JP2018007664A - アナプラズマ・ファゴサイトフィルム(Aph)およびアナプラズマ・プラチス(Apl)に特異的な抗体を検出するための組成物および方法 - Google Patents
アナプラズマ・ファゴサイトフィルム(Aph)およびアナプラズマ・プラチス(Apl)に特異的な抗体を検出するための組成物および方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は米国特許仮出願第61/103,743号(2008年10月8日出願)(参照によりその全体
が本明細書に組み込まれる)に基づく優先権を主張する。
アナプラズマ症は哺乳動物(例えばヒト、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、シカ、および反芻動物)に発生し、マダニ媒介性病原体、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム(Anaplasma phagocytophilum;「Aph」)(以前はエーリキア・エクイ(Ehrlichia equi)として知られていた)による顆粒球細胞の感染によって引き起こされる。一般的な臨床症状には発熱、嗜眠、歩行困難、血小板減少、リンパ節腫脹、および食欲不振(anexoria)があるが、これらは全て、アナプラズマ症に特異的なものではない。従って、正確な診断のためには特異的な試験が重要である。
ス(Ehrlichia platys)として知られていた)は近縁種である。Aplはイヌ伝染性周期性
血小板減少症(ICCT)を引き起こす。感染したイヌは、米国では通常、無症候であるが、世界の他の地域では臨床的疾患となりうる。現行のアナプラズマの血清学的検査では、有意な交差反応性のために、この2つの種を識別することができない。AphおよびAplの検出法および2つの感染を識別する方法が当該分野で必要とされている。
本発明のある態様では、SEQ ID NO:8もしくはSEQ ID NO:10のアミノ酸配列から成るか
、または、SEQ ID NO:10のアミノ酸1-45;SEQ ID NO:10のアミノ酸41-89;SEQ ID NO:10
のアミノ酸85-130;SEQ ID NO:10のアミノ酸126-160;SEQ ID NO:10のアミノ酸129-146;SEQ ID NO:10のアミノ酸144-160;もしくはSEQ ID NO:10のアミノ酸136-155から成るか、または、SEQ ID NO:1-21のアミノ酸配列の少なくとも17個の連続するアミノ酸から成るか、または、SEQ ID NO:1-21と少なくとも94%の同一性を有するポリペプチドから成る精製ポリペプチドを1つまたはそれ以上含有する組成物を提供する。この1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドは、指示薬、シグナル配列、輸送停止配列、アミノ酸スペーサー、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンド、異種ポリペプチド、免疫応答を亢進する部分、精製を促進する部分、ポリペプチドの安定性を向上する部分、SEQ ID NO:1-21を含有する1つもしくはそれ以上の更なるポリペプチド、またはそれらの組み合わせに結合していてもよい。本発明の別の態様では、1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
条件下で、1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドを含有する組成物を試験サンプルと接触させることを含む。ポリペプチド/抗体複合体を検出する。ポリペプチド/抗体複合体の検出は、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドもしくはアナプラズマ・プラチス・ポリペプチド、またはその両方に特異的な抗体が試験サンプル中に存在することを示す。1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドを含有する組成物は、SEQ ID NO:8ま
たは19のアミノ酸配列の少なくとも17個の連続するアミノ酸から成ってもよい。ポリペプチド/抗体複合体の検出は、アナプラズマ・プラチスに特異的な抗体が試験サンプル中に存在することを示す。1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドを含有する組成物は、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列;SEQ ID NO:10のアミノ酸41-89;もしくはSEQ ID NO:10のアミ
ノ酸85-130の少なくとも17個の連続するアミノ酸から成るか、またはSEQ ID NO:10、SEQ ID NO:10のアミノ酸41-89、もしくはSEQ ID NO:10のアミノ酸85-130と少なくとも約94%の同一性を有するポリペプチドから成ってもよい。ポリペプチド/抗体複合体の検出は、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドもしくはアナプラズマ・プラチス・ポリペプチド、またはその両方に特異的な抗体が試験サンプル中に存在することを示す。1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドを含有する組成物は、SEQ ID NO:10のアミノ酸1-45;SEQ ID NO:10のアミノ酸126-160;SEQ ID NO:10のアミノ酸129-146;SEQ ID NO:10のアミノ酸144-160;SEQ ID NO:10のアミノ酸136-155の少なくとも17個の連続するアミノ酸から成るか、またはSEQ ID NO:10のアミノ酸1-45;SEQ ID NO:10のアミノ酸126-160;SEQ ID NO:10のアミノ酸129-146;SEQ ID NO:10のアミノ酸144-160;SEQ ID NO:10のアミノ酸136-155と少なくとも約94%の同一性を有するポリペプチドから成ってもよい。ポリペプチド/抗体複合体の検出は、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドに特異的な抗体が試験サンプル中に存在することを示す。検出の前に複合体を指示薬と接触させてもよい。試験サンプル中の抗体の量を測定してもよい。1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドを基材に結合させてもよい。
は1本鎖抗体であってもよい。
;またはSEQ ID NO:10のアミノ酸136-155の少なくとも17個の連続するアミノ酸から成っ
てもよい。ポリペプチド/抗体複合体の検出は、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドが試験サンプル中に存在することを示す。1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドはSEQ ID NO:8または19のアミノ酸配列の少なくとも17個の連続するアミノ酸から
成ってもよい。ポリペプチド/抗体複合体の検出は、アナプラズマ・プラチス・ポリペプチドが試験サンプル中に存在することを示す。1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドは、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列;SEQ ID NO:10のアミノ酸41-89;またはSEQ ID NO:10の
アミノ酸85-130の少なくとも17個の連続するアミノ酸から成ってもよい。ポリペプチド/抗体複合体の検出は、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドまたはアナプラズマ・プラチス・ポリペプチドが試験サンプル中に存在することを示す。1つまたはそれ以上の抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Fabフラグメント、Fab'フラ
グメント、Fab'-SHフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fvフラグメント、または1本鎖抗体であってもよい。
本発明のポリペプチド
本明細書で使用する単数形(「a」、「an」、および「the」)は、特に記載しない限り、その複数形も包含する。
精製ポリペプチドは約70%、80%、90%、95%、99%、またはそれ以上の純度を有する。純度
が70%未満である未精製または半精製の細胞抽出物またはポリペプチドの混合物は、精製
ポリペプチドに含まれない。
はAであり;そして、156位のXはFまたはIである。
1.SEQ ID NO:10のアミノ酸1-45(Aph p44-1)(SEQ ID NO:1および12と同じ反応性を有する)
2.SEQ ID NO:10のアミノ酸41-89(Aph p44-2)(SEQ ID NO:2および13と同じ反応性を
有する)
3.SEQ ID NO:10のアミノ酸85-130(Aph p44-3)(SEQ ID NO:3および14と同じ反応性を有する)
4.SEQ ID NO:10のアミノ酸126-160(Aph p44-4)(SEQ ID NO:4、9、11、15、および20と同じ反応性を有する)
5.SEQ ID NO:10のアミノ酸129-146(Aph p44-4-1)(SEQ ID NO:5および16と同じ反応
性を有する)
6.SEQ ID NO:10のアミノ酸144-160(Aph p44-4-2)(SEQ ID NO:6および17と同じ反応
性を有する)
7.SEQ ID NO:10のアミノ酸136-155(Aph p44-3)(SEQ ID NO:7および18と同じ反応性
を有する)
更に、SEQ ID NO:8および9は同じ反応性を有する、すなわち、それらのポリペプチドは実質的に同様に、アナプラズマ抗原に特異的な抗体と特異的に結合する。
酸4-21;SEQ ID NO:11のアミノ酸19-34;またはSEQ ID NO:11のアミノ酸11-30を含む。
様では、SEQ ID NO:1-9および11-12の約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、または46個以上の連続するアミノ酸(または約46から約6
の間の任意の数のアミノ酸)から成る精製ポリペプチドを提供する。天然型AphまたはAplアミノ酸は、AphまたはApl菌体によって天然に生成される任意のポリペプチドである。精製ポリペプチドは、ある特定の数未満の連続するSEQ ID NO:1-21の天然型アナプラズマ・アミノ酸(例えば約200、175、150、125、100、75、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、または6個未満のアミノ酸(または約200個から約6個の間の任意の数のアミノ酸)を含有してもよい。すなわち、精製ポリペプチ
ドは完全長ポリペプチドより小さい。これらのポリペプチドが完全長アナプラズマ・ポリペプチドより小さいという事実は重要であり、これは、Aplおよび/またはAphアッセイにおいて、ポリペプチドが小さいほど完全長ポリペプチドより高い特異性および/または感度を有しうるためである。更に、これらのより小さいポリペプチドは完全長ポリペプチドに比較して製造がより安価となり、より高い純度で得られうる。
、6個、またはそれ未満の連続する天然型アナプラズマ・アミノ酸(または約200個から約6個の間の任意の数のアミノ酸)から成る精製ポリペプチドを提供する。別の態様では、SEQ ID NO:10の約6、10、15、25、50、75、100、125、150、175、200個、またはそれ以上
の連続する天然型アナプラズマ・アミノ酸(または約6個から約200個の間の任意の数のアミノ酸)から成る精製ポリペプチドを提供する。
ポリペプチドも本発明のポリペプチドである。例えばSEQ ID NO:1の変異型ポリペプチド
は、SEQ ID NO:1との同一性が少なくとも約98%(約1アミノ酸変化)、96%(約2アミノ
酸変化)、93%(約3アミノ酸変化)、91%(約4アミノ酸変化)、89%(約5アミノ酸変
化)、87%(約6アミノ酸変化)、84%(約7アミノ酸変化)、82%(約8アミノ酸変化)
、または80%(約9アミノ酸変化)であってもよい。SEQ ID NO:2の変異型ポリペプチドは、SEQ ID NO:2との同一性が少なくとも約98%(約1アミノ酸変化)、96%(約2アミノ酸
変化)、94%(約3アミノ酸変化)、92%(約4アミノ酸変化)、90%(約5アミノ酸変化
)、88%(約6アミノ酸変化)、約86%(約7アミノ酸変化)、84%(約8アミノ酸変化)
、82%(約9アミノ酸変化)、または80%(約10アミノ酸変化)であってもよい。SEQ ID
NO:3の変異型ポリペプチドは、SEQ ID NO:3との同一性が少なくとも約98%(約1アミノ
酸変化)、96%(約2アミノ酸変化)、94%(約3アミノ酸変化)、91%(約4アミノ酸変
化)、89%(約5アミノ酸変化)、87%(約6アミノ酸変化)、85%(約7アミノ酸変化)
、83%(約8アミノ酸変化)、または80%(約9アミノ酸変化)であってもよい。SEQ ID NO:4および9の変異型ポリペプチドは、SEQ ID NO:4および9との同一性が少なくとも約97%
(約1アミノ酸変化)、94%(約2アミノ酸変化)、91%(約3アミノ酸変化)、89%(約
4アミノ酸変化)、86%(約5アミノ酸変化)、83%(約6アミノ酸変化)、または80%(
約7アミノ酸変化)であってもよい。SEQ ID NO:5の変異型ポリペプチドはSEQ ID NO:5との同一性が少なくとも約94%(約1アミノ酸変化)、89%(約2アミノ酸変化)、または83%(約3アミノ酸変化)であってもよい。SEQ ID NO:6の変異型ポリペプチドはSEQ ID NO:6との同一性が少なくとも約94%(約1アミノ酸変化)、88%(約2アミノ酸変化)、また
は82%(約3アミノ酸変化)であってもよい。SEQ ID NO:7の変異型ポリペプチドはSEQ ID
NO:7との同一性が少なくとも約95%(約1アミノ酸変化)、90%(約2アミノ酸変化)、85%(約3アミノ酸変化)、または80%(約4アミノ酸変化)であってもよい。SEQ ID NO:8の変異型ポリペプチドはSEQ ID NO:8との同一性が少なくとも約97%(約1アミノ酸変化)、94%(約2アミノ酸変化)、91%(約3アミノ酸変化)、88%(約4アミノ酸変化)、84%(約5アミノ酸変化)、または81%(約6アミノ酸変化)であってもよい。
ニューヨーク),(1993);GriffinおよびGriffin編, Computer Analysis Of Sequence Data, Part I, Humana Press(ニュージャージー),(1994);von Heinje, Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press,(1987);および、GribskovおよびDevereux編, Sequence Analysis Primer, M Stockton Press(ニューヨーク),(1991)。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのアラインメント法はコンピュータープログラムに体系化されており、例えばGCGプログラム・パッケージ(Devereuxら, Nuc. Acids Res. 12:387 (1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschulら, J. Molec. Biol. 215:403 (1990))、およびBestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix(商標), Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison,
WI 53711)(SmithおよびWaterman(Adv. App. Math., 2:482-489 (1981))の局所的相
同性アルゴリズムを使用))がある。例えば、FASTAアルゴリズムを使用するコンピュー
ター・プログラムALIGNを、ギャップオープンペナルティ=-12、ギャップ伸長ペナルティー=-2のアフィン・ギャップ検索を用いて使用してもよい。
で許容されるように、パラメータを設定する。
物である。ある態様ではアッセイは競合アッセイであり、生物学的に同等のポリペプチドは、相当する反応性抗原または抗体への本発明のポリペプチドの結合を約80、95、99、または100%低下させる能力を有する。相当する野生型ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、変異型ポリペプチドにも特異的に結合する。
のポリペプチドの結合を促進するためのリンカーまたは他の配列を含有してもよい。例えばポリペプチドを免疫グロブリンのFc領域またはウシ血清アルブミンにコンジュゲートさせてもよい。
スペーサーは、天然では本発明のポリペプチドと結合していないアミノ酸配列である。アミノ酸スペーサーは約1、5、10、20、100、または1,000個のアミノ酸を含有してもよい。
ド(例えばグルタチオン-S-トランスフェラーゼ、ヒスチジン・タグ、およびブドウ球菌
プロテインA)、またはそれらの組み合わせを更に含有してもよい。他のアミノ酸配列が
本発明のポリペプチドのCまたはN末端に存在して、融合タンパク質を形成してもよい。1つより多い本発明のポリペプチドが融合タンパク質中に存在してもよい。本発明のポリペプチドのフラグメントが本発明の融合タンパク質中に存在してもよい。本発明の融合タンパク質は1つまたはそれ以上の本発明のポリペプチド、そのフラグメント、またはそれらの組み合わせを含有してもよい。
テストしてもよい。例えばELISAアッセイにおいて、アナプラズマ・ファゴサイトフィル
ム・ポリペプチド(例えば30アミノ酸長ポリペプチド・フラグメント)を固相支持体(例えばプラスチック製マルチウェル・プレートのウェル)に結合させる。一群の抗体を標識して固相支持体に付加し、非特異的吸着が阻害されるような条件下で未標識の抗原に結合させ、未結合の抗体および他のタンパク質を洗浄除去する。抗体の結合を、例えば無色の基質を有色の反応生成物に変化させる反応によって、検出する。その後、同定された30アミノ酸長から徐々により小さな、オーバーラップしているフラグメントを試験し、目的のエピトープをマッピングしてもよい。
することができる。本発明の免疫原性ポリペプチドは、SEQ ID NO:1-21に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントであってもよい。本発明の免疫原性ポリペプチド・フラグメントは約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、またはそれ以上のアミノ酸長で
あってもよい。本発明の免疫原性ポリペプチド・フラグメントは約200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10
、9、8、7、6、またはそれ未満のアミノ酸長であってもよい。
本発明のポリヌクレオチドは全微生物ゲノムより少ないゲノムを含有してもよく、また、1本鎖または2本鎖核酸であってもよい。ポリヌクレオチドはRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNA、化学的に合成したRNAもしくはDNA、またはそれらの組み合わせであってもよい。ポ
リヌクレオチドを精製して、他の成分(例えばタンパク質、脂質、および他のポリヌクレオチド)を含有しないようにしてもよい。例えばポリヌクレオチドは50%、75%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の純度であってもよい。例えばcDNAもしくはゲノム・ライブラリー内の、数百から数百万の他の核酸分子中に存在する核酸分子、またはゲノムDNA制限酵素消化物を含有するゲル切片は、精製ポリヌクレオチドと見なされない。本発
明のポリヌクレオチドは上記の本発明のポリペプチドをコードする。本発明のある態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:1-21に示すポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする。
ルタチオン-S-トランスフェラーゼ、ヒスチジン・タグ、およびブドウ球菌プロテインA)をコードする配列を含有してもよい。
子であってもよいが、ただし天然に存在するゲノム中でそれら組換えDNA分子に直接隣接
している核酸配列は除去されているか、または存在しない。単離されたポリヌクレオチドには非天然型核酸分子も包まれる。
たは99%の同一性を有する相同ヌクレオチド配列およびその相補体も本発明のポリヌクレ
オチドである。配列同一性%は「ポリペプチド」の項に記載するように算出できる。縮重ヌクレオチド配列とは、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするが、遺伝子コードの縮重によって核酸配列が野生型ポリヌクレオチド配列と異なるポリヌクレオチドである。生物学的に機能的なポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドの相補的DNA(cDNA)分子、種ホモログ(species homologs)、および変異体も、本発明
のポリヌクレオチドである。
、または組織など)中に存在する核酸配列から得てもよい。ポリヌクレオチドは、例えば自動合成装置を使用して実験室で合成してもよい。PCRなどの増幅法を用いて、ポリペプ
チドをコードするゲノムDNAまたはcDNAのいずれかからポリヌクレオチドを増幅してもよ
い。
はColE1など)またはアデノウイルス・ベクター(アデノウイルス2型ベクターまたは5
型ベクター)であってもよい。必要により他のベクターを使用してもよく、それらには、限定されるわけではないが以下がある:シンドビスウイルス、シミアンウイルス40、アルファウイルス・ベクター、ポックスウイルス・ベクター、サイトメガロウイルスおよびレトロウイルス・ベクター、例えばマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、モロニー・マウス白血病ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス。ミニクロモソーム(例えばMCおよびMC1)、バクテリオファージ、ファージミド、酵母人工染色体、細菌人工染色体、ウイ
ルス粒子、ウイルス様粒子、コスミド(λファージのcos部位が挿入されたプラスミド)
、およびレプリコン(細胞中で、それ自身の制御下で複製することができる遺伝子要素)を使用してもよい。
い。本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの転写および/または翻訳を指示する1つまたはそれ以上の発現調節要素に隣接しているか、またはその近傍に位置している場合、機能的に結合している。
ー)として用い、試験サンプル(例えば生体サンプル)中のアナプラズマ・ポリヌクレオチドの存在を検出してもよい。プローブは、例えばハイブリダイゼーションによって、一般的には配列特異的に、標的核酸と相互作用する能力を有する分子である。プライマーは、酵素処理を補助することができ、標的核酸とハイブリダイズして酵素処理を起こすことができるプローブのサブセットである。プライマーは、当該分野で使用できるヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体もしくは類似体で、酵素処理に干渉しないものを任意に組み合わせたものから調製してもよい。
よい。ポリヌクレオチド・プローブまたはプライマーを標識してもよい。好適な標識、そしてプローブおよびプライマーを標識する方法は当該分野で公知であり、それらには例えば、ニックトランスレーションまたはキナーゼによって導入される放射性標識、ビオチン標識、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、金属キレート標識、および酵素標識がある。サンプル由来のポリヌクレオチドを、好適なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でプローブまたはプライマーと接触させる。
たはプライマーおよび試験サンプル由来の相補的ポリヌクレオチドを含有するハイブリダイズした複合体の存在は、AplまたはAplポリヌクレオチド配列がサンプル中に存在することを示す。
本発明の抗体は、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチド、アナプラズマ・プラチス・ポリペプチド、本発明の変異型ポリペプチド、またはそれらのフラグメントに特異的に結合する抗体分子である。本発明の抗体はAphポリペプチド、Aplポリペプチド、変異型ポリペプチド、またはそれらの組み合わせに特異的であってもよく、例えばSEQ ID NO:1-21の1つまたはそれ以上に特異的な抗体であってもよい。本発明の別の態様では、抗体はアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドに特異的である(例えばSEQ ID NOs:1、4、5、6、7、9、11、12、15、16、17、18、または20に特異的な抗体)。本
発明の別の態様では、抗体はアナプラズマ・プラチス・ポリペプチドに特異的である(例えばSEQ ID NO:8または19に特異的な抗体)。本発明の別の態様では、抗体はアナプラズ
マ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドおよびアナプラズマ・プラチス・ポリペプチドの両方に特異的である(例えばSEQ ID NO:2、3、10、13、14、または21に特異的な抗体)。当業者は、本明細書に記載するアッセイを用いて、抗体がアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドまたはアナプラズマ・プラチス・ポリペプチドに特異的であるか否かを容易に判定できる。本発明の抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、1本鎖抗体(scFv)、または抗体の抗原結合フラグメントであってもよい。抗体の抗原結合フラグメントはインタクトな抗体の抗原結合部位または可変領域を含むインタクトな抗体の一部分であって、その部分はインタクトな抗体のFc領域の定常重鎖ドメインを含有しない。抗原結合抗体フラグメントの例として、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、およびFvフ
ラグメントがある。
プに結合する。抗体は好適な実験動物においてin vivoで作製するか、または組換えDNA技術によってin vitroで作製してもよい。抗体の調製法およびキャラクタリゼーション法は当該分野で周知である。例えば以下を参照されたい:Dean, Methods Mol. Biol. 80:23-37(1998);Dean, Methods Mol. Biol. 32:361-79(1994);Baileg, Methods Mol. Biol. 32:381-88(1994);Gullick, Methods Mol. Biol. 32:389-99(1994);Drenckhahnら
Methods Cell. Biol. 37:7-56(1993);Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10:239-65 (1992); Wrightら Crit. Rev. Immunol. 12:125-68(1992)。例えば、ポリクローナル抗体
は本発明のポリペプチドを動物(例えばヒトもしくは他の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ブタ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ロバ、またはウマ)に投与することにより調製してもよい。免疫した動物由来の血清を回収し、例えば硫酸アンモニウム沈殿
後にクロマトグラフィー(例えばアフィニティークロマトグラフィー)を行うことによって、抗体を血漿から精製する。ポリクローナル抗体の調製および加工法は当該分野で公知である。
以上の結合アフィニティーで結合する場合、抗体またはその抗原結合フラグメントがSEQ ID NO:1-21のポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する。特異的結合は、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、またはウェスタンブロットアッセイを用い、当該分野で周知の方法論によって試験できる。
(a)SEQ ID NO:1-21もしくはその抗原結合フラグメントへの結合を巡って参照抗体と競合する;(b)参照抗体と同じSEQ ID NO:1-21もしくはその抗原結合フラグメントのエピトープに結合する;(c)参照抗体と実質的に同じKdでSEQ ID NO:1-21もしくはその抗原結合フラグメントに結合する;および/または、(d)参照抗体と実質的に同じオフレートでSEQ ID NO:1-21もしくはその抗原結合フラグメントに結合する(ここで、参照抗体はSEQ ID NO:1-21のポリペプチドまたはその抗原結合フラグメントにKa=107 l/molまたは
それ以上の結合アフィニティーで特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである)。
ナル抗体の結合を測定することによって行ってもよい。モノクローナル抗体の作製および加工法は当該分野で公知である。例えばKohlerおよびMilstein, Nature, 256:495(1975
)参照。特定のアイソタイプのモノクローナル抗体は、最初の融合体から選択して直接調製するか、または異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマから同胞選択(sib selection)法を用いてクラス・スイッチ変異体を単離することによ
って二次的に調製してもよい。Steplewskiら, P.N.A.S. U.S.A. 82:8653 1985; Spriaら,
J. Immunolog. Meth. 74:307, 1984参照。本発明のモノクローナル抗体は組換えモノク
ローナル抗体であってもよい。例えば米国特許第4,474,893号;米国特許第4,816,567号を参照。本発明の抗体は化学的に構築してもよい。例えば米国特許第4,676,980号参照。
ばJonesら, Nature 321:522(1986);Reichmannら, Nature 332:323(1988);Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593(1992)参照)、イヌ化抗体、イヌ抗体、またはヒト抗
体であってもよい。ヒト抗体は、例えば直接的不死化、ファージディスプレイ、トランスジェニック・マウス、またはトリメラ(Trimera)法によって作製してもよい(例えばRei
senerら, Trends Biotechnol. 16:242-246(1998)参照)。
プラチスに感染した動物由来の血清、血液、血漿、尿、糞便、組織、または唾液サンプル)中のアナプラズマ・プラチス抗原の存在の検出に特に有用である。
原およびApl抗原に特異的に結合してもよい。
またはAph抗原の存在を検出してもよい。支持体には、例えばガラス、ポリスチレン、ポ
リプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、およびマグネタイト(magletite)がある
。
はAph菌体または抗原を単離してもよい。抗体を(例えば吸着または共有結合によって)
、その免疫学的選択活性を保持するようにして、固相支持体に固定化してもよい。必要により、抗体の抗原結合部位をアクセス可能な状態に保持するように、スペーサー基を含有させてもよい。その後、固定化した抗体を用いてサンプル(例えば生体サンプル(唾液、血清、喀痰、血液、尿、糞便、脳脊髄液、羊水、創傷滲出液、または組織など))由来のアナプラズマ菌体またはアナプラズマ抗原を結合させてもよい。結合したアナプラズマ菌体またはアナプラズマ抗原を、例えばpH変化によって、カラムマトリックスから回収する。
はAph特異的抗体の増加または減少を測定することによって、疾患の寛解を目的とする特
定の治療計画が有効であるか否かを判定してもよい。抗体の検出および/または定量は、例えば直接結合アッセイ、例えばRIA、ELISA、またはウェスタンブロット・アッセイを用いて行ってもよい。
本発明の方法を用いて、試験サンプル、例えば生体サンプル、環境サンプル、または実験用サンプル中のアナプラズマ抗原、Apl抗原、Aph抗原、Aplポリヌクレオチド、Aphポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせに特異的な抗体またはその特異的結合フラグメントを検出してもよい。試験サンプルは、Aplポリヌクレオチド、Aphポリヌクレオチド、Aplポリペプチド、アナプラズマ種ポリペプチド、Aphポリペプチド、アナプラズマ種に特異的な抗体、Aplに特異的な抗体、および/もしくはAphに特異的な抗体、無関係のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、もしくは抗原、または上記のものの組み合わせを含有する可能性があるか、あるいは上記のいずれも含有しない可能性があってもよい。生体サンプルには、例えば哺乳動物(ウマ、ネコ、イヌ、またはヒトなど)由来の血清、血液、細胞、血漿、唾液、尿、糞便、または組織がある。試験サンプルは未処理であるか、または沈殿、分画、分離、希釈、濃縮、もしくは精製を行ってもよい。
び/またはAph抗原に特異的な抗体と特異的に結合する。本発明のある態様では、1つま
たはそれ以上の本発明のポリペプチド(例えばSEQ ID NO:1、4、5、6、7、9、11、12、15、16、17、18、20、またはそのフラグメント)は、Aph抗原に特異的であってApl抗原には特異的に結合しない抗体に特異的に結合する。本発明の別の態様では、1つまたはそれ以上の本発明のポリペプチド(例えばSEQ ID NO:2、3、10、13、14、21、またはそのフラグメント)はAphおよびApl抗原の両方に特異的な抗体に特異的に結合する。本発明のある態様では、1つまたはそれ以上の本発明のポリペプチド(例えばSEQ ID NO:8、19、または
そのフラグメント)は、Apl抗原に特異的であってAph抗原に特異的に結合しない抗体に特異的に結合する。当業者は、抗体/ポリペプチド複合体結合の検出に使用されるアッセイおよび条件に詳しい。サンプル中のポリペプチドおよび抗Aplおよび/または抗Aph抗体間の複合体形成を検出する。抗体/ポリペプチド複合体が形成されれば、サンプル中にアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドおよび/またはアナプラズマ・プラチス・ポリペプチドが存在することを示す。ポリペプチド/抗体複合体が検出されなければ、サンプル中にアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドおよび/またはアナプラズマ・プラチス・ポリペプチドが存在しないことを示す。
下で試験サンプルを本発明の抗体と接触させる。抗原/抗体複合体の形成を可能とし、これに好適な条件は当業者に公知である。抗体-抗原複合体の量を当該分野で公知の方法に
よって測定してもよい。レベルがコントロール・サンプル中で生成されるものより高ければAplおよび/またはAphに感染していることを示す。コントロール・サンプルはAphおよ
び/もしくはAplポリペプチドまたはAphおよび/もしくはApl特異的抗体のいずれも含有
しないサンプルである。本発明のある態様では、コントロールはアナプラズマ種ポリペプチドまたはアナプラズマ種特異的抗体を含有しない。本発明のある態様では、抗体はAph
抗原のみに特異的である。本発明の別の態様では、抗体はAphおよびApl抗原の両方に特異的である。本発明の別の態様では、抗体はApl抗原のみに特異的である。あるいはまた、
本発明のポリペプチドを試験サンプルと接触させてもよい。陽性試験サンプル中のAplお
よび/またはAphに特異的な抗体は、好適な条件下で抗原-抗体複合体を形成する。抗体-
抗原複合体の量を当該分野で公知の方法によって測定してもよい。
に特異的であるため、検出される感染はAph感染である。SEQ ID NO:8および19は抗Apl抗
体に特異的であるため、検出される感染はApl感染である。ポリペプチド/抗体複合体が
検出されなければ、被験体はアナプラズマ・ファゴサイトフィルムまたはアナプラズマ・プラチスに感染していないことを示す。
後、15日後、16日後、17日後、18日後、19日後、20日後、21日後、またはそれ以降までに被験体において検出される。本発明のある態様では、Aplおよび/またはAph感染は、被験体のAplおよび/またはAph感染の約21日後、20日後、19日後、18日後、17日後、16日後、15日後、14日後、13日後、12日後、11日後、10日後、9日後、8日後、7日後、6日後、5日
後、またはそれ以前までに被験体において検出される。
ト)を含有してもよい。各添加の前に洗浄工程を行ってもよい。発色団または酵素基質を添加し、呈色させる。呈色反応を停止させ、例えば分光光度計を用いて、色を定量する。
、血球凝集(HA)、蛍光偏光免疫アッセイ(FPIA)、およびマイクロタイタープレート・アッセイ(マイクロタイタープレートの1つまたはそれ以上のウェル中で行うアッセイ)がある。本発明のあるアッセイは、リバーシブルフロークロマトグラフィー結合アッセイ、例えばSNAP(登録商標)アッセイを含む。例えば米国特許第5,726,010号参照。
、試験サンプルに添加する。この混合物を支持体または基材に適用する。Aplおよび/ま
たはAphに特異的な抗体が試験サンプル中に存在すれば、それらは指示薬にコンジュゲー
トしたポリペプチドの1つまたはそれ以上、および支持体上に固定化されたポリペプチドの1つまたはそれ以上に結合する。その後、このポリペプチド/抗体/指示薬複合体を検出することができる。このタイプのアッセイでは、試験サンプル中の抗Aplおよび/また
は抗Aph抗体の量を定量化できる。
抗Aph抗体の量を定量化できる。
び/またはAphポリペプチドへの抗体または抗原結合性抗体フラグメントの結合を判定す
る手段を含んでもよい。キットは、1つまたはそれ以上の本発明のポリペプチドまたは抗体を含有する装置、および(例えば哺乳動物におけるAplおよび/またはAph感染の同定のための)1つまたはそれ以上のポリペプチドまたは抗体の使用説明書を含んでもよい。ま
たキットは、キットの1つまたはそれ以上のポリペプチドまたは抗体をAplおよび/また
はAph感染の同定に使用できることを示すラベルを含む包装材料を含んでもよい。当業者
に公知の他の成分(例えばバッファー、コントロールなど)をそれらの試験キットに含ませてもよい。本発明のポリペプチド、抗体、アッセイ、およびキットは、例えば患者におけるAplおよび/またはAph感染の個々の症例の診断、並びにAplおよび/またはAph蔓延の疫学的研究に有用である。
してもよい。
(例えばApl)と識別して検出することもできる。
づく。このシグナルは反応においてPCR産物の量と正比例して増加する。リアルタイムPCRは進行中の増幅反応の進展をモニタリングすることを可能とする増幅法である。Quantitation of DNA/RNA Using Real-Time PCR Detection, Perkin Elmer Applied Biosystems(1999);PCR Protocols(Academic Press New York, 1989)参照。各サイクルで蛍光発光の量を記録することにより、指数関数的増幅期にあるPCR反応をモニタリングできる(こ
こで、PCR産物量の最初の有意な増加は、標的テンプレートの初期量と相関関係を有する
)。開始時の核酸標的コピー数が多いほど、より早期に蛍光の有意な増加が観察される。
よび/またはAphポリヌクレオチドとハイブリダイズして増幅産物が形成される。増幅産
物を検出し、Aplおよび/またはAphポリヌクレオチドの存在および/または量を測定する。増幅産物の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応に好適な条件下でAplおよび/またはAphポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド・プローブを用いて行うことができる。プローブからの検出シグナルを測定し、該検出シグナルを定量標準からの第2のプローブ検出シグナルと比較することによって、増幅産物を定量してもよい。定量標準を、試験サンプルと並行して抽出してもよい。
(a)SEQ ID NO:1、4、5、6、7、9、11、12、15、16、17、18、または20から成るポリペプチドに特異的に結合する1つまたはそれ以上の抗体をポリペプチド/抗体複合体の形成が可能な条件下でサンプルと接触させ、ポリペプチド/抗体複合体を検出すること;および
(b)SEQ ID NO:8または19から成るポリペプチドに特異的に結合する1つまたはそれ以
上の抗体をポリペプチド/抗体複合体の形成が可能な条件下でサンプルと接触させ、ポリペプチド/抗体複合体を検出すること。
(a)SEQ ID NO:1、4、5、6、7、9、11、12、15、16、17、18、または20を含有する1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドをポリペプチド/抗体複合体の形成が可能な条件下で試験サンプルと接触させ、ポリペプチド/抗体複合体を検出すること;および
(b)SEQ ID NO:8または19を含有する1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドをポリペ
プチド/抗体複合体の形成が可能な条件下で試験サンプルと接触させ、ポリペプチド/抗体複合体を検出すること。
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体を使用して、Aplおよび/また
はAphに起因する疾患を治療、寛解、または予防することができる。例えば、抗体(例え
ば本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント)を動物(例えばヒトまたはイヌ)に投与してもよい。本発明のある態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントを医薬的に許容されるキャリアを含む医薬組成物として動物に投与する。医薬組成物は治療的有効量の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。治療的有効量は、被験体におけるAplおよび/またはAph感染の症状の改善またはAplおよび/またはAph菌体量の低減に有効な量である。
も有効なエピトープを含有するかを判定できる。その後、それらのエピトープまたはエピトープをコードするポリヌクレオチドを含むポリペプチドまたは融合タンパク質を構築し、これを用いて強力な抗体反応を惹起してもよい。
発させてもよい。ポリヌクレオチドの注射は、構築および改変を容易にするために実用面で有益である。更に、ポリヌクレオチドの注射により、ホストにおいてポリペプチドが合成される。従って、ポリペプチドが天然の翻訳後修飾、構造、およびコンフォメーションでホスト免疫系に提示される。ポリヌクレオチドを“ネイキッドDNA”として被験体に送
達してもよい。
てもよい。本発明のある態様では、抗体を約20から約100mgの1日用量で投与する。
リアは、それ自体ではホストに有害な抗体の産生を誘導してはならない。それらのキャリアには、限定されるわけではないが以下がある:大型で代謝が遅い高分子、例えばタンパク質、多糖(ラテックス機能性SEPHAROSE(登録商標)、アガロース、セルロース、セル
ロースビーズなど)、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー(例えばポリグルタミン酸、ポリリジンなど)、アミノ酸コポリマー、ペプトイド、リピトイド(lipitoid)、および不活性非病原性ウィルス粒子または細菌細胞。リポソーム、ハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生体接着剤(bioadhesive)を本発明
の組成物のキャリアとして使用してもよい。
物に含有させてもよい。必要により、アジュバントを組成物に含有させてもよい。アジュバントは特異的免疫応答を非特異的に増強させるのに使用できる物質である。一般に、アジュバントおよび本発明のポリペプチドは混合した後に免疫系に提示するか、または別々に、しかし動物の同じ部位に提示する。アジュバントには、例えば油性アジュバント(例えばフロイント完全および不完全アジュバント)、無機塩(例えばAlk(SO4)2、AlNa(SO4)2、AlNH4(SO4)、シリカ、アラム、Al(OH)3、およびCa3(PO4)2)、ポリヌクレオチド(す
なわちポリICおよびポリAU酸)、およびある種の天然物質(例えば結核菌(Mycobacterium tuberculosis)由来のワックスD、並びにコリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、およびブルセラ属のメンバーに見
られる物質)がある。使用できるアジュバントには、それらに限定されるわけではないが以下がある:MF59-0、水酸化アルミニウム、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソ
グルタミン(thr-MDP)、N-アセチル-ノル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン(CGP
11637、別名nor-MDP)、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1’-2’-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチル
アミン(CGP 19835A、別名MTP-PE)、およびRIBI(細菌から抽出された3つの成分、モノ
ホスホリル脂質A、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格(MPL+TDM+CWS)を2%スクアレン/TWEEN(登録商標)80(ポリソルベート)エマルジョンに混合したものを含有
する)。
ペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体のパーセンテージは、単位重量の0.1%から60%
まで様々である。
る。必要により、初回注射の1ヶ月後、3ヶ月後、6ヶ月後、1年後、またはそれ以降に、1
回またはそれ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体のブースター注射を行うことにより、動物における免疫応答を維持してもよい。必要により、共刺激分子またはアジュバントを組成物の前、後、またはそれと共に提供してもよい。
ように免疫応答を惹起するのに有効な量で投与する。ポリヌクレオチドを哺乳動物(例えばヒヒ、チンパンジー、イヌ、またはヒト)に、1ng/kg、10ng/kg、100ng/kg、1000ng/kg、0.001mg/kg、0.1mg/kg、または0.5mg/kgの用量で筋肉内注射してもよい。ポリペプチドまたは抗体を0.01、0.05、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、5、または10mg/kgの用量で
哺乳動物に筋肉内注射してもよい。
よび/もしくはAphに感染していない動物に投与するか、またはAplおよび/もしくはAph
に感染した動物に投与してもよい。免疫学的有効量または治療的有効量とは、個体への該量の投与(一回投与、または連続投与の一部として)がAplおよび/またはAph感染の治療、寛解、または予防に有効であることを意味する。組成物中のポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗体の特定の用量は多くの因子に依存し、それらの因子には、限定されるわけではないが組成物を投与する哺乳動物の種、年齢、性別、併用薬剤、全身症状、および組成物の投与様式がある。本発明の組成物の有効量は慣例的な実験法を用いるだけで容易に決定できる。
実施例1 Aph p44タンパク質に由来するポリペプチドを用いた抗Aphおよび抗Apl抗
体の検出
炭酸バッファー(pH9.6)に混合したSEQ ID NO:12-18および10に示すポリペプチド(0.5μg/mL)でImmulon(登録商標)4マイクロタイター・プレートを一晩コーティングした
。全ての実施例で、SEQ ID NO:10に示すポリペプチドは143位にN、145位にA、および156
位にIを有する。
ッキングした後、乾燥剤を用いて一晩乾燥させた。コンジュゲート希釈剤で1:200に希釈
した試験サンプルをプレートに添加し、40分間インキュベートした。プレートをPetChek
(登録商標)洗浄バッファーで6回洗浄した。コンジュゲート希釈剤で1:2000に希釈したHRPコンジュゲート・ウサギ抗イヌIgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories社
、ペンシルバニア州ウェストグローブ;カタログ番号:304-035-003)をプレートに添加
し、40分間インキュベートした。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで6回洗浄した。60μlの3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(「TMB」)をプレートに添加し、10分間インキュベートした。50μlの停止溶液を添加し、A650を測定した。試験サンプルは
以下の通りである:
APL_13DPI:実験的にAplに感染させたイヌ(感染13日後)
APL_78DPI:実験的にAplに感染させたイヌ(感染78日後)
APH:ミネソタからのAph感染イヌ(7検体)由来サンプルのプール
neg:無作為抽出した健常イヌ(7検体)由来サンプルのプール
プールとの反応性が陽性を示した。rp44、p44-2、およびp44-3は感染の異なる2つの時点で、実験的にAplに感染させたイヌの血清との交差反応性を示した。実験的にAplに感染させたイヌの血清とp44-1、p44-4、p44-4-1、p44-4-2、およびp44-4-3との反応性はほぼバ
ックグラウンド・レベルであった。従って、ポリペプチドp44-1、p44-4、p44-4-1、p44-4-2、およびp44-4-3はApl感染イヌ由来血清と交差反応性を有さない。
炭酸バッファー(pH9.6)に混合したポリペプチド(Aph p44-4およびApl p44-4は0.5μg/mL;Aph rp44は0.25μg/mL)で、Immulon(登録商標)4プレートを一晩コーティングした。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで2回洗浄した後、2% TWEEN(登録商
標)20(ポリソルベート)/2.5%スクロース含有0.1M Tris(pH7.6)で2時間ブロッキン
グした。乾燥剤を用いてプレートを一晩乾燥させた。25μLの試験サンプルを50μLのペプチド:HRPコンジュゲート(p44-4-Aph(SEQ ID NO:15):HRPコンジュゲートでは0.5μg/mL
、p44-4-Apl(SEQ ID NO:19):HRPコンジュゲートでは1μg/mL、Aph rp44コンジュゲートでは3μg/mL)と混合し、マイクロタイター・プレート上でインキュベートした(インキュ
ベート時間は、図2に示す実験では1時間、図3に示す実験では1時間45分とした)。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで6回洗浄した。60μLのTMBをプレートに添加し、10分間インキュベートした。50μLの停止溶液を添加し、A650を測定した。カットオ
フ値を10検体の陰性サンプルとの反応性に基づいて決定した;カットオフ=平均値+2 x SD(標準偏差)。
ヌ由来のアナプラズマ・プラチス陽性サンプルを用いた結果を示す。rp44(SEQ ID NO:10)は5検体の「HP」サンプル中4検体が陽性、7検体の「P」サンプル中7検体が陽性であっ
た。Aph p44-4(SEQ ID NO:15)は、5検体の「HP」サンプル中0検体が陽性、7検体の「P
」サンプル中0検体が陽性であった。Apl p44-4(SEQ ID NO:19)は、5検体の「HP」サン
プル中5検体が陽性、7検体の「P」サンプル中7検体が陽性であった。従ってAph p44-4はAplに感染したイヌ由来の血清と交差反応しない。
イトフィルム陽性サンプルを用いた結果を示す。rp44(SEQ ID NO:10)は22検体のMEサンプル中21検体が強い陽性結果を示した。Aph p44-4(SEQ ID NO:15)は、22検体の「ME」
サンプル中20検体が強い陽性結果を示した。Apl p44-4(SEQ ID NO:19)は、22検体中18
検体が陰性、22検体のMEサンプル中4検体が非常に弱い陽性結果を示した。従ってApl p44-4はAphに感染したイヌ由来の血清と交差反応しないと見なされる。
炭酸バッファー(pH9.6)に混合したポリペプチド(Aph p44-4およびApl p44-4は0.5μg/mL;Aph rp44は0.25μg/mL)で、Immulon(登録商標)4プレートを一晩コーティングした。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで3回洗浄した。プレートを2% TWEEN(登録商標)20(ポリソルベート)/2.5%スクロース含有0.1M Tris(pH7.6)で2時間ブ
ロッキングし、一晩放置して乾燥させた。25μLの試験サンプルを50μLのペプチド:HRPコンジュゲート(Aph p44-4コンジュゲートでは0.5μg/mL、Apl p44-4コンジュゲートでは1μg/mL、Aph rp44コンジュゲートでは3μg/mL)と混合し、マイクロタイター・プレート
上で1時間インキュベートした。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで6回洗
浄した。60μLのTMBを添加し、10分間インキュベートした。50μLの停止溶液を添加し、A650を測定した。結果を図4に示す。
約14日でApl感染イヌ由来血清と交差反応し、AplおよびAph感染の検出に使用できる。
Aph p44-4(SEQ ID NO:15)およびAph rp44(SEQ ID NO:10)を、実験的にAphに感染させたイヌ由来の血清との反応性に関して、一連の時点において試験した。11検体の無作為抽出した健常なフィールド犬サンプルも試験した。炭酸バッファー(pH9.6)に混合した
ポリペプチド(Aph p44-4は0.5μg/mL;Aph rp44は0.25μg/mL)で、Immulon(登録商標
)4プレートを一晩コーティングした。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで4回洗浄した。プレートを2% TWEEN(登録商標)20(ポリソルベート)/2.5%スクロース
含有0.1M Tris(pH7.6)で2時間ブロッキングし、乾燥剤を用いてプレートを一晩乾燥さ
せた。25μLの試験サンプルを50μLのペプチド:HRPコンジュゲート(p44-4-Aph(SEQ ID
NO:15):HRPコンジュゲートでは0.5μg/mL、Aph rp44コンジュゲートでは3μg/mL)と
混合し、プレートに添加した。プレートを1時間インキュベートした。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで6回洗浄した。TMBをプレートに添加し、10分間インキュベートした。50μLの停止溶液を添加し、A650を測定した。結果を図5に示す。Aph p44-4(SEQ ID NO:15)は、感染後約10〜14日でAph感染を検出できた。Aph rp44(SEQ ID NO:10
)は、感染後約10日でAph感染を検出できた。
炭酸バッファー(pH9.6)に混合したポリペプチド(0.5μg/mLまたは1.0μg/mL)で、Immulon(登録商標)4プレートを一晩コーティングした。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで4回洗浄した後、2% TWEEN(登録商標)20(ポリソルベート)/2.5%ス
クロース含有0.1M Tris(pH7.6)で2時間ブロッキングした。乾燥剤を用いてプレートを
一晩乾燥させた。サンプル希釈剤で1:200に希釈した血清試験サンプル100μlを45分間イ
ンキュベートした。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで6回洗浄した。サンプル希釈剤で1:2000に希釈したHRPコンジュゲート・ウサギ抗イヌIgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories社、ペンシルバニア州ウェストグローブ;カタログ番号:304-035-003)100μLを添加し、45分間インキュベートした。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで6回洗浄した。60μlのTMBをプレートに添加し、10分間インキュベー
トした。50μlの停止溶液を添加し、A650を測定した。試験サンプルは以下の通りである
:
陽性(「+」)は後期Aph感染イヌ由来の血清7検体のプールを示す。
陰性(「-」)は無作為抽出した健常イヌ血清7検体のプールを示す。
VML8、VML14、VML21、およびVML156は、IFAでAph陽性であり、アナプラズマ症の急性臨床兆候を示すイヌ4検体由来の血清サンプルを示す。結果を図6に示す。Aph p44-4は4検
体の血清と反応した。Aph p44-1およびAph p44-2は4検体の血清と反応せず、Aph p44-3は4検体の血清とわずかに反応した。従って、Aph p44-4およびAph 44-3は、アナプラズマ症の急性臨床兆候を示す被験体におけるAphの検出に使用できる。
Aph p44-4-v(SEQ ID NO:20)を表2に示すサンプルを用いて試験した。
標)4プレートを一晩コーティングした。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファー
で2回洗浄した後、2% TWEEN(登録商標)20(ポリソルベート)/2.5%スクロース含有0.1M Tris(pH7.6)で2時間ブロッキングした。乾燥剤を用いてプレートを一晩乾燥させた。コンジュゲート希釈剤で1:200に希釈した試験サンプルをプレートに添加し、40分間イン
キュベートした。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで6回洗浄した。コンジュゲート希釈剤で1:2000に希釈したHRPコンジュゲート・ウサギ抗イヌIgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Laboratories社、ペンシルバニア州ウェストグローブ;カタログ番号:304-035-003)をプレートに添加し、40分間インキュベートした。プレートをPetChek(登録商標)洗浄バッファーで6回洗浄した。60μlのTMBをプレートに添加し、10分間イン
キュベートした。50μlの停止溶液を添加し、A650を測定した。結果を図7に示すが、こ
れは重複(duplicate)実験の平均値を示す。p44-4-vでは、以下のサンプルで陽性結果を示し:VML21;ILS73、APH、および+ve;以下のサンプルで陰性結果を示した:APLおよび-ve。従って、Aph 44-4-vは急性症例において、少なくとも感染後14日という短期間でAph
感染を検出することができる。Aph p44-4-vはApl感染イヌ由来血清と交差反応性を示さない。
Claims (22)
- SEQ ID NO:8もしくはSEQ ID NO:10のアミノ酸配列から成る;または、SEQ ID NO:10の
アミノ酸1-45;SEQ ID NO:10のアミノ酸41-89;SEQ ID NO:10のアミノ酸85-130;SEQ ID NO:10のアミノ酸126-160;SEQ ID NO:10のアミノ酸129-146;SEQ ID NO:10のアミノ酸144-160;もしくはSEQ ID NO:10のアミノ酸136-155から成る;または、SEQ ID NO:1-21のア
ミノ酸配列の少なくとも17個の連続するアミノ酸から成る;または、SEQ ID NO:1-21と少なくとも約94%の同一性を有するポリペプチドから成る精製ポリペプチドを1つまたはそ
れ以上含有する組成物。 - 請求項1記載の1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドが指示薬、シグナル配列、輸送停止配列、アミノ酸スペーサー、膜貫通ドメイン、タンパク質精製リガンド、異種ポリペプチド、免疫応答を亢進する部分、精製を促進する部分、ポリペプチドの安定性を向上する部分、SEQ ID
NO:1-21を含有する1つもしくはそれ以上の更なるポリペプチド、またはそれらの組み合わせに結合している、請求項1記載の組成物。 - 試験サンプル中のアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドもしくはアナプラズマ・プラチス・ポリペプチド、またはその両方に特異的に結合する抗体を検出する方法であり、以下:
(a)請求項1記載の1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドを含有する組成物を、ポリペプチド/抗体複合体の形成が可能な条件下で試験サンプルと接触させること;
(b)ポリペプチド/抗体複合体を検出すること;
を含み、ポリペプチド/抗体複合体の検出が、試験サンプルにおけるアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドもしくはアナプラズマ・プラチス・ポリペプチド、またはその両方に特異的な抗体の存在を示す、上記方法。 - 1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドが指示薬、シグナル配列、輸送停止配列、膜貫通ドメイン、アミノ酸スペーサー、タンパク質精製リガンド、異種ポリペプチド、免疫応答を亢進する部分、精製を促進する部分、ポリペプチドの安定性を向上する部分、SEQ ID
NO:1-21を含有する1つもしくはそれ以上の更なるポリペプチド、またはそれらの組み合わせに結合している、請求項4記載の組成物。 - 1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドを含有する組成物がSEQ ID NO:8または19のア
ミノ酸配列の少なくとも17個の連続するアミノ酸から成り、ポリペプチド/抗体複合体の検出が、試験サンプルにおけるアナプラズマ・プラチスに特異的な抗体の存在を示す、請求項4記載の方法。 - 1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドを含有する組成物がSEQ ID NO:10のアミノ酸配列;SEQ ID NO:10のアミノ酸41-89;もしくはSEQ ID NO:10のアミノ酸85-130の少なくと
も17個の連続するアミノ酸から成る;または、SEQ ID NO:10;SEQ ID NO:10のアミノ酸41-89;もしくはSEQ ID NO:10のアミノ酸85-130と少なくとも約94%の同一性を有するポリペプチドから成り、ポリペプチド/抗体複合体の検出が試験サンプルにおけるアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドもしくはアナプラズマ・プラチス・ポリペプチド、またはその両方に特異的な抗体の存在を示す、請求項4記載の方法。 - 1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドを含有する組成物がSEQ ID NO:10のアミノ酸1-45、SEQ ID NO:10のアミノ酸126-160、SEQ ID NO:10のアミノ酸129-146;SEQ ID NO:10の
アミノ酸144-160、SEQ ID NO:10のアミノ酸136-155の少なくとも17個の連続するアミノ酸から成る;または、SEQ ID NO:10のアミノ酸1-45、SEQ ID NO:10のアミノ酸126-160、SEQ
ID NO:10のアミノ酸129-146;SEQ ID NO:10のアミノ酸144-160、SEQ ID NO:10のアミノ
酸136-155と少なくとも約94%の同一性を有するポリペプチドから成り、ポリペプチド/抗体複合体の検出が試験サンプルにおけるアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドに特異的な抗体の存在を示す、請求項4記載の方法。 - 工程(b)の実施前に工程(a)の複合体を指示薬と接触させることを更に含む、請求項4記載の方法。
- 試験サンプル中の抗体の量を測定する、請求項4記載の方法。
- 1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドが基材に結合する、請求項4記載の方法。
- SEQ ID NO:1-21から成るポリペプチドに特異的に結合する抗体。
- 抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Fabフラグメント、Fab'フラグメン
ト、Fab'-SHフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fvフラグメント、または1本鎖抗体である、請求項12記載の抗体。 - サンプル中のアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドもしくはアナプラズマ・プラチス・ポリペプチド、またはその両方を検出する方法であり、以下:
(a)請求項1記載の1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドに特異的に結合する1つまたはそれ以上の抗体を、ポリペプチド/抗体複合体の形成が可能な条件下でサンプルと接触させること;
(b)ポリペプチド/抗体複合体を検出すること;
を含み、ポリペプチド/抗体複合体の検出がサンプルにおけるアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドもしくはアナプラズマ・プラチス・ポリペプチド、またはその両方の存在を示す、上記方法。 - 1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドがSEQ ID NO:10のアミノ酸1-45、SEQ ID NO:10のアミノ酸126-160、SEQ ID NO:10のアミノ酸129-146、SEQ ID NO:10のアミノ酸144-160
、SEQ ID NO: 10のアミノ酸136-155の少なくとも17個の連続するアミノ酸から成り、ポリペプチド/抗体複合体の検出が試験サンプルにおけるアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドの存在を示す、請求項14記載の方法。 - 1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドがSEQ ID NO:8または19のアミノ酸配列の少な
くとも17個の連続するアミノ酸から成り、ポリペプチド/抗体複合体の検出が試験サンプルにおけるアナプラズマ・プラチス・ポリペプチドの存在を示す、請求項14記載の方法。 - 1つまたはそれ以上の精製ポリペプチドがSEQ ID NO:10のアミノ酸配列;SEQ ID NO:10のアミノ酸41-89;またはSEQ ID NO:10のアミノ酸85-130の少なくとも17個の連続するア
ミノ酸から成り、ポリペプチド/抗体複合体の検出が試験サンプルにおけるアナプラズマ・ファゴサイトフィルム・ポリペプチドまたはアナプラズマ・プラチス・ポリペプチドの存在を示す、請求項14記載の方法。 - 1つまたはそれ以上の抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Fabフラグメ
ント、Fab'フラグメント、Fab'-SHフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fvフラグメント、または1本鎖抗体である、請求項14記載の方法。 - 医薬的に許容される、または獣医学的に許容されるキャリアを更に含む、請求項1記載の組成物。
- アジュバントを更に含む、請求項19記載の組成物。
- 哺乳動物被験体におけるアナプラズマ・プラチス感染、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム感染、またはその両方を治療または寛解する方法であり、哺乳動物被験体に治療的有効量の請求項19記載の組成物を投与することを含む、上記方法。
- 哺乳動物において免疫応答を惹起する方法であり、免疫学的有効量の請求項19記載の組成物を該哺乳動物に投与することを含む上記方法。
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