JP2017516461A - 遺伝子サイレンシングにおいて低下したｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を有するｕｎａオリゴマー - Google Patents

遺伝子サイレンシングにおいて低下したｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を有するｕｎａオリゴマー Download PDF

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Abstract

本発明は、低下したoff-target効果を有する遺伝子サイレンシング用のＵＮＡオリゴマーを提供する。該ＵＮＡオリゴマーは第１鎖および第２鎖を有することができ、各々の鎖は１９〜２９モノマー長であり、該モノマーはＵＮＡモノマーおよび種々の核酸モノマーである。実施形態には、対象にＵＮＡオリゴマーを投与することによって、低下したoff-target効果で、ＴＴＲ−関連アミロイドーシスを治療または予防する医薬組成物および方法が含まれる。

Description

本発明は、遺伝子サイレンシングによって作動可能であるバイオ医薬品および治療剤の分野に関する。より詳細には、本発明は、遺伝子サイレンシングにおいて低下したoff-target効果を有する活性剤の構造、組成物および使用に関する。活性剤は、遺伝子サイレンシング、中でも、トランスサイレチン−関連アミロイドーシスを治療する方法、に使用することができるＵＮＡオリゴマーである。
ＲＮＡ干渉のような遺伝子サイレンシング技術の主要な欠点は、off-target効果の発生である。遺伝子−サイレンシング剤が標的にしていない遺伝子産物に効果を有する場合にoff-target効果が起こる。したがって、それは望ましくない。off-target効果は、遺伝子サイレンシング治療剤を開発するための主要な障害のうちの一つとして現れる。
off-target効果を減少させる一つの方法は、望ましい標的以外の遺伝子に対する効果を回避する遺伝子サイレンシング剤の構造を理知的にデザインすることである。遺伝子サイレンシング剤は、特定のoff-target効果を有する剤の濃度が減少するように、貯めることができる場合がある。また、遺伝子サイレンシング剤は、off-target効果を回避するように化学的に修飾できる場合もある。これらの通常の方法は、off-target効果を減少することができてきたが、それらを実行することは困難となり得る。
必要なのは、低下したoff-target効果を有する遺伝子サイレンシング剤である。
ＲＮＡ干渉を介して作動し、off-target効果を回避または低下する治療剤オリゴマーの方法および組成物に対して長年の要望が存在する。
本発明は、遺伝子サイレンシング用の活性剤、および疾患を治療または予防することにおいて該活性剤を使用する方法を提供する。
詳細には、活性剤は、遺伝子サイレンシングにおいて低下したoff-target効果を有するＵＮＡオリゴマーである。
本発明のＵＮＡオリゴマーは、以下に詳細に記載する、アンロックド・ヌクレオモノマー（unlocked nucleomonomer）活性剤（ＵＮＡ）である。
本発明のＵＮＡオリゴマーは、広範囲の遺伝子標的に対して、低下したoff-target効果での遺伝子サイレンシングに有効となり得る。
ある種の態様において、本発明は、ＡｐｏＣＩＩＩ発現を阻害するＵＮＡオリゴマーを提供する。
いくつかの態様において、本発明は、アミロイドーシス用の治療剤を提供する。より詳細には、本発明は、トランスサイレチンのノックダウンにおいて低下したoff-target効果を有するＵＮＡオリゴマーを用いて、トランスサイレチン−関連アミロイドーシスを治療する方法に関する。
ある種の態様において、本発明は、低下したoff-target効果でアミロイドーシスを治療することに用いることができる、ＴＴＲ発現およびＶ３０Ｍ ＴＴＲ発現を阻害するためのＵＮＡオリゴマーを提供する。ＵＮＡオリゴマーは、第１鎖および第２鎖を有することができ、それぞれの鎖は１９〜２９モノマー長であり、モノマーはＵＮＡモノマーおよび核酸モノマーである。実施形態には、ＵＮＡオリゴマーを対象に投与することによって、低下したoff-target効果でＴＴＲ−関連アミロイドーシスを治療または予防する医薬組成物および方法が含まれる。
ある種の態様において、本発明のＵＮＡオリゴマーは、植物における遺伝子サイレンシングに用いることができる。
本発明の実施形態には、以下のものが含まれる：
標的遺伝子の発現を阻害するＵＮＡオリゴマーであって、該オリゴマーは第１鎖および第２鎖を含み、それぞれの鎖は１９〜２９モノマー長であり、該モノマーはＵＮＡモノマーおよび核酸モノマーを含み、ここに該オリゴマーは１４〜２９モノマー長の二本鎖構造を有し、およびここに該オリゴマーは同一の標的を用いた場合にｓｉＲＮＡと比較して低下したoff-target効果を有する。
上記のＵＮＡオリゴマーであって、ここに第２鎖はＲＮＡ干渉のガイド鎖であり、第１鎖はＲＮＡ干渉のパッセンジャー鎖である。上記のＵＮＡオリゴマーであって、ここにＵＮＡオリゴマーは、第１鎖の１端の第１のポジションのＵＮＡモノマー、第１鎖の３端から最後の２つのポジションのうちの一方または両方のＵＮＡモノマー、および第２鎖の３端から最後の２つのポジションのうちの一方または両方のＵＮＡモノマーを有する。
上記のＵＮＡオリゴマーであって、ここにＵＮＡオリゴマーは、第１鎖の１端の第１のポジションのＵＮＡモノマー、および第１鎖の３端から最後の２つのポジションのうちの一方または両方のＵＮＡモノマーを有する。上記のＵＮＡオリゴマーであって、ここにＵＮＡオリゴマーは、第１鎖の１端の第１のポジションのＵＮＡモノマー、および第２鎖の３端から最後の２つのポジションの１つ以上のＵＮＡモノマーを有する。
上記のＵＮＡオリゴマーであって、ここにＵＮＡオリゴマーは、第１鎖の１端の第１のポジションのＵＮＡモノマーを有する。上記のＵＮＡオリゴマーであって、ここにＵＮＡオリゴマーは、第１鎖の３端から最後の２つのポジションのうちの１つ以上のＵＮＡモノマー、および第２鎖の３端から最後の２つのポジションの１つ以上のＵＮＡモノマーを有する。
上記のＵＮＡオリゴマーであって、ここにＵＮＡオリゴマーは、１つまたは２つのオーバーハングを有する。上記のＵＮＡオリゴマーであって、ここにＵＮＡオリゴマーは、低下したoff-target効果でＴＴＲ発現を阻害する。上記のＵＮＡオリゴマーであって、ここにＵＮＡオリゴマーは、低下したoff-target効果でアポリポタンパク質遺伝子の発現を阻害する。
上記のＵＮＡオリゴマーであって、ここにオリゴマーはイン・ビボ(in vivo)でＴＴＲ発現を阻害する。
上記のＵＮＡオリゴマーであって、ここにＵＮＡオリゴマーは、低下したoff-target効果で植物における遺伝子発現を阻害することを標的にする。
塩基修飾型、糖修飾型、または結合修飾型である少なくとも１つの核酸モノマーを含む、上記のＵＮＡオリゴマー。
上記のＵＮＡオリゴマーであって、ここにオリゴマーは配列番号：３〜３２の群から選択される配列を含む。
上記のＵＮＡオリゴマーであって、ここにオリゴマーは第２鎖の５’端からポジション２〜８のいずれか１つ以上のＵＮＡモノマーを含む。
上記のＵＮＡオリゴマーおよび医薬上許容し得る不活性成分を含む医薬組成物。
上記の医薬組成物であって、ここに組成物は局所投与または全身投与することができる。
上記の医薬組成物であって、ここに組成物は静脈内、皮下、肺、筋肉内、腹膜内、経皮、または経口投与することができる。
液体処方を含む上記の医薬組成物。
カチオン性脂質、アニオン性脂質、ステロール、ペグ化脂質、およびこれらのいずれかの組合せから選択される１つ以上の脂質を含む、上記の医薬組成物。
上記の医薬組成物であって、ここに組成物はリポソームを実質的に含まない。
上記の医薬組成物であって、ここに組成物はリポソームを含む。
必要とする対象に有効量の上記のＵＮＡオリゴマーを投与することを含む、ＴＴＲ−関連アミロイドーシスを治療または予防する方法。
ＴＴＲ−関連アミロイドーシスがＡＴＴＲである上記の方法。対象がヒトである上記の方法。上記の方法であって、ここに方法は対照と比較して少なくとも１０％低下したoff-target効果で対象におけるＴＴＲを減じる。
上記の方法であって、ここに有効量は０．００１〜５０．０ｍｇ／ｋｇの用量である。上記の方法であって、ここにＴＴＲのｍＲＮＡ発現は少なくとも５日間低下する。
上記の方法であって、ここに方法は対象における末梢神経ニューロパシーまたは自律神経ニューロパシーを減じる。
上記のＵＮＡオリゴマーで細胞を処理することを含む、細胞中のＴＴＲ遺伝子の発現を阻害する方法。
哺乳動物に上記のＵＮＡオリゴマーを投与することを含む、哺乳動物におけるＴＴＲ遺伝子の発現を阻害する方法。
１０〜１０００塩基対の長さを有するＵＮＡオリゴマーを植物に投与することを含む、植物における遺伝子の発現を阻害する方法。
図１：図１は、ＵＮＡオリゴマーが、ＰＳＩＣＨＥＣＫ−２ベクター（Promega）を用いたデュアルルシフェラーゼ・レポーターアッセイにおいて、ＡｐｏＣＩＩＩ ｍＲＮＡ発現について驚くべき低下したoff-target活性を示したことを示す。詳細には、５’端ポジション１（A"）およびポジション２０（U"）に位置するパッセンジャー鎖、ならびにポジション２０（U"）のガイド鎖にＵＮＡモノマーを有するＵＮＡオリゴマーＡＴＸ９８は、５’端ポジション１（A"）に位置するパッセンジャー鎖にＵＮＡモノマーを有しない相当するＵＮＡオリゴマーＡＴＳ９８と比較して、パッセンジャー鎖（ＰＳＣＭ）による大きく低下したoff-targetノックダウン活性を有していた。ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ９８は、２５０−倍を超える低下したoff-targetノックダウンを有していた。
図２：図２は、ＵＮＡオリゴマーが、ＰＳＩＣＨＥＣＫ−２ベクターを用いたデュアルルシフェラーゼ・レポーターアッセイにおいてＡｐｏＣＩＩＩ ｍＲＮＡ発現について驚くべき低下したoff-target活性を示したことを示す。詳細には、５’端ポジション１（C"）およびポジション２０（U"）に位置するパッセンジャー鎖の、ならびにポジション２０（U"）のガイド鎖のＵＮＡモノマーを有するＵＮＡオリゴマーＡＴＸ１００は、５’端ポジション１（C"）に位置するパッセンジャー鎖のＵＮＡモノマーを有しない相当するＵＮＡオリゴマーＡＴＳ１００と比較して、パッセンジャー鎖（ＰＳＣＭ）による大きく低下したoff-targetノックダウン活性を有していた。ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ１００は、ほぼ１００−倍低下したoff-targetノックダウンを有していた。
図３：図３は、ある種のＵＮＡオリゴマーが、ＴＴＲ ｍＲＮＡ発現について、通常のｓｉＲＮＡに少なくとも匹敵するノックダウンレベルの活性を有することを示す。詳細には、５’端に位置する第１鎖のＵＮＡモノマーを有するＵＮＡオリゴマーＡＴＸ１３、および５’端に位置する第１鎖のＵＮＡモノマーおよび５’端から数えて２０番目および２１番目のポジションの３’端に位置する第２鎖の２つのＵＮＡモノマーを有するＵＮＡオリゴマーＡＴＸ１５は、通常のｓｉＲＮＡ ＡＴＳ−９１と比較して少なくとも匹敵するノックダウンレベルの活性を有していた。さらに、５’端に位置する第１鎖のＵＮＡモノマー、５’端から数えて２０番目のポジションの３’端に位置する第１鎖の１つのＵＮＡモノマー、および５’端から数えて２０番目のポジションの３’端に位置する第２鎖の１つのＵＮＡモノマーを有するＵＮＡオリゴマーＡＴＸ２１は、通常のｓｉＲＮＡ ＡＴＳ−９１と比較して少なくとも匹敵するノックダウンレベルの活性を有していた。また、真っ向の比較において、５’端に位置する第１鎖のＵＮＡモノマー、５’端から数えて２０番目のポジションの３’端に位置する第１鎖に１つのＵＮＡモノマー、および５’端から数えて２０番目のポジションの３’端に位置する第２鎖に１つのＵＮＡモノマーを有するＡＴＸ２５は、通常のｓｉＲＮＡ ＡＴＳ−９２と比較して少なくとも匹敵するノックダウンレベルの活性を有していた。
図４：図４は、ＵＮＡオリゴマー、ＡＴＸ１３、ＡＴＸ１５およびＡＴＸ２１の構造を示す。
図５：図５は、off-target（ＯＴ）効果を測定するプロトコールを示す。ＰＳＩＣＨＥＣＫ−２ベクター（Promega）を用いるデュアルルシフェラーゼ・レポーターアッセイを確立して、off-target効果を定量化した。各測定について、４種類のプラスミドを構築した：第２鎖またはアンチセンス・ノックダウン用のガイド鎖ＧＳＣＭおよびガイド鎖ＧＳＳＭ、および第１鎖またはセンス鎖ノックダウン用のパッセンジャー鎖ＰＳＣＭおよびパッセンジャー鎖ＰＳＳＭ。レポータープラスミドは、ＵＮＡオリゴマーとＨｅＬａ細胞に同時トランスフェクトした。この系において、ＵＮＡオリゴマーがルシフェラーゼの３−ＵＴＲにインサートした標的配列に結合すると、ケミルミネセントシグナルが低下するかまたは消失する。
図６：図６は、ノックダウンレベルについて、通常のｓｉＲＮＡに対する真っ向の比較に用いたＵＮＡオリゴマーの構造を示す。ＵＮＡオリゴマーは、ポジション６２５からポジション６５１のＴＴＲ ｍＲＮＡ領域中のポジション２８４付近に貼り付けた。５種類のＵＮＡオリゴマー、すなわちＡＴＸ２５、ＡＴＸ３７、ＡＴＸ２１、ＡＴＸ３８およびＡＴＸ３９を調製した。これらのＵＮＡオリゴマーを、同じポジションを標的にした通常のｓｉＲＮＡと比較したoff-target効果について試験した。
図７：図７は、低下したoff-target効果を有するＵＮＡオリゴマーの実施形態の構造を示す。
図８：図８は、ＴＴＲ発現のノックダウンにおけるoff-target効果について、通常のｓｉＲＮＡ ＡＴＳ９２に対するＵＮＡオリゴマーＡＴＸ２５の真っ向の比較の結果を示す。ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ２５は通常のｓｉＲＮＡ（ＧＳＣＭ）を超える大きなノックダウンを有していた。驚くべきことに、ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ２５は通常のｓｉＲＮＡ（ＰＳＣＭ）に匹敵する低下したoff-targetノックダウンを有していた。
図９：図９は、ＴＴＲ発現のノックダウンにおけるoff-target効果について、通常のｓｉＲＮＡ ＡＴＳ１０４に対するＵＮＡオリゴマーＡＴＸ３７の真っ向の比較の結果を示す。ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ３７は、通常のｓｉＲＮＡ（ＧＳＣＭ）を超える大きなノックダウンを有していた。驚くべきことに、ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ３７は、通常のｓｉＲＮＡ（ＰＳＣＭ）と比較して実質的に低下したoff-targetノックダウンを有していた。
図１０：図１０は、ＴＴＲ発現のノックダウンにおけるoff-target効果について、通常のｓｉＲＮＡ ＡＴＳ９１に対するＵＮＡオリゴマーＡＴＸ２１の真っ向の比較の結果を示す。ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ２１は、通常のｓｉＲＮＡ（ＧＳＣＭ）に匹敵するノックダウンを有していた。驚くべきことに、ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ２１は、通常のｓｉＲＮＡ（ＰＳＣＭ）と比較して実質的に低下したoff-targetノックダウンを有していた。
図１１：図１１は、ＴＴＲ発現のノックダウンにおけるoff-target効果について、通常のｓｉＲＮＡ ＡＴＳ１０５に対するＵＮＡオリゴマーＡＴＸ３８の真っ向の比較の結果を示す。ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ３８は、通常のｓｉＲＮＡ（ＧＳＣＭ）と比較して増大したノックダウンを有していた。驚くべきことに、ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ３８は、通常のｓｉＲＮＡ（ＰＳＣＭ）と比較して実質的に低下したoff-targetノックダウンを有していた。
図１２：図１２は、ＴＴＲ発現のノックダウンにおけるoff-target効果について、通常のｓｉＲＮＡ ＡＴＳ１０６に対するＵＮＡオリゴマーＡＴＸ３９の真っ向の比較の結果を示す。ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ３９は、通常のｓｉＲＮＡ（ＧＳＣＭ）と比較して匹敵するノックダウンを有していた。驚くべきことに、ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ３９は、通常のｓｉＲＮＡ（ＰＳＣＭ）と比較して実質的に低下したoff-targetノックダウンを有していた。
図１３：図１３は、ある種のＵＮＡオリゴマーが予想し得ない低下したoff-target効果を示したことを示す。詳細には、ＵＮＡオリゴマー中、より詳細には、５’端および３’端におけるパッセンジャー鎖中、ならびに３’端におけるガイド鎖中の３つのポジションにおけるＵＮＡモノマーの組合せの存在が、パッセンジャー鎖による予期せぬ低下したoff-targetノックダウン活性を提供することが示された。
本発明は、遺伝子サイレンシング用の活性剤であるＵＮＡオリゴマー、ならびに疾患を治療または予防することにおいてＵＮＡオリゴマーを使用する方法を提供する。本発明のＵＮＡオリゴマーは、遺伝子サイレンシングにおいて低下したoff-target効果を有することができる。
本発明のＵＮＡオリゴマーは、以下に詳細に記載するアンロックド・ヌクレオモノマー活性剤（ＵＮＡ）である。ＵＮＡオリゴマーは、１つ以上のＵＮＡモノマーが含まれる鎖状分子である。ＵＮＡモノマーは、プロパン−１，２，３−トリ−イル−トリスオキシ構造に基づく小有機分子である。ＵＮＡオリゴマーは、ＵＮＡモノマー、ならびに天然発生のヌクレオシドまたは修飾型ヌクレオチドに基づいていてもよい種々のヌクレオチドからなる鎖とすることができる。
いくつかの態様において、本発明は、アミロイドーシス用の治療剤を提供する。より詳細には、本発明は、トランスサイレチンのノックダウンにおいて低下したoff-target効果を有するＵＮＡオリゴマーを用いてトランスサイレチン−関連アミロイドーシスを治療する方法に関する。
ある種の態様において、本発明のＵＮＡオリゴマーは、植物における遺伝子サイレンシングに使用することができる。植物において使用するためのＵＮＡオリゴマーは、１０〜１０００塩基対の長さを有していてもよい。本発明のＵＮＡオリゴマーは、低下したoff-target効果を提供しつつ、数ある中で、植物におけるゲノム機能解析に、植物特性の制御に、ウイルスおよび病原菌に対する抵抗性を付与するために、または昆虫からの保護のために用いることができる。
本発明のＵＮＡオリゴマーは、低下したoff-target効果で特定の遺伝子ノックダウンについて活性になり得る。
いくつかの実施形態において、ＵＮＡオリゴマーは、病気標的であると確認された遺伝子標的を標的にする。
ある種の実施形態において、本開示のＵＮＡオリゴマーは、トランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子を標的化することができる。
さらなる実施形態において、本開示のＵＮＡオリゴマーは、ＡｐｏＣＩＩＩのようなアポリポタンパク質遺伝子を標的化することができる。
トランスサイレチンに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）には、末梢、自律および中枢神経系を含む、種々の器官および組織におけるアミロイド繊維状タンパク質の沈着が含まれる。トランスサイレチン（ＴＴＲ）は、レチノール結合タンパク質、および血漿および脳脊髄液中の血清チロキシンに結合し、輸送する分泌型甲状腺ホルモン結合タンパク質である。
ＡＴＴＲの症状には、ニューロパシーおよび／または心筋症が含まれる場合がある。末梢神経ニューロパシーは、感覚および運動ニューロパシーを有して下肢で開始し、ついで上肢に進行することができる。自律神経ニューロパシーは、胃腸管症状および起立性低血圧症によって明白にすることができる。
ＡＴＴＲを患った患者におけるＴＴＲ遺伝子の最も一般的な突然変異は、Ｖａｌ−３０−Ｍｅｔである。ＡＴＴＲアミロイドーシスの主な治療は、変異型ＴＴＲ産生の主要源を取り除き、それを正常なＴＴＲと置き換える肝臓移植である。ＴＴＲアミロイドの形成を元に戻すことができる薬理学的療法は現在存在しない。
いくつかの実施形態において、本発明は、低下したoff-target効果でＴＴＲの効率的な遺伝子サイレンシングおよびノックダウンの活性剤を提供する。
いくつかの実施形態において、トランスサイレチンに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を治療するためのＵＮＡオリゴマーを提供する。本発明のＵＮＡオリゴマーは、末梢、自律および中枢神経系を含む種々の器官および組織におけるアミロイド繊維状タンパク質の沈着を減少することができる。
ある種の態様において、本発明は、ＡＴＴＲおよび関連するアミロイド−関連疾患の治療剤を提供する。
本発明の態様には、ニューロパシーおよび／または心筋症を含むＡＴＴＲアミロイドーシスの臨床上の特徴を治療するために用いることができるＵＮＡオリゴマーが含まれる。
いくつかの実施形態において、本発明のＵＮＡオリゴマーは、１つの突然変異Ｖａｌ−３０−Ｍｅｔ ＴＴＲを標的化する。
本発明は、ＴＴＲアミロイドの形成を戻すことができる薬理学的療法を提供することができる。
ＵＮＡモノマー
ＵＮＡモノマーは、以下に示すプロパン−１，２，３−トリ−イル−トリスオキシ構造に基づく小有機分子である：
Figure 2017516461
式中、Ｒ１およびＲ２はＨであり、Ｒ１およびＲ２はホスホジエステル結合となることができ、Ｂａｓｅは核酸塩基となることができ、Ｒ３は以下に記載する官能基である。
もう１つの視点において、ＵＮＡモノマー主原子は、ＩＵＰＡＣ命名法で以下のように表し得る：
Figure 2017516461
式中、オリゴマー鎖の進行方向は、プロパン残基の１−端から３−端である。
核酸塩基の例には、ウラシル、チミジン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニン、グアニン、イノシン、ならびに天然および非−天然の核酸塩基アナログが含まれる。
一般に、ＵＮＡモノマーはヌクレオチドでないため、それはオリゴマーにおいて少なくとも４つの形態を示すことができる。第１に、ＵＮＡモノマーはオリゴマー中の内部モノマーになることができ、その場合、ＵＮＡモノマーは両側で他のモノマーによって挟まれる。この形態において、ＵＮＡモノマーは、オリゴマーが二本鎖である場合の塩基対形成に関与できる。例えば、二本鎖中に核酸塩基と他のモノマーが存在する。
プロパン−１−イル位およびプロパン−３−イル位の両方で挟まれた内部モノマーとしてのＵＮＡモノマー（Ｒ３は−ＯＨ）の例を以下に示す。
Figure 2017516461
第２に、ＵＮＡモノマーは、オリゴマー二本鎖のオーバーハング中のモノマーになることができ、その場合、ＵＮＡモノマーは両側で他のモノマーによって挟まれる。この形態において、ＵＮＡモノマーは塩基対形成に関与しない。ＵＮＡモノマーは、ヌクレオチドとは異なって弾力的な有機構造であるため、ＵＮＡモノマーを含むオーバーハングは、オリゴマーに対して弾力的なターミネーター（terminator）になる。
ＵＮＡモノマーは、オリゴマーのオーバーハングにおいて末端モノマーとなることができ、その場合、ＵＮＡモノマーはプロパン−１−イル位またはプロパン−３−イル位のいずれかで１つのモノマーのみに結合する。この形態おいて、ＵＮＡモノマーは、塩基対形成に関与しない。ＵＮＡモノマーはヌクレオチドとは異なって弾力的な有機構造であるため、ＵＮＡモノマーを含むオーバーハングは、オリゴマーに対して弾力的なターミネーターとなることができる。
プロパン−３−イル位に結合した末端モノマーとしてのＵＮＡモノマーの例を以下に示す。
Figure 2017516461
ＵＮＡモノマーは弾力的な分子となることができるため、末端モノマーとしてのＵＮＡモノマーは広く異なるコンフォメーションを推測することができる。プロパン−３−イル位に結合した末端モノマーとしてのエネルギー最小限化（energy minimized）ＵＮＡモノマーのコンフォメーションの例を以下に示す。
Figure 2017516461
ＵＮＡ−Ａ末端の形：破線の結合はプロパン−３−イル結合を示す。

したがって、末端ＵＮＡモノマーを有するＵＮＡオリゴマーは、ｓｉＲＮＡのような通常の核酸剤とは構造上顕著に異なるものである。例えば、ｓｉＲＮＡは、二本鎖中の末端モノマーまたはオーバーハングが安定化されていることを必要とする場合がある。それに対して、末端ＵＮＡモノマーのなじみ性は、異なる特性を有するＵＮＡオリゴマーを提供することができる。
中でも、ＵＮＡモノマーの構造は、それが天然発生のヌクレオチドに結合することを許容する。ＵＮＡオリゴマーは、ＵＮＡモノマーならびに天然発生ヌクレオシドに基づくことができる種々のヌクレオチドからなる鎖とすることができる。
いくつかの実施形態において、ＵＮＡモノマーの官能基Ｒ３は−ＯＲ４、−ＳＲ４、−ＮＲ４ ２、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ４、モルホリノ、モルホリン−１−イル、ピペラジン−１−イル、または４−アルカノイル−ピペラジン−１−イルとすることができ、ここにＲ４は現れる各場合について同一または異なっていてもよく、Ｈ、アルキル、コレステロール、脂質分子、ポリアミン、アミノ酸、またはポリペプチドとすることができる。
ＵＮＡモノマーは有機分子である。ＵＮＡモノマーは核酸モノマーまたはヌクレオチドではなく、天然発生のヌクレオシドまたは修飾型の天然発生のヌクレオシドでもない。
本発明のＵＮＡオリゴマーは合成鎖状分子である。本発明のＵＮＡオリゴマーは核酸ではなく、オリゴヌクレオチドでもない。
いくつかの実施形態において、上記に示したように、ＵＮＡモノマーはＵＮＡ−Ａ（A"と命名）、ＵＮＡ−Ｕ（U"と命名）、ＵＮＡ−Ｃ（C"と命名）、およびＵＮＡ−Ｇ（G"と命名）とすることができる。
本明細書中で用いてもよい記号には、ｍＡ、ｍＧ、ｍＣ、およびｍＵが含まれ、それらは２'−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドを示す。
本明細書中で用いてもよい記号には、小文字ｃおよびｕが含まれ、それらは２'−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドを示する。
本明細書中で用いてもよい記号にはｄＴが含まれ、それには２'−デオキシＴヌクレオチドが含まれる。
ＵＮＡオリゴマー用のモノマー
本明細書中で用いるオリゴマー配列の関連において、記号ＸはＵＮＡモノマーを表す。
本明細書中で用いるオリゴマー配列の関連において、記号Ｎはいずれかの天然ヌクレオチドモノマーまたは修飾ヌクレオチドモノマーを表す。
本明細書中で用いるオリゴマー配列の関連において、記号Ｑは非−天然型、修飾型または化学修飾型のヌクレオチドモノマーを表す。
非−天然型、修飾型、および化学修飾型のヌクレオチドモノマーの例には、２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２'−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド、２'−デオキシ−２'−フルオロリボヌクレオチド、２'−デオキシ−２'−フルオロピリミジンヌクレオチド、２'−デオキシリボヌクレオチド、２'−デオキシプリンヌクレオチド、ユニバーサル塩基ヌクレオチド、５−Ｃ−メチル−ヌクレオチドおよび逆位デオキシ塩基脱落モノマー残基が含まれる。
非−天然型、修飾型、および化学修飾型のヌクレオチドモノマーの例には、３'−端安定化ヌクレオチド、３'−グリセリルヌクレオチド、３'−逆位塩基脱落ヌクレオチド、および３'−逆位チミジンが含まれる。
非−天然型、修飾型、および化学修飾型のヌクレオチドモノマーの例には、ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）核酸ヌクレオチド、２'−Ｏ，４'−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド、２'−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２'−メチル−チオ−エチル、２'−デオキシ−２'−フルオロヌクレオチド、および２'−Ｏ−メチルヌクレオチドが含まれる。
非−天然型、修飾型、および化学修飾型のヌクレオチドモノマーの例には、２'−アミノヌクレオチド、２'−Ｏ−アミノヌクレオチド、２'−Ｃ−アリルヌクレオチド、および２'−Ｏ−アリルヌクレオチドが含まれる。
非−天然型、修飾型、および化学修飾型のヌクレオチドモノマーの例には、Ｎ６−メチルアデノシンヌクレオチドが含まれる。
非−天然型、修飾型、および化学修飾型のヌクレオチドモノマーの例には、修飾型塩基５−（３−アミノ）プロピルウリジン、５−（２−メルカプト）エチルウリジン、５−ブロモウリジン；８−ブロモグアノシン、または７−デアザアデノシンを有するヌクレオチドモノマーが含まれる。
非−天然型、修飾型、および化学修飾型のヌクレオチドモノマーの例には、２’−Ｏ−アミノプロピル置換型ヌクレオチドが含まれる。
非−天然型、修飾型、および化学修飾型のヌクレオチドモノマーの例には、ヌクレオチドの２'−ＯＨ基を２'−Ｒ、２'−ＯＲ、２'−ハロゲン、２'−ＳＲ、または２'−アミノで置き換えることが含まれ、ここにＲはＨ、アルキル、アルケニル、またはアルキニルとなることができる。
修飾型ヌクレオチドの幾つかの例は、Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag, 1984に提供されている。
ＵＮＡオリゴマー
本発明のＵＮＡオリゴマーは、鎖状分子である。ＵＮＡオリゴマーは、二本鎖対とすることができる。したがって、ＵＮＡオリゴマーは二本鎖の第１鎖および二本鎖の第２鎖を有し得、これは３つのミスマッチまで生じることができるが、第１鎖に相補的である。ＵＮＡオリゴマー・二本鎖は、オーバーハングを有することができる。
米国特許第８，３１４，２２７号ならびに米国特許出願公開第２０１１０３１３０２０ Ａ１では、いくつかのＵＮＡオリゴマーが論じられている。
ＵＮＡオリゴマーの標的は、標的核酸とすることができる。いくつかの実施形態において、標的は、対象のいずれかのｍＲＮＡとすることができる。ＵＮＡオリゴマーは、ＲＮＡ干渉における遺伝子サイレンシングに活性になることができる。
ＵＮＡオリゴマーは、一緒になって二本鎖を提供する２つの鎖を含んでいてもよい。二本鎖は、パッセンジャー鎖またはセンス鎖といってもよい第１鎖、およびガイド鎖またはアンチセンス鎖といってもよい第２鎖からなっていてもよい。
いくつかの態様において、本発明のＵＮＡオリゴマーは、二本鎖構造のいずれかの鎖、または両方の鎖中のいずれかのポジションに、いずれかの数のホスホロチオエート・モノマー間結合を有することができる。
本発明のＵＮＡオリゴマーの例には、一般的に相補的である二本鎖対が含まれる。したがって、例えば、配列番号：１は二本鎖の第１鎖を表すことができ、および配列番号：２は第１鎖に相補的である二本鎖の第２鎖を表すことができる。
例えば、第１鎖中の記号「Ｎ」は、第２鎖中の対応するポジションのモノマーに相補的であるいずれのヌクレオチドも表すことができる。本開示の例示的なＵＮＡオリゴマーを、１〜８モノマー、またはそれよりも長いオーバーハングを用いることができるが、２−モノマー長のオーバーハングとともに示す。
鎖またはオリゴマー中の記号「Ｘ」は、ＵＮＡモノマーを表す。
さらに、オリゴマーがＵＮＡモノマーで終結する場合は、ヌクレオチドについての５’−端の代わりに上記に示したポジション番号付けに従って末端ポジションは１−端を有し、あるいは末端ポジションは、ヌクレオチドについての３’−端の代わりに上記に示したポジション番号付けに従って３−端を有する。例えば、ＵＮＡオリゴマー
Figure 2017516461
は、第１鎖上のＵＮＡモノマー １−端、第１鎖上のＵＮＡモノマー ３−端、第２鎖上のＵＮＡモノマー ３−端、および第２鎖上のヌクレオチド ５’−端を有する。
いくつかの実施形態において、本発明のＵＮＡオリゴマーは、第１鎖の１−端に１つ以上のＵＮＡモノマー、および第１鎖の３−端に１つ以上のＵＮＡモノマーを有することができる。
さらなる実施形態において、本発明のＵＮＡオリゴマーは、第２鎖の３−端に１つ以上のＵＮＡモノマーを有することができる。
ある種の実施形態において、本発明の二本鎖ＵＮＡオリゴマーは、第１鎖の１−端に１つ以上のＵＮＡモノマー、第１鎖の３−端に１つ以上のＵＮＡモノマー、および第２鎖の３−端に１つ以上のＵＮＡモノマーを有することができる。
本発明のＵＮＡオリゴマーは第１鎖および第２鎖を有することができ、それぞれの鎖は独立して１９〜２３モノマー長である。
ある種の実施形態において、本発明のＵＮＡオリゴマーは１９〜２３モノマー長である第１鎖を有していてもよい。
ある種の実施形態において、本発明のＵＮＡオリゴマーは１９〜２１モノマー長である二本鎖領域を有していてもよい。
さらなる実施形態において、本発明のＵＮＡオリゴマーは１９〜２３モノマー長である第２鎖を有していてもよい。
ある種の実施形態において、本発明のＵＮＡオリゴマーは、１９モノマー長である第１鎖および２１モノマー長である第２鎖を有していてもよい。
ある種の実施形態において、本発明のＵＮＡオリゴマーは、２０モノマー長である第１鎖および２１モノマー長である第２鎖を有していてもよい。
ある種の実施形態において、本発明のＵＮＡオリゴマーは、２１モノマー長である第１鎖および２１モノマー長である第２鎖を有していてもよい。
ある種の実施形態において、本発明のＵＮＡオリゴマーは、２２モノマー長である第１鎖および２１モノマー長である第２鎖を有していてもよい。
遺伝子発現を阻害する本発明のＵＮＡオリゴマーは、第１鎖および第２鎖を有することができ、それぞれの鎖は１９〜２９モノマー長である。モノマーはＵＮＡモノマーおよび核酸モノマーとすることができる。オリゴマーは、１４〜２９モノマー長の二本鎖構造を有することができる。ＵＮＡオリゴマーは、標的遺伝子を標的化し、通常のｓｉＲＮＡと比較して低下したoff-target効果を示すことができる。いくつかの実施形態において、本発明のＵＮＡオリゴマーは、第１鎖および第２鎖を有することができ、それぞれの鎖は１９〜２３モノマー長である。
もう１つの態様において、ＵＮＡオリゴマーは平滑末端を有していてもよく、または１つ以上のオーバーハングを有していてもよい。いくつかの実施形態において、第１鎖および第２鎖は、鎖間の連結オリゴマーと連結してもよく、一端の連結ループと二本鎖領域を形成してもよい。
ある種の実施形態において、オーバーハングは１または２モノマー長とすることができる。
ＵＮＡオリゴマーは、細胞中の標的核酸の切断を仲介することができる。いくつかのプロセスにおいて、ＵＮＡオリゴマーの第２鎖（少なくともその一部分は標的核酸に相補的とすることができる）は、標的核酸にハイブリダイズすることができるガイド鎖として作用することができる。
第２鎖は、RNA Induced Silencing Complex（RISC）に組み込まれることができる。
本開示のＵＮＡオリゴマーは、遺伝子サイレンシング活性と相性がよい、天然発生の核酸ヌクレオチドおよびその修飾物を含んでいてもよい。
いくつかの態様において、ＵＮＡオリゴマーは、遺伝子発現を阻害することができる二本鎖構築物分子である。
本明細書中で用いる鎖という語は、モノマーの単一の連続した鎖をいい、その鎖はいずれの数の内部モノマーおよび２つの末端モノマーを有し、各末端モノマーは１の側で１つの内部モノマーに結合し、鎖が終結するようにもう１の側ではモノマーに結合しない。
ＵＮＡオリゴマーのモノマーは、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ギャップ結合（gapped linkage）および他の変形を介して結合してもよい。
いくつかの実施形態において、ＵＮＡオリゴマーは、第１鎖および第２鎖の間の相補性にミスマッチを含むことができる。他の実施形態において、ＵＮＡオリゴマーは１、または２、または３つのミスマッチを有していてもよい。ミスマッチは、二本鎖領域中のいずれのポジションに発生してもよい。
ＵＮＡオリゴマーの標的は、標的遺伝子の標的核酸とすることができる。
ＵＮＡオリゴマーは、二本鎖領域の外側に１つまたは２つのオーバーハングを有していてもよい。オーバーハングは、第１鎖または第２鎖の末端の対合していない部分とすることができる。第１鎖および第２鎖のオーバーハング部分の長さは、同一または異なるものとすることができる。
ＵＮＡオリゴマーは、少なくとも１つの平滑末端を有していてもよい。平滑末端はオーバーハング部分を有さず、平滑末端の二本鎖領域は第１鎖および第２鎖の両方について同じポジションで終結する。
ＵＮＡオリゴマーはＲＩＳＣの長さとすることができ、それは、ＵＮＡオリゴマーが２５塩基対未満の二本鎖長を有することを意味する。
ある種の実施形態において、ＵＮＡオリゴマーは、それ自体の上でフォールドし、それ自体にハイブリダイズして連結ループを有する二本鎖領域を形成する一本鎖とすることができる。
低下したoff-target効果を有するＵＮＡオリゴマー構造の例を表１に示す。
Figure 2017516461
いくつかの実施形態において、低下したoff-target効果を有するＵＮＡオリゴマーは、第１鎖（パッセンジャー鎖ともいう）の１端の第１のポジションに、および第１鎖の３端から最後の２のポジションの一方または両方に、ならびに第２鎖（ガイド鎖ともいう）の３端から最後の２のポジションの一方または両方にＵＮＡモノマーを有することができる。例えば、表１の配列番号：３および４では、第１鎖の３端から最後の２つのポジションの両方および第２鎖の３端から最後の２つのポジションの両方がＵＮＡモノマーである。
いくつかの実施形態において、低下したoff-target効果を有するＵＮＡオリゴマーは、第１鎖の１端の第１のポジションに、および第１鎖の３端から最後の２つのポジションのうちの一方または両方にＵＮＡモノマーを有することができる。例えば、表１中の配列番号：５および６では、第１鎖の３端の最後の２のポジションの両方がＵＮＡモノマーである。
いくつかの実施形態において、低下したoff-target効果を有するＵＮＡオリゴマーは、第１鎖（パッセンジャー鎖ともいう）の１端の第１のポジションに、および第２鎖の３端から最後の２のポジションの１つ以上にＵＮＡモノマーを有することができる。例えば、表１中の配列番号：７および８では、第２鎖の３端から最後の２のポジションの両方がＵＮＡモノマーである。
いくつかの実施形態において、低下したoff-target効果を有するＵＮＡオリゴマーは、第１鎖の１端の第１のポジションにＵＮＡモノマーを有することができる。例えば、表１の配列番号：９および１０。
いくつかの実施形態において、低下したoff-target効果を有するＵＮＡオリゴマーは、第１鎖の３端から最後の２のポジションのうちの１つ以上に、ならびに第２鎖の３端から最後の２のポジションの１つ以上にＵＮＡモノマーを有することができる。例えば、表１中の配列番号：１１および１２では、第１鎖の３端から最後の２のポジションの両方および第２鎖の３端から最後の２のポジションの両方がＵＮＡモノマーである。
いくつかの実施形態において、前記したいずれかのポジションに１以上のＵＮＡモノマーを有することに加えて、低下したoff-target効果を有するＵＮＡオリゴマーは、第２鎖の５’端からポジション２〜８のいずれか１以上のシード（ｓｅｅｄ）領域にＵＮＡモノマーを有することができる。
低下したoff-target効果を有するＵＮＡオリゴマー構造の例を表２に示す。
Figure 2017516461
アミロイドーシスを治療する方法
本発明の方法には、低下したoff-target効果を用いた、哺乳動物対象におけるＴＴＲ−関連アミロイドーシスの治療および予防が含まれる。
本発明の方法において、治療または予防を必要とする対象は、有効量のＵＮＡオリゴマーを投与することができる。対象は、ヒトまたは哺乳動物とすることができる。
対象は、ＡＴＴＲとしても知られているＴＴＲ−関連アミロイドーシスを有していてもよい。
詳細には、対象は、Ｖ３０Ｍ遺伝子を有することができる。本発明の方法は、低下したoff-target効果で、対象におけるＶ３０Ｍ ＴＴＲを減少することができる。
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、低下したoff-target効果で、対照と比較して少なくとも１０％、対象におけるＴＴＲまたはＶ３０Ｍ ＴＴＲを減少することができる。ある種の実施形態において、対象におけるＴＴＲまたはＶ３０Ｍ ＴＴＲは、低下したoff-target効果で、対照と比較して少なくとも２０％、または３０％、または５０％、減少することができる。
本発明のＵＮＡオリゴマーの有効量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜５０．０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量とすることができる。
本発明の方法において、ＴＴＲ ｍＲＮＡ発現は、少なくとも５日間、対象において減少することができる。ある種の実施形態において、ＴＴＲ ｍＲＮＡ発現は、少なくとも１０日間、または１５日間、対象において減少することができる。
本発明の方法において、対象における末梢神経ニューロパシーまたは自律神経ニューロパシーを減じることができる。
本発明の方法において、対象における末梢神経ニューロパシーまたは自律神経ニューロパシーを減少することができる。いくつかの実施形態において、対象は減少した下肢脱力、減少した痛みまたは改善した感覚を体験することができる。本発明の方法は、対象における硝子体混濁の発生を減少することができる。
本開示の方法において、ＵＮＡオリゴマーの投与は、炎症応答を生じないかもしれない。
さらなる実施形態において、本発明には、細胞をＵＮＡオリゴマーで処理することによって、細胞中のＴＴＲ遺伝子の発現を阻害する方法が含まれる。
さらなる実施形態において、本発明には、ＵＮＡオリゴマーを含有する組成物を哺乳動物に投与することによって哺乳動物におけるＴＴＲ遺伝子の発現遺伝子の発現を阻害する方法が含まれる。
医薬組成物
いくつかの態様において、本発明は、ＵＮＡオリゴマーおよび医薬上許容し得る不活性成分を含有する医薬組成物を提供する。
医薬組成物は、局所投与または全身投与することができる。いくつかの態様において、医薬組成物はいずれの投与のモダリティともすることができる。ある種の態様において、投与は、静脈内、皮下、肺、筋肉内、腹膜内、経皮、経口または経鼻投与とすることができる。
本発明の実施形態には、脂質処方中にＵＮＡオリゴマーを含有する医薬組成物が含まれる。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、カチオン性脂質、アニオン性脂質、ステロール、ペグ化脂質、およびこれらのいずれかの組合せから選択される１種以上の脂質を含んでいてもよい。
ある種の実施形態において、医薬組成物は、実質的にリポソームを含まないことができる。
さらなる実施形態において、医薬組成物は、リポソームを含むことができる。
さらなる実施形態において、医薬組成物は、ウイルスまたは細菌ベクター内にＵＮＡオリゴマーを含むことができる。
本開示の医薬組成物には、当該技術分野で知られている不活性成分、希釈剤または賦形剤が含まれていてもよい。医薬組成物の例は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A.R. Gennaro編 1985)に記載されている。
医薬組成物用の賦形剤の例には、抗酸化剤、懸濁化剤、分散剤、保存剤、緩衝化剤、等張剤および界面活性剤が含まれる。
実施例１：
本実施例は、ＵＮＡオリゴマーがＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングにおいてパッセンジャー鎖のoff-target活性を劇的に低下させることを示す。パッセンジャー鎖off-target活性の低下は、オリゴマー中の種々のＵＮＡモノマーのポジショニングに依存することができる。本実施例において、ＵＮＡオリゴマー中の３つのポジションのＵＮＡモノマーの組合せの存在、より詳細には、５'端および３'端のパッセンジャー鎖中、ならびに３'端のガイド鎖中のＵＮＡモノマーの組合せの存在が、パッセンジャー鎖によるoff-targetノックダウン活性を大きく低下したことを示す。
低下したoff-target効果を有するＡｐｏＣＩＩＩに標的化されたＵＮＡオリゴマーを表３に示す。本明細書中で用いるように、二本鎖オリゴマーは上方のパッセンジャー鎖および下方のガイド鎖で表される。端の基の番号付けは、前記した末端モノマーの同一性に依存する。
Figure 2017516461
図１は、ＰＳＩＣＨＥＣＫ−２ベクター（Promega）を用いるデュアルルシフェラーゼ・レポーターアッセイにおいて、ＵＮＡオリゴマーがＡｐｏＣＩＩＩ ｍＲＮＡ発現について驚くべき低下したoff-target活性を示したことを示す。詳細には、５’端ポジション１（A"）およびポジション２０（U"）に位置するパッセンジャー鎖、ならびにポジション２０（U"）のガイド鎖にＵＮＡモノマーを有するＵＮＡオリゴマーＡＴＸ９８は、５'端ポジション１（A"）に位置するパッセンジャー鎖にＵＮＡモノマーを有しない比較ＵＮＡオリゴマーＡＴＳ９８と比較してパッセンジャー鎖（ＰＳＣＭ）による大きく低下したoff-targetノックダウン活性を有していた。
ＡＴＳ９８のパッセンジャー鎖についてのＩＣ５０は１.５７であり、ＡＴＸ９８のパッセンジャー鎖についてのＩＣ５０は３９７であった。したがって、ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ９８は、ＩＣ５０の比で測定して、２５０−倍を超えて低下したoff-targetノックダウンを有していた。off-targetノックダウンにおけるこの劇的な低下は、ＵＮＡオリゴマー中の３つのポジションにおけるＵＮＡモノマー：パッセンジャー鎖の５'端および３'端、ならびに３'端のガイド鎖、の組合せの存在に帰結することができる。
図２は、ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ１００がＰＳＩＣＨＥＣＫ−２ベクターを用いたデュアルルシフェラーゼ・レポーターアッセイにおいてＡｐｏＣＩＩＩ ｍＲＮＡ発現について驚くべき低下したoff-target活性を示したことを示している。ＡＴＸ１００は５’端ポジション１（C"）およびポジション２０（U"）に位置するパッセンジャー鎖、ならびにポジション２０（U"）に位置するガイド鎖にＵＮＡモノマーを有し、５’端ポジション１（C"）に位置するパッセンジャー鎖にＵＮＡモノマーを有しない比較ＵＮＡオリゴマーＡＴＳ１００と比較してパッセンジャー鎖（ＰＳＣＭ）による大きく低下したoff-targetノックダウン活性を有していた。
ＡＴＳ１００のパッセンジャー鎖についてのＩＣ５０は２３．５であり、ＡＴＸ１００のパッセンジャー鎖についてのＩＣ５０は２２３９であった。したがって、ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ１００は、ＩＣ５０の比で測定して、ほぼ１００−倍低下したoff-targetノックダウンを有していた。off-targetノックダウンにおけるこの劇的な低下は、ＵＮＡオリゴマー中の３つのポジション：パッセンジャー鎖の５’端および３’端、ならびに３’端のガイド鎖、のＵＮＡモノマーの組合せの存在に帰結することができる。
実施例２：図３は、ある種のＵＮＡオリゴマーが、ＴＴＲ ｍＲＮＡ発現について、通常のｓｉＲＮＡに匹敵する活性のノックダウンレベルを有したことを示す。ＡＴＸ１３、ＡＴＸ１４、ＡＴＸ１５、ＡＴＸ１６、ＡＴＸ１７、ＡＴＸ２１およびＡＴＸ２５は、ヒトＴＴＲの３'−ＵＴＲに標的化され、したがって、野生型 Ｖ３０ＶおよびＶ３０Ｍ突然変異体ＴＴＲの両方に標的化した。
詳細には、１（５’）端に位置する第１鎖にＵＮＡモノマーを有するＵＮＡオリゴマーＡＴＸ１３、ならびに１（５’）端に位置する第１鎖にＵＮＡモノマーを有し、５'端から数えて２０番目および２１番目の３（３'）端に位置する第２鎖に２つのＵＮＡモノマーを有するＵＮＡオリゴマーＡＴＸ１５は、通常のｓｉＲＮＡ ＡＴＳ−９１と比較して少なくとも匹敵する活性のノックダウンレベルを有していた。
さらに、１（５’）端に位置する第１鎖のＵＮＡモノマー、５’端から数えて２０番目のポジションの３（３’）端に位置する第１鎖の１つのＵＮＡモノマー、および５’端から数えて２０番目のポジションの３（３’）端に位置する第２鎖に１つのＵＮＡモノマーを有するＵＮＡオリゴマーＡＴＸ２１は、通常のｓｉＲＮＡ ＡＴＳ−９１と比較して少なくとも匹敵する活性のノックダウンレベルを有していた。
また、真っ向の比較において、１（５’）端に位置する第１鎖のＵＮＡモノマー、１端から数えて２０番目のポジションの３（３’）端に位置する第１鎖の１つのＵＮＡモノマー、および５'端から数えて２０番目のポジションの３（３’）端に位置する第２鎖に１つのＵＮＡモノマーを有するＡＴＸ２５は、通常のｓｉＲＮＡ ＡＴＳ−９２と比較して少なくとも匹敵する活性のノックダウンレベルを有していた。
図４は、ＵＮＡオリゴマー ＡＴＸ１３、ＡＴＸ１５およびＡＴＸ２１の構造を示す。
実施例３：図５は、off-target（ＯＴ）効果を測定するためのプロトコールを示す。ＰＳＩＣＨＥＣＫベクターを用いるルシフェラーゼ・レポーターアッセイを確立した。各測定について、４つのプラスミド：第２鎖またはアンチセンス・ノックダウン用のガイド鎖ＧＳＣＭおよびガイド鎖ＧＳＳＭ、および第１鎖またはセンス鎖ノックダウン用のパッセンジャー鎖ＰＳＣＭおよびパッセンジャー鎖ＰＳＳＭ、を構築した。レポータープラスミドは、ＨｅＬａ細胞にＵＮＡオリゴマーと一緒に同時トランスフェクトした。この系において、ＵＮＡオリゴマーがルシフェラーゼの３-ＵＴＲにインサートした標的配列に結合すると、化学ルミネセンス信号が低下するか消失する。
実施例４：図６は、ノックダウンレベルについて通常のｓｉＲＮＡに対する真っ向の比較に用いたＵＮＡオリゴマーの構造を示す。ＵＮＡオリゴマーは、ポジション６２５〜ポジション６５１のＴＴＲ ｍＲＮＡ領域中のポジション６２８付近に貼り付いた。５つのＵＮＡオリゴマー、すなわちＡＴＸ２５、ＡＴＸ３７、ＡＴＸ２１、ＡＴＸ３８およびＡＴＸ３９を調製した。これらのＵＮＡオリゴマーを、同一のポジションに標的化した通常のｓｉＲＮＡと比較したoff-target効果について試験した。
実施例５：図７は、低下したoff-target効果を有するＵＮＡオリゴマーのいくつかの実施形態の構造を示す。
図８は、ＴＴＲ発現のノックダウンにおけるoff-target効果について通常のｓｉＲＮＡ ＡＴＳ９２に対するＵＮＡオリゴマーＡＴＸ２５の真っ向の比較の結果を示す。ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ２５は、通常のｓｉＲＮＡ（ＧＳＣＭ）を超える増大したノックダウンを有していた。驚くべきことに、ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ２５は、通常のｓｉＲＮＡ（ＰＳＣＭ）と比較して低下したoff-targetノックダウンを有していた。
実施例６：図９は、ＴＴＲ発現のノックダウンにおけるoff-target効果について、通常のｓｉＲＮＡ ＡＴＳ１０４に対するＵＮＡオリゴマーＡＴＸ３７の真っ向の比較の結果を示す。ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ３７は、通常のｓｉＲＮＡ（ＧＳＣＭ）を超える増大したノックダウンを有していた。驚くべきことに、ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ３７は、通常のｓｉＲＮＡ（ＰＳＣＭ）と比較して実質的に低下したoff-targetノックダウンを有していた。
実施例７：図１０は、ＴＴＲ発現のノックダウンにおけるoff-target効果について、通常のｓｉＲＮＡ ＡＴＳ９１に対するＵＮＡオリゴマーＡＴＸ２１の真っ向の比較の結果を示す。ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ２１は、通常のｓｉＲＮＡ（ＧＳＣＭ）に匹敵するノックダウンを有していた。驚くべきことに、ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ２１は、通常のｓｉＲＮＡ（ＰＳＣＭ）と比較して実質的に低下したoff-targetノックダウンを有していた。
実施例８：図１１は、ＴＴＲ発現のノックダウンにおけるoff-target効果について、通常のｓｉＲＮＡ ＡＴＳ１０５に対するＵＮＡオリゴマーＡＴＸ３８の真っ向の比較の結果を示す。ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ３８は、通常のｓｉＲＮＡ（ＧＳＣＭ）と比較して増大したノックダウンを有していた。驚くべきことに、ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ３８は、通常のｓｉＲＮＡ（ＰＳＣＭ）と比較して実質的に低下したoff-targetノックダウンを有していた。
実施例９：図１２は、ＴＴＲ発現のノックダウンにおけるoff-target効果について、通常のｓｉＲＮＡ ＡＴＳ１０６に対するＵＮＡオリゴマー ＡＴＸ３９の真っ向の比較の結果を示す。ＵＮＡオリゴマー ＡＴＸ３９は、通常のｓｉＲＮＡ（ＧＳＣＭ）と比較して匹敵するノックダウンを有していた。驚くべきことに、ＵＮＡオリゴマー ＡＴＸ３９は、通常のｓｉＲＮＡ（ＰＳＣＭ）と比較して実質的に低下したoff-targetノックダウンを有していた。
実施例１０：本実施例では、ＵＮＡオリゴマーについてのoff-target活性における予期せぬ低下を示す。パッセンジャー鎖off-target活性の低下は、オリゴマー中の種々のＵＮＡモノマーのポジショニングに依存する。本実施例においては、ＵＮＡオリゴマー中の３つのポジション、より詳細には、１端および３（３'）端のパッセンジャー鎖の、ならびに３（３'）端のガイド鎖、のＵＮＡモノマーの組合せの存在が、パッセンジャー鎖による予期せぬ低下したoff-targetノックダウン活性を提供することを示す。
低下したoff-target効果を有するＴＴＲに標的化されたＡＴＸ２５をベースとした図１３のＵＮＡオリゴマーを表４に示す。
Figure 2017516461
図１３は、ＴＴＲに標的化されたＡＴＸ２５をベースとするある種のＵＮＡオリゴマーが予期せぬ低下したoff-target効果を示したことを示す。ＰＳＩＣＨＥＣＫ−２ベクター（Promega）を用いるデュアルルシフェラーゼ・レポーターアッセイを用いた。詳細には、５’端ポジション１（A"）およびポジション２０（U"）に位置するパッセンジャー鎖、ならびにポジション２０（U"）のガイド鎖にＵＮＡモノマーを有するＵＮＡオリゴマー１Ｕ−ＡＴＸ２５は、パッセンジャー鎖（ＰＳＣＭ）による低下したoff-targetノックダウン活性を有していた。驚くべきことに、１２Ｕ−ＡＴＸ２５については、５'端ポジション２（U"）に位置する、オリゴマーの構造へのＵＮＡモノマーの付加が、パッセンジャー鎖（ＰＳＣＭ）によるoff-targetノックダウン活性の４倍の低下を与えた。また、１３Ｕ−ＡＴＸ２５については、５’端ポジション３（G"）に位置する、オリゴマーの構造へのＵＮＡモノマーの付加が、パッセンジャー鎖（ＰＳＣＭ）によるoff-targetノックダウン活性の６倍の低下を与えた。さらに、５’端ポジション２（U"）およびポジション３（G"）に位置する、オリゴマーの構造へのＵＮＡモノマーの付加が、パッセンジャー鎖（ＰＳＣＭ）によるoff-targetノックダウン活性の７倍の低下を与えた。図１３からの結果を表５に要約する。
Figure 2017516461
実施例１１：本実施例は、イン・ビボ（in vivo）においてＶ３０Ｍ ＴＴＲ沈着を減少することができ、したがってトランスサイレチン−関連アミロイドーシスのような症状または疾患を治療または予防する方法に好適であるＵＮＡオリゴマーに関する。ヒトＴＴＲ Ｖ３０Ｍ過剰発現用のトランスジェニック・マウスは、６月齢で用いる。ＴＴＲ野生型およびＴＴＲノックアウトマウスを対照として用いる。動物は制御された環境で飼育し、ケタミンとメデトミジンを用いて麻酔した。
ＴＴＲ遺伝子サイレンシングのために、ＴＴＲ ＵＮＡオリゴマーおよび対照をリポソーム処方で送達した。ＴＴＲ ＵＮＡオリゴマーを１ｍｇ／ｋｇの濃度でマウス尾静脈に注射した（ｎ ＝ ６）。週齢を合致させた非処理の対照は、ブランク処方で処理した。１週間当たり１回の注射を４週間行い、最後の注射から４８時間後に動物を殺した。肝臓および大腸を取り出し、１０％ホルマリンに収集し、凍結した。
肝臓および大腸のｍＲＮＡをフェノール抽出（Invitrogen）を用いて単離した。Ｖ３０Ｍマウスから得た坐骨神経を他の組織から切除し、ｍＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉカラム（Qiagen）を用いて抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ二本鎖ｃＤＮＡキット（Invitrogen）を用いてｃＤＮＡを合成した。抽出したＲＮＡは、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ ＲＮＡ ＳｔｄＳｅｎｓ Ａｎａｌｙｓｉｓキット（Bio-Rad）を用いて確認した。プライマーおよびｉＱ Ｓｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒ Ｍｉｘ（Bio-Rad）を用いてｑＰＣＲを行った。二重免疫蛍光分析は、前記したように取り出し、処理したＶ３０Ｍの坐骨神経、後根神経節および大腸を用いて行った。比較は、スチューデントのＴ−検定または一元配置分散分析（Ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を用いて行った。データは、平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として表す。０．０５未満のｐ−値を有意とする。
ＵＮＡオリゴマーＡＴＸ１３、ＡＴＸ１５、ＡＴＸ２１、１Ｕ−ＡＴＸ２５、１２Ｕ−ＡＴＸ２５、１３Ｕ−ＡＴＸ２５、１２３Ｕ−ＡＴＸ２５、ＡＴＸ３７、ＡＴＸ３８またはＡＴＸ３９のいずれか１つ、またはこれらのＵＮＡオリゴマーのいずれかの組合せのＶ３０Ｍマウスへの注射は、対照に対して少なくとも９０％、坐骨神経、後根神経節および大腸におけるＶ３０Ｍ ＴＴＲ沈着を減少する。
本明細書中で具体的に言及するすべての刊行物、特許および書籍は、すべての目的について出典明示して本明細書の一部とみなす。
記載した方法論、プロトコール、材料および試薬は変化し得るため、本発明がこれら特定のものに限定されないことは理解される。また、本明細書中で用いた用語は記載した特定の実施形態のみを記載する目的のものであり、添付する特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書中で用いるおよび添付する特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、別段、明白に文章が規定していない限り複数形も含まれることは注記しておく。そのうえに、「ａ」（または「ａｎ」）、「１以上の」および「少なくとも１つの」のような用語は本明細書中では交換可能に使用することができる。また、「〜を含む」、「〜を含む」、「〜を含有する」、「〜を包含する」および「〜を有する」なる用語は、相互交換可能に用いることができることも注記しておく。
さらなる説明がなくても、当業者であれば前記の記載に基づいて本発明をその完全な範囲まで利用することができると考えられる。したがって、以下の実施形態は、単なる説明目的を意図しており、いかなる方法においても開示の残余の限定ではない。
本明細書に開示するすべての特徴は、いずれの組合せで結合してもよい。本明細書に開示する各特徴は、同一、等価、または同様の目的を提供する別の特徴によって置き換えてもよい。

Claims (33)

  1. 標的遺伝子の発現を阻害するＵＮＡオリゴマーであって、該オリゴマーは第１鎖および第２鎖を含み、それぞれの鎖は１９〜２９モノマー長であり、該モノマーはＵＮＡモノマーおよび核酸モノマーを含み、ここに該オリゴマーは１４〜２９モノマー長の二本鎖構造を有し、ここに該オリゴマーは同一の標的を有するｓｉＲＮＡと比較して低下したoff-target効果を有する、オリゴマー。
  2. 第２鎖がＲＮＡ干渉のガイド鎖であり、第１鎖がＲＮＡ干渉のパッセンジャー鎖である、請求項１記載のＵＮＡオリゴマー。
  3. 該ＵＮＡオリゴマーが、第１鎖の１端の第１のポジションのＵＮＡモノマー、第１鎖の３端から最後の２つのポジションのうちの一方または両方のＵＮＡモノマー、および第２鎖の３端からの最後の２つのポジションのうちの一方または両方のＵＮＡモノマーを有する、請求項１記載のＵＮＡオリゴマー。
  4. 該ＵＮＡオリゴマーが、第１鎖の１端の第１のポジションのＵＮＡモノマー、および第１鎖の３端から最後の２つのポジションのうちの一方または両方のＵＮＡモノマーを有する、請求項１記載のＵＮＡオリゴマー。
  5. 該ＵＮＡオリゴマーが、第１鎖の１端の第１のポジションのＵＮＡモノマー、および第２鎖の３端から最後の２つのポジションの１つ以上のＵＮＡモノマーを有する、請求項１記載のＵＮＡオリゴマー。
  6. 該ＵＮＡオリゴマーが、第１鎖の１端の第１のポジションのＵＮＡモノマーを有する、請求項１記載のＵＮＡオリゴマー。
  7. ＵＮＡオリゴマーが、第１鎖の３端から最後の２つのポジションのうちの１つ以上のＵＮＡモノマー、および第２鎖の３端から最後の２つのポジションの１つ以上のＵＮＡモノマーを有する、請求項１記載のＵＮＡオリゴマー。
  8. ＵＮＡオリゴマーが１または２つのオーバーハングを有する、請求項１記載のＵＮＡオリゴマー。
  9. 該第１鎖および第２鎖が結合していて、１端にループを有する二本鎖領域を形成する、請求項１記載のＵＮＡオリゴマー。
  10. 該ＵＮＡオリゴマーが、低下したoff-target効果でＴＴＲ発現を阻害する、請求項１記載のＵＮＡオリゴマー。
  11. ＵＮＡオリゴマーが、低下したoff-target効果でアポリポタンパク質の遺伝子発現を阻害する、請求項１記載のＵＮＡオリゴマー。
  12. 該オリゴマーが、イン・ビボ(in vivo)においてＴＴＲ発現を阻害する、請求項１記載のＵＮＡオリゴマー。
  13. 該ＵＮＡオリゴマーが、低下したoff-target効果で植物における遺伝子発現を阻害することに標的化される、請求項１記載のＵＮＡオリゴマー。
  14. 塩基修飾型、糖修飾型、または結合修飾型である少なくとも１つの核酸モノマーを含む、請求項１記載のＵＮＡオリゴマー。
  15. 該オリゴマーが、配列番号：３〜３２の群から選択される配列を含む、請求項１記載のＵＮＡオリゴマー。
  16. 該オリゴマーが、第２鎖の５’端からポジション２〜８のいずれか１つ以上にＵＮＡモノマーを含む、請求項１記載のＵＮＡオリゴマー。
  17. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＵＮＡオリゴマーおよび医薬上許容される不活性成分を含む医薬組成物。
  18. 該組成物が局所または全身投与することができる、請求項１７記載の医薬組成物。
  19. 該組成物が、静脈内、皮下、肺、筋肉内、腹膜内、経皮、または経口投与することができる、請求項１７記載の医薬組成物。
  20. 脂質処方を含む、請求項１７記載の医薬組成物。
  21. カチオン性脂質、アニオン性脂質、ステロール、ペグ化脂質、およびこれらのいずれかの組合せから選択される１つ以上の脂質を含む、請求項１７記載の医薬組成物。
  22. 該組成物が実質的にリポソームを含まない、請求項１７記載の医薬組成物。
  23. 該組成物がリポソームを含む、請求項１７記載の医薬組成物。
  24. 必要とする対象に請求項１〜１６のいずれか１項に記載の有効量のＵＮＡオリゴマーを投与することを含む、ＴＴＲ−関連アミロイドーシスを治療または予防する方法。
  25. ＴＴＲ−関連アミロイドーシスがＡＴＴＲである、請求項２４記載の方法。
  26. 対象がヒトである、請求項２４記載の方法。
  27. 該方法が、対照と比較して少なくとも１０％低下したoff-target効果で対照におけるＴＴＲを低下する、請求項２４記載の方法。
  28. 該有効量が０．００１〜５０．０ｍｇ／ｋｇの用量である、請求項２４記載の方法。
  29. ＴＴＲ ｍＲＮＡ発現が少なくとも５日間低下する、請求項２４記載の方法。
  30. 該方法が、対象における末梢神経ニューロパシーまたは自律神経ニューロパシーを低下させる、請求項２４記載の方法。
  31. 請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＵＮＡオリゴマーで細胞を処理することを含む、細胞におけるＴＴＲ遺伝子の発現を阻害する方法。
  32. 哺乳動物に請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＵＮＡオリゴマーを投与することを含む、哺乳動物におけるＴＴＲ遺伝子の発現を阻害する方法。
  33. １０〜１０００塩基対の長さを有するＵＮＡオリゴマーを植物に投与することを含む、植物における遺伝子の発現を阻害する方法。
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