料に含まれる活性酸素消去活性の測定試薬として含む、自閉症スペクトラム障害の判定用キット。
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