JP2017525387A - Ｃｄ４４の単離されたポリペプチドおよびその使用 - Google Patents

Abstract

CD44の単離されたポリペプチドが提供される。したがって、配列番号1〜3からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチドが提供される。また、配列番号1〜3からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、抗炎症活性を含む、単離されたエンドキャップ付加修飾型ポリペプチドが提供される。組成物、融合タンパク質、医薬組成物、および炎症疾患の治療におけるそれらの使用もまた提供される。
【選択図】なし

Description

本発明は、その一部の実施形態では、CD44の単離されたポリペプチドに関し、より詳細には、排他的ではないが、CD44vRAの単離されたポリペプチドおよび炎症性疾患の治療でのその使用に関する。

CD44は、細胞-細胞相互作用および細胞-マトリックス相互作用、細胞移動、プログラムされた細胞死（アポトーシス）、または、逆に、細胞生存および増殖をはじめとする複数の細胞機能に関与する細胞表面接着分子である。

CD44は、ヒアルロン酸（HA）に対する主要な細胞表面受容体であるが、コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリノゲン、ラミニン、粘膜血管アドレッシン（mucosal vascular addressin）およびオステオポンチンなどのタンパク質に結合することもまた示されている。CD44は、炎症部位への循環中のリンパ球の動員に必須であり、CD44、およびときにはヒアルロン酸の顕著な集積が、創傷治癒、組織再構築、炎症、形態形成および発癌などの集中的な細胞移動および細胞増殖の領域で検出される。

マウスおよびヒトCD44のゲノム配列は、5’末端に5個の定常エキソン、および3’末端に5個の定常エキソンを含む。マウスCD44遺伝子は、V₁〜V₁₀と表わされる10個の可変エキソン（variant exon）を分子の中央部に含み、合計20個のエキソンとなる。ヒトCD44遺伝子は、これら10個の可変エキソンのうちの9個（V₂〜V₁₀）のみを含み、それにより合計19個のエキソンを含む。示差的なV₂〜V₁₀オルタナティブ・スプライシングは、可変エキソン（Vx、x＝1〜10と表わされる）の様々な組み合わせを発現するCD44の多数のアイソフォームを生成し、これらは膜近傍ドメインに挿入され、分子の可変領域を構成する。これらの分子はCD44変異体（CD44v）と表わされる。数十種類のCD44アイソフォームが、現在までに知られている。

いずれの可変エキソンも含まないCD44sは最も偏在的な形態であり、大部分の細胞タイプにより発現される［Ponta, H., et al. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003 Jan;4(1):33-45］。10種類の可変エキソンのうちの1種以上が含まれるCD44変異体タンパク質は、主に、癌、ならびに関節リウマチおよび多発性硬化症などの自己免疫疾患との関連で報告される［例えば、Naor et al. Adv. Cancer Res.,71, 241-319,1997；およびNaor et al. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 39, 527-579, 2002を参照されたい］。

関節リウマチ（RA）を有する患者の関節炎症性細胞は、CD44vRAと表わされるオルタナティブ・スプライシングされたCD44変異体の配列を示す。ヒトCD44vRAは、可変エキソン4と可変エキソン5との間のスプライシング連結部に追加のアラニンの付加（これはリーディングフレームに干渉しない）を伴って、ケラチン生成細胞CD44v3〜v10アイソフォームのものと同じ配列を含む。コラーゲン誘導性関節炎（CIA）を有するマウスは、同じ箇所に、これもまたアラニンを含む同様の配列を含む。CD44vRA配列は、RA患者および乾癬性関節炎（PA）患者の関節炎症性滑膜細胞上に発現されるが、健康なドナーのケラチン生成細胞および末梢血白血球（PBL）のいずれでも発現されない。さらに、RA患者の関節炎症性細胞がCD44vRAを発現する一方で、同じ患者由来のPBLおよび変形性関節症患者由来の滑液細胞はこの変異体をほとんど発現せず、このことは、このアイソフォームの排他性を実証する（Nedvetzki et al., J Clin Invest 111:1211-1220, 2003；Golan et al., J Autoimm 28:99-113, 2007）。

抗CD44抗体、CD44タンパク質、ペプチドまたは誘導体の投与を、様々な自己免疫疾患を治療するために用いることができることが報告されてきた（例えば、Naor et al., Adv. Cancer Res., 71, 241-319, 1997；Naor et al., Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 39, 527-579, 2002；Turley EA, and Naor D. Front Biosci. 17:1775-1794, 2012）。加えて、抗CD44vRAモノクローナル抗体およびCD44vRA由来ペプチドが以前に示唆された（Golan et al., J Autoimm 28:99-113, 2007、国際公開第2010/058396号、同第2005/007700号；同第2003/014160号、同第2000/075312号；米国特許第7,534,605号および同第8,193,311号；ならびに米国特許出願公開第20060019340号）。

国際公開第2010/058396号 国際公開第2005/007700号 国際公開第2003/014160号 国際公開第2000/075312号 米国特許第7,534,605号 米国特許第8,193,311号 米国特許出願公開第20060019340号

Ponta, H., et al. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003 Jan;4(1):33-45 Naor et al. Adv. Cancer Res.,71, 241-319,1997 Naor et al. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 39, 527-579, 2002 Nedvetzki et al., J Clin Invest 111:1211-1220, 2003 Golan et al., J Autoimm 28:99-113, 2007 Turley EA, and Naor D. Front Biosci. 17:1775-1794, 2012

本発明の一部の実施形態の態様において、配列番号1〜3からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチドが提供される。

本発明の一部の実施形態の態様において、配列番号1〜3からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたエンドキャップ付加修飾型ポリペプチドが提供され、このとき、修飾型ポリペプチドは抗炎症活性を含む。

本発明の一部の実施形態において、エンドキャップ付加は、N末端エンドキャップ付加を含む。

本発明の一部の実施形態において、N末端エンドキャップ付加は、アセチルを含む。

本発明の一部の実施形態において、エンドキャップ付加は、C末端エンドキャップ付加を含む。

本発明の一部の実施形態において、C末端エンドキャップ付加は、アミドを含む。

本発明の一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1〜3からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。

本発明の一部の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1に示される。

本発明の一部の実施形態において、エンドキャップ付加修飾型ポリペプチドは、配列番号4〜6からなる群より選択される。

本発明の一部の実施形態において、単離されたポリペプチドと、該単離されたポリペプチドに連結される非タンパク質性部分とを含む組成物が提供され、このとき、単離された融合ポリペプチドは、抗炎症活性を含む。

本発明の一部の実施形態において、C末端および/またはN末端に連結されたアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドを含む単離された融合ポリペプチドが提供され、このとき、C末端アミノ酸配列は単離された融合ポリペプチドとは不連続なCD44vRAアミノ酸配列であり、融合ポリペプチドは抗炎症活性を含む。

本発明の一部の実施形態において、連結は共有結合である。

本発明の一部の実施形態において、抗炎症活性はワクチン接種または粘膜耐性には依存しない。

本発明の一部の実施形態において、単離されたポリペプチドまたは組成物は、血清アミロイドA、トランスサイレチン（transthyretin）およびアポリポタンパク質Bからなる群より選択されるタンパク質と結合することができる。

本発明の一部の実施形態において、活性薬剤としての単離されたポリペプチドまたは組成物と、製薬上許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物が提供される。

本発明の一部の実施形態において、それを必要とする被験体での炎症性疾患を治療する方法が提供され、該方法は、治療上有効量の単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物を被験体に投与し、それにより被験体での炎症性疾患を治療することを含む。

本発明の一部の実施形態において、炎症性疾患の治療用の医薬の製造のための、単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物の使用が提供される。

本発明の一部の実施形態において、投与は、経口投与を含む。

本発明の一部の実施形態において、組成物は、経口投与用に製剤化される。

本発明の一部の実施形態において、炎症性疾患は、CD44vRAを発現する細胞を含む。

本発明の一部の実施形態において、炎症性疾患は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、アルツハイマー病、癌および心血管疾患からなる群より選択される。

本発明の一部の実施形態において、炎症性疾患は関節リウマチである。

本発明の一部の実施形態において、単離されたポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。

本発明の一部の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドを含む核酸構築物が提供される。

本発明の一部の実施形態において、単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物のバッチの有効性を決定する方法が提供され、該方法は、以下のステップ；
(a) 単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物のバッチを、関節リウマチ患者の炎症関節から取得される線維芽細胞と接触させるステップ；および
(b) 所定のインキュベーション時間後に、線維芽細胞の生存率を決定して、それによりバッチの有効性を決定するステップ
を含む。

本発明の一部の実施形態において、該方法は、接触ステップ前に、修飾を含む単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物を合成するステップを含む。

本発明の一部の実施形態において、接触ステップ後の線維芽細胞の生存率の低下は、バッチが有効であることを示す。

本発明の一部の実施形態において、該方法は、細胞の生存率を、単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物の参照標準バッチとの接触後の細胞の生存率と比較して、それによりバッチの相対的有効性を決定するステップを含む。

本発明の一部の実施形態において、該方法は、in vitroまたはex vivoで実行される。

特に定義しない限り、本明細書中で用いられるすべての技術用語および/または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似または同等な方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験で用いることができるが、例示的な方法および/または材料が以下に記載される。矛盾がある場合には、定義を含む特許明細書が支配するであろう。加えて、材料、方法、および例は単に例示的なものであり、必ずしも限定的であることを意図しない。

本発明の一部の実施形態が、添付の図面を参照して、例としてのみ、本明細書中に説明される。ここで、詳細には図面を具体的に参照して、示される項目は、例として、かつ本発明の実施形態の例示的議論の目的のためであることが強調される。これに関して、図面を用いて行なわれる説明は、本発明の実施形態をどのようにして実施できるかを当業者に明らかにする。

−20℃での保存が100％の安定性を表わすものとして、示された温度での保存後の5mer RAペプチド（配列番号1）の安定性（％）を実証する液体クロマトグラフィー-質量分析（LCMS）を示す図である。 9mer RAペプチド（配列番号3）がDBA/1バックグラウンドのコラーゲン誘導性関節炎（CIA）マウスでの関節炎症を低減させることを実証するグラフである。図は、示された時点（矢頭でマーク）での、25μg（図2A）、100μg（図2B）または150μg（図2C）の用量での9merペプチドの注入に続く足腫脹を示す。PBSを対照として注入した。y軸はそれぞれの測定時点での足の幅と疾患発症時（0時点）での足の幅との差異（単位：mm）を示すΔ足腫脹を表わす。結果は平均±SEとして表わし；各群中のマウス数（n）は各図中の挿入文字で示す；^*P＜0.05。 5mer RAペプチド（配列番号1）を用いた処置がC57BL/6バックグラウンドのCIAマウスでの炎症関節の正常組織学を回復させることができることを実証する図である。図3Aおよび図3Bは、PBS対照（図3A）または5mer RAペプチド（図3B）を用いて処置されたマウス由来のH＆E染色済み後肢関節切片の代表的な顕微鏡写真である。図3Cは、PBS対照（n＝7）または5mer RAペプチド（n＝7）を用いて処置されたマウス由来のH＆E染色済み後肢関節切片の組織学的検査により評価した場合の平均炎症スコアをまとめたグラフであり、0は浸潤がないことを示し、4は非常に重い浸潤を示す。p＜0.0001。 7merおよび9mer保護型RAペプチド（配列番号5〜6）がDBA/1バックグラウンドのCIAマウスでの関節炎症を低減させることを実証するグラフである。図は、示した時点（矢印によりマーク）での200μgの用量でのペプチドの注入後の足腫脹を示す。PBSを対照として注入した。y軸はそれぞれの測定時点での足の幅と疾患発症時（0時点）での足の幅との差異（単位：mm）を示すΔ足腫脹を表わす。結果は平均±SEとして表わし；各群中のマウス数（n）は各図中の挿入文字で示す；^*P＜0.05、^**p＜0.01。 5mer保護型RAペプチド（配列番号4）がDBA/1バックグラウンドのCIAマウスでの関節炎症を低減させることを実証するグラフである。図は、示した時点（矢印によりマーク）での200μgの用量でのペプチドの注入後の足腫脹を示す。PBS（図5Aおよび図5B）またはデキサメタゾン（Dex）（図5A）を対照として注入した。y軸はそれぞれの測定時点での足の幅と疾患発症時（0時点）での足の幅との差異（単位：mm）を示すΔ足腫脹を表わす。結果は平均±SEとして表わし；各群中のマウス数（n）は各図中の挿入文字で示す；^*P＜0.05、^**p＜0.01。 5mer保護型RAペプチド（配列番号4）がDBA/1バックグラウンドのCIAマウスでの関節炎症を低減させることを実証するグラフである。図は、示した時点（矢印によりマーク）での200μgの用量でのペプチドの注入後の足腫脹を示す。PBS（図5Aおよび図5B）またはデキサメタゾン（Dex）（図5A）を対照として注入した。y軸はそれぞれの測定時点での足の幅と疾患発症時（0時点）での足の幅との差異（単位：mm）を示すΔ足腫脹を表わす。結果は平均±SEとして表わし；各群中のマウス数（n）は各図中の挿入文字で示す；^*P＜0.05、^**p＜0.01。 5mer保護型RAペプチド（配列番号4）がC57BLバックグラウンドのCIAマウスでの関節炎症を低減させることを実証するグラフである。図は、疾患の発症後、連続した10日間にわたる70μgの用量でのペプチドの注入後の足腫脹を示す。PBSを対照として注入した。y軸はそれぞれの測定時点での足の幅と疾患発症時（0時点）での足の幅との差異（単位：mm）を示すΔ足腫脹を表わす。結果は平均±SEとして表わす；^*P＜0.006。 コアMTADV配列（配列番号5）を含む7mer保護型RAペプチドがDBA/1バックグラウンドのCIAマウスでの関節炎症を低減させ、非特異的なコアスクランブル化7merペプチド（配列番号7）はこのモデルでの関節炎症に効果がないことを実証するグラフである。図は、示した時点（矢印によりマーク）での200μgの用量でのペプチドの注入後の足腫脹を示す。PBSを対照として注入した。y軸は、足腫脹（単位：mm）（図7Aおよび図7C）またはそれぞれの測定時点での足の幅と疾患発症時（0時点、図7B）での足の幅との差異を示すΔ足腫脹（図7B）を表わす。結果は平均±SEとして表わし；各群中のマウス数（n）は各図中の挿入文字で示す；^*P＜0.05、^**p＜0.005。 表6に説明される実験方法に従った7mer保護型RAペプチド（配列番号5）または非特異的スクランブル化7merペプチド（配列番号7）の注入後のCIAマウスでの健康な後肢の割合（％）を示す棒グラフである。PBSを対照として注入した。 注入1回当たり70μgの用量が、5mer保護型RAペプチド（配列番号4）によるC57BL/6バックグラウンドのCIAマウスでの関節炎症を阻害するための至適用量であることを実証するグラフである。図は、疾患の発症後、連続した10日間にわたる70、200および600μg（図9A）または10、25および70μg（図9B）の用量でのペプチドの注入後の足腫脹を示す。PBSを対照として注入した。y軸はそれぞれの測定時点での足の幅と疾患発症時（0時点）での足の幅との差異を示すΔ足腫脹を表わす。結果は平均±SEとして表わし；各群中のマウス数（n）は各グラフ中の挿入文字で示し；^*Pはグラフごとに指示される。 注入1回当たり70μgの用量が、5mer保護型RAペプチド（配列番号4）によるC57BL/6バックグラウンドのCIAマウスでの関節炎症を阻害するための至適用量であることを実証するグラフである。図は、疾患の発症後、連続した10日間にわたる70、200および600μg（図9A）または10、25および70μg（図9B）の用量でのペプチドの注入後の足腫脹を示す。PBSを対照として注入した。y軸はそれぞれの測定時点での足の幅と疾患発症時（0時点）での足の幅との差異を示すΔ足腫脹を表わす。結果は平均±SEとして表わし；各群中のマウス数（n）は各グラフ中の挿入文字で示し；^*Pはグラフごとに指示される。 C57BL/6マウスでの遅延型過敏（DTH）応答に対する5mer RAペプチド（配列番号1）の効果を実証するグラフである。y軸は、7日目での右耳と左耳との厚みの差異を表わす。PBSおよび抗TNFαを用いた処置は、それぞれ陽性対照および陰性対照として機能した。結果は平均±SEとして表わす。DTHプロトコールは、0日目のオキサゾロンを用いた感作；6日目のオキサゾロンを用いた耳での誘発（チャレンジ）；および7日目の耳厚の測定を含んだ。PBSまたはペプチドは、−1日目〜7日目まで注入した。 ELISAにより決定した場合の、5merペプチド（配列番号1）を用いて処置したマウス血清中の中和性抗ペプチド特異的抗体の非存在を示すグラフである。ELISAプレートは、5merペプチドを用いて、またはコラーゲンおよびマウスIgG（陽性対照として機能する）を用いてコーティングした。5merペプチドまたはPBSを用いて処理されたマウス由来血清をプレートウェルに加えた。未接種（ナイーブ）マウスおよびPBSを用いて処理されたマウス由来の血清は、陰性対照として機能した。 5merペプチド標的タンパク質の特定のために用いた手順の模式的表現である。 ペプチドの単回注入後のマウス血清中の5mer RAペプチド（配列番号1）の薬物動態学的排出を示すグラフである。 MTTアッセイにより決定した場合の、RA患者の炎症関節から単離された線維芽細胞の生存率に対する5mer RAペプチド（配列番号1）のin vitro効果を実証するグラフである。 血清アミロイドA（SAA）が、MTTアッセイにより決定した場合の、RA患者の炎症関節から単離された線維芽細胞の生存率に対する5mer RAペプチド（配列番号1）のin vitro効果を妨げることを実証するグラフである。ラクトアルブミン（LA）を非特異的対照として用いた。5merペプチドは一定濃度（25μg/mL）で加え；x軸はSAA濃度およびLA濃度を示す。 MTTアッセイにより決定した場合の、5mer保護型RAペプチド（配列番号4）との比較での、RA患者の炎症関節から単離された線維芽細胞の生存率に対する5mer RAペプチド（配列番号1）のin vitro効果を実証するグラフである。

本発明は、その一部の実施形態では、CD44の単離されたポリペプチドに関し、より詳細には、排他的ではないが、CD44vRAの単離されたポリペプチドおよび炎症性疾患の治療でのその使用に関する。

本発明の少なくとも1つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、以下の記載で説明されるかまたは実施例により例示される詳細に対するその適用に必ずしも限定されないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態であり得、または種々の様式で実施もしくは実行することができる。

CD44は、細胞-細胞相互作用および細胞-マトリックス相互作用、細胞移動、プログラムされた細胞死、または、逆に、細胞生存および増殖をはじめとする複数の細胞機能に関与する細胞表面接着分子である。ヒトCD44のゲノム配列は、5’末端に5個の定常エキソン、および3’末端に5個の定常エキソン、ならびにそれらの間に囲まれる9個の可変エキソンを含む。数十種類のCD44のスプライシング変異体が、現在までに知られている。いずれの可変エキソンも含まないCD44s（配列番号9）は最も偏在的な形態であり、大部分の細胞タイプにより発現される。乾癬性関節炎（PA）、関節リウマチ（RA）を有する患者の関節炎症性細胞はCD44vRAと表わされるオルタナティブ・スプライシングされたCD44変異体の配列（配列番号11）を示し、これは、健康なドナーのケラチン生成細胞および末梢血白血球（PBL）のいずれでも発現されない。

本発明を実施に向かわせながら、本発明者らはここで、CD44vRAの可変エキソン4と可変エキソン5との間のスプライシング連結部でのアラニンの包含により生じるMTADV配列を含む、5mer、7merまたは9merという短いペプチドが、CIAマウスモデル（ヒトRAのマウスアナログ）での関節炎症を阻害できることを明らかにしている。理論に拘泥することを望まないが、本発明の一部の実施形態のポリペプチドは、CD44vRAの天然のリガンドと競合することにより、その活性を生じると考えられる。

下記およびそれに続く実施例節に例示される通り、本発明者らは、5mer、7merおよび9merのペプチド（配列番号1〜3、本明細書中で「RAペプチド」とも称される）ならびにそれぞれのペプチドのアミノ末端およびカルボキシル末端にアセチルおよびアミド保護残基を有する各ペプチド（配列番号4〜6、本明細書中で「RA保護型ペプチド」とも称される）を合成した。ペプチドは、疎水性アミノ酸を含み、タンパク質分解部位を含まず、室温および4℃にて少なくとも22週間安定である（実施例1、図1）。合成されたRAペプチドおよびRA保護型ペプチドは、CIAマウスモデルにてin vivoで関節炎症を減少させることができた（実施例2〜4、図2A〜2B、図3A〜3C；図4、図5A〜5B、図6、図8および図9A〜9B）。さらに、ペプチドは、中和性抗ペプチド特異的抗体の生成を引き起こさず、かつ遅延型過敏（DTH）応答により評価した場合に全般的免疫応答に影響しなかった（実施例5〜6、図10〜11）。重要なことに、スクランブル化非特異的7mer保護型ペプチド（配列番号7）はCIAマウスモデルの関節炎症に対して影響を有しなかった（実施例3、図7A〜Bおよび図8）。質量分析により、RAペプチドのわずかな潜在的標的タンパク質、すなわち、血清アミロイドA、トランスサイレチンおよびアポリポタンパク質Bがさらに明らかになった（実施例7、図12）。加えて、本発明者らは、RAペプチドおよびRA保護型ペプチドの活性を試験するための新規なin vitroアッセイを開発した（実施例9、図14〜16）。

結果として、本教示は、炎症性疾患の治療でのRAペプチドおよびRA保護型ペプチドを含む組成物の使用を示唆する。

つまり、本発明の第1の態様において、配列番号1〜3からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチドが提供される。

具体的な実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1に示される通りである。

具体的な実施形態において、ポリペプチドは、配列番号2に示される通りである。

具体的な実施形態において、ポリペプチドは、配列番号3に示される通りである。

本発明の態様において、配列番号1〜3からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたエンドキャップ付加修飾型ポリペプチドが提供され、該修飾型ポリペプチドは、抗炎症活性を含む。

具体的な実施形態において、エンドキャップ付加修飾型ポリペプチドのポリペプチドアミノ酸配列は、配列番号1〜3からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。

本発明の別の態様では、単離されたポリペプチドと、該単離されたポリペプチドに連結された非タンパク質性部分とを含む組成物が提供され、このとき、単離された融合ポリペプチドは抗炎症活性を含む。

本発明の別の態様では、C末端および/またはN末端に連結されたアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドを含む単離された融合ポリペプチドが提供され、該C末端アミノ酸配列は、該単離されたポリペプチドとは不連続なCD44vRAアミノ酸配列であり；該融合タンパク質は抗炎症活性を含む。

本明細書中で相互に交換可能に用いられる「ペプチド」および「ポリペプチド」との用語は、生来型ペプチド（分解生成物、合成的に合成されたペプチドまたは組み換えペプチドのいずれか）およびペプチドミメティクス（典型的には、合成的に合成されたペプチド）、ならびに、例えば、身体内でペプチドをより安定にする修飾を含むことができ、細胞に浸透してクリアランス、生体内分布および/または薬物動態をより改善できるペプチドアナログである、ペプトイド（peptoid）およびセミペプトイド（semipeptoid）を包含する。そのような修飾としては、限定するものではないが、N末端修飾、C末端修飾、ペプチド結合修飾、骨格修飾、および残基修飾が挙げられる。ペプチドミメティクス化合物を調製するための方法は、当技術分野で周知であり、かつ、例えば、Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)（本明細書中で完全に説明されているが如く、参照により組み入れられる）に特定されている。これに関するさらなる詳細は、下記で提供される。

ペプチド内のペプチド結合（-CO-NH-）は、例えば、Nメチル化アミド結合（-N(CH₃)-CO-）、エステル結合（-C(=O)-O-）、ケトメチレン結合（-CO-CH₂-）、スルフィニルメチレン結合（-S(=O)-CH₂-）α-アザ結合（-NH-N(R)-CO-（式中、Rはいずれかのアルキル（例えば、メチル）であり得る））、アミン結合（-CH₂-NH-）、スルフィド結合（-CH₂-S-）、エチレン結合（-CH₂-CH₂-）、ヒドロキシエチレン結合（-CH(OH)-CH₂-）、チオアミド結合（-CS-NH-）、オレフィン二重結合（-CH=CH-）、フッ素化オレフィン二重結合（-CF=CH-）、レトロアミド結合（retro amide bond）（-NH-CO-）、ペプチド誘導体（-N(R)-CH₂-CO-（式中、Rは炭素原子上に天然に存在する「正常」側鎖である））により置換することができる。

これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合のうちのいずれかに存在することができ、同時に数箇所（例えば2〜3箇所）の結合にさえ存在し得る。

天然芳香族アミノ酸であるTrp、TyrおよびPheは、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸（Tic）、ナフチルアラニン、Pheの環メチル化誘導体、Pheのハロゲン化誘導体またはO-メチル-Tyrなどの非天然芳香族アミノ酸により置換することもできる。

本発明の一部の実施形態のペプチドはまた、1個以上の修飾型アミノ酸または1個以上の非アミノ酸モノマー（例えば、脂肪酸、複合糖質など）も含むことができる。

「アミノ酸」（単数または複数）との用語は、20種類の天然に存在するアミノ酸；例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンをはじめとする多くの場合にin vivoで翻訳後修飾されたそれらのアミノ酸；および、限定するものではないが、2-アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン（isodesmosine）、ノル-バリン、ノル-ロイシンおよびオルニチンをはじめとする他の稀なアミノ酸を含むものと理解される。さらに、「アミノ酸」との用語は、D-アミノ酸とL-アミノ酸（立体異性体）の両方を含む。

以下の表1および表2は、本発明の一部の実施形態と共に用いることができる天然に存在するアミノ酸（表1）、および非従来型または修飾型アミノ酸（例えば、合成アミノ酸、表2）を列記する。

本発明のポリペプチドのアミノ酸は、保存的にまたは非保存的に置換することができる。

本明細書中で用いる場合、「保存的置換」との用語は、類似の立体的特性を有する天然に存在するかもしくは天然に存在しないアミノまたはペプチドミメティクスを用いた、ペプチドの生来型配列中に存在するアミノ酸の置き換えを意味する。置き換える対象である生来型アミノ酸の側鎖は、極性または疎水性のいずれかであり、保存的置換は、これもまた極性または疎水性である（置き換えられるアミノ酸の側鎖と同じ立体的性質を有することに加えて）、天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸またはペプチドミメティクス部分を用いるべきである。

天然に存在するアミノ酸は、典型的にはそれらの性質に従って分類されるので、本発明において立体的に類似の非荷電アミノ酸による荷電アミノ酸の置き換えが保存的置換と見なされるという事実を考慮すれば、天然に存在するアミノ酸による保存的置換は、容易に決定できる。

天然に存在しないアミノ酸による保存的置換を生成するために、当技術分野で周知のアミノ酸アナログ（合成アミノ酸）を用いることも可能である。天然に存在するアミノ酸のペプチドミメティクスは、熟練者に公知の文献中に十分に報告されている。

保存的置換の形をとる場合には、置換するアミノ酸は、元のアミノ酸と同じかまたは類似の、側鎖中の官能基を有するべきである。

本明細書中で用いる場合、「非保存的置換」との語句は、異なる電気化学的性質および/または立体的性質を有する、別の天然に存在するかまたは天然に存在しないアミノ酸による、親配列中に存在するアミノ酸の置き換えを意味する。つまり、置換するアミノ酸の側鎖は、置換される生来型アミノ酸の側鎖よりも著しく大きい（または小さい）ことができ、かつ/または置換されるアミノ酸とは著しく異なる電気的性質を有する官能基を有することができる。このタイプの非保存的置換の例としては、フェニルアラニンまたはシクロヘキシルメチルグリシン（cycohexylmethyl glycine）によるアラニンの置換、イソロイシンによるグリシンの置換、または-NH-CH[(-CH₂)₅-COOH]-CO-によるアスパラギン酸の置換が挙げられる。本発明の範囲に入るこれらの非保存的置換は、神経保護特性を有するペプチドを未だ構成するものである。

本発明の一部の実施形態のペプチドは、好ましくは直鎖状形態で用いられるが、環化（cyclicization）がペプチドの特性を深刻に干渉しない場合には、ペプチドの環状形態もまた用いることができることが明らかである。

本ペプチドは、好ましくは、ペプチドが可溶性形態であることを必要とする治療薬中で用いられるので、本発明の一部の実施形態のペプチドは、好ましくは、1種以上の非天然または天然極性アミノ酸を含み、そのようなものとしては、限定するものではないが、それらのヒドロキシル含有側鎖によりペプチド可溶性を増大させることができるセリンおよびトレオニンが挙げられる。

言及される通り、本発明のペプチドのN末端およびC末端は、官能基により保護することができる。好適な官能基は、Green and Wuts, "Protecting Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, Chapters 5 and 7, 1991（その教示は参照により本明細書中に組み入れられる）に記載されている。つまり、ポリペプチドは、そのN（アミン）末端および/またはC（カルボキシル）末端で修飾されて、エンドキャップ付加修飾型ペプチドを生じさせることができる。

本明細書中で用いる場合、本明細書中では相互に交換可能に用いられる「エンドキャップ付加修飾型ポリペプチド」および「保護型ポリペプチド」との語句は、そのN（アミン）末端および/またはC（カルボキシル）末端で修飾されているポリペプチドを意味する。エンドキャップ付加修飾とは、それによりキャップを形成するポリペプチドの末端への化学部分の連結を意味する。そのような化学部分は、エンドキャップ付加部分と本明細書中で称され、典型的には、本明細書中および当技術分野で、相互に交換可能に、ペプチド保護部分またはペプチド保護基とも称される。ヒドロキシル保護基としては、限定するものではないが、エステル、カーボネートおよびカルバメート保護基が挙げられる。アミン保護基としては、限定するものではないが、アルコキシおよびアリールオキシカルボニル基が挙げられる。カルボン酸保護基としては、限定するものではないが、脂肪族エステル、ベンジルエステルおよびアリールエステルが挙げられる。

本明細書中で用いる場合、「エンドキャップ付加部分」との語句は、ペプチドの末端に連結される場合に、該ペプチドのNおよび/またはC末端を修飾する部分を意味する。エンドキャップ付加修飾は、典型的には、ペプチド末端の電荷をマスクし、かつ/または疎水性、親水性、反応性、可溶性などのその化学的特徴を変化させる。エンドキャップ付加修飾の性質を選択することにより、ペプチドの疎水性/親水性、ならびに可溶性を細かく制御することができる。具体的な実施形態において、保護基は、それに連結されたペプチドの、細胞への輸送を促進する。これらの部分は、細胞内部で、加水分解により、または酵素的に、in vivoで切断することができる。

具体的な実施形態において、エンドキャップ付加修飾は、ポリペプチドの生物学的活性（すなわち、抗炎症活性）を損なわない。ペプチドエンドキャップ付加修飾に好適な部分の例は、例えば、Green et al., "Protective Groups in Organic Chemistry"（Wiley, 2nd ed. 1991）およびHarrison et al., "Compendium of Synthetic Organic Methods", Vols. 1-8（John Wiley and Sons, 1971-1996）に見出すことができる。

具体的な実施形態において、エンドキャップ付加は、N末端エンドキャップ付加を含む。

N末端エンドキャップ付加部分の代表例としては、限定するものではないが、ホルミル、アセチル（本明細書中で「Ac」とも表記される）、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（本明細書中で「Cbz」とも表記される）、tert-ブトキシカルボニル（本明細書中で「Boc」とも表記される）、トリメチルシリル（「TMS」とも表記される）、2-トリメチルシリル-エタンスルホニル（「SES」とも表記される）、トリチルおよび置換トリチル基、アリルオキシカルボニル、9-フルオレニルメチルカルボニル（本明細書中で「Fmoc」とも表記される）、およびニトロベラトリルオキシカルボニル（「NVOC」）が挙げられる。

具体的な実施形態において、N末端エンドキャップ付加はアセチルを含む。

具体的な実施形態において、エンドキャップ付加はC末端エンドキャップ付加を含む。

C末端エンドキャップ付加部分の代表例は、典型的には、C末端でのカルボキシ基のアシル化をもたらす部分であり、限定するものではないが、ベンジルおよびトリチルエステルならびにアルキルエスール、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテル、アリルエーテル、モノメトキシトリチルおよびジメトキシトリチルが挙げられる。あるいは、C末端エンドキャップ付加の-COOH基は、アミド基へと修飾されることができる。

具体的な実施形態において、C末端エンドキャップ付加は、アミドを含む。

ペプチドの他のエンドキャップ付加修飾としては、ヒドロキシル、チオール、ハライド、アルキル、アリール、アルコキシ、アリールオキシなどの異なる部分を用いたアミンおよび/またはカルボキシルの置き換えが挙げられる。

具体的な実施形態において、ペプチドは、そのN末端またはC末端のみで修飾される。

他の具体的な実施形態において、ペプチドは、N末端およびC末端の両方で修飾される。

具体的な実施形態において、ペプチドは、アセチルを用いてN末端で修飾され、かつアミドを用いてC末端で修飾される。

具体的な実施形態において、エンドキャップ付加修飾型ポリペプチドは、配列番号4〜6からなる群より選択される。

本発明はさらに、本発明に係るペプチド、アナログおよび誘導体を含むポリペプチドコンジュゲートおよび融合ポリペプチドを提供する。

つまり、言及される通り、本発明の一態様において、C末端および/またはN末端連結されたアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドを含む単離された融合ポリペプチドが提供され、このとき、該C末端アミノ酸配列は、該単離された融合ポリペプチドとは不連続なCD44vRAアミノ酸配列であり；かつ、該融合ポリペプチドは、抗炎症活性を含む。

本明細書中で用いる場合、「不連続なCD44vRAアミノ酸配列」との語句は、配列番号11の座標306、308または308でそれぞれ始まるCD44vRAのアミノ酸配列に対して、そのC末端で直接連結されている配列番号1、2または3のアミノ酸配列を含まない融合ポリペプチドを意味する。

具体的な実施形態において、単離されたポリペプチドおよび連結されたアミノ酸配列は、直接的に、あるいはスペーサーまたは合成的リンカーもしくはアミノ酸リンカーであり得るリンカーを介して共有的に連結されている。

本明細書中で用いる場合、「CD44」との用語は、多数の哺乳動物細胞タイプで発現され、かつCD44遺伝子によりコードされる細胞表面タンパク質を意味する。具体的な実施形態において、CD44は、ヒトCD44遺伝子である。CD44と表わされ、エキソン1〜5および16〜20を含む標準的アイソフォームは、大部分の細胞タイプで発現され、かつGeneBank登録番号NM_000610およびNP_000601（配列番号8および9）に示される。

本明細書中で用いる場合、「CD44vRA」（配列番号10および11）との用語は、炎症部位で、例えば、RA患者の滑液細胞上で発現されるが、健康な個体のPBL上では発現されないCD44変異体を意味する。CD44vRA変異体は、炎症部位（例えば、RA患者の関節）の細胞中に存在する公知のCD44遺伝子の一次転写産物のオルタナティブ・スプライシングにより恐らくは生成され、かつ公知のCD44遺伝子の切断または突然変異からは生じない、天然に存在する配列である。このCD44vRA変異体配列は、CD44の定常部分のエキソン1〜5、15〜17および19、ならびに該遺伝子の可変領域のエキソン7〜14（v3〜v10）を含む。変異体コード配列は、エキソンv4とエキソンv5との橋渡しをするイントロンの端部から転写され、かつエキソンv5の5’末端に挿入される3個の追加の塩基（CAG）を含む。この追加のCAG配列は、リーディングフレームは無傷なままで、配列番号11の303位にアミノ酸アラニンに対する新規コドンの挿入をもたらす。

「CD44」および「CD44vRA」との用語は、所望の活性（例えば、細胞移動および/または細胞-細胞相互作用および細胞-マトリックス相互作用）を示すCD44およびCD44vRAホモログも意味する。そのようなホモログは、配列番号9および11のポリペプチドに対して、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％もしくは100％同一または相同であるか、あるいはそれをコードするポリヌクレオチド配列に対して、80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％同一であり得る。

ホモログはまた、活性を保持する限り、オルソログ、欠失変異体、挿入変異体、またはアミノ酸置換をはじめとする置換変異体も意味する場合がある。

配列同一性または相同性は、Blast、ClustalW、およびMUSCLEなどのいずれかのタンパク質または核酸配列アライメントアルゴリズムを用いて決定することができる。

本発明の他の具体的な実施形態において、ペプチドは非タンパク質性部分に連結される。

具体的な実施形態において、単離されたポリペプチドおよび連結された非タンパク質性部分は、直接的にまたはスペーサーもしくはリンカーを介して、共有的に連結される。

本明細書中で用いる場合、「非タンパク質性部分」との語句は、上記のペプチドに連結されているペプチド結合アミノ酸を含まない分子を意味する。具体的な実施形態において、非タンパク質性部分は非毒性部分である。本教示に従って用いることができる例示的な非タンパク質性部分としては、限定するものではないが、薬物、化学物質、小分子、ポリヌクレオチド、検出可能部分、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニルピロリドン（PVP）、ポリ（スチレン/無水マレイン酸共重合体）（poly(styrene comaleic anhydride)）（SMA）、およびジビニルエーテル/無水マレイン酸共重合体（DIVEMA）が挙げられる。本発明の具体的な実施形態において、非タンパク質性部分は、ポリエチレングリコール（PEG）を含む。

そのような分子は非常に安定であり（恐らくは非タンパク質性部分により賦与される立体障害により、in vivoタンパク質分解活性に対して抵抗性である）、かつ下記でさらに説明される通り、高価でなく非常に効率的である通常の固相合成法を用いて生成できる。しかしながら、組み換えペプチド生成物がin vitro修飾（例えば、下記でさらに説明される通りのPEG化）に供される、組み換え技術もまた用いることができることが理解されるであろう。

PEGとのポリペプチドアミノ酸配列のバイオコンジュゲーション（すなわち、PEG化）は、PEGカルボン酸のN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステル、モノメトキシPEG₂-NHS、カルボキシメチル化PEGのスクインイミジルエステル（SCM-PEG）、PEGのベンゾトリアゾールカーボネート誘導体、PEGのグリシジルエーテル、PEG p-ニトロフェニルカーボネート（PEG-NPC、メトキシPEG-NPCなど）、PEGアルデヒド、PEG-オルトピリジル-ジスルフィド、カルボニルジミダゾール活性化PEG（carbonyldimidazol-activated PEG）、PEG-チオール、PEG-マレイミドなどのPEG誘導体を用いて実行できる。そのようなPEG誘導体は、種々の分子量で市販されている［例えば、カタログPolyethylene Glycol and Derivatives, 2000（Shearwater Polymers, Inc., Huntsvlle, Ala.）を参照されたい］。所望であれば、上記誘導体のうちの多数は、単官能モノメトキシPEG（mPEG）形態で入手可能である。一般的に、本発明のポリペプチドに付加されるPEGは、数百ダルトンから約100kDa（例えば、3〜30kDa）の分子量（MW）の範囲であるべきである。より大きなMWのPEGを用いることができるが、PEG化ポリペプチドの収量の幾分かの損失を生じ得る。比較的低いMWのPEGに対して得られるものほど高い純度の比較的大きなMWのPEGを得るのは困難である場合があるので、より大きなPEG分子の純度もまた監視するべきである。少なくとも85％純度のPEGを用いるのが好ましく、少なくとも90％純度、95％純度、またはそれ以上がより好ましい。分子のPEG化は、例えば、Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press San Diego, Calif. (1996)のChapter 15およびZalipsky et al., "Succinimidyl Carbonates of Polyethylene Glycol"（Dunn and Ottenbrite, eds., Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, American Chemical Society, Washington, D.C. (1991)）にさらに議論されている。

簡便には、PEGは、コンジュゲートの活性が保持される限り、部位特異的突然変異誘発によりポリペプチド中の選択された位置に連結することができる。PEG化の標的は、ペプチド配列のN末端またはC末端のいずれかのシステイン残基であり得るであろう。さらに、またはあるいは、他のシステイン残基を、ポリペプチドアミノ酸配列に（例えば、N末端またはC末端に）加えて、PEG化の標的として機能させることができる。活性を損なわない突然変異のための好ましい位置を選択するために、コンピュータ解析を実行することができる。

PEG-マレイミド、PEG-ビニルスルホン（VS）、PEG-アクリレート（AC）、PEG-オルトピリジルジスルフィドなどの活性化型PEGの種々のコンジュゲーション化学を用いることができる。活性化型PEG分子の調製方法は、当技術分野で公知である。例えば、PEG-VSは、PEG-OHのジクロロメタン（DCM）溶液をNaHと反応させて、次にジビニルスルホンと反応させる（モル比：OH 1：NaH 5：ビニルスルホン50、0.2グラムPEG/mL DCM）ことにより、アルゴン下で調製できる。PEG-ACは、PEG-OHのDCM溶液を塩化アクリロイルおよびトリエチルアミンと反応させる（モル比：OH 1：塩化アクリロイル1.5：トリエチルアミン2、0.2グラムPEG/mL DCM）ことにより、アルゴン下で作製される。そのような化学基は、直線状、2腕、4腕、または8腕PEG分子に連結することができる。

結果として生じるコンジュゲート化型分子（例えば、PEG化型またはPVPコンジュゲート化型ポリペプチド）を分離し、精製し、かつ、例えば、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）ならびに生物学的アッセイを用いて定性分析する。

具体的な実施形態において、配列番号1〜3からなると列記されるもの以外の本発明のポリペプチドのCD44vRAペプチド部分は、5〜100、5〜50、または5〜40、または5〜20、5〜15、5〜10、5〜9、5〜7アミノ酸長である。

具体的な実施形態において、本発明のポリペプチドのペプチド部分は、配列番号1〜3からなると列記されるもの以外のCD44vRAアミノ酸配列を含まない。

本発明のペプチドおよび組成物は、浸透化剤（penetrating agent）に連結（共有的または非共有的）することができる。

本明細書中で用いる場合、「浸透化剤」との語句は、細胞膜を通過する連結型ペプチドまたは組成物のうちのいずれかの転位を増強する薬剤を意味する。

一実施形態において、浸透化剤はペプチドであり、ペプチド結合を介して（直接的にまたは間接的に）ポリペプチドに連結される。

典型的には、ペプチド浸透化剤は、リジンもしくはアルギニンなどの正に荷電したアミノ酸を比較的豊富に含むアミノ酸組成を有するか、または極性/荷電アミノ酸と非極性疎水性アミノ酸との交互のパターンを含む配列を有する。

具体的な実施形態において、ポリペプチドは、下記でさらに説明される通りのポリペプチドの細胞内送達を増強する、細胞浸透に好適な製剤中に提供される。

非限定的な例として、細胞浸透性ペプチド（CPP）配列は、細胞内浸透を増強させるために用いることができるが；しかしながら、本開示はそれに限定されず、かつ当業者に公知である通り、いずれの好適な浸透化剤も用いることができる。

細胞浸透性ペプチド（CPP）は、ほとんどすべての細胞の内部へのアクセスを獲得する能力を有する短いペプチド（≦40アミノ酸）である。CPPは非常にカチオン性が高く、通常は、アルギニンおよびリジンアミノ酸に富む。CPPは、タンパク質、オリゴヌクレオチドなど、および200nmリポソームでさえある、広範な共有的および非共有的にコンジュゲート化された積み荷を細胞中へと運搬する並外れた特性を有する。したがって、追加の例示的実施形態において、CPPは、ポリペプチドまたは組成物を細胞の内部へと輸送するために用いることができる。

TAT（HIV-1由来の転写活性化因子）、pAntp（ペネトラチン（penetratin）とも名付けられている、ショウジョウバエ（Drosophila）アンテナペディアホメオドメイン転写因子）およびVP22（単純ヘルペスウイルス由来）が、非毒性かつ効率的な様式で細胞に進入することができ、かつ本発明の一部の実施形態と共に用いるために好適であり得るCPPの例である。CPP-積み荷（カーゴ）コンジュゲートを生成するためのプロトコールおよびそのようなコンジュゲートを細胞に感染させるためのプロトコールは、例えば、L Theodore et al.［The Journal of Neuroscience, (1995) 15(11): 7158-7167］、Fawell S, et al.［Proc Natl Acad Sci USA, (1994) 91:664-668］、およびJing Bian et al.［Circulation Research (2007) 100: 1626-1633］に見出すことができる。

本発明の一部の実施形態のポリペプチドは、固相技術および組み換え技術をはじめとする、ペプチド合成の技術分野の当業者に公知のいずれかの技術により合成することができる。

本明細書中に記載されるタンパク質性ポリペプチドのうちのいずれかは、ポリヌクレオチドによりコードされることができる。これらのポリヌクレオチドは、それ自体を治療薬として用いることができるか、または薬剤の組み換え製造で用いることができる。

つまり、本発明の一態様において、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。

つまり、本発明の一態様において、単離されたポリヌクレオチドを含む核酸構築物が提供される。

そのような核酸構築物またはシステムは、核酸配列の発現を指示するための少なくとも1種類のcis作用性調節エレメントを含む。cis作用性調節配列としては、ヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、ならびに一定条件下でのみヌクレオチド配列の誘導可能発現を指示するものが挙げられる。つまり、例えば、構成的または誘導可能な様式での細胞中でのポリヌクレオチド配列の転写を指示するためのプロモーター配列が、核酸構築物に含まれる。

本発明の単離されたポリペプチドおよび組成物は、抗炎症活性を有する。

本明細書中で用いる場合、「抗炎症活性」との語句は、急性および/もしくは慢性炎症応答の予防および/または低減、ならびに/あるいは炎症関連疾患を予防および/または治療することを意味する。抗炎症活性を定性分析するためのアッセイとしては、限定するものではないが、炎症状態（例えば、RA）に対するin vitroモデルおよびin vivoモデルの両方を用いる、以下の実施例節に記載されるものが挙げられる。非限定的な例としては、下記でさらに説明される通りの、CIAマウスモデルでのin vivo足腫脹（例えば、Nedvetzki, et al., (2004) PNAS 101, 18081-18086を参照されたい）、CIAマウスから取得される関節切片の組織学的検査およびRA患者の滑液から取得される線維芽細胞のin vitro細胞生存率が挙げられる。

具体的な実施形態において、抗炎症活性は、ワクチン接種または粘膜耐性に依存しない。

具体的な実施形態において、組成物の単離されたポリペプチドは、Weiss et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 285-290；および以下の実施例節の実施例5に開示されるものなどの遅延型過敏症アッセイ（DTH）により評価し得る通り、全般的な免疫応答には影響を及ぼさない。

具体的な実施形態において、単離されたポリペプチドまたは組成物は、血清アミロイドA、トランスサイレチンおよびアポリポタンパク質Bからなる群より選択されるタンパク質に結合することができる。

本明細書中で用いる場合、「血清アミロイドA」または「SAA」との用語は、SAA1、SAA2およびSAA4遺伝子のポリヌクレオチドおよび発現生成物（例えば、ポリペプチド）を意味する。SAA1はまた、血清アミロイドAl、MGCl 11216、PIG4、SAA、および腫瘍タンパク質p53誘導性タンパク質4（TP53I4）としても知られる。具体的な実施形態において、SAA1とは、以下のGeneBank番号：NM_199161およびNM_000331ならびにUniprot番号：P0DJI8（配列番号12〜14）に提供されるものなどのヒトSAA1を意味する。具体的な実施形態において、SAA1とは、以下のGeneBank番号：NM 009117（配列番号15）に提供されるものなどのマウスSAA1を意味する。SAA2は、血清アミロイドA2およびSAAとしても知られる。具体的な実施形態において、SAA2とは、以下のGeneBank番号：NM_001127380およびNM_030754ならびにUniprot番号P0DJI8（配列番号16〜18）に提供されるものなどのヒトSAA2を意味する。具体的な実施形態において、SAA2とは、以下のGeneBank番号：NM_011314（配列番号19）に提供されるものなどのマウスSAA2を意味する。具体的な実施形態において、SAA4とは、以下のGeneBank番号：NM_006512およびUniprot番号P35542（配列番号20〜21）に提供されるものなどのヒトSAA4を意味する。

具体的な実施形態において、「SAA」との用語は、タンパク質の血清アミロイドA急性期ファミリーに属するSAA1遺伝子およびSAA2遺伝子を意味する。

本明細書中で用いる場合、「トランスサイレチン」との用語は、甲状腺ホルモンであるチロキシンおよびレチノールのタンパク質キャリアであるTTR遺伝子のポリヌクレオチドおよび発現生成物（例えば、ポリペプチド）を意味する。具体的な実施形態において、トランスサイレチンとは、以下のGeneBank番号：NP_000362およびNM_000371（配列番号22〜23）に提供されるものなどのヒトトランスサイレチンを意味する。他の具体的な実施形態において、トランスサイレチンとは、以下のGeneBank番号：NP_038725およびNM_013697（配列番号24〜25）に提供されるものなどのマウストランスサイレチンを意味する。

本明細書中で用いる場合、「アポリポタンパク質B」との用語は、APOB遺伝子のポリヌクレオチドおよび発現生成物（例えば、ポリペプチド）を意味する。具体的な実施形態において、アポリポタンパク質Bとは、以下のGeneBank番号：NP_000375およびNM_000384（配列番号26〜27）に提供されるものなどのヒトアポリポタンパク質Bを意味する。他の具体的な実施形態において、アポリポタンパク質Bとは、以下のGeneBank番号：NP_033823およびNM_009693（配列番号28〜29）に提供されるものなどのマウスアポリポタンパク質Bを意味する。

抗炎症活性によって、本発明のポリペプチドおよび組成物は、その発症または進行に関してCD44vRA（活性または発現）に依存する疾患を治療するために、例えば、関節リウマチ（RA）などの炎症性疾患の治療のために用いることができる。

つまり、本発明の一態様において、それを必要とする被験体での炎症性疾患を治療する方法が提供され、該方法は、治療上有効量の単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物を被験体に投与し、それにより被験体での炎症性疾患を治療することを含む。

本発明の別の態様において、炎症性疾患の治療用の医薬の製造のための、単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物の使用が提供される。

本明細書中で用いる場合、「治療すること」との用語は、病理（疾患、障害、または状態、例えば炎症、例えばRA）の発症を阻害すること、予防することもしくは停止させること、および/または病理の低減、寛解、または退行を引き起こすことを意味する。当業者は、様々な方法論およびアッセイを、病理の発症を評価するために用いることができること、および、同様に、様々な方法論およびアッセイを、病理の低減、寛解または退行を評価するために用いることができることを理解するであろう。

具体的な実施形態において、「治療すること」との用語は、RAおよび関連疾患に伴う症状を改善すること、疾患の重症度を軽減することもしくは回復させること、または疾患の発症を予防すること、疾患に伴う症状の発現を、それが生じる前に予防すること、疾患の進行またはそれに伴う症状の悪化を遅らせること、寛解期間の開始を助長すること、疾患の進行性慢性期に生じる不可逆的なダメージを遅らせること、当該進行期の開始を遅らせること、生存率もしくはさらに迅速な回復を改善すること、または上記のうちの2種以上の組み合わせを意味する。

本明細書中で用いる場合、「それを必要とする被験体」との語句は、炎症性疾患を有すると診断されるか、または炎症性疾患を発症するリスクがある哺乳動物雄性または雌性被験体（例えば、ヒト）を意味する。獣医学的使用もまた予期される。被験体は、新生児、幼児、小児、青年、成体および高齢者を含むいずれの年代でもあり得る。

被験体での炎症を判定する方法は当技術分野で周知であり、限定するものではないが、被験体由来血液サンプル中で、赤血球沈降速度（ESR）；血漿粘度；C反応性タンパク質（CRP）レベル；IL6およびTNFαなどの特定の炎症性サイトカインのレベルを測定すること；ならびにフィブリノゲン測定およびヘマトクリットまたはヘモグロビンを用いるなどして、炎症インデックスを決定することが挙げられる。

具体的な実施形態において、炎症性疾患は、CD44vRAを発現する細胞を含む。細胞上でのCD44vRAの発現を評価できるアッセイの非限定的な例としては、フローサイトメトリーおよび免疫細胞化学が挙げられる。

炎症性疾患（本明細書中で炎症または炎症状態とも称される）の例としては、限定するものではないが、慢性炎症性疾患および急性炎症性疾患が挙げられる。

免疫性疾患の例としては、限定するものではないが、過敏症に関連する炎症性疾患、自己免疫疾患、感染性疾患、移植片拒絶疾患、アレルギー性疾患および癌性疾患が挙げられる。

過敏症に関連する炎症性疾患
過敏症の例としては、限定するものではないが、I型過敏症、II型過敏症、III型過敏症、IV型過敏症、即時過敏症、抗体媒介過敏症、免疫複合体媒介過敏症、Tリンパ球媒介過敏症およびDTHが挙げられる。

I型過敏症または即時過敏症、例えば、喘息など。

II型過敏症としては、限定するものではないが、リウマチ様疾患、リウマチ様自己免疫疾患、関節リウマチ（Krenn V. et al., Histol Histopathol 2000 Jul; 15(3): 791）、乾癬性関節炎（PA）、脊椎炎、強直性脊椎炎（Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001;3(3):189）、全身性疾患、全身性自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス（Erikson J. et al., Immunol Res 1998;17(1-2):49）、硬化症、全身性硬化症（Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab Immunol.1999 Mar;6(2):156；Chan OT. et al., Immunol Rev 1999 Jun; 169: 107）、腺疾患、腺の自己免疫疾患、膵臓の自己免疫疾患、糖尿病、I型糖尿病（Zimmet P.Diabetes Res Clin Pract 1996 Oct;34 Suppl:S125）、甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス病（Orgiazzi J.Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun;29(2):339）、甲状腺炎、自発性自己免疫性甲状腺炎（Braley-Mullen H. and Yu S., J Immunol 2000 Dec 15;165(12):7262）、橋本甲状腺炎（Toyoda N. et al., Nippon Rinsho 1999 Aug;57(8):1810）、粘液水腫、特発性粘液水腫（Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999 Aug; 57(8): 1759）、自己免疫性生殖疾患、卵巣疾患、卵巣の自己免疫性（Garza KM. et al., J Reprod Immunol 1998 Feb;37(2):87）、自己免疫性抗精子不妊症（Diekman AB. et al., Am J Reprod Immunol.2000 Mar;43(3):134）、繰り返す流産（Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9）、神経変性疾患、神経学的疾患、神経学的自己免疫疾患、多発性硬化症（Cross AH. et al., J Neuroimmunol 2001 Jan 1;112(1-2):1）、アルツハイマー病（Oron L. et al., J Neural Transm Suppl.1997;49:77）、重症筋無力症（Infante AJ. and Kraig E., Int Rev Immunol 1999;18(1-2):83）、運動神経障害（Kornberg AJ.J Clin Neurosci.2000 May;7(3):191）、ギラン・バレー症候群、神経障害および自己免疫性神経障害（Kusunoki S. Am J Med Sci.2000 Apr;319(4):234）、筋無力性疾患、ランバード・イートン筋無力症候群（Takamori M.Am J Med Sci.2000 Apr;319(4):204）、腫瘍随伴性神経学的疾患、小脳萎縮症、腫瘍随伴性小脳萎縮症、腫瘍非随伴性スティッフマン症候群、小脳萎縮症、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シドナム舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群、多発性内分泌腺症、自己免疫性多発性内分泌腺症（Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol(Paris)2000 Jan;156(1):23）；神経障害、異常免疫性神経障害（Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999;50:419）；ニューロミオトニー、後天性ニューロミオトニー、先天性多発性関節拘縮症（Vincent A. et al., Ann N Y Acad Sci.1998 May 13;841:482）、心血管疾患、心臓血管の自己免疫疾患、アテローム動脈硬化（Matsuura E. et al., Lupus. 1998;7 Suppl 2:S135）、心筋梗塞（Vaarala O. Lupus. 1998;7 Suppl 2:S132）、血栓症（Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9）、肉芽腫症、ウェーゲナー肉芽腫症、動脈炎、高安動脈炎および川崎症候群（Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25;112(15-16):660）；抗第VIII因子自己免疫疾患（Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost.2000;26(2):157）；血管炎、壊死性小血管血管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、糸球体腎炎、少免疫性巣状壊死性糸球体腎炎、半月体形成性糸球体腎炎（Noel LH.Ann Med Interne(Paris) 2000 May;151(3):178）；抗リン脂質症候群（Flamholz R. et al., J Clin Apheresis、1999;14(4):171）；心不全、心不全におけるアゴニスト様β-アドレナリン作動性受容体抗体（Wallukat G. et al., Am J Cardiol. 1999 Jun 17;83(12A):75H）、血小板減少性紫斑病（Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 Apr-Jun;14(2):114）；溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血（Efremov DG. et al., Leuk Lymphoma 1998 Jan;28(3-4):285）、胃腸疾患、胃腸管の自己免疫疾患、腸疾患、慢性炎症性腸疾患（Garcia Herola A. et al., Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan;23(1):16）、セリアック病（Landau YE. and Shoenfeld Y.Harefuah 2000 Jan 16;138(2):122）、筋組織の自己免疫疾患、筋炎、自己免疫性筋炎、シェーグレン症候群（Feist E. et al., Int Arch Allergy Immunol 2000 Sep;123(1):92）；平滑筋の自己免疫疾患（Zauli D. et al., Biomed Pharmacother 1999 Jun;53(5-6):234）、肝疾患、肝臓の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎（Manns MP.J Hepatol 2000 Aug;33(2):326）および原発性胆汁性肝硬変（Strassburg CP. et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 Jun;11(6):595）が挙げられる。

IV型過敏症またはT細胞媒介過敏症としては、限定するものではないが、リウマチ様疾患、関節リウマチ（Tisch R., McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci USA 1994 Jan 18;91(2):437）、全身性疾患、全身性自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス（Datta SK., Lupus 1998;7(9):591）、腺疾患、腺の自己免疫疾患、膵臓疾患、膵臓の自己免疫疾患、I型糖尿病（Castano L. and Eisenbarth GS. Ann.Rev.Immunol.8:647）；甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス病（Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol 1993 Mar;92(1):77）；卵巣疾患（Garza KM. et al., J Reprod Immunol 1998 Feb;37(2):87）、前立腺炎、自己免疫性前立腺炎（Alexander RB. et al., Urology 1997 Dec;50(6):893）、多腺性症候群、自己免疫性多腺性症候群、I型自己免疫性多腺性症候群（Hara T. et al., Blood、1991 Mar 1;77(5):1127）、神経学的疾患、自己免疫性神経学的疾患、多発性硬化症、神経炎、視神経炎（Soderstrom M. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry, 1994 May;57(5):544）、重症筋無力症（Oshima M. et al., Eur J Immunol 1990 Dec;20(12):2563）、スティッフマン症候群（Hiemstra HS. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2001 Mar 27;98(7):3988）、心血管疾患、シャガス病での心臓の自己免疫性（Cunha-Neto E. et al., J Clin Invest 1996 Oct 15;98(8):1709）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（Semple JW. et al., Blood 1996 May 15;87(10):4245）、抗ヘルパーTリンパ球自己免疫性（Caporossi AP. et al., Viral Immunol 1998;11(1):9）、溶血性貧血（Sallah S. et al., Ann Hematol、1997 Mar;74(3):139）、肝疾患、肝臓の自己免疫疾患、肝炎、慢性活動性肝炎（Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar;54(3):382）、胆汁性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（Jones DE. Clin Sci(Colch)1996 Nov;91(5):551）、腎疾患、腎臓の自己免疫疾患、腎炎、間質性腎炎（Kelly CJ. J Am Soc Nephrol 1990 Aug;1(2):140）、結合組織疾患、耳疾患、自己免疫性結合組織疾患、自己免疫性耳疾患（Yoo TJ. et al., Cell Immunol 1994 Aug;157(1):249）、内耳の疾患（Gloddek B. et al., Ann N Y Acad Sci 1997 Dec 29;830:266）、皮膚疾患、皮膚病、真皮の疾患、水疱性皮膚疾患、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡および落葉状天疱瘡が挙げられる。いくつかの同じ疾患が、それらの疾患の不均一性によって異なる過敏症のクラスに分類され得ることに留意されたい。

遅延型過敏症の例としては、限定するものではないが、接触性皮膚炎および薬疹が挙げられる。

Tリンパ球媒介過敏症型の例としては、限定するものではないが、ヘルパーTリンパ球および細胞障害性Tリンパ球が挙げられる。

ヘルパーTリンパ球媒介過敏症の例としては、限定するものではないが、T_h1リンパ球媒介過敏症およびT_h2リンパ球媒介過敏症が挙げられる。

自己免疫疾患
自己免疫疾患としては、限定するものではないが、心血管疾患、リウマチ様疾患、腺疾患、胃腸疾患、皮膚疾患、肝疾患、神経学的疾患、筋疾患、腎疾患、生殖関連疾患、結合組織疾患および全身性疾患が挙げられる。
自己免疫性心血管疾患の例としては、限定するものではないが、アテローム動脈硬化（Matsuura E. et al., Lupus. 1998;7 Suppl 2:S135）、心筋梗塞（Vaarala O. Lupus. 1998;7 Suppl 2:S132）、血栓症（Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9）、ウェーゲナー肉芽腫症、高安動脈炎および川崎症候群（Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25;112(15-16):660）、抗第VIII因子自己免疫疾患（Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost.2000;26(2):157）、壊死性小血管血管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、少免疫性巣状壊死性糸球体腎炎および半月体形成性糸球体腎炎（Noel LH. Ann Med Interne(Paris) 2000 May;151(3):178）、抗リン脂質症候群（Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999;14(4):171）、抗体誘導性心不全（Wallukat G. et al., Am J Cardiol. 1999 Jun 17;83(12A):75H）、血小板減少性紫斑病（Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 Apr-Jun;14(2):114；Semple JW. et al., Blood 1996 May 15;87(10):4245）、自己免疫性溶血性貧血（Efremov DG. et al., Leuk Lymphoma 1998 Jan;28(3-4):285；Sallah S. et al., Ann Hematol 1997 Mar;74(3):139）、シャガス病での心臓の自己免疫性（Cunha-Neto E. et al., J Clin Invest 1996 Oct 15;98(8):1709）、および抗ヘルパーTリンパ球自己免疫性（Caporossi AP. et al., Viral Immunol. 1998;11(1):9）が挙げられる。

自己免疫性リウマチ様疾患の例としては、限定するものではないが、関節リウマチ（Krenn V. et al., Histol Histopathol 2000 Jul;15(3):791；Tisch R., McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci units S A 1994 Jan 18;91(2):437）および強直性脊椎炎（Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001;3(3):189）が挙げられる。

自己免疫性腺疾患の例としては、限定するものではないが、膵臓疾患、I型糖尿病、甲状腺疾患、グレーヴス病、甲状腺炎、突発性自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、特発性粘液水腫、卵巣の自己免疫性、自己免疫性抗精子不妊症、自己免疫性前立腺炎およびI型自己免疫性多腺性症候群が挙げられる。自己免疫疾患としては、限定するものではないが、膵臓の自己免疫疾患、I型糖尿病（Castano L. and Eisenbarth GS. Ann.Rev.Immunol. 8:647；Zimmet P.Diabetes Res Clin Pract 1996 Oct;34 Suppl:S125）、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス病（Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun;29(2):339；Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol 1993 Mar;92(1):77）、突発性自己免疫性甲状腺炎（Braley-Mullen H. and Yu S., J Immunol 2000 Dec 15;165(12):7262）、橋本甲状腺炎（Toyoda N. et al., Nippon Rinsho 1999 Aug;57(8):1810）、特発性粘液水腫（Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999 Aug;57(8):1759）、卵巣の自己免疫性（Garza KM. et al., J Reprod Immunol 1998 Feb;37(2):87）、自己免疫性抗精子不妊症（Diekman AB. et al., Am J Reprod Immunol. 2000 Mar;43(3):134）、自己免疫性前立腺炎（Alexander RB. et al., Urology 1997 Dec;50(6):893）およびI型自己免疫性多腺性症候群（Hara T. et al., Blood. 1991 Mar 1;77(5):1127）が挙げられる。

自己免疫性胃腸疾患の例としては、限定するものではないが、慢性炎症性腸疾患（Garcia Herola A. et al., Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan;23(1):16）、セリアック病（Landau YE. and Shoenfeld Y. Harefuah 2000 Jan 16;138(2):122）、大腸炎、回腸炎およびクローン病が挙げられる。

自己免疫性皮膚疾患の例としては、限定するものではないが、自己免疫による水疱性の皮膚疾患（例えば、限定するものではないが、尋常性天疱瘡、水疱性天疱瘡および落葉状天疱瘡など）が挙げられる。

自己免疫性肝疾患の例としては、限定するものではないが、肝炎、自己免疫性慢性活動性肝炎（Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar;54(3):382）、原発性胆汁性肝硬変（Jones DE. Clin Sci(Colch) 1996 Nov;91(5):551；Strassburg CP. et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 Jun;11(6):595）および自己免疫性肝炎（Manns MP. J Hepatol 2000 Aug;33(2):326）が挙げられる。

自己免疫性神経学的疾患の例としては、限定するものではないが、多発性硬化症（Cross AH. et al., J Neuroimmunol 2001 Jan 1;112(1-2):1）、アルツハイマー病（Oron L. et al., J Neural Transm Suppl. 1997;49:77）、重症筋無力症（Infante AJ. and Kraig E., Int Rev Immunol 1999;18(1-2):83；Oshima M. et al., Eur J Immunol (1990);20(12):2563）、神経障害、運動神経障害（Kornberg AJ. J Clin Neurosci.(2000);7(3):191）;ギラン・バレー症候群および自己免疫性神経障害（Kusunoki S. Am J Med Sci.(2000);319(4):234）、筋無力症、ランバード・イートン筋無力症候群（Takamori M. Am J Med Sci.(2000);319(4):204）;腫瘍随伴性神経学的疾患、小脳萎縮症、腫瘍随伴性小脳萎縮症およびスティッフマン症候群（Hiemstra HS. et al., Proc Natl Acad Sci units S A (2001);98(7):3988）;腫瘍非随伴性スティッフマン症候群、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シドナム舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群および自己免疫性多発性内分泌腺症（Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol(Paris)2000 Jan;156(1):23）;異常免疫性神経障害（Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999;50:419）;後天性ニューロミオトニー、先天性多発性関節拘縮症（Vincent A. et al., Ann N Y Acad Sci. 1998 May 13;841:482）、神経炎、視神経炎（Soderstrom M. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 May;57(5):544）および神経変性疾患が挙げられる。

自己免疫性筋疾患の例としては、限定するものではないが、筋炎、自己免疫性筋炎および原発性シェーグレン症候群（Feist E. et al., Int Arch Allergy Immunol 2000 Sep;123(1):92）、および平滑筋の自己免疫疾患（Zauli D. et al., Biomed Pharmacother 1999 Jun;53(5-6):234）が挙げられる。

自己免疫性腎疾患の例としては、限定するものではないが、腎炎および自己免疫性間質性腎炎（Kelly CJ. J Am Soc Nephrol 1990 Aug;1(2):140）が挙げられる。

生殖に関連する自己免疫疾患の例としては、限定するものではないが、繰り返す流産（Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9）が挙げられる。

自己免疫性結合組織疾患の例としては、限定するものではないが、耳の疾患、自己免疫性耳疾患（Yoo TJ. et al., Cell Immunol 1994 Aug;157(1):249）、および内耳の自己免疫疾患（Gloddek B. et al., Ann N Y Acad Sci 1997 Dec 29;830:266）が挙げられる。

自己免疫性全身性疾患の例としては、限定するものではないが、全身性エリテマトーデス（Erikson J. et al., Immunol Res 1998;17(1-2):49）および全身性硬化症（Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab Immunol. 1999 Mar;6(2):156；Chan OT. et al., Immunol Rev 1999 Jun;169:107）が挙げられる。

感染性疾患
感染性疾患の例としては、限定するものではないが、慢性感染性疾患、亜急性感染性疾患、急性感染性疾患、ウイルス性疾患、細菌性疾患、原虫性疾患、寄生虫性疾患、真菌性疾患、マイコプラズマ疾患およびプリオン疾患が挙げられる。

移植片拒絶疾患
移植片の移植に関連する疾患の例としては、限定するものではないが、移植片拒絶、慢性移植片拒絶、亜急性移植片拒絶、超急性移植片拒絶、急性移植片拒絶および移植片対宿主病が挙げられる。

アレルギー性疾患
アレルギー性疾患の例としては、限定するものではないが、喘息、皮疹、じんま疹、花粉アレルギー、ほこり・ダニアレルギー、毒液アレルギー、化粧品アレルギー、ラテックスアレルギー、化学物質アレルギー、薬物アレルギー、昆虫咬傷アレルギー、動物鱗屑アレルギー、刺毛植物アレルギー、ツタウルシアレルギーおよび食物アレルギーが挙げられる。

癌性疾患
癌の例としては、限定するものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が挙げられる。癌性疾患の具体的な例としては、限定するものではないが、骨髄性白血病、例えば、慢性骨髄性白血病、成熟を伴う急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、増大した好塩基球を伴う急性非リンパ球性白血病、急性単球性白血球、好酸球増加症を伴う急性骨髄単球性白血病など；悪性リンパ腫、例えば、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫など；リンパ性白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病など；骨髄増殖性疾患、例えば、固形腫瘍、良性髄膜腫、唾液腺の混合腫瘍、慢性腺腫など；腺癌、例えば、小細胞肺癌、腎臓癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、結腸癌、肉腫、脂肪肉腫、粘液様肉腫、滑膜肉腫、横紋筋肉腫（肺胞）、骨外性粘液様軟骨肉腫、ユーイング腫瘍などが挙げられ、他の癌としては、精巣および卵巣の未分化胚細胞腫、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、悪性メラノーマ、中皮腫、乳癌、皮膚癌、前立腺癌および卵巣癌が挙げられる。

具体的な実施形態において、炎症性疾患は、関節リウマチ（RA）、乾癬性関節炎、アルツハイマー病、癌および心血管疾患からなる群より選択される。

他の具体的な実施形態において、炎症性疾患はRAを含む。

本明細書中で用いる場合、「関節リウマチ（RA）」との語句は、主に関節を侵す自己免疫疾患を意味する。RAとしては、限定するものではないが、成人性RA、若年性特発性関節炎（juvenile iodopathic arthritis）、若年性RAおよび若年性慢性関節炎が挙げられる。RAは、関節リウマチの分類に関する米国リウマチ協会（American Rheumatoid Association）基準、またはいずれかの類似の基準に従って診断することができ、活動性早期RA（少なくとも8週間であるが4年以下にわたって診断されている活動性RA）および初期（抗CCPおよび共有エピトープなどのRA特異的予後バイオマーカーの存在を伴って、RAの診断のための基準を完全には満たさない多発性関節炎）RAを含む。

本発明の単離されたポリペプチドおよび組成物を用いる治療中の改善を示すためにモニタリングすることができるRA臨床的パラメータ症状の例は、以下の通りである：
・少なくとも1時間にわたり、かつ少なくとも6週間存在する朝のこわばり；
・少なくとも6週間の3箇所以上の関節の腫脹；
・少なくとも6週間の手首関節、中手指節関節、または近位指節間関節の腫脹；
・対称的な関節腫脹；
・浸食または明白な骨脱灰を含む手のx線変化；
・リウマチ性皮下結節；および
・リウマチ因子。

RA改善を評価するためにヒトで用いることができる追加のパラメータは、米国リウマチ学会議（American College of Rheumatology；ACR）に従うことができ、例えば、特定のRA症状の低下による疾患活動性改善の割合（％）（20、50または70％）を表わすACR改善基準：ACR20、ACR50およびACR70を含む。つまり、例えば、ACR20とは、圧痛がありかつ腫脹した関節の数の20％改善および残りの5種類のACRコアセット尺度のうちの3種類での20％改善を達成する患者を意味する。

本発明者らは、単離されたポリペプチドの3種類の潜在的な標的タンパク質を発見し、これらのタンパク質のうちの1種類（すなわち、SAA）の付加がポリペプチドのin vitro活性を妨げ得ることも示している（以下の実施例節中の実施例7および9、ならびに図15を参照されたい）ので、本発明は、本発明の単離されたポリペプチドまたは組成物と血清アミロイドA（SAA）、トランスサイレチン（thranthyretin）および/またはアポリポタンパク質B阻害剤とを含む併用治療の使用を考慮する。

つまり、本発明の別の態様において、それを必要とする被験体での炎症性疾患を治療する方法が提供され、該方法は：
(a) 本発明の一部の実施形態の治療上有効量の単離されたポリペプチドまたは組成物を被験体に投与すること；および
(b) 血清アミロイドA（SAA）、トランスサイレチン（thranthyretin）およびアポリポタンパク質Bからなる群より選択されるタンパク質の治療上有効量の阻害剤を該被験体に投与すること
を含み、それにより被験体での炎症性疾患を治療する。

別の態様において、炎症性疾患の治療用の医薬の製造のための、本発明の一部の実施形態の単離されたポリペプチドまたは組成物と、血清アミロイドA（SAA）、トランスサイレチン（thranthyretin）およびアポリポタンパク質Bからなる群より選択されるタンパク質の阻害剤との使用が提供される。

本発明の別の態様において、本発明の一部の実施形態の単離されたポリペプチドまたは組成物、ならびにSAA、トランスサイレチン（thranthyretin）およびアポリポタンパク質Bからなる群より選択されるタンパク質に対する阻害剤を包装する包装材料を含む、炎症性疾患の治療での使用に関して特定されている製品またはキットが提供される。

本発明の別の態様において、それを必要とする被験体での炎症性疾患を治療する方法が提供され、該方法は：
(a) 配列番号1〜3からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む治療上有効量の単離されたポリペプチドを被験体に投与することであって、該ポリペプチドが、抗炎症活性を含む；および
(b) 血清アミロイドA（SAA）、トランスサイレチン（thranthyretin）およびアポリポタンパク質Bからなる群より選択されるタンパク質の治療上有効量の阻害剤を該被験体に投与すること
を含み、それにより被験体での炎症性疾患を治療する。

別の態様において、炎症性疾患の治療用の医薬の製造のための、配列番号1〜3からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、抗炎症活性を含む、上記ポリペプチド；ならびに血清アミロイドA（SAA）、トランスサイレチン（thranthyretin）およびアポリポタンパク質Bからなる群より選択されるタンパク質の阻害剤の使用が提供される。

本発明の別の態様において、配列番号1〜3からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、抗炎症活性を含む、上記ポリペプチド；ならびにSAA、トランスサイレチン（thranthyretin）およびアポリポタンパク質Bからなる群より選択されるタンパク質に対する阻害剤を包装する包装材料を含む、炎症性疾患の治療での使用に関して特定されている製品またはキットが提供される。

本明細書中で用いる場合、「阻害剤」との用語は、ゲノムレベル（例えば、相同組み換えおよび部位特異的エンドヌクレアーゼ）および/または転写および/もしくは翻訳を妨げる様々な分子（例えば、RNAサイレンシング剤、例えば、siRNA、shRNA、マイクロRNA）を用いて転写産物レベルで、かつ/またはタンパク質レベル（例えば、アプタマー、小分子および阻害ペプチド、アンタゴニスト、ポリペプチドを切断する酵素、抗体など）で、タンパク質（例えば、SAA、トランスサイレチン（thranthyretin）およびアポリポタンパク質B）の発現および/または活性をダウンレギュレーションする薬剤を意味する。

非限定的な例としては、SAAを阻害する抗体（抗血清アルブミンAなど）、SAA mRNAを標的とするRNA干渉（例えば、国際公開第2006071691号を参照されたい）、アポリポタンパク質Bを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（限定するものではないが、ミポメルセン（Mipomersen）（ISIS-301012、KYNAMRO^TM））、アポリポタンパク質B合成阻害剤としてのトリアゾロン（例えば、米国特許第6197972号を参照されたい）およびアポリポタンパク質B分泌阻害剤（例えば、欧州特許出願公開第1099438号を参照されたい）が挙げられる。

具体的な実施形態において、ステップ(a)がステップ(b)の前に行なわれる。

別の具体的な実施形態において、ステップ(a)がステップ(b)の後に行なわれる。

また別の具体的な実施形態において、ステップ(a)がステップ(b)と同時に行なわれる。

本発明の方法に従う複数ラウンドの投与ならびに単離されたポリペプチドまたは組成物および阻害剤の複数用量を投与することができる。具体的な実施形態において、ステップ(a)が複数回行なわれる。つまり、具体的な実施形態において、阻害剤の投与が、単離されたポリペプチドまたは組成物の少なくとも1回の投与後に行なわれる。具体的な実施形態において、ステップ(B) が複数回行なわれる。つまり、具体的な実施形態において、本発明の単離されたポリペプチドまたは組成物を投与するステップが、阻害剤の少なくとも1回の投与後に行なわれる。具体的な実施形態において、本発明の単離されたポリペプチドまたは組成物を投与するステップが、阻害剤の投与に対して順次行なわれる。

単離されたポリペプチドまたは組成物および阻害剤は、同じ容器中または別個の容器中に包装することができ；それぞれの可能性が、本発明の別個の実施形態を表わす。

具体的な実施形態において、単離されたポリペプチドまたは組成物および阻害剤は、別個の製剤中にある。

他の具体的な実施形態において、単離されたポリペプチドまたは組成物および阻害剤は、共製剤（co-formulation）中にある。

本発明の単離されたポリペプチド、組成物および阻害剤は、それ自体が被験体に提供されるか、またはそれが製薬上許容される担体と共に混合されている医薬組成物の一部分として提供されることができる。

つまり、本発明の一態様において、活性薬剤としての単離されたポリペプチドまたは組成物と、製薬上許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物が提供される。

本明細書中で用いる場合、「医薬組成物」とは、生理学的に好適な担体および賦形剤などの他の化学的成分を含む、本明細書中に記載される1種以上の活性成分の調製物を意味する。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を促進することである。

本明細書中では、「活性成分」との用語は、生物学的作用を担うポリペプチドまたはポリペプチドを含む組成物を意味する。

本明細書中、以下では、相互に交換可能に用いることができる「生理学的に許容される担体」および「製薬上許容される担体」との語句は、生物に対して顕著な刺激を引き起こさず、かつ投与された化合物の生物学的活性および特性を取り消さない担体または希釈剤を意味する。アジュバントが、これらの語句に含められる。

本明細書中、「賦形剤」との用語は、活性成分の投与をさらに促進するために医薬組成物に加えられる不活性物質を意味する。限定的でない賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖および種々のタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。

薬物の製剤化および投与のための技術は、“Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PAの最新版（参照により本明細書中に組み入れられる）に見出すことができる。

好適な投与経路は、例えば、経口送達、局所送達、皮内送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達、または非経口送達（筋内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに髄腔内注射、直接脳室内注射、心内注射（例えば、右心室または左心室内へ、総冠動脈（common coronary artery）内へ）、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が挙げられる。

具体的な実施形態において、投与経路は経口投与である。

他の具体的な実施形態において、投与経路は、皮膚へのものである。皮膚への活性薬剤の投与方法は当技術分野で公知であり、例えば、皮内注入、皮膚の外表面に適用される活性薬剤を含むゲル、液体スプレーおよびパッチが挙げられる。

本発明の一部の実施形態において、被験体の皮膚への活性薬剤の投与は、局所的に（皮膚上に）行なわれる。

本発明の一部の実施形態において、被験体の皮膚への活性薬剤の投与は、非侵襲的に、例えば、被験体の皮膚上に適用される活性成分を含むゲル、液体スプレーまたはパッチ（例えば、リザーバ型パッチおよびマトリックス型パッチ）を用いて行なわれる。

皮膚への活性薬剤の送達を増加させるために、活性薬剤を、表皮または真皮層への送達を増加させるために設計された種々のビヒクルと共に製剤化することができることに留意すべきである。そのようなビヒクルとしては、限定するものではないが、リポソーム、デンドリマー、ノイソーム（noisome）、トランスファーソーム（transfersome）、マイクロエマルジョンおよび固体脂質ナノ粒子が挙げられる。

本発明の一部の実施形態において、投与は皮内注入により行なわれる。

中枢神経系（CNS）への薬物送達のための慣用のアプローチとしては、以下のものが挙げられる：神経外科的戦略（例えば、大脳内注射または脳室内点滴）；BBBの内在性輸送経路のうちの1つを利用するための試みでの、薬剤の分子的操作（例えば、それ自体はBBBを通過できない薬剤との組み合わせでの、内皮細胞表面分子に対する親和性を有する輸送ペプチドを含むキメラ融合タンパク質の作製）；薬剤の脂溶性を高めるために設計された薬理学的戦略（例えば、脂質またはコレステロール担体への水溶性薬剤のコンジュゲート化）；および高浸透圧破壊によるBBBの完全性の一時的破壊（頸動脈へのマンニトール溶液の点滴またはアンジオテンシンペプチドなどの生物学的に活性な薬剤の使用によりもたらされる）。しかしながら、これらの戦略のそれぞれが、侵襲的な外科的手順に伴う固有のリスク、内在性輸送システムに固有の制限により課せられるサイズ制限、CNSの外側で活性であり得るキャリアモチーフにより構成されるキメラ分子の全身投与に伴う潜在的な望ましくない生物学的副作用、およびBBBが破壊される脳の領域内での脳ダメージの考えられるリスクなどの制限を有し、これがそれぞれの戦略を最適でない送達方法にしている。

代わりに、全身的ではなく局所的に、例えば、関節への局所注入などの患者の組織領域への直接的な医薬組成物の注入を介して、医薬組成物を投与することができる。関節に活性薬剤を投与する方法は当技術分野で公知であり、皮下注射針が関節に挿入され、それにより関節内関節（intra-articular joint）の関節内腔へと活性薬剤が送達される、関節内注射が挙げられる。

記載される通り、本発明のポリペプチドおよび組成物は、例えば、アルツハイマー病を治療するために用いることができる。中枢神経系（CNS）への薬物送達のための慣用のアプローチとしては、以下のものが挙げられる：神経外科学的戦略（例えば、海馬内（IH）注射、頭蓋内（IC）注射、大脳内注射、脳室内注射（ICV）もしくは点滴または髄腔内投与）；BBBの内在性輸送経路のうちの1つを利用するための試みでの、薬剤の分子的操作（例えば、それ自体はBBBを通過できない薬剤との組み合わせでの、内皮細胞表面分子に対する親和性を有する輸送ペプチドを含むキメラ融合タンパク質の作製）；薬剤の脂溶性を高めるために設計された薬理学的戦略（例えば、脂質またはコレステロール担体への水溶性薬剤のコンジュゲート化）；および高浸透圧破壊によるBBBの完全性の一時的破壊（頸動脈へのマンニトール溶液の点滴またはアンジオテンシンペプチドなどの生物学的に活性な薬剤の使用によりもたらされる）。しかしながら、これらの戦略のそれぞれが、侵襲的な外科的手順に伴う固有のリスク、内在性輸送システムに固有の制限により課せられるサイズ制限、CNSの外側で活性であり得るキャリアモチーフにより構成されるキメラ分子の全身投与に伴う潜在的な望ましくない生物学的副作用、およびBBBが破壊される脳の領域内での脳ダメージの考えられるリスクなどの制限を有し、これがそれぞれの戦略を最適でない送達方法にしている。

本発明の一部の実施形態の医薬組成物は、当技術分野で周知のプロセスにより、例えば、慣用の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、磨砕、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥プロセスにより、製造することができる。

本発明の一部の実施形態に従う使用のための医薬組成物は、したがって、製薬的に用いることができる調製物への活性成分の加工を容易にする賦形剤および助剤を含む1種以上の生理学的に許容される担体を用いて、慣用の様式で製剤化することができる。適切な製剤化は、選択される投与経路に依存する。

注入のためには、医薬組成物の活性成分は、水溶液中に、好ましくは、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理食塩緩衝液などの生理学的に適合する緩衝液中に製剤化することができる。経粘膜投与のためには、浸透対象となるバリアに適した浸透剤（penetrant）が、製剤中に用いられる。そのような浸透剤は、当技術分野で一般的に知られている。

経口投与のためには、医薬組成物は、活性化合物を当技術分野で周知の製薬上許容される担体と組み合わせることにより、容易に製剤化することができる。そのような担体は、医薬組成物が、患者による経口摂取のための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液剤などとして製剤化されることを可能にする。経口使用のための薬学的調製物は、固体賦形剤を用いて、得られた混合物を任意により粉砕し、所望であれば好適な助剤を加えた後で顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠コアを得ることで製造することができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールをはじめとする糖；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウム（sodium carbomethylcellulose）などのセルロース調製物；および/またはポリビニルピロリドン（PVP）などの生理学的に許容されるポリマーなどの充填剤である。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を添加することができる。

具体的な実施形態において、医薬組成物は、経口投与用に製剤化される。

糖衣錠コアは好適なコーティングと共に提供される。この目的のために、任意によりアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る、濃縮糖溶液を用いることができる。識別のために、または活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに染料または顔料を加えることができる。

経口的に用いることができる医薬組成物は、ゼラチン製の押し込み式（push-fit）カプセル剤、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤製の軟密封カプセル剤を含む。押し込み式カプセル剤は、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および任意により安定化剤と混合して活性成分を含有することができる。軟カプセル剤中では、活性成分は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィン、または液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁されることができる。さらに、安定化剤を加えることができる。経口投与用のすべての製剤は、選択された投与経路に対して好適な剤形でなければならない。

口内投与に関して、組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤またはトローチ剤の形態を取ることができる。

鼻吸入による投与に関して、本発明の一部の実施形態による使用のための活性成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定されることができる。ディスペンサーでの使用のための、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物および好適な粉末基剤（ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有して製剤化することができる。

本明細書中に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために製剤化することができる。注射用製剤は、任意により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器中の単位投与剤形で提示することができる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の懸濁液剤、溶液剤またはエマルジョン剤であることができ、懸濁化剤、安定化剤および/または分散化剤などの製剤化剤（formulatory agent）を含有することができる。

非経口投与用の医薬組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、活性成分の懸濁液は、適切な油性または水性の注射用懸濁液として調製されることができる。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。任意により、懸濁液はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、活性成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤も含有することができる。

あるいは、活性成分は、使用前に好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン不含水溶液）を用いて構成するための粉末形態であることができる。

本発明の一部の実施形態の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの慣用の座薬基剤を使用して、座剤または停留浣腸剤などの直腸用組成物に製剤化することもできる。

本発明の一部の実施形態の医薬組成物はまた、上昇した血清半減期を与えるための持続放出用に製剤化することもできる。そのような徐放系は、当業者に周知であり、例えば、マイクロカプセルおよびナノ粒子が挙げられる。具体的な実施形態において、タンパク質およびペプチドのためのProLease生分解性ミクロスフェア送達系（Tracy, 1998, Biotechnol. Prog. 14, 108；Johnson et al., 1996, Nature Med. 2, 795；Herbert et al., 1998, Pharmaceut. Res. 15, 357）が用いられ、これは、ポリマーマトリックス中にタンパク質を含有する生分解性ポリマー性ミクロスフェアから構成される乾燥粉末であって、他の薬剤を含むかまたは含まないで乾燥製剤として組み合わせることができる。

本発明の一部の実施形態との関連での使用のために好適な医薬組成物は、活性成分が、意図される目的を達成するために有効な量で含有される組成物を含む。より具体的には、治療上有効量とは、障害（例えば、RA）の症状を予防、軽減もしくは改善するか、または治療される被験体の生存を延長するのに有効な活性成分の量を意味する。

治療上有効量の決定は、特に本明細書中に与えられる詳細な開示に鑑みて、十分に当業者の能力の範囲内である。

本発明の方法で使用されるいかなる調製物についても、治療上有効量または用量は、in vitroおよび細胞培養アッセイから最初に推定することができる。例えば、用量は、所望の濃度または力価を達成するために動物モデルで策定することができる。そのような情報は、ヒトでの有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。

本明細書中に記載される活性成分の毒性および治療有効性は、in vitro、細胞培養物、または実験動物での標準的な薬学的手順によって決定することができる。これらのin vitroアッセイおよび細胞培養アッセイならびに動物研究から得られるデータは、ヒトでの使用のための投与量範囲を定めるために使用することができる。投与量は、用いられる投与剤形および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な処方、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択することができる（例えば、Finglet al., (1975) “The Pharmacological Basis of Therapeutics”,Ch.1 p.1を参照されたい）。

投薬量および投薬間隔を、活性成分のレベルが生物学的な効果を誘導または抑制するために十分である（最小有効濃度（MEC））ようにするために個々に調節することができる。MECはそれぞれの調製物について変化するが、in vitroデータから推定することができる。MECを達成するために必要な投与量は個々の特性および投与経路に依存するであろう。検出アッセイを使用して、血漿濃度を求めることができる。

マウス動物モデルに関して本明細書中に示される用量は、炎症性疾患を有すると診断されたヒトおよび他の動物などの他の生物種の治療に対して変換することができる。FDAにより承認された変換表が、Reagan-Shaw S., et al., FASEB J. 22:659-661 (2007)に示されている。

ヒト等価用量は、以下の通りに算出される：HED（mg/kg）＝動物用量（mg/kg）×（動物K_m/ヒトK_m）。

本発明の一部の実施形態において、単離されたポリペプチドまたは組成物は、その間のいずれの中間下位範囲および値も含む、マウスでの約2.5〜40mg/kg/日の範囲に相当する量で提供される。

具体的な実施形態において、単離されたポリペプチドまたは組成物は、マウスで約3.5 mg/kg/日に相当する量で提供される。

治療される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行われることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。

投与される組成物の量は、当然ながら、処置される被験体、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するであろう。

本発明の一部の実施形態の組成物は、所望であれば、活性成分を含有する1つ以上の単位投与剤形を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、FDA承認キットなど）で提示され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（ブリスターパックなど）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。適合し得る製薬用担体中に製剤化された本発明の調製物を含む組成物もまた、上記でさらに詳述された通り、示された症状を治療するために調製され、適切な容器に入れられ、かつラベル付けされ得る。

本発明の治療剤は、それぞれの薬剤自体を用いる治療と比較して改善された治療効果を達成するために、追加の活性薬剤と共に個体に提供できることが理解されるであろう。そのような療法では、対策（例えば、補助薬の投薬および選択）は、併用療法に伴い得る有害副作用に対して取られる。

そのような併用療法の投与は、これらの活性薬剤の固定された比率を有する単一カプセル剤として、または各薬剤に対する複数のカプセル剤としてなど、同時であり得る。

つまり、本発明の薬剤は、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）、疾患修飾性抗リウマチ薬（DMARDS）、コルチコステロイド、鎮痛剤、線維筋痛薬物療法、化学療法剤および当技術分野で周知の他の治療レジメンなどの、炎症性疾患を治療するための他の確立されているかまたは実験的な治療レジメンと共に、単独で投与することができる。

言及される通り、本発明者らは、本発明のペプチドおよび組成物の活性を試験するための新規in vitroアッセイを開発した。アッセイは、RAペプチドがRA患者の滑液から単離される線維芽細胞の生存率を低下させることができるとの理解に基づく。つまり、このアッセイは、抗炎症活性を定性分析するために、ならびに例えば、保存温度、ペプチドに対する修飾および製剤化などの環境条件への曝露後の本発明のペプチドおよび組成物の安定性を試験するために、本発明の製造されたペプチドおよび組成物のバッチ間変動を比較する目的で用いることができる。

つまり、本発明の一態様において、本発明の一部の実施形態の単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物のバッチの有効性を決定する方法が提供され、該方法は以下のステップを含む：
(a) 単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物のバッチを、関節リウマチ患者の炎症関節から取得される線維芽細胞に接触させるステップ；および
(b) 所定のインキュベーション時間後に該線維芽細胞の生存率を決定し、それによりバッチの有効性を決定するステップ。

具体的な実施形態において、方法は、修飾を有する単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物を合成するステップを含む。そのような修飾は、上記で提示された修飾のうちのいずれかであり得る。

具体的な実施形態において、方法はin vitroまたはex vivoで実行される。

本明細書中で用いる場合、「有効性」との用語は、該当する生物学的特性（すなわち、RA患者から取得される線維芽細胞の生存率の低下）に関連する生成物の属性に基づく、生成物（すなわち、単離されたポリペプチドまたは組成物）の生物学的活性の尺度を意味する。

本明細書中で用いる場合、「バッチ」との用語は、特定された制限内の固有の性質および品質を有することが意図され、かつ典型的には同じ製造サイクル中の単回の製造指示に従って製造される、特定量の薬物を意味する。つまり、本教示は、バッチ品質決定の一部分として、単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物の生物学的活性を評価するための製造手順のQAにて用いることができる。

具体的な実施形態において、「バッチ」との用語はまた、安定性特性決定および/またはペプチドおよび製剤修飾に曝露された薬物の量も意味する。

本明細書中で用いる場合、「線維芽細胞」との用語は、細胞外マトリックスおよびコラーゲンを合成する結合組織細胞を意味し、かつRA患者の滑液から取得される。該方法に従って用いられる線維芽細胞は、RA患者から直接的に単離された初代培養、またはATCCから入手できる市販の細胞株であるSW 982、PCS-201-010およびACS-1023などの、線維芽細胞から得られる細胞株であり得る。

被験体から滑液を取得するための方法は当技術分野で周知であり、限定するものではないが、関節生検および関節吸引などの生検が挙げられる。典型的には、組織または体液生検を得るための手順は、Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (dot) healthatoz (dot)com/healthatoz/Atoz/search.aspに詳細に記載されている。

具体的には、関節穿刺としても知られる関節吸引とは、針およびシリンジを用いた関節周囲腔からの体液の取り出しを意味する。これは通常、腫脹を軽減するかまたは関節の障害および/もしくは問題を診断するための分析用の体液を取得するために、局所麻酔下で行われる。関節吸引は通常、膝に対して行われるが；しかしながら、体液を、股関節、足首、肩、肘、または手首などの他の関節から取り出すこともできる。

関節生検とは、関節または滑膜生検を意味する。手順の中で、関節の内膜、または滑膜もしくは滑液のサンプルが採取される。簡潔には、手順は、外科医により医療機関で実行される。この生検を行なうためには、以下のものなどの多数のアプローチが利用可能である：関節の切開を介する；関節に挿入された内視鏡を用いる；または、より典型的には、皮膚を介した鋭利器具の挿入によるアプローチ。サンプルは、いずれの関節からでも採取でき、典型的には検査される関節は膝である。鋭利器具（トロカール）を関節腔に押し込む。シリンジが取り付けられた針を関節に挿入し、検査室分析のための体液を引き出す。針を抜く前に、外科医が関節へと針の刺入部に沿って鎮痛性化合物を注入することができる。トロカールおよび続いて生検針を挿入し、標本を採取する。標本を採取した後、トロカールおよび生検針の両方を取り除く。

用いる手順にかかわらず、生物学的サンプルが得られたら、線維芽細胞をさらに単離することができる。線維芽細胞集団の富化は、当技術分野で周知の方法により行なうことができ、例えばBendersky et al, J Immunol.;188:4349-59, 2012に開示されているもの、磁気細胞分離およびフローサイトメトリー細胞ソーティングが挙げられる。

つまり、例えば、線維芽細胞は、約48時間にわたってDMEM栄養添加培地中でプラスチックウェル中にて接着性滑液細胞を培養すること、およびそれに続くすべての非接着細胞の除去により単離することができる。線維芽細胞を含む接着細胞は、典型的には、線維芽細胞様の形態を示し、CD90を発現し、低レベルのCD49aインテグリンを発現し、マクロファージ表面マーカー（CD14）、T細胞表面マーカー（CD3）、およびB細胞表面マーカー（CD20）について陰性であり（例えば、フローサイトメトリーにより決定する場合）、シリウスレッド染色により決定されるI型コラーゲンに対して陽性に染色される。

線維芽細胞の初代培養は、具体的な実施形態において、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％またはそれ以上の線維芽細胞を含む。

線維芽細胞の調製に続いて、所定量の細胞を、細胞培養プレート（例えば、12、24、96、384穴プレート）中で、適切な増殖培地と共にインキュベートし、所定量の試験対象の単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物を用いて刺激する。培地の選択は、十分に当業者の能力の範囲内である。つまり、例えば、RPMIまたはDMEM（例えば、Sigma-Aldrich社またはBiological Industries, Beit Haemek, Israelから取得することができる）を増殖培地として用いることができる。培地には、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質/抗真菌剤溶液、2-メルカプトエタノールおよび血清を添加することができる。

細胞生存率に対する検出可能な効果をもたらすであろう、in vitro試験のためにインキュベートされる細胞の所定量の選択は、十分に当業者の能力の範囲内である。つまり、例えば、細胞濃度は、1×10⁴個/mL〜5×10⁶個/mL；1×10⁴個/mL〜1×10⁶個/mL；5×10⁴個/mL〜5×10⁶個/mL；1×10⁵個/mL〜5×10⁶個/mL；または1×10⁵個/mL〜1×10⁶個/mLであり得る。

具体的な実施形態において、細胞濃度は2×10⁵個/mLである。

細胞生存率に対する検出可能な効果をもたらすであろう、in vitro試験のために用いられるペプチドまたは組成物の選択は、十分に当業者の能力の範囲内である。好ましくは、用いる濃度は、選択された刺激パラメータの線形領域内であるべきである。つまり、例えば、濃度は、1μg/mL〜30μg/mL；1μg/mL〜20μg/mL；5μg/mL〜30μg/mL；または5μg/mL〜20μg/mLであり得る。

試験対象濃度の数は、少なくとも1種類、少なくとも2種類、少なくとも3種類、少なくとも5種類、少なくとも6種類、1〜10種類、2〜10種類、3〜10種類、5〜10種類、1〜5種類、2〜5種類および3〜5種類の異なる濃度であり得る。

試験対象濃度のそれぞれに対するサンプルの反復数は、2回、3回、4回、5回または6回反復であり得る。

所定のインキュベーション時間後、線維芽細胞の生存率を決定する。細胞生存をモニタリングする具体的な方法は当技術分野で公知であり、かつ、例えば、黄色の塩であるMTT（3-(4,5-ジメチルチアゾリル-2)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（例えば、Sigma Aldrich社から取得できる）を青紫色の不溶性ホルマザン沈殿物へと還元する生存細胞に選択的な能力に基づくMTT試験；TUNEL法（例えば、Roche社から取得できる）などのアポトーシスアッセイ；およびアネキシンVアッセイ［例えば、ApoAlert(登録商標)アネキシンVアポトーシスキット（Clontech Laboratories, Inc., CA, USA）］などが挙げられる。

インキュベーション時間は様々であり得、細胞生存率に対する検出可能な効果をもたらすであろうインキュベーション時間の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。具体的な実施形態において、インキュベーション時間は12時間〜96時間である。本発明の一部の実施形態において、インキュベーション時間は12時間〜72時間；12時間〜48時間；12時間〜24時間；24時間〜96時間、24時間〜72時間または24時間〜48時間である。本発明の具体的な実施形態において、インキュベーション時間は24時間〜48時間である。

具体的な実施形態において、前記接触ステップ後の線維芽細胞の生存率の低下は、バッチが有効であることを示す。

具体的な実施形態において、アッセイは、陽性および陰性対照サンプルをさらに含むことができる。アッセイのための陽性対照としては、非特異的な線維芽細胞の細胞死を誘導する薬剤、例えば、アスコルビン酸塩が挙げられる（例えば、Schmidt et al., J Biomed Mater Res. 1993 Apr; 27(4):521-30を参照されたい）。

アッセイのための陰性対照としては、SAA（例えば、PeproTech社から取得できる）などの、試験対象のポリペプチドまたは組成物の生物学的活性を妨げる薬剤が挙げられる。

具体的な実施形態において、方法は、細胞の生存率を、単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物の参照標準バッチと接触させた後の細胞の生存率と比較して、それによりバッチの相対的有効性を決定するステップを含む。

本明細書中で用いる場合、「相対的有効性」との用語は、既知の有効性を有する単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物の標準参照（RS）と比較した、単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物のバッチの有効性の定性的尺度を意味する。

具体的な実施形態において、単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物のバッチの有効性は、参照標準（RS）の既知の有効性と比較して決定される。

本明細書中で用いる場合、「参照標準」または「RS」との語句は、単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物に対する測定の基礎として用いられる、標準化された単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物を意味する。RSは、単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物の新規調製物を比較することができる較正済の生物学的効果のレベルを提供する。

具体的な実施形態において、RSは、疾患（例えば、RA）の治療で有効な活性成分の最適有効性および品質を特徴とする。

有効性および相対的有効性の算出は当技術分野で公知である。具体的な実施形態において、相対的有効性は、平行線検定ソフトウェア、例えば、PLA（Stegmann Systems GmbH）およびGen5データ解析ソフトウェア（BioTek社）などの生物学的アッセイに好適なソフトウェアを用いて算出される。

本発明の実施形態の方法および/またはシステムの実装は、手動、自動、またはその組み合わせで、選択されたタスクを実行または完了することを含むことができる。さらに、本発明の方法および/またはシステムの実施形態の実際の器具および設備によっては、数種類の選択されたタスクを、オペレーティングシステムを用いてハードウェア、ソフトウェアもしくはファームウェアまたはそれらの組み合わせにより実装することができる。

本明細書中で使用される用語「約」は、±10％を示す。

用語「含む」（comprises、comprising、includes、including）、「有する」（having）、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない」（including but not limited to）ことを意味する。

用語「からなる」（consisting of）は、「含み、かつそれらに限定される」（including and limited to）ことを意味する。

表現「から本質的になる」（consisting essentially of）は、追加の成分、ステップおよび/または部分が、特許請求される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にのみ、組成物、方法または構造が追加の成分、ステップおよび/または部分を含み得ることを意味する。

本明細書中で用いる場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈がそうでないことを明らかに指示しない限り、複数形の対象を含む。例えば、「化合物」（a compound）または「少なくとも1種の化合物」との用語は、それらの混合物をはじめとする複数の化合物を含み得る。

本出願を通して、本発明の種々の実施形態が、範囲形式で表わされ得る。範囲形式での記述が単に利便性および簡潔性のためのものであり、本発明の範囲の柔軟性のない制限として解釈されてはならないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記述は、すべての考えられる下位範囲ならびにその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、1〜6の範囲の記述は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの下位範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、1、2、3、4、5、および6を具体的に開示していると見なされるべきである。これは範囲の広さにかかわらず適用される。

本明細書中で数値範囲が示されるときはいつでも、示された範囲内のいずれの引用数値（分数または整数）も含むことを意味する。1番目に示される数と2番目に示される数との「間の範囲」および1番目に示される数字「から」2番目に示される数字「まで」の「範囲」との語句は、本明細書中で相互に交換可能に用いられ、かつ1番目と2番目の示された数字ならびにその間のすべての分数および整数を含むことを意味する。

本明細書中で使用する場合、「方法」（method）との用語は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を意味し、これには、限定するものではないが、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれる。

特定の配列表が参照される場合、そのような参照は、例えば、配列決定エラー、クローニングエラーまたは塩基置換、塩基欠失もしくは塩基付加を生じさせる他の変化により生じる、軽度の配列変動を含むなどの、その相補的配列に実質的に対応する配列も意図するものと理解されるべきであり、ただし、そのような変動の頻度は、50ヌクレオチド中に1箇所未満、あるいは、100ヌクレオチド中に1箇所未満、あるいは、200ヌクレオチド中に1箇所未満、あるいは、500ヌクレオチド中に1箇所未満、あるいは、1,000ヌクレオチド中に1箇所未満、あるいは、5,000ヌクレオチド中に1箇所未満、あるいは、10,000ヌクレオチド中に1箇所未満である。

明確にするために別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態で説明されている本発明の種々の特徴は、別個に、またはいずれかの適切な部分組み合わせで、あるいは本発明のいずれかの他の記載される実施形態で好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈で記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。

本明細書中上記に描かれるような、および、下記の特許請求の範囲の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様は、実験的裏付けが下記の実施例に見出される。

次に下記の実施例を参照するが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明の一部の実施形態を非限定に例示するものである。

一般的に、本明細書中で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子的、生化学、微生物学および組換えDNAの技術が含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の文献を参照されたい："Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989)；"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)；Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)；Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)；Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；米国特許第4,666,828号；同第4,683,202号；同第4,801,531号；同第5,192,659号および同第5,272,057号に説明される方法論；"Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)；"Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique"、Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition；"Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)；Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)；Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)；利用可能な免疫アッセイは、特許および科学文献に広範囲に記載されており、例えば、米国特許第3,791,932号；同第3,839,153号；同第3,850,752号；同第3,850,578号；同第3,853,987号；同第3,867,517号；同第3,879,262号；同第3,901,654号；同第3,935,074号；同第3,984,533号；同第3,996,345号；同第4,034,074号；同第4,098,876号；同第4,879,219号；同第5,011,771号および同第5,281,521号を参照されたい；"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984)；“Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)；"Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984)；"Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986)；"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984)および"Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press；"PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990)；Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)；これらの文献のすべてが、あたかも本明細書中に完全に記載されているように参照により組み入れられるものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通して提供される。それらの文献に記載の手順は当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は参照により本明細書中に組み入れられる。

実施例1
ペプチド合成および特性決定
材料および方法
5mer、7merおよび9merペプチドの合成：5mer、7merおよび9merペプチド［MTADV（配列番号1）、MTADVDR（配列番号2）およびTRMTADVDR（配列番号3）］、-3、アセチル化-Nおよびアミド化-C末端5mer、7merおよび9merペプチド［Ac-MTADV-NH₂（配列番号4）、Ac-MTADVDR-NH₂（配列番号5）およびAc-TRMTADVDR-NH₂（配列番号6）］ならびにスクランブル化7merペプチド［Ac-TMDVADR-NH₂（配列番号7）］は、固相合成fmoc化学を用いてSigma Israelにより合成された。95〜97％の純度に到達した。

液体クロマトグラフィー-質量分析（LCMS）：ペプチドの安定性、薬物動態（PK）および標的タンパク質をLCMSにより評価した。

質量分析のためのサンプル調製：タンパク質結合ビーズを、2.8mM DTTを用いて還元し（60℃、30分間）、8.8mMヨードアセトアミド（iodoacetamide）（室温、暗条件で30分間）を用いて8M尿素および400mM重炭酸アンモニウム中で変性させた。タンパク質を、改変型トリプシン（Promega社）を含む2M尿素、25mM重炭酸アンモニウム中で、1：50の酵素：基質比にて37℃で一晩、消化した。C18チップ（Harvard社）を用いて、トリプシンペプチドを脱塩し、乾燥させ、かつ0.1％ギ酸中に再懸濁した。質量分析測定：キャピラリーHPLC（Eksigent社）を取り付けたOrbitrapXL質量分析計（Thermo-Fisher社）を用いて、LC-MS/MSにより、得られたトリプシンペプチドを分析した。具体的には、ペプチドを、Reprosil C18-Aqua（Dr Maisch GmbH, Germany）を充填した自家製キャピラリーカラム（75 micron ID）にオンライン連結されたC18トラップカラム（0.35mm、LC-Packings社）にロードし、94分間の5〜40％アセトニトリル線形勾配、それに続く12分間の95％アセトニトリル（0.1％ギ酸の存在下、水中）を0.25μL/分の流速で用いて分解した。質量分析は、完全MSスキャン（解像度60000）およびそれに続く衝突誘起解離（collision induces dissociation：CID）を繰り返し用いるポジティブモードで行なった。最上位の7種類（＞1荷電ペプチド、350〜2000M/Z）を、各完全質量スペクトルからのフラグメント化のために選択した。

データ分析：質量分析は、Discovererソフトウェアバージョン1.4をヒトuniprotデータベースに対して、およびdecoyデータベースに対して（偽発見率（FDR）を決定するため）用いて、SequestおよびMascot検索エンジンを用いて分析した。高信頼度は、0.01 FDRを指す。

各ペプチドのピーク面積を算出することにより、半定量を行なった。タンパク質の面積は、各タンパク質からの3つの最も強度が高い（most intense）ペプチドの平均である。

結果
CD44vRA変異体の可変エキソン4と可変エキソン5との間のスプライシング連結部にアラニンを含めることにより、元のMTDV配列の代わりにMTADV配列の存在を生じさせることが、CD44vRAの病理活性を賦与することが示された（Nedvetzki et al., J Clin Invest 111:1211-1220,2003）。

本発明者らは、MTADV配列を含む5mer、7mer、および9merペプチド（本明細書中ではRAペプチドとも称される）を合成した。5mer RAペプチドは、相対的に疎水性のアミノ酸配列ならびに低分子量（700ダルトン未満）を含む。したがって、これは組織に容易に浸透することができ、結果として、局所投与および経口送達に用いることができる。

RAペプチドのタンパク質分解分析はタンパク質分解部位がないことを実証し（データ示さず）、このことは、ペプチドが少なくとも比較的に安定であることを示す。質量分析による定量分析は、生理食塩液中での4℃、室温または−20℃にて22週間の保存に際する5merペプチド（配列番号1）のほぼ同等な安定性を示した（図1）。−20℃での保存が100％の安定性を示すとすると、これらの結果は、5merペプチドが室温および4℃にて少なくとも22週間安定であることを実証する。

実施例2
5merおよび9mer RAペプチドは、コラーゲン誘導型関節炎（CIA）マウスモデルでの関節炎症を減少させることができる
材料および方法
マウス：コラーゲン誘導型関節炎（CIA）を、Nedvetzki et al., PNAS 101, 18081-18086, 2004に記載される通りに、II型コラーゲンの注入によりDBA/1マウスまたはC57BLマウスで生じさせた。

処置プロトコール：PBS、または9mer RAペプチド（配列番号3）を、注入当たり25μg、100μgまたは150μgの用量で、6日間以内に4回、CIAマウスにi.p.投与した（以下の表3を参照されたい）。PBS（n＝7）、または5mer RAペプチド（配列番号1、n＝7）を、注入当たり70μgの用量で、連続する10日間にわたってC57BL/6バックグラウンドのCIAマウスにi.p.投与した。すべての群で、1回目の注入は、足腫脹により決定される疾患の発症時に行なわれた。

関節炎症の評価：炎症は、足腫脹応答により評価した。足腫脹は、マイクロキャリパー（micro caliber）により測定した。2.1〜2.3mmの範囲の足腫脹を、「疾患の発症」およびペプチド注入のための開始時点と見なした。2.3mm超の足腫脹を示したマウスは実験から除外した。すべての測定を、盲検で行なった（さらなる詳細については、Nedvetzki, et al., (2004) PNAS 101, 18081-18086を参照されたい）。

組織学：11日目（処置の停止1日後）にマウスを屠殺し、後肢を分離し、4％パラホルムアルデヒドを用いて室温で一晩、固定した（さらなる詳細については、Nedvetzki et al. (2004) PNAS 101,18081-18086を参照されたい）。固定後、可動関節切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン（H＆E）を用いて染色し、盲検で組織学者により評価した。関節浸潤スコア：0＝浸潤なし；4＝重度の浸潤。

統計解析：各測定時点についての統計解析は、対応のない値についてのステューデントt検定により行なった。

結果
コラーゲン誘導型関節炎（CIA）マウスモデルは、ヒト関節リウマチ（RA）のマウスアナログである。CIAマウスモデルでの関節炎症に対する作製されたRAペプチドの効果を評価するために、様々な投与量の9mer RAペプチド（配列番号3）を、疾患の発症から開始してDBA/1バックグラウンドのCIAマウスに投与し、関節炎症を、足腫脹を測定することにより評価した。図2A〜2Bに示される通り、25μgおよび100μgの9mer RAペプチド（配列番号3）を投与されたマウスは、PBSを投与されたマウスと比較して足腫脹応答での有意な差異を示さず、このことは、顕著な治療効果がないことを暗示した。対照的に、150μgの9mer RAペプチド（配列番号3）を投与されたマウスは、足腫脹の有意な減少を示した（図2C）。

PBS対照を用いた処置後のC57BL/6バックグラウンドのCIAマウスから取得された後肢切片の組織学的評価により、関節包への単核炎症性細胞の重度の浸潤、甚大な滑液腔肥大（synovial hypertrophy）および反応性細胞が充満した関節腔の重度の狭窄が明らかになった。加えて、軟骨基質の破壊を伴う関節軟骨および軟骨下骨の重度の浸食が見られた。残った軟骨基質が、同様に重度に浸潤されていた。併せると、PBS処置マウスでの平均関節浸潤スコアは約4であった（図3Aおよび図3C）。

逆に、5mer RAペプチド（配列番号1）を用いた処置後のCIAマウスから取得された後肢切片の組織学的評価により、皆無または軽度の滑液腔肥大（synovial hypertrophy）を有する、皆無から軽度の関節包への単核炎症性細胞の浸潤が明らかになった。炎症性浸潤物は、サンプルのうちの少数で見られた。関節腔が保存され、反応性細胞はあるとしてもわずかであった。加えて、関節軟骨および軟骨下骨の浸食は見られず、かつ軟骨基質は概ね保存されていた。さらに、わずかなサンプルが、未罹患マウスと区別できなかった（データ示さず）。併せると、5mer RAペプチド処置マウスでの平均関節浸潤スコアは約1であった（図3Bおよび図3C）。

総合すると、対照PBS処置群の関節炎症スコアは、5mer RAペプチド（配列番号1）処置群よりも有意に高く（P＜0.0001）、このことは、ペプチドを用いた処置が、炎症関節の正常な組織学を強く回復させ得ることを示す。

併せると、5merおよび9mer RAペプチド（配列番号1および3）を用いた処置は、CIAマウスモデルでの関節炎症を阻害する。

理論に拘泥することなく、未知のCD44vRAリガンドとCD44vRAとの相互作用は、CD44vRA糖タンパク質のコンホメーション変化をもたらすことが示唆される。この新規エピトープは、v3エキソン生成物のヘパリン硫酸塩へのFGF-2の結合が同じ分子内に存在することを可能にする。結合されたFGF-2はFGF受容体1を発現する内皮細胞または線維芽細胞との相互作用へと向かい、それにより、その増殖および炎症活性の拡大がもたらされる（Nedvetzki et al., J Clin Invest 111:1211-1220, 2003）。RAペプチドは、Nedvetzkiら（J Clin Invest 111:1211-1220, 2003）により記載されるFGF-2誘導型炎症カスケードの遮断をもたらす未知のリガンドとの相互作用に関して細胞表面CD44と競合し得る。

実施例3
5mer、7merおよび9mer保護型RAペプチドは、CIAマウスモデルでの関節炎症を減少させることができる
材料および方法
マウス：上記の実施例2に記載された通りである。

処置プロトコール：PBS、または試験対象ペプチド［Ac-TRMTADVDR-NH₂（配列番号6）、Ac-MTADVDR-NH₂（配列番号5）、Ac-MTADV-NH₂（配列番号4）およびスクランブル化Ac-TMDVADR-NH₂（配列番号7）］を、注入当たり70μgまたは200μgの用量で、連続する9〜10日間にわたってDBAバックグラウンドのCIA/1マウスにi.p.投与した（以下の表4〜7を参照されたい）。非特異的対照として、数匹のマウスにデキサメタゾン（Dex）を50μgの用量で、同じプロトコールに従ってi.p.投与した。すべての群で、1回目の注入は、足腫脹により決定される疾患の発症時に行なわれた。

関節炎症の評価：上記の実施例2に記載された通りである。2mm未満の足腫脹は健康であると見なした。

統計解析：上記の実施例2に記載された通りである。

結果
次のステップでは、9mer、7merおよび5mer RAペプチドを、ペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端に保護残基、すなわち、アセチル残基およびアミド残基を含めて合成した［Ac-TRMTADVDR-NH₂（配列番号6）、Ac-MTADVDR-NH₂（配列番号5）およびAc-MTADV-NH₂（配列番号4）、本明細書中ではそれぞれ、9mer、7merおよび5mer RA保護型ペプチドと称される］。これらの保護残基は、実験マウスでのペプチドの天然段階を保存し、かつペプチドを安定化する。CIAの発症時のそれらの注入後にDBA/1マウスの関節炎症を減少させる保護型ペプチドの能力を評価した。すべての測定は、盲検で行なった。

図4および図5A〜5Bに見て取れる通り、注入当たり200μgの用量でのすべての保護型RAペプチドの注入が、PBSを用いて処置されたマウスと比較して、DBAバックグラウンドのCIAマウスでの関節炎症を有意に阻害した。これも図5Aから明らかである通り、デキサメタゾンの投与は同様に足蹠腫脹を減少させ、これは恐らく、このステロイドの非特異的抗炎症作用を生じさせることによる。5mer保護型ペプチド（配列番号4）はまた、注入当たり70μgの用量で投与された場合に、C57BL/6バックグラウンドのCIAマウスでの関節炎症も有意に阻害することができた（図6）。すべての測定は、盲検で行なった。

次のステップでは、関節炎症に対するスクランブル化RAペプチドの効果を評価した。この目的で、7mer保護型RAペプチド（Ac-MTADVDR-NH₂、配列番号5）の効果を、7merスクランブル化保護型ペプチド（Ac-TMDVADR-NH₂、配列番号7）の効果と比較した。図7A〜7Cに示される通り、スクランブル化非特異的7mer保護型ペプチドは足蹠腫脹に対して効果を有しなかった。すべての測定は、盲検で行なった。

図7A〜7Cに示される結果はまた、各群での健康な足の割合（％）を決定することによっても評価した。したがって、疾患の重症度を反映するCIA DBA/1マウスの後肢の評価（図8）により、7mer保護型RAペプチドを用いて処置されたCIAマウスで60％超の後肢が健康なままであったことが示された。比較すると、試験された他の群での健康なままの後肢の割合（％）は、PBS処置群で15％であり、かつ7merスクランブルペプチド群では33％であった。

併せると、5mer、7merおよび9mer RA保護型ペプチド（配列番号4〜6）はDBAおよびC57BL/6バックグラウンドの両方のCIAマウスに対する注入時に関節炎症を阻害し、その一方で、非特異的スクランブル化7mer保護型ペプチド（配列番号7）は関節炎症に対して効果を有しない。アセチル化およびアミド化はRAペプチドの活性に影響を与えず（データ示さず）；しかしながら、それらはRAペプチドの安定性および薬物動態を改善することが予測される。

実施例4
CIAマウスモデルでの関節炎症を減少させるために、70μg/注入が5mer保護型RAペプチドに対する最適な用量である
材料および方法
マウス：上記の実施例2に記載された通りである。

処置プロトコール：PBS、または試験対象ペプチド［Ac-MTADV-NH₂（配列番号4）］を、注入当たり10μg、25μg、70μg、200μgまたは600μgの用量で、連続する10日間にわたってCIAマウスにi.p.投与した（以下の表8〜9を参照されたい）。すべての群で、1回目の注入は、足腫脹により決定される疾患の発症時に行なわれた。

関節炎症の評価：上記の実施例2に記載された通りである。測定は、盲検で行なった。

統計解析：上記の実施例2に記載された通りである。

結果
5mer RAペプチドの最適な抗炎症治療用量を見積もるために、保護型ペプチド（配列番号4）の数種類の異なる用量をC57BL/6バックグラウンドのCIAマウスに投与し、足蹠腫脹測定（アルキメデス観察に基づく足蹠の体積の電子的自動測定）により、関節炎症を測定した。図9Aに見て取れる通り、PBS対照と比較した場合に、5mer保護型RAペプチド（配列番号4）の注入当たり70μg、200μgまたは600μgの注入は関節炎症を減少させるが；しかしながら、70μgのペプチドの用量が、統計学的に最も有意な抗炎症効果を生じた。加えて、図9Bに示される通り、5mer保護型RAペプチド（配列番号4）の注入当たり10μgおよび25μgの注入は、有意な抗炎症効果を引き起こさなかった。

併せると、データは、注入当たり70μgの用量が、5mer保護型RAペプチド（配列番号4）によるCIA阻害に関して最適かつ最小の用量であることを示す。

実施例5
5mer RAペプチドはCIAマウスモデルでのDTHを阻害しない
材料および方法
DTHモデル：C57BL/6マウスの腹部に、オキサゾロン溶液を塗布した（感作）。遅延型過敏（DTH）応答を生じさせるために、6日目に、それぞれのマウスの右耳に同じハプテンであるオキサゾロンを塗布した（誘発）。DTH発症を示す右耳と左耳との厚みの差異を、24時間後にマイクロキャリパーにより測定した。DTH誘導は、正常な免疫応答を示す。さらなる詳細については、Weiss et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 285-290を参照されたい。

処置プロトコール：PBSおよび5merペプチド（配列番号1）を、200μgの用量で、感作の1日前、およびその後に感作期間（7日間）の間、毎日投与した。抗TNF抗体（Herrring at al., (2002) Infect Immun 70, 2959-64）を、非特異的作用を実証するために、比較のために用いた。

統計解析：上記の実施例2に記載された通りである。

結果
全般的免疫応答に対するRAペプチドの影響を評価するために、遅延型過敏（DTH）応答に対する5mer RAペプチド（配列番号1）の効果を、C57BL/6マウスで作製したDTHモデルで評価した。DTHは、微生物に対する免疫応答を特徴付ける急性炎症を反映する。結果は、5mer RAペプチドの注入がDTH応答に影響せず、ペプチドを用いて処置されたマウスが、7日間のアッセイ期間を通して、PBSを用いて処置された対照マウスと同じDTH応答を見せたことを示す（図10）。比較すると、抗TNFα抗体を用いて処置されたマウスは阻害されたDTH応答を見せ、これは対照マウスと比較して有意であった。

実施例6
5merペプチドはCIAマウスモデルで中和抗体を生じない
材料および方法
マウス：上記の実施例2に記載された通りである。

処置プロトコール：PBS、または5mer RAペプチド（配列番号1）を、注入当たり70μgの用量で、連続する10日間にわたってC57BL/6バックグラウンドのCIAマウスにi.p.投与した。すべての群で、1回目の注入は、足腫脹により決定される疾患の発症時に行なわれた。

ELISA：96穴ELISAプレートを、5mer RAペプチド（配列番号1）、コラーゲンまたは免疫グロブリン（陽性対照）を用いてコーティングした。PBSまたは5mer RAペプチドを用いて処置されたCIAマウス由来の血清を、コーティングされたプレートに添加し、コラーゲンまたはRAペプチドに対する中和抗体の存在を、抗免疫グロブリン＋検出系を用いて検出した。プレートウェルを、1mg/mLペプチドまたはタンパク質を用いてコーティングした。マウス血清を、低温で15時間、プレートウェルに加えた。検出系は、HRP-抗マウスIgGおよびTMB（Bako社）基質を含んだ。450nmの波長でELISAリーダーを用いて、プレートを分析した。

統計解析：上記の実施例2に記載された通りである。

結果
RAペプチドを用いた処置が、ペプチド抗炎症作用を減少させるかまたは遮断さえする特異的中和抗体の生成を引き起こすか否かを決定するために、血清中の抗5merペプチド抗体の存在量を、ELISAアッセイを用いて決定した。図11に示される通り、5mer RAペプチド（配列番号1）に対する中和抗体は、ペプチドを用いた処置後のCIAマウスの血清中では検出されなかった。逆に、CIAマウスモデルがコラーゲン注入により作製されている場合、抗コラーゲン特異的抗体が、CIAマウスの血清中にはっきりと明らかになった。

実施例7
血清アミロイドA、トランスサイレチンおよびアポリポタンパク質Bが5merペプチドの潜在的標的タンパク質である
材料および方法
ペプチド標的タンパク質の分離：関節リウマチ（RA）患者の関節から滑液を取り出した。滑液を、PBSを用いて1：1に希釈し、1,200rpmで遠心分離した。細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含有する溶解バッファーに供した。細胞溶解液を、振盪しながら、4℃にて12時間、ビオチン化5merペプチド（Sigma社）またはPBSと共にインキュベートした。ストレプトアビジンセファロースビーズ（Sephdex社）を、振盪しながら、4℃にてさらなる1時間、ビオチン化5merペプチド処理細胞抽出物またはPBS処理細胞抽出物に添加した。ペプチド結合ビーズおよび対照ビーズを遠心分離により分離し、十分に洗浄し、質量分析へと進めた。図12を参照されたい。質量分析（MS）測定および分析は、ハイファ（Haifa）のイスラエル工科大学（Technion）にあるSmoler Proteomic Research Centerで行なった。

結果
5merペプチド（配列番号1）に結合したRA患者の滑液細胞から抽出された細胞溶解液由来のタンパク質の質量分析により、5mer RAペプチド（配列番号1）の潜在的標的タンパク質として、血清アミロイドA（SAA）、トランスサイレチンおよびアポリポタンパク質Bが特定された。示されたタンパク質は、RAの病理に関与することが知られているが、アルツハイマー病、癌疾患および心血管疾患の病理にも関与することが知られている。

実施例8
5mer RAペプチドの薬物動態
材料および方法
処置プロトコール：C57BL/6マウスを、200μg 5merペプチド（配列番号1）の単回i.p.注射に供した。注入の15分後、35分後および60分後に末梢血採血（500〜1000μL）により血液サンプルを採取し、血清を質量分析評価に送った。

質量分析：血中の5mer RAペプチドの濃度を、上記の通りの質量分析により決定した。

結果
単回i.p.注射後のマウス血液中の5mer RAペプチド排出の薬物動態（PK）を、図13に示す。

実施例9
RAペプチドの効果を評価するためのin vitroモデル
材料および方法
細胞：RA患者の炎症関節由来の線維芽細胞を、Bendersky et al, J Immunol.;188:4349-59, 2012に示される通りに培養および維持した。20,000個の細胞を、示された濃度のペプチド、血清アミロイドAまたはα-ラクトアルブミンと共に、96穴プレートのそれぞれに添加した。

MTTアッセイ：MTTアッセイは、Madhyastha et al. (2015) J Clin Diagn Res.;9:ZC05-8に示される通りに行なった。

統計解析：上記の実施例2に記載された通りである。

結果
作製されたRAペプチドの生物学的活性を評価するためのツールとして、in vitroモデルを開発した。この目的のために、RA患者の炎症関節由来の線維芽細胞をin vitroでインキュベートし、細胞生存率に対するペプチドの効果をMTTアッセイにより評価した。

図14に示される通り、5mer RAペプチド（配列番号1）の用量を増大させると、細胞生存が徐々に阻害される。5merペプチドと組み合わせた線維芽細胞培養物への50μg/mL血清アミロイドA（SAA）の添加は、この阻害を妨げる。結果はまた、ペプチドの2.5μg/mL（約5nM）の低用量が、このin vitroモデルでの細胞生存を著明に阻害することができること、およびin vitroでの最大抑制効果が60％であることを示す。

細胞生存率に対するペプチドの効果の特異性を実証するために、ペプチドを一定濃度（25μg/mL）で細胞培養物に添加し、SAAまたはラクトアルブミン（LA、似通った分子量を有する対照タンパク質）を漸増濃度（excalating concentration）で添加した。図15に示される通り、5merペプチドは線維芽細胞の生存率を低下させ、SAAの添加は用量応答性にこの低下を徐々に妨げた。対照的に、LAの添加はペプチドの抑制活性に対して影響を有さず；このことは、SAAは、特異的に5merペプチドの阻害効果を妨げることを示す。

次のステップでは、5mer保護型RAペプチド（配列番号4）の抑制効果を、5mer RAペプチド（配列番号1）と比較した。図16に示される通り、ペプチド修飾は、ペプチドの抑制効果を改善した。

本発明をその具体的な実施形態と組み合わせて説明してきたが、多数の代替物、改変および変更が当業者には明らかであろうことが明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲に入るすべてのそのような代替物、改変および変更を包含することが意図される。

本明細書で言及された刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許または特許出願が各々あたかも具体的かつ個別に参照により本明細書中に組み入れられることが示されているのと同程度に、その全体が参照により本明細書中に組み入れられる。さらに、本出願中でのいかなる引用文献の引用または特定も、そのような引用文献が本発明に対する先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。

Claims (29)

1. 配列番号1〜3からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド。
2. 配列番号1〜3からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたエンドキャップ付加修飾型ポリペプチドであって、該修飾型ポリペプチドは抗炎症活性を含む、単離されたエンドキャップ付加修飾型ポリペプチド。
3. エンドキャップ付加はN末端エンドキャップ付加を含む、請求項2に記載のエンドキャップ付加修飾型ポリペプチド。
4. N末端エンドキャップ付加はアセチルを含む、請求項3に記載のエンドキャップ付加修飾型ポリペプチド。
5. エンドキャップ付加はC末端エンドキャップ付加を含む、請求項2〜4のいずれか1項に記載のエンドキャップ付加修飾型ポリペプチド。
6. C末端エンドキャップ付加はアミドを含む、請求項5に記載のエンドキャップ付加修飾型ポリペプチド。
7. ポリペプチドが配列番号1〜3からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項2〜6のいずれか1項に記載のエンドキャップ付加修飾型ポリペプチド。
8. ポリペプチドが配列番号1に示される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド。
9. 配列番号4〜6からなる群より選択される、請求項2に記載のエンドキャップ付加修飾型ポリペプチド。
10. 請求項1〜9のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチドと、該単離されたポリペプチドに連結される非タンパク質性部分とを含む組成物であって、該単離された融合ポリペプチドは抗炎症活性を含む、組成物。
11. C末端および/またはN末端に連結されたアミノ酸配列を有する請求項1〜8のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチドを含む単離された融合ポリペプチドであって、該C末端アミノ酸配列は単離された融合ポリペプチドとは不連続なCD44vRAアミノ酸配列であり、該融合ポリペプチドは抗炎症活性を含む、単離された融合ポリペプチド。
12. 連結は共有結合である、請求項10に記載の組成物または請求項11に記載の単離されたポリペプチド。
13. 抗炎症活性はワクチン接種または粘膜耐性には依存しない、請求項2〜8および10〜12のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチドまたは組成物。
14. 血清アミロイドA、トランスサイレチンおよびアポリポタンパク質Bからなる群より選択されるタンパク質と結合することができる、請求項1〜13のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチドまたは組成物。
15. 活性薬剤としての請求項1〜14のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチドまたは組成物と、製薬上許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
16. それを必要とする被験体での炎症性疾患を治療する方法であって、治療上有効量の、請求項1〜15のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物を被験体に投与し、それにより被験体での炎症性疾患を治療することを含む方法。
17. 炎症性疾患の治療用の医薬の製造のための、請求項1〜15のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物の使用。
18. 投与が経口投与を含む、請求項16に記載の方法。
19. 組成物が経口投与用に製剤化される、請求項15に記載の医薬組成物。
20. 炎症性疾患がCD44vRAを発現する細胞を含む、請求項16および18のいずれか1項に記載の方法または請求項17に記載の使用。
21. 炎症性疾患が、関節リウマチ、乾癬性関節炎、アルツハイマー病、癌および心血管疾患からなる群より選択される、請求項16および18のいずれか1項に記載の方法または請求項17に記載の使用。
22. 炎症性疾患が関節リウマチである、請求項16および18のいずれか1項に記載の方法または請求項17に記載の使用。
23. 請求項1または11のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
24. 請求項23に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む核酸構築物。
25. 請求項1〜15のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物のバッチの有効性を決定する方法であって、以下のステップ；
    (a) 請求項1〜15のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物のバッチを、関節リウマチ患者の炎症関節から取得される線維芽細胞と接触させるステップ；および
    (b) 所定のインキュベーション時間後に、線維芽細胞の生存率を決定して、それによりバッチの有効性を決定するステップ
    を含む、方法。
26. 接触ステップ前に、修飾を含む単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物を合成するステップを含む、請求項25に記載の方法。
27. 接触ステップ後の線維芽細胞の生存率の低下は、バッチが有効であることを示す、請求項25または26に記載の方法。
28. 細胞の生存率を、単離されたポリペプチド、組成物または医薬組成物の参照標準バッチとの接触後の細胞の生存率と比較して、それによりバッチの相対的有効性を決定するステップを含む、請求項25〜27のいずれか1項に記載の方法。
29. in vitroまたはex vivoで実行される、請求項25〜28のいずれか1項に記載の方法。

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