JP2017532286A - 神経幹細胞を標的とするためのニューロフィラメントペプチドの使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、単離したNFL-TBS40〜63ペプチドは、神経幹細胞に対する特異性が高いことを示す。したがって、本明細書では、インビトロ若しくはインビボにおいてこれらの細胞を検出するための方法で使用するため、化合物若しくは生物学的物質を前記細胞に向かわせるため、又は神経変性障害若しくは脳腫瘍を治療するためにこのペプチドを提示する。

Description

本発明は、単離したNFL-TBS40〜63ペプチドは、神経幹細胞に対する特異性が高いことを示す。
神経幹細胞(NSC類又はNSC)は、成人脳の2つの主要な神経性領域:脳室下帯(SVZ)及び海馬の歯状回に位置する(Gage 2000年)。神経幹細胞の特徴は、自己再生し、培養中にニューロスフェアを形成し、増殖して、ニューロン、星状膠細胞及び乏突起膠細胞を生成する能力(多分化能)である(Hall及びWat、1989年;Reynolds及びWeiss、1992年; Azari等、2010年)。これらの細胞の特徴は、新たな治療アプローチをもたらす。正常なNSC又は遺伝的に改変されたNSCの使用は、神経変性障害(パーキンソン病、ハンチントン病及びアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症)の治療及び悪性神経膠腫の治療のために既に報告されている。神経幹細胞をベースにした療法の開発は、再生医療及び脳腫瘍の治療のために、神経幹細胞を標的とし、これらの細胞の動員を増加させ、神経形成を刺激するために有益であろう(Kim等、2013年及びBexell等、2013年の概説を参照のこと)。
NSCは更に、薬物スクリーニングのために極めて有望である。まだ、これらの細胞を特定し、それらに治療分子を標的化することは困難である。
成人神経幹細胞が発見されて以来、発生から成人期まで同じ組織において、又は異なる成人組織において、幹細胞が共通の顕著な特徴をどの程度有するのかは、重要な問題となってきた。転写因子SOX2、中間径繊維タンパク質ネスチン及びビメンチン並びに膜タンパク質プロミニン1は、様々な領域及び個体発生過程に亘るNSCに共通の分子マーカーであることが示唆された(Lendahl等、1990年、Suh等、2007年、Weigmann等、1997年)。しかし、これらのマーカーは成人脳にかなり広く行き渡っており、SOX2は星状膠細胞全てにおいて発現し (Suh等、2007年)、ネスチン及びプロミニン1は脳室の内部を覆っている上衣細胞に存在する(Beckervordersandforth等、2010年、Coskun等、2008年)。
更に、NSCを単離し、特徴付ける従来の方法は、ニューロスフェア形成及びマーカー分子の免疫検出等のように、合成培地における挙動に依存する。しかし、これらの方法は、時間がかかり、いくつかの抗体の使用を伴い、更に実験及び治療に使用するのに細胞を適さなくしてしまうことがある。
したがって、神経幹細胞の検出に有用な新規化合物を開発する必要性がある。
更に、治療薬を神経幹細胞の中へ送達するために(それによって、例えば、神経幹細胞の動員を増加させ、且つ/又は神経形成を刺激するために)これらの細胞を特異的に標的とする化合物を同定する必要もある。
このような状況において、本発明者等は、「NFL-TBS40〜63」と呼ばれる微小管脱重合ペプチドがインビトロ及びインビボにおいて神経幹細胞に対して特有の特異性を有することを初めて示した。
以下に挙げた結果によって、NFL-TBS40〜63ペプチドが新生仔ラット及び成体ラットの神経幹細胞中に用量依存的摂取によって大量に移動することができることが明らかである。更に、成体ラットの側脳室に注射したとき、NFL-TBS40〜63ペプチドは上衣層に、その一部は上衣下帯に位置したので、このペプチドはまたインビボにおいてSVZ中に入り、神経幹細胞を標的とすることができることが示された。要するに、これらの結果はこのペプチドが細胞培養及び動物モデルの両方において神経幹細胞によって選択的に摂取されることを示している。
本発明者等はまた、低濃度で使用したとき(典型的には、40μmol/L未満)、NFL-TBS40〜63ペプチドはNSCに対してあまり大きな細胞傷害作用を有さないことを示した。したがって、ヒトにおいて治療薬をNSCに標的化するために安全に使用することができる。
本発明者等はまた、高濃度(典型的には40μmol/L超)では、NFL-TBS40〜63ペプチドは、NSCの分化状態及び付着を増強することによって、インビトロにおいてNSCの自己再生能力を低下させることを示した(図4及び図5を参照のこと)。したがって、NFL-TBS40〜63ペプチドは、神経変性疾患を罹患している患者において(例えば、死細胞を置換することによって)、又は脳癌を罹患している患者において(例えば、しばしば腫瘍再発の原因となる幹細胞の増殖を低下させることによって)使用することができる。
したがって、本発明者等は、
i)間葉系幹細胞について蛍光量子ドットと結合させたTat及びRGDペプチドで以前に示されたように(Shah等、2007年;Lei等、2008年;Jo等、2012年)、NSCを追跡するためにNSCを標識するため、若しくは特性(自己再生若しくは分化)を調節するため;又は
ii)神経膠芽腫細胞で以前に示されたように(Balzeau等、2013)、機能化したナノ粒子を使用する送達系としての
NFL-TBS40〜63ペプチドの使用を提案する。
Remington、The Science and Practice of Pharmacy、19版、1995年、Mack Publishing Company社
本発明者等は、「NFL-TBS40〜63」と呼ばれる微小管脱重合ペプチドがインビトロ及びインビボにおいて神経幹細胞に対して特有の特異性を有し、これらの特定の細胞に治療化合物を送達するために使用することができることを初めて示した。
NFL-TBS40〜63ペプチドは、ニューロフィラメント軽サブユニットに沿って位置するチューブリン結合部位の配列に対応する。このペプチドは以前に、本発明者等によって、インビトロ及びインビボにおいて神経膠芽腫細胞を標的とし、そのために微小管ネットワークを破壊することができることが示された(Bocquet等、2009年;Berges等、2012年;Balzeau等、2013年;Lepinoux-Chambaud及びEyer、2013年)。その一方で、これらの研究は、星状膠細胞、乏突起膠細胞又はニューロンを含む神経系の増殖の遅い健康な細胞では内部移行のレベルが非常に低いことを強調した(Bocquet等、2009年)。したがって、同じペプチドが、神経幹細胞はもちろん、健康な細胞を特異的に標的化し、浸透することができることは驚くべきことである。
実際に、本発明者等は、本明細書でNSCによるNFL-TBS40〜63摂取に関与する細胞機構は、基本的にその他の細胞で以前に観察されたものとは異なることを示す。
第1に、NSC中におけるNFL-TBS40〜63の摂取機構は基本的に、神経膠芽腫細胞において認められものとは異なる。神経膠芽腫細胞においては、ペプチドはエンドサイトーシスによってのみ内部移行し(Lepinoux-Chambaud及びEyer、2013年)、一方、神経幹細胞においては、ペプチドは受動輸送によって膜から直接移動することができ、これは温度及びエネルギー依存性である。このことはまた、エンドサイトーシスの阻害剤全種を使用して裏付けられた。この結果は、NFL-TBS40〜63ペプチドはNSCにおいて、エンドサイトーシス経路であるマクロピノサイトーシスによって誘導多能性幹細胞(iPS細胞)に導入されるR8及びTatのようなその他の細胞浸透性ペプチドとは異なる特有の進入経路を使用することを示している(Yukawa等、2010年)。
第2に、神経膠芽腫細胞でNFL-TBS40〜63ペプチドが微小管ネットワークを破壊し細胞周期をブロックする特異的な効果は、神経幹細胞では認められない。神経幹細胞におけるチューブリン免疫染色によって、ペプチドでインキュベーションした後、微小管ネットワークが十分に組織化されていることが明らかになった。ペプチドによって長時間処理しても、神経幹細胞の細胞周期及び生存能に影響はなかった。1つの可能性は、神経膠芽腫においてはβIII-チューブリンの発現レベルが高い一方、神経幹細胞及び前駆細胞はβII-チューブリンを発現したことであろう(Namakura等、2003年;Katsetos等、2009年)。
第3に、高濃度のNFL-TBS40〜63ペプチドは神経幹細胞の自己再生を中断し、未処理細胞と比較して2次ニューロスフェアの数を減少させる。この効果は、ペプチド存在下ではニューロスフェアの接着が増加し、分化した細胞が増加する可能性があることによって説明され得る。この効果は、神経幹細胞に特異的である。
定義
神経幹細胞は、神経系の主要な表現型を生じる自己再生性の多能性細胞である。幹細胞は、環境からの外部刺激によって複数の細胞種に分化する能力が特徴である。これらは非対称細胞分裂を受けて2つの娘細胞になり、1つは特殊化されておらず、もう一つは特殊化される。NSCは、主にニューロン、星状膠細胞及び乏突起膠細胞に分化する(Hall及びWat、1989年;Reynolds及びWeiss、1992年;Azari等、2010年)。
NFL-TBS40〜63ペプチドは、以下の配列: YSSYSAPVSSSLSVRRSYSSSSGS(配列番号1)を有する24個のアミノ酸長のポリペプチドである。本発明の適用の場合、「本発明で使用したペプチド」と呼ばれる。以前に言及したように、これは軽ニューロフィラメントサブユニットの第2のチューブリン結合部位に対応する(NFLタンパク質のTBS部位のアミノ酸40から63)。
このペプチドは神経膠腫細胞の増殖に影響を及ぼすことが以前に開示された。更に、そのとき、検出不可能とまではいかないにしても、正常な星状膠細胞又はニューロンにはわずかな影響しか及ぼさないことが開示された(Bocquet等、2009年)。神経幹細胞に対するその影響は、今まで全く評価されたことはなく、示唆されたこともない。
本発明の方法で使用した「単離されたアミノ酸配列」にはNFL-TBS40〜63ペプチドが含まれるが、完全なニューロフィラメント軽サブユニット自体であってはならない。これは、このタンパク質がその断片(すなわち、NFL-TBS40〜63ペプチド)と同じ生物学的活性を有さないからである。特に、完全なNFLタンパク質は、NSCに浸透することができない。したがって、本発明の単離されたアミノ酸配列には、提供したNFL-TBS40〜63ペプチドが含まれるが、完全なニューロフィラメント軽(NFL)サブユニット自体は含まれない。
一般的に、本発明の方法で使用した単離されたアミノ酸配列は100個以下のアミノ酸、好ましくは50個以下のアミノ酸を含む。
好ましい実施形態では、本発明の方法で使用した単離されたアミノ酸配列は、NFL-TBS40〜63ペプチド(配列番号1)又はその生物学的に活性のある誘導体から構成される。好ましくは、NFL-TBS40〜63ペプチド(配列番号1)自体から構成される。
本発明の方法は更に、「NFL-TBS40〜63ペプチドの生物学的に活性のある誘導体」を使用することができる。本明細書で使用したように、「ペプチド誘導体」という用語には、それが意味するペプチドのバリアント及び断片が含まれる。したがって、軽ニューロフィラメントサブユニット(すなわちNFL-TBS40〜63(配列番号1))の第2のチューブリン結合部位の「誘導体」には、NFL-TBS40〜63ペプチドのバリアント及び断片が含まれる。より詳細には、本発明の状況では、誘導体はこのペプチドの「生物学的活性のある」バリアント及び断片、すなわち、親NFL-TBS40〜63ペプチドの生物学的活性及び特異性を保持するバリアントを示す。したがって、本発明の状況では、NFL-TBS40〜63ペプチドの「生物学的に活性のある」誘導体は、親NFL-TBS40〜63ペプチドのように神経幹細胞に対して高い特異性を示さなければならない。NFL-TBS40〜63ペプチドの前記誘導体は、インビトロにおいて従来の細胞摂取実験によって評価したとき、好ましくはNSCに対して親NFL-TBS40〜63ペプチドと同じ特異性を有する。ペプチドの細胞摂取は、前記ペプチドをエンドサイトーシスが阻害された(例えば、前記細胞を4℃で維持することによって、又は細胞のATPを欠乏させることによって)細胞と接触させることによって、及び細胞内部に見いだされる(例えば、免疫化学によって)ペプチドの量を測定することによって、測定することができる。
好ましい実施形態では、NFL-TBS40〜63ペプチドの誘導体は、NFL-TBS40〜63ペプチドの生物学的に活性のある断片である。前記断片は、親NFL-TBS40〜63ペプチドの少なくとも12個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも16個、より好ましくは少なくとも18個のアミノ酸を含み、親NFL-TBS40〜63ペプチドの特異性を保持していることが特徴である。
別の好ましい実施形態では、NFL-TBS40〜63ペプチドの誘導体は、NFL-TBS40〜63ペプチドの生物学的に活性のあるバリアントである。前記バリアントは、ペプチドの対立形質バリアントであるか、又はペプチドのペプチド模倣バリアントであってもよい。「ペプチドの対立形質バリアント」は、1つ又は複数のアミノ酸がその他のアミノ酸によって置換されているか、又は抑制されている以外はNFL-TBS40〜63ペプチドと同じアミノ酸配列を有し、最終的なペプチドは親NFL-TBS40〜63ペプチドの特異性を保持している。好ましくは、このような対立形質バリアントは、(配列番号1の)親NFL-TBS40〜63ペプチドと比較して、70%、好ましくは80%、より好ましくは90%、更により好ましくは95%の同一性を有する。例えば、このような対立形質バリアントは、NFL-TBS40〜63ペプチドの24個のアミノ酸の20個を保持する、ウズラのニューロフィラメント軽サブユニットのTBSモチーフであってもよい。ペプチドのバリアントはまた、NSCに対する特異性を含む親ペプチドのいくつかの特性を模倣している有機分子であるペプチド模倣バリアントであってもよい。好ましいペプチド様物質は、好ましくは非天然アミノ酸、Lアミノ酸の代わりにDアミノ酸、立体拘束、イソステリック置換、環化又はその他の改変を使用した、本発明で記載したペプチドの構造改変によって得られる。その他の好ましい改変には、限定はしないが、1つ若しくは複数のアミド結合が非アミド結合によって置換されたもの、及び/或いは1つ若しくは複数のアミノ酸側鎖が異なる化学的部分によって置換されたもの、或いは1つ若しくは複数のN末端、C末端又は1つ若しくは複数の側鎖が保護基によって保護されているもの、及び/或いは2重結合及び/又は環化及び/又は立体特異性がアミノ酸鎖に導入されて剛性及び/又は結合親和性が増加しているものが含まれる。更にその他の好ましい改変には、親NFL-TBS40〜63ペプチドと比較して酵素分解に対する耐性の増強、生物学的利用率の改善、より一般的には薬物動態特性の改善を目的とするものが含まれる。アミドのC末端部分の変化(それによって、迅速なタンパク質分解から同物を保護すること)が、NFL-TBS40〜63ペプチドの標的化特性に影響を及ぼさないことは注目に値する。
これらのバリアントは全て当業界では周知である。したがって、NFL-TBS40〜63ペプチドのペプチド配列が分かれば、当業者であればNFL-TBS40〜63ペプチドと類似の、又はNFL-TBS40〜63ペプチドよりも優れた生物学的特性を有するペプチド模倣体を設計し、生成することができる。NFL-TBS40〜63ペプチドの好ましいペプチド模倣バリアントは、NSCに対するNFL-TBS40〜63ペプチドの特異性を保持している。
本発明で使用したペプチド(すなわち、NFL-TBS40〜63ペプチド又はその断片を含むアミノ酸配列、そのペプチド模倣バリアント又は対立形質バリアント)は、業界で認識されている技術を使用して便利に合成することができる。
本明細書で使用したように、2つのアミノ酸配列の間の「同一性の割合」とは、最良アラインメント(最適アラインメント)した後に得られた2つの比較配列の間で同一であるアミノ酸残基の割合を意味し、この割合は純粋に統計学的であり、2つの配列の間の差は全長に沿って無作為に分配されている。2つのアミノ酸配列の間の配列比較は、例えば、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.htmlで利用可能なBLASTプログラムで実施することができ、使用するパラメータは初期設定によって与えられたものである(特に、パラメータは「オープンギャップペナルティ」:5及び「伸長ギャップペナルティ」:2であり、選択したマトリックスは、例えば、プログラムによって推奨された「BLOSUM 62」マトリックスであり、2つの比較配列の間の割合同一性はこのプログラムによって直接計算される)。
本明細書で使用したように、用語「生物学的試料」又は「試料」は、インビトロにおいて扱う細胞培養物を示す。培養した細胞は、系列由来か又は初代由来であってもよい。この第2の場合、細胞は生検又は外科的手術の後で動物の脳から抽出することができる。
NSCを標的化するためのNFL-TBS40〜63ペプチドの使用
神経幹細胞の標的化は、NSCが成人脳に存在し、そこで増殖し、自己再生して新たなニューロン、星状膠細胞及び乏突起膠細胞に分化することができるので、新たな再生戦略の開発に有望である。
本発明者等は、本明細書で、NFL-TBS40〜63ペプチドがインビトロにおいて神経幹細胞中に受動的に移動することができ、ラットの脳脊髄液中に注射したとき、インビボにおいて細胞傷害を引き起こすことなく、成体神経幹細胞を標的とすることができることを示す。更に、インビトロにおけるニューロスフェアの形成は、このペプチドの存在によって変化しないが、これらの細胞の自己再生能力は少し減少し、付着細胞の増加及びNSC増殖の減少と関連した。これらの結果は、NFL-TBS40〜63ペプチドが神経幹細胞を標的化するための新たな分子手段となり、再生医療及び脳腫瘍の治療のための新たな戦略において使用できることを示している。より詳細には、NSCによるNFL-TBS40〜63ペプチドの摂取は、これらの細胞の分化を増加させるか又は誘導し(それによって死細胞と置換し)、したがって、神経変性障害に罹患している患者にとって有益である。或いは、癌性NSCの分化が有利になるようにすることによって、NFL-TBS40〜63ペプチドは異常な増殖を減少させることができ、したがって脳癌に罹患している患者にとって有益である。
したがって、第1の態様では、本発明はインビトロにおいて化合物又は生物学的物質を神経幹細胞に標的化するための、NFL-TBS40〜63ペプチド(配列番号1)又はその生物学的に活性のある誘導体を含む単離されたアミノ酸配列の使用に関する。
或いは、本発明は、インビボにおいて化合物又は生物学的物質を神経幹細胞に標的化するための方法において使用するための、NFL-TBS40〜63ペプチド(配列番号1)又はその生物学的に活性のある誘導体を含む単離されたアミノ酸配列に関する。
また、本発明は、化合物又は生物学的物質を、インビボにおいてそれらを必要とする対象の神経幹細胞に、又はインビトロにおいて神経幹細胞に標的化するための方法に関する。
このような化合物又は生物学的物質は、NFL-TBS40〜63ペプチドに直接結合することができるか、又はNFL-TBS40〜63ペプチドに結合させた適切な担体(例えば、ナノカプセル、リポソーム、ミセル又は当業者に公知の任意のカプセル化手段)に含有させることができる。
前記化合物又は生物学的物質は、医薬化合物及び/又は標識マーカーであってもよい。このような化合物/マーカーの例を以下に開示する。
したがって、この標的化方法は、それらを必要とする患者を治療するため、又はインビトロ若しくはインビボにおいて神経幹細胞を検出するために使用することができる。
NSCに関連した疾患を治療するためのNFL-TBS40〜63ペプチドコンジュゲートの使用
その後の態様では、本発明は、NFL-TBS40〜63ペプチド(配列番号1)又はその生物学的に活性のある誘導体を含有する医薬組成物を、それらを必要とする患者を治療するための方法で使用するために提供する。
上記で開示したように、(配列番号1の)NFL-TBS40〜63ペプチド又はその生物学的に活性のある誘導体は、インビボにおいてNSC分化が有利になるようにする又はNSC自己再生を低下させるために単独で使用することができる。
この場合、本発明は、NFL-TBS40〜63ペプチド(配列番号1)又はその生物学的に活性のある誘導体を含む単離されたアミノ酸配列を、それらを必要とする患者を治療するための医薬組成物の製造のために使用することに関する。
この医薬組成物におけるNFL-TBS40〜63ペプチドの濃度は、(分化又は自己再生に対する)医薬品の効果をそれ自体に誘導するために十分高くするべきである。この高濃度は、典型的に少なくとも約0.04mg/kgであり、推奨される最大開始用量MRSDは約4μg/kgである。これらの値は、ラットに注射したペプチドの量(約230gの体重に対して57μg)及びラット(=6)及びヒト(=37)に通常使用したKm値に基づいている(Reigner B.等、2002年)。
或いは、(配列番号1の)NFL-TBS40〜63ペプチド又はその生物学的に活性のある誘導体は、別の化合物に共有結合(又はコンジュゲート)してもよい。
この後者の場合、本発明は、NFL-TBS40〜63ペプチド(配列番号1)又はその生物学的に活性のある誘導体を含む単離されたアミノ酸配列を、それらを必要とする患者を治療するための医薬コンジュゲートの製造に使用することに関する。
本明細書で使用したように、用語「医薬コンジュゲート」は、NFL-TBS40〜63(配列番号1)又はその生物学的に活性のある誘導体を含有する任意のコンジュゲート分子を示す。このコンジュゲート分子は、
- NFL-TBS40〜63(配列番号1)又はその生物学的に活性のある誘導体を含有する融合タンパク質、
- NFL-TBS40〜63ペプチド又はその生物学的に活性のある誘導体に直接結合した化合物又は生物学的物質、或いは、
- 適切な担体(例えば、ナノカプセル、リポソーム、ミセル)に含有される化合物又は生物学的物質であって、前記担体がNFL-TBS40〜63ペプチド又はその生物学的に活性のある誘導体に結合している化合物又は生物学的物質
であってもよい。
前記化合物又は生物学的物質は任意の性質であってもよい。
好ましい実施形態では、前記化合物又は生物学的物質は神経変性障害を治療することを目的とする。よって、これは分化因子(AMPA、ピラセタム、SCS-111、FK-960、アピゲニン等)及び自己再生(SOX2又はCBF1等)、増殖(OLIG2又はID2等)又は分化(MASH1又はPAX6等)に影響を及ぼす転写因子からなる群において選択することが好ましい。これらの因子は、Ahmed等、2009年及びTaupin等、2011年において概説されている。
好ましい実施形態では、前記化合物又は生物学的物質は脳癌を治療することを目的とする。よって、これは表面受容体を活性化若しくは阻害する分子、又はサイトカイン(HGH、SCF、VEGF等)が好ましい。これらの分子はOh及びLim、2009年に開示されている。
NFL-TBS40〜63ペプチドは、例えば、転写因子(SOX2、CBF1、OLIG2、ID2、MASH1、PAX6又はAhmed等、2009年において言及されたもの)を特に神経幹細胞に向かわせ、それによって神経幹細胞の動員を増加させ、神経形成を刺激し、且つ/又はこれらの分化、遊走、増殖及び/又は自己再生を調節することができる。
注目すべきことに、NFL-TBS40〜63ペプチドはその他の化合物をNSCに標的化するための担体(例えば、カプセル化化合物)として使用するとき、その濃度は、(分化又は自己再生に対する)医薬品の効果をそれ自体に誘導するには低すぎる。
別の実施形態では、本発明は、前記医薬組成物又は前記医薬コンジュゲートを含有する医薬組成物の有効量をそれらを必要とする患者に投与することによって、これらの患者を治療的に処置する方法に関する。この治療的使用及び方法によって利益を得ることができる患者は、例えば、脳腫瘍又は神経変性疾患に罹患している患者である。
脳腫瘍、より詳細には神経膠芽腫には、NSCの腫瘍幹細胞への異常な発達が関与する。これらの細胞は通常従来の治療に抵抗性であり、腫瘍の再発(recidive)に有利である。
NSCは神経変性の原因ではないので、神経変性疾患はNSCに直接関係しない。しかし、NSCは、ヒト脳において、変性したニューロンの修復及び置換に寄与する新たな細胞の天然の供給源である。これらの神経変性疾患は、例えば、アルツハイマー病、皮質基底核変性症、クロイツフェルト-ヤコブ病、前頭側頭葉変性、ハンチントン病、多発性硬化症、正常圧水痘症、器質慢性脳症候群、シャルコー-マリー-トゥース病、アレキサンダー病、パーキンソン病、ピック病、進行性核上性麻痺又は老人性認知症(アルツハイマー型)である。
特定の実施形態では、腫瘍又はニューロン変性が神経性区域の近傍に位置するとき、NFL-TBS40〜63(配列番号1)又はその生物学的に活性のある誘導体は、神経幹細胞の分化を増強するために単独で投与することができる。
反対の場合、すなわち、腫瘍又はニューロン変性がいかなる神経区域からも離れて位置するとき、NFL-TBS40〜63(配列番号1)又はその生物学的に活性のある誘導体は、神経形成又は損傷を受けた区域へのNSCの遊走に有利な薬理学的分子に結合することができる。これらの分子は、例えば、Agasse等、2004年に開示されているように、増殖因子又はサイトカイン(BDNF、VEGF、CNTF、bGFG、LIF等)である。
好ましい実施形態では、前記対象は、ほ乳類、好ましくはマウス、ラット、ネコ又はイヌであり、より好ましくはヒトである。
このような医薬組成物は、上記で定義したような医薬コンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む。
本発明の目的のために、適切な薬学的に許容される担体には、限定はしないが、水、塩溶液(例えば、NaCl)、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース等の炭水化物、アミロース又はデンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘稠パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース及びポリビニルピロリドンが含まれる。医薬調製物は滅菌し、所望するならば、活性化合物と有害な反応をしない補助剤、例えば、潤沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、着色剤、矯臭剤及び/又は芳香族物質等と混合することができる。組成物はまた、所望するならば、微量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はpH緩衝剤を含有することができる。組成物は、液状溶液、懸濁液又はエマルジョンであってもよい。いくつかの適切で的確な製剤は、例えば、Remington、The Science and Practice of Pharmacy、19版、1995年、Mack Publishing Company社に記載されている。
患者が神経膠芽腫に罹患している場合(この場合、血液脳関門は変化し、数多くの分子に対して多孔性になる)、本発明のペプチドは静脈内注射によって投与することが可能である。この場合、医薬組成物は、個体に静脈内投与するために適合した組成物として通常の手法に従って製剤化することができる。典型的に、静脈内投与用の組成物は、滅菌した等張水性緩衝液に溶かした溶液である。
更に、好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、脳内注射による投与専用の液体組成物である。前記脳内注射は、例えば、外科医が現在通常使用している定位脳手術を使用することによって行うことができる。
本発明による化合物の有効用量は、例えば、選択した投与方法、治療する個体の体重、年齢、性別及び感受性等の数多くのパラメータに応じて変化する。したがって、最適な用量は、専門医が関連するパラメータに応じて個々に決定しなければならない。下記に挙げた最初の動物実験からヒトに期待される活性用量を予測するために、Rocchetti等(2007年)によって記載されたようなk2及びCT値も使用することができる。
動物(例えば、ラット)を治療するための有効用量は、定位的単回注射(60μl)を使用して約0.01マイクロモルと0.1ミリモルとの間の範囲であり、好ましくは約0.02と0.08マイクロモルの間であることが予見される。ヒト脳はラット脳よりも平均700倍重く、ヒトを治療するための有効用量は約0.01mg/kgと約0.1mg/kgの間、好ましくは約0.01mg/kgと0.05mg/kgの間の範囲であることが予見される。これらの指示した用量は、臨床治療研究の状況において調整するべきであることは明らかである。
NSCを検出するためのNFL-TBS40〜63ペプチドの使用
別の態様では、本発明は、インビボ又はインビトロにおいて、神経幹細胞を検出するための、NFL-TBS40〜63ペプチド(配列番号1)又はその生物学的に活性のある誘導体の使用に関する。
特定の実施形態では、本発明は、インビトロにおいて生物学的試料を、神経幹細胞の有無について試験するための方法であって、
a. 試料の細胞を適切な培地に懸濁すること、
b. NFL-TBS40〜63ペプチド又はその生物学的に活性のある誘導体を、試料の懸濁細胞と混合すること、
c. 前記NFL-TBS40〜63ペプチドを含有する細胞の割合を測定することを含み、
前記NFL-TBS40〜63ペプチドを含有する細胞の割合が、試料中の神経幹細胞の割合に対応する方法に関する。
NFL-TBS40〜63ペプチド及びその生物学的に活性のある誘導体の特徴は以前に記載されたことがある。
好ましい実施形態では、この方法はNFL-TBS40〜63ペプチド(配列番号1)自体を使用する。
好ましい実施形態では、前記NFL-TBS40〜63ペプチドは、従来技術によってペプチドを含有する細胞の有無が容易に検出されるように標識する。
本明細書で使用した用語「標識した」は、検出可能な(好ましくは定量可能な)効果を提供するために使用することができ、アミノ酸配列に結合することができる任意の原子又は分子を意味する。標識には、限定はしないが、色素、32P等の放射標識、ビオチン等の結合部分、ジゴキシゲニン等のハプテン、発光発生部分、リン光部分若しくは蛍光発生部分、質量タグが含まれ、蛍光色素は単独で、又は蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)によって放射スペクトルを抑制又はシフトさせることができる消光剤と組み合わせて含まれる。前記標識は、蛍光、放射活性、比色、重量測定、X線回折又は吸収、磁性、酵素活性、質量の特徴又は質量によって影響を受ける挙動(例えば、MALDI飛行時間型質量分析)等、好ましくは蛍光によって検出することができるシグナルを提供することができる。標識は、電荷部分(正若しくは負の電荷)であってもよく、或いは電荷的に中性であってもよい。標識は、標識を含む配列が検出可能であれば、核酸又はタンパク質配列を含むか、又はこれらから構成されていてもよい。
好ましくは、前記標識は蛍光色素である。適切な蛍光色素には、例えば、
1. フルオレセイン及びヘキサクロロ-フルオレセイン、テトラクロロ-フルオレセイン、カルボキシフルオレセイン(TAMRA)、CAL FLUOR(登録商標)( BIOSEARCH TECHNOLOGIES社製のCAL Fluor Green 520、CAL FLUOR Gold 540、CAL FLUOR ORANGE 560、CAL FLUOR RED 590、CAL FLUOR RED 635)、カルボキシフルオレセインのスクシニミジルエステル(6-カルボキシ-2',4,4',5',7,7'-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX(商標)のスクシニミジルエステル)又は6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'ジメトキシフルオレセイン(JOE(商標)のスクシニミジルエステル)のような誘導体;
2. ローダミン及び5-若しくは6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミンのような誘導体;
3. シアニン及びCy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5のような誘導体;
4. 4,4-ジフルオロ-5,7-ジフェニル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸、4,4-ジフルオロ-5,p-メトキシフェニル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸、4,4-ジフルオロ-5-スチリル-4-ボラ-3a,4-adiaz-a-S-インダセン-プロピオン酸、4,4-ジフルオロ-5,7-ジフェニル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸、4,4-ジフルオロ-5,p-エトキシフェニル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン 3-プロピオン酸及び4,4-ジフルオロ-5-スチリル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-S-インダセン-プロピオン酸のようなBODIPY(登録商標)発色団;
5. テキサスレッド(登録商標)及び誘導体;
6. APTS、HPTS(CASCADE BLUE(登録商標))のようなピレントリスルホン酸;並びに
7. エオジン及び誘導体が含まれる。
より好ましくは、前記蛍光色素は、フルオレセイン及びヘキサクロロ-フルオレセイン、テトラクロロ-フルオレセイン、カルボキシフルオレセイン(TAMRA)、CAL FLUOR(登録商標)(BIOSEARCH TECHNOLOGIES社製のCAL Fluor Green 520、CAL FLUOR Gold 540、CAL FLUOR ORANGE 560、CAL FLUOR RED 590、CAL FLUOR RED 635)のような誘導体、カルボキシフルオレセインのスクシニミジルエステル(6-カルボキシ-2',4,4',5',7,7'-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX(商標))のスクシニミジルエステル又は6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'ジメトキシフルオレセイン(JOE(商標))のスクシニミジルエステル)からなる群で選択する。
本発明の状況では、このような蛍光色素標識ペプチドを検出するための好ましい従来の技術には、限定はしないが、フローサイトメトリー又は蛍光顕微鏡が含まれる。
このインビトロにおける方法において、前記アミノ酸配列を含有する細胞の割合は、試料中の神経幹細胞の割合に「対応する」。これは、NFL-TBS40〜63ペプチドを含有する細胞の割合が、生物学的試料中における神経幹細胞の割合と同等で、大体約5%(at more or less about 5%)であることを意味する。試料中における細胞の絶対数がわかるとき、試料中における神経幹細胞の絶対数が大体約5%であると本発明の方法から推測することもできる。
細胞を懸濁し、インビトロにおいて幹細胞に適切な培地中で増殖させる。このような培地は当業者には周知で、グルコース及びL-グルタミン、及びペニシリン/ストレプトマイシンを含むと有利である。前記培地は、細胞の分化を回避するためにウシ胎児血清を含有しない。しかし、この培地はEGF及び/又はFGF、所望により神経細胞用の補助剤(例えば、B27)を含有すると有利である。細胞は、5% CO2ガスを満たして加湿した37℃のインキュベーター内で維持する。
この方法の工程a)において、ニューロスフェアは適切な培地中において37℃で本発明のペプチドと接触させる。
好ましくは、添加するアミノ酸配列の濃度には、1と100μMの間、より好ましくは2と50μMの間、更により好ましくは5と30μMの間が含まれる。
好ましくは、NFL-TBS40〜63ペプチドは、細胞に少なくとも30分間、好ましくは1時間添加し、その後、残存する遊離のペプチドを除去するために細胞を徹底的に洗浄する。
好ましくは、NFL-TBS40〜63ペプチドは蛍光性色素と直接又は適切な担体を介して結合させ、細胞中におけるその存在はフローサイトメトリーによって明らかにする。より好ましくは、蛍光性色素は、本発明のペプチドに更に結合した脂質ナノカプセル中に含有させる。
或いは、NFL-TBS40〜63ペプチドは標識せず、その検出は、例えば、アミノ酸配列の全部又は一部に対する抗体を使用して従来の手段によって間接的に実施する。この場合、間接的検出の従来技術(例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、ウェスタンブロット等)を使用することができる。
好ましい実施形態では、神経幹細胞の検出のためのインビトロにおける方法は、NFL-TBS40〜63ペプチド自体を使用する。より好ましくは、カルボキシフルオレセイン標識NFL-TBS40〜63ペプチド又はビオチンタグNFL-TBS40〜63ペプチドを使用する。
更に、例えば、腫瘍が脳室下帯の近くにあるとき、又は有害な/薬剤による処置の間のNSCの予後を追跡するために、インビボにおいて脳内のNSCを検出することは有用であり得る。或いは、パーキンソン病又はアルツハイマー病に罹患した患者の脳に再移植する前に、インビトロにおいてこれらの細胞を操作するために(例えば、遺伝子治療によって)、前記患者の脳からこれらの細胞を抽出するために(定位吸引術によって)これらの細胞を検出することは有用であり得る。最後に、多発性硬化症に罹患した患者の脳の脱随した区域に再移植する前に、インビトロにおいて乏突起膠細胞を増殖させるために、前記患者からNSCを回収することは有用であり得る。したがって、本発明の別の実施形態では、本発明は、インビボにおいて神経幹細胞を検出するための、NFL-TBS40〜63ペプチド又はその生物学的に活性のある誘導体を含む単離されたアミノ酸配列、言い換えれば、インビボにおいて神経幹細胞を検出するために使用するNFL-TBS40〜63ペプチド又はその生物学的に活性のある誘導体を含む単離されたアミノ酸配列の使用に関する。
この特定の実施形態では、本発明のアミノ酸配列は、好ましくは蛍光性色素又は発光性色素で、直接又は外科的手術中に安全な状態で検出することができる適切な担体(ナノカプセル等)によって標識する。
例えば、本発明は、インビボにおいて神経幹細胞の存在を検出するための方法であって、
a) NFL-TBS40〜63ペプチド又はその生物学的に活性のある誘導体を含むアミノ酸配列を、直接又は適切な担体によって(ナノカプセル等)蛍光色素若しくは発光性色素で標識すること、
b) 前記アミノ酸配列を脳内に注射すること、
c) 神経幹細胞を明らかにするために特定の波長の光を(蛍光性色素若しくは発光性色素に応じて)、ペプチドを注射した脳領域に適用すること
を含む方法を提供する。
新生仔ラットの神経幹細胞におけるNFL-TBS40〜63ペプチドの用量依存摂取を示した図である。(A)ニューロスフェアは濃度を増加させたFITC標識NFL-TBS40〜63ペプチドで30分間インキュベートし、その後、0.4%トリパンブルーを有する(濃い曲線)又は有さない(点線)NSC中におけるペプチド摂取をFACS解析する前に分離させた。結果はペプチドを含有する蛍光細胞の割合を表し、ペプチド無しでインキュベートした細胞(対照)と比較した。(B)新生仔ラットの神経幹細胞中におけるNFL-TBS40〜63ペプチド摂取の共焦点顕微鏡写真。ニューロスフェアはFITC標識ペプチド20μmol/Lで6時間インキュベートし、免疫組織化学を実施してα-チューブリンを検出し、核はDAPIで染色した。 成体ラットのNSC中におけるNFL-TBS40〜63ペプチド摂取を示した図である。(A)成体ラットの神経幹細胞におけるNFL-TBS40〜63ペプチドの用量依存摂取。成体ラットから得られたニューロスフェアは濃度を増加させたFITC標識NFL-TBS40〜63ペプチドで30分間インキュベートし、その後FACS解析する前に分離した。結果は蛍光細胞の割合を表す。(B)インビボにおいてNFL-TBS40〜63ペプチド注射した後の成体ラットのSVZの免疫組織化学。成体ラットの右側脳室にFITC標識NFL-TBS40〜63ペプチド1mmol/Lを投与し、1時間後殺処分した。SVZ中に発現した中間径フィラメントは、抗ビメンチン(1)及び抗GFAP(2)で染色し、核はDAPIで染色した。白色の断続的な線で区切ったSVZはビメンチンを発現する上衣細胞によって側脳室から分離され、上衣下帯内にGFAP発現細胞がある。 新生仔ラットの神経幹細胞中におけるNFL-TBS40〜63ペプチドの受動輸送を示した図である。ニューロスフェアは、正常な条件で(黒い棒)又はATP欠乏緩衝液中で30分間(A)並びに4℃で30分間(B)培養した。次に、細胞は、それぞれ同じ条件でFITC標識NFL-TBS40〜63ペプチド20μmol/Lで30分間又は1時間インキュベートした。(C)ニューロスフェアはクロルプロマジン50μmol/L、PMA 10μg/mL、DAM 1mmol/L、ワートマニン100nmol/L、U0126 40μmol/L、ゲニステイン400μmol/L、スニチニブ1μmol/L及びゲフィチニブ50μmol/Lで30分間予備処理した。次に、これらを同じ条件でFITC標識NFL-TBS40〜63ペプチド20μmol/Lで30分間インキュベートした。最後に、ニューロスフェアを分離して、FACSによってペプチド摂取を解析した。結果は、正常(対照)条件と比較したときの蛍光細胞の割合を表す。 NFL-TBS40〜63ペプチドはニューロスフェア形成を変化させないが、NSC自己再生を中断させ、高濃度で細胞の接着を増加させることを示した図である。ニューロスフェアの形成を分析するために、濃度を増加させたNFL-TBS40〜63ペプチドと一緒に、若しくは一緒にせずに、又はコルヒチン1μg/mLと一緒に5〜7日間NSCをインキュベートし、1次ニューロスフェアの数をそれぞれの条件で顕微鏡分析によって計数した。 NFL-TBS40〜63ペプチドはニューロスフェア形成を変化させないが、NSC自己再生を中断させ、高濃度で細胞の接着を増加させることを示した図である。NSC自己再生を分析するために、処理した1次ニューロスフェアを分離し、2次ニューロスフェアの数を5日後にそれぞれの条件で顕微鏡分析によって計数した。処理したニューロスフェアの数を未処理ニューロスフェア(対照)と比較した。*P<0.05;***P<0.001。 NFL-TBS40〜63ペプチドはニューロスフェア形成を変化させないが、NSC自己再生を中断させ、高濃度で細胞の接着を増加させることを示した図である。NFL-TBS40〜63ペプチドと一緒に、又は一緒にせずに処理した付着性1次ニューロスフェアの数は顕微鏡分析によって計数した。付着性ニューロスフェアの割合は対照条件と比較して決定した。***P<0.001。 NFL-TBS40〜63ペプチドはニューロスフェア形成を変化させないが、NSC自己再生を中断させ、高濃度で細胞の接着を増加させることを示した図である。それぞれの条件の1次ニューロスフェアの代表的な形態の画像は、倒立顕微鏡Leica及びMetamorphソフトウェアで撮影した。 NFL-TBS40〜63ペプチドはニューロスフェア形成を変化させないが、NSC自己再生を中断させ、高濃度で細胞の接着を増加させることを示した図である。NSC上でのPSA-NCAM発現を定量するために、ニューロスフェアを、濃度を増加させたNFL-TBS40〜63ペプチドと一緒に、若しくは一緒にせずに、又はウシ新生児血清(血清)1%と一緒に7日間処理して、分離した細胞をPSA-NCAM標識後にFACSによって解析した。結果は、対照条件と比較したPSA-NCAMを発現する蛍光細胞の割合を表す。 NFL-TBS40〜63ペプチドはニューロスフェア形成を変化させないが、NSC自己再生を中断させ、高濃度で細胞の接着を増加させることを示した図である。NSC増殖を分析するために、細胞をBD Cell Tak中でインキュベートし、濃度を増加させたNFL-TBS40〜63ペプチドと一緒に、若しくは一緒にせずに、又はコルヒチン1μg/mLと一緒に72時間処理した。次に、DNA濃度(ng/mL)は、CyQUANT細胞増殖アッセイを使用して定量した。結果は、対照条件と比較したDNA濃度(ng/mL)の割合を表す。 NFL-TBS40〜63ペプチドが神経幹細胞の細胞周期及び生存能に影響を及ぼさないことを示した図である。ニューロスフェアは濃度を増加させたNFL-TBS40〜63ペプチド又はコルヒチン1μg/mLと一緒に48時間処理した。次に、ニューロスフェアを分離し、細胞周期分析をPI取り込み及びFACS読み取りによって実施した。細胞周期の各相の細胞の割合は、未処理細胞(対照)と比較して決定した。*P<0.05;***P<0.001。 NFL-TBS40〜63ペプチドが神経幹細胞の細胞周期及び生存能に影響を及ぼさないことを示した図である。NSCはコーティングしたLabTekチャンバー上で培養し、FITC標識ペプチド20μmol/Lでインキュベートした。次に、免疫組織化学を実施して、抗-α-チューブリンで微小管ネットワークを明らかにした。画像は、Metamorphソフトウェアで分析した。 NFL-TBS40〜63ペプチドが神経幹細胞の細胞周期及び生存能に影響を及ぼさないことを示した図である。ニューロスフェアは濃度を増加させたNFL-TBS40〜63ペプチド又はコルヒチン1μg/mLと一緒に72時間処理した。次に、ニューロスフェアを分離し、細胞生存能分析をAnnexin V/PI染色及びFACS読み取りによって実施した。生存可能な細胞の割合は、ペプチドを有さないが同条件でインキュベートした細胞(対照)と比較して決定した。***P<0.001。 NFL-TBS40〜63ペプチドの神経幹細胞に対する仮定の効果を示した図である。ペプチド及びEGFの存在下で、ニューロスフェア形成は影響を受けなかったが、自己再生能力は低下し、幹細胞の接着は増加し、おそらく分化した細胞は増加した。
以下の実施例ではNFL-TBS40〜63ペプチドの高い特異性及び生物学的効果を記載する。しかし、これらは特に本発明のアミノ酸配列の性質及びそれを使用するための実験条件に関して限定するものではない。
略語:CED:対流強化輸送法;DAPI:4'6-ジアミニド-2-フェニルインドール;DAM:5-(N,N-ジメチル)アミロライドヒドロキシクロリド;DNA:デオキシリボ核酸;DG:歯状回;EGF:上皮成長因子;FITC:カルボキシ-フルオレセインイソチオシアネート;GFAP:グリア繊維酸性タンパク質;NBCS:ウシ新生仔血清;NFL-TBS:ニューロフィラメント軽サブユニット-チューブリン結合部位;NSC:神経幹細胞;PBS:リン酸緩衝ナトリウム;PE:R-フィコエリトリン;PI:ヨウ化プロピジウム;PMA:13-酢酸12-ミリスチン酸ホルボール;PSA-NCAM:ポリシアル酸神経細胞付着分子;SEM:平均の標準誤差;SVZ:脳室下帯。
細胞培養及び材料
神経幹細胞の初代培養は、新生仔(1〜5日)又は成体(<4ヶ月)のウィスターラット脳の脳室下帯から得る。分離した細胞は、D-グルコース(Sigma社)25mmol/L、ピルビン酸Na 1mmol/L、HEPES 15mmol/L、5%ペニシリン/ストレプトマイシン(PAA社)及び1% B27(Gibco社)を補給し、EGF(Promega社)20ng/mLを含有するMEMアルファ(PAA)中で増殖させた。5〜7日後、幹細胞は浮遊するニューロスフェアを形成した。
ペプチドは、Millegen(Toulouse社、France)又はEurogentec(Seraing社、Belgium)によって合成された。NFL-TBS40〜63ペプチド(YSSYSAPVSSSLSVRRSYSSSSGS)は、ビオチン化するか又はカルボキシ-フルオレセインイソチオシアネート(FITC)に結合し、滅菌水に溶解する。
クロルプロマジンヒドロキシクロリド(50mol/L)、13-酢酸12-ミリスチン酸ホルボール(PMA、10g/mL)、5-(N,N-ジメチル)アミロライドヒドロキシクロリド(DAM、1mmol/L)、ワートマニン(100nmol/L)、U0126(40μmol/L)、スニチニブ(1μmol/L)及びコルヒチン(1μg/mL)はSigma社から入手した。ゲニステイン(400μmol/L)は、Merck社から入手した。ゲフィチニブ(50μmol/L)はSanta Cruz Biotechnology社から入手した。
フローサイトメトリー
FITC標識NFL-TBS40〜63ペプチドの内部移行を蛍光標示式細胞分取器(FACS、Becton Dickinson社)によって評価するために、ニューロスフェアを35mm皿に接種し、濃度を増加させたFITC標識NFL-TBS40〜63ペプチドを含有する培地中で、37℃で30分間培養した。FITC標識NFL-TBS40〜63ペプチドの細胞外シグナルを消失させるために、0.4%トリパンブルー(Sigma社)をFACS解析前に添加した。摂取機構を調べるために、ニューロスフェアは4℃で30分間予備インキュベートするか、又は細胞性ATPを欠乏させるためにアジ化ナトリウム10mmol/Lと一緒に2-デオキシ-D-グルコース6mmol/Lの存在下で予備インキュベートするか、又は様々な阻害剤と一緒に37℃で30分間予備インキュベートした。その後、FITC標識ペプチド20μmol/Lを細胞に37℃で30分間添加した。その後、遠心分離(700rpmで5分間)してから、細胞を機械的に分離し、PBSで2回洗浄し、次いでヨウ化プロピジウム(PI、Sigma社)50μg/mL中に再懸濁した。FITC標識ペプチドを取り込んだ蛍光陽性細胞をフローサイトメトリー(FACSCalibur、Becton Dickinson社)によって分析した。
神経幹細胞上でのPSA-NCAM発現を定量するために、ニューロスフェアを35mm皿に接種し、濃度を増加させたビオチン化NFL-TBS40〜63ペプチドを含有するか、又は1%ウシ新生仔血清(NBCS)を含有する培地中で、37℃で7日間培養した。分離後、細胞をR-フィコエリトリン(PE)にコンジュゲートした抗PSA-NCAM抗体で、4℃で10分間インキュベートし(Miltenyi社)、洗浄した後PI 50μg/mL中に再懸濁した。PSA-NCAMを発現した蛍光陽性細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
NFL-TBS40〜63ペプチドの細胞周期に対する可能性のある効果を調べるために、ニューロスフェアを35mm皿に接種し、次に濃度を増加させたビオチン化NFL-TBS40〜63ペプチド又はコルヒチン1μmol/Lと一緒に37℃で48時間処理した。次に、ニューロスフェアをマイクロ遠心分離管に収集した。遠心分離後(700rpmで5分間)、細胞を機械的に分離し、PBS-Tween 0.5%で透過処理し、エタノール70%で固定してからRNアーゼ(Invitrogen社)1mg/mLを37℃で30分間添加した。細胞懸濁液は、フローサイトメトリーによるDNA含量分析の前にPI 10μg/mLで希釈した。
NFL-TBS40〜63ペプチドの存在下での細胞生存能を分析するために、ニューロスフェアを35mm皿に接種し、次に濃度を増加させたビオチン化ペプチド又はコルヒチン1μmol/Lで、37℃で3若しくは5日間処理した。次に、ニューロスフェアをマイクロ遠心分離管に収集した。遠心分離後(700rpmで5分間)、細胞を機械的に分離し、アネキシン-V FITC(アネキシン-V FITCキット、Miltenyi Biotec社)で、室温で15分間染色した。最後に、細胞はフローサイトメトリーによる分析の前にPI 1μg/mL溶液で対比染色した。
CyQUANT細胞増殖アッセイ
NSC増殖に対するNFL-TBS40〜63ペプチドの効果を分析するために、1次ニューロスフェアを分離し、ウェル当たり5.103個の細胞を96ウェルマイクロプレート上のBD Cell-Tak(BD Biosciences社)に播種した。細胞は濃度を増加させたビオチン化NFL-TBS40〜63ペプチド又はコルヒチン1μg/mLと一緒に37℃で72時間処理した。PBSで洗浄後、細胞を-80℃で凍結させた。最後に、DNA濃度は、CyQUANT細胞増殖アッセイキット(Molecular Probes社)を使用して分析した。
共焦点顕微鏡
神経幹細胞におけるNFL-TBS40〜63ペプチド摂取を視覚化するために、ニューロスフェアをBD Cell-Tak(BD Biosciences社)カバーガラス又はLabTekチャンバーに播種した。24時間後、ニューロスフェアをFITC標識NFL-TBS40〜63ペプチド20μmol/Lで30分、6時間又は72時間インキュベートした。PBSで洗浄した後、細胞を4%パラホルムアルデヒドで15分間固定し、PBSで3回洗浄した。次に、これらを0.5%トリトンX-100透過処理溶液で30分間インキュベートして、PBSで3回洗浄してから、ブロッキング溶液(0.1%トリトンX-100に溶かした1%牛血清アルブミン)で1時間インキュベートした。その後、ニューロスフェアをマウス抗α-チューブリン抗体(Sigma社)1/1000で、4℃で一晩インキュベートした。PBSで3回洗浄した後、Alexa568nm抗マウス抗体(Life Technologies社)1/200を2時間使用してチューブリンの位置を突き止めた。ニューロスフェアはPBSで3回洗浄してから、4'6-ジアミニド-2-フェニルインドール(DAPI、Sigma社)3μmol/Lを5分間添加した。PBSで洗浄した後、カバーガラスにProLong Gold antifade溶液(Life Technologies社)を加えた。染色したニューロスフェアは、倒立蛍光顕微鏡Leica又はLSM 700 Zeiss共焦点顕微鏡で観察し、画像はそれぞれMetamorph又はZen 2009ソフトウェアで分析した。
ニューロスフェア形成及び自己再生分析
ニューロスフェア形成特性を調べるために、24ウェルプレートでEGF 20ng/mLを含有する培地にウェル当たり5.103個のSVZ細胞を接種した。細胞は、濃度を増加させたビオチン化ペプチドの非存在下若しくは存在下で、又はコルヒチン1μg/mLでインキュベートした。5〜7日後、1次ニューロスフェアの総数及び付着した1次ニューロスフェアの割合を各条件下で顕微鏡分析によって測定し、写真を倒立顕微鏡及びMetamorphソフトウェアで撮影した。次に、自己再生アッセイのため、1次ニューロスフェアを各条件下で収集し、単一細胞として分離し、EGF 20ng/mLを含有する培地に接種した。5日後、2次ニューロスフェアの総数を各条件下で顕微鏡分析によって計数した。
NFL-TBS40〜63ペプチドの心室内注射及び免疫組織化学
実験手順及び動物の世話は全てフランス政府の指針に則り、動物実験倫理の地方委員会(Comite d'Ethique en Experimentation Animale des Pays-de-la-Loire)の承認後実行した。
雌成体ウィスターラットをケタミン10%(80mg/kg)及びキシラジン2%(10mg/kg)の混合物の腹腔内注射によって麻酔した。その後、動物を定位固定器具(David Kopf instruments社、Tujunga、CA)に入れ、皮膚を矢状切開して頭蓋を露出させ、適切な座標に歯科用ドリルを使用して小孔を開けた(ブレグマの前方へ-0.8mm及び側方へ1.6mm)。頭蓋の外縁から右側脳室に4.3mmの深さで、32G針(Hamilton社、VWR)を付けた10μLハミルトンシリンジ(ハミルトンガラスシリンジ70RN)を使用してFITC-ペプチド1mmol/Lの体積20μLを注射し、カニューラによってペプチドを含有する100μLハミルトン22Gシリンジ(ハミルトンガラスシリンジ810RN)に連結した。浸透圧ポンプ(Harvard Apparatus社)を用いた対流強化送達法(CED)によって流速0.5μL/分の流速でゆっくり注入を実施した。注射後、針を抜いて(0.5mm/分)、頭部の皮膚を縫合した。動物は、注射して1時間後、6時間後、又は24時間後に殺処分し、脳を取り出し凍結してから、Leicaクリオスタットを使用して薄片を作製した。
免疫組織化学のために、脳切片(厚さ12μm)を冷メタノールで10分間固定し、PBSで3回洗浄し、PBS 5%ウシ血清アルブミンで、室温で1時間ブロックした。次に、切片をPBS 5%ウシ血清アルブミンで1/200に希釈したマウス抗GFAP、1/200に希釈したマウス抗ビメンチン(Sigma社)及び1/500に希釈したマウス抗ネスチン抗体(R&D)で一晩インキュベートした。PBSで3回洗浄後、1次抗体は、PBS 5%ウシ血清アルブミンで1/200にした抗マウス抗体Alexa 568nm(Life Technologies社)を使用して明らかにし、室温で90分間インキュベートして、その後PBSで洗浄した。次に脳切片を4'6-ジアミニド-2-フェニルインドール(DAPI、Sigma社)3μmol/Lで5分間対比染色し、PBSで2回すすいだ。最後に、スライドにProLong Gold antifade試薬(Life Technologies社)を加え、Nikon共焦点顕微鏡で観察し、Nikon NIS elementsソフトウェアを使用して写真を撮影した。
統計学的解析
全実験は、少なくとも3回繰り返した。FACS解析のために、試料当たり20000事象を解析した。結果は、蛍光細胞の平均パーセントとして表し、データは平均の標準誤差(SEM)を有する棒グラフとして表した。統計学的解析は、Prism 3.00(GraphPad software社、San Diego、CA)を使用したスチューデントのt検定で実施した。アスタリスクは対照条件に対する有意なレベルを示す:*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。
3.結果
新生仔及び成体ラットの神経幹細胞におけるNFL-TBS40〜63ペプチドの内部移行はまずインビトロ及びインビボにおいて調べ、次にその摂取機構を特徴付けた。その後、NSCの微小管ネットワーク、細胞周期及び生存能に対するペプチドの可能性のある分子及び細胞効果を分析した。最後に、ニューロスフェア形成、自己再生及び分化を含むNSCの基本的な特性に対するペプチド摂取の影響を評価した。
NFL-TBS40〜63ペプチドは、インビトロ及びインビボにおいて新生仔及び成体ラットの神経幹細胞に浸透する
神経幹細胞は、濃度を増加させたカルボキシフルオレセインタグ付けペプチドで30分間インキュベートし、次にペプチド取り込みは高感度FACS技術を使用して評価した。図1Aは、新生仔ラットのNSCにおけるペプチドの用量依存摂取を示している。FITC-ペプチド5μmol/Lでは、新生仔NSCの38.72±9.08%がペプチドを内部移行し、40μmol/LではほとんどのNSCがペプチドを内部移行した(91.07±5.13%)。これらの実験で得られたシグナルが内部移行したFITC-ペプチドに対応するかどうかを評価するために、FACS読み取りの前に0.4%トリパンブルーを添加してFITC-ペプチドの表面結合蛍光を消失させた。結果は、消失させないものと類似のペプチドの用量依存摂取を示し、ペプチドの細胞内蛍光が裏付けられた(図1A)。更に、共焦点顕微鏡によって、ニューロスフェア中に存在するNSC並びに周辺の前駆細胞におけるペプチドの内部移行が裏付けられた(図1B)。
インビトロにおける成体NSCのペプチド摂取は更に、フローサイトメトリー並びにインビボにおける成体ラットの側脳室へのペプチドの注射及びその後の免疫組織化学によって調べた。NSCは成体ラットSVZから単離し、濃度を増加させたFITCタグ付けペプチドで30分間インキュベートした。ペプチド取り込みは、高感度FACS技術を使用して評価した。これらの細胞においてペプチドの用量依存摂取が認められ、40μmol/Lで最大閾値92.74±2.51%に到達し、新生仔ラットのNSCによって認められた摂取と同等であった(図2A)。インビボにおける成体NSCによるペプチドの可能性のある標的化摂取を試験するために、FITCタグ付けペプチドを成体ラットの右側脳室に注射し、注射1時間後に試料を検査した。ビメンチンを発現する繊毛上衣細胞の1層によってSVZは側脳室から分離され、上衣下帯にGFAP発現細胞がある。脳切片によって、ペプチドは右側脳室、上衣細胞に局在し、細胞がGFAPを発現するSVZにおいて一部が認められることが明らかになった(図2B)。類似のパターンがペプチド注射の6時間後及び24時間後に認められた(データは示さず)。これらの共焦点分析によって、ペプチドは上衣細胞に内部移行し、検出可能な細胞傷害性を引き起こすことなく上衣障壁を横断して神経幹細胞及び前駆細胞が見いだされたSVZに浸透することができることが示された。
受動輸送によるNFL-TBS40〜63ペプチドの摂取
ペプチド摂取、特にペプチドの内部移行のよく知られている2つの主要な経路、エンドサイトーシス及び直接移動(Stewart等、2008年)に関与する分子機構を調べた。ペプチドを添加する前に細胞を4℃で、又はATP欠乏緩衝液中で30分間インキュベートし、更にそれらを30分間インキュベートすることによって、受動又は能動輸送をまず評価した。ペプチド摂取は、4℃又はATP欠乏によって影響を受けなかったので、NSCにおける内部移行は受動機構によって生じることが示された(図3A及び図3B)。能動輸送の使用を更に排除するために、よく知られた各エンドサイトーシス経路の一群の阻害剤並びにエンドサイトーシス機構に関与するシグナル伝達経路の阻害剤(PI3K、MAPK、成長因子受容体)を試験した。図3Cは、これらの阻害剤の存在下で、ペプチド摂取は影響を受けないことを示し、エンドサイトーシスによってNSCに内部移行しているのではないことが裏付けられた。
NFL-TBS40〜63ペプチドはニューロスフェア形成に影響を及ぼさないが、高濃度(100μmol/L)においてのみ細胞接着を増加させることによって神経幹細胞の自己再生を低下させる
NSCの特徴は、インビトロにおいてニューロスフェアを形成し、自己再生する能力である。濃度を増加させたペプチドにNSCを5日間曝露したとき、100μmol/L以外では一次ニューロスフェアの数は未処理対照NSC培養物と比較して変化しなかった(図4A)。更に、結果は、1次ニューロスフェアのほとんどがペプチド40μmol/Lで付着性であることを示した。高濃度のペプチドでは、浮遊するニューロスフェアは認められなかった(図4C)。これらのニューロスフェアの画像は、ペプチド濃度の増加に相関した付着細胞の数の増加を示した(図4D)。
この効果は、ペプチド存在下でのニューロスフェア接着の増加及び細胞増殖の減少によって説明された。
これらの観察を完全にするために、PSA-NCAM発現も分析した。このタンパク質の特徴は、細胞-細胞相互作用及び細胞外マトリックスとの細胞相互作用を制限することによって、及び細胞付着を止めることによって神経幹細胞を増殖させることである(Johnson等、2005年)。
高いペプチド濃度での神経幹細胞の接着増加は、神経幹細胞上でのポリシアル酸神経細胞付着分子(PSA-NCAM)発現の弱い減少と関連する。これはまた、神経幹細胞を1% NBCSでインキュベートしたときに示された(図4E)。
更に、結果は、細胞を高濃度のペプチドで1週間インキュベートしたとき、抗増殖剤のコルヒチンで示されたように、神経幹細胞増殖の著しい減少を示した。これらの結果は、ペプチドは低いペプチド濃度から神経幹細胞の増殖を変化させ、この効果は高濃度ではより重大であることを示唆した(図4F)。
したがって、この研究では、高濃度のペプチドは神経幹細胞におけるPSA-NCAM発現を減少させ、したがってそれらの付着増加を説明する。
NSCの自己再生能力を調べるために、ペプチドと一緒に、又は一緒にしないで培養した1次ニューロスフェアを分離し、培養培地のみで5日間置換した。ペプチドで既に培養した1次ニューロスフェアから分離した細胞は、対照NSC培養物と比較したとき、生じる2次ニューロスフェアの数がかなり低かった(図4B)。これらの実験では、陽性対照は、細胞増殖をブロックするコルヒチン1μg/mLにNSCを曝露することによって使用した。考え合わせると、これらの結果は、ペプチドは(高濃度100μmol/Lを除いて)ニューロスフェア形成に影響を及ぼさないが、細胞接着を増加させ、細胞増殖を減少させて神経幹細胞の自己再生に影響を及ぼすことを示した。
NFL-TBS40〜63ペプチドは神経幹細胞に対して検出可能な細胞傷害性効果を有さない
ペプチドは10μmより高い濃度で神経膠芽腫細胞において微小管形成を中断させ、結果的に細胞周期を中断することが示された。しかし、このような効果は、ニューロン及び星状膠細胞のような正常細胞では認められなかった(Bocquet等、2009年;Berges等、2012年)。NSCにおけるペプチドの効果を調べるために、濃度を増加させたペプチドの存在下でNSCの細胞周期を、48時間FACS解析を使用することによって分析した。ペプチドが有っても無くても、NSCの細胞周期は変化せず、G1期の細胞が約60〜65%、S期が10%、G2/M期が7%であった。NSCの細胞周期は、微小管ネットワークを中断させる陽性対照として使用したコルヒチン1μg/mLの存在下でのみ影響を受けた(図5A)。これらの結果は、神経膠芽腫細胞とは対照的に、ペプチドがNSCの細胞分割に影響を及ぼさないことを示す(Berges等、2012年)。更に、共焦点顕微鏡によって、ペプチドで6時間インキュベートした後、NSCの微小管ネットワークは影響を受けなかったが、コルヒチンは微小管ネットワークに非常に影響を及ぼすことが示された(図5B)。ペプチドがNSCの生存能にあまり影響を及ぼさないことも示された。細胞は、濃度を増加させたペプチド又はコルヒチンで3日間処理し、アネキシンV-FITC及びPIで染色し、その後フローサイトメトリーによって分析した。生細胞の数は、コルヒチンで処理したとき強く低下したが、細胞生存能はペプチドの存在下では変わらなかった(図5C)。
要約すると、これらの結果は、低濃度では(20μmol/Lまで)ペプチドは細胞接着に影響を及ぼすことなく細胞増殖を中断するが、高濃度(40μmol/Lから)ではペプチドは神経幹細胞の増殖及び付着の両方に影響を及ぼすことを示し、神経幹細胞が前駆細胞又は分化した細胞に分化する可能性が特徴付けられた(図6)。
(参考文献)

Claims (15)

  1. インビトロにおいて化合物又は生物学的物質を神経幹細胞に標的化するための、NFL-TBS40〜63ペプチド(配列番号1)又はその生物学的に活性のある誘導体を含む単離されたアミノ酸配列の使用。
  2. 前記化合物又は生物学的物質がNFL-TBS40〜63ペプチド又は前記誘導体に直接結合している、請求項1に記載の使用。
  3. 前記化合物又は生物学的物質がナノカプセル、リポソーム又はミセル中に含有されている、請求項1に記載の使用。
  4. 前記生物学的に活性のある誘導体が、NFL-TBS40〜63ペプチドの生物学的活性及び特異性を保持しているNFL-TBS40〜63ペプチドのバリアント又は断片である、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用。
  5. インビボにおいて化合物又は生物学的物質を神経幹細胞に標的化するための方法において使用するための、NFL-TBS40〜63ペプチド(配列番号1)又はその生物学的に活性のある誘導体を含む単離されたアミノ酸配列。
  6. 前記化合物又は生物学的物質がNFL-TBS40〜63ペプチド又は前記誘導体に直接結合している、請求項5に記載の単離されたアミノ酸配列。
  7. 前記化合物又は生物学的物質がナノカプセル、リポソーム又はミセル中に含有されている、請求項5に記載の単離されたアミノ酸配列。
  8. 前記生物学的に活性のある誘導体が、NFL-TBS40〜63ペプチドの生物学的活性及び特異性を保持しているNFL-TBS40〜63ペプチドのバリアント又は断片である、請求項5から7のいずれか一項に記載の単離されたアミノ酸配列。
  9. 前記化合物又は生物学的物質が神経変性障害又は脳癌を治療することを目的とする、請求項5から8のいずれか一項に記載の単離されたアミノ酸配列。
  10. インビボにおいてNSC分化が有利になるようにする又はNSC自己再生を低下させるために使用するための、NFL-TBS40〜63ペプチド(配列番号1)又はその生物学的に活性のある誘導体を含む単離されたアミノ酸配列。
  11. 神経変性疾患を治療するために使用するための、NFL-TBS40〜63ペプチド(配列番号1)又はその生物学的に活性のある誘導体を含む単離されたアミノ酸配列。
  12. インビトロにおいて神経幹細胞を検出するための、NFL-TBS40〜63ペプチド(配列番号1)又はその生物学的に活性のある誘導体の使用。
  13. 前記NFL-TBS40〜63ペプチド又は前記誘導体が標識されている、請求項12に記載の使用。
  14. インビトロにおいて生物学的試料を、神経幹細胞の有無について試験するための方法であって、
    a.試料の細胞を適切な培地に懸濁すること、
    b.NFL-TBS40〜63ペプチド又はその生物学的に活性のある誘導体を、試料の懸濁細胞と混合すること、
    c.前記NFL-TBS40〜63ペプチドを含有する細胞の割合を測定することを含み、
    前記NFL-TBS40〜63ペプチド又は前記誘導体を含有する細胞の割合が、前記試料中の神経幹細胞の割合に対応する方法。
  15. 前記NFL-TBS40〜63ペプチド又は前記誘導体が標識されている、請求項14に記載の方法。
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