JP2017502692A - 癌免疫療法のための新規ｍｓｌｎ標的化ｄｎａワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、メソテリン（Mesothelin）をコードする組換えＤＮＡ分子を含む、サルモネラ（Salmomnella）の弱毒化された変異体株に関する。特に、本発明は、癌免疫療法への前記サルモネラの弱毒化された変異体株の使用に関する。

Description

発明の分野
本発明は、メソテリン（Mesothelin）をコードする組換えＤＮＡ分子を含む、サルモネラ（Salmomnella）の弱毒化された変異体株に関する。特に、本発明は、癌免疫療法への前記サルモネラの弱毒化された変異体株の使用に関する。

発明の背景
メソテリンは、種々のヒト固形腫瘍の細胞表面上に存在するグリコシル−ホスファチジルイノシトールアンカー糖タンパク質である。メソテリンは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｋ１として最初に同定された（Chang et al., 1995）。メソテリン（ＭＳＬＮ）遺伝子は、メソテリンと呼ばれる、ｍＡＢ Ｋ１が結合する成熟部分である４０−ｋＤａのグルコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質、及び細胞から放出される巨核球増強因子と呼ばれるＮＨ₂−末端の３１−ｋＤａのフラグメントにプロセッシングされる７１−ｋＤａの前駆体タンパク質をコードする。メソテリンは、制限された組の正常成人組織、例えば中皮上で低レベルで存在するが、しかし中皮腫、卵巣癌及び膵臓癌において異常に過剰発現される腫瘍分化抗原である（Hassan et al., 2004）。従って、ＭＳＬＮは、癌ワクチンの開発のための有望な候補体である。

メソテリン（ＭＳＬＮ）は、免疫療法のための標的抗体として記載されている（Hassan et al., Clin Cancer Res, 2004）。いくつかの免疫療法アプローチは、ＭＳＬＮ過剰発現腫瘍型を標的化するために使用されてきた。Hassan et al. (Clin Cancer Res, 2004)は、成熟ヌードマウスにおいて抗腫瘍活性を示す抗−メソテリン免疫毒素ＳＳ１Ｐ[SS1(dsFv)PE38]を開示している。近年では、ボーラス注射又は連続静脈内注入を通しての抗メソテリン免疫毒素ＳＳ１Ｐ又はキメラ性抗−メソテリンモノクローナル抗体ＭＯＲＡｂ−００９の投与に基づいてのいくつかの初期段階の臨床試験が開始されている（Kelly et al., Mol Cancer Ther 2012に総合的に要約されている）。第Ｉ／II期臨床試験下で現在試験された別の免疫療法アプローチは、抗メソテリン修飾リンパ球の投与に基づかれている（ClinicalTrials.gov; 識別番号NCT01355965 and NCT01439152）。Dung et al. (Clin Cancer Res, 2012) は、静脈内投与される、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）に基づくメソテリンワクチンを開示している。Yamasaki et al. (Int J Cancer, 2013) は、ヒトアデノウィルス４０に基かれる静脈内遺伝的メソテリンワクチンを開示している。

サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）の弱毒化された誘導体は、S.エンテリカ株が免疫化の粘膜経路を介して、すなわち非経口投与に比べて単純且つ安全性の利点を提供する、経口又は経鼻的に送達され得るので、哺乳類免疫系への異種抗原の送達のための魅力的ビークル (vehicles)である。さらに、サルモネラ株は、全身性及び粘膜区画の両レベルで強い体液性及び細胞性免疫応答を誘発する。バッチ製造費用は比較的低く、そして細菌性生ワクチンの製剤は非常に安定している。弱毒化は、種々の遺伝子、例えば毒性、調節及び代謝性遺伝子の欠失により達成され得る。

ａｒｏ突然変異により弱毒化されたいくつかのサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）株は、動物モデルにおいて異種抗原のための安全且つ効果的な送達ビークルであることが示されている。

生存弱毒化サルモネラ・チピムリウム株を介して、マウス標的細胞中に、ＤＮＡコンストラクトコード抗原、特に腫瘍間質抗原を送達するアプローチが、国際公開第０３／０７３９９５号に記載されている。Niethammer et al., (Nature Medicine 2002, 8(12), 1369) は、腫瘍血管形成のために必須であるネズミ血管内成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２又はＦＬＫ−１）をコードする発現ベクターを有する、弱毒化Ｓ．チピムリウム ａｒｏＡ株ＳＬ７２０７が、癌ワクチンとして機能的であることを示している。

しかしながら、ヒトへの使用のために許容され、そしてVivotif（登録商標）（Berna Biotech Ltd., a Crucell Company, Switzerland; 販売承認番号PL 15747/0001 dated 16 December 1996）の商品名で市販されている、わずか１種の弱毒化サルモネラ・エンテリカ血清型株、すなわちサルモネラ・エンテリカ血清型チフィ （Salmonella enterica serovar Ty21a）Ｔｙ２１ａ（短縮すると：Ｓ．チフィＴｙ２１ａ）が存在する。

腸チフスに対するこの十分に許容される経口生ワクチンは、野生型ビルレント細菌単離物Ｓ．チフィＴｙ２の化学的突然変異誘発により誘導され、そしてgalE遺伝子における機能喪失突然変異及び他のあまり定義されていない突然変異を有する。フィールド試験において有効且つ安全であることが示された後、多くの国々で腸チフスワクチンとして許可されている。

国際公開第２０１３／０９１８９８号は、ガラクトースエピメラーゼ活性を欠き、そして組換えＤＮＡ分子を保有する、弱毒化された変異体サルモネラ・チフィ株を増殖するための方法を開示している。

ＭＳＬＮは、癌ワクチンの開発のための有望な腫瘍抗原である。これまで利用できるＭＳＬＮワクチンの主な制限は、静脈内投与経路を介しての投与及び関連する副作用である。ＭＳＬＮの標的化に基づく改善された癌治療アプローチのための高い必要性は、これまで満たされていない。

本発明の目的
従来技術の観点から、新規の経口ＭＳＬＮ標的化癌ワクチンを提供することが本発明の目的である。そのようなＭＳＬＮ標的化癌ワクチンは、癌患者のための治療選択肢を改善するための主要利点を提供するであろう。

発明の概要
１つの側面によれば、本発明は、メソテリン (ＭＳＬＮ)をコードする発現カセットを含む組換えＤＮＡ分子の少なくとも１つのコピーを含むサルモネラの弱毒化された変異体株に関する。

本発明の弱毒化されたサルモネラ株は、健常マウスにおいて強い免疫応答を誘発することが示されている。本発明者の知る限り、この新規の弱毒化されたサルモネラ株は、ＭＳＬＮを標的化する最初の経口癌ワクチンである。ＭＳＬＮは中皮腫、卵巣及び膵臓癌、及び広範囲の他の腫瘍において過剰発現されるので、本発明の弱毒化されたサルモネラ株は、それらの症状の治療のための癌ワクチンとして高い可能性を有する。

最初の研究では、本発明のワクチン（ＶＸＭ０４）は、健常なマウスにおいて強いＭＳＬＮ特異的免疫応答を誘発したことが実証されている。それらの結果は、ＶＸＭ０４によるワクチン化がＭＳＬＮを過剰発現する腫瘍細胞に対して免疫応答、及び免疫記憶の発達を導くことができることを示唆する。新規ワクチンＶＸＭ０４が相対的に低い用量で効果的であることは顕著であり、且つ驚くべきことである。本発明の弱毒化されたサルモネラ変異体株は、単剤療法で、又は第２腫瘍抗原をコードするＤＮＡ分子を含む、サルモネラの第２の弱毒化された変異体株と組み合わせて適用され得る。さらに、本発明の弱毒化されたサルモネラ変異体株は、化学療法、放射線療法又は生物学的癌治療と組み合わせて投与され得る。ＶＸＭ０４による治療はまた、患者が化学療法に対する耐性を進める場合（化学療法−不応性患者）、効果的であり得る。従って、本発明の新規の弱毒化されたサルモネラ変異体株は、新規の非常に改善された癌療法アプローチにおいて有用であり得る。

特定の実施形態によれば、前記サルモネラの弱毒化された変異体株は、サルモネラ・エンテリカ種のものである。特定の実施形態によれば、前記サルモネラの弱毒化された変異体株は、サルモネラ・チフィ（チフス菌）（Salmonella typhi）Ty21aである。

特定の実施形態によれば、前記発現カセットは真核生物の発現カセットである。

特定の実施形態によれば、前記ＭＳＬＮは、ヒトＭＳＬＮ、及びそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有するタンパク質から成る群から選択される。

特定の実施形態によれば、ＭＳＬＮは、配列番号１に見られるようなアミノ酸配列を有する。

特定の実施形態によれば、前記組換えＤＮＡ分子は、ＣＭＶプロモーターの制御下で、カナマイシン抗生物質耐性遺伝子、ｐＭＢ１ ｏｒｉ、及びヒトＭＳＬＮ、又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有するタンパク質をコードする真核生物発現カセットを含む。特定の実施形態によれば、ヒトＭＳＬＮは配列番号２に見られるような核酸配列を有する。

特定の実施形態によれば、サルモネラの弱毒化された変異体株は、医薬として使用するためのものである。

特定の実施形態によれば、サルモネラの弱毒化された変異体株は、ワクチンとして使用するためである。

特定の実施形態によれば、サルモネラの弱毒化された変異体株は、癌免疫療法への使用のためである。

特定の実施形態によれば、癌免疫療法がさらに、腫瘍抗原及び／又は腫瘍間質抗原をコードする発現カセットを含む組換えＤＮＡ分子の少なくとも１つのコピーを含む、サルモネラの１又は２以上のさらに弱毒化された変異体株の投与を包含する。特定の実施形態によれば、前記サルモネラの１又は２以上のさらに弱毒化された変異体株は、真核生物発現カセットを含むチフス菌Ｔｙ２１ａである。特定の実施形態によれば、前記サルモネラの１又は２以上のさらに弱毒化された変異体株はヒトＶＥＧＦＲ−２及び／又はヒトウィルムス’（Ｗｉｌｍｓ’）腫瘍タンパク質（ＷＴ１）をコードするサルモネラの弱毒化された変異体株を含む。

特定の実施形態によれば、前記サルモネラの弱毒化された変異体株は、前記サルモネラの１又は２以上のさらに弱毒化された変異体株と共に同時投与される。

特定の実施形態によれば、前記癌免疫療法は、化学療法、放射線療法又は生物学的癌療法を伴う。

特定の実施形態によれば、前記サルモネラの弱毒化された変異体株は、前記化学療法又は放射線療法治療サイクルの間、又は生物学的癌療法の間に投与される。

特定の実施形態によれば、前記サルモネラの弱毒化された変異体株は、前記化学療法又は放射線療法治療サイクルの前、又は生物学的癌療法の前に投与される。

特定の実施形態によれば、前記サルモネラの弱毒化された変異体株は、前記化学療法又は放射線療法治療サイクルの後、又は生物学的癌療法の後に投与される。

さらなる実施形態によれば、サルモネラの弱毒化された変異体株は、化学療法、放射線療法治療サイクル及び生物学的癌療法の少なくとも１つの前及び間に投与される。複数の化学療法、放射線療法及び生物学的癌療法が実施される場合、サルモネラの弱毒化された変異体株は、それらの療法の少なくとも１つの前又は間、又は前及び間、特にそれらの療法の少なくとも２つの間に投与され得る。

特定の実施形態によれば、前記サルモネラの弱毒化された変異体株は経口投与される。

特定の実施形態によれば、前記癌は、中皮腫、卵巣癌及び膵臓癌、頸部、頭及び首、外陰部、肺及び食道の扁平上皮癌、肺腺癌、子宮内膜癌、二相性滑膜肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍並びに胃腺癌から選択される。

特定の実施形態によれば、単回用量は、約１０⁵〜約１０¹¹、具体的には約１０⁶〜約１０¹⁰、より具体的には約１０⁶〜約１０⁹、より具体的には約１０⁶〜約１０⁸、最も具体的には約１０⁶〜約１０⁷個のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む。

特定の実施形態によれば、サルモネラの弱毒化された変異体株は、ＭＳＬＮ発現パターン及び／又は患者のＭＳＬＮに対する予備免疫応答を評価する工程を含む個別化された癌免疫療法へ使用するためのものである。

図１は、プラスミドｐＶＡＸ１０.ｈＭＳＬＮに含まれるＭＳＬＮ ｃＤＮＡによりコードされるヒトＭＳＬＮのアミノ酸配列を示す。 図２は、ｐＶＡＸ１０.ｈＭＳＬＮの核酸配列を示す。 図３は、ｐＶＡＸ１０.ｈＭＳＬＮのプラスミド地図を示す。 図４は、ＭＳＬＮ−ＧＳＬ−Ｐｅｎｔａにより検出される場合、健常Ｃ５７ＢＩ／６マウスからの脾臓におけるＭｅｓｏ−特異的ＣＤ８＋細胞の百分率を示す。ＶＸＭ−０４ｍにより処理されたマウス全体に比較して、ＶＸＭ−０４ｍ−emptyにより処理されたマウス全体の個々の百分率が示される。 図５は、ＭＳＬＮ−ＧＳＬ−Ｐｅｎｔａにより検出される場合、健常Ｃ５７ＢＩ／６マウスからの脾臓におけるＭｅｓｏ−特異的ＣＤ８＋細胞の百分率を示す。処理グループに応じて分配された個々の百分率が示される。 図６は、ＭＳＬＮ−ＧＳＬ−Ｐｅｎｔａにより検出される場合、健常Ｃ５７ＢＩ／６マウスからの脾臓におけるＭｅｓｏ−特異的ＣＤ８＋細胞の百分率を示す。処理グループに応じて分配された個々の百分率が示される。 図７は、ＭＳＬＮ−ＩＱＬ−Ｐｅｎｔａにより検出される場合、健常Ｃ５７ＢＩ／６マウスからの脾臓におけるＭｅｓｏ−特異的ＣＤ８＋細胞の百分率を示す。ＶＸＭ−０４ｍにより処理されたマウス全体に比較して、ＶＸＭ−０４ｍ−emptyにより処理されたマウス全体の個々の百分率が示される。 図８は、ＭＳＬＮ−ＩＱＬ−Ｐｅｎｔａにより検出される場合、健常Ｃ５７ＢＩ／６マウスからの脾臓におけるＭｅｓｏ−特異的ＣＤ８＋細胞の百分率を示す。処理グループに応じて分配された個々の百分率が示される。 図９は、ＭＳＬＮ−ＩＱＬ−Ｐｅｎｔａにより検出される場合、健常Ｃ５７ＢＩ／６マウスからの脾臓におけるＭｅｓｏ−特異的ＣＤ８＋細胞の百分率を示す。処理グループに応じて分配された個々の百分率が示される。

発明の詳細な説明
本発明は、本発明の以下の詳細な説明及び本明細書に含まれる実施例を参照することにより、容易に理解され得る。

１つの側面によれば、本発明は、メソテリン (ＭＳＬＮ)をコードする発現カセットを含む組換えＤＮＡ分子の少なくとも１つのコピーを含むサルモネラの弱毒化された変異体株に関する。

本発明によれば、弱毒化されたサルモネラ株は、メソテリン（ＭＳＬＮ）をコードする発現カセットを含む組換えＤＮＡ分子の標的細胞への送達のために、前記組換えＤＮＡ分子の細菌担体として機能する。

本発明においては、用語「弱毒化された（attenuated）」とは、弱毒化突然変異を保有しない親細菌株に比較して、低められた毒性の細菌株を意味する。弱毒化された細菌株は好ましくは、それらの毒性を失っているが、しかし保護免疫性を誘発するそれらの能力は保持している。弱毒化は、ビルレンス、調節及び代謝遺伝子を包含する種々の遺伝子の欠失により達成され得る。弱毒化された細菌は自然界において見出され得るか、又はそれらは、例えば新しい培地又は細胞培地への適応により、実験室において人工的に製造され得るか、又はそれらは組換えＤＮＡ技法により製造され得る。

本発明においては、用語「変異体株（mutant strain）」とは、そのゲノムに突然変異を保有する細菌株を意味する。ここで、用語「突然変異（mutation）」とは、点突然変異、挿入、欠失、転座及び逆位を包含する核酸配列における変化を意味する。

本発明においては、用語「含む（comprises）」又は「含む（comprising）」とは、「含むが、それらに限定されない（including, but not limited to）」を意味する。この用語は、任意の言及される特徴、要素、整数、工程又は構成要素の存在を特定するために、オープンエンド（open-ended）であることが意図されるが、しかし１又は２以上の他の特徴、要素、整数、工程、構成要素又はそれらの群の存在又は追加を排除するものではない。従って、用語「含む（comprising）」とは、より制限的な用語「〜から成る（consisting of）」及び「〜から実質的に成る（essentially consisting of）」を包含する。１つの実施形態によれば、本出願に、及び特に、請求項内に使用される場合、用語「含む（comprising）」は、用語「〜から成る（consisting of）」により置換され得る。

本発明においては、用語「組換えＤＮＡ分子（recombinant DNA molecule）」とは、好ましくは、異なった起源のＤＮＡ片から構成される、構築されたＤＮＡコンストラクトを意味する。組換えＤＮＡ分子は、発現ベクタープラスミド中に、ＭＳＬＮをコードするオープン・リーディング・フレームを導入することにより生成される線状核酸、又は好ましくは環状組換えＤＮＡプラスミドであり得る。

本発明においては、用語「発現カセット（expression cassette）」とは、少なくとも、ＭＳＬＮ遺伝子を、その発現を制御する調節配列の制御下に含む核酸ユニットを意味する。サルモネラの弱毒化された変異体株に含まれる発現カセットは好ましくは、標的細胞において、前記含まれる、ＭＳＬＮをコードするオープン・リーティング・フレームの転写を媒介することができる。発現カセットは典型的には、プロモーター、少なくとも１つのオープン・リーディング・フレーム、及び転写終結シグナルを含む。

メソテリンは、正常中皮細胞上に存在し、そして中皮腫、及び卵巣及び膵臓腺癌を包含するいくつかのヒト腫瘍において過剰発現される４０−ｋＤａの細胞表面糖タンパク質である。メソテリン遺伝子は、巨核球増強因子（ＭＰＦ）と呼ばれる３１−ＫＤａのシェッドタンパク質、及び４０−ｋＤａの細胞結合メソテリンフラグメントを生成するために、プロセッシングされる、７１−ＫＤａの前駆体タンパク質をコードする。メソテリンは、インターロイキン−３の存在下で巨核球−コロニー形成活性を示すことが示されている。メソテリンは、制限された組の正常成人組織、例えば中皮上に低レベルで存在するが、しかし広範囲の種類のヒト腫瘍、たとえば中皮腫、卵巣癌及び膵臓癌、頸部、頭及び首、外陰部、肺及び食道の扁平上皮癌、肺腺癌、子宮内膜癌、二相性滑膜肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍及び胃腺癌において異常に過剰発現される腫瘍分化抗原である。メソテリンの正常な生物学的機能は不明である。メソテリンノックアウトマウスにおける研究は、検出できる表現型を示さず、そして雄及び雌の両マウスは健常な子孫を生んだ。膵臓癌における研究は、メソテリンが細胞増殖、移行及びＳ期細胞集団を高めることにより、腫瘍形成において役割を演じていることを示唆している。さらに、メソテリンが免疫原性タンパク質であるという証拠がある。その発現プロフィールに、その発癌性機能及びその免疫原性のために、腫瘍抗原メソテリンは、癌ワクチンの開発のための有能な候補体である。

メソテリンは、制限された組の正常成人組織、例えば中皮上に低レベルで存在するが、しかし中皮腫、卵巣癌及び膵臓癌において異常に過剰発現される腫瘍分化抗原である（Ｈassan et al., 2004）。従って、ＭＳＬＮは、癌ワクチンの開発のための有能な候補体である。

特定の実施形態によれば、サルモネラの弱毒化された変異体株は、サルモネラ・エンテリカ種のものである。特定の実施形態によれば、サルモネラの弱毒化された変異体株は、サルモネラ・チフィＴｙ２１ａである。弱毒化されたＳ．チフィＴｙ２１ａ株は、Vivotif（登録商標）（Berna Biotech Ltd., a Crucell Company, Switzerlandにより製造される）としても知られているTyphoral L（登録商標）の活性成分である。それは現在、腸チフスに対して唯一のライセンス取得された経口生ワクチンである。このワクチンは、広範囲に試験されており、そして患者の毒性だけでなく、第三患者への伝達に関して安全であることが証明されている（Wahdan et al., J. Infectious Diseases 1982, 145:292-295）。このワクチンは、世界４０ヶ国以上で承認されている。Typhoral L（登録商標）の販売承認番号は、1996年１２月１６日付けのPL１５７４７／０００１である。ワクチンの１用量は、少なくとも２×１０⁹個の生存S.チフィＴｙ２１ａコロニー形成単位及び少なくとも５×１０⁹個の非生存S. チフィＴｙ２１ａ細胞を含む。

サルモネラ・チフィＴｙ２１ａ細菌株の生化学的性質の１つは、ガラクトースを代謝できないその能力である。弱毒化された細菌株はまた、硫酸塩を硫化物に還元することができず、このことは野生型サルモネラ・チフィＴｙ２株と区別される。その血清学的特性に関して、サルモネラ・チフィＴｙ２１ａ株は、細菌の外膜の多糖であるＯ９−抗原を含み、そしてサルモネラ・チフィムリウムの特徴的成分であるＯ５−抗原を欠いている。この血清学的特性は、バッチリリースのためのアイデンティティ試験のパネルにそれぞれの試験を含むための理論的根拠を支持する。

特定の実施形態によれば、発現カセットは、真核生物発現カセットである。本発明においては用語「真核生物発現カセット（eukaryotic expression cassette）」とは、真核細胞におけるオープン・リーディング・フレームの発現を可能にする発現カセットを意味する。十分な免疫応答を誘発するのに必要とされる異種抗原の量は、細菌に対しては毒性であり、そして細胞死、過剰弱毒化、又は異種抗原の発現の損失をもたらすことができることは示されている。細菌ベクターにおいて、但し標的細胞においてのみ発現されない真核生物発現カセットの使用がこの毒性問題を克服でき、そして発現されるタンパク質は、真核生物グリコシル化パターンを示すことができる。

真核生物発現カセットは、真核細胞においてオープン・リーディング・フレームの発現を制御できる調節配列、好ましくはプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む。本発明のサルモネラの弱毒化された変異体株により含まれる組換えＤＮＡ分子に含まれるプロモーター及びポリアデニル化シグナルは、好ましくは、免疫化される対象の細胞内で機能的であるよう選択される。特に、ヒトのためのＤＮＡワクチンの製造のための適切なプロモーターの例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）からのプロモーター、例えば強ＣＭＶ最初期プロモーター、シミアンウイルス40（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）からプロモーター、例えばＨＩＶ長末端反復（ＬＩＲ）プロモーター、モロニーウィルス、エプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）からのプロモーター、及びラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）からのプロモーター、並びにヒト遺伝子、例えばヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、及びヒトメタロチオネインからのプロモーター。特定の実施形態によれば、真核生物発現カセットは、ＣＭＶプロモーターを含む。本発明においては、用語「ＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ promoter）」とは、強い即時−初期サイトメガロウィルスプロモーターのことである。

特に、ヒトのためのＤＮＡワクチンの製造のための適切なポリアデニル化シグナルの例は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化部位、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びＬＴＲポリアデニル化シグナルを包含するが、但しそれらだけには限定されない。特定の実施形態によれば、本発明のサルモネラの弱毒化された変異体株により含まれる組換えＤＮＡ分子に含まれる真核生物発現カセットは、ＢＧＨポリアデニル化部位を含む。

異種ＭＳＬＮ遺伝子の発現のために必要とされる調節要素の他に、プロモーター及びポリアデニル化シグナルのように、他の要素もまた、組換えＤＮＡ分子に含まれ得る。そのような追加の要素は、エンハンサーを包含する。例えば、エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンのエンハンサー、及びウィルスエンハンサー、例えばＣＭＶ、ＲＳＶ及びＥＢＶからのそれらのエンハンサーであり得る。

調節配列及びコドンは一般的に、種依存性であり、結果的に、タンパク質製造を最大にするために、調節配列及びコドンは好ましくは、免疫化される種において効果的であるよう選択される。当業者は、所定の対象種において機能的である組換えＤＮＡ分子を製造することができる。

特定の実施形態によれば、ＭＳＬＮは、ヒトＭＳＬＮ、及びそれと少なくとも約８０％の配列同一性を共有するタンパク質から成る群から選択される。

これに関連して、用語「約（about）」又は「おおよそ（approximately）」とは、所定の値又は範囲の８０％〜１２０％以内、他方では９０％〜１１０％以内、例えば９５％〜１０５％以内を意味する。

本発明においては、用語「ヒトＭＳＬＮと少なくとも約８０％の配列同一性を共有するタンパク質ＭＳＬＮ（protein that shares at least about 80% sequence identity with human MSLN）」とは、ヒトＭＳＬＮのアミノ酸配列、及び／又はそのアミノ酸配列をコードする核酸配列において異なるタンパク質を意味する。タンパク質は、天然起源のもの、例えば異なった種のＭＳＬＮの相同体、又は構築されたタンパク質、例えば構築されたＭＳＬＮ誘導体であり得る。コドンの使用は、種間で異なることは知られている。従って、標的細胞において異種タンパク質を発現する場合、標的細胞のコドン使用に核酸配列を適合させることが、必要であり、又は少なくとも、助けになる．所定のタンパク質の誘導体を企画し、そして構成するための方法は、当業者の誰にも良く知られている。

ヒトＭＳＬＮと、少なくとも約８０％の配列同一性を共有するタンパク質は、１又は２以上のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を含む、１又は２以上の突然変異を含むことができる。本発明の教示によれば、前記欠失され、付加され、そして／又は置換されたアミノ酸は、連続したアミノ酸であっても良く、又はヒトＭＳＬＮと、少なくとも約８０％の配列同一性を共有するタンパク質のアミノ酸配列の長さにわたって散在されても良い。本発明の教示によれば、任意の数のアミノ酸は、ヒトＭＳＬＮとの配列同一性が少なくとも約８０％である限り、付加され、欠失され、そして／又は置換され得る。特定の実施形態によれば、ヒトＭＳＬＮとの配列同一性は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９５％、又は最も具体的には、少なくとも約９５％である。親タンパク質、及び欠失、付加及び／又は置換を有するその誘導体の親配列に対する比較を包含する、配列同一性を決定するための方法及びアルゴリズムは、当該技術分野における通常の技術の実務者に十分に知られている。ＤＮＡレベルに基づけば、ヒトＭＳＬＮと、少なくとも約８０％の配列同一性を共有するタンパク質をコードする核酸配列は、遺伝子コードの縮重のために、かなりの程度、異なる。

特定の実施形態によれば、ＭＳＬＮは、配列番号１に見られるようなアミノ酸配列を有する。

特定の実施形態によれば、組換えＤＮＡ分子が、ＣＭＶプロモーターの制御下で、カナマイシン抗生物質耐性遺伝子、ｐＭＢ１ ｏｒｉ、及びヒトＭＳＬＮ、又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有するタンパク質をコードする真核生物発現カセットを含む。特定の実施形態によれば、ヒトＭＳＬＮは、配列番号２に見られるような核酸配列を有する。

特定の実施形態によれば、組換えＤＮＡ分子は、市販のｐＶＡＸ１（登録商標）発現プラスミド（nvitrogen, San Diego, California）に由来する。この発現ベクターは、ｐＢＲ３２２の複製の低コピーｐＭＢ１起点により、複製の高コピーｐＵＣ起点を置換することにより修飾された。低コピー修飾は、代謝負荷を低め、そしてそのコンストラクトを、より安定にするために行われた。生成された発現ベクター主鎖がｐＶＡＸ１０と命名された。ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩを介して、この発現ベクター主鎖中への、配列番号２で見られるような核酸配列を有するヒトＭＳＬＮの挿入が、発現プラスミドｐＶＡＸ１０.ｈＭＳＬＮを生成した。この発現プラスミドｐＶＡＸ１０.ｈＭＳＬＮは、図３に概略されている。

特定の実施形態によれば、サルモネラの弱毒化された変異体株は、医薬としての使用のためのものである。

特定の実施形態によれば、サルモネラの弱毒化された変異体株は、ワクチンとしての使用のためのものである。

本発明においては、用語「ワクチン（Vaccine）」とは、投与に基づいて、対象に免疫応答を誘発できる剤を意味する。ワクチンは好ましくは、疾患を予防し、改善するか、又は治療することができる。本発明のワクチンは、サルモネラの弱毒化された変異体株、好ましくはＳ．チフィＴｙ２１ａを含む。本発明のワクチンはさらに、発現カセット、好ましくは、ヒトＭＳＬＮ又はそれと少なくとも約８０％の配列同一性を共有するタンパク質から選択された、ＭＳＬＮコードの真核生物発現カセットを含む組み換えＤＮＡ分子の少なくとも１つのコピーを含む。

ＭＳＬＮコードの組換えＤＮＡ分子を含む本発明の弱毒化された生変異体株は、この組換えＤＮＡ分子の経口送達のためのビークルとして使用され得る。異種抗原、例えばＭＳＬＮをコードするＤＮＡ分子を含むそのような送達ベクターは、ＤＮＡワクチンと呼ばれる。

遺伝子免疫化は、従来のワクチン接種よりも好都合であり得る。標的ＤＮＡは、相当の期間、検出され得、従って抗原のデポー (depot)として作用する。ＧｐＣアイランドのような、いくつかのプラスミドにおける配列モチーフは、免疫刺激性であり、そしてＬＰＳ及び他の細菌成分のために、免疫刺激によりさらに促進されるアジュバントとして機能することができる。

生細菌ベクターは、他の投与形、例えばマイクロカプセル化よりも利点を構成することができる、それら自体の免疫調節因子、例えばリポ多糖（ＬＰＳ）を、現場産生する。さらに、サルモネラのように多くの細菌は、パイエル板（Peyer’s patches）のＭ細胞を介して腸管内腔から出、そして結果的に、リンパ節及び脾臓に移行し、従って免疫系の誘導部位へのワクチンの標的化を可能にするので、自然エントリー経路の使用は、有益であるものとして証明している。サルモネラ・チフィのワクチン株Ｔｙ２１ａは、卓越した安全性プロフィールを有することが現在まで実証されて来た。Ｍ細胞を介して腸管内腔から出る時点で、細菌は、食細胞、例えばマクロファージ及び樹状細胞により取り込まれる。それらの細胞は、病原体により活性化され、そして分化し始め、そしておそらく、リンパ節及び脾臓に移行する。それらの弱毒化突然変異のために、Ｓ．チフィＴｙ２１株の細菌は、それらの食細胞内に存続することができず、この時点で死亡する。組換えＤＮＡ分子は、特定の輸送系を介して、又はエンドソーム漏れにより、放出され、そして続いて、貧食免疫細胞の細胞質ゾル中に移送される。最終的に、組換えＤＮＡ分子は核中に侵入し、ここでそれらは転写され、食細胞の細胞質ゾル中でのＭＳＬＮ発現を導く。ＭＳＬＮに対する特異的細胞毒性Ｔ細胞が活性化された抗原提示細胞により誘発される。

Ｓ．チフィＴｙ２１ａが全身流血中に侵入できることを示す、今日まで入手できるデータは存在しない。従って、弱毒化されたサルモネラ・チフィＴｙ２１ａ生ワクチン株は、卓越した安全性プロフィールを示すと共に、免疫系の特異的標的化を可能にする。対照的に、アデノウィルスに基づくＤＮＡワクチンは、意図せぬウィルス複製の固有の免疫性を負担する可能性がある。

サルモネラ・エンテリカの弱毒化された誘導体は、Ｓ．エンテリカ株は、免疫化の粘膜経路を介して、すなわち経口的に又は経鼻的に、実質的に送達され、これが、非経口投与に比較して、単純性及び安全性の利点を提供するので、哺乳類免疫系への異種抗原の送達のためのビークルとして魅力的である。さらに、サルモネラ株は、全身性及び粘膜性区画の両レベルで、強い体液性及び細胞性免疫応答を誘発する。

特定の実施形態によれば、サルモネラの弱毒化された変異体株は、癌免疫療法への使用のためである。

特定の実施形態によれば、癌免疫療法はさらに、腫瘍抗原及び／又は腫瘍間質抗原をコードする発現カセットを含む組換えＤＮＡ分子の少なくとも１つのコピーを含む、サルモネラの１又は２以上のさらに弱毒化された変異体株の投与を包含する。特定の実施形態によれば、前記サルモネラの１又は２以上のさらに弱毒化された変異体株が真核生物発現カセットを含むチフス菌Ｔｙ２１ａである。特定の実施形態によれば、前記１又は２以上のサルモネラ株はさらに、ヒトＶＥＧＦＲ−２及び／又はヒトウィルムス（Ｗｉｌｍｓ’）腫瘍タンパク質（ＷＴ１）をコードするサルモネラの弱毒化された変異体株を含む。

本発明のサルモネラの弱毒化された変異体株と、第２の腫瘍抗原をコードするＤＮＡ分子を含む第２の弱毒化された変異体株との組み合わせは、相乗的抗腫瘍効果を有することができる。特に、異なった腫瘍抗原の同時標的化は、腫瘍逃避の危険性を最小限に抑えることができる。ＭＳＬＮに基づく癌免疫療法と、ＶＥＧＦＲ−２に基づく免疫療法との組み合わせは、ＭＳＬＮ過剰発現腫瘍細胞及び腫瘍血管形成が同時に攻撃されるので、特に効果的であり得る。

特定の実施形態によれば、サルモネラの弱毒化された変異体株は、前記サルモネラの１又は２以上のさらに弱毒化された変異体株と共に同時投与される。

本発明においては、用語「同時投与（co-administration）」又は「同時投与する（co-administer）」とは、サルモネラの２種の異なった弱毒化された変異体株の３日連続で、より具体的には、２日連続での、より具体的には、同日での、より具体的には、１２時間以内での投与を意味する。最も具体的には、本発明においては、用語「同時投与」とは、サルモネラの２種の異なった弱毒化された変異体株の同時投与のことである。

特定の実施形態によれば、癌免疫療法は、化学療法、放射線療法又は生物学的癌療法を伴う。癌の治療のためには、癌幹細胞の完全な根絶が必須である。最大効力のためには、異なった治療アプローチの組み合わせが有益であり得る。

本発明においては、用語「生物学的癌療法（biological cancer therapy）」とは、生存生物、生存生物由来の物質、又はそのような物質の実験室製造されたバージョンの使用を包含する癌療法を意味する。癌についてのいくつかの生物学的療法は、癌細胞に対して作用する身体の免疫系を刺激することを目的とする（いわゆる、生物学的癌免疫療法）。生物学的癌療法アプローチは、腫瘍抗原の送達、治療抗体、例えば薬剤の送達、免疫刺激サイトカインの投与、及び免疫細胞の投与を包含する。治療抗体は、腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原を標的化する抗体、及びチェックポイント阻害剤として機能する抗体、例えば抗−ＰＤ−１、抗−ＰＤ−Ｌ１及び抗−ＣＴＬＡ４を包含する。

本発明のサルモネラの弱毒化された変異体株と組み合わせて使用され得る化学療法剤は、例えば次のものであり得る：ゲムシタビン、アミホスチン（エチオール）、カバジタキセル、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、メクロレタミン、ストレプトゾトシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシンリポ（ドキシル）、オレイン酸、ゲムシタビン（ジェムザール）、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ（ダウノキソーム）、プロカルバジン、ケトコナゾール、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、5-フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、１０−ヒドロキシ−７−メチルカンプトテシン（ＳＮ３８）、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンα、インターフェロンβ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、オキサリプラチン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾトシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、及びそれらの組み合わせ。

ＶＸＭ０４と組み合わせての最も好ましい本発明の化学療法剤は、カバジタキセル、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、ドセタキセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、パクリタキセル（タキソール）、イリノテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、フォリン酸、５−フルオロウラシル及びブレオマイシン、特にゲムシタビンである。

可能性ある副作用の発生に依存して、抗生物質又は抗炎症剤による治療を包含することはまた、有益であり得る。

ヒスタミン、ロイコトリエン又はサイトカインにより媒介される過敏反応に類似する有害事象が発生した場合、発熱、アナフィラキシー、血圧不安定性、気管支痙攣、呼吸困難のための治療の選択肢が利用できる。所望しないＴ−細胞由来の自動攻撃の場合の治療の選択肢は、幹細胞移植後に適用される、急性及び慢性の移植片対宿主病における標準的な治療スキームに由来する。シクロスポリン及びグルココルチコイドは、治療の選択肢として提案されている。

全身性サルモネラ・チフィＴｙ２１ａ型感染の可能性が低い場合、例えばフルオロキノロン、例えばシプロフロキサシン又はオフロキサシンによる適切な抗生物質療法が推薦される。胃腸管の細菌感染は、それぞれの薬剤、例えばリファキシミンにより治療されるべきである。

特定の実施形態によれば、サルモネラの弱毒化された変異体株は、化学療法又は放射線療法治療サイクルの間、又は生物学的癌療法の間、投与される。

特定の実施形態によれば、サルモネラの弱毒化された変異体株は、化学療法又は放射線療法治療サイクルの前、又は生物学的癌療法の前、投与される。このアプローチは、化学療法又は放射線療法が高められた癌免疫性の条件下で、行われ得る利点を有する。

特定の実施形態によれば、サルモネラの弱毒化された変異体株は、化学療法又は放射線療法治療サイクルの後、又は生物学的癌療法の後、投与される。

特定の実施形態によれば、サルモネラの弱毒化された変異体株は、経口投与される。経口投与は、非経口投与よりも、より簡単で、安全で且つより快適である。対照的に、細菌生ワクチン、例えばDung et al., (Clin Cancer Res, 2012)に記載される、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）に基づくメソテリンワクチンの静脈内投与は、当初、敗血症型の安全性リスクに関連する菌血症を引起す。従って、細菌生ワクチンの静脈内投与は、注意した観察及び臨床学的症状、例えばサイトカイン放出のモニタリングを必要とする。本発明の弱毒化された変異体株の経口投与は、記載されるリスクを少なくとも部分的に克服することができる。しかしながら、本発明の野サルモネラの弱毒化された変異体株はまた、任意の他の適切な経路によっても投与され得ることは注目されるべきである。好ましくは、治療的有効用量が対象に投与され、そしてこの用量は、特定の用途、悪性腫瘍の種類、対象の体重、年齢、性別及び健康の状態、投与方法及び製剤、等に依存する。投与は、必要に応じて、単回又は複数回であり得る。

本発明のサルモネラの弱毒化された変異体株は、溶液、懸濁液、凍結乾燥物の形、又はいずれか他の適切な形で提供され得る。それは、医薬的に許容できる担体、希釈剤、及び／又は賦形剤と組み合わせて提供され得る。ｐＨ値を調節するための剤、緩衝剤、毒性を調節するための剤、及び同様のものがまた、包含され得る。本発明においては、用語「医薬的に許容できる（pharmaceutically acceptable）」とは、生理学的に許容され、そして哺乳類（例えば、ヒト）に投与される場合、典型的には、有害な反応を生成しない、医薬組成物中の分子実体及び他の成分を意味する。用語「医薬的に許容できる」とはまた、連邦又は州政府の規制当局により承認されるか、又は哺乳類、及びより具体的には、ヒトへの使用のために、米国薬局方又は他の一般的に認められている薬局方に列挙されたことを意味することができる。

特定の実施形態によれば、癌は、中皮腫、卵巣癌及び膵臓癌、頸部、頭及び首、外陰部、肺及び食道の扁平上皮癌、肺腺癌、子宮内膜癌、二相性滑膜肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍及び胃腺癌から選択される。

本発明のワクチンは、比較的低い用量で驚くべき効果的である。特定の実施形態によれば、単回用量は、約１０⁵〜約１０¹¹、具体的には約１０⁶〜約１０¹⁰、より具体的には約１０⁶〜約１０⁹、より特に約１０⁶〜約１０⁸、最も具体的には約１０⁶〜約１０⁷個のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む。低用量のこの細菌生ワクチンの投与は、排泄、及び第三者への伝播のリスクを最少にする。

この場合、用語「約（about）」又は「おおよそ（approximately）」とは、所定の値又は範囲の３倍以内、他方では、２倍以内、例えば１．５以内を意味する。

特定の実施形態によれば、サルモネラの弱毒化された変異体株は、ＭＳＬＮ発現パターン及び／又は患者のＭＳＬＮに対する予備免疫応答を評価する工程を包含する個別化された癌免疫療法への使用のためのものである。

ＶＸＭ０４は、種々の癌型の治療のために、単独で、又は真核発現系を含む、他のサルモネラ・チフィＴｙ２１ａに基づく癌ワクチンと組み合わせて、使用され得る。特定の実施形態によれば、ＶＸＭ０４は、個別化された患者特異的癌治療のために使用され得る。このためには、患者の腫瘍及び／又は間質抗原発現パターン、及び／又は腫瘍及び／又は間質抗原に対する患者の前免疫応答は、患者の特異的腫瘍及び／又は間質抗原パターンを標的化する比較診断により、最初の段階で評価され得る。患者の腫瘍及び／又は間質抗原発現パターン、又は腫瘍及び／又は間質抗原に対する患者の前免疫応答に依存して、ＶＭＸ０４は、単独で、又は真核発現系を含む、１又は２以上の適切なさらなる、サルモネラ・チフィＴｙ２１ａに基づく癌ワクチンと組み合わせて投与され得る。しかしながら、ＶＸＭ０４と、１又は２以上のさらなる、サルモネラ・チフィＴｙ２１ａに基づく癌ワクチンとの組み合わせがまた、固定された組み合わせとして投与され得る。複数のサルモネラ・チフィＴｙ２１ａに基づく癌ワクチンを組合すそれらのカクテルは、棚製品から離れて個別に構成され得る。固定された又は個別化された、その組み合わせは、ＶＸＭ０１（国際公開第２０１３／０９１８９８号）を、抗血管形成基礎療法として含むことができる。

実施例１：組換えプラスミドｐＶＡＸ１０.ｍＭＳＬＮ 及びｐＶＡＸ１０.ｈＭＳＬＮの調製
ヒトＭＳＬＮ（１８９３ｂｐ、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０１３４０４．４によるＭＳＬＮ配列）及びネズミＭＳＬＮ（１８７８ｂｐ、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０１８８５７．１によるＭＳＬＮ配列）を、ｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１由来のｐＶＡＸ１０主鎖中にクローン化した。ＭＳＬＮ ＤＮＡフラグメントを、二本鎖遺伝子合成により生成し、ここでオリゴヌクレオチドを、熱安定性リガーゼを用いて、一緒に連結した。得られる連結生成物を、ＰＣＲにより増幅した。増幅の後、ヒト及びネズミＭＳＬＮのインビトロ合成されたＤＮＡフラグメントを、ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩを介して、ｐＶＡＸ１０主鎖中にクローン化した（組換えプラスミドｐＶＡＸ１０．ＶＲ２−１のＶＥＧＦＲ−２コード領域を、ヒト又はネズミＭＳＬＮにより置換した）。品質管理のために、全体プラスミドを配列決定し、そしてＥ．コリの形質転換の後、それぞれの基準配列に整列させた。両配列は、誤差がないことが判明した。得られるプラスミドを、ｐＶＡＸ１０.ｍＭＳＬＮ 及びｐＶＡＸ１０.ｈＭＳＬＮと命名した。

実施例２：組換えプラスミドによる弱毒化サルモネラ株の形質転換
Ｓ．チフィＴｙ２１ａを、プラスミドｐＶＡＸ１０.ｈＭＳＬＮにより形質転換した。Ｓ．チフィムリウムＳＬ７２０７（ａｒｏＡ^-）を、プラスミドｐＶＡＸ１０.ｍＭＳＬＮにより形質転換した。形質転換は、エレクトロポレーションにより実施された。

コンピテントサルモネラ細胞の調製：
Ｓ．チフィＴｙ２１ａ及びＳ．チフィムリウムＳＬ７２０７のグリセロール培養物を、ＬＢプレート（動物性成分フリーの［ＡＣＦ］大豆ペプトン）上に接種した。プレートを、３７℃で一晩インキュベートした。１つのコロニーを、一晩の液体前培養のために、それぞれ使用した。それぞれ１つのコロニーにより接種された、３ｍｌのＬＢ培地（ＡＣＦ大豆ペプトン）を、３７℃及び１８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。コンピテント細胞を調製するために、２×３００ｍｌのＬＢ培地（ＡＣＦ大豆ペプトン）を、３ｍｌの一晩の培養物により接種し、そして約０．５のＯＤ₆₀₀まで、３７℃及び１８０ｒｐｍでインキュベートした。次に、培養物を、１０分間、氷上に配置した。続いて、細菌を、３０００ｘｇにて４℃で１０分間、遠心分離し、そして各ペレットを、５００ｍｌの氷冷却Ｈ₂Ｏ_destに再懸濁した。新たな遠心分離工程の後、細菌ペレットを、１０％氷冷却グリセロールにより２度、洗浄した。両ペレットを、２ｍｌの１０％グリセロールに一緒に置き、そして最終的に、５０μｌのアリコートで、ドライアイス上で凍結した。使用されたグリセロールは、何れの動物性成分も含まなかった（Sigma Aldrich、G5150）。

コンピテントサルモネラ細胞の形質転換：
各形質転換反応のために、コンピテント細胞の５０μｌアリコートを、氷上で１０分間解凍した。３〜５μｌのプラスミドＤＮＡ（コンピテントＳ．チフィＴｙ２１ａ細胞のためのｐＶＡＸ１０.ｈＭＳＬＮ及びコンピテントＳ．チフィムリウムＳＬ７２０７細胞のためのｐＶＡＸ１０.ｍＭＳＬＮ）を添加した後、その混合物を、氷上で５分間インキュベートとした。続いて、その混合物を、前もって冷却されたキュベット（１ｍｍの厚さ）に移した。電機パルスを、１．５ｋＶ／ｃｍで実施した。その直後、１ｍｌのＬＢ培地（ＡＣＦ大豆ペプトン）を細胞に添加し、細胞を２ｍｌのエッペンドルフ管に移し、そして３７℃で１時間、振盪した。ベンチ遠心分離上での短い遠心分離工程（１６６００ｒｃｆ、２０秒）の後、細菌ペレットを、２００μｌのＬＢ（ＡＣＦ大豆ペプトン）抗生物質フリー培地に再懸濁した。その混合物を、カナマイシン（濃度＝２５μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレート（ＡＣＦ大豆ペプトン）上に、ドリガルスキ（Drigalski）ヘラにより適用した。プレートを、３７℃で一晩インキュベートした。

組換えサルモネラクローンのプラスミド調製：
各組換えサルモネラ株の３個のクローンを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地（ＡＣＦ大豆ペプトン）３ｍｌ下で３７℃で一晩インキュベートした。次に、細菌培養物を、遠心分離（１６６００ｒｃｆ、３０秒）によりペレット化した。プラスミド単離を、Macherey-NagelからのNucleoSpin Plasmid Kitを用いて行った。プラスミドＤＮＡを、５０μｌの水によりシリカゲルカラムから溶出した。５μｌの溶出物を、対照のために、アガロースゲル電子泳動に使用した。

長期間貯蔵のために、陽性クローンのグリセロール培養物の１ｍｌを生成した。このために、１７２μｌのグリセロール（動物性成分を含まない）を、１ｍｌの低スクリューマイクロチューブにおける対数的に増殖する３ｍｌの培養物の８２８μｌの培地に添加した。サンプルを、さらに使用するまで、−７０℃で貯蔵した。

サルモネラから単離された組換えプラスミドＤＮＡの完全な配列決定：
３ｍｌの液体ＬＢ−Ｋａｎ培地（ＡＣＦ大豆ペプトン）を、組換えサルモネラ（ｐＶＡＸ１０.ｍＭＳＬＮを有するＳ．チフィＴｙ２１ａ及びｐＶＡＸ１０.ｍＭＳＬＮを有するＳ．チフィムリウムＳＬ７２０７）の１つのコロニーにより接種し、そして３７℃及び１８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。一晩の培養物を、ベンチ遠心分離機（Biofuge pico, Heraeus）上で、１３００ｒｐｍでの３０秒の遠心分離によりペレット化した。プラスミド単離を、Macherey-NagelからのNucleoSpin Plasmid Kitを用いて行った。高分子量ゲノムＤＮＡ及び細胞成分のアルカリ溶解及び沈殿の後、プラスミドＤＮＡを、シリカ膜を有するカラム上に負荷した。洗浄工程の後、プラスミドを、５０μｌの滅菌水によりカラムから溶出し、そして配列決定した。次に、その配列を、クローン特異的整列により、それぞれの参照配列と比較し、すなわち各サルモネラクローンのプラスミド配列を、参照配列と共に順に整列した。すべての配列は、それぞれの参照配列と一致した。組換えサルモネラ株を、ＶＳＭ０４（プラスミドｐＶＡＸ１０.ｍＭＳＬＮを有するＳ．チフィＴｙ２１ａ）及びＸＭ０４ｍ（プラスミドｐＶＡＸ１０.ｍＭＳＬＮを有するＳ．チフィムリウムＳＬ７２０７）と命名した。

実施例３：健常なＣ５７ＢＩ／６マウスにおけるＶＸＭ０４ｍの免疫動態の評価
健常なＣ５７ＢＩ／６マウスにおけるネズミメソテリンに対する特異的免疫活性化の動態を、ペンタマー分析及びＥＬＩＳｐｏｔにより評価した。負の対照として、ベクター対照グループ（ＶＸＭ０４ｍ−ｅｍｐｔｙ＝発現プラスミドを含まないサルモネラ・チフィムリウムを受けている）は、サルモネラ空ベクターにより引起される任意の非特異的バックグラウンド刺激と、所望する免疫学的効果とを区別するために、研究設定に含まれた。免疫モニタリングを、ＶＸＭ０４ｍ 及びＶＸＭ０４ｍ−ｅｍｐｔｙによる４回の二日毎のワクチン接種（各１０¹⁰個のＣＦＵ／用量）の後、Ｄ５、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４及びＤ２１で実施した。

１．動物の維持
受け入れ時、生後６週の健常な５２匹の雌Ｃ５７ＢＩ／６マウスを、ＪＡＮＶＩＥＲ (Le Genest St Isle, France)から入手し、そして手順を開始する前、特定病原体フリー（ＳＰＦ）動物ケアユニットにおいて７日間、観察した。動物は、温度（２３±２℃）、湿度（４５±１０％）、光周期（１２時間の明／１２時間の暗）及び換気の調節された条件下の室に維持された。動物はＳＰＦ条件下で維持された。室温及び湿度は連続的にモニターされた。空気処理システムは、再循環しないで、１４回の空気変更／時でプログラムされた。新鮮な外気は、各部屋に均等に核酸される前、一連のフィルターに通された。正圧（２０±４Ｐａ）が、齧歯動物コロニー内の汚染又は病原体の拡散を防止するために、実験室において維持された。動物は、食料及び水を供給されるよう装備されたポリカーボネート製ケージ（Techniplast, Limonest, France）に収容された。使用される標準的な面積のケージは、ケージ当たり最大１０匹のマウス（同じグループからの）で、８００ｃｍ²であった。動物は無菌のトウモロコシ穂軸（参照: LAB COB 12、SERLAB、Cergy-Pontoise、France）に維持され、それらは週２度、交換された。動物用材料は、ＤＩＥＴＥＸ (Saint-Gratien, France)から購入された。照射されたＲＭ１を、減菌制御された顆粒として使用した。食物は、ゴム栓及びスニッパー管を装備した水のボトルから自由に与えられた。水のボトルは、無菌濾過により滅菌され、そして週２度、交換された。Ｄ０で、５２匹のうち５０匹のマウスを、Vivo manager（登録商標）ソフトウェア(Biosystemes, Couternon, France)を用いて、それぞれ２５匹のマウスの２つのグループに、それらの個々の体重に従って分配した。両グループの平均体重は、統計学的に異ならなかった（分散分析）。

２．処理スケジュール
グループ１〜５からのマウスは、ＶＸＭ０４−ｅｍｐｔｙを受け、グループ６〜１０からの動物は、ＶＸＭ０４ｍの投与を受けた。ＶＸＭ０４−ｅｍｐｔｙ及びＶＸＭ０４ｍの両者を解凍し、そして３０以内に投与し、作業溶液を、使用後に廃棄した。ＶＸＭ０４−ｅｍｐｔｙ及びＶＸＭ０４ｍの処理用量は、投与当たり１００μｌ中、１０¹⁰個のＣＦＵであった。ＶＸＭ０４−ｅｍｐｔｙ及びＶＸＭ０４ｍを、０．１ｍｌの体積を有するカニューレを介して強制経口投与（経口、ＰＯ）により投与した。動物グループにかかわらず、各動物は、投与の前、胃における酸を中和するために、投与前適用緩衝液を受けた（１００μｌ／動物／適用）。従って、緩衝液は、２．６ｇの炭酸水素ナトリウム、１．７ｇのＬ−アスコルビン酸、０．２ｇのラクトース・１水和物の１００ｍｌの飲料水への溶解により構成され、そしてＶＸＭ０４−ｅｍｐｔｙ及びＶＸＭ０４ｍの適用前３０以内に適用された。処理スケジュールは、次の通りであった：

グループ１〜５からのマウスは、４回連続して（Ｑ２Ｄ×４）、二日毎にＣＦＵ中、１０¹⁰でＶＸＭ０４ｍ−ｅｍｐｔｙの毎日のＰＯ投与を受けた。

グループ６〜１０からのマウスは、４回連続して（Ｑ２Ｄ×４）、二日毎にＣＦＵ中、１０¹⁰でＶＸＭ０４ｍの毎日のＰＯ投与を受けた。

３．動物モニタリング及び終結
動物の生存性及び動作を、毎日記録し、体重を週２度、測定した。

投与されるサルモネラワクチンにもかかわらず、マウスは、ワクチン接種段階の後、５日（グループ１〜６）、７日（グループ２〜７）、１０日（グループ３〜８）、１４日（グループ４〜９）及び２１日（グループ５〜１０）で終結された（動物グループ及び各時点当たり５匹のマウス）。イソフラン（Ｂａｘｔｅｒ， Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、終結の前、動物を麻酔した。動物は、頚椎脱臼により終結された。剖検（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、及び消化管の肉眼検査）を、すべての終結された動物に対して実施した。マウス終結の時点で、脾臓を採取し、そしてそれぞれ冷却されたＰＢＳ（２−８℃）を含む単一のＩＤラベル付の管中に個々に配置し、そして２−８℃で一晩、貯蔵した。新たに単離され、そして精製された脾臓細胞を、ペンタマー分析のために使用した。新たに調製されたＣＤ８⁺細胞を、ＥＬＩＳｐｏｔ分析のために使用した。

４．脾臓細胞調製
脾臓細胞調製を、次の通りに実施した：洗浄工程においては、ＰＢＳの一部を廃棄し、そして新鮮なＰＢＳにより置き換えた。１００μｍのナイロンCell Strainer (ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ)を、５ｍｌの１×ＰＢＳを含む５０ｍｌのＦａｌｃｏｎの開口部に吊るした。脾臓を、メスで切断し、そして次に、５ｍｌの注射器のスタンプにより細胞ストレーナーを通して押した。１つのストレーナーを、膵臓当たりに使用し、そのストレーナーは常に、無菌の１×ＰＢＳによりすすいだ。細胞を、２−８℃で１０分間、１，５００ｒｐｍ（約４５０ｇ）で遠心分離し、そして上清液を廃棄した。１ｍｌのＡＣＫ−Ｅｒｙ−溶解緩衝液（８．３ ｇ/ｌの ＮＨ₄、１ ｇ/ｌの ＫＨＣＯ₃、０．０３７ ｇ/ｌ のＥＤＴＡ; ｐＨ ７．２ −７．４）を、脾臓当たりに添加し、赤血球細胞を溶解した。その溶液を、ＲＴで３０秒間インキュベートした。１０ｍｌのＰＢＳを添加し、そして細胞を再び、２−８℃で１０分間、１，５００ｒｐｍで回転沈降し、上清液を廃棄した。ペレットを、１０ｍｌのＤＭＥＭ培地に再懸濁した。生存／死亡細胞染色を、トリパンブルーにより実施し、そして細胞数を計数した。細胞懸濁液を、続く分析のために分割した。約１/３を、ペンタマー分析のために使用し、残りをＥＬＩＳｐｏｔ分析のために使用した。

５．ペンタマー分析
ペンタマー分析は、生存性染色及びペンタマー染色を包含した。生存性染色のために、蛍光反応性色素（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ−成分Ａ）の１つのバイアル、及び無水ＤＭＳＯ（成分Ｂ）のバイアルを、室温にし、その後、キャップを除いた。５０μｌのＤＭＳＯ（成分Ｂ）を、反応性色素（成分Ａ）のバイアルに添加した。続いて、ウェルを混合し、そしてすべての色素が溶解したことを可視的に確認した。反応性色素の溶液を、再構成の数時間以内に、遅延することなく使用した。少なくとも１×１０⁶個の細胞を含む細胞懸濁液を遠心分離し、そして上清液を廃棄した。細胞を、１ｍｌのＰＢＳにより１度、洗浄し、そして１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。細胞を計数し、そしてその密度を、ＰＢＳにより、１ｍｌの体積中、１×１０⁶個の細胞に調節した。１μｌの再構成された蛍光反応性色素を、１ｍｌの細胞懸濁液に添加した。次に、その懸濁液を十分に混合し、そして室温で３０分間インキュベートし、光から保護した。細胞を、１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む、１ｍｌのＰＢＳにより１度、洗浄し、そして１％ＦＣＳを含む、１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。

ペンタマー染色のために、生存性ゲート制御のためにＰａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅにより前標識された脾臓細胞を使用した。ペンタマー分析に使用されるＰｒｏ５（登録商標）組換えＭＨＣ ペンタマーを、次の表１に列挙する：

Ｐｒｏ５（登録商標）を、１４、０００ｘｇで５−１０分間、冷却された微量遠心分離機において遠心分離し、非特異的染色を回避するために、バイアルの底で溶液に存在する任意のタンパク質凝集物を収集した。上清液を、ペンタマー染色のために使用した。すべての試薬は、必要とされるまで、氷上に維持され、遮光された。１×１０⁶個の脾臓細胞を、染色条件ごとに割り当てた。細胞を、２ｍｌの洗浄緩衝液（１％ＦＣＳを含むＰＢＳ）により洗浄し、そして回転沈降し（５００ｘｇで５分間）、上清液を廃棄し、そして細胞を残留体積物（約５０μｌ）に再懸濁した。管を、すべての続く工程のために、氷上で冷却して維持し、但し他の指示がある場合を除く。標識されていないペンタマーの１つの試験物（２μｌ）を細胞に添加し、そしてその溶液を、ピペットにより混合し、そして遮光しながら、室温（２２℃）で１０分間インキュベートした。次に、細胞を、２ｍｌの洗浄緩衝液により洗浄し、そして残留液体（約５０μｌ）に再懸濁した。Ｐｒｏ５（登録商標）Fluorotag Ｒ−ＰＥを、１４，０００ｘｇで３分間、冷却された微量遠心分離機により回転せしめ、他方では非特異的結合に寄与するタンパク質凝集物を除去した。試薬は、必要とされるまで、遮光下で氷上で維持された。上清液を、ペンタマー染色のために使用した。８μｌのＰｒｏ５（登録商標）Fluorotag及び１μｌの抗−ＣＤ３ ＦＩＴＣ及び０．５μｌの抗−ＣＤ３ ＡＰＣ／Ｃｙ−７抗体を添加し、そしてその溶液を、ピペットにより混合した。サンプルを、遮光下で２０分間、氷上でインキュベートした。細胞を、２ｍｌの洗浄緩衝液により２度、洗浄し、そして各管を混合した。２００μｌの定着液（ＰＢＳ中、１％ＦＣＳ、２．５％ホルムアルデヒド）を添加し、そして管と振盪した。十分な振盪は、細胞凝集を回避するために重要であった。管は、データ取得のための準備まで、冷蔵庫で暗所に保存された。いずれの場合でも、サンプルは、定着の後、形態の変化のために、データ収集を進める前、３時間、放置された。

各ペンタマー（Proimmuneにより製造された）に対する特異的結合を調査した。ｍメソテリン特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞を、適切なゲートを選択した後、計数した。ｍメソテリン特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の比率を、ペンタマーへの結合親和性に基いて計算した。その比率を、ＶＸＭ０４ｍとＶＸＭ０４ｍ−ｅｍｐｔｙ対照グループとの間で、及びグループ内で時間の経過と共に比較した。すべての統計学的分析を、Ｖｉｖｏ ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア(Biosystems, Dijon, France)を用いて実施した。ｐ値＜０．０５は、有意として見なされた。Ｍｅｓｏ−特異的ＣＤ８⁺細胞の個々の百分率は、図４−９に示されている。図４−６は、ＭＳＬＮ−ＧＳＬ−Ｐｅｎｔａにより検出されるＭｅｓｏ−特異的ＣＤ８⁺細胞を表し；図７−９は、ＭＳＬＮ−ＩＱＬ−Ｐｅｎｔａにより検出されるＭｅｓｏ−特異的ＣＤ８⁺細胞を表す。免疫反応速度（平均値）は、ワクチン接種後、１０日でピークに達した。１０日目でのＭｅｓｏ−特異的ＣＤ８⁺細胞の百分率は、使用されるペンタマーに関係なく、対照グループに比較して、有意に高められた。

Claims (15)

1. メソテリン（Mesothelin）(ＭＳＬＮ)をコードする発現カセットを含む組換えＤＮＡ分子の少なくとも１つのコピーを含む、サルモネラ（Salmonella）の弱毒化された変異体株。
2. 前記サルモネラの弱毒化された変異体株が、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）種のものであり、特にサルモネラ・チフィ（Salmonella typhi）Ty21aである、請求項１に記載のサルモネラの弱毒化された変異体株。
3. 前記発現カセットが真核生物の発現カセットである、請求項１又は２に記載のサルモネラの弱毒化された変異体株。
4. 前記ＭＳＬＮが、ヒトＭＳＬＮ、及びそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有するタンパク質から成る群から選択され、特にＭＳＬＮが、配列番号１に見られるようなアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のサルモネラの弱毒化された変異体株。
5. 前記組換えＤＮＡ分子が、ＣＭＶプロモーターの制御下で、カナマイシン抗生物質耐性遺伝子、ｐＭＢ１ ｏｒｉ、及びヒトＭＳＬＮ、又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有するタンパク質をコードする真核生物発現カセットを含み、特にヒトＭＳＬＮは配列番号２に見られるような核酸配列を有する、請求項３又は４に記載のサルモネラの弱毒化された変異体株。
6. 医薬として使用するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のサルモネラの弱毒化された変異体株。
7. ワクチンとして使用するための、請求項６に記載のサルモネラの弱毒化された変異体株。
8. 癌免疫療法への使用のための、請求項７に記載のサルモネラの弱毒化された変異体株。
9. 前記癌免疫療法が、腫瘍抗原及び／又は腫瘍間質抗原をコードする発現カセットを含む組換えＤＮＡ分子の少なくとも１つのコピーを含む、サルモネラの１又は２以上のさらに弱毒化された変異体株の投与をさらに含み、具体的には、前記サルモネラの１又は２以上のさらに弱毒化された変異体株が真核生物発現カセットを含むサルモネラ・チフィＴｙ２１ａであり、より具体的には、前記サルモネラの１又は２以上のさらに弱毒化された変異体株がヒトＶＥＧＦＲ−２及び／又はヒトウィルムス（Ｗｉｌｍｓ’）腫瘍タンパク質（ＷＴ１）をコードするサルモネラの弱毒化された変異体株を含む、請求項８に記載のサルモネラの弱毒化された変異体株。
10. 前記サルモネラの弱毒化された変異体株が、前記サルモネラの１又は２以上のさらに弱毒化された変異体株と同時投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の、特に請求項９に記載のサルモネラの弱毒化された変異体株。
11. 前記癌免疫療法が、化学療法、放射線療法又は生物学的癌療法を伴い、特に前記サルモネラの弱毒化された変異体株が、前記化学療法又は放射線療法治療サイクルの前若しくは間、又は生物学的癌療法の前若しくは間、又は前記化学療法若しくは放射線療法治療サイクル若しくは生物学的癌療法の前若しくは間に投与される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のサルモネラの弱毒化された変異体株。
12. 前記サルモネラの弱毒化された変異体株が経口投与される、請求項６〜１１のいずれか１項に記載のサルモネラの弱毒化された変異体株。
13. 前記癌が、中皮腫、卵巣癌及び膵臓癌、頸部、頭及び首、外陰部、肺及び食道の扁平上皮癌、肺腺癌、子宮内膜癌、二相性滑膜肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍並びに胃腺癌から選択される、請求項８〜１２のいずれか１項に記載のサルモネラの弱毒化された変異体株。
14. 単回用量が、約１０⁵〜約１０¹¹、具体的には約１０⁶〜約１０¹⁰、より具体的には約１０⁶〜約１０⁹、より具体的には約１０⁶〜約１０⁸、最も具体的には約１０⁶〜約１０⁷個のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む、請求項６〜１３のいずれか１項に記載のサルモネラの弱毒化された変異体株。
15. ＭＳＬＮ発現パターン及び／又は患者のＭＳＬＮに対する予備免疫応答を評価する工程を含む、個別化された癌免疫療法への使用のための、請求項８〜１４のいずれか１項に記載のサルモネラの弱毒化された変異体株。

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