JP2017512498A - 複数成分複数段階マラリアワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
a)前赤内期抗原は、少なくとも抗原PfCelTOS、PfCSPおよびPfTRAPまたはそのドメイン、変異体もしくは断片を含み、
b)血液段階抗原(単数または複数)は、頂端膜抗原1(PfAMA1)の少なくとも1種または複数の変異体またはその断片を含み、
c)有性段階抗原(単数または複数)は、オーキネート抗原Pfs25および/または生殖体/ガメトサイト表面タンパク質Pf230C0またはその変異体もしくは断片を含む。
a)前赤内期抗原は、少なくとも抗原PfCelTOS、PfCSPおよびPfTRAPまたはそのドメイン、変異体または断片を含み、
b)血液段階抗原(単数または複数)は、頂端膜抗原1(PfAMA1)の少なくとも1種または複数の変異体またはその断片を含み、
c)有性段階抗原(単数または複数)は、オーキネート抗原Pfs25および/または生殖体/ガメトサイト表面タンパク質Pf230C0またはその変異体もしくは断片を含む。
a)前赤内期抗原は、少なくともPfCelTOS、PfCSPのTSR−ドメインおよびPfTRAPのTSR−ドメインを含み、
b)血液段階抗原は、頂端膜抗原(PfAMA1)の1種または複数の変異体を含み、
c)有性段階抗原(単数または複数)は、オーキネート抗原Pfs25および/または生殖体/ガメトサイト表面タンパク質Pf230C0またはその変異体を含む。
i)PfAMA1−DICO1およびPfMsp1−19、
ii)PfAMA1−DICO2およびPfRh2、ならびに
iii)PfAMA1−DICO3、PfRIPR_EGF7/8
を含む。
a)ポリペプチド1:PfCelTOS、PfCSPのTSR−ドメインおよびPfTRAPのTSR−ドメイン、
b)ポリペプチド2:PfgAMA1、
c)ポリペプチド3:PfMsp1−19_EGF1、PfMsp4_EGF、PfMsp8_EGF1、PfMsp8_EGF2およびPfMsp3のN末端断片、
d)ポリペプチド4:Pfs25およびPfs230C0
を含む。
a)ポリペプチド1:配列番号1、
b)ポリペプチド2:配列番号2、
c)ポリペプチド3:配列番号3、および
d)ポリペプチド4:配列番号4
のアミノ酸配列を有する4(4)種の組換えポリペプチド
または1個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
a)ポリペプチド10:PfAMA1−DICO1、
b)ポリペプチド11:PfAMA1−DICO2、
c)ポリペプチド12:PfAMA1−DICO3、
d)ポリペプチド8:Pfs25およびPfs230C0ならびに
e)ポリペプチド9:PfCelTOS、PfCSPのTSR−ドメインおよびPfTRAPのTSR−ドメイン
を含む。
a)ポリペプチド10:配列番号11、
b)ポリペプチド11:配列番号12、
c)ポリペプチド12:配列番号13、
d)ポリペプチド8:配列番号8、
e)ポリペプチド9:配列番号26
のアミノ酸配列を有する5(5)種の組換えポリペプチド
または1個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
f)ポリペプチド10:PfAMA1−DICO1、
g)ポリペプチド11:PfAMA1−DICO2、
h)ポリペプチド12:PfAMA1−DICO3、
i)ポリペプチド13:Pfs25、Pfs230C0およびPfRh5bならびに
j)ポリペプチド14:PfCelTOS、PfCSPのTSR−ドメインおよびPfTRAPのTSR−ドメイン、PfRh5a
を含む。
e)ポリペプチド10:配列番号11、
f)ポリペプチド11:配列番号12、
g)ポリペプチド12:配列番号13、
h)ポリペプチド13:配列番号28、
i)ポリペプチド14:配列番号9
のアミノ酸配列を有する5(5)種の組換えポリペプチド
または1個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
a)ポリペプチド1:PfAMA1−DICO1およびPfMsp1−19、
b)ポリペプチド2:PfAMA1−DICO2およびPfRh2、
c)ポリペプチド3:PfAMA1−DICO3、PfRIPR_EGF7/8、
d)ポリペプチド4:PfCelTOS、PfCSPのTSR−ドメインおよびPfTRAPのTSR−ドメインならびに
e)ポリペプチド5:Pfs25およびPfs230C0
を含む、請求項1から24のいずれか一項に記載の混合物。
a)ポリペプチド1:配列番号14、
b)ポリペプチド2:配列番号15、
c)ポリペプチド3:配列番号16、
j)ポリペプチド4:配列番号8、
d)ポリペプチド5:配列番号26
のアミノ酸配列を有する5(5)種の組換えポリペプチド
または1個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
a)ポリペプチド1:PfAMA1−DICO1、
b)ポリペプチド2:PfAMA1−DICO2、
c)ポリペプチド3:PfAMA1−DICO3、
d)ポリペプチド4:Pfs25、Pfs230C0およびPfRh5ペプチドならびに
e)ポリペプチド5:PfCelTOS、PfCSPのTSR−ドメインおよびPfTRAPのTSR−ドメイン、PfRh5ペプチド
を含む。
a)ポリペプチド1:配列番号11、
b)ポリペプチド2:配列番号12、
c)ポリペプチド3:配列番号13、
d)ポリペプチド4:配列番号28、
e)ポリペプチド5:配列番号9
のアミノ酸配列を有する5(5)種の組換えポリペプチド
または1個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
a)群1(前赤内期段階):配列番号1および5〜10、
b)群1(前赤内期段階):配列番号2、3および11〜22、
c)群1(前赤内期段階):配列番号4および23〜28
のアミノ酸配列を有する群1、2および3(群2に由来する少なくとも3種のタンパク質)から選択される少なくとも5(5)種の組換えポリペプチド
または1個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む。
a)配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号4の配列を有するポリペプチド、
b)配列番号8、配列番号11、配列番号12、配列番号13および配列番号26の配列を有するポリペプチド、
c)配列番号9、配列番号11、配列番号12、配列番号13および配列番号28の配列を有するポリペプチド、
d)配列番号8、配列番号14、配列番号15、配列番号16および配列番号26の配列を有するポリペプチド、
e)配列番号9、配列番号14、配列番号15、配列番号16および配列番号28の配列を有するポリペプチド、
f)好ましくは、1個もしくは複数のアミノ酸残基が保存的に置換されている、a)〜i)のポリペプチドの修飾された形態;
g)ストリンジェントな条件下でa)〜i)の核酸分子のいずれかとハイブリダイズ可能である核酸分子
h)ストリンジェントな条件下でa)〜i)の核酸分子のいずれかの相補体とハイブリダイズ可能である核酸分子
i)a)〜i)の核酸分子のいずれかと少なくとも85%の配列同一性を有する核酸分子
j)またはa)〜i)の核酸分子のいずれかの相補体
をコードする単離された核酸分子または複数の核酸分子に関連する。
a)融合タンパク質をコードする核酸を含む核酸構築物を提供するステップと、
b)核酸構築物を宿主細胞中に導入するステップと、
c)融合タンパク質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を維持するステップと
を含む。
以下の実施例では、本開示の材料および方法が提供される。これらの実施例は単に例示目的であって、決して本開示を限定すると解釈されてはならないということが理解されなければならない。本明細書において引用されたすべての刊行物、特許および特許出願は、すべての目的でその全文が参照により本明細書に組み込まれる。
表1に列挙される抗原断片配列を、植物発現のために最適化した(GeneArt)。最適化された配列を、NcoIおよびNotI断片として植物発現ベクターpTRAkc中に挿入した。抗原融合タンパク質の作製のために、抗原を含有する植物発現ベクターを、NotIによって線形化し、5’リン酸基をウシ腸アルカリホスファターゼ(CIP)によって除去し、抗原ドメインをEagI断片として挿入した。すべての構築物は、精製のためのC末端His6−タグおよびER検索のためのSEKDEL−タグを保持していた(Pelham, 1990)。pTRAkcプラスミドの詳細な説明が、Boes et al (Boes et al. 2011)に報告されている。すべての組換え遺伝子構築物を、配列決定することによって検証し、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)株GV3101中に導入した(pMP90RK)。組換えアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)をこれまでに記載されたように培養した(Sack et al. 2007; Vaquero et al. 1999)。培養物の光学濃度(OD)を決定し、発現株をサイレンシングサプレッサーp19を保持するアグロバクテリウム(agrobacterium)株(Plant Bioscience Limited, Norwich, England)と5:1の比で混合し、1の最終ODとした。
PfCelTos:熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)のオーキネートおよびスポロゾイトの細胞通過タンパク質(CelTos);CSP_TSR:熱帯熱マラリア原虫(P.falciparum)のサーカムスポロゾイトタンパク質(CSP)由来のTSR−ドメイン;TRAP_TSR:熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)のトロンボスポンジン関連接着タンパク質(TRAP)由来のTSR−ドメイン;PfgAMA1:熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)頂端膜抗原(AMA1)細胞外ドメイン1〜3;PfMsp1−19_EGF1:熱帯熱マラリア原虫(P.falciparum)のMSP1の19kDa断片に由来するEGF1;PfMsp4_EGF:熱帯熱マラリア原虫(P.falciparum)のMSP4に由来するEGF;PfMsp8_EGF1:熱帯熱マラリア原虫(P.falciparum)のMSP8に由来するEGF1;PfMsp8_EGF2:熱帯熱マラリア原虫(P.falciparum)のMSP8に由来するEGF2;Pfs25:熱帯熱マラリア原虫(P.falciparum)のオーキネート表面タンパク質25;Pfs230C0:熱帯熱マラリア原虫(P.falciparum)の生殖体/ガメトサイト表面タンパク質230のC0−断片。
各構築物のために、それぞれの発現カセットを含有する組換え細菌を、ロックウール中で成長した6〜8週齢のベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)植物中に手作業で別個に注射した。浸潤されたベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)植物を16時間の光周期を用い、22℃で5日間インキュベートした。植物葉組織をタンパク質抽出および精製のために回収した。
乳鉢(mortal)および乳棒を使用して液体窒素中で葉組織を破砕し、可溶性タンパク質を1gの葉材料あたり2mlの抽出バッファーを用いて抽出した。本発明者らは、25−230C0のためには、PBS pH7.4を使用し、その他の3種のタンパク質は10mM二硫化ナトリウムを含有するPBS pH 7.4を使用して抽出した。不溶性材料を遠心分離(16000xg、20分、4℃)によって除去し、清澄な上清を精製に直接使用した。熱安定性融合タンパク質CCTおよび25−230C0には、植物宿主細胞タンパク質を効率的に除去するためにさらなる熱沈殿ステップを実施した(65℃で5分間の植物抽出物のインキュベーション)。その後、不溶性材料を一連の遠心分離および濾過ステップによって除去した。
Hisタグをつけた対象の組換えタンパク質を、固定化金属イオンクロマトグラフィー(IMAC)によって精製した。手短には、抽出物のpHをpH8.0に調整し、NaClを500mMの最終濃度に添加した。標的タンパク質は、ニッケルを充填したキレーティングセファロース上に捕獲された。pH8.0に調整したPBSを用いる洗浄ステップ後に、標的タンパク質をpH8.0のPBSに溶解した15mM、50mMおよび250mMイミダゾールの段階勾配で溶出した。
精製されたタンパク質(配列番号1〜4)を等量で混合して(本明細書において以下、PlasmoMixと呼ばれる)、220μg/mlの各組換えタンパク質(総タンパク質濃度880μg/ml)を含有する溶液を調製し、「完全で容易な提案(complete and Easy offer)」およびその対応する免疫処置プロトコールに従うウサギの免疫処置のために、Biogenes(Berlin、Germany)に送った。
免疫処置後、ウサギ抗血清から得られた抗体を、プロテインAクロマトグラフィーによって精製した。手短には、血清サンプルをPBSを用いて1:5希釈し、精製に先立って0.45μmフィルターを通して濾過した。抗体をプロテインA樹脂(GE Healthcare)上に結合させ、結合していない不純物をPBSを用いる洗浄ステップによって除去した。結合している抗体を100mMグリシンpH3.0を用いて溶出し、1M TRIS pH8.0を用いて直接中和した。25mM HEPESを含有し、L−グルタミン(E15−041、PAA)を含有しないRPMI1640に対するバッファー交換を、HiPrep脱塩カラムを使用して実施し、抗体を、遠心性濃縮装置(VivaSpin 15R 30.000 MWCO、Sartoruis)によって、12mg/mlを超える濃度に濃縮し、滅菌濾過した。抗体を4℃で保存した。
タンパク質を、還元および/または非還元条件下で市販の4〜12%(w/v)勾配ゲル(Invitrogen)で分離し、フェアバンクス(Fairbanks)プロトコール(Wong et al. 2000)に従ってクマシーR−250で染色した。分離されたタンパク質をニトロセルロースメンブレン(Whatman、Dassel、Germany)上にブロッティングし、PBSに溶解した5%(w/v)脱脂粉乳を用いてブロッキングした。タンパク質を、1:5000希釈の一次抗体としてウサギ抗His6タグを用いてプロービングした。二次抗体は、アルカリホスファターゼ標識されたヤギ抗ウサギH+Lとした。バンドをNBT/BCIP(基質バッファー:150mM NaCl、2mM MgCl2、50mM Tris−HCl、pH9.6中、1mg・ml−1)を用いて可視化した。インキュベーションステップの間に、メンブランを0.05%(v/v)Tween−20を補給したPBSを用いて3回洗浄した。
1:CCT−ERH(配列番号1)
2:gAMA1−ERH(配列番号2)
3:NME−ERH(配列番号3)
4:Pfs25_230C0−ERH(配列番号4)
M:分子量マーカー
免疫処置のために使用されたタンパク質に対する血清における特異的抗体(IgG)力価、ならびにすべてのサブユニット/ドメインに対する反応性を、室温で1時間インキュベートした後、1μg/mlの濃度の組換えタンパク質を用いてコーティングされた高結合性96ウェルプレート(Greiner bio−one、Frickenhausen、Germany)を使用するELISAによって測定した。ウェルをPBS中、5%(w/v)脱脂粉乳を用いてブロッキングし、再度室温で1時間インキュベートした。血清ならびに免疫前血清の段階希釈を96ウェルプレートに適用し、室温で1時間インキュベートした。抗原が結合している抗体をHRPO標識ヤギ抗ウサギIgG Fcを用いてプロービングし、30分後に405nmでABTS基質を用いて検出した。各ステップの間に、プレートを0.05%(v/v)Tween−20を補給したPBSを用いて3回洗浄した。特異的IgG力価を、免疫前血清の値の2倍のOD405nmをもたらす希釈として規定した。
熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)寄生生物の異なる段階を可視化するために、間接IFAの大部分をこれまでに記載されるように(Pradel et al, 2004)実施した。熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)株NF54の無性段階およびガメトサイトの培養を、これまでに記載されるように(Ifediba and Vanderberg, 1981)実施した。寄生生物調製物を8ウェル診断用スライド(Thermo scientific)上で風乾させ、−80℃のメタノールを用いて10分間固定化した。非特異的結合をブロックしメンブランを透過処理するために、固定化された細胞を、PBS中0.5%BSA、0.01%サポニン中、室温で30分間、続いてPBS中0.5%BSA、0.01%サポニン、1%中性ヤギ血清中、室温で30分間インキュベートした。サンプルを、ヤギ血清を含まないブロッキング溶液で希釈されたPlasmoMixに対する精製された抗体とともに、37℃で1時間インキュベートした。精製された抗体を15μg/mlの最終濃度で使用した。異なる熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)生活環段階の対比染色のために、Pf_CSP_TSR(スポロザイトの対比染色)、MSP1−19(シゾントの対比染色)またはPfs25(マクロガメートおよび接合子の対比染色)に由来する単一熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)抗原断片に対するマウス抗血清をフラウンホーファー(Fraunhofer)IMEによって作製し、1/200の最終濃度で使用した。ヤギ血清を含まないブロッキング溶液中1/1000の希釈の蛍光コンジュゲートAlexa Fluor 488ヤギ抗マウスまたはAlexa Fluor 594ヤギ抗ウサギ抗体(Invitrogen)とともに細胞をインキュベートすることによって、一次抗体を可視化した。Alexa Fluor 594がカップリングした抗体が生じる寄生生物の標識がない場合には、PBS中0.05%エバンスブルーを用いて細胞を対比染色した。核を強調するために、サンプルをPBS中0.01%サポニン中のヘキストとともにインキュベートした。最後に、細胞を抗退色溶液AF2(Citifluor Ltd.)とともにマウントし、マニキュア液で密閉した。ライカsp5共焦点顕微鏡を使用して標識された細胞の検査およびイメージのスキャニングを実施した。本開示のPlasmoMixに対して作製され精製されたウサギ抗体を用いる、異なる熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)段階の例示的免疫蛍光アッセイが図4に示されている。図の各部分では、左側にヘキスト核染色、左から2番目に陽性対照染色(マウス対照pAb、Alexa488を用いて標識された抗マウスpAbを用いて検出)、左から3番目にPlasmoMixに対して作製された精製されたウサギpAbを用いる染色(Alexa594を用いて標識された抗ウサギpAbを用いて検出)、左から4番目に中性ウサギpAb対照、および右側に透過とそれに続いて重ね合わせイメージが示されている。
熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)抗原に対する抗血清の、熱帯熱マラリア原虫(P.falciparum)NF54スポロザイトのヒト肝臓細胞への結合および侵襲を阻止する能力を評価するために、Rathore et al. (2003)およびMcCormick et al. (2008)に提示されるプロトコールに従って、スポロザイト結合/侵襲の阻害アッセイを実施した。HepG2細胞を、10%FBSを含有するRPMI培地で60000/mlの濃度に希釈した。この懸濁液の400μlを、E−C−L細胞結合マトリックス(Millipore)でコーティングされた8ウェルLab−Tek permanoxチャンバースライド(Thermo Scientific)の各ウェルに添加した。細胞を37℃、5%CO2で48時間インキュベートして、閉じた単層を形成した。HepG2細胞の播種後2日目に、人工感染性吸血の19〜21日後のアノフェレス・ステフェンシ(Anopheles stephensi)蚊から熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)NF54スポロザイトを単離し、PBS中0.0001%FBS中に集めた。スポロザイトをノイバウエル血球算定器を使用してカウントし、300μlのRPMI/10% FBS中20000個のスポロザイトを、事前にRPMIを用いて3回洗浄したHepG2細胞の各ウェルに添加した。RPMI中に溶解した、PlasmoMixに対するウサギ抗血清から得られた精製されたポリクローナル抗体を600μg/mlの濃度で使用し、細胞をその後37℃、5%CO2で3時間インキュベートした。細胞外および細胞内スポロザイト間を区別するために、これまでに記載されたプロトコールに従い(Hugel et al. 1996, Pradel and Frevert 2001)いくつかの修飾を用いて二重標識を実施した。細胞外スポロザイトを標識するために、HepG2細胞をRPMI培地を用いて3回洗浄した。RPMIで1/200希釈したウサギ抗CSP(MRA−24、ATCC)との、37℃で1時間のインキュベーションの次に、RPMIを用いる3回の洗浄ステップ、およびRPMIで1/1000希釈したalexa 488コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体(Invitrogen)との、37℃で1時間のインキュベーションを続けた。細胞をPBSを用いて3回洗浄し、風乾し、メタノールを用いて−80℃で10分間固定化した。PBS中0.5%BSA、0.01%サポニンとともにインキュベートすることによるブロッキングおよび細胞膜の透過処理を、4℃で一晩実施した。続いてすべてのスポロザイトを標識するために、ブロッキング溶液で1/200希釈したウサギ抗CSP(MRA−24、ATCC)との、37℃で1時間のインキュベーションの次に、ブロッキング溶液を用いる3回の洗浄ステップ、およびブロッキング溶液で1/1000希釈したalexa 594コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体(Invitrogen)との、37℃で1時間のインキュベーションを続けた。核を強調するために、サンプルをPBS中ヘキストとともにインキュベートした。最後に、細胞を抗退色溶液AF2(Citifluor Ltd.)とともにマウントし、マニキュア液で密閉した。細胞外(赤色および緑色蛍光)および細胞内(赤色のみの蛍光)のカウントを、Zeiss LSM510共焦点顕微鏡を使用して実施した。本開示のPlasmoMixに対して作製された精製されたウサギ抗体のISI結果が、以下の表4に列挙されている。
プラスモジウム属(Plasmodium)寄生生物に対する成長阻害の可能性を、標準化されたプロトコールを使用して実施した。熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)寄生生物株3D7A(MR4によって提供された)を、37℃で5%CO2、5%O2および90%N2で、10%Albumax II(Invitrogen)、25mM Hepes、12μg/mlのゲンタマイシンおよび100μΜのヒポキサンチンを補給したRPMI培地中、4%のヘマトクリットで、5%未満の寄生虫症で培養物中に維持した。培養物を日常的なルーチンで維持し、ギムザ染色によって寄生中症を推定した。アッセイに使用される赤血球は15人のマラリア無感作血液ドナーから混合し、それらは3週間以内のものだった。赤血球はSAG−マンニトール中、4℃で保存した。寄生生物を、侵襲後1〜16時間の時間ウィンドウ内の10%ソルビトール処理によって同調させた。アッセイには、侵襲後36〜40時間の高度に同調した培養物のみを使用した。
阻害%=100%−((A655 IgGサンプル−A655 RBC対照))/((A655シゾント対照−A655 RBC対照))*100%
熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)抗原に対する抗血清の、熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)NF54のヒトから蚊への伝達を阻止する能力を評価するために膜飼育アッセイを実施した(Bishop and Gilchrist, 1946)。手短には、パーコール密度勾配遠心分離によって相当な鞭毛放出を示す成熟段階Vガメトサイトを培養物から精製し(Kariuki et al, 1998)、等量の新鮮なA+−赤血球と混合する。次いで細胞を、試験のためにそれぞれの抗血清を補給した、等量の活性ヒトA+−血清と混合した。未精製の試験血清を1/10の濃度まで、精製された試験血清を1mg/mlの濃度まで使用した。サンプルを、38℃に加熱したガラスフィーダーの底に広げたパラフィルムの薄層を介して、3〜5日齢のA.ステフェンシ(Stephensi)蚊に直接与えた。感染に使用した蚊は、これまでは脱脂綿パッドに浸した5%サッカロース、0.05%パラアミノ安息香酸、40μg/mlゲンタマイシンの溶液で与えられた。ゲンタマイシンは感染率全体を増強するための食事の一部であった(Beier MS et al, 1994)。蚊は、吸血で20分間摂食することが許可され、その後、80%湿度で26℃の安全な昆虫実験室中で維持された。翌日以降、摂食は上記の溶液を使用して行われた。異なる吸血の感染性を測定するために、血液を与えられた蚊の20個の中腸の各サンプルを感染の9〜12日後に解剖し、オーシストのカウントを容易にするために、PBS中0.2%マーキュロクロムを用いて染色した。オーシストのカウントを、100倍の倍率を使用して光学顕微鏡で実施した。PlasmoMixに対して作製された精製されウサギ抗体のTBA結果が、表4に列挙されている。
上記ですでに記載した。
上記ですでに記載した。
乳鉢(mortal)および乳棒を使用して液体窒素中で葉組織を破砕し、可溶性タンパク質を、1gの葉材料あたり3〜7mlの抽出バッファー(10mM 二硫化ナトリウムおよび500mM NaCl、pH7.4を含有するPBS)を用いて抽出した。10%(v/v)の1M TRIS pH8.0を添加することによって、タバコ粗抽出物をpH8.0に調整した。PfCelTOS−PfCSP_TSR−PfTRAP_TSR−PfRh5a(配列番号33)およびPfs25−Pfs230_C0_PfRh5b(配列番号36)の場合には、植物宿主細胞タンパク質を除去するために熱沈殿を実施した。抽出物を、抽出物中の温度が65℃に達するまでサーモミキサー(Eppendorf)中でインキュベートした。不溶性材料を遠心分離(16000xg、20分、4℃)によって除去し、清澄な上清を精製に直接使用した。
CCT−9AD4およびF0−Q5Aは、さらなる精製ステップを行わずに直接使用した。AMA1_DiCo変異体(PfAMA1−DiCo1−3およびPfAMA1−DiCo1−Msp1_19FUP、PfAMA1−DiCo2−Rh2およびPfAMA1−DiCo3−RIPR7/8)は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。したがって、キメラモノクローナル抗体4G2(PfAMA1特異的)を、製造業者の説明書に従って、NHS活性化セファロース(GE healthcare)に共有結合によって連結させた。PBSを用いて、結合していないタンパク質を洗浄除去し、100mM グリシン pH3.0を用いて結合しているタンパク質を溶出し、10%(v/v)1M TRIS pH8.0を用いて直ちに中和した。
タンパク質を、非還元条件下で市販の4〜12%(w/v)勾配ゲル(Invitrogen)で分離し、フェアバンクス(Fairbanks)プロトコール(Wong et al. 2000)に従ってクマシーR−250で染色した。分離されたタンパク質をニトロセルロースメンブレン(Whatman、Dassel、Germany)上にブロッティングし、PBSに溶解した5%(w/v)脱脂粉乳を用いてブロッキングした。PfAMA1を含有するタンパク質を、以下の1:5000の希釈の一次抗体としてキメラモノクローナル抗体4G2と、続いて、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒト抗血清を用いてプロービングした。タンパク質PfCelTOS−PfCSP_TSR−PfTRAP_TSR−PfRh5aを、PfCSP_TSR特異的モノクローナル抗体と、続いて、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウス抗血清を用いてプロービングし、タンパク質Pfs25−Pfs230_C0_PfRh5bを、キメラモノクローナル抗体4B7(Pfs25−specific)と、続いて、PfAMA1タンパク質の検出のために使用される同一二次抗体を使用してプロービングした。バンドをNBT/BCIP(基質バッファー中1mg・ml−1:150mM NaCl、2mM MgCl2、50mM Tris−HCl、pH9.6)を用いて可視化した。インキュベーションステップの間に、メンブランを0.05%(v/v)Tween−20を補給したPBSを用いて3回洗浄した。
ウサギの免疫処置のために、2種のワクチン混合物M1およびM2(ワクチンカクテル)を調製し、混合物は以下に記載されている。
免疫処置のために使用されるワクチン混合物(M1およびM2)に対する血清中の特異的抗体(IgG)力価を、それぞれのワクチン混合物(50mM炭酸バッファーpH9.5中、10μg/ml)でコーティングされた高結合性96ウェルプレートを使用するELISAによって測定した。コーティングステップ(室温、一晩)後、TBS中、1%(v/v)ウシ胎児血清を用いて、室温で30分間ウェルをブロッキングした。血清ならびに免疫前血清の段階希釈を、96ウェルプレートにアプライし、室温で1時間インキュベートした。抗原が結合している抗体を、POD標識抗ウサギIgG抗体(Sigma A4914)を用いて、室温で1時間プロービングし、TMB One基質(Kem−En−Tac Diagnostic)を用いて検出した。15分後に500mM硫酸を添加することによって反応を停止し、450nmで(参照波長630nm)黄色溶液の吸収を測定した。各ステップの間に、プレートを、0.05%(v/v)Triton X−100を補給したTBSを用いて3回洗浄した。特異的IgG力価は、免疫前血清の値の2倍のOD450nmをもたらす希釈として定義した。
本明細書を通じて引用される文献参考文献、発行された特許および公開された特許出願を含むすべての引用された参考文献の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
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Claims (58)
- 寄生生物熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)に対するヒトワクチンとして適した組換えタンパク質の混合物であって、寄生生物生活環の前赤内期、血液および有性段階の熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)表面タンパク質に由来する抗原を含み、
a)前赤内期抗原が、少なくとも抗原PfCelTOS、PfCSPおよびPfTRAPまたはそのドメイン、変異体もしくは断片を含み、
b)血液段階抗原(単数または複数)が、頂端膜抗原1(PfAMA1)の少なくとも1種もしくは複数の変異体またはその断片を含み、
c)有性段階抗原(単数または複数)が、オーキネート抗原Pfs25および/もしくは生殖体/ガメトサイト表面タンパク質Pf230C0またはその変異体もしくは断片を含む、混合物。 - 前記PfCSPのドメインが、PfCSPのTSR−ドメインである、請求項1に記載の混合物。
- 前記PfTRAPのドメインが、PfTRAPのTSR−ドメインである、請求項1または2のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記血液段階抗原が、少なくともさらなる熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)血液段階抗原を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記前赤内期(pre-erytrocytic)抗原が、組換え融合タンパク質中に含まれる、請求項1から4のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記組換え融合物が、配列番号1、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8および配列番号10または1個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドまたはその断片からなる群から選択される、請求項5に記載の混合物。
- 前記頂端膜抗原1(PfAMA1)の変異体が、任意の野生型PfAMA1、PfAMA1−DICO1、PfAMA1−DICO2、PfAMA1−DICO3および除去されたまたは追加の潜在的なN−グリコシル化部位を有するその変異体からなる群から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記頂端膜抗原1(PfAMA1)の変異体が、野生型PfAMA1である、請求項1から7のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記頂端膜抗原1(PfAMA1)の変異体が、配列番号2、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号17、配列番号18および配列番号19または1個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドまたはその断片からなる群から選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記頂端膜抗原1(PfAMA1)の変異体が、発現宿主特異的N−グリカンを保持する、請求項1から9のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記さらなる熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)血液段階抗原が、PfMsp1、PfRIPR、PfRh2、PfMsp4、PfMsp8、PfRh5およびPfMsp3またはその変異体もしくは断片からなる群から選択される、請求項2から10のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記さらなる熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)血液段階抗原が、PfMsp1−19、PfRIPR_EGF7/8、PfRh2、PfMsp4_EGF、PfMsp8_EGF1、PfMsp8_EGF2、PfRh5a(ペプチド)、PfRh5b(ペプチド)およびPfMsp3のN末端断片またはその変異体もしくは断片からなる群から選択される、請求項2から11のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記さらなる熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)血液段階抗原が、PfMsp1−19(配列番号37)、PfRIPR_EGF7/8(配列番号39)およびPfRh2(配列番号38)またはその変異体もしくは断片からなる群から選択される、請求項2から11のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記さらなる熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)血液段階抗原が、PfMsp1−19_EGF1(配列番号32)、PfMsp4_EGF(配列番号33)、PfMsp8_EGF1(配列番号34)、PfMsp8_EGF2(配列番号35)およびPfMsp3のN末端断片(配列番号36)またはその変異体もしくは断片を含む、請求項2から11のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記さらなる熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)血液段階抗原が、組換え融合タンパク質中に含まれる、請求項1から14のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記組換え融合タンパク質が、配列番号3または1個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドまたはその断片を含む、請求項15に記載の混合物。
- 前記血液段階抗原が、PfAMA1−DICO1、PfAMA1−DICO2およびPfAMA1−DICO3またはその変異体もしくは断片を含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記血液段階抗原が、好ましくは、組換え融合タンパク質(配列番号14)として、PfAMA1−DICO1(配列番号11)およびPfMsp1−19(配列番号37)を、またはその変異体もしくは断片を含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記血液段階抗原が、好ましくは、組換え融合タンパク質(配列番号15)として、PfAMA1−DICO2(配列番号12)およびPfRh2(配列番号38)を、またはその変異体もしくは断片を含む、請求項1から18のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記血液段階抗原が、好ましくは、組換え融合タンパク質(配列番号16)として、PfAMA1−DICO3(配列番号13)、PfRIPR_EGF7/8(配列番号39)を、またはその変異体もしくは断片を含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記血液段階抗原が、
i)PfAMA1−DICO1およびPfMsp1−19、
ii)PfAMA1−DICO2およびPfRh2、ならびに
iii)PfAMA1−DICO3、PfRIPR_EGF7/8
を含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の混合物。 - 前記PfAMA1−DICO1およびPfMsp1−19が、第1の組換え融合タンパク質中に含まれ、PfAMA1−DICO2およびPfRh2が、第2の組換え融合タンパク質中に含まれ、PfAMA1−DICO3およびPfRIPR_EGF7/8が、第3の組換え融合タンパク質中に含まれる、請求項21に記載の混合物。
- 前記第1の組換え融合タンパク質が、配列番号14または1個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドまたはその断片を含む、請求項21または22のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記第2の組換え融合タンパク質が、配列番号15または1個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む、請求項21から23のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記第3の組換え融合タンパク質が、配列番号16または1個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む、請求項21から24のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記有性段階抗原Pfs25およびPfs230C0の変異体が、野生型または除去されたもしくは追加の潜在的なN−グリコシル化部位を有する変異体または断片である、請求項1から25のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記有性段階抗原が、Pfs25およびPfs230C0またはその変異体もしくは断片を含む、請求項1から26のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記有性段階抗原が、組換え融合タンパク質中に含まれる、請求項1から27のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記組換え融合タンパク質が、配列番号4、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27および配列番号28または1個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドまたはその断片からなる群から選択される、請求項28に記載の混合物。
- 4(4)種の組換えポリペプチドを含み、種々の組換えポリペプチドが、以下の抗原:
a)ポリペプチド1:PfCelTOS、PfCSPのTSR−ドメインおよびPfTRAPのTSR−ドメイン、
b)ポリペプチド2:PfgAMA1、
c)ポリペプチド3:PfMsp1−19_EGF1、PfMsp4_EGF、PfMsp8_EGF1、PfMsp8_EGF2およびPfMsp3のN末端断片、
d)ポリペプチド4:Pfs25およびPfs230C0
を含む、請求項1から29のいずれか一項に記載の混合物。 - a)ポリペプチド1:配列番号1、
b)ポリペプチド2:配列番号2、
c)ポリペプチド3:配列番号3、および
d)ポリペプチド4:配列番号4
のアミノ酸配列を有する4(4)種の組換えポリペプチド、
または1個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む、請求項1から30のいずれか一項に記載の混合物。 - 5(5)種の組換えポリペプチドを含み、種々の組換えポリペプチドが、以下の抗原:
a)ポリペプチド1:PfAMA1−DICO1、
b)ポリペプチド2:PfAMA1−DICO2、
c)ポリペプチド3:PfAMA1−DICO3、
d)ポリペプチド4:PfCelTOS、PfCSPのTSR−ドメインおよびPfTRAPのTSR−ドメイン、ならびに
e)ポリペプチド5:Pfs25およびPfs230C0
を含む、請求項1から31のいずれか一項に記載の混合物。 - a)ポリペプチド1:配列番号11、
b)ポリペプチド2:配列番号12、
c)ポリペプチド3:配列番号13、
d)ポリペプチド4:配列番号8および
e)ポリペプチド5:配列番号26
のアミノ酸配列を有する5(5)種の組換えポリペプチド、
または1個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む、請求項1から32に記載の混合物。 - 5(5)種の組換えポリペプチドを含み、種々の組換えポリペプチドが、以下の抗原:
a)ポリペプチド1:PfAMA1−DICO1、
b)ポリペプチド2:PfAMA1−DICO2、
c)ポリペプチド3:PfAMA1−DICO3、
d)ポリペプチド4:PfCelTOS、PfCSPのTSR−ドメインおよびPfTRAPのTSR−ドメインおよびPfRh5a、ならびに
e)ポリペプチド5:Pfs25およびPfs230C0およびPfRh5b
を含む、請求項1から33のいずれか一項に記載の混合物。 - a)ポリペプチド1:配列番号11、
b)ポリペプチド2:配列番号12、
c)ポリペプチド3:配列番号13、
d)ポリペプチド4:配列番号9、および
e)ポリペプチド5:配列番号28
のアミノ酸配列を有する5(5)種の組換えポリペプチド
または1個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む、請求項1から34に記載の混合物。 - 5(5)種の組換えポリペプチドを含み、種々の組換えポリペプチドが、以下の抗原:
f)ポリペプチド1:PfAMA1−DiCo1−Msp1_19FUP、
g)ポリペプチド2:PfAMA1−DiCo2−Rh2、
h)ポリペプチド3:PfAMA1−DiCo3−RIPR7/8、
i)ポリペプチド4:PfCelTOS、PfCSPのTSR−ドメインおよびPfTRAPのTSR−ドメインおよびPfRh5a、ならびに
j)ポリペプチド5:Pfs25およびPfs230C0およびPfRh5b
を含む、請求項1から35のいずれか一項に記載の混合物。 - f)ポリペプチド1:配列番号14、
g)ポリペプチド2:配列番号15、
h)ポリペプチド3:配列番号16、
i)ポリペプチド4:配列番号9、および
j)ポリペプチド5:配列番号28
のアミノ酸配列を有する5(5)種の組換えポリペプチド、
または1個もしくは複数のアミノ酸残基の置換、挿入、付加もしくは欠失により組換えもしくは合成法によって生成されるその相同ポリペプチドを含む、請求項1から36に記載の混合物。 - 前記ポリペプチドが、等モル比または任意のその他の比で混合物中に含まれる、請求項30から37のいずれか一項に記載の混合物。
- a)配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号4の配列を有するポリペプチド、
b)配列番号8、配列番号11、配列番号12、配列番号13および配列番号26の配列を有するポリペプチド、
c)配列番号9、配列番号11、配列番号12、配列番号13および配列番号28の配列を有するポリペプチド、
d)配列番号8、配列番号14、配列番号15、配列番号16および配列番号26の配列を有するポリペプチド、
e)配列番号9、配列番号14、配列番号15、配列番号16および配列番号28の配列を有するポリペプチド、
f)好ましくは1個もしくは複数のアミノ酸残基が保存的に置換されている、a)〜e)のポリペプチドの修飾された形態;
g)ストリンジェントな条件下でa)〜f)の核酸分子のいずれかとハイブリダイズ可能である核酸分子
h)ストリンジェントな条件下でa)〜f)の核酸分子のいずれかの相補体とハイブリダイズ可能である核酸分子
i)a)〜h)の核酸分子のいずれかと少なくとも85%の配列同一性を有する核酸分子
j)またはa)〜i)の核酸分子のいずれかの相補体
をコードする単離された核酸分子または複数の核酸分子。 - 請求項39に記載のヌクレオチド分子を含むベクター。
- 請求項40に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 植物細胞である、請求項41に記載の宿主細胞。
- 前記植物がベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)またはタバコ(Nicotiana tabacum)である、請求項42に記載の宿主細胞。
- 酵母細胞である、請求項41に記載の宿主細胞。
- 前記酵母が、コマガタエラ・パストリス(Komagataella pastoris)である、請求項44に記載の宿主細胞。
- 生理学的に許容される媒体中に、有効成分としての請求項1から38のいずれか一項に記載の混合物および担体を含む、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)に対してヒト個体を免疫処置するためのワクチン組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項46に記載のワクチン組成物。
- 組換えタンパク質の混合物を生成する方法であって、(a)前記組換えタンパク質を生成するのに適した条件下、適した培養培地中で請求項41に記載の宿主細胞を培養するステップと、(b)前記生成された組換えタンパク質を得るステップと、任意選択で、(c)前記組換えタンパク質をプロセシングするステップとを含む、方法。
- 前記宿主細胞が、植物細胞である、請求項48に記載の方法。
- 前記植物が、藻類、コケ、単子葉植物および/または双子葉植物からなる群から選択される、請求項49に記載の方法。
- 前記植物が、オランダミツバ属(Apium)、シロイヌナズナ属(Arabidopsis)、アブラナ属(Brassica)、トウガラシ属(Capsium)、ニンジン属(Daucus)、オオムギ属(Hordeum)、アキノノゲシ属(Lactuca)、トマト属(Lycopersicon)、タバコ属(Nicotiana)、ペチュニア属(Petunia)、シロガラシ属(Sinapis)、ナス属(Solanum)、コムギ属(Triticum)またはトウモロコシ属(Zea)からなる群に由来する属から選択される、請求項49に記載の方法。
- 前記植物がベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)またはタバコ(Nicotiana tabacum)である、請求項49に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、酵母細胞である、請求項48に記載の方法。
- 前記酵母が、コマガタエラ・パストリス(Komatagaella pastoris)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisae)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)またはシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosacharomyces pombe)からなる群から選択される、請求項53に記載の方法。
- 患者において熱帯性マラリアを治療および/または予防するための方法であって、治療有効量の請求項1から38のいずれか一項に記載の組換えタンパク質の混合物または請求項46もしくは47に記載のワクチン組成物を投与するステップを含む、方法。
- 請求項1から38のいずれか一項に記載の混合物中の種々の組換えタンパク質と結合する、種々の単離された抗体またはその断片を含む抗体組成物。
- 請求項56に記載の抗体組成物を含む診断アッセイ。
- 請求項56に記載の抗体組成物または請求項55に記載の診断アッセイを含む診断キット。
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