JP2017513515A - 多発性骨髄腫におけるＨＤＡＣｉ／ＤＮＭＴｉの組み合わせに対する応答を予測する方法 - Google Patents

多発性骨髄腫におけるＨＤＡＣｉ／ＤＮＭＴｉの組み合わせに対する応答を予測する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、多発性骨髄腫に罹患している患者が、少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤（HDACi）及び少なくとも１つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（DNMTi）からなる併用処置に応答するかどうかを試験する方法であって、ｉ）該患者から得られた生物学的サンプル中の、表Ａから選択される幾つかの遺伝子Ｇ１〜Ｇｎの発現レベル（ＥＬｉ）を決定する工程と、ii）工程ｉ）で決定した該発現レベル（ＥＬｉ）を所定の参照レベル（ＥＬＲｉ）と比較する工程と、iii）以下の式（Ｉ）（式中、βｉは、遺伝子Ｇｉの回帰β係数参照値を表し、そして、該遺伝子Ｇｉの発現（ＥＬｉ）が該所定の参照レベル（ＥＬＲｉ）よりも高い場合、Ｃｉ＝１であるか、又は該遺伝子の発現（ＥＬｉ）が該所定の参照レベル（ＥＬＲｉ）以下である場合、Ｃｉ＝−１である）を通してHADMSスコアを計算する工程と、iv）工程iii）で決定したスコアHADMSを所定の参照値HADMSＲと比較する工程と、ｖ）該HADMSスコアが該所定の参照値HADMSＲよりも高いとき、該患者が該併用処置に応答すると結論付けるか、又は該HADMSスコアが該所定の参照値HADMSＲよりも低いとき、該患者が該併用処置に応答しないと結論付ける工程とを含む方法に関する。

Description

本発明は、多発性骨髄腫処置応答を予測する方法に関する。
発明の背景：
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、骨髄における悪性形質細胞（ＭＭＣ）の蓄積を特徴とする非常に致死率の高い新形成である。ＭＭにおけるＤＮＡのメチル化のプロファイルは、ゲノムグローバルな低メチル化と同時に、公知の又は潜在的な腫瘍抑制遺伝子のプロモータの高メチル化を含む（Heuck, 2013；Walker, 2010）。近年、幾つかの潜在的な抑制遺伝子の高メチル化が、著しく短い全生存期間に関連していることが立証された（Heuck, 2013）。
デシタビン（５−アザ−２’−デオキシシチジン）又は５−アザシチジンは、いずれも、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を処置するために臨床的に使用されているＤＮＭＴ阻害剤である（Hollenbach, 2010）。ＭＭでは、単剤療法として又はレナリドミド若しくはデキサメタゾンと併用する、DNMTiの臨床試験が進行中である（Maes, 2013）。ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、ＭＭを含む様々な癌を処置するための分子標的でもある（Feng, 2008; Khan, 2004；Lavelle, 2001；Mitsiades, 2004；Mitsiades, 2003；Catley, 2003；Kaiser, 2006；Neri, 2012；Neri, 2008；Minami, 2013；Hideshima, 2013）。ロミデプシン及びボリノスタット（ＳＡＨＡ）は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫の処置について食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されており（Zhang, 2009）、そして、幾つかのHDACiは、ＭＭにおいて臨床試験で評価されている（Maes, 2013；Neri, 2012）。プロテアソーム阻害が、ユビキチン化タンパク質の蓄積を導き、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）に影響を与え、そして、ＨＤＡＣが媒介するアグリソーム（aggregosome）の形成を増加させることは、HDACiとボルテゾミブとの組み合わせがＭＭにおいて有望であり得ることを示した（Richardson, 2013；San-Miguel, 2013）。パノビノスタット／ボルテゾミブ／デキサメタゾン（PANORAMA）及びボリノスタット／ボルテゾミブ（VANTAGE 088）の組み合わせは、２つの大規模第III相臨床試験が始まっている（Richardson, 2013；Dimopoulos, 2013）。VANTAGE 088の試験結果は、再発性又は不応性のＭＭ患者において、ボリノスタット及びボルテゾミブの組み合わせが、ボルテゾミブ及びプラセボと比べて無増悪生存期間を著しく延長することを示した（Dimopoulos, 2013）。しかし、この組み合わせは、毒性に関連しているので、耐容性を増大させ、そして、有効性を強化するために、新規処置スケジュールを検討しなければならない（Dimopoulos, 2013）。
HDACi及びDNMTiによる処置は、ＭＭにおいて免疫療法の魅力的な標的であるMAGE-A3を誘導することができ、そして、MAGE-A3特異的細胞傷害性Ｔリンパ球による殺傷を促進することができる（Moreno-Bost, 2011）。近年、Matthewsらは、Vk*MYCトランスジェニックＭＭマウスモデルを用いて、インビボで、HDACiとBH3-only模倣剤（ABT-737）、組み換えヒトＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（rhTRAIL）、又は５−アザシチジンとの組み合わせの潜在力について研究した（Matthews, 2013）。HADCi/rhTRAIL又はHDACi/ABT-737の組み合わせは、インビボにおいて重大な薬剤誘導毒性に関連している。対照的に、HDACi及びDNMTiは、毒性を示すことなく、インビボにおける腫瘍量の著しい低減及びマウスの生存期間の延長を示した（Matthews, 2013）。固形癌又は進行血液学的悪性疾患の患者では、HDACi及びDNMTiの組み合わせは、良好な耐容性を示し（Bots, 2009）、そして、ＭＳＤ、ＡＭＬ（Bots, 2009；Fandy, 2009；Zhang, 2009）、及び不応性進行非小細胞肺癌（Juergens, 2011）における有望な活性を示唆した。同時に、これら知見は、DNMTi及びHDACi処置が異常な腫瘍特異的エピジェネティックプログラムを標的とすることは、ＭＭにおいて処置的関心を持たれるであろうということを示唆する。しかし、エピジェネティック療法に対するＭＭＣの感受性を予測するバイオマーカーの同定は、依然として臨床試験を改善するための重要な目標である。本発明者らは、最近、DNMTi（Moreaux, 2013；Moreaux, 2012）及びHDACi（Moreaux, 2013）に対するＭＭＣの感受性を予測するための、遺伝子発現（ＧＥＰ）に基づくリスクスコアを報告した。HDACi及びDNMTiの組み合わせは、ＭＭにおいて潜在的な処置的価値を有するので、本発明者らは、エピジェネティックを標的とする組み合わせの試験を実施するのに有用であり得るＧＥＰに基づくスコアを構築するために研究を行った。
HDACi及びDNMTiの組み合わせに対するＭＭＣの感受性を予測するバイオマーカーの同定は、これら臨床試験を最適化するための重要な目標である。本発明において、本発明者らは、少なくとも１つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（DNMTi）及び少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤（HDACi）からなる併用処置が標的とするＭＭＣを有する患者の同定を可能にする、新規「HDACi／DNMTiスコア」又は「HADMS」を構築するために、多発性骨髄腫細胞（ＭＭＣ）の遺伝子発現プロファイリングを使用した。
発明の概要：
本発明は、多発性骨髄腫に罹患している患者が、少なくとも１つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（DNMTi）及び少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤（HDACi）からなる併用処置に応答するかどうかを試験する方法に関する。
発明を実施するための形態：
本発明者らは、患者のヒストンデアセチラーゼ阻害剤（HDACi）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（DNMTi）、ヒト多発性骨髄腫細胞株（ＨＭＣＬ）、及び初代多発性骨髄腫細胞を用いて、多発性骨髄腫処置応答について調べた。
デシタビン及びＴＳＡ処置によって、３７５個の遺伝子が著しくアップレギュレートされた。該３７５個の遺伝子の中でも、２０６人の新たに診断された患者のコホート（ＨＭコホート）において、ヒストンアセチル化／ＤＮＡメチル化スコア（ＨＡＤＭスコア又はHADMS）を構築する９６個の遺伝子は、予後不良値に関連している４２個の遺伝子と、予後良好に関連している５４個の遺伝子とを含む。全生存期間についてのmaxstat解析を用いると、ＨＡＤＭスコアは、２つの独立した患者のコホートであるＨＭ及びUAMS-TT2において高リスク骨髄腫と有意に関連していた。本発明者らは、少なくとも１つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（DNMTi）及び少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤（HDACi）からなる併用処置に対する骨髄腫細胞の感受性を予測するための、新規遺伝子発現に基づくスコアを報告した。ＨＡＤＭスコアによって、少なくとも１つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（DNMTi）及び少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤（HDACi）からなる併用処置に対して感受性の高いＭＭＣを有する高リスク患者を同定することができ、これは、エピジェネティック療法の組み合わせによって恩恵を受けることができる患者の同定において有用である。
定義
用語「患者」は、哺乳類を意味する。本発明の好ましい実施態様では、患者は、多発性骨髄腫に罹患している任意の患者（好ましくは、ヒト）を指す。用語「多発性骨髄腫」とは、世界保健機関分類Ｃ９０において改訂されたもの等の多発性骨髄腫を指す。
用語「ヒストンデアセチラーゼ阻害剤」又は「HDACi」は、当技術分野において一般的な意味を有し、そして、多発性骨髄腫の処置法を指す。用語「ヒストンデアセチラーゼ阻害剤」又は「HDACi」は、ヒドロキサマート（パノビノスタット（LBH-589）、トリコスタチン−Ａ（ＴＳＡ）、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、ベリノスタット（PXD101）、NVP-LAQ824、及びギビノスタット（ITF2357））、環状ペプチド（ロミデプシン（デプシペプチド））、脂肪族系酸（バルプロ酸（ＶＰＡ）及びフェニル酪酸ナトリウム）、及びベンズアミド（MS-275、MGCD0103）の４つの分類に分けることができるヒストンデアセチラーゼ阻害剤を指す（１０）。HDACiは、クラスＩ特異的ＨＤＡＣ阻害剤（MGCD0103、ロミデプシン及びMS-275）又はクラスＩ及びIIの両ＨＤＡＣに対して活性を示すｐａｎ−ＨＤＡＣ阻害剤（ＴＳＡ、パノビノスタット、ボリノスタット、及びベリノスタット）として特徴付けられる（１０）。
用語「ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤」又は「DNMTi」は、当技術分野において一般的な意味を有し、そして、多発性骨髄腫の処置法を指す。用語「ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤」又は「DNMTi」は、ヌクレオシドアナログ（５−アザシチジン（アザシチジン）、５−アザ−２’−デオキシシチジン（デシタビン、５−アザ−ＣｄＲ）、ゼブラリン、５−フルオロ−２’−デオキシシチジン（５−Ｆ−ＣｄＲ）、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン（ＤＨＡＣ））、及び非ヌクレオシドアナログファミリー（ヒドララジン、プロカインアミド、プロカイン、ＥＧＣＧ（（−）−エピガロカテキン−３−ガラート）、プサムマプリンＡ、ＭＧ９８、ＲＧ１０８）に更に分類することができるＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤を指す（８）。
用語「生物学的サンプル」とは、多発性骨髄腫細胞、骨髄、又は髄質細胞を指す。
本発明に関する全ての遺伝子は、それ自体公知であり、そして、以下の表Ａに列挙される。
応答を予測する方法
本発明は、多発性骨髄腫に罹患している患者が、少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤（HDACi）及び少なくとも１つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（DNMTi）からなる併用処置に応答するかどうかを試験する方法であって、
ｉ）前記患者から得られた生物学的サンプル中の、表Ａから選択される幾つかの遺伝子Ｇ１〜Ｇｎの発現レベル（ＥＬｉ）を決定する工程と、
ii）工程ｉ）で決定した発現レベル（ＥＬｉ）を所定の参照レベル（ＥＬＲｉ）と比較する工程と、
iii）以下の式

（式中、βｉは、遺伝子Ｇｉの回帰β係数参照値を表し、そして、該遺伝子Ｇｉの発現（ＥＬｉ）が該所定の参照レベル（ＥＬＲｉ）よりも高い場合、Ｃｉ＝１であるか、又は該遺伝子の発現（ＥＬｉ）が該所定の参照レベル（ＥＬＲｉ）以下である場合、Ｃｉ＝−１である）
を通してHADMSスコアを計算する工程と、
iv）工程iii）で決定したスコアHADMSを所定の参照値HADMSＲと比較する工程と、
ｖ）該HADMSスコアが該所定の参照値HADMSＲよりも高いとき、該患者が該併用処置に応答すると結論付けるか、又は該HADMSスコアが該所定の参照値HADMSＲよりも低いとき、該患者が該併用処置に応答しないと結論付ける工程と
を含む方法に関する。
幾つかの実施態様では、表Ａ中の少なくとも４２個の遺伝子の発現レベルを決定し、該遺伝子は、以下の通りである。
幾つかの実施態様では、表Ａ中の４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、又は９６個の遺伝子の発現レベルを決定し、遺伝子の全ての組み合わせが、

からなる４２個の遺伝子の最小セットを含む。
幾つかの実施態様では、表Ａの９６個の遺伝子の発現レベルを決定する。
遺伝子の発現レベルは、様々な技術によって決定することができる。一般的には、決定される発現レベルは、相対発現レベルである。より好ましくは、該決定は、生物学的サンプルをプローブ、プライマー、若しくはリガンド等の選択的試薬と接触させて、該生物学的サンプル中に元々存在する、対象となるポリペプチド若しくは核酸の存在を検出するか又は量を測定することを含む。該接触は、プレート、マイクロタイター皿、試験管、ウェル、グラス、カラム等の任意の好適な装置において実施してよい。具体的な実施態様では、該接触は、核酸アレイ又は特異的リガンドアレイ等の、試薬でコーティングされた基材において実施される。該基材は、ガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマー等を含む任意の好適な支持体等の固体又は半固体の基材であってよい。該基材は、スライドガラス、メンブレン、ビーズ、カラム、ゲル等の様々な形態及びサイズであってよい。該接触は、該試薬と生物学的サンプルの核酸又はポリペプチドとの間で形成される、核酸ハイブリッド又は抗体−抗原複合体等の検出可能な複合体に適した任意の条件下で行ってよい。
好ましい実施態様では、発現レベルは、ｍＲＮＡの量を決定することによって決定してよい。
ｍＲＮＡの量を決定する方法は、当技術分野において周知である。例えば、まず、生物学的サンプルに含有されている核酸を、標準的な方法に従って、例えば、溶解酵素若しくは化学溶液を用いて抽出するか、又は製造業者の説明書に従って核酸結合樹脂によって抽出する。次いで、抽出されたｍＲＮＡをハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロット解析）及び／又は増幅（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出する。好ましくは、定量又は半定量ＲＴ−ＰＣＲが好ましい。リアルタイム定量又は半定量ＲＴ−ＰＣＲが、特に有利である。
増幅の他の方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、及び核酸配列ベース増幅（NASBA）を含む。
少なくとも１０個のヌクレオチドを有し、かつ本明細書において対象となるｍＲＮＡに対して配列相補性又は相同性を示す核酸は、ハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーとして利用される。このような核酸は同一である必要はないが、典型的には、同程度のサイズの相同な領域に対して少なくとも約８０％、より好ましくは８５％、そして、更により好ましくは９０〜９５％同一であると理解される。特定の実施態様では、ハイブリダイゼーションを検出するために、検出可能なラベル等の適切な手段と組み合わせて核酸を使用することが有利である。蛍光リガンド、放射性リガンド、酵素リガンド、又は他のリガンド（例えば、アビジン／ビオチン）を含む広範な適切な指示薬が当技術分野において公知である。
プローブは、典型的には、１０〜１０００、例えば、１０〜８００、より好ましくは１５〜７００、典型的には２０〜５００ヌクレオチド長の一本鎖核酸を含む。プライマーは、典型的には、増幅される対象となる核酸と完全に又はほぼ完全に一致するように設計された１０〜２５ヌクレオチド長のより短い一本鎖核酸である。プローブ及びプライマーは、これらがハイブリダイズする核酸に対して「特異的」であり、すなわち、好ましくは、ストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーション条件（最高融解温度Ｔｍに対応、例えば、５０％ ホルムアミド、５×又は６×ＳＣＣ、ＳＣＣは、０．１５M ＮａＣｌ、０．０１５M クエン酸ナトリウムである）下でハイブリダイズする。
上記増幅及び検出法で用いられる核酸のプライマー又はプローブは、キットにしてもよい。このようなキットは、コンセンサスプライマー及び分子プローブを含む。また、好ましいキットは、増幅が生じたかどうかを決定するために必要な構成要素を含む。また、該キットは、例えば、ＰＣＲバッファ及び酵素；ポジティブコントロール配列、反応コントロールプライマー；並びに特定の配列を増幅及び検出するための説明書を含んでもよい。
具体的な実施態様では、本発明の方法は、生物学的サンプルから抽出した全ＲＮＡを提供する工程と、該ＲＮＡを増幅及び特異的プローブへのハイブリダイゼーションに供する工程であって、より具体的には、定量又は半定量ＲＴ−ＰＣＲを用いる工程とを含む。
別の好ましい実施態様では、発現レベルは、ＤＮＡチップ解析によって決定される。このようなＤＮＡチップ又は核酸マイクロアレイは、マイクロチップ、スライドガラス、又はミクロスフィアサイズのビーズであってよい基材に化学的に結合する様々な核酸プローブからなる。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカ又はシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、又はニトロセルロースで構成され得る。プローブは、約１０〜約６０塩基対であってよいｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチド等の核酸を含む。発現レベルを決定するためには、試験患者由来の生物学的サンプルを、任意でまず逆転写に供し、標識し、そして、ハイブリダイゼーション条件でマイクロアレイと接触させて、マイクロアレイ表面に結合しているプローブ配列に対して相補的な標的核酸との間に複合体を形成させる。次いで、標識されているハイブリダイズ複合体を検出し、そして、定量又は半定量してよい。標識は、例えば、放射性標識又は蛍光標識を用いる等、様々な方法によって行うことができる。当業者であれば、マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの変法を利用可能である（例えば、Hoheisel, Nature Reviews, Genetics, 2006, 7:200-210の総説を参照）。
この状況において、本発明は、更に、表Ａに列挙した遺伝子に対して特異的な核酸を担持する固体支持体を含むＤＮＡチップを提供する。
比較のために用いられる所定の参照値ＥＬＲｉ又はHADMSＲは、「カットオフ」値からなっていてよい。
例えば、各遺伝子についての各参照（「カットオフ」）値ＥＬＲｉは、以下の工程を含む方法を実施することによって決定することができる：
ａ）多発性骨髄腫に罹患している患者由来のサンプルの回収物を提供する工程；
ｂ）工程ａ）で提供された回収物に含有されている各サンプルについて、関連遺伝子の発現レベルを決定する工程；
ｃ）該発現レベルに従って該サンプルをランク付けする工程；
ｄ）発現レベルに従ってランク付けされた増加する、それぞれ、減少する数のメンバーのサブセットの対に該サンプルを分類する工程；
ｅ）工程ａ）で提供された各サンプルについて、対応する癌患者の実際の臨床転帰に関連する情報（すなわち、無病生存期間（ＤＦＳ）、又は無再発生存期間（ＥＦＳ）、又は全生存期間（ＯＳ）又は両方）を提供する工程；
ｆ）腫瘍組織サンプルのサブセットの各対について、生存曲線のカプラン・マイヤー百分率を得る工程；
ｇ）腫瘍組織サンプルのサブセットの各対について、両サブセット間の統計的有意性（ｐ値）を計算する工程；
ｈ）該ｐ値が最小になる発現レベルの値である、該発現レベルについての参照値ＥＬＲを選択する工程。
例えば、１００人の患者の１００個のサンプルについて遺伝子Ｇｉの発現レベルを評価した。１００個のサンプルを遺伝子Ｇｉの発現レベルに従ってランク付けする。サンプル１は、最高発現レベルを有し、そして、サンプル１００は、最低発現レベルを有する。最初のグループ分けでは、一方がサンプルＮｒ１であり、そして、他方が９９個の他のサンプルである２つのサブセットを提供する。次のグループ分けでは、一方がサンプル１及び２であり、そして、他方が９８個の残りのサンプルであり、一方がサンプル１〜９９であり、そして、他方がサンプルＮｒ１００である最後のグループ分けまで行う。対応する癌患者についての実際の臨床転帰に関する情報に従って、２つのサブセットの９９個のグループのそれぞれについてカプランメイヤー曲線を作成する。また、９９個のグループのそれぞれについて、両サブセット間のｐ値を計算した。次いで、最小ｐ値が最も強いという基準に基づく識別等、参照値ＥＬＲｉを選択する。言い換えれば、ｐ値が最小である両サブセット間の境界に対応する発現レベルを参照値とみなす。本発明者らが行った実験によれば、参照値ＥＬＲｉは、必ずしも、発現レベルの中央値ではないことに留意すべきである。
また、当業者であれば、参照値を得、そして、その後、本発明の併用処置に対する応答を評価するために、HADMSＲの評価と同じ技術を用いることができると理解する。しかし、１つの実施態様では、参照値HADMSＲは、HADMSの中央値である。
１つの実施態様では、遺伝子Ｇｉについての参照値ＥＬＲｉを表Ａに記載する（右の列）。
回帰β係数の参照値は、Ｃｏｘモデルを用いて各遺伝子Ｇｉについて当業者が容易に決定することができる。Ｃｏｘモデルは、生存期間データの解析に対するモデリングアプローチに基づく。該モデルの目的は、生存期間に対する幾つかの変数の効果を同時に調べることである。Ｃｏｘモデルは、生存期間データを解析するための十分に認められている統計的手法である。臨床試験において患者の生存期間を解析するために用いられる場合、該モデルによって、他の変数の効果から処置の効果を分離することができる。ログランク検定は、生存期間に影響を与えることが知られている、年齢及び罹病期間等の幾つかの変数の効果を調べる（そして、調整する）ために用いることはできない。生存期間に影響を与えることが知られている変数の調整は、処置の効果を推定することができる精度を改善することができる。Ｃｏｘによって導入される回帰法は、一度に幾つかの変数を調べるために用いられる。また、比例ハザード回帰分析としても知られている。簡潔に述べると、この手順は、説明変数に対する生存期間（又はより具体的には、いわゆるハザード関数）をモデル化するか又は回帰させる。ハザード関数は、個体が間隔の開始時まで生存していたと仮定して、個体が短い時間間隔内に事象（例えば、死亡）を経験する確率である。したがって、時間ｔにおける死亡のリスクとして解釈することができる。量ｈ０（ｔ）は、ベースラインであるか又は根底にあるハザード関数であり、そして、全ての説明変数がゼロであるときの死亡の（又は事象に達する）確率に対応する。ベースラインハザード関数は、通常の回帰における切片に類似している（ｅｘｐ０＝１から）。回帰係数βは、説明変数の変化に関連する、ハザードにおいて予測することができる比例変化を与える。係数βは、最大尤度と呼ばれる統計的方法によって推定される。生存期間解析では、ハザード比（ＨＲ）（ハザード比＝ｅｘｐ（β））は、説明変数の２つのセットによって記載される条件に対応するハザード率の比である。例えば、薬物研究では、処置した集団は、単位時間当たりコントロール集団の２倍の割合で死亡し得る。ハザード比は、２になり、これは、処置に起因する死亡のハザードがより高いことを示す。
１つの実施態様では、回帰β係数の参照値を表Ａに記載する。
典型的には、多発性骨髄腫に罹患している患者が本発明の併用処置に応答するかどうかを決定するため、及び多発性骨髄腫に罹患している患者の生存期間を予測するための参照値HADMSＲは、−２１．５７である。
また、本発明は、上記方法を実施するためのキットであって、表Ａに列挙する遺伝子の発現レベルを測定するための手段を含むキットに関する。典型的には、該キットは、上記の通り、プライマー、プライマーセット、プローブ、プローブセットを含んでよい。具体的な実施態様では、該プローブ又は該プローブセットは、上記の通り標識される。また、該キットは、固相マトリクス、そして、該当する場合、標準物質を含む、特定の検出プロトコールに必要な他の好適に包装された試薬及び物質を含有してもよい。
具体的な実施態様では、前記スコアをコンピュータプログラムによって得てもよい。
処置の方法
本発明の方法によって、少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤及び少なくとも１つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤からなる併用処置による処置に対して応答するか（「応答者」）又は応答しない（「非応答者」）患者のサブグループを規定することができる。
本発明の更なる目的は、それを必要としている患者において多発性骨髄腫を処置する方法に関する。
本発明の状況では、用語「処置する」又は「処置」とは、本明細書で使用するとき、このような用語が適用される疾患若しくは病態、又はこのような疾患若しくは病態の１つ以上の症状を正常に戻す、軽減する、進行を阻害する、又は予防することを意味する。
具体的な実施態様では、該方法は、以下の工程を含む：
ａ）本発明に係る方法を実施することによって、患者が本発明の併用処置に応答するかどうかを試験する工程、
ｂ）HADMSスコアが参照値HADMSＲよりも高い（すなわち、患者が、少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤及び少なくとも１つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤からなる併用処置に対して応答する）とき、本発明の併用処置を投与する工程。
本発明の更なる目的は、上記方法によって応答者に分類された、それを必要としている患者における多発性骨髄腫の処置において使用するための、少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤及び少なくとも１つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤からなる併用処置に関する。
本発明の更なる目的は、上記方法によって応答者に分類された、それを必要としている患者における多発性骨髄腫の処置において使用するための、トリコスタチン−Ａ（ＴＳＡ）又はボリノスタット（ＳＡＨＡ）、及びデシタビン（５−アザ−２’−デオキシシチジン）又は５−アザシチジンからなる併用処置に関する。
以下の図面及び実施例によって本発明を更に説明する。しかし、これら実施例及び図面は、いかなる方法によっても、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
２０６人の未処置患者の骨髄腫細胞におけるHADMSスコアを構築するために用いた９６個の遺伝子のシグナルのクラスタグラム。HADMSスコアが増加する順に並べられた２０６人の患者のＭＭＣにおける９６のプローブセットのシグナルを、低（濃い青色）発現から高（濃い赤色）発現へと表示する。 正常及び悪性の形質細胞におけるHADMSスコア。正常骨髄形質細胞（ｎ＝７）、意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症患者の前悪性形質細胞（ＭＧＵＳ、ｎ＝５）、髄内ＭＭ患者の多発性骨髄腫細胞（ｎ＝２０６）、及びヒト骨髄腫細胞株（ｎ＝４０）におけるHADMSスコア。 多発性骨髄腫におけるHADMSスコアの予後値。（Ａ）ＨＭコホートの患者を、HADMSスコアの増加に従ってランク付けしたところ、ＯＳにおける最大差は、患者を高リスク（２３．７％）群及び低リスク（７６．３％）群に分けるＨＡＤＭＳスコア＝−２１．５７で得られた。HADMSスコアの予後値を、ＴＴ２療法で処置されたＵＡＭＳからの３４５人の患者の独立コホートを用いて検証した（UAMS-TT2コホート）。UAMS-TT2コホートの患者のHADMSスコア及び２つの予後群を線引きする比率を計算するためのパラメータは、ＨＭコホートで規定したものであった。（Ｂ）また、HADMSスコアは、ＨＭコホート及びUAMS-TT2コホートにおける無再発生存期間（ＥＦＳ）を予測することもできた。 多発性骨髄腫におけるHADMSスコアの予後値。（Ａ）ＨＭコホートの患者を、HADMSスコアの増加に従ってランク付けしたところ、ＯＳにおける最大差は、患者を高リスク（２３．７％）群及び低リスク（７６．３％）群に分けるＨＡＤＭＳスコア＝−２１．５７で得られた。HADMSスコアの予後値を、ＴＴ２療法で処置されたＵＡＭＳからの３４５人の患者の独立コホートを用いて検証した（UAMS-TT2コホート）。UAMS-TT2コホートの患者のHADMSスコア及び２つの予後群を線引きする比率を計算するためのパラメータは、ＨＭコホートで規定したものであった。（Ｂ）また、HADMSスコアは、ＨＭコホート及びUAMS-TT2コホートにおける無再発生存期間（ＥＦＳ）を予測することもできた。 HADMSスコアは、HDACi／DNMTi併用処理に対する患者の初代骨髄腫細胞の感受性を予測する。（Ａ）１０人のＭＭ患者の腫瘍サンプル由来の単核細胞を、段階的な濃度のデシタビン及びＴＳＡの有り無しで、ＩＬ−６（２ng/mL）の存在下、４日間培養した。培養の４日目に、フローサイトメトリーを用いて生存ＣＤ１３８＋ＭＭＣ数を決定した。灰色のカラムは、低HADMSスコアを有する５人の患者の初代骨髄腫細胞数の平均±ＳＤを表し（薬物を添加していない数の百分率として表す）、そして、白色のカラムは、高HADMSスコアを有する５人の患者の初代骨髄腫細胞数の平均±ＳＤを表す。（Ｂ）１２人の骨髄腫患者のサンプルを用いて５−アザシチジン及びＳＡＨＡの組み合わせについても調べた。灰色のカラムは、低HADMSスコアを有する７人の患者の初代骨髄腫細胞数の平均±ＳＤを表し（薬物を添加していない数の百分率として表す）、そして、白色のカラムは、高HADMSスコアを有する５人の患者の初代骨髄腫細胞数の平均±ＳＤを表す。 正常形質細胞の分化におけるHADMSスコア。正常記憶Ｂ細胞（ＭＢ、ｎ＝５）、正常前駆形質芽球（PrePB、ｎ＝５）、正常形質芽球（ＰＢ、ｎ＝５）、正常早期形質細胞（Early PC、ｎ＝５）、正常骨髄形質細胞（ｎ＝７）、意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症患者の前悪性形質細胞（ＭＧＵＳ、ｎ＝５）、髄内ＭＭ患者の多発性骨髄腫細胞（ｎ＝２０６）、及びヒト骨髄腫細胞株（ｎ＝４０）におけるHADMSスコア。 UAMS-TT2コホートを用いた患者のＭＭＣにおけるHADMS。UAMS-TT2コホートを用いて、多発性骨髄腫のＵＡＭＳ分子分類の８つの群に属する患者のＭＭＣについて、HADMSスコアを計算した。ＰＲ：増殖、ＬＢ：低骨疾患、ＭＳ：ＭＭＳＥＴ、ＨＹ：高二倍体、ＣＤ１：サイクリンＤ１、ＣＤ２：サイクリンＤ２、ＭＦ：ＭＡＦ、ＭＹ：骨髄。＊は、コホートの全患者に比べて、この群におけるスコア値が有意に高いことを示す（Ｐ＜．０５）。＊＊は、コホートの全患者に比べて、この群におけるスコア値が有意に低いことを示す（Ｐ＜．０５）。
実施例
材料及び方法
ヒト骨髄腫細胞株（ＨＭＣＬ）及び患者の初代多発性骨髄腫細胞。
ヒト骨髄腫細胞株ＨＭＣＬ、Ｎ＝４０は、既に記載した通り入手した（Gu, 2000；Moreaux, 2011；Rebouissou, 1998；Tarte, 1999；Zhang, 1994）か、又はDSMZ及びAmerican Type Culture Collectionから購入した。マイクロアレイのデータは、ArrayExpress公開データベースに寄託する（アクセッション番号E-TABM-937及びE-TABM-1088）。ハイデルベルク及びモンペリエの大学病院における未処置多発性骨髄腫患者（Ｎ＝２０６）又は意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症患者（Ｎ＝５）に加えて、７人の健常ドナーが、ヘルシンキ宣言に従った書面によるインフォームド・コンセント後にモンペリエ及びハイデルベルクの倫理委員会によって承認された試験に含まれていた。ハイデルベルク−モンペリエ（ＨＭ）コホートに含まれているＭＭ患者の臨床パラメータ及び処置レジメンは、既に記載されていた（Hose, 2011）。精製ＭＭＣの遺伝子発現プロファイリング（ＧＥＰ）を、記載の通り（De Vos, 2002）、Affymetrix U133 2.0 plusマイクロアレイ（Affymetrix, Santa Clara, CA, USA）を用いてアッセイし、そして、MAS5 Affymetrixアルゴリズムを用いてデータを正規化した。.CEL及びMAS5ファイルを、アクセッション番号E-MTAB-362としてArrayExpress公開データベース（http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/）に寄託する。また、アーカンソー医科大学（UAMS, Little Rock, USA)においてトータルセラピー２プロトコールで処置した３４５人の患者のコホート（UAMS-TT2コホート）の精製ＭＭＣ由来の公的に入手可能なＭＡＳ５正規化ＧＥＰデータ（GEO、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/、アクセッション番号GSE2658）も用いた（Barlogie, 2006）。UAMS-TT2患者について、ＭＭＳＥＴスパイク発現（Kassambara, 2012）及びＴＰ５３プローブセットシグナルによってサロゲートされるdel17p13を用いてＴ（４；１４）転座を評価した。正常記憶Ｂ細胞（ＭＢ）、前駆形質芽球、形質芽球、及び早期形質細胞の遺伝子発現データ（Jourdan, 2009；Jourdan, 2011）は、アクセッション番号E-MEXP-2360及びE-MEXP-3034としてArrayExpressデータベースに寄託する。
HDACi＋DNMTiの組み合わせによって調節解除される遺伝子の同定。
５つのＨＭＣＬ（ＸＧ−５、ＸＧ−６、ＸＧ−７、ＸＧ−２０、及びＬＰ１）を、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＬ−６依存性ＨＭＣＬについてはＩＬ−６を添加した１０％ ウシ胎児血清中で７日間、０．５μmol/L デシタビン（Sigma, St Louis, MO）で処理した。最後の２４時間の間、Hellerらが記載した通り(Heller, 2008)、０．３３μmol/L ＴＳＡ（Sigma）を添加した。全ゲノムの遺伝子発現プロファイリングを、Affymetrix U133 2.0 plusマイクロアレイ（Affymetrix）を用いてアッセイした。
HDACi＋DNMTiの組み合わせに対する初代骨髄腫細胞の感受性。
１０人の患者の初代骨髄腫細胞を、段階的な濃度のデシタビン及びＴＳＡの有り無しで培養した。１２人の患者の初代骨髄腫細胞を、段階的な濃度の５−アザシチジン（Sigma）及びボリノスタット（ＳＡＨＡ）（Sigma）の有り無しで培養した。記載の通り（Mahtouk, 2004；Moreaux, 2012）、抗CD138-PE mAb（Immunotech, Marseille, France）を用いてＭＭＣの細胞毒性を評価した。GraphPad Prism（http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/）を用いて結果を解析した。
統計解析
公開されている通り（Kassambara, 2012）、SAM (Significance Analysis of Microarrays)ソフトウェア（Cui, 2003）を用いて遺伝子発現データを解析した。患者の群間の全生存期間の差の統計的有意性をログランク検定によって計算した。Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いて多変量解析を実施した。カプラン・マイヤー法を用いて生存曲線をプロットした。これら解析は全て、R.2.10.1（http://www.r-project.org/）及びbioconductorバージョン2.5を用いて実施した。デシタビン／ＴＳＡの組み合わせで調節解除された予後遺伝子により、本発明者らが既に公開している方法論を用いて、ヒストンアセチル化／ＤＮＡメチル化リスクスコア（HADMSスコアと命名）を構築した（Moreaux, 2012；Moreaux, 2013）。簡潔に述べると、患者のＭＭＣシグナルがprobeset maxstat値を上回るか又は下回るかに従って±１重み付けした、デシタビン／ＴＳＡの組み合わせで調節解除された各遺伝子のＣｏｘモデルベータ係数と予後値との合計としてHADMSスコアを構築した（Kassambara, 2012；Moreaux, 2012；Moreaux, 2013）。Reactome機能的相互作用マップを用いて、有意にエンリッチされた経路を同定した。Broad Instituteから得られた標準経路及びジーンオントロジー遺伝子セットとの重複を計算することによって、遺伝子セットエンリッチメント解析を実施した（Subramanian, 2005）。
結果
発現がデシタビン及びトリコスタチンＡの組み合わせによって調節解除され、そして、多発性骨髄腫における予後値に関連している遺伝子の同定。
遺伝子発現マイクロアレイを用いて、本発明者らは、デシタビン及びＴＳＡの組み合わせの亜致死（表１）処理後の５つのＨＭＣＬにおける遺伝子発現の変化を解析した（Heller, 2008）。デシタビン及びＴＳＡ処理によって、３７５個の遺伝子が有意にアップレギュレートされた（ＳＡＭ教師つき対応あり解析、ＦＤＲ＜５％；表２）。REACTOME解析によって、インターフェロンシグナル伝達（Ｐ＜０．０００１；ＦＤＲ＝１Ｅ−３）、細胞接着分子（Ｐ＜０．０００１；ＦＤＲ＝１．６Ｅ−４）、抗原の処理及び提示（Ｐ＜０．０００１；ＦＤＲ＝７．６Ｅ−５）、及びＥＧＦ受容体シグナル伝達（Ｐ＝０．０００４；ＦＤＲ＝４．３Ｅ−３）経路に関連する遺伝子において、デシタビン／ＴＳＡによって調節される遺伝子が有意にエンリッチされることが明らかになった（表３）。ＭＭの病態生理における重要な機能に関連しているＨＤＡＣ及びＤＮＭＴによって調節解除される遺伝子を同定するために、本発明者らは、Maxstat R関数及びBenjamini-Hochberg複合試験補正を用いて、発現が予後値に関連している、デシタビン及びＴＳＡ処理によって調節解除される遺伝子について調べた（Kassambara, 2012）。３７５個の遺伝子の中でも、２０６人の新たに診断された患者のコホート（ＨＭコホート）において、４２個の遺伝子は、予後不良値を有し、そして、５４個は、予後良好値を有していた（表Ａ）。デシタビン及びＴＳＡの組み合わせによって調節される遺伝子の予後情報を、材料及び方法の部分に記載した通り、HADMSスコアで収集した（図１）。正常、前悪性、又は悪性の形質細胞におけるHADMSスコア値を図２に示す。HADMSスコア値は、正常ＢＭＰＣと比べてＭＧＵＳ患者由来のＭＭＣにおいて有意に高かった（Ｐ＝０．００９；図２）。患者のＭＭＣは、ＭＧＵＳ患者由来の形質細胞よりも有意に高いHADMSスコアを有しており（Ｐ＝０．００３）、そして、ＨＭＣＬは、最も高いスコアを有していた（Ｐ＜０．００１）（図２）。多発性骨髄腫の分子分類の８個の群におけるHADMSスコアを調べると、HADMSスコアは、増殖、ｔ（４；１４）、及び高二倍体のサブグループにおいて有意に高く（それぞれ、Ｐ＜０．００１；Ｐ＝０．００１、及びＰ＜０．００１）、そして、低骨疾患及びＣＤ２のサブグループにおいて有意に低かった（Ｐ＝０．００２及びＰ＜０．００１）（Zhan, 2006）（図６）。

表１：０．５μM デシタビンで７日間及び０．３３μMで最後の２４時間処理したＨＭＣＬの細胞生存率。データは、トリパンブルー排除によって評価した生存細胞の平均率±ＳＤである（３回の実験）。

表２：デシタビン／ＴＳＡで処理したＨＭＣＬにおいて高発現した遺伝子。５つのＨＭＣＬを、７日間０．５μM デシタビンの有り無しで、そして、最後の２４時間０．３３μM ＴＳＡの有り無しで培養した。Affymetrix U133 plus 2.0マイクロアレイを用いて遺伝子発現をプロファイリングした。コントロールとデシタビン＋ＴＳＡで処理した細胞との間で発現が著しく異なる遺伝子を、偽発見率５％のＳＡＭ教師つき対応あり解析を用いて同定した。

表３：REACTOME解析によって、インターフェロンシグナル伝達（Ｐ＜０．０００１；ＦＤＲ＝１Ｅ−３）、細胞接着分子（Ｐ＜０．０００１；ＦＤＲ＝１．６Ｅ−４）、抗原の処理及び提示（Ｐ＜０．０００１；ＦＤＲ＝７．６Ｅ−５）、及びＥＧＦ受容体シグナル伝達（Ｐ＝０．０００４；ＦＤＲ＝４．３Ｅ−３）経路に関連する遺伝子において、デシタビン／ＴＳＡによって調節される遺伝子が有意にエンリッチされていることが明らかになった。
２つの独立した患者のコホートにおけるHADMSスコアの予後的意義の評価。
全生存期間についてのmaxstat解析を用いたところ、HADMSスコアは、２つの独立した患者のコホートであるＨＭ及びUAMS-TT2において高リスク骨髄腫と有意に関連していた（図３Ａ）。Maxstat統計的検定によって、ＨＭ患者コホートを２つの群に分ける：中央ＯＳが２７ヶ月間である、２３．７％ 患者の高リスク群（HADMSスコア＞−２１．５７）、及び中央生存期間に達しない、７６．３％ 患者の低リスク群（HADMSスコア＜−２１．５７）（Ｐ＝７Ｅ−３３；図３Ａ）。UAMS-TT2コホートでは、HADMSスコア＞−２１．５７は、患者の２０．８％において高リスクに関連している（Ｐ＝０．００７；図３Ａ）。HADMSスコアは、無再発生存期間（ＥＦＳ）を予測することもできた。高リスク群は、それぞれ、ＨＭ及びUAMS-TT2コホートにおいて１３ヶ月間及び３４ヶ月間の中央ＥＦＳを有しており、そして、低リスク群は、４０ヶ月間及び６２ヶ月間の中央ＥＦＳを有していた（それぞれ、Ｐ＝８．３Ｅ−１５及び０．００３；図３Ｂ）。
HADMSスコアの予後値を、通常の予後因子（β２Ｍ、ＩＳＳ、ｔ（４；１４）、及びdel17p）並びに公開されているＧＥＰに基づくリスクスコアであるUAMS-HRS（Shaughnessy, 2007)、ＩＦＭスコア（Decaux, 2008）、ＧＰＩ（Hose, 2011）、ＲＳスコア（Reme, 2013）、ＤＭスコア（Moreaux, 2012）、及びＨＡスコア（Moreaux, 2013)と比較した。一変量ＣＯＸ解析では、これら因子は全て予後値を有していた（表４）。２つずつ比較するか、又は多変量ＣＯＸ解析において一斉に比較したところ、HADMSスコア及びβ２Ｍは、ＨＭコホートにおいて独立なままであった。UAMS-TT2コホートでは、２つずつ比較したとき、ＩＦＭスコア、ｔ（４；１４）、del17p、ＧＰＩ、及びＤＭスコアで検定したHADMSスコアは、依然として独立な予後因子であった。一斉に検定したとき、UAMS-HRS、ｔ（４；１４）、del17p、及びＨＡスコアは、独立なままであった（表４）。

表４：ＨＭ及びＴＴ２患者のコホートにおけるＯＳのＣｏｘ一変量及び多変量解析。
Ｃｏｘモデルを用いて単一の変数又は複数の変数として予後因子を検定した。Ｐ値及びハザード比（ＨＲ）を示す。ＮＳ、閾値５％において有意差無し；ＧＰＩ、遺伝子発現に基づく増殖指数；ＩＳＳ、国際病期分類システム；ＨＲＳ、高リスクスコア；ＩＦＭ、国際骨髄腫財団；ＤＭスコア、ＤＮＡメチル化スコア、ＨＡスコア、ヒストンアセチル化スコア、UAMS TT2患者のβ２ｍ及びアルブミンの血清濃度は入手不可能である。ＮＡ、入手不可能。
HADMSスコアは、DNMTi及びHDACiの組み合わせに対する骨髄腫細胞の感受性を予測する。
インビトロにおいて骨髄微環境と共培養した患者の初代ＭＭＣを用いて、DNMTi及びHDACiによる併用処置に対する骨髄腫細胞の感受性を予測するためのHADMSスコアの有効性を調べた（Mahtouk, 2004; Moreaux, 2013；Moreaux, 2012；Moreaux, 2013）。高HADMSスコアを有する患者のＭＭＣ（ｎ＝５）は、低HADMSスコアを有する患者のＭＭＣ（ｎ＝５）よりもデシタビン及びＴＳＡの組み合わせに対する感受性が有意に高かった（３．４倍）（図４Ａ）。本発明者らは、別のDNMTi及びHDACiの組み合わせを用いてこれら結果を確認した。高HADMSスコアを有する患者の初代ＭＭＣ（ｎ＝５）は、低HADMSスコアを有する患者のＭＭＣ（ｎ＝７）よりも、臨床等級の阻害剤５−アザシチジン／ＳＡＨＡの組み合わせに対して有意に１．７倍高い感受性を示した（図４Ｂ）。
低HADMSスコア値を有する患者のＭＭＣは、成熟ＢＭＰＣの遺伝子サインを特徴とするが、一方、高HADMSスコアを有する患者は、増殖している形質芽球の遺伝子サインを有する。
高HADMSスコア群及び低HADMSスコア群を比較して異なる遺伝子サインを同定できるかどうかを確認するために、本発明者らは、ＧＳＥＡ解析を実施した。低HADMSスコアを有する患者のＭＭＣは、正常成熟ＢＭＰＣ（遺伝子セット：ZHAN MULTIPLE MYELOMA DN、Ｐ＝０．０１、表５）及び骨微環境依存性（遺伝子セット：VILIMAS NOTCH1 TARGETS UP、ZHENG IL22 SIGNALING UP、AMIT EGF RESPONSE 120 HELA、及びRUTELLA RESPONSE TO HGF、Ｐ＜０．０２、表６、７、８、及び９）に関連する遺伝子において有意なエンリッチメントを示した。逆に、高HADMSスコアを有する患者のＭＭＣは、増殖している形質芽球前駆細胞（遺伝子セット：MOREAUX MULTIPLE MYELOMA BY TACI DN、WHITFIELD CELL CYCLE S、Ｐ＜０．０１、表１０及び１１）、ＩＦＮによって調節される遺伝子（遺伝子セット：REACTOME INTERFERON ALPHA BETA SIGNALING、RADAEVA RESPONSE TO IFNA1 UP、及びDER IFN BETA RESPONSE UP、Ｐ＜０．０１、表１２、１３、及び１４）、及び転写（遺伝子セット：REACTOME TRANSCRIPTION、Ｐ＜０．０００１、表１５）に関連する遺伝子において有意なエンリッチメントを示した。正常形質細胞の分化におけるHADMSスコアを調べると、HADMSスコア値は、記憶Ｂ（ＭＢ）細胞と比べて、前駆形質芽球（PrePB、Ｐ＝０．０５）及び形質芽球（ＰＢ、Ｐ＝０．０１）において有意に高かった（図５）。早期形質細胞は、最高のスコアを有し（Ｐ＜０．００１）、そして、HADMSスコアは、成熟ＢＭＰＣにおいて最低値まで劇的に減少した（Ｐ＜０．００１）（図５）。

表５：遺伝子セットのエンリッチメント解析によって、高HADMSスコア患者と比較して、低HADMSスコア患者においてZHAN MULTIPLE MYELOMA DNセットが有意に高発現することが明らかになった（Ｐ＝０．０１）。

表６：遺伝子セットのエンリッチメント解析によって、高HADMSスコア患者と比較して、低HADMSスコア患者においてVILIMAS NOTCH1 TARGETS UPセットが有意に高発現することが明らかになった（Ｐ＝０．００７）。

表７：遺伝子セットのエンリッチメント解析によって、高HADMSスコア患者と比較して、低HADMSスコア患者においてZHENG IL22 SIGNALING UPセットが有意に高発現することが明らかになった（Ｐ＝０．００７）。

表８：遺伝子セットのエンリッチメント解析によって、高HADMSスコア患者と比較して、低HADMSスコア患者においてAMIT EGF RESPONSE 120 HELAセットが有意に高発現することが明らかになった（Ｐ＝０．０１）。

表９：遺伝子セットのエンリッチメント解析によって、高HADMSスコア患者と比較して、低HADMSスコア患者においてRUTELLA RESPONSE TO HGFセットが有意に高発現することが明らかになった（Ｐ＝０．０１）。

表１０：遺伝子セットのエンリッチメント解析によって、低HADMSスコア患者と比較して、高HADMSスコア患者においてMOREAUX MULTIPLE MYELOMA BY TACI DNセットが有意に高発現することが明らかになった（Ｐ＜０．０００１）。

表１１：遺伝子セットのエンリッチメント解析によって、低HADMSスコア患者と比較して、高HADMSスコア患者においてWHITFIELD CELL CYCLE Sセットが有意に高発現することが明らかになった（Ｐ＝０．００２）。

表１２：遺伝子セットのエンリッチメント解析によって、低HADMSスコア患者と比較して、高HADMSスコア患者においてREACTOME INTERFERON ALPHA BETA SIGNALINGセットが有意に高発現することが明らかになった（Ｐ＝０．００２）。

表１３：遺伝子セットのエンリッチメント解析によって、低HADMSスコア患者と比較して、高HADMSスコア患者においてRADAEVA RESPONSE TO IFNA1 UPセットが有意に高発現することが明らかになった（Ｐ＝０．００４）。

表１４：遺伝子セットのエンリッチメント解析によって、低HADMSスコア患者と比較して、高HADMSスコア患者においてDER IFN BETA RESPONSE UPセットが有意に高発現することが明らかになった（Ｐ＜０．０００１）。

表１５：遺伝子セットのエンリッチメント解析によって、低HADMSスコア患者と比較して、高HADMSスコア患者においてREACTOME TRANSCRIPTIONセットが有意に高発現することが明らかになった（Ｐ＜０．０００１）。
考察
この研究では、本発明者らは、インビトロにおけるHDACi／DNMTiの組み合わせに対して感受性の高いＭＭＣを有する高リスク患者を同定することができるＧＥＰに基づくHADMSスコアを報告した。HDACi／DNMTiの組み合わせは良好な耐容性を示し（Bots, 2009）、血液学的悪性疾患を含む癌において有望な活性を示し（Bots, 2009；Fandy, 2009；Zhang, 2009；Juergens, 2011）、そして、ＭＭにおいて潜在的な処置的価値を有していた（Matthews, 2013）ので、HADMSスコアによって、この処置から恩恵を受けることができるＭＭ患者を同定することができた。
骨髄腫細胞株におけるデシタビン及びＴＳＡによって調節解除される３７５個の遺伝子の中でも、４８個の遺伝子は、ＴＳＡ処理後に調節解除されることも見出された（Moreaux, 2013）。１６個の遺伝子は、デシタビン（Moreaux, 2012）、そして、デシタビン／ＴＳＡ処理によって共同で調節解除された。本発明者らは、デシタビン、ＴＳＡ、又はデシタビン／ＴＳＡによって発現が影響を受けた５個の遺伝子の重複を同定した（表１６、１７、及び１８）。主にＩＦＮによって調節される遺伝子の調節解除は、デシタビンとデシタビン／ＴＳＡ併用処理との間で共有されていた（Moreaux, 2012）。本発明者らによる研究及びHellerらの研究において８５個の遺伝子が共通して同定された（表１９）。したがって、デシタビン／ＴＳＡの組み合わせによって調節解除される遺伝子の８０％が、ＭＭＣにおいてデシタビン処理又はＴＳＡ処理単独によっては影響を受けないことが見出された。ヒストン修飾とＤＮＡメチル化との協同は、グローバルなエピジェネティックパターンの確立及び遺伝子座特異的な遺伝子の調節に重要である（Cedar, 2009）。このクロストークは、ＳＥＴドメインのヒストンメチルトランスフェラーゼとＤＮＡメチルトランスフェラーゼとの間の生化学的相互作用によって媒介され得る（Cedar, 2009）。興味深いことに、HADMSスコアは、ＳＥＴドメインのヒストンメチルトランスフェラーゼMMSETの高発現を特徴とするｔ（４；１４）サブグループにおいて有意にアップレギュレートされる（図６）。
HADMSスコアを構築する９６個の遺伝子は、予後不良に関連する４２個の遺伝子と予後良好に関連する５４個の遺伝子を含む（図１）。これら遺伝子の中でも、一部は、ＭＭのバイオロジーに関与する経路及びDNMTi／HDACiの組み合わせに対する感受性を強調することができた。高HADMSスコア値を有する患者のＭＭＣにおいて増殖に関連する遺伝子における有意なエンリッチメントが同定されたので、高HADMSスコア患者のDNMTi／HDACiの組み合わせに対する感受性がより高いことは、DNMTiのＤＮＡへの取り込みが細胞周期中の細胞に限定されるという事実によって説明することができた（Hollenbach, 2010）。更に、HDACiは、網膜芽細胞腫タンパク質の脱リン酸化を通じてＧ１細胞周期の停止を誘導し、そして、ｐ５３及びｐ２１の発現を増加させることが示されている（Lavelle, 2001；Mitsiades, 2003；Neri, 2012）。メチル化特異的ＰＣＲを用いて、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ＣＤＫＩ、ｐ１５、及びｐ１６）及びｐ１４を含む腫瘍抑制遺伝子の過剰メチル化が、幾つかの研究によって同定されている（Braggio, 2010；Takada, 2005；Mateos, 2002）。本発明者らは、DNMTi／HDACi処理が、ＭＭＣにおいてｐ２１及びｐ５７ ＣＤＫＩ発現を誘導し（表Ａ）、そして、その発現が、ＭＭ患者における予後良好と関連している（表Ａ）ことを報告した。また、本発明者らは、別の予後良好遺伝子であるCdc14bの発現が誘導されることも同定した。Cdc14bは、細胞周期中に複数の機能を果たすことが示唆されている（Mocciaro, 2010）。酵母では、Cdc14bタンパク質ホスファターゼは、有糸分裂ＣＤＫの不活化及び有糸分裂終了に必須である（Mocciaro, 2010；Wei, 2011）。Cdc14b欠損マウスの細胞は、増殖欠陥を示し、そして、インビトロ及びインビボの両方において老化を増大させた（Wei, 2011）。より最近では、Cdc14bの欠損によって、Ａ型及びＢ型のサイクリンを含む細胞周期特異的遺伝子の転写が著しく増大することが報告された。逆に、Cdc14bの異所性発現によって、細胞周期遺伝子が著しく抑制される（Guillamot, 2011）。これらエピジェネティック薬によって誘導される予後良好遺伝子の中でも、本発明者らは、ＥＧＦの負の調節因子（ERRFI1、Ｍｉｇ−６としても知られている）を同定する。マウスにおけるERRFI1の欠損は、ＥＧＦＲを活性化させ、そして、ＭＡＰＫシグナル伝達を維持し、その結果、腫瘍が発達することが報告されている（Zhang, 2007; Anastasi, 2007；Ferby, 2006）。ERRFI1の欠損、突然変異、又はダウンレギュレーションは、グリア芽細胞腫、肺癌、及び乳癌において頻繁に同定されている（Anastasi, 2005; Ichimura, 2008；Ying, 2010）。グリア芽細胞腫では、ERRFI1の高発現は、増殖、ＥＧＦＲのＳＴＸ８との結合、及び取り込まれたＥＧＦＲの分解のためのエンドソームへの駆動を減少させることが示された。対照的に、ERRFI1の欠乏によって、腫瘍浸潤が増加した（Ying, 2010）。更に、最近の研究では、ERRFI1の発現が老化プロセス中にアップレギュレートされることが証明された（Xie, 2013）。本発明者らは、ＥＧＦ／ＥＧＦ受容体ファミリーが、骨髄腫細胞成長因子として作用するＭＭのバイオロジーに関与している（Mahtouk, 2006；Mahtouk, 2005；Mahtouk, 2004）ことを既に証明している。pan-ErbB阻害剤は、インビトロにおいて骨髄微環境と共培養したＭＭＳの強力なアポトーシスを誘導し、そして、デキサメタゾン又は抗ＩＬ−６抗体との組み合わせは、更なる効果を示した（Mahtouk, 2004）。したがって、DNMTi／HDACiの組み合わせは、ＭＭＣにおける主な腫瘍抑制遺伝子の発現を誘導するのに有用であり得た。
増殖遺伝子サインによれば、高HADMSスコア患者は、ヒストンクラスタ遺伝子を含む転写に関連する遺伝子の高発現を特徴とする（表１５）。コアヒストンタンパク質は、細胞が分裂しているとき、短いＳ期の間に速やかに合成されなければならない（Harris, 1991）。その結果、ヒストンｍＲＮＡは、高度に細胞周期に調節されており、細胞がＳ期に入るときに３５倍増加し、そして、Ｓ期の終わりに再度減少する（Harris, 1991）。要するに、これらデータは、活発な成長によって区別される高HADMSスコア患者が、HDACi／DNMTiが標的とする遺伝子、そして、特に、予後良好値を有する５４個の遺伝子のアップレギュレーションによって効率的に標的とされ得る理由を明らかにすることができた。
逆に、低HADMSスコアを有する患者のＭＭＣは、より静止段階にある可能性がある。低HADMSスコアを有する患者のＭＭＣが、細胞間情報伝達シグナル経路における著しいエンリッチメントによって明確に示される骨髄微環境依存性に関連する成熟ＢＭＰＣに類似のサインを示すことが、ＧＳＥＡ解析によって明らかになった（表５〜９）。対照的に、高HADMSスコアを有する患者のＭＭＣは、それほど分化していない増殖形質芽球前駆細胞と類似性を共有するサインを特徴とする（表１０〜１５）。近年、形質細胞の分化の様々な成熟段階を反復し（Jourdan, 2011；Jourdan, 2009）、そして、プロテアソーム阻害剤抵抗性に関連している（Leung-Hagesteijn, 2013；Chaidos, 2013）前駆細胞の機構がＭＭ患者の骨髄内に存在することが報告された。Ｂ細胞及び前駆形質芽球を含むＭＭＣ前駆細胞は、プロテアソーム阻害剤に対しても生存し、そして、ボルテゾミブ処置に対して不応性である骨髄種患者において著しくエンリッチされることが見出された。これらXbp1s陰性前駆形質芽球細胞は、高Ｉｇ産生に関与していないので、小胞体（ＥＲ）ストレスの低減、ひいては、プロテアソーム阻害剤に対する抵抗性を特徴とする（Leung-Hagesteijn, 2013；Orlowski, 2013）。更に、形質芽球前駆細胞は、成熟形質細胞と比べて、エピジェネティック調節因子を高発現することが記載されており、これは、形質細胞の分化段階におけるＭＭＣの転移がエピジェネティック可塑性に関連している可能性のあることを示唆する（Chaidos, 2013）。ＧＳＥＡ結果によれば、HADMSスコアは、正常成熟ＢＭＰＣに比べて、前駆形質芽球、形質芽球、及び早期形質細胞において有意に高かった（図５）。したがって、HDACi／DNMTiによる併用処置は、ＭＭにおける処置失敗の原因である腫瘍前駆細胞を標的とする処置的関心を有し得る。
近年の臨床試験は、ＭＤＳ、ＡＭＬ（Bots, 2009；Fandy, 2009；Zhang, 2009）、及び不応性進行非小細胞肺癌（Juergens, 2011）におけるHDACi／DNMTiの組み合わせの有望な活性を示唆していた。ＭＭでは、DNMTi又はHDACiを評価する臨床試験が進行中であり、そして、これらの組み合わせから、Vk*MYCトランスジェニックＭＭマウスモデルにおいて有意な結果が得られた（Matthews, 2013）。本研究では、本発明者らは、エピジェネティック療法の組み合わせから恩恵を受けることができる患者を同定するのに有用であり得る、DNMTi及びHDACiの組み合わせに対するＭＭ細胞の感受性を予測する新たなスコアを報告した。

表１６：デシタビン及びデシタビン／ＴＳＡで処理したＨＭＣＬにおいて共同で高発現した遺伝子。

表１７：ＴＳＡ及びデシタビン／ＴＳＡで処理したＨＭＣＬにおいて共同で高発現した遺伝子。

表１８：ＴＳＡ、デシタビン、及びデシタビン／ＴＳＡで処理したＨＭＣＬにおいて共同で高発現した遺伝子。

表１９：Heller Gらによって実施された研究及び本研究において、デシタビン／ＴＳＡで処理されたＨＭＣＬにおいて高発現した遺伝子。
参照文献：
本願全体を通して、様々な参照文献が、本発明が関連する技術分野の状況について説明している。これら参照文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。

Claims (3)

  1. 多発性骨髄腫に罹患している患者が、少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤（HDACi）及び少なくとも１つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（DNMTi）からなる併用処置に応答するかどうかを試験する方法であって、
    ｉ）該患者から得られた生物学的サンプル中の、表Ａから選択される幾つかの遺伝子Ｇ１〜Ｇｎの発現レベル（ＥＬｉ）を決定する工程と、
    ii）工程ｉ）で決定した該発現レベル（ＥＬｉ）を所定の参照レベル（ＥＬＲｉ）と比較する工程と、
    iii）以下の式

    （式中、βｉは、遺伝子Ｇｉの回帰β係数参照値を表し、そして、該遺伝子Ｇｉの発現（ＥＬｉ）が該所定の参照レベル（ＥＬＲｉ）よりも高い場合、Ｃｉ＝１であるか、又は該遺伝子の発現（ＥＬｉ）が該所定の参照レベル（ＥＬＲｉ）以下である場合、Ｃｉ＝−１である）
    を通してHADMSスコアを計算する工程と、
    iv）工程iii）で決定したスコアHADMSを所定の参照値HADMSＲと比較する工程と、
    ｖ）該HADMSスコアが該所定の参照値HADMSＲよりも高いとき、該患者が該併用処置に応答すると結論付けるか、又は該HADMSスコアが該所定の参照値HADMSＲよりも低いとき、該患者が該併用処置に応答しないと結論付ける工程と
    を含む方法。
  2. 工程ｉ）が、表Ａ中の４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、又は９６個の遺伝子の発現レベル（ＥＬｉ）を決定することを含み、遺伝子の全ての組み合わせが、

    からなる４２個の遺伝子の最小セットを含む、請求項１記載の多発性骨髄腫に罹患している患者が、少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤（HDACi）及び少なくとも１つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（DNMTi）からなる併用処置に応答するかどうかを試験する方法。
  3. それを必要としている患者における多発性骨髄腫を処置する方法であって、
    ａ）請求項１又は２記載の方法を実施することによって、該患者が本発明の併用処置に応答するかどうかを試験する工程と、
    ｂ）HADMSスコアが参照値HADMSＲよりも高いとき、少なくとも１つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤及び少なくとも１つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤の併用処置を投与する工程と
    を含む方法。
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